WO2005087286A1 - 生体組織シート及びその作製方法、並びに同シートを用いる移植方法 - Google Patents

生体組織シート及びその作製方法、並びに同シートを用いる移植方法 Download PDF

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amniotic membrane
cell
derived
epithelium
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Kouji Hashimoto
Yuuji Shirakata
Yuuichi Ohashi
Junji Hamuro
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Definitions

  • the present invention relates to a biological tissue sheet. Specifically, the present invention relates to keratoconjunctival epithelial cells, skin epidermal cells, hair follicle epithelial cells, oral mucosal epithelial cells, airway mucosal epithelial cells and intestinal mucosal epithelium without using heterogeneous animal-derived cells as feeder cells.
  • the present invention relates to a biological tissue sheet produced by culturing and proliferating cells such as cells on the amniotic membrane, and a method for producing the sheet, and the use of the sheet (transplantation method, etc.)
  • the skin is an organ that covers the outermost layer of a living body, and is a kind of barrier that protects a living body from an external force.
  • the skin is composed of the epidermis, dermis, and subcutaneous tissue.
  • the epidermis is mainly keratinocyte power, which contains a small number of pigment cells, Langerno cells, and cells.
  • the cells that make up the epidermis are mainly keratinocytes, (1) keratinocytes that have lost their nuclei, which occupy the outermost layer, (2) cells that have nuclei beneath them (granular cells, spiny cells, basal cells)
  • the epidermis basement membrane exists between the basal cells in the lowermost layer and the dermis.
  • the basal layer is a single cell layer, which is the mother cell layer of epidermal keratinocytes, and it is thought that the only cells with the ability to divide are basal cells.
  • a state in which the epidermis has been lost for some reason is an ulcer.
  • the epidermis is regenerated and the ulcer surface becomes epithelialized by the proliferation of keratinocytes from the periphery or by the proliferation of keratinocytes derived from some hair follicles.
  • epithelialization takes time only by regeneration of the epidermis from the surrounding area.
  • the cell cycle of the basal layer is about 450 hours.
  • Daughter cells born by division change morphologically and functionally as they move to the spinous layer, and then keratinize through the granular layer to become the stratum corneum and eventually fall out of the body.
  • the time until dropout is called turnover time, which is estimated to be 47-48 days.
  • An epidermis regeneration model that is generally accepted at present is the ability of keratinocytes to divide. Based on force, it is classified into three types: stem cells, transit-amplifying cells, and post-mitotic cells.
  • a stem cell is a cell that has infinite self-renewal ability and generates a transit-amplifying cell by division.
  • Transit-amplifying cells have a certain splitting ability, and after splitting, the power to become transit-amplifying cells eventually loses splitting ability and becomes post-mitotic cells.
  • Stem cell of epidermis is considered to have the following characteristics.
  • epidermal growth factor (EGF) family Eko EGF
  • EGF transforming growth factor
  • TGF transforming growth factor
  • betacellulin betacellulin
  • amphiregulin amphiregulin
  • neuregulins but those actually related to epidermal keratinocyte proliferation are TGF-a ;, HB-EGF, amphiregulin.
  • TGF—j8, vitamin D, retinoic acid, etc. are known as factors that suppress the growth of epidermal keratinocytes.
  • JP-A-10-277143 JP-A-10-277143 (Patent Document 1) describes a graft for treating a full-thickness defect such as human skin and a method for producing the same.
  • the graft disclosed in this document is made by embedding fibroblasts derived from dermal tissue in human fibrin sheet and attaching the epidermal tissue to the surface of this sheet.
  • the cultured epidermis has the advantage that a small skin piece can be obtained several thousand times just by collecting a small piece of skin once, and it can be repeatedly stored because it can be cryopreserved, compared to conventional skin grafting. It seems to be the biggest advantage.
  • the epidermis sheet is divided into an autologous cultured epidermis sheet and an autologous cultured epidermis sheet depending on the origin of the cells used.
  • autologous skin sheet transplantation is mainly intended to cover and engraft the epidermal defect site, while transplantation of other culture skin sheet is effective as a biological dressing.
  • epidermal keratinocytes produce various cell growth factors and cytokines, and the effectiveness of other-cultured epidermal sheets has been revealed.
  • Cornea One of the tissues expected to contribute to regenerative medicine alongside the skin is the cornea. Cornea
  • keratoconjunctival epithelial cells are always in contact with the outside world, foreign substances such as microorganisms in the outside world, light rays such as ultraviolet rays Power It has a defensive action to protect the eyeball. In other words, keratoconjunctival epithelial cells play an extremely important role in maintaining transparency and maintaining the corneal transparency and the entire eyeball.
  • the cornea may become turbid and lose its transparency due to pathological conditions such as keratitis, corneal ulcer, and perforation.
  • pathological conditions such as keratitis, corneal ulcer, and perforation.
  • treatment by cornea transplantation using the cornea provided by the eyeball donor K. et al. Is performed.
  • corneal transplantation the transparent cornea is transplanted after removing the cornea from which the patient has lost transparency. This transplantation restores transparency and restores visual acuity again.
  • corneal transplantation can be expected to have an effective therapeutic effect
  • diseases that cannot be dealt with by corneal transplantation alone. Examples include Stevens' Johnson syndrome, pemphigoid, chemical trauma, and burns.
  • keratoconjunctival epithelial cells repeat division every day, old cells peel off, and new cells are regenerated from stem cell tissue.
  • stem cell tissue that regenerates the cornea is damaged.
  • Stem cell tissue that regenerates corneal epithelium is called “corneal limbal tissue”, and is limited to the boundary between black eyes and white eyes, and is in a special environment exposed to the outside world.
  • this stem cell tissue itself is eradicated by some kind of disorder.
  • the defective part is covered with surrounding conjunctival epithelium, lacking transparency, and exerting an extremely low visual acuity.
  • the corneal limbus is withered, so that the transplanted cornea cannot be maintained for a long time simply by transplanting the cornea.
  • amniotic membrane transplantation method has been developed as one method of transplanting the limbus (Medical Asahi, September 1999 issue: p62-65, N Engl J Med340: 1697 1703, 1999: Non-patent document 1 ).
  • the amniotic membrane used in this transplantation method is obtained from the placenta of pregnant women who have undergone cesarean section. Since the amniotic membrane has a thick basement membrane, it acts as a substrate for the proliferation and differentiation of keratoconjunctival epithelial cells when transplanted.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 10-277143
  • Non-Patent Document 1 Medical Asahi September 1999 issue: p62-65, N Engl J Med340: 1697 1703, 1999
  • Cultivated epidermal keratinocytes using a serum-free culture method and then changed to a high calcium medium supplemented with fetal calf serum to produce a cultured epidermal sheet and transplant it to burn patients.
  • this serum-free culture method is the mainstream, but 3T3 cells derived from different animals are used as a feeder layer.
  • a graft obtained by culturing in the presence of cells derived from different animals has a risk of contamination with products derived from different animals. Therefore, transplantation using the graft is regarded as xenotransplantation or equivalent, and is considered to have a major ethical and safety problem. In fact, there are no examples of xenotransplantation being put to practical use in the medical field.
  • Transplantation of cultured epidermis sheets made it possible to cover a wide range of wound surfaces by subculturing keratinocytes from stamp-sized skin. In addition, since it can be stored frozen, it can be applied to the treatment of intractable and recurrent skin ulcers that require repeated transplantation. It is not always easy to satisfactorily engraft culture sheets produced by conventional culture methods, for example, transplanted cultured skin sheets. This is because the cultured epidermis sheet lacks the components of the basement membrane and the stratified epidermis does not form a strong stratum corneum. In that respect, the three-dimensional cultured skin developed by Bell also has a stratum corneum and a granular layer.
  • the present invention has been made in view of the above background and problems, and an object thereof is to provide a biological tissue sheet that is expected to have a high therapeutic effect and has high safety at the time of transplantation.
  • the present inventors first tried to produce a cultured skin sheet. Specifically, in consideration of safety, the condition that no cells derived from different animals (feeder cells) are used when culturing epithelial cells, and three-dimensional culture is developed as a development system for conventional cultured epidermal sheet autotransplantation. Skin was prepared, and basement membrane components, cell adhesion molecules, and differentiation antigens were examined by immunohistochemistry and electron microscopy.
  • the engraftment of the cultured epidermal sheet depends on the formation of the constituent components of the basement membrane. That is, the cultured skin sheet is cultured in close contact with the bottom surface of the plastic petri dish, and must be peeled off from the petri dish bottom surface when producing the sheet. Dispa One type of collagenase is used, but the components of the basement membrane are degraded by these enzymes. In previous reports, dispase prevents the detection of pemphigoid antigens on Western plots, and the fluorescent antibody method degrades laminin 5 recognized by the GB3 monoclonal antibody.
  • Collagenase has been reported to be unaffected by the force ⁇ 6 18 4 integrin, which reduces the expression of tethered fibers, type IV and type VII collagen.
  • the three-dimensional cultured skin maintains a structure similar to that of the in vivo epidermis, and the formation of basement membrane components is observed.
  • the j8 1 integrin, j8 4 integrin, and pemphigoid antigen were formed relatively well, and the electron microscope findings showed that the hemidesmosome was well formed. It was confirmed.
  • the present inventors examined whether or not a transplant material applicable to other tissues can be produced by the same method as that for a cultured skin sheet. Specifically, an attempt was made to produce a corneal epithelial sheet. As a result, by culturing corneal epithelial cells on amniotic membranes placed on collagen containing fibroblasts, good stratification and epidermalization without using feeder cells were achieved.
  • the present inventors have succeeded in producing a safe and practical biological tissue sheet without using cells derived from different animals. It was also found that a biological tissue sheet can be produced even under serum-free culture conditions.
  • amniotic membrane is particularly excellent as a culture substrate for epidermal cells.
  • an amniotic membrane was adhered to a collagen gel containing fibroblasts, seeded with human epidermal keratinocytes (keratinocytes), and migration of human epidermal keratinocytes to the periphery was observed. The migration was markedly enhanced as compared to the case where the cells were directly seeded on the collagen gel (control group).
  • human epidermal keratinocytes cultured on an amniotic membrane placed on a collagen gel containing fibroblasts are collected together with the amniotic membrane, and then placed on another amniotic membrane adhered to the collagen gel containing fibroblasts.
  • the migration was markedly enhanced compared to when placed on collagen gel containing fibroblasts (control group).
  • control group collagen gel containing fibroblasts
  • an excellent epidermis reconstruction technique was that the collected epidermal keratinocytes were collected together with the amniotic membrane and transplanted onto another amnion previously transplanted to the skin defect.
  • artificial dermis has been used for dermal defects, and a certain degree of therapeutic effect has been obtained.
  • the basement membrane is not sufficiently constructed, resulting in poor engraftment.
  • the transplantation method (1) or (2) above is used in combination with artificial dermis transplantation, the cultured epidermis is transplanted through the amniotic membrane having a basement membrane component.
  • the cultured epidermis is formed on the amniotic membrane, after transplantation, the cells constituting the cultured epidermis are favored to proliferate and migrate to the periphery, and as a result, the cultured epidermis rapidly expands. A high therapeutic effect can be obtained. Therefore, it is expected that an excellent therapeutic method can be established for skin defects extending to a wide range of subcutaneous tissues by combining artificial dermal transplantation with the above transplantation technique.
  • the present invention has been completed on the basis of the above results and knowledge, and provides the following configuration.
  • the present invention provides a biological tissue sheet comprising biologically derived cells grown on amniotic membrane in the absence of heterologous animal cells.
  • biological cells are grown in a state where an amniotic membrane is placed on a collagen gel containing human fibroblasts. This improves the proliferation rate of living cells.
  • serum-free medium As a medium for growing living cells, (1) serum-free medium, or (2) serum components
  • a medium containing only serum derived from the recipient can be used.
  • the biological cell is preferably a cell derived from the corneal epithelium, conjunctival epithelium, skin epidermis, hair follicle epithelium, oral mucosa, airway mucosa or intestinal mucosa.
  • amniotic membrane from which the epithelium has been removed is preferable to use as the amniotic membrane as a culture substrate.
  • a biological tissue sheet is configured to contain amniotic membrane as a culture substrate in addition to the proliferated cells.
  • the biological tissue sheet of the present invention is transplanted to a tissue defect, for example, directly or via an amniotic membrane different from the amniotic membrane used as a culture substrate.
  • a tissue defect for example, directly or via an amniotic membrane different from the amniotic membrane used as a culture substrate.
  • an amniotic membrane typically after transplanting an amniotic membrane (second amniotic membrane, ie, an amniotic membrane different from the amniotic membrane used for producing the biological tissue sheet) into the tissue defect, the biological tissue is placed on the amniotic membrane.
  • a sheet will be transplanted.
  • a biological tissue sheet according to a further aspect of the present invention is the biological tissue sheet in the absence of heterologous animal cells, wherein biological cells grown on an amniotic membrane placed on a collagen gel containing human fibroblasts are combined with the amniotic membrane in the second form. It contains cells obtained by placing on an amniotic membrane and further proliferating.
  • the present invention further provides a method for producing a biological tissue sheet.
  • One embodiment of the manufacturing method of the present invention includes the following steps. That is, (a) a step of preparing a biological cell; (b) a step of seeding the biological cell on an amniotic membrane; and (c) a step of culturing and proliferating the biological cell in the absence of a heterologous animal cell. It is.
  • step b the following steps are performed as the step b.
  • (B-1) culturing human fibroblasts in a collagen gel; and (b-2) placing an amniotic membrane on the collagen gel and then seeding the biological cells on the amniotic membrane. It is.
  • the step of bringing the outermost layer into contact with air is further performed. This step promotes keratinization (epithelialization) of the cell layer.
  • a serum-free medium or (2) a medium containing only serum derived from a recipient as a serum component can be used.
  • the biological cell is preferably a cell derived from the corneal epithelium, conjunctival epithelium, skin epidermis, hair follicle epithelium, oral mucosa, airway mucosa or intestinal mucosa.
  • amniotic membrane from which the epithelium has been removed is preferable to use as the amniotic membrane as a culture substrate.
  • the present invention further includes the following steps: (A) a step of seeding skin epidermal cells on the amniotic membrane; (B) a step of culturing and proliferating the skin epidermal cells; and (C) proliferated skin
  • a method for preparing skin epidermal cells comprising the step of recovering epidermal cells.
  • FIG. 1 is a diagram showing a hematoxylin and eosin-stained image (8 days after air lifting) of a three-dimensional cultured skin sheet (cultured skin sheet) produced by the method of Example 1.
  • a collagen gel (matrix) containing an epidermis keratinocyte layer, amniotic membrane, and fibroblasts in order from the upper layer.
  • the basal cell layer, spiny cell layer, granule layer, and stratum corneum are organized in order from the bottom, and are very close to human normal epidermis!
  • FIG. 2 is a diagram showing a hematoxylin and eosin stained image (8 days after air lifting) of a three-dimensional cultured skin sheet (cultured skin sheet) produced by the method of Example 2.
  • Human epidermal keratinocytes seeded on the amniotic membrane are composed of a single basal cell layer and 5-6 cell layers. The formation of the stratum corneum is also observed and the epidermis is reconstructed.
  • FIG. 3 shows the results of testing the effect of amniotic membrane on epidermal keratinocyte proliferation and migration.
  • the right column shows the results of the test group (when epidermal keratinocytes were cultured on amniotic membranes in close contact with collagen gel containing fibroblasts) (first day, 10th day in order of increasing force).
  • the left column shows the results of the control group.
  • FIG. 4 shows the results of testing the effect of amniotic membrane on epidermal keratinocyte proliferation and migration.
  • the left column shows the results of the test group (when the cultured epidermis sheet is placed on the amniotic membrane in close contact with the collagen gel containing fibroblasts and cultured) (from day 1, day 7, day 10, in order from the top) , And 14th day).
  • the middle column shows the results of control group 1 (when a cultured epidermal sheet is placed on a collagen gel containing fibroblasts and cultured).
  • the right column is FIG. 6 shows the results of Control Group 2 (when a cell layer obtained by three-dimensional culture without using amniotic membrane is placed on a collagen gel containing fibroblasts and cultured).
  • the present invention provides a biological tissue sheet having the following constitutional power. That is, a biological tissue sheet containing biologically derived cells grown on amniotic membrane in the absence of heterologous animal cells. Biological cells form a cell layer. The features of the biological tissue sheet of the present invention and its production method are described in detail below.
  • the biological tissue sheet of the present invention comprises: (a) a step of preparing living body-derived cells; (b) a step of seeding the living body-derived cells on an amniotic membrane; and (c) the living body in the absence of heterologous animal cells. It is produced by a method comprising a step of culturing and proliferating a derived cell.
  • step a biological cells are prepared.
  • the living body-derived cells cells suitable for the purpose of the finally obtained biological tissue sheet are used.
  • skin epidermal cells including stem cells and progenitor cells
  • hair follicle epithelial cells including stem cells and progenitor cells
  • corneal epithelial cells including stem cells and progenitor cells
  • mucosal epithelial cells for the purpose of regenerating mucosal epithelial tissue.
  • mucosal epithelial cells include oral mucosal epithelial cells, intestinal mucosal epithelial cells, airway mucosal epithelial cells and the like.
  • the preparation method of living body-derived cells will be described taking skin epidermal cells, corneal epithelial cells, oral mucosal epithelial cells, intestinal mucosal epithelial cells and airway mucosal epithelial cells as examples.
  • Corneal epithelial cells can be obtained from corneal limbal tissue force.
  • endothelium cells such as corneal limbal tissue force are peeled and removed, and the conjunctiva is excised to produce a single cell suspension. This is stored in a nitrogen tank and then rapidly thawed at 37 ° C to prepare the corneal epithelial cell suspension.
  • Subculture if necessary.
  • EpiLife TM (Cascade), MCDB153 medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), which is a serum-free medium, or a medium produced by modifying the amino acid composition of these mediums, etc. should be used. Can do.
  • Oral mucosal epithelial cells include cells present in the root of the tooth (inner oral mucosal epithelial cells), lip cells, palate cells, buttocks cells, and the like. Of these, the intraoral mucosal epithelial cells are particularly preferred because of their high proliferative ability and low antigenicity. Oral mucosal epithelial cells can be collected by excising the area where the target cells are present with a scalpel or by cleaving. In the oral marginal mucosal epithelial cells, the oral mucosal epithelium adhering to the tooth extraction can be separated from the enamel cement transition and collected. In order to remove impurities such as connective tissue, treatment with enzymes such as dispase or trypsin or filter treatment is preferred!
  • Intestinal mucosal epithelial cells are collected from colonoscopy intestinal epithelial biopsy tissue, or collected in the usual way during laparotomy.
  • epidermal cells can be excised from the tissue by lazer capture microdissection.
  • the technique of the present invention is also applied to a biological tissue sheet produced using all human digestive tract epithelial cells of the esophagus, stomach, duodenum, small intestine, and large intestine.
  • human gastrointestinal epithelium is damaged by ulcers or inflammation, bone marrow-derived cells play a rescue role in response to emergency situations, and the epithelium is repaired.
  • Gastrointestinal epithelial cells though some, are made by bone marrow.
  • the significance of the present invention can be regarded as equivalent to that using corneal epithelial cells.
  • the epithelial cells made from the bone marrow which are usually only a few in a thousand, are cured, and the ulcers (injuries) inside the gastrointestinal tract made from gastric ulcer, colitis, etc. Over the course of the process, it has increased from 50 to 100 times, and it has been found that about 1 in 10 gastrointestinal epithelial cells are derived from the bone marrow.
  • Gastrointestinal mucosal epithelial cell-derived tissue tissue prepared here is used for intractable ulcers and inflammation of enteric diseases such as severe intestinal infections, ulcerative colitis, Crohn's disease, Behcet's disease, etc. In the sense of promoting the regeneration of the intestinal epithelium, it is considered to be extremely meaningful. Expected to be useful for intestinal allergy
  • Airway mucosal epithelial cells are easily obtained from biopsy tissue of the airway mucosa, and in the same way as described above, treatment with an enzyme such as dispase trypsin or filtering is performed to remove impurities such as connective tissue. Is preferred. Airway mucosal epithelial cells play an important role in the pathogenesis of various infectious diseases through the biosynthesis and release of j8 defensin. The role of airway mucosal epithelium is high in asthma and allergic diseases! Providing a biological tissue sheet produced from the airway mucosal epithelial cells according to the present invention to the airway mucosa that has undergone tissue damage goes beyond the emergency response and leads to the provision of an artificial airway. In particular, the immunosuppressive action of the sheet prepared on the amniotic membrane is beneficial.
  • oral mucosal epithelial cells and intestinal mucosal epithelial cells are preferably treated with an enzyme such as dispase trypsin or filtered to remove impurities such as connective tissue after collection of the tissue.
  • an enzyme such as dispase trypsin or filtered to remove impurities such as connective tissue after collection of the tissue.
  • the living body-derived cells are also prepared with a person (recipient) ability to receive transplantation of the living tissue sheet. That is, it is preferable that the donor of the biological cell and the recipient of the biological transplant sheet are the same person. By using such autologous cells, the problem of immune rejection is solved.
  • the prepared biological cells are seeded (mounted) on the amniotic membrane (step b), and then subjected to culture (step c).
  • the “amniotic membrane” is a membrane that covers the outermost layers of the uterus and placenta in mammals, and is composed of a basement membrane and an epithelial layer formed on a collagen-rich parenchyma. It is preferable to use human amniotic membrane as the amniotic membrane.
  • human amnion can be collected by force such as human fetal membrane and placenta obtained as a postpartum at the time of delivery.
  • human fetal membrane obtained immediately after delivery Human amniotic membrane can be prepared by treating and purifying the monolith consisting of placenta and umbilical cord.
  • a known method such as the method described in JP-A-5-5698 can be employed. That is, the amniotic membrane is peeled off from the fetal membrane obtained at the time of delivery, the remaining tissue is removed by physical treatment such as ultrasonic washing and enzyme treatment, and the human amniotic membrane can be prepared through an appropriate washing step.
  • the human amniotic membrane thus prepared can be stored frozen until use. Freezing of the human amniotic membrane can be performed, for example, at ⁇ 80 ° C. in a liquid in which DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) and glyceride are mixed in an equal volume ratio.
  • DMEM Denbecco's modified Eagle's medium
  • the operability can be improved by cryopreserving, and the antigenicity can be expected to decrease.
  • the amniotic membrane can be used as it is, it is preferable to use a material obtained by removing the epithelium from the amniotic membrane by reptile treatment or the like. For example, after thawing the human amniotic membrane cryopreserved as described above, it is treated with EDTA or proteolytic enzyme to loosen the adhesion between cells, and the epithelium is removed using a cell scraper or the like to remove the epithelium.
  • the prepared human amniotic membrane can be prepared.
  • the cell derived from a living body has a cell density of, for example, about 1 X 10 3 Zcm 2 or more, preferably about 1 X 10 3 Zcm 2 —about 1 X 10 7 Zcm 2 , more preferably about 1 X 10 4.
  • Pieces Zcm 2 approximatelyx. 1 X 10 6 pieces Zcm 2 is seeded on the amniotic membrane.
  • an amniotic membrane is placed on a human fibroblast-containing collagen matrix prepared in advance, and then living cells are seeded on the amniotic membrane and cultured. That is, in this embodiment, after culturing human fibroblasts in a collagen gel (step bl), and placing the amniotic membrane on the collagen gel, the biological cells are seeded (placed) on the amniotic membrane. ) (Step b-2) is performed.
  • the biological tissue sheet prepared by such a procedure will contain biological cells grown on the amniotic membrane placed on a collagen gel containing human fibroblasts.
  • the biological tissue sheet of this aspect is a collagen matrix. It can also be used as a transplant material together with a tuss. It can also be used as a transplant material after removing the collagen matrix. Alternatively, it can be used as a transplant material after removing the collagen matrix and amniotic membrane.
  • Collagen gel functions as a culture substrate for human fibroblasts.
  • the type of collagen used as a raw material for the collagen gel is not particularly limited, and type I collagen, type III collagen, type IV collagen, and the like can be used. A mixture of a plurality of types of collagen can also be used. These collagens can be extracted and purified from the skins of animals such as pigs, sushi, and hedges, and connective tissues such as soft bones by acid solubilization, alkali solubilization, enzyme solubilization, etc. it can. For the purpose of reducing antigenicity, it is preferable to use a so-called atherocollagen in which the telopeptide is removed by treatment with a degrading enzyme such as pepsin or trypsin. Collagen derived from amnion, particularly human amnion, may be used as a material for the collagen gel.
  • the term “derived from amniotic membrane” means that it is widely obtained using amnion as a starting material.
  • the origin of the human fibroblasts contained in the collagen gel is not particularly limited, and any tissue can be used as long as it produces collagen.
  • a force such as skin tissue or oral mucosa tissue was also prepared. Human fibroblasts can be used.
  • human fibroblasts are prepared by the following procedure. The skin is collected, and then the dermis is peeled off from the skin. Shred the dermis and attach it to the I-type collagen coat dish. After static culture, pass human fibroblasts that migrate from the dermis. The cells are detached from the bottom of the dish, and the cell suspension is prepared and seeded in a cell culture dish. If appropriate, the cells are stored frozen (eg, stored in liquid nitrogen). On the other hand, a neutralized collagen solution is prepared using type I collagen (see Examples described later). Add this to a culture vessel (eg culture insert) and let it stand at room temperature for about 10 minutes to gel.
  • a culture vessel eg culture insert
  • Cultivation of living body-derived cells seeded on amniotic membrane is performed in the absence of heterologous animal cells.
  • "in the absence of heterologous animal cells” means culturing living body-derived cells.
  • the condition is that animal cells that are heterogeneous to the living cell are not used, specifically when human cells (eg, human skin epidermis cells or human corneal epithelial cells) are used as living cells.
  • human cells eg, human skin epidermis cells or human corneal epithelial cells
  • the condition that cells of non-human species such as mice and rats are not present (coexisted) in the culture solution is obtained by culturing under such conditions.
  • components derived from different species including heterologous cells themselves) are mixed into the transplanted material (ie, biological tissue sheet).
  • the medium used for culturing living body-derived cells is not particularly limited as long as the cells are allowed to grow.
  • MCDB153 medium Nisui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • EpiLife TM Cascade
  • medium prepared by modifying the amino acid composition of these mediums DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) commonly used for epithelial cell growth )
  • Ham's F12 medium can be used.
  • a serum-free medium that does not contain a protein derived from a different animal.
  • a medium supplemented with growth factors, antibiotics and the like may be used.
  • a serum-free culture method as the culture method in the present invention.
  • the culture may be carried out in a medium containing serum.
  • serum derived from the same species human-derived serum when cultivating human biological cells
  • autologous serum is used. It is preferable to use it.
  • autologous serum that eliminates the risk of causing immune rejection.
  • step c living body-derived cells grow on the amniotic membrane.
  • step d A step of contacting the surface layer of the cell layer with air is performed. This step is also referred to as air-lifting in this specification. This step d is performed for the differentiation of the cells forming the cell layer and the induction of the barrier function.
  • the surface of the culture solution is lowered by temporarily removing a part of the culture solution using a dropper, pipette, etc., thereby exposing the outermost layer of the cell layer to the outside of the culture solution. It can be carried out. Alternatively, the cell layer can be lifted together with the amniotic membrane, and the outermost layer can be temporarily exposed from the culture medium surface. Furthermore, air may be sent into the culture solution using a tube or the like, and air may be brought into contact with the uppermost layer of the cell layer. From the viewpoint of ease of operation, it is preferable to carry out the method by lowering the surface of the culture solution and exposing the outermost layer of the cell layer.
  • the time for performing step d that is, the time for contacting the outermost layer of the cell layer with air varies depending on the state of the cell and the culture conditions, but is, for example, about 3 days to 3 weeks, preferably 5 days. 2 weeks, more preferably about 1 week.
  • step c cultivation step
  • step e a step of collecting the living body-derived cells together with the amnion, and ⁇ -collecting the living body-derived cells and the amnion that are collected on the amnion side And placing the cell on the second amniotic membrane, and further culturing and proliferating the living body-derived cells.
  • step e and step 13 ⁇ 4 another amniotic membrane (second amniotic membrane) is adhered to one side of the amniotic membrane (first amniotic membrane), and a part of the first amniotic membrane is covered with the other one. In the part, a construct comprising a cell layer covering the second amniotic membrane is obtained.
  • the entire surface of the second amniotic membrane is covered with the cell layer !, a structure, and a part of the surface of the second amniotic membrane. It is possible to obtain a construct that is covered with a cell layer.
  • step e living cells derived from the culture and amnion used as a culture substrate are collected.
  • the proliferating living cells and amniotic membrane can be recovered by peeling off the amniotic membrane after culturing.
  • the proliferating living cells and amniotic membrane can be recovered by detaching the collagen gel force from the amniotic membrane after culturing.
  • step re the collected biological cells and the amniotic membrane are placed on another amniotic membrane, and then the biological cells are cultured again.
  • two-stage culture step C and step
  • step re a construct composed of the collected biological cells and amniotic membrane (hereinafter referred to as “cell-amniotic membrane construct”) is placed on a separately prepared amniotic membrane (second amniotic membrane) with the amnion side down. Is done. Multiple cell-amniotic constructs can also be placed on the second amniotic membrane. For example, a plurality of cell-amniotic constructs can be obtained by cutting the cell-amniotic construct recovered after culturing in step C. Alternatively, it is possible to prepare a plurality of cell-amniotic constructs by preparing a plurality of culture systems independent of each other and performing Step C in parallel.
  • the cell-amniotic construct so that the interval is constant. In subsequent cultures (and after transplantation into the living body), when cells proliferate and the cell layer extends to the surroundings
  • the region where the cell layer is not initially formed in the second amniotic membrane can be quickly and efficiently covered with the cell layer. That is, if the above method is adopted, a cell layer having a large surface area can be formed in a short time on the second amniotic membrane. In this way, a more efficient cell layer can be produced.
  • the cell layer together with the second amniotic membrane can be transplanted into the tissue defect part of the living body. Formation of the layer is promoted and a high therapeutic effect is obtained.
  • step d air lifting
  • the culture in step f can be performed under the same conditions as the culture conditions in step c above. That is, it is preferable to use a culture medium that is preferably cultured in the absence of heterologous animal cells and that is serum-free and does not contain proteins derived from heterologous animals. If a medium containing serum is used, serum derived from the same species (when culturing human living cells) It is preferable to use autologous serum, the ability to use human-derived serum. Similarly to step C, in step f, the culture conditions may be changed during the culture step for the purpose of good growth of cells derived from living organisms! /.
  • the biological tissue sheet of the present invention is extremely safe because it does not use cells derived from different animals in its production process, and uses amniotic membrane as a scaffold when culturing biological cells. It will be expensive. Since the use of amniotic membrane also contributes to the improvement of engraftment, the biological tissue sheet of the present invention provides a high therapeutic effect when transplanted. In particular, an extremely dense cell layer is formed in a biological tissue sheet produced by a method using amniotic membrane and collagen gel, and the engraftment after transplantation becomes very high.
  • the biological tissue sheet of the present invention is used for regeneration (reconstruction) of the skin epidermis, hair follicle epithelium, corneal epithelium, oral mucosal epithelium, intestinal mucosal epithelium, and airway mucosal epithelium.
  • the living tissue sheet of the present invention can be directly transplanted into a tissue defect part of a living body.
  • directly transplantation means transplantation without substantially interposing another substance between the tissue defect and the biological tissue sheet.
  • transplant the living tissue sheet of the present invention (except for those using the second amniotic membrane in the production process) into the tissue defect part of the living body so that other substances are interposed between them. You can also.
  • a biological tissue sheet can be transplanted into a tissue defect through an amniotic membrane (second amniotic membrane) different from the amniotic membrane used as a culture substrate.
  • a biological tissue sheet prepared in advance can be transplanted onto the amniotic membrane.
  • the presence of amniotic membrane as a base is expected to allow the cells contained in the biological tissue sheet to proliferate efficiently and migrate well to the surroundings. That is, rapid extension of the cell layer constituting the biological tissue sheet can be expected, and a high therapeutic effect can be obtained.
  • the external defect is protected by covering the tissue defect with amniotic membrane. This also contributes to improving the therapeutic effect.
  • the present invention further provides a novel method for preparing skin epidermal cells based on the finding that the proliferation and migration of skin epidermal cells are good on amniotic membrane.
  • the preparation method of the present invention comprises the following steps: (A) a step of seeding skin epidermal cells on the amniotic membrane; (B) a step of culturing and proliferating the skin epidermal cells; and (C) proliferating skin epidermal cells. To recover It is characterized by including a pop.
  • the preparation method of the present invention the cells proliferate efficiently, and the migration of the cells to the periphery also becomes good. Therefore, it is possible to produce a large cell layer (cultured epithelium) in a short time.
  • skin epidermal cells can be collected and cultured in a conventional manner (see above).
  • physical means detachment with a cell scraper or the like
  • enzymatic means treatment with dispase or trypsin
  • the skin epidermis cells may be collected in a layered state, or may be collected in a state separated into individual cells.
  • amniotic membrane was collected at the cesarean section in the operating room. The operation was careful of cleanliness, and a special gown was worn after hand washing according to the surgical operation. Before delivery, a clean bat for collecting amnion and physiological saline for washing were prepared. After delivery, the placenta tissue was transferred to a vat and the amnion tissue was manually detached from the placenta. The adhesion between the amniotic membrane and the placenta was strong! The part was excised with scissors.
  • the amniotic process was performed in the order of (1) washing, (2) trimming, and (3) storage. In all processes, sterilize all containers and equipment that should be used in a clean fume hood, and use petri dishes, etc. that are sterilized and discarded (disposable). Eve was used. Blood components adhering to the collected amniotic membrane were removed while washing with physiological saline, and further washed with a sufficient amount of physiological saline (0.005% ofloxacin added). Subsequently, the plate was washed a total of three times with a phosphate buffer solution (PBS) supplemented with penicillin streptomycin (50 IU).
  • PBS phosphate buffer solution
  • amniotic membrane was transferred into a petri dish and divided into pieces of about 4 X 3 cm using scissors. After division, amniotic membranes in good condition were selected based on shape and thickness. [0051] 1-3. Preservation of amniotic membrane
  • Each 1cc of the stock solution was put into a 2cc sterilized cryotube, collected, washed and selected one by one, and then stored in an 80 ° C deep freezer.
  • DMEM Denbecco's modified MEM medium, GIBCOBRL
  • the stored amniotic membrane was used for 3 months, and was incinerated after the expiration date.
  • the following epithelial treatment may be performed without performing such a preservation treatment.
  • the peeled epidermis is washed with DMEM, then with PBS, and then immersed in a 0.25% trypsin solution and treated at 37 ° C for 10 minutes. Transfer the epidermis to a plastic petri dish containing trypsin neutralization solution, loosen the epidermis with tweezers, and sterilize it with 50 ml Move to Yubu. PBS is added to prepare the epidermal keratinocyte suspension. Count the number of cells and centrifuge at 1000rpm for 5 minutes to precipitate the cells.
  • the peeled dermis is washed with DMEM and then cut into small pieces with a knife on a side 2mm.
  • the cut dermis is closely attached to the type I collagen-coated dish at an interval of about 1 cm.
  • Collect the remaining cells using PBS precipitate the cells by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes, aspirate the supernatant, add DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, and adjust the cell suspension. Inoculate in a cell culture dish. Passage cell density should be approximately 1: 3.
  • the cells are stored frozen as appropriate.
  • the cryopreservation solution is 10% glycerol, 20% FCS, 70% DMEM and stored in liquid nitrogen.
  • Type I collagen solution (cell matrix type 1A: 3 mg / ml: Nitta Gelatin): 0.1N NaOH: 1 volume, 8 times concentration for 6 volumes DMEM: 1 volume, 20% FCS / DMEM: 10 volumes
  • a neutral collagen solution (final collagen concentration: lmg / ml) at 4 ° C, add lml to a 24mm diameter force insert (Corning-Costar), and let stand at room temperature for 10 minutes. Make it gelled. 5xl0 5 cells were grown in logarithmic culture and used as fibroblasts in the logarithmic growth phase (cells cultured by the outgrowth method from the remaining dermis after dispase treatment and exfoliation of the epidermis were used for passage 5-10).
  • Neutralized collagen solution Mix at a volume ratio of 8 to prepare a neutralized collagen solution containing cells (final collagen concentration: 0.8 mg / ml). Add 3.5 ml of this solution to each culture insert and leave it in a CO incubator (37 ° C. Gelation takes about 30 minutes.
  • the bottom surface of the collagen gel is in close contact with the membrane, but the upper part of the collagen gel contracts to a thickness of 2-3 mm.
  • Wash the stored amniotic membrane (amniotic membrane from which the epithelium has been removed) twice with PBS and then once with the keratinocyte culture medium.
  • Air exposure is performed 3 days after seeding epidermal cells on the amniotic membrane. Place sterilized filter paper in a maintenance container for air exposure, and add the layering medium to the extent that the filter paper is immersed (approximately 9 ml). Carefully remove the culture medium inside the culture insert, transfer the culture insert onto filter paper, Incubate in a plate. Change the culture every other day. 7- to 14-day air exposure completes a three-dimensional cultured skin.
  • L-glutmine 4mM, Adenin; 0.18mM, transfferin; 5ug / ml, selenious acid; 53nM, triiodothyronine; 20pM, serine; lmM, choline chloride; 0.64mM, linoleic acid; 2ug / ml, FCS; 2%
  • the cultured skin sheet obtained as a result of the above operation easily peels off the dish bottom surface force or the collagen matrix force. Since the conventional technology causes the sheet to shrink, it is necessary to use a chitin membrane (peskitin W) as a support and often breaks, but the above method produces a strong sheet, Since no sheet shrinkage is observed, the use of a support becomes unnecessary.
  • peskitin W chitin membrane
  • the cultured epidermis sheet was prepared by the above method, the epidermis became 5-8 layers on the 7th day after exposure to air, the formation of stratum corneum was observed, and the structure was almost the same as normal human skin.
  • the histological findings of the stratified keratinocytes are a single basal cell-like cell and a 5-8 layer stratification on top of it.
  • the cultured epidermis sheet can be used approximately 4 weeks after the skin is collected, and the surface area of the culture surface increases several thousand times in the calculation.
  • keratinocytes have 1 to 2 layers and no formation of stratum corneum was observed, and 4 days after air exposure, keratinocytes were stratified 3-4 layers of spiny layer A clear stratum corneum formation was observed. After 7 days, the spinous layer was about 5-8, and this state was reliably maintained until around 14th. Compared with the conventional cultured skin sheet, it formed a clearly stronger sheet, and it seemed that it was easy to handle and easy to handle without using a support.
  • Immunohistochemically, laminin-5, type IV collagen, type VII collagen, and j84 integrin were expressed mainly in the basal epidermis basal cells, and were different from the in vivo epidermis expression pattern.
  • the intercellular adhesion molecules E-cadherin, desmoglein 1, desmoglein 3, and the underlying proteins desmoplakin, placoglobin were expressed in the spinous layer, including the basal lamina.
  • the intercellular adhesion molecule and the molecular marker were expressed in the same manner as in vivo epidermis, but the expression of the components of the basement membrane seemed to be insufficient.
  • Electron microscopic findings showed that desmosomes were well formed. In the basement membrane, hemidesmosome formation was generally good, but the basement plate was partially fragmented although it was partially formed. The mooring vertebrae were fragmented.
  • the prepared cultured skin sheet can be frozen by using a small amount of a preservation solution with or without a carrier. Specifically, it is first stored frozen in an 80 ° C freezer and then stored the next day in a 150 ° C ultra-low temperature freezer. When stored at 150 ° C, it can be stored in the form of a sheet for a long period of time, and a sufficient therapeutic effect is actually obtained. In addition, it is also possible to store at 4 ° C using a storage solution used for storage of living tissue. In this case, it is desirable to add an antioxidant substance.
  • Amniotic membrane and epidermal keratinocytes were prepared by the same procedure as in Example 1.
  • Air exposure is performed 3 days after seeding epidermal cells on the amniotic membrane. Place sterilized filter paper in a maintenance container for air exposure and filter the stratification medium. Add to the extent that the paper is immersed (approximately 9 ml). Carefully remove the culture medium inside the culture insert, transfer the culture insert onto filter paper,
  • L-glutmine 4 mM, Adenin; 0.18 mM, transfferin; 5 ug / ml, selenious acid; 53 nM, triiodothyronine; 20 pM, serine; 1 mM, choline chloride; 0.64 mM, linoleic acid; 2ug / ml, FCS; 2%
  • An amniotic membrane was prepared in the same manner as in Example 1.
  • the cornea was purchased for donors from Northwest Lions Eye Bank (Seattle, USA).
  • the cornea is transferred to a petri dish containing Dulbecco's phosphate buffer (PBS), and the annulus is cut into 2-3 mm sides with a scalpel under a stereomicroscope. Wash the minced rings several times with PBS and sterilize in 70% ethanol for 1 minute. After washing with PBS, soak in Dispase solution (Dispase II, Godo Shusei Co., Ltd., 250 units / ml Dulbecco's modified MEM medium; DMEM) and leave at 4 ° C for a period (18-24 hours). The next day, the epithelium is also peeled off with forceps under a stereomicroscope.
  • PBS Dulbecco's phosphate buffer
  • the exfoliated corneal epithelium is washed with DMEM, then with PBS, then immersed in a 0.25% trypsin solution and treated at 37 ° C for 10 minutes. Transfer the epidermis to a plastic petri dish containing trypsin neutralizing solution, loosen the epidermis with tweezers, and transfer to a 15 ml sterile tube.
  • the PBS is added to adjust the corneal epithelial cell suspension. Count the number of cells, and centrifuge for 5 minutes at lOOOrpm to precipitate the cells.
  • the endothelial cells are peeled and removed from the corneal limbal tissue, and the conjunctiva is excised.
  • cryopreservation conditions including the preservation solution composition
  • thawing conditions of the prepared corneal epithelial cells are shown below.
  • Cryopreservation conditions Reduce the temperature to -20 ° C at a rate of 1 ° C / hour and then store in a nitrogen tank.
  • Thaw conditions Thaw as quickly as possible at 37 ° C and dilute 10 times with PBS.
  • the peeled dermis is washed with DMEM and then cut into small pieces with a knife on a side 2mm.
  • the cut dermis is closely attached to the type I collagen-coated dish at an interval of about 1 cm.
  • Type I collagen solution (cell matrix type 1A: 3 mg / ml: Nitta Gelatin): 0.1N NaOH: 1 volume, 8 times concentration for 6 volumes DMEM: 1 volume, 20% FCS / DMEM: 10 volumes Prepare a neutral collagen solution (final collagen concentration: lmg / ml) at 4 ° C, add lml to a 24 mm diameter force insert (Corning-Costar), and let stand for 10 minutes at room temperature. Put it into a gel.
  • 5xl0 5 cells were grown in logarithmic culture and used as fibroblasts in the logarithmic growth phase (cells cultured by the outgrowth method from the remaining dermis after dispase treatment and exfoliation of the epidermis were used for passage 5-10). Adjust the concentration to 10% FCS / DMEM / ml and mix this cell suspension: 2 volumes with neutralized collagen solution: 8 volumes to prepare a neutralized collagen solution containing cells (collagen Final concentration: 0.8 mg / ml). Add 3.5 ml of this solution to each culture insert and leave it in a CO incubator (37 ° C, 5% CO). Gelled in about 30 minutes
  • the bottom surface of the collagen gel is in close contact with the membrane, but the upper part of the collagen gel contracts to a thickness of 2-3 mm.
  • 0 phosphoethanolamine; 0.lmM, insulin; 5ug / ml, hydrocortis one; 0.4ug / ml,
  • L-glutmine 4mM, Adenin; 0.18mM, transfferin; 5ug / ml, selenious acid; 53nM, triiodothyronine; 20pM, serine; lmM, choline chloride; 0.64mM, linoleic acid; 2ug / ml, FCS; 2%
  • Air exposure is performed 14 days after seeding of corneal epithelial cells. Place sterilized filter paper in a maintenance container for air exposure, and add the layering medium to the extent that the filter paper is immersed (approximately 9 ml). Carefully remove the culture medium inside the culture insert, transfer the culture insert onto filter paper,
  • the corneal epithelium On the third day after exposure to air, the corneal epithelium is composed of 3 to 4 layers, and the formation of the stratum corneum is observed.
  • the amnion was removed from the epithelium so that the epithelium was present and the other side was up, and the amnion was spread and adhered.
  • a stainless steel donut-shaped ring (inner diameter: 6 mm, height: 2 mm) was placed on the amniotic membrane, and the epidermal keratinocyte suspension was seeded inside (6 mm, with a hole).
  • the amniotic membrane and epidermal keratinocyte suspension were both prepared by the method described in Example 1.
  • Figure 3 shows the conditions in the petri dish on the 1st and 10th days after stratification.
  • the right column of Fig. 3 shows the results of the test group (when the epidermal keratinocytes were cultured on the amniotic membrane in close contact with the collagen gel containing fibroblasts) (upper force in the first and tenth days in order).
  • the left column shows the results of the control group (when epidermal keratinocytes were cultured on a collagen gel containing fibroblasts).
  • Cells (cell layers) are observed in a circular and spot shape in the central area of the dish.
  • the test group left column
  • the cell layer expanded greatly from day 1 to day 10. That is, it can be seen that cells proliferate well and migration to the periphery is enhanced.
  • the control group there is no noticeable change in the cell layer size on day 1 and day 10. From the above results, it has been clarified that on the amniotic membrane, the cell proliferation rate is high and the migration is markedly enhanced.
  • Proliferation and migration test of epidermal keratinocytes on amniotic membrane 2 (Combination with three-dimensional culture method) First, three-dimensional culture according to the procedure described in Example 1 (epidermis on amniotic membrane adhered to collagen gel) Culture of keratinocytes and subsequent air exposure) was carried out, and a cell layer was formed on the amniotic membrane to produce a cultured epidermis sheet (7 days after the start of stratification by air exposure). On the other hand, on the collagen gel containing fibroblasts, the amnion from which the epithelium was present was placed in an expanded state so that the side where the epithelium existed was placed in close contact.
  • the cultured skin sheet was cut into a circle having a diameter of about 8 mm, placed on the amniotic membrane on the collagen gel containing fibroblasts, and allowed to stand. Then, the spread of the epidermal keratinocyte layer to the surroundings was observed after 1, 7, 10, and 14 days. Same conditions except not using amniotic membrane Cell layer obtained by three-dimensional culture without using amniotic membrane (control group l) (cell layer obtained by seeding epidermal keratinocytes directly on collagen gel and then culturing)
  • control group 2 Those directly placed on a collagen gel containing fibroblasts (control group 2) were used for comparison. Both the amniotic membrane and the epidermal keratinocyte suspension were prepared by the method described in Example 1.
  • Figure 4 shows the conditions in the petri dish on the 1st, 7th, 10th, and 14th days from the start of culture.
  • the left column of Fig. 4 shows the results of the test group (when the cultured epidermis sheet is placed on the amniotic membrane in close contact with the collagen gel containing fibroblasts and cultured) (upper force in the first, seventh, 10th day and 14th day).
  • the middle column shows the results of control group 1 (when a cultured skin sheet is placed on a collagen gel containing fibroblasts and cultured).
  • the right column shows the results of control group 2 (when a cell layer obtained by three-dimensional culture without using amniotic membrane is placed on a collagen gel containing fibroblasts and cultured). .
  • FIG. 4 cells (cell layers) are observed in the center of the petri dish.
  • the cell layer has expanded significantly over time. That is, it can be seen that the cells proliferate well and the migration to the periphery is enhanced.
  • the force with which the cell layer slightly expands over time is greatly different from that in the test group.
  • control group 2 right column
  • Three-dimensional cultured epidermis sheets prepared in advance are transplanted by patch graft (for example, one patch is 15 mm in diameter) And). Fix for 3 days, and then disinfect once every 2 days (0.05% hibiten water, disinfectant isodine solution).
  • the cells constituting the three-dimensional cultured epidermal sheet are considered to proliferate and migrate well by being transplanted onto the amniotic membrane. As a result, the cell layer is expected to expand rapidly, and a high therapeutic effect is expected.
  • the use of the biological tissue sheet provided by the present invention can be utilized for regeneration (reconstruction) of wide skin epidermis, corneal epithelium, oral mucosal epithelium, airway mucosal epithelium and intestinal mucosal epithelium. Among these, it can be suitably used for regeneration of the skin epidermis or corneal epithelium.
  • the biological tissue sheet of the present invention can be used for gene therapy.
  • gene therapy There are two types of gene therapy, in vivo and ex vivo.
  • the former is a method in which a gene is directly introduced into a living body, and the latter is a method in which a cell is taken out and the gene is introduced and then returned to the body.
  • cultured skin, cultured corneal epithelium, cultured As long as the gene is introduced into the intestinal mucosal epithelial sheet, it will immediately develop into an ex vivo method.

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Abstract

　高い治療効果が望めるとともに移植時の安全性が高い生体組織シートを提供する。(a)生体由来細胞を調製し、(b)前記生体由来細胞を羊膜上に播種し、(c)異種動物細胞非存在下、前記生体由来細胞を培養して増殖させることによって、生体組織シートを作製する。生体由来細胞としては例えば、角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜、気道粘膜又は腸管粘膜由来の細胞を使用する。

Description

明 細 書
生体組織シート及びその作製方法、並びに同シートを用いる移植方法 技術分野
[0001] 本発明は生体組織シートに関する。詳細には、本発明は、異種動物由来細胞をフ ィーダ一細胞として使用することなぐ角結膜上皮細胞、皮膚表皮細胞、毛包上皮細 胞、口腔粘膜上皮細胞、気道粘膜上皮細胞や腸管粘膜上皮細胞などの生体由来 細胞を羊膜上で培養 '増殖させることによって作製される生体組織シート及び同シー トの作製方法、並びに同シートの利用（移植方法等）に関する。
背景技術
[0002] 皮膚は生体の最外層を覆う器官であり、外界力 生体を防御する一種のバリアであ る。皮膚は、表皮、真皮、および皮下組織から構成されており、表皮は主として角化 細胞力 なり、これに色素細胞、ランゲルノ、ンス細胞などが少数混在する。表皮を構 成する細胞は主に角化細胞であり、（1)最外層を占める、核の消失した角質細胞、（2) その下層にある核を有する細胞 (顆粒細胞、有棘細胞、基底細胞)よりなり、さらに最 下層の基底細胞と真皮の間に表皮基底膜が存在する。基底層は一層の細胞層で、 表皮角化細胞の母細胞層であり、分裂能力を有する細胞は基底細胞のみであると考 えられている。
[0003] 表皮が何らかの理由により失われた状態が潰瘍である。表皮の欠損した部位では、 周辺からの角化細胞の増殖や、一部毛包由来の角化細胞の増殖によって表皮が再 生され潰瘍面は上皮化する。しかし、一度に広範囲の表皮欠損が生じる熱傷や、難 治性の深い、毛包の欠如した潰瘍では周辺からの表皮の再生のみでは上皮化に時 間がかかる。
[0004] 基底層の細胞周期は約 450時間である。分裂により生まれた娘細胞は有棘層へと 移動するに伴い形態的、機能的に変化し、さらに顆粒層を経て角化し角層となり、最 終的には体外に脱落する。脱落するまでの時間を turnover timeといい、 47-48日と みられている。
[0005] 現在一般的に認められている表皮の再生モデルでは表皮角化細胞をその分裂能 力より、 stem cell (幹細胞）、 transit- amplifying cell (移行増殖期細胞）、 post— mitotic cell (分裂後細胞）の 3種類に分類している。 stem cellとは、無限の自己再生能力を有 する細胞で、分裂により transit- amplifying cellを生み出す。 Transit- amplifying cellは 一定の分裂能力を有し、分裂後、 transit-amplifying cellとなる力 最終的に分裂能力 を失 ヽ、 post— mitotic cellとなる。
[0006] 表皮の stem cellは以下の特徴を有しているとされている。（l)stem cellそのものは細 胞周期が長い (slow cycling) o (2)部位により存在場所が異なる。（3)集合して存在する 。（4) α 2 |8 1および α 3 |8 1インテグリンを強く発現する。しかし、基底細胞では約 40% の細胞力 Sインテグリンを強く発現しており、実際には stem cellは基底細胞の約 10%程 度と推定されている。つまり、基底層には stem cellのみではなぐ transit— amplifying cell, post— mitotic cellも存在しているということである。
[0007] 表皮が傷害を受けた場合、増殖刺激が起こり、細胞は盛んに増殖を始め再生が開 始される。このとき、最も重要な役割を担っているのがー連の上皮細胞成長因子群で ある。上皮細胞成長因子（epidermal growth factor, EGF)ファミリー〖こは、 EGF、トラン スフォーミング増殖因子（transforming growth factor, TGF)— a、へパリン結合性 EGF様増殖因子（heparin binding EGF like growth factor, HB— EGF)、ベタセルリン（ betacellulin)、アンフィレギュリン（amphiregulin)、ニューレグリン（neuregulins)が含ま れるが、実際に表皮角化細胞の増殖に関係するものは TGF— a；、 HB— EGF、アンフィ レグリンであると考えられており、これらの因子は表皮角化細胞に対して自己増殖的 に作用することが示されている。逆に、表皮角化細胞の増殖に対して抑制的に作用 する因子としては TGF— j8、ビタミン D、レチノイン酸 (retinoic acid)などが知られてい
3
る。
[0008] 再生医学の分野において、ヒト皮膚において真皮、上皮の全層が欠損した損傷部 位を移植するための移植片の開発が進められている。例えば、特開平 10— 277143 号公報 (特許文献 1)には、ヒト皮膚等の全層欠損創を治療するための移植片及びそ の製造方法が記載されている。当該文献に開示される移植片は、ヒトのフイブリンシ ート内に真皮組織由来の線維芽細胞を包埋し、表皮組織をこのシートの表面に付着 して作られる。 従来、皮膚欠損の修復には皮膚全層を移植する全層植皮と、表皮と真皮上層を移 植する分層植皮が行われているが、採取部位の大きさに制限がある。その点、培養 表皮は一度小皮膚片を採取するだけで数千倍の皮膚面積が得られるという利点が あり、また、凍結保存が可能であるため繰り返し使用できることは従来の植皮術と比 較すると最大の利点であると思われる。
表皮シートは使用する細胞の由来によって自家培養表皮シートと他家培養表皮シ ートに分かれる。自家培養表皮シート移植は表皮欠損部位を被覆し、生着させること を主な目的とする場合が多ぐ一方、他家培養表皮シート移植は、生物学的被覆材 料 (biological dressing)としての効果を期待する場合が多い。表皮細胞の基礎的研 究から、表皮角化細胞は様々な細胞成長因子、サイト力インを産生することが明らか となり他家培養表皮シートの有効性が判明している。
[0009] 培養表皮を安全かつ安定的に供給する技術が完成すれば、移植技術の進歩と相 まって再生医療が実用化され、患者への福音は計り知れない。表皮の再生を考えた 場合、分裂 ·増殖能を有する基底細胞を分離 '培養し、大量に増殖させて表皮を再 生させ、移植に用いるということは非常に理にかなつたものであるといえる。しかし、基 ホ田胞には stem cellの ではな \、 transit— amplifying cell、 post— mitotic cellも ま れており、より効率の良い培養皮膚の作製には表皮 stem cellを選択的に培養する技 術の確立が望まれるところである。
これまでに多くの研究者によって表皮細胞を培養する技術の研究 *開発が試みら れ、その成果は皮膚生物学の分野において多大な恩恵をもたらした。具体的には、 培養角化細胞を用いることで、表皮細胞の特性、表皮の再生、分化、増殖機構が急 速に明らかになりつつある。一方で、患者より小皮膚片を採取し、角化細胞を継代培 養し、大量に増殖させることが可能となり、また凍結保存ができるようになったことから 、広範囲熱傷、難治性潰瘍などの治療に培養皮膚が用いられつつある。
[0010] 皮膚と並んで再生医療の貢献が期待されている組織の一つが角膜である。角膜は
、眼球を構成する光学系の最も外層にあり、透明な血管のない組織であって、涙液と 共に平滑な表面を形成することにより良好な視力を得ることに貢献している。また、角 結膜上皮細胞は常に外界と接し、外界の微生物などの異物、紫外線などの光線など 力 眼球を守る防御作用を持っている。すなわち、角結膜上皮細胞は、角膜の透明 性と眼球全体を防御し恒常性を維持するために極めて重要な役割を果たして 、る。
[0011] 角膜は、例えば、角膜炎、角膜潰瘍、穿孔等の病態により濁り、透明性が失われて しまう場合がある。このような角膜の濁りによる永続的な視力の低下に対しては、眼球 提供者カゝら提供された角膜を用いる角膜移植による治療が行われている。角膜移植 は、患者の透明性が失われた角膜を取り除いた後、透明な角膜を移植するというもの であって、この移植により透明性が回復し、再び視力を取り戻すことができる。
このような角膜移植によって効果的な治療効果が期待できる場合がある一方で、角 膜の移植だけでは対処できない疾病が存在する。例えば、ステイーブンス 'ジョンソン 症候群、眼類天疱瘡、化学外傷、熱傷などである。通常、角結膜上皮細胞は、毎日 分裂を繰り返し、古くなつた細胞は、はがれ落ち、幹細胞組織から新たな細胞が再生 される。ところが以上のような病態では、角膜を再生させる幹細胞組織に障害がある ことがわかってきている。
[0012] 角膜上皮を再生させる幹細胞組織は「角膜輪部組織」と呼ばれ、ちょうど黒目と白 目の境界部分に限局し、外界に露出された特殊な環境にある。上述した病態では、 この幹細胞組織自体がなんらかの障害を受けて根絶してしまうと考えられて 、る。そ して、この幹細胞組織の根絶により、その欠損部分は周りに存在する結膜上皮で覆 われ、透明性に欠け、視力の極端な低下力あたらされる。このように、上述の病態で は角膜輪部が枯渴しているため、単に角膜を移植するだけでは移植された角膜を長 期に維持できない。そのため、恒久的な眼表面再建を図るためには、角膜輪部をも 移植する必要がある。この角膜輪部を移植する方法の一つとして、羊膜移植法が開 発されている（メディカル朝日 1999年 9月号： p62— 65、 N Engl J Med340 : 1697 一 1703、 1999 :非特許文献 1)。この移植法に用いられる羊膜は、帝王切開した妊 婦等の胎盤から得られる。羊膜は厚い基底膜をもつことから、移植された場合、角結 膜上皮細胞が増殖、分化するための基質として作用する。さらに、羊膜は免疫原性 がほとんどなぐ抗炎症、瘢痕形成抑制などの作用を併せ持つことから、羊膜上に移 植される角結膜上皮やこれらの幹細胞組織は移植受容者 (レシピエント）の拒絶反応 等カゝら保護されることになる。 [0013] 特許文献 1 :特開平 10— 277143号公報
非特許文献 1：メディカル朝日 1999年 9月号： p62— 65、 N Engl J Med340 : 1697 一 1703、 1999
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0014] 表皮角化細胞の培養は従来困難なものとされていたが、 1975年、 Rheinwaldと
Greenによりマウス 3T3フィーダ一レイヤー法が発表され、初めて表皮角化細胞の培 養が可能となった。この方法はマウス 3T3細胞をフィーダ一レイヤーとして用いること や、牛胎仔血清を使用するためにロット間での差がみられることなどにより培養は決し て容易なものではなかった。 1980年代になり、 Henningsと Yuspaは培養液中の Ca2+濃 度を低くすると表皮角化細胞が未分化状態となり増殖が亢進することを示した。さら に Boyceと Hamは低 Ca2+濃度培地である MCDB153培地を開発し、牛下垂体抽出液 を添加することでヒト表皮角化細胞の無血清培養法が可能であることを示した。 1986 年には Pittelkowらは無血清培養法を用いて表皮角化細胞を培養し、さらに牛胎仔血 清添加高カルシウム培地に変更することで培養表皮シートを作製し熱傷患者に移植 し良好な成績を得た。現在ではこの無血清培養法が主流であるが、異種動物由来の 3T3細胞がフィーダ一レイヤーとして用いられている。異種動物由来の細胞の共存下 で培養して得られる移植片では異種動物由来の産物が夾雑する危険性が存在する 。従って、当該移植片を用いた移植術は異種移植ないしはそれに準ずるものとして 捉えられ、倫理的、安全上に大きな問題があるとされている。事実、医療現場におい て異種移植が実用化された例はな ヽ。
[0015] 培養表皮シート移植は切手大の皮膚より角化細胞を継代培養することにより広範 囲の創面を覆うことを可能とした。また、凍結保存可能であるため、繰り返し移植を必 要とする難治性、再発性皮膚潰瘍治療に応用できる。従来の培養法で作製された培 養シート、たとえば、移植された培養表皮シートを良好に生着させることは必ずしも容 易なことではない。それは培養表皮シートが基底膜の構成成分を欠き、重層化した 表皮が強固な角層を形成していないことによるものである。その点、 Bellにより開発さ れた三次元培養皮膚は角層、顆粒層も認められ現時点では皮膚に最も近い培養皮 膚であるが、手技の煩雑さ、特殊技術の必要性より、いまだ本邦では普及していない 。三次元培養皮膚は海外にお!、てはすでに他家移植で有効性が示され商品化され ている。しかし、他家移植では上皮化の促進作用は認められる力 永久的な生着は 期待できない。本邦においては倫理面、安全性の確認の点で他家移植は普及する 見込みが少なく自家移植の改善に焦点が当てられてきている。
[0016] 一方、角膜が結膜上皮で覆われ混濁を生じる眼表面疾患に対する外科的治療とし ては、現在は角膜上皮移植術が行われているが、強い炎症を伴った難治性角結膜 疾患 (Stevens-Johnson症候群や眼類天疱瘡、角膜腐食など）においては、その予後 が極めて不良である。その最大の理由として、強い抗原性を有する異系（ァ口）の角 膜上皮が宿主の免疫系に認識され拒絶を受けることが挙げられる。更に、拒絶反応 の予防のため術後に多量の免疫抑制剤を全身及び局所投与することによる合併症 もその予後不良の大きな要因となっている。一方、ァ口の角膜上皮を利用する場合に は、ドナー不足の問題がある。一眼力も得られる角膜を用いて数十の角膜上皮シート の作製できる技術を達成すればドナー不足の課題は解決される。
課題を解決するための手段
[0017] 本発明は以上の背景及び課題に鑑みてなされたものであって、高い治療効果が望 めるとともに移植時の安全性が高い生体組織シートを提供することを目的とする。力 力る目的の下、本発明者らはまず培養表皮シートの作製を試みた。具体的には、安 全性を考慮して上皮細胞の培養時に異種動物由来の細胞 (フィーダ一細胞）を使用 しない条件とした上で、従来の培養表皮シート自家移植の発展系として三次元培養 皮膚を作製し、基底膜構成成分、細胞接着分子、分化抗原について免疫組織学的 ならびに電子顕微鏡的に検討した。その結果、従来の培養表皮シートと比較して、強 固な角層の形成が認められ、細胞接着分子、分ィ匕のマーカーは vivo表皮と同様に十 分に発現していた。基底膜構成成分については、へミデスモゾームの形成は良好で 、類天疱瘡抗原、）8 4インテグリンは十分に発現していた。
培養表皮シートの生着性についてはその基底膜の構成成分の形成に左右される。 すなわち、培養表皮シートは、プラスチックシャーレの底面に密着し培養されており、 シートを作製する際にシャーレ底面より剥離する必要がある。この剥離にはディスパ 一ゼゃコラゲナーゼを用いるがこれらの酵素により基底膜の構成成分は分解される。 これまでの報告では、デイスパーゼにより類天疱瘡抗原はウェスタンプロットで検出で きなくなり、蛍光抗体法では GB3モノクローナル抗体で認識されるラミニン 5が分解さ れる。また、コラゲナーゼでは係留線維や IV型、 VII型コラーゲンの発現が減少する 力 α 6 18 4インテグリンは影響をうけないことが報告されている。これに対して、三次 元培養皮膚は vivo表皮に近い構築を保っており、基底膜の構成成分の形成が認め られる。本発明者らの検討においても、 j8 1インテグリン、 j8 4インテグリン、類天疱瘡 抗原は比較的良好に形成されていることが判明し、電子顕微鏡所見においてもへミ デスモゾームは良好に形成していることが確認された。
[0018] 次に本発明者らは、培養表皮シートと同様の手法によって他の組織に適用可能な 移植材料を作製できるか否かを検討した。具体的には角膜上皮シートの作製を試み た。その結果、線維芽細胞を含有したコラーゲン上に載置した羊膜上で角膜上皮細 胞を培養することによって、フィーダ一細胞を使用することなぐ良好な重層化及び上 皮化が達成された。
以上のように本発明者らは、異種動物由来の細胞を全く用いな 、安全で実用的な 生体組織シートの作製に成功した。また、無血清培養条件下においても生体組織シ ートを作製可能であることを見出した。
[0019] 更に本発明者らは、表皮細胞の培養基質として羊膜が特に優れているとの仮定の 下、種々の実験を行った。まず、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルに羊膜を密着さ せ、その上にヒト表皮角化細胞 (ケラチノサイト）を播種し、周辺へのヒト表皮角化細胞 の遊走を観察したところ、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に細胞を直接播種し た場合 (コントロール群）に比較して著明に遊走が亢進していた。一方、線維芽細胞 を含むコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で培養したヒト表皮角化細胞を羊膜ととも に回収し、その後、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルに密着させた別の羊膜上に載 置し、周辺へのヒト表皮角化細胞の遊走を観察したところ、線維芽細胞を含むコラー ゲンゲル上に載置した場合 (コントロール群）に比較して著明に遊走が亢進して 、た 。これらの実験結果から、羊膜上では表皮角化細胞の増殖が良好で、且つ細胞の遊 走能力も良好に発揮されることが見出された。即ち、表皮角化細胞の培養基質として 羊膜が極めて優れていることが明ら力となった。また、この知見に基づけば二通りの 移植術、即ち (1)線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で培養した 表皮角化細胞を羊膜とともに回収し、その後、別の羊膜上に載置し培養することによ つて得られるシート状構築物 (羊膜 (第 1の羊膜)の片面に別の羊膜 (第 2の羊膜)が 接着しており、且つ一部で第 1の羊膜を被覆し、他の一部では第 2の羊膜を被覆する 細胞層を備える構築物）を表皮欠損部に移植する方法、及び (2)線維芽細胞を含む コラーゲンゲル上に載置した羊膜上で培養した表皮角化細胞を羊膜とともに回収し、 それを、予め皮膚欠損部に移植した別の羊膜上に移植する方法が優れた表皮再建 術となると考えられた。ここで、真皮全層及び皮下組織までの欠損では保存的治療 ではなかなか上皮化しないため、まず移植床を整える必要がある。真皮の欠損には 従来、人工真皮が用いられており、ある程度の治療効果が得られている。人工真皮 では血管の再生がみられるが、その上に培養表皮を移植する場合、基底膜の構成 が不十分であることにより生着が不良になることが指摘されている。一方、人工真皮 移植と組み合わせて上記の (1)又は (2)の移植術を用いれば、基底膜構成成分を有す る羊膜を介して培養表皮が移植されることになる力 高い生着率を期待できる。しか も、羊膜上に培養表皮が形成された状態となることから、移植後、培養表皮を構成す る細胞の良好な増殖及び周辺への遊走が促され、その結果、培養表皮が速やかに 伸展することで高い治療効果が得られる。従って、広範囲の皮下組織にまで至る皮 膚欠損に対しても、人工真皮移植と上記移植術を組み合わせることによって整容的 にも優れた治療法を確立できると期待される。
本発明は以上の成果及び知見に基づいて完成されたものであって、次の構成を提 供する。
即ち本発明は、異種動物細胞非存在下、羊膜上で増殖させた生体由来細胞を含 有してなる生体組織シートを提供する。
本発明の一態様では、ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上に羊膜を載置し た状態で生体由来細胞を増殖させる。これによつて、生体由来細胞の増殖率の向上 が図られる。
生体由来細胞を増殖させるときの培地として、（1)無血清培地、又は (2)血清成分とし て、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を使用することができる。
生体由来細胞は好ましくは、角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘 膜、気道粘膜又は腸管粘膜由来の細胞である。
培養基質としての羊膜には、上皮が除去された羊膜を使用することが好ましい。
[0021] 本発明の一態様では、増殖した細胞に加えて、培養基質としての羊膜を含有して 生体組織シートが構成される。
本発明の生体組織シートは例えば、直接、又は培養基質として使用した羊膜とは 別の羊膜を介して組織欠損部に移植される。後者の場合、典型的には組織欠損部 に対して羊膜 (第 2の羊膜、即ち生体組織シートの作製に使用する羊膜とは別の羊 膜)を移植した後、当該羊膜の上に生体組織シートを移植することになる。
本発明の更なる一態様の生体組織シートは、異種動物細胞非存在下、ヒト線維芽 細胞を含有するコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で増殖させた生体由来細胞を 前記羊膜とともに第 2の羊膜上に載置し、更に増殖させて得られる細胞を含有するこ とを特徴とする。
[0022] 本発明はさらに、生体組織シートの作製方法を提供する。本発明の作製方法の一 態様は、以下のステップを含む。即ち、（a)生体由来細胞を調製するステップ; (b)前記 生体由来細胞を羊膜上に播種するステップ；及び (c)異種動物細胞非存在下、前記 生体由来細胞を培養して増殖させるステップである。
本発明の一態様では、前記ステップ bとして、以下のステップが実施される。即ち、 (b-1)コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養するステップ;及び (b- 2)前記コラーゲ ンゲル上に羊膜を載置した後、前記生体由来細胞を該羊膜上に播種するステップで ある。
本発明の他の一態様では、（d)前記生体由来細胞が増殖した後、最表層を空気に 接触させるステップが更に実施される。このステップによって、細胞層の角化（上皮化 )が促される。
本発明の更に他の一態様では、（e)前記生体由来細胞を前記羊膜とともに回収する ステップ;及び！)回収した前記生体由来細胞及び前記羊膜を、羊膜側を下にして第 2 の羊膜上に載置した後、前記生体由来細胞を培養して増殖させるステップが更に実 施される。即ち、 2段階の培養が実施される。
ステップ cを実施する際の培地として、（1)無血清培地、又は (2)血清成分として、レシ ピエントに由来する血清のみを含む培地を使用することができる。
生体由来細胞は好ましくは、角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘 膜、気道粘膜又は腸管粘膜由来の細胞である。
培養基質としての羊膜には、上皮が除去された羊膜を使用することが好ましい。
[0023] 本発明は更に、以下のステップ、即ち (A)皮膚表皮細胞を羊膜上に播種するステツ プ； (B)前記皮膚表皮細胞を培養して増殖させるステップ；及び (C)増殖した皮膚表皮 細胞を回収するステップを含む、皮膚表皮細胞の調製方法を提供する。
図面の簡単な説明
[0024] [図 1]実施例 1の方法で作製した三次元培養皮膚シート (培養表皮シート）のへマトキ シリン 'ェォジン染色像 (エアーリフティング後 8日目）を示す図である。上層から順に 、表皮角化細胞層、羊膜、繊維芽細胞を含むコラーゲンゲル (マトリクス)である。表 皮角化細胞層では、下から順に基底細胞層、有棘細胞層、顆粒層、角層が整然と構 成されており、ヒト正常表皮に非常に近 、形態を示して!/、る。
[図 2]実施例 2の方法で作製した三次元培養皮膚シート (培養表皮シート)のへマトキ シリン 'ェォジン染色像 (エアーリフティング後 8日目）を示す図である。羊膜上に播種 されたヒト表皮角化細胞は一層の基底細胞層と 5— 6層の細胞層からなっており、角 層の形成も認められ、表皮が再構成されている。
[図 3]表皮角化細胞の増殖及び遊走に対する羊膜の効果について試験した結果を 示す図である。右欄が試験群 (線維芽細胞を含むコラーゲンゲルに密着させた羊膜 上で表皮角化細胞を培養した場合)の結果 (上力 順に 1日目、 10日目）である。左 欄はコントロール群の結果である。
[図 4]表皮角化細胞の増殖及び遊走に対する羊膜の効果について試験した結果を 示す図である。左欄が試験群 (線維芽細胞を含むコラーゲンゲルに密着させた羊膜 の上に培養表皮シートを載置し、培養した場合)の結果 (上から順に 1日目、 7日目、 10日目、及び 14日目）である。中央欄はコントロール群 1 (線維芽細胞を含むコラー ゲンゲル上に培養表皮シートを載置し、培養した場合)の結果である。同様に右欄は コントロール群 2 (羊膜を使用せずに三次元培養して得られた細胞層を、線維芽細胞 を含むコラーゲンゲル上に載置し、培養した場合)の結果である。
発明を実施するための最良の形態
[0025] 本発明は、次の構成力もなる生体組織シートを提供する。即ち、異種動物細胞非 存在下、羊膜上で増殖させた生体由来細胞を含有してなる生体組織シートである。 生体由来細胞は細胞層を形成して 1、る。以下に本発明の生体組織シート及びその 製法の特徴を詳述する。
[0026] 本発明の生体組織シートは、（a)生体由来細胞を調製するステップ、（b)前記生体由 来細胞を羊膜上に播種するステップ、（c)異種動物細胞非存在下、前記生体由来細 胞を培養して増殖させるステップを含む方法によって作製される。
ステップ aでは生体由来細胞を調製する。生体由来細胞としては、最終的に得られ る生体組織シートの用途に適合した細胞を使用する。例えば皮膚表皮組織の再生 用のシートを作製する場合には、皮膚表皮細胞 (その幹細胞、前駆細胞を含む)や 毛包上皮細胞 (その幹細胞、前駆細胞を含む)などが好適に使用される。同様に、角 膜上皮組織の再生を目的とする場合には角膜上皮細胞 (その幹細胞、前駆細胞を 含む）が好適に使用され、粘膜上皮組織の再生を目的とする場合には粘膜上皮細 胞 (その幹細胞、前駆細胞を含む）が好適に使用される。粘膜上皮細胞の例としては 口腔粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞、気道粘膜上皮細胞などを挙げることができ る。
生体由来細胞の調製方法について、皮膚表皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上 皮細胞、腸管粘膜上皮細胞及び気道粘膜上皮細胞を例に採り説明する。
(皮膚表皮細胞）
まず、皮膚の採取にあたっては、あら力じめ採取部位を予防的にポビドンョードなど の消毒薬にて消毒し、抗真菌剤の外用塗布を行った後、小皮膚片を皮膚生検に準 じて採取する。表皮角化細胞の培養にあたってはハサミで皮膚片力 脂肪組織と真 皮をできる限り取り除き、ダルベッコリン酸緩衝液 (PBS)にて数回洗浄する。 70%エタ ノールに 1分間浸し滅菌する。短冊状に切り、デイスパーゼ液に浸し、 4°Cでー晚静 置する。ついで表皮を真皮から剥離する。剥離した表皮を、洗浄後、表皮片をほぐし 、表皮角化細胞浮遊液を調整する。細胞を無血清培地に懸濁し、コラーゲンコートシ ヤーレに播種し、継代培養を行う。
[0027] (角膜上皮細胞）
角膜上皮細胞は角膜輪部組織力ゝら得ることができる。例えば角膜輪部組織力ゝら内 皮細胞を剥離除去し、結膜を切除し単一細胞懸濁液を作製する。そしてこれを窒素 タンクで保存し、その後急速に 37°Cで融解して角膜上皮細胞浮遊液を調整する。必 要に応じて継代培養する。継代培養には、例えば無血清培地である EpiLife™ (カス ケード社)、 MCDB153培地（日水製薬株式会社)やこれらの培地のアミノ酸組成等を 改変して作製される培地などを使用することができる。
[0028] (口腔粘膜上皮細胞）
口腔粘膜上皮細胞としては歯根部に存在する細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）、口 唇部の細胞、口蓋部の細胞、頰部の細胞などが用いられる。中でも口腔内縁粘膜上 皮細胞はその増殖能が高ぐまた抗原性が低いことから、これを用いることが特に好 ましい。口腔粘膜上皮細胞は、目的とする細胞が存在する場所をメスなどで切除した り、搔爬したりすることにより採取することができる。口腔内縁粘膜上皮細胞にあって は、抜歯に付着している口腔粘膜上皮をエナメルセメント移行部より分離し、これより 採取することができる。尚、結合組織などの不純物を除去するために、デイスパーゼ やトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好まし!/、。
[0029] (腸管粘膜上皮細胞）
腸管粘膜上皮細胞は大腸内視鏡下腸管上皮生検組織より採取、または開腹手術 時に通常の手法で採取される。また、組織より lazer capture microdissectionにより上 皮細胞を切除することもできる。食道、胃、十二指腸、小腸、大腸のヒトの全ての消化 管上皮細胞を用いて作製される生体組織シートについても本発明の技術は適用され る。潰瘍や炎症などでヒトの消化管上皮が傷害を受けた時、骨髄由来細胞が緊急事 態に対応するレスキュー的な役割を果たし、上皮が修復される。消化管上皮細胞も 一部とはいえ骨髄力 作られる。この意味で本発明の意義は角膜上皮細胞を用いる ものと同等とみなすことができる。通常はわずか 1000個に数個程度しかない骨髄から できる上皮細胞が、胃潰瘍、大腸炎などでできた消化管内面の潰瘍 (傷口)が治って いく過程では 50倍から 100倍にも増え、概ね 10個に 1個の消化管上皮細胞が骨髄由 来であることが判明している。ここで作製される消化管粘膜上皮細胞由来生体組織 シートは難病に指定されている重症腸管感染症、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベー チェット病などの腸疾患の治りにくい潰瘍、炎症に対して、腸管上皮の再生を促す意 味でもすこぶる有意義と考えられる。腸管アレルギーに対しての有用性も期待される
[0030] (気道粘膜上皮細胞）
気道粘膜上皮細胞は気道粘膜の生検組織より容易に得られ、前述の組織同様に 結合組織などの不純物を除去するために、デイスパーゼゃトリプシンなどの酵素によ る処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。気道粘膜上皮細胞は j8デフェンシ ンの生合成、放出などを介し、各種感染症の病態進展に重要な働きを担う。また、喘 息やアレルギー疾患にお 、ても気道粘膜上皮の果たす役割は高!、。組織障害を受 けた気道粘膜に本発明になる気道粘膜上皮細胞から作製される生体組織シートを 提供することは、緊急時対応を超え、人口気道の提供にも繋がるものである。特に羊 膜上に作製されたシートの持つ免疫抑制作用は有益である。
[0031] 口腔粘膜上皮細胞や腸管粘膜上皮細胞などは特に、組織の採取後、結合組織な どの不純物を除去するために、デイスパーゼゃトリプシンなどの酵素による処理や、フ ィルター処理を施すことが好まし 、。
[0032] 生体由来細胞は、生体組織シートの移植を受ける者 (レシピエント)力も調製するこ とが好ましい。即ち、生体由来細胞のドナーと、生体移植シートのレシピエントが同一 人であることが好ましい。このような自家細胞を用いることにより、免疫拒絶の問題が 解消される。
[0033] 調製された生体由来細胞は、羊膜上に播種 (載置)され (ステップ b)、その後培養 に供される (ステップ c)。
「羊膜」とは、哺乳動物において子宮と胎盤の最表層を覆う膜であって、コラーゲン に富む実質組織上に基底膜、上皮層が形成されて構成される。羊膜としてヒト羊膜を 使用することが好ましい。ヒト羊膜は、例えば分娩時に後産として得られるヒト胎仔膜 、胎盤など力 採取することができる。具体的には、分娩直後に得られるヒト胎仔膜、 胎盤及び臍帯からなる一体物を処理、精製することによりヒト羊膜を調製することがで きる。処理、精製方法は、特開平 5—5698号に記載される方法などの公知の方法を 採用できる。すなわち、分娩時に得られる胎仔膜より羊膜を剥離し、超音波洗浄等の 物理的処理及び酵素処理などにより残存組織を除去し、適宜洗浄工程を経てヒト羊 膜を調製することができる。
このように調製したヒト羊膜は、使用時まで凍結して保存しておくことができる。ヒト羊 膜の凍結は、例えば- 80°C、 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)とグリセ口 一ルとを体積比で等量混合した液中で行うことができる。凍結保存することにより操作 性が向上することは勿論のこと、抗原性が低下することも期待できる。
[0034] 羊膜をそのまま利用することもできるが、羊膜から搔爬処理などによって上皮を除 去したものを利用することが好ましい。例えば、上記のように凍結保存したヒト羊膜を 解凍した後、 EDTAやタンパク分解酵素で処理して細胞間の接着を緩め、そしてセル スクレイパーなどを用いて上皮を搔爬することにより、上皮が除去されたヒト羊膜を調 製することができる。
上皮を除去したヒト羊膜を利用する場合には、上皮を除去して表出した面側 (即ち、 基底膜側）に生体由来細胞を播種することが好ましい。この面側には、 IV型コラーゲ ンがリッチに含まれており、播種された生体由来細胞の増殖、重層化が良好に行わ れると考えられるカゝらである。
[0035] 生体由来細胞は、例えば細胞密度が約 1 X 103個 Zcm2以上、好ましくは約 1 X 103 個 Zcm2—約 1 X 107個 Zcm2、更に好ましくは約 1 X 104個 Zcm2—約 1 X 106個 Zcm2と なるように羊膜上に播種される。
[0036] 好適な一態様では、予め調製したヒト線維芽細胞含有コラーゲンマトリクス上に羊 膜を載置し、その後、羊膜上に生体由来細胞を播種し、培養する。即ち、この態様で は、コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養するステップ (ステップ b-l)、及び前記 コラーゲンゲル上に羊膜を載置した後、前記生体由来細胞を該羊膜上に播種 (載置 )するステップ (ステップ b- 2)が実施される。このような手順で作製された生体組織シ ートは、ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で増殖させた 生体由来細胞を含有することとなる。この態様の生体組織シートは、コラーゲンマトリ タスごと移植材料として用いることもできる。また、コラーゲンマトリクスを除去した後に 移植材料として用いることもできる。或いは、コラーゲンマトリクス及び羊膜を除去した 後に移植材料として用いてもょ ヽ。
「コラーゲンゲル」はヒト線維芽細胞の培養基質として機能する。コラーゲンゲルの 原材料となるコラーゲンの種類は特に限定されず、 I型コラーゲン、 III型コラーゲン、 IV型コラーゲンなどを用いることができる。複数の種類のコラーゲンが混在するものを 用いることもできる。これらのコラーゲンは、ブタ、ゥシ、ヒッジなどの動物の皮膚、軟 骨などの結合組織から、酸可溶化法、アルカリ可溶ィ匕法、酵素可溶化法などにより抽 出、精製することができる。尚、抗原性を低下させる目的から、ペプシンやトリプシン などの分解酵素で処理することによりテロペプチドを除去した、いわゆるァテロコラー ゲンとしたものを用いることが好ましい。コラーゲンゲルの材料として羊膜由来、特に ヒト羊膜由来のコラーゲンを用いてもよい。ここで、羊膜由来とは、広く羊膜を出発原 料として得られたものであることを意味する。
[0037] コラーゲンゲルが含有するヒト線維芽細胞の由来は特に限定されず、コラーゲンを 産生するものであればいずれの組織由来のものでもよぐ例えば、皮膚組織、口腔粘 膜組織など力も調製したヒト線維芽細胞を使用することができる。
[0038] コラーゲンマトリクスの作製方法の具体例を示す。まず、以下の手順でヒト線維芽細 胞を調製する。皮膚を採取し、続いて皮膚から真皮を剥離する。真皮を細切し、 I型コ ラーゲンコートディッシュに密着させる。静置培養し、真皮片から遊走するヒト線維芽 細胞を継代する。細胞がディッシュ底面から剥離させ、細胞浮遊液を調整し、細胞培 養用ディッシュに播種する。適宜細胞を凍結保存 (例えば液体窒素中で保存)する。 一方、 I型コラーゲンを用いて中和コラーゲン液を調製する (後述の実施例を参照） 。これを培養容器 (例えばカルチャーインサート）に添加し、室温で 10分間程度静置 させてゲル化させる。次に、上述の方法によって予め培養しておいた対数増殖期のヒ ト線維芽細胞をこのゲルに混和し、再度ゲル化させる。その後、静置培養する。以上 の手順によってヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンマトリクスが得られる。この創意 工夫により、必要な強度を有し、羊膜層や生体由来細胞を載置できるコラーゲンマト リクスとなったもので、本発明の根幹をなす。コラーゲンマトリクスの上には、別途用意 した羊膜が載置 (密着)される。
[0039] 羊膜上に播種した生体由来細胞の培養 (ステップ は、異種動物細胞非存在下で 実施される。本発明において「異種動物細胞非存在下」とは、生体由来細胞を培養 する際の条件として、当該生体由来細胞に対して異種である動物の細胞が使用され ないことをいう。具体的には生体由来細胞としてヒト細胞 (例えばヒト皮膚表皮細胞や ヒト角膜上皮細胞)を使用する場合に、マウスやラット等、ヒト以外の動物種の細胞が 培養液中に存在 (併存)しな 、条件のことを 、う。このような条件で培養を実施するこ とによって、最終的に得られる移植材料 (即ち生体組織シート）に異種由来の成分（ 異種細胞自体を含む）が混入するおそれがなくなる。
生体由来細胞を培養する際に用 、られる培地は、当該細胞を増殖させるものであ れば特に限定されない。例えば、 MCDB153培地（日水製薬株式会社)や、 EpiLife™( カスケード社)、これらの培地のアミノ酸組成等を改変して作製される培地、上皮細胞 の成長に通常用いられる DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)とハム F12培 地 (Ham's F12 medium)とを所定割合で混ぜた培地などを使用することができる。特 に、本発明では無血清で且つ異種動物由来のタンパク質を含まない培地を用いるこ とが好ましい。一方、成長因子や抗生物質等が添加された培地を使用してもよい。伹 し、血清を含まない培地を使用することが好ましい。即ち、本発明における培養方法 として無血清培養法を採用することが好ましい。血清由来の成分の混入による免疫 拒絶等の問題を回避することができる力 である。尚、血清を含む培地中で培養する ことにしてもよいが、その場合には同種由来の血清 (ヒトの生体由来細胞を培養する 際にはヒト由来の血清）を使用する力、自家血清を使用することが好ましい。勿論、可 能であれば、免疫拒絶反応の惹起のおそれがなくなる自家血清を使用することが好 ましい。
生体由来細胞の良好な増殖を目的として培養ステップの途中で培養条件を変更す ることちでさる。
[0040] ステップ cの結果、羊膜上で生体由来細胞が増殖する。このようにして得られた細胞 層の表層を角化する必要がある場合 (例えば皮膚表皮細胞を用いて皮膚表皮シート を作製する場合や、角膜上皮細胞を用いて角膜上皮シートを作製する場合)には、 細胞層の表層を空気に接触させるステップ (ステップ d)が実施される。尚、このステツ プを本明細書においてエアーリフティング (Air-lifting)とも呼ぶ。このステップ dは、細 胞層を形成する細胞の分化、及びバリア機能の誘導のために行われる。
このステップは、培養液の一部をスポイト、ピペットなどを用いて一時的に除去する ことにより培養液表面を低下させ、これにより細胞層の最表層を一時的に培養液外に 露出させることによって行うことができる。又は、細胞層を羊膜ごと持ち上げて、最表 層を培養液表面から一時的に露出させることにより行うこともできる。更には、チュー ブなどを用いて空気を培養液中に送り込み、細胞層の最上層に空気を接触させても よい。操作の容易さの観点から、培養液表面を低下させて細胞層の最表層を露出さ せる方法により行うことが好まし 、。
このステップ dを行う時間、即ち細胞層の最表層を空気に接触させる時間は、細胞 の状態や培養条件などによって変動するが、例えば 3日一 3週間程度であり、好まし くは 5日一 2週間、更に好ましくは約 1週間である。
[0041] 本発明の一態様では、ステップ c (培養ステップ)の後に、（e)前記生体由来細胞を前 記羊膜とともに回収するステップと β回収した前記生体由来細胞及び前記羊膜を、羊 膜側を下にして第 2の羊膜上に載置した後、前記生体由来細胞を培養して増殖させ るステップが更に実施される。ステップ e及びステップ 1¾実施することによって、羊膜（ 第 1の羊膜)の片面に別の羊膜 (第 2の羊膜)が接着しており、且つ一部で第 1の羊膜 を被覆し、他の一部では第 2の羊膜を被覆する細胞層を備える構築物が得られる。 尚、第 2の羊膜の大きさや培養条件等を適宜調整することによって、第 2の羊膜の表 面の全体が細胞層で被覆されて!、る構築物、及び第 2の羊膜の表面の一部が細胞 層で被覆されて 、る構築物の 、ずれかを得ることができる。
[0042] ステップ eでは、培養後の生体由来細胞と、培養基質として用いた羊膜が回収され る。例えば、培養皿内に載置した羊膜上で生体由来細胞を培養した場合には、培養 後に羊膜を培養皿力 剥離することで、増殖した生体由来細胞及び羊膜を回収する ことができる。一方、コラーゲンゲル上に載置した羊膜上で生体由来細胞を培養した 場合には、培養後に羊膜をコラーゲンゲル力も剥離することで、増殖した生体由来細 胞及び羊膜を回収することができる。 [0043] ステップ reは、回収した生体由来細胞と羊膜を、別の羊膜上に載置した後、生体 由来細胞を再び培養する。このように、当該態様では二段階の培養 (ステップ C及び ステップ£)が実施される。
ステップ reはまず、回収した生体由来細胞と羊膜からなる構築物（以下、「細胞-羊 膜構築物」という）が、羊膜側を下にして、別途用意した羊膜 (第 2の羊膜)上に載置 される。複数個の細胞-羊膜構築物を第 2の羊膜上に載置することもできる。例えば、 ステップ Cによる培養後に回収した細胞-羊膜構築物を裁断することによって複数個 の細胞-羊膜構築物を得ることができる。或いは、互いに独立した複数の培養系を用 意し、並行してステップ Cを実施することによって複数個の細胞-羊膜構築物を得るこ とちでさる。
複数個の細胞-羊膜構築物を第 2の羊膜上に載置する場合、均一に分散した状態
、即ち間隔が一定となるように細胞-羊膜構築物を配置することが好ましい。その後の 培養において (及び生体への移植後）細胞が増殖して細胞層が周囲へと伸展する際
、第 2の羊膜において当初細胞層が形成されていない領域を迅速且つ効率的に細 胞層で被覆することができるからである。即ち、以上の方法を採用すれば、第 2の羊 膜上において、広い表面積の細胞層を短時間に形成させることができる。このように 、一層効率的な細胞層の作製が可能となる。一方、第 2の羊膜の表面全体を被覆す る細胞層が形成される前に第 2の羊膜ごと細胞層を生体の組織欠損部に移植するこ ともでき、この場合には移植後に迅速な細胞層の形成が促されて高い治療効果が得 られる。
広い表面積の細胞層を短時間に得ることができるから、以上の方法は培養表皮シ ートを作製する際に特に好適なものとなる。尚、細胞層の表層を角化する必要がある 場合には、ステップ eの前、ステップ eとステップ fの間、又はステップ fの後に、上記と同 様の方法でエアーリフティング (ステップ d)を実施する。
[0044] ステップ fにおける培養は、上記ステップ cにおける培養条件と同様の条件で実施す ることができる。即ち、異種動物細胞非存在下で培養することが好ましぐ培地には無 血清で且つ異種動物由来のタンパク質を含まな 、ものを用いることが好ま 、。血清 を含む培地を採用する場合には同種由来の血清 (ヒトの生体由来細胞を培養する際 にはヒト由来の血清）を使用する力、自家血清を使用することが好ましい。また、ステ ップ Cと同様にステップ fにおいても、生体由来細胞の良好な増殖を目的として培養ス テツプの途中で培養条件を変更してもよ!/、。
[0045] 本発明の生体組織シートは、その作製過程において異種動物由来の細胞を使用 しないこと、及び生体由来細胞を培養する際の足場として羊膜を使用することによつ て、安全性が極めて高いものとなる。羊膜を使用することは生着性の向上にも寄与す ることから、本発明の生体組織シートは移植した際に高い治療効果が得られるものと なる。特に、羊膜及びコラーゲンゲルを使用する方法で作製された生体組織シートで は極めて緻密な細胞層が形成され、移植後の生着性が非常に高くなる。
[0046] 本発明の生体組織シートは、皮膚表皮、毛包上皮、角膜上皮、口腔粘膜上皮、腸 管粘膜上皮、及び気道粘膜上皮などの再生 (再建）に利用される。例えば、本発明 の生体組織シートを生体の組織欠損部に直接、移植することができる。ここでの「直 接移植」とは、組織欠損部と生体組織シートの間に他の物質を実質的に介在させる ことなく移植することを意味する。一方、両者の間に他の物質が介在するように、本発 明の生体組織シート (但し、作製過程において第 2の羊膜を使用するものは除く）を、 生体の組織欠損部に移植することもできる。例えば、培養基質として用いた羊膜とは 別の羊膜 (第 2の羊膜)を介して、組織欠損部に生体組織シートを移植することができ る。具体的には、組織欠損部に対して羊膜 (第 2の羊膜)を移植した後、予め作製し ておいた生体組織シートを当該羊膜上に移植することができる。このような移植術に よれば、羊膜が下地として存在することによって、生体組織シートに含有される細胞 が効率的に増殖するとともに周囲へと良好に遊走することが期待される。即ち、生体 組織シートを構成する細胞層の迅速な伸展を期待でき、高 、治療効果が得られる。 一方、組織欠損部が羊膜で被覆されることによって外部カゝら保護される。このことも治 療効果の向上に寄与する。
[0047] 本発明は更に、羊膜上では皮膚表皮細胞の増殖及び遊走が良好になるとの知見 に基づいて、皮膚表皮細胞の新規な調製方法を提供する。本発明の調製方法は以 下のステップ、即ち (A)皮膚表皮細胞を羊膜上に播種するステップ; (B)前記皮膚表皮 細胞を培養して増殖させるステップ；及び (C)増殖した皮膚表皮細胞を回収するステ ップを含むことを特徴とする。本発明の調製方法によれば効率的に細胞が増殖し、 周辺への細胞の遊走も良好となる。従って、短時間で大面積の細胞層（培養上皮）を 作製することが可能である。ここで、皮膚表皮細胞の採取及び培養は常法 (上記参 照）で行うことができる。また、増殖した皮膚表皮細胞の回収には、物理的手段 (セル スクレイパーなどによる剥離）、酵素的手段 (デイスパーゼゃトリプシンによる処理)な どを用いることができる。尚、皮膚表皮細胞を層状態のままで回収しても、或いは個 々の細胞に分離された状態で回収してもよ 、。
[0048] 以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例 に限定されるものではない。
実施例 1
[0049] 羊膜を用いた三次元培養皮膚シート (培養表皮シート)の作製
1.羊膜の調製
1-1.羊膜の採取
全身的合併症のない帝王切開予定の妊婦に対して事前に産婦人科医とともに十 分なインフォームドコンセントを行った後、手術室で帝王切開時に羊膜を採取した。 操作は清潔に気をつけ、手術操作に準じて手洗いの後に専用ガウンを装用した。分 娩前に清潔な羊膜採取用のバットと洗浄用の生理食塩水を準備した。分娩後に胎盤 組織をバットに移し、用手的に羊膜組織を胎盤より剥離した。羊膜と胎盤との癒着が 強!、部分はハサミで切除した。
[0050] 1-2.羊膜の処理
羊膜処理の過程は（1)洗浄、（2)トリミング、（3)保存の順で行った。すべての過程 において、操作は清潔なドラフト内で行うのが望ましぐ使用する容器や器具もすベ て滅菌されたものを使用し、シャーレ等は滅菌された使 、捨て（デイスポーザブル)タ イブのものを使用した。採取した羊膜に付着した血液成分を生理食塩水にて洗浄し ながら除去し、さらに十分量の生理食塩水（0.005% ofloxacin添加）にて洗浄した。続 V、て、ペニシリン ストレプトマイシン（50IU)を添カ卩したリン酸緩衝液 (PBS)で合計 3回 洗浄した。次に、羊膜をシャーレ内に移し、ハサミを用いて約 4 X 3 cm程度のサイズ に分割した。分割後、形状や厚さなどを基準に状態のよい羊膜を選別した。 [0051] 1-3.羊膜の保存
2ccの滅菌クライオチューブに lccずつ保存液を入れ、そこに採取、洗浄して選別さ れた羊膜を 1枚ずついれラベルした後、 80°Cのディープフリーザーに保存した。保 存液には 50%滅菌済みグリセロールを含む DMEM (ダルベッコ変法 MEM培地、 GIBCOBRL社)を使用した。保存された羊膜の使用期限は 3ヶ月とし、期限が過ぎれ ば焼却処分した。尚、このような保存処理を行わずに、以下の上皮処理を実施しても よい。
[0052] 1-4.羊膜上皮の処理
80°Cで保存して 、た羊膜を室温で解凍した後、ペニシリン ストレプトマイシン（ 50IU)を添加したリン酸緩衝液 (PBS)で 2回洗浄した。洗浄後の羊膜を 0.02%EDTA 溶液（Nacalai tesque社)に浸し（100mm培養皿）、 COインキュベーター内で 37°C、 1
2
時間反応させた。反応後、羊膜を十分量の PBSで 2回洗浄し、実体顕微鏡下、セルス クレイパー（Nunc社 USA)を用いて用手的に上皮を搔爬（除去）した。尚、この処理方 法によって一層の羊膜上皮が完全に除去搔爬されたことを光学的及び電子顕微鏡 的操作 (走査型電子顕微鏡)で確認した (データ示さず)。
[0053] 2.表皮角化細胞の調製
2-1.皮膚の採取
あらかじめ採取部位を 3日間程度予防的にポビドンョードにて消毒 ·抗真菌剤の外 用塗布を行った後、小皮膚片を皮膚生検に準じて採取する。
[0054] 2-2.表皮角化細胞の無血清培養法
ハサミで皮膚片カも脂肪組織と真皮をできる限り取り除き、ダルベッコリン酸緩衝液 (PBS)にて数回洗浄する。 70%エタノールに 1分間浸し滅菌する。 PBSにて洗浄後、 幅 3mm長さ 10mm程度の短冊状に切り、デイスパーゼ液 (デイスパーゼ II、 合同酒精 社、 250単位/ mlダルベッコ変法 MEM培地； DMEM)に浸し、 4°Cでー晚（18— 24時間) 静置する。翌日、ピンセットを用いて表皮を真皮カゝら剥離する。剥離した真皮は線維 芽細胞培養に供する。剥離した表皮を、 DMEMにて洗浄、続いて、 PBSにて洗浄後、 0.25%トリプシン溶液中にひたし、 37°C、 10分間の処理を行う。表皮をトリプシン中和 液を入れたプラスチックシャーレに移しピンセットにて表皮片をほぐし、 50mlの滅菌チ ユーブに移す。 PBSを添加し、表皮角化細胞浮遊液を調整する。細胞数を数え、 1000rpm、 5分間遠心し細胞を沈殿させる。上清を吸引し、細胞を無血清培地である MCDB153培地で懸濁し、 100mmコラーゲンコートシャーレ（旭テクノグラス、 I型コラー ゲンコートディッシュ； 4010- 010)当たり 2— 3 X 106細胞/ 10ml培養液の割合で播種す る。翌日培養液を交換し、以後 1日おきに培養液を交換する。細胞密度が 70— 80%程 度になった時点で継代培養を行う。
[0055] 3.線維芽細胞の調製
剥離した真皮を DMEMにて洗浄後、一辺カ^ー 2mmにメスを用いて細切する。細切 した真皮片を I型コラーゲンコートディッシュに約 lcmの間隔で密着させる。 COインキ
2 ュベータ一に 30分間静置し、完全に密着させる。その後、牛胎児血清を 10%含む DMEM培地を約 5ml添加し、 7日間静置する。 7日目に初回の培養液交換を行う。真 皮片から線維芽細胞が遊走してくるのを確認する。細胞が増殖し、真皮片の周囲 5mmまで遊走してきた段階で、継代を行う。 PBSで洗浄後、 0.125%トリプシン、 0.05%EDTAを含む溶液を 3ml添カ卩し、 37°C、 3分間処理する。細胞がディッシュ底面 力も剥離したことを顕微鏡で確認した後、 3mlのトリプシンインヒビターを添加し細胞を 回収し 50mlのチューブに移す。 PBSを用いて残りの細胞を回収し、 1000rpm、 5分間の 遠心処理にて細胞を沈殿させ、上清を吸引後、牛胎児血清を 10%含む DMEM培地 を添加し、細胞浮遊液を調整し、細胞培養用ディッシュに播種する。継代の細胞密 度はおおむね 1 : 3程度とする。適宜細胞を凍結保存する。凍結保存液は 10%グリセ ロール、 20%FCS、 70%DMEMを用い、液体窒素中で保存する。
[0056] 4.中和コラーゲンゲルの作製
I型コラーゲン溶液 (セルマトリクスタイプ 1A: 3mg/ml：新田ゼラチン）： 6容量に対して 0.1N NaOH : 1容量、 8倍濃度 DMEM : 1容量、 20%FCS/DMEM : 10容量の割合で中 和コラーゲン液 (コラーゲンの最終濃度： lmg/ml)を 4°Cにて作製し、直径 24mmの力 ルチヤーインサート（Corning- Costar社）に lmlずつ添カ卩し、室温で 10分間静置しゲ ル化させる。あら力じめ培養してぉ 、た対数増殖期の線維芽細胞 (デイスパーゼ処理 し表皮を剥離した残りの真皮から outgrowth法で培養し 5-10代継代した細胞を用いる 。）を 5xl05細胞/ ml、 10%FCS/DMEMの濃度に調整し、この細胞懸濁液： 2容量に対し て中和コラーゲン液： 8容量の割合で混和し、細胞を含む中和コラーゲン溶液を調製 する（コラーゲンの最終濃度： 0.8mg/ml)。この溶液を各カルチャーインサートに 3.5ml ずつ添カ卩し、 COインキュベーター内 (37°C に静置する。約 30分でゲル化し
2 、 5%CO )
2
たことを確認する。その後 10%FCS/DMEMをゲルが浸る程度（カルチャーインサイト 内側に 3ml、カルチャーインサート外側に 3ml)加え 5日間静置培養する。培養 2日目よ りゲルは収縮を開始しはじめ、線維芽細胞の増殖を位相差顕微鏡下に観察できる。
[0057] 5.羊膜の接着
培養開始後 5日後にはコラーゲンゲルの底面はメンブレンに密着しているがコラー ゲンゲル上部は収縮し厚さが 2— 3mmになっている。保存していた羊膜 (上皮を除去 した羊膜)を PBSにて 2回洗浄、さらに角化細胞用培養液で 1回洗浄する。羊膜の実 質細胞側を下にしてカルチャーインサートに移し、ピンセットを用いてコラーゲンゲル と密着させる。ピンセットにて皺ができないようにのばし、カルチャーインサートの側壁 に羊膜の周辺を密着させる。 COインキュベーター内に移し、 37°Cで 30分間静置する
2
[0058] 6.角化細胞の播種
2-2.で調製した角化細胞をトリプシン 'EDTAを用いてディッシュ力も剥離し、回収 する。 lOOOrpm, 5分間遠心し、上清を除去し、 200万個 /0.25mlの濃度になるように細 胞を懸濁する。カルチャーインサート内側の羊膜上に 0.25mlの細胞懸濁液を播種し 、 COインキュベーター内に移し、角化細胞が羊膜に密着するように 1.5— 2.0時間ィ
2
ンキュベータ一内で静置し、その後 lmlの表皮細胞増殖用培地をカルチャーインサ ート内側に緩やかに添加し、さらにカルチャーインサート外側に lml添加する。翌日 表皮細胞増殖用培地をカルチャーインサート内側に緩やかに追加し、さらにカルチ ヤーインサート外側にも lml追加する。
[0059] 7.気相下培養
表皮細胞を羊膜に播種後 3日目に空気曝露 (エアーリフティング)を行う。空気曝露 用の維持容器に滅菌したフィルターペーパーを設置し、重層化用培地をフィルター ペーパーが浸る程度 (約 9ml)添加する。カルチャーインサート内側の培養液を注意 深く除去し、カルチャーインサートをフィルターペーパー上に移し、 COインキュベー ター内で培養する。培養液は一日おきに交換する。 7— 14日の空気曝露により三次 元培養皮膚が完成する。重層化用培地は以下のごとく調整する。ダルベッコ変法 MEM培地： F- 12培地 = 1:1、カルシウム濃度； 1.95mM、 monoethanolamine;0.1mM、 0— phosphoethanolamine;0. lmM、 insulin;5ug/ ml、 hydrocortis one ; 0.4ug/ ml、
L— glutamine;4mM、 Adenin;0.18mM、 transfferin;5ug/ml、 selenious acid;53nM、 triiodothyronine;20pM、 serine; lmM、 choline chloride ;0.64mM、 linoleic acid;2ug/ml、 FCS;2%
[0060] 以上の操作の結果得られる培養表皮シートは、ディッシュ底面力も若しくはコラーゲ ンマトリクス力 容易に剥離する。従前の技術ではシートの収縮が起こるため、キチン 膜 (ペスキチン W)を支持体として用いることが必要であり、また破損することも多 、が 、以上の方法によれば強固なシートが作製され、シートの収縮も認められないことか ら、支持体の使用が不要となる。
[0061] 8.組織学的検索
以上の方法で培養表皮シートを作製したところ空気曝露後 7日目では表皮は 5— 8 層となり、角層の形成が認められ、正常ヒト皮膚とほぼ同様の構造を呈していた。重 層化した角化細胞の組織所見は一層の基底細胞様の細胞とその上に 5— 8層の重 層化し、分ィ匕した細胞構築が認められる（図 1)。 3代継代した細胞で培養表皮シート を作製した場合、皮膚採取後約 4週間で培養表皮シートが使用可能となり、培養面 表面積は計算上、数千倍に増加する。
一方、空気曝露前後で経時的に標本を作製し、 HE染色を施行した。空気曝露後 9 日目の標本より凍結組織切片を作製し、 -チレイ社のヒストファイン SAB— APキットを 用いて免疫組織化学染色を行い、基質は-ユーフクシンを用いた。用いた抗体は以 下の通りである。モノクローナル抗体；ラミニン 5 (GB3、 Sera Lab)、 IV型コラーゲン（ MAB1910、 Chemicon)、 VII型コラーゲン（LH7.2、 YLEM)、 β 4インテグリン（ MAB1964, Chemicon)、 β 1インテグリン（P4C10、 Gibco BRL)、デスモグレイン 1 ( DG3.10、 Progen)、プラコグロビン（PG5.1、？1"086 、デスモプラキン（0?—2.15、 Progen)、 Eカドヘリン（HECD— 1、 Takara)、 Pan—ケラチン（Dako)、 EGFレセプター ( Ab3、 Oncogene Science)、ポリクローナノレ抗体；インポノレクリン (Biomedical Technologies Inc.)、デスモグレイン 3 (Serotec)。類天疱瘡抗原の確認には類天疱瘡 患者血清を用い、 FITC標識抗ヒ HgG抗体を使用し、蛍光顕微鏡下に観察した。電 子顕微鏡検索には空気曝露後 9日目の標本を定法で固定、包埋し、日立社製透過 型電子顕微鏡で観察した。
空気曝露前の HE所見では角化細胞は 1一 2層であり角層の形成は認められず、空 気曝露後 4日では角化細胞は重層化がみられ 3— 4層の有棘層と明らかな角層の形 成がみられた。 7日後には有棘層は約 5— 8層程度となり、この状態は 14日頃までは 確実に維持されていた。従来の培養表皮シートとくらべ明らかに強固なシートを形成 しており、支持体を用いなくても操作は容易で非常に扱いやすいと思われた。免疫 組織学的にはラミニン 5、 IV型コラーゲン、 VII型コラーゲン、 j8 4インテグリンは基底層 の表皮基底細胞を中心として発現がみられ、 vivo表皮の発現形式とは異なっていた 。細胞間接着分子である Eカドヘリン、デスモグレイン 1、デスモグレイン 3、その裏打ち 蛋白であるデスモプラキン、プラコグロビンは基底層力ゝら有棘層に発現されて 、た。
EGFレセプター、 /3 1インテグリンは基底層力も傍基底層にかけて発現していた。類 天疱瘡抗原は基底膜部に線状に発現がみられた。免疫組織所見をまとめると、細胞 間接着分子、分ィ匕のマーカーはおおむね vivo表皮と同様に発現がみられたが、基底 膜の構成成分の発現は不十分であると思われた。電顕所見ではデスモゾームは良 好に形成されて 、た。基底膜部ではへミデスモゾームの形成はおおむね良好であつ たが基底板は一部形成が認められるものの、断片的であった。係留線椎は断片的に 形成がみられた。
[0062] 9.シートの保存
作製した培養表皮シートはキャリアーと共に若しくはキャリアーなしに少量の保存液 を用いることで凍結可能である。具体的にはまず、 80°Cのフリーザーで凍結保存し 、翌日、 150°Cの超低温フリーザーで保存する。 150°Cでの保存では長期間シート の形で保存可能であり、実際に十分な治療効果が得られている。その他、生体組織 の保存に用いられる保存液を使用して 4°Cで保存することも可能であり、この場合に は抗酸ィ匕物質を添加しておくことが望まし 、。
[0063] 10.培養表皮シートの移植 剥離したシートをプレートに付着していた面が創面を覆うように移植し、圧迫'固定 を行う。通常、テープ固定と包帯による圧迫で十分である。培養シート移植も通常の 皮膚移植と同様、自己の細胞を用いた自家移植と他人の細胞を用いた他家移植と に分類される。自家移植は生着性に優れるが作製に時間がかかる。他家移植は、生 着しないが、 biological dressingとしての効果があり、一見生着したかのように見えるこ ともある。シートの保存が可能となったことより、一度に大量に他家培養シートを作製 しておけば必要時に直ちに使用できる利点を有する。これらの理由により、他家培養 シートは、主に急性期の熱傷患者に応用されている。臨床応用の際には、熱傷、下 腿潰瘍、先天性表皮水疱症、獣皮様母斑、瘢痕、分層採皮部位の被覆などが対象 となる。
実施例 2
[0064] 三次元培養皮膚シート (培養表皮シート）の作製 (コラーゲンゲルを用いな 、場合） 1.羊膜、表皮角化細胞の調製
実施例 1と同様の手順で羊膜と表皮化角化細胞を調製した。
[0065] 2.角化細胞の播種
保存していた羊膜を PBSにて 2回洗浄、さらに角化細胞用培養液で 1回洗浄する。 羊膜の実質細胞側を下にしてカルチャーインサートの底面上に接着させる。あらかじ め培養してあった角化細胞をトリプシン 'EDTAを用いてディッシュ力も剥離し、回収 する。 lOOOrpm, 5分間遠心し、上清を除去し、 200万個 /0.25mlの濃度になるように細 胞を懸濁する。カルチャーインサート内側の羊膜上に 0.25mlの細胞懸濁液を播種し 、 COインキュベーター内に移し、角化細胞が羊膜に密着するように 1.5— 2.0時間ィ
2
ンキュベータ一内で静置し、その後 lmlの表皮細胞増殖用培地をカルチャーインサ ート内側に緩やかに添加し、さらにカルチャーインサート外側に lml添加する。翌日 表皮細胞増殖用培地をカルチャーインサート内側に緩やかに追加し、さらにカルチ ヤーインサート外側にも lml追加する。
[0066] 3.気相下培養
表皮細胞を羊膜に播種後 3日目に空気曝露 (エアーリフティング)を行う。空気曝露 用の維持容器に滅菌したフィルターペーパーを設置し、重層化用培地をフィルター ペーパーが浸る程度 (約 9ml)添加する。カルチャーインサート内側の培養液を注意 深く除去し、カルチャーインサートをフィルターペーパー上に移し、 COインキュベー
2
ター内で培養する。培養液は一日おきに交換する。 7— 14日の空気曝露により三次 元培養皮膚が完成する。重層化用培地は以下のごとく調整する。ダルベッコ変法 MEM培地： F- 12培地 = 1:1、カルシウム濃度； 1.95mM、 monoethanolamine;0.1mM、 0— phosphoethanolamine;0. lmM、 insulin;5ug/ ml、 hydrocortis one ; 0.4ug/ ml、
L— glutamine;4mM、 Adenin;0.18mM、 transfferin;5ug/ml、 selenious acid;53nM、 triiodothyronine;20pM、 serine; 1 mM、 choline chloride ;0.64mM、 linoleic acid;2ug/ml 、 FCS;2%
[0067] 4.組織学的検索
以上の方法で培養表皮シートを作製したところ空気曝露後 7日では表皮は 5— 8層 となり、角層の形成が認められ、正常ヒト皮膚とほぼ同様の構造を呈していた（図 2)。 実施例 3
[0068] 羊膜を用いた三次元角膜上皮シートの作製
1.羊膜の調製
実施例 1と同様の手順で羊膜を調製した。
2.角膜上皮細胞の調製
2-1.角膜の調達
角膜はドナー用のものを Northwest Lions Eye Bank (シアトル、米国）より購入した。
2-2.角膜上皮細胞の無血清培養法
角膜をダルベッコリン酸緩衝液 (PBS)の入ったシャーレに移し、実体顕微鏡下に輪 部をメスにて一辺が 2— 3mmに細切する。細切した輪部を数回 PBSにて洗浄し、 70% エタノールに 1分間浸し滅菌する。 PBSにて洗浄後、デイスパーゼ液 (ディスパーゼ II 、合同酒精社、 250単位/ mlダルベッコ変法 MEM培地； DMEM)に浸し、 4°Cで一晚（ 18— 24時間）静置する。翌日、実体顕微鏡下にピンセットを用いて上皮を実質力も剥 離する。剥離した角膜上皮を、 DMEMにて洗浄、続いて、 PBSにて洗浄後、 0.25%トリ プシン溶液中に浸し、 37°C、 10分間の処理を行う。表皮をトリプシン中和液を入れた プラスチックシャーレに移しピンセットにて表皮片をほぐし、 15mlの滅菌チューブに移 す。 PBSを添加し、角膜上皮細胞浮遊液を調整する。細胞数を数え、 lOOOrpm, 5分 間遠心し細胞を沈殿させる。上清を吸引し、細胞を無血清培地である EpiLife培地で 懸濁し、 60mmコラーゲンコートシャーレ（旭テクノグラス、 I型コラーゲンコートディッシ ュ; 4010-020)当たり 1一 2 X 106細胞 /5πύ培養液の割合で播種する。翌日培養液を交 換し、以後 1日おきに培養液を交換する。細胞密度が 70— 80%程度になった時点で 継代培養を行う。
尚、以上の方法では無血清培地中を使用して角膜上皮細胞を培養することにした 力 以下に示す手順のように血清を含む培地を使用することもできる。
(1)角膜輪部組織力ゝら内皮細胞を剥離除去し、結膜を切除する。
(2)デイスパーゼ液（ディスパーゼ I、合同酒精社、 250単位/ mlダルベッコ変法 MEM 培地； DMEM)に浸して 4°Cでー晚（18— 24時間）静置する。
(3) 0.25%トリプシン溶液中に浸し、 37°C、 10分間の処理を行う。
(4)顕微鏡下で上皮のみをトリプシン溶液中ではがす。
(5)ピペッティングして、 30%FCS/DMEMを同量カ卩えて懸濁する。
(6) PBS (-)で残りの細胞をさらに回収して遠心処理する。
(7)適量の培養液で単一細胞懸濁液とする。
[0069] 調製した角膜上皮細胞の凍結保存条件 (保存液組成含む)及び融解条件の一例 を以下に示す。
凍結保存条件： 1°C/時間の速度で- 20°Cまで温度を低下させ、その後窒素タンクで 保存する。
保存液組成： 20%FCS/10%DMSO/DMEM
融解条件：出来るだけ急速に 37°Cで融解し、 PBSで 10倍希釈する。
[0070] 3.線維芽細胞の調製
剥離した真皮を DMEMにて洗浄後、一辺カ^ー 2mmにメスを用いて細切する。細切 した真皮片を I型コラーゲンコートディッシュに約 lcmの間隔で密着させる。 COインキ
2 ュベータ一に 30分間静置し、完全に密着させる。その後、牛胎児血清を 10%含む DMEM培地を約 5ml添加し、 7日間静置する。 7日目に初回の培養液交換を行う。真 皮片から線維芽細胞が遊走してくるのを確認する。細胞が増殖し、真皮片の周囲 5mmまで遊走してきた段階で、継代を行う。 PBSで洗浄後、 0.125%トリプシン、
0.05%EDTAを含む溶液を 3ml添カ卩し、 37°C、 3分間処理する。細胞がディッシュ底面 力も剥離したことを顕微鏡で確認した後、 3 mlのトリプシンインヒビターを添加し細胞 を回収し 50mlのチューブに移す。 PBSを用いて残りの細胞を回収し、 1000rpm、 5分間 の遠心処理にて細胞を沈殿させ、上清を吸引後、牛胎児血清を 10%含む DMEM培 地を添加し、細胞浮遊液を調整し、細胞培養用ディッシュに播種する。継代の細胞 密度はおおむね 1 : 3程度とする。適宜細胞を凍結保存する。凍結保存液は 10%ダリ セロール、 20%FCS、 70%DMEMを用い、液体窒素中で保存する。
[0071] 4. 中和コラーゲンゲルの作製
I型コラーゲン溶液 (セルマトリクスタイプ 1A: 3mg/ml：新田ゼラチン）： 6容量に対して 0.1N NaOH : 1容量、 8倍濃度 DMEM : 1容量、 20%FCS/DMEM : 10容量の割合で中 和コラーゲン液 (コラーゲンの最終濃度： lmg/ml)を 4°Cにて作製し、直径 24 mmの力 ルチヤーインサート（Corning- Costar社）に lmlずつ添カ卩し、室温で 10分間静置しゲ ル化させる。あら力じめ培養してぉ 、た対数増殖期の線維芽細胞 (デイスパーゼ処理 し表皮を剥離した残りの真皮から outgrowth法で培養し 5-10代継代した細胞を用いる 。）を 5xl05細胞/ ml、 10%FCS/DMEMの濃度に調整し、この細胞懸濁液： 2容量に対し て中和コラーゲン液： 8容量の割合で混和し、細胞を含む中和コラーゲン溶液を調製 する（コラーゲンの最終濃度： 0.8mg/ml)。この溶液を各カルチャーインサートに 3.5ml ずつ添カ卩し、 COインキュベーター内 (37°C、 5%CO )に静置する。約 30分でゲル化し
2 2
たことを確認する。その後 10%FCS/DMEMをゲルが浸る程度（カルチャーインサイト 内側に 3ml、カルチャーインサート外側に 3ml)加え 5日間静置培養する。培養 2日目よ りゲルは収縮を開始しはじめ、線維芽細胞の増殖を位相差顕微鏡下に観察できる。
[0072] 5.羊膜の接着
培養開始後 5日後にはコラーゲンゲルの底面はメンブレンに密着しているがコラー ゲンゲル上部は収縮し厚さが 2— 3mmになっている。保存していた羊膜を PBSにて 2 回洗浄、さらに角化細胞用培養液で 1回洗浄する。羊膜の実質細胞側を下にして力 ルチヤーインサートに移し、ピンセットを用いてコラーゲンゲルと密着させる。ピンセッ トにて皺ができないようにのばし、カルチャーインサートの側壁に羊膜の周辺を密着 させる。 COインキュベーター内に移し、 37°Cで 30分間静置する。
2
[0073] 6.角膜上皮細胞の播種
2-2.で調製した角膜上皮細胞をトリプシン 'EDTAを用いてディッシュ力も剥離し、 回収する。 lOOOrpm, 5分間遠心し、上清を除去し、 200万個 /0.25mlの濃度になるよう に細胞を懸濁する。カルチャーインサート内側の羊膜上に 0.25mlの細胞懸濁液を播 種し、 COインキュベーター内に移し、角化細胞が羊膜に密着するように 1.5— 2.0時
2
間インキュベーター内で静置し、その後表皮細胞増殖用無血清培地を緩やかに添 加し (カルチャーインサート内側に 3ml、カルチャーインサート外側に 3ml)さらに 14日 間液相下で培養を続ける。角膜上皮細胞播種 3日目に培養液を重層化用培養液（ 下記参照）に変更し、以後 2日に 1回培養液を交換する。
重層化用培地は以下のごとく調整する。ダルベッコ変法 MEM培地： F-12培地 = 1:1 、カノレシゥム濃度； 1.95mM、 monoethanolamine;0.1mM、
0— phosphoethanolamine;0. lmM、 insulin;5ug/ ml、 hydrocortis one ; 0.4ug/ ml、
L— glutamine;4mM、 Adenin;0.18mM、 transfferin;5ug/ml、 selenious acid;53nM、 triiodothyronine;20pM、 serine; lmM、 choline chloride ;0.64mM、 linoleic acid;2ug/ml、 FCS;2%
[0074] 7.気相下培養
角膜上皮細胞を播種後 14日目に空気曝露 (エアーリフティング)を行う。空気曝露 用の維持容器に滅菌したフィルターペーパーを設置し、重層化用培地をフィルター ペーパーが浸る程度 (約 9ml)添加する。カルチャーインサート内側の培養液を注意 深く除去し、カルチャーインサートをフィルターペーパー上に移し、 COインキュベー
2
ター内で培養する。培養液は 3日目に交換する。 3日間の空気曝露により培養角膜が 完成する。
[0075] 8.組織学的検索
空気曝露後 3日目では角膜上皮は 3— 4層となり、角層の形成が認められ、正常ヒト 角膜とほぼ同様の構造を呈して 、る。
実施例 4
[0076] 羊膜の細胞培養基質としての特性評価 1.羊膜上での表皮角化細胞の増殖及び遊走試験 1
線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に、その上皮が存在して 、た側が上になるよう に、上皮が除去された羊膜を広げた状態で載せ、密着させた。次に、羊膜上にステ ンレス製のドーナツ状リング（内径 6mm、高さ 2mm)をおき、内部（6mmで穴の開いてい る部分）に表皮角化細胞懸濁液を播種した。尚、羊膜及び表皮角化細胞懸濁液はと もに、実施例 1に記載した方法で調製した。
2日後にリングをとり、空気曝露による重層化を開始した。周囲への表皮角化細胞 の遊走を重層化 1日後及び 10日後に観察した。羊膜を使用しないこと以外は同条件 としたものを比較対象 (コントロール群）とした。
重層化後 1日目及び 10日目のシャーレ内の状態を図 3に示す。図 3の右欄が試験 群 (線維芽細胞を含むコラーゲンゲルに密着させた羊膜上で表皮角化細胞を培養し た場合)の結果 (上力も順に 1日目、 10日目）である。左欄はコントロール群 (線維芽 細胞を含むコラーゲンゲル上で表皮角化細胞を培養した場合)の結果である。シャ ーレの中央領域において円形、スポット状に観察されるのが細胞 (細胞層）である。 試験群 (左欄)では 1日目力 10日目にかけて細胞層が大幅に拡大している。即ち 、細胞が良好に増殖するとともに、周辺への遊走が亢進していることがわかる。一方、 コントロール群では 1日目と 10日目において細胞層の大きさに目立った変化は認め られない。以上の結果から羊膜上では細胞の増殖率が高いとともに、著明に遊走が 亢進することが明らかとなった。
2.羊膜上での表皮角化細胞の増殖及び遊走試験 2 (三次元培養法との組合せ） まず、実施例 1に記載した手順で三次元培養 (コラーゲンゲルに接着させた羊膜上 での表皮角化細胞の培養、及びそれに続く空気曝露)を実施し、羊膜上に細胞層が 形成されて 、る培養表皮シート (空気曝露による重層化開始後 7日目のもの）を作製 した。一方、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に、その上皮が存在していた側が 上になるように、上皮が除去された羊膜を広げた状態で載せ、密着させた。次に、培 養表皮シートを直径約 8mmの円形にくり抜き、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上の 羊膜上に載置し、静置した。そして、周囲への表皮角化細胞層の拡がりを 1日後、 7 日後、 10日後、及び 14日後に観察した。羊膜を使用しないこと以外は同条件とした もの（コントロール群 l)、及び羊膜を使用せずに三次元培養して得られた細胞層（コ ラーゲンゲル上に直接、表皮角化細胞を播種し、その後培養して得られた細胞層）を
、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に直接、載置したもの（コントロール群 2)を比 較対象とした。尚、羊膜及び表皮角化細胞懸濁液はともに、実施例 1に記載した方 法で調製した。
培養開始から 1日目、 7日目、 10日目及び 14日目のシャーレ内の状態を図 4に示 す。図 4の左欄が試験群 (線維芽細胞を含むコラーゲンゲルに密着させた羊膜の上 に培養表皮シートを載置し、培養した場合)の結果 (上力も順に 1日目、 7日目、 10日 目、及び 14日目）である。中央欄はコントロール群 1 (線維芽細胞を含むコラーゲンゲ ル上に培養表皮シートを載置し、培養した場合)の結果である。同様に右欄はコント ロール群 2 (羊膜を使用せずに三次元培養して得られた細胞層を、線維芽細胞を含 むコラーゲンゲル上に載置し、培養した場合)の結果である。
図 4において、シャーレのほぼ中央に観察されるのが細胞 (細胞層）である。試験群 (左欄)では、時間の経過とともに細胞層が顕著に拡大している。即ち、細胞が良好 に増殖するとともに、周辺への遊走が亢進していることがわかる。一方、コントロール 群 1 (中央欄)では時間の経過とともに細胞層の若干の拡大が認められる力 その程 度は試験群の場合と大きく相違する。また、コントロール群 2 (右欄)では観察期間を 通して細胞層の大きさに目立った変化はない。以上のように、三次元培養によって得 られた培養表皮シートを構成する細胞においても、羊膜上で培養することによって高 い細胞増殖率が得られるとともに、細胞の周辺への遊走が著明に亢進することが明 らかとなつた。
3.まとめ
1.及び 2.の結果から、羊膜上では表皮角化細胞の増殖が良好であり、かつ細胞 の遊走能力も良好に発揮されることが判明した。また、 2.の結果によれば、線維芽細 胞を含むコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で培養した表皮角化細胞を羊膜ととも に回収し、それを、予め皮膚欠損部に移植した別の羊膜上に移植する方法が優れた 表皮再建術となると考えられた。この場合の移植術の具体例を以下に示す。
(1)皮膚全層及び皮下組織に至る欠損創にっ ヽて、まず創傷清拭 (debridement)を 施行し、壊死組織を除去する。詳しくは、 1%キシロカイン Eを欠損創の周囲に注射し た後、メス又はハサミで壊死組織を除去し、潰瘍底面を平坦化させる。次に人工真皮 を移植し、タイオーバー（tie over)固定を行う。
(2) 1— 2週後にタイオーバーを除去し、人工真皮が生着していることを確認する。具 体的には、人工真皮が潰瘍底面に密着していることを目視的に確認し、指で左右に 動力してみて動かないことを確認する。また、人工真皮の下に滲出液、血液が貯留し ていないことを目視的に確認する。続いて、生着した人工真皮の上に羊膜 (上皮成 分を除去し、細菌が陰性であることを確認し凍結保存している羊膜を 37°Cに温めた 後、滅菌生理食塩水で 2回洗浄した物）を移植し、包帯、テープ、 tie-overなどで固定 する。
(3)数日間、固定状態を保持した後、羊膜が人工真皮に生着していることを確認する 。具体的には、羊膜と人工真皮の間に滲出液、血液が貯留していないことを目視的 に確認する。さらに指で左右に動力してみて動かないことを確認する。
(4)予め用意しておいた三次元培養表皮シート（羊膜と細胞層で構成されるもの、又 は細胞層のみ力も構成されるもの）をパッチグラフトで移植する（例えば一つのパッチ を直径 15mmとする)。 3日間固定し、以降 2日に 1回の割合で消毒処置 (0.05%ヒビテン 水、消毒用イソジン液)を行う。
(5)羊膜上に移植されることによって、三次元培養表皮シートを構成する細胞は良好 に増殖及び遊走すると考えられる。その結果、細胞層が迅速に拡大し、高い治療効 果が発揮されると期待される。
産業上の利用可能性
本発明が提供する生体組織シートの用途は広ぐ皮膚表皮、角膜上皮、口腔粘膜 上皮、気道粘膜上皮及び腸管粘膜上皮などの再生 (再建）に利用され得る。中でも、 皮膚表皮又は角膜上皮の再生に好適に利用され得る。
また、本発明の生体組織シートを遺伝子治療に利用することも可能である。遺伝子 治療には大きく in vivo法と ex vivo法があり、前者は遺伝子を直接生体内に導入する 方法で、後者はいつたん細胞を取り出し、遺伝子を導入した後再び体内に戻す方法 である。遺伝子治療の現在の技術水準に鑑みると、培養皮膚、培養角膜上皮、培養 腸管粘膜上皮シートに遺伝子を導入しさえすれば即座に ex vivo法へと発展する。各 種ウィルスベクターによるケラチノサイトへの遺伝子導入の有効性が示されてきており 、特に、アデノウイルスベクターを用いた場合ほぼ 100%のケラチノサイトに導入可能 である。皮膚科領域での遺伝子治療では、 VII型コラーゲン、ラミニン 5等の異常が原 因である先天性表皮水疱症などの遺伝病の治療には自家培養表皮シートに正常遺 伝子を導入することで極めて有効な治療となることが予想される。また、糖尿病、血友 病など体内の分子の欠乏により引き起こされる全身性疾患においてケラチノサイトに 遺伝子を導入し欠乏分子を産生させ、補充する、いわゆるデリバリーシステムとして の培養皮膚の可能性もあり、今後ますます培養生体組織の応用が発展することが予 想される。
[0080] なお、本邦においては、他家移植に関しては倫理面、ならびに安全性の確認の点 で問題であり一般的には普及しておらず、自家移植力 Sもっぱら推進されているのが 現状であり、その点で、三次元培養生体組織の自家移植が今後進められることにな ると思われる。
[0081] この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものでは ない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その 全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

請求の範囲
[I] 異種動物細胞非存在下、羊膜上で増殖させた生体由来細胞を含有してなる生体 組織シート。
[2] ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上に前記羊膜を載置した状態で前記生 体由来細胞を増殖させることを特徴とする請求項 1に記載の生体組織シート。
[3] 無血清培地を使用して前記生体由来細胞を増殖させることを特徴とする、請求項 1 又は 2に記載の生体組織シート。
[4] 血清成分として、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を使用して前記生体 由来細胞を増殖させることを特徴とする、請求項 1又は 2に記載の生体組織シート。
[5] 前記生体由来細胞が角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜、気道 粘膜又は腸管粘膜由来の細胞であることを特徴とする、請求項 1一 4のいずれかに 記載の生体組織シート。
[6] 前記羊膜が、上皮が除去された羊膜であることを特徴とする、請求項 1一 5のいず れかに記載の生体組織シート。
[7] 増殖した細胞に加えて、培養基質としての前記羊膜を含有することを特徴とする、 請求項 1一 6の 、ずれか〖こ記載の生体組織シート。
[8] 第 2の羊膜を介して組織欠損部に移植される移植材料であることを特徴とする請求 項 7に記載の生体組織シート。
[9] 異種動物細胞非存在下、ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上に載置した 羊膜上で増殖させた生体由来細胞を前記羊膜とともに第 2の羊膜上に載置し、更に 増殖させて得られる細胞を含有することを特徴とする、請求項 1一 6のいずれかに記 載の生体組織シート。
[10] 以下のステップを含んでなる、生体組織シートの作製方法：
(a)生体由来細胞を調製するステップ；
(b)前記生体由来細胞を羊膜上に播種するステップ；
(c)異種動物細胞非存在下、前記生体由来細胞を培養して増殖させるステップ。
[II] 前記ステップ bが以下のステップからなる、請求項 10に記載の作製方法：
(b-1)コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養するステップ； (b-2)前記コラーゲンゲル上に羊膜を載置した後、前記生体由来細胞を該羊膜上 に播種するステップ。
[12] 以下のステップを更に含むことを特徴とする、請求項 10又は 11に記載の作製方法
(d)前記生体由来細胞が増殖した後、最表層を空気に接触させるステップ。
[13] 以下のステップを更に含むことを特徴とする、請求項 11又は 12に記載の作製方法
(e)前記生体由来細胞を前記羊膜とともに回収するステップ；
(£)回収した前記生体由来細胞及び前記羊膜を、羊膜側を下にして第 2の羊膜上に 載置した後、前記生体由来細胞を培養して増殖させるステップ。
[14] 前記ステップ cが、無血清培地を使用して実施されることを特徴とする、請求項 10— 13のいずれかに記載の作製方法。
[15] 前記ステップ cが、血清成分として、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を 使用して実施されることを特徴とする、請求項 10— 13のいずれかに記載の作製方法
[16] 前記生体由来細胞が角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜、気道 粘膜又は腸管粘膜由来の細胞であることを特徴とする、請求項 10— 15のいずれか に記載の作製方法。
[17] 前記羊膜が、上皮が除去された羊膜であることを特徴とする、請求項 10— 16のい ずれかに記載の作製方法。
[18] 以下のステップを含んでなる、皮膚表皮細胞の調製方法：
(A)皮膚表皮細胞を羊膜上に播種するステップ；
(B)前記皮膚表皮細胞を培養して増殖させるステップ；
(C)増殖した皮膚表皮細胞を回収するステップ。
[19] 請求項 1一 9の ヽずれかの生体組織シートを移植材料として使用する移植方法。
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