WO2005079580A1

WO2005079580A1 - 植物病害防除剤組成物及び微生物

Info

Publication number: WO2005079580A1
Application number: PCT/JP2005/002759
Authority: WO
Inventors: Mitsunori Maeda
Original assignee: Nippon Soda Co., Ltd.
Priority date: 2004-02-23
Filing date: 2005-02-22
Publication date: 2005-09-01
Also published as: KR100857746B1; JPWO2005079580A1; KR20080044922A; JP4695070B2; KR20060115765A

Abstract

【課題】　本発明は、バチルス属（Bacillus）に属する新規な微生物、特に各種農園芸作物の灰色かび病や菌核病，うどんこ病，炭疽病，輪斑病，青かび病，緑かび病、軟腐病、かいよう病等が発生し易い低温条件に於いても植物病害防除能を有する植物病害防除剤組成物や、かかる植物病害防除剤組成物を用いた植物病害の防除方法や、該微生物の選抜方法をを提供することを課題とする。【解決手段】　バチルス属（Bacillus sp.）に属する新規な微生物を含有する植物病害防除剤組成物であり、かかる微生物として、具体的にはバチルス　ズブチリス（Bacillus subtilis）４−５−１−１株Ｎｏ．３０、バチルス　エスピー（Bacillus sp.）４−５−２１　０３０６株を挙げることができる。また、本発明の植物病害防除剤組成物を植物及び／又は土壌を処理することにより、灰色かび病や菌核病，うどんこ病，炭疽病，輪斑病，青かび病，緑かび病、軟腐病、かいよう病に対して特に効果的な防除方法、該微生物に主として由来しそのごく一部の特性を変更させた菌株、該微生物の選抜方法を提供する。

Description

明細書

植物病害防除剤組成物及び微生物

技術分野

[0001] 本発明は、各種農園芸作物の灰色かび病ゃ菌核病、うどんこ病、炭疽病、輪斑病

、青かび病、緑かび病、軟腐病、かいよう病等の植物病害に対して植物病害が発生する温度領域の低温域での防除能も有するバチルス属（Bacillus)に属する新規な微生物、該新規微生物を有する植物病害防除剤組成物、該植物病害防除剤組成物を用いた植物病害の防除方法に関する。

背景技術

[0002] 従来から、ベンズイミダゾール系殺菌剤及びチオファネート系殺菌剤が農園芸作物に寄生する種々の病原菌に対して優れた防除効果を示し、 1970年頃より農園芸用殺菌剤として広く一般に使用され、作物増産に大きく寄与してきた。

[0003] 一方、従来の合成殺菌剤による防除に代わるべき、あるいは併用すべき手段として、環境汚染が極めて少なぐ生態系に調和し、かつ防除効果の優れたものとして生物農薬が知られている。農園芸作物の病害防除、特に灰色かび病に用いられてきた微生物として、トリコデルマ属、ダリオクラディウム属、バチルス属に属する微生物が挙げられ、これまでにこれらの微生物を含有する農園芸用殺菌剤組成物も数多く研究開発されてきた。

[0004] 例えば、バチルス属に属する細菌については、特開昭 63—273470号公報では、バチルス.ズブチリス（Bacillus subtilis) JB3株菌（NCIB12375)、バチルス.ズブチリス JB3. 6株菌（NCIBB12376)、ノチノレス 'ズブチノレス R1株菌（NCIB12616)、あるレヽはこれらの変異株等から得られる抗菌物質が植物の病気、動物及びヒトの微生物汚染等を抑制し、更に一般的な微生物汚染を抑制するとし、上記各菌株の培養物を用レ、て各種農園芸作物の病害を防除する試みがなされている (例えば特許文献 1参照 )。また、上記バチルス'ズブチリス JB3菌株（NCIB12375)、バチルス'ズブチリス JB3 • 6株菌（NCIBB12376)、ノくチノレス'ズブチノレス R1株菌（NCIB12616)、あるいはこれらの変異株等から得られる抗菌物質を単離し、これを各種農園芸作物の病害防除に用いるという試みがなされている（例えば特許文献 2参照）。その他、クヮの炭疽病や白紋羽病の防除微生物として、バチルス 'アミ口リクエファシエンスが知られている（例えば特許文献 3、非特許文献 1、非特許文献 2参照)。また、バチルス'ズブチリス（

Bacillus subtilis) QST-713株の芽胞製剤であるインプレッション水和剤が 2003年 5月に農薬登録を取得し、上市されている（例えば非特許文献 3参照）。

特許文献 1 :特開昭 63 - 273470号公報

特許文献 2：特開平 2 - 22299号公報

特許文献 3：特開平 11 - 246324号公報

非特許文献 1 :植物防疫第 56卷第 8号（2002)

非特許文献 2： Phytopathology Vol. 91 No. 2, 2001

非特許文献 3 :バイオコントローノレ Vol. 7 No. 1 , 2003

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] しかし、このようなバチルス属に属する細菌を応用した農園芸作物の病害防除方法では、植物病原菌の生育適温と病害防除細菌の生育適温とのずれが大きぐ何れも各種農園芸作物病害が発生する低温域での防除が必ずしも十分であるとは言えな力、つた。例えば、各種農園芸作物の灰色かび病は 15°C前後の低温での発病が極めて旺盛であり、 20°Cから 45°Cに生育適温を持つバチルス属に属する細菌では、特に気温が低く推移した場合、決して十分な防除効果が得られるとは限らなかった (例えば非特許文献 3参照)。

[0006] 本発明は、力かる実情に鑑みてなされたものであり、本発明の課題は、各種農園芸作物等の植物の病害、特に灰色かび病等の対象植物病害に対して、 10°Cから 15°C といった低温域においても一定して優れた防除能を有するバチルス属（Bacillus)に属する微生物、該微生物を含有する植物病害防除剤組成物や、これを用いて植物及び/又は土壌を処理する植物病害の防除方法、該微生物に主として由来しそのごく一部の特性を変更させた菌株、該微生物の選抜方法を提供することにある。課題を解決するための手段

[0007] 本発明者らは、上記の課題を解決するため、日本曹達株式会社榛原フィールドリサーチセンターの各圃場力採取した茶葉から、植物病害防除能を有する候補微生物を単離した。各圃場から採取した茶葉の葉面を少量の滅菌水内で洗浄し、その洗浄水を標準寒天培地（日水製薬社製)上に塗抹して、生育してきた微生物のコロニーを採取し、更に単一のコロニーとなるように分離 '取得した。これらの微生物の中から、常温 (20°C)で灰色かび病（Botrytis cinerea)に対して防除効果を有する菌株を選抜した。選抜された菌株について低温（10°C)で生育可能な菌株を更に選抜し、再度低温（14°C)で灰色かび病に対して防除効果を有する 2菌株の微生物を見出した。これら 2菌株は、コロニーの形態からバチルス属（Bacillus)の細菌と予想され、その形態や菌学的性質は以下の通りであった。

[0008] グラム陽性の桿菌でカタラーゼ反応陽性で、好気的に酸を生成し、バチルス型の芽胞形成が認められた。

[0009] 16SrDNAの約 l lOObp塩基配列を基に系統解析を行い相同性検索を行った結果、 4_5_1_1株 No. 30は、バチルス'ズブチリス（Bacillus subtilis) ,バチルス'ァ

Bacillus velesensis)と相同性一致率 99· 906%、バチルス'リチェ二ホルミス（Bacillus licheniformis)と相同性一致率 99· 719%であった。また、アビマニュアルキット（bio Merieux Industry)の API 50 CHを用い検討したところ、 4— 5— 1—1株 No. 30は、バチルス.ズブチリス（Bacillus subtilis)との相同性は 44· 7%、バチルス'リチェニホルミス（Bacillus licheniformis)との相同性は 35. 1 %であった。更に、嫌気的生育，プロピオン酸塩の利用の有無， 55°Cでの生育可否について検討したところ何れも陰性であつた。更に炭素化合物の利用性について調べたところ、 4-5-1— 1株 No. 30は、 lyceroU し _Arabinose、 Ribose、 D_Xylose、 D_Lrlucose、 D_^ructose、 D-Mannose^ Inositol、 MannitoU Sorbitol、ひ- Methy卜 D_glucoside、 Amygdaline、 Arbutin、 Esculin 、 Salicm、 Cellobiose、 Maltose^ Lactose^ Melibiose、 Sucrose^ Trehalose^ D-Raffinose 、 Starchy Glycogen^ β -Gentiobioseは、禾 ll用でき、 Erythritol、 D_Arabinose、 L-Xylose、 Adonitol、 β—Methyト D-xyloside、 Galactose^ L_Sorbose、 Rhamnose、 Dulcitol、ひ—Methy卜 D_mannoside、 N-Acethy卜 glucosamine、 Inuline、 Melezitose、 Xylitol、 D-Turanose、 D— Lyxose、 D-Tagatose、 D— Fucose、 L— Fucose、 D— Arabitol、 L-Arabitol Gluconate 2— ceto— gluconate、 5— ceto— gluconateは、禾 lj用できな力つた。

[0010] 一方、 4_5_21 0306株にっレヽて、 16SrDNAの約 700bp塩基酉己歹 IJを基に系統解析を行い相同性検索を行った結果、バチルス'ズブチリスと相同性一致率 99. 0% であった。また、アビマニュアルキット（bio Merieux Industry)の API 50 CHを用い検討したところ、 4—5—21 0306株は、バチルス'ズブチリス（Bacillus subtilis)との相同性は 87. 4%であった。更に炭素化合物の利用性について調べたところ、 4-5-21 0 30り株は、 ulyceroU L- Arabmose、 Ribose、 D- Glucose、 D- ructose、 D- Mannose、 Inositol、 MannitoU Sorbitol、ひ- Methy卜 D_glucoside、 Amygdaline、 Arbutin、 Esculin 、 Salicin、 Cellobiose、 Maltose^ Lactose、 Sucrose、 Trehalose^ D_Raffmose、 Starch、 Glycogenは、禾 lj用でき、 ErythritoU D— Arabinose、 D_Xylose、 L— Xylose、 Adonitol、 β -Methy卜 D_xyloside、 Galactose^ L-Sorbose、 Rhamnose、 Dulcitol、

-Methy卜 D_mannoside、 N-Acethy卜 glucosamine、 Melibiose、 Inuline、 Melezitose、 XylitoU β— Gentiobiose、 D— Turanose、 D— Lyxose、 D— Tagatose、 D— Fucose、 L_Fucose、 D-Arabito L-Arabitol Gluconate^ 2_ceto_gluconate、 5-ceto-gluconate は、利用できなかった。

[0011] 以上の結果を総合すると 4 5— 1 1株 Νο· 30は、はバチルス'ズブチリス（

Bacillus subtilis)と判断された。また、 4_5_21 0306株は、バチルス'ズブチリス（ Bacillus subtilis)の近縁種であるバチルスエスピー（Bacillus sp.)と判断された。これらの菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に 2004年 2月 10日にそれぞれ寄託番号 F ERM BP_10244、寄託番号 FERM BP—10245として寄託されている。そして、上記細菌は、灰色かび病の他、菌核病やうどんこ病、炭疽病、輪斑病，青かび病，緑かび病、軟腐病、かいよう病等広範囲の病害に対し優れた防除活性を有する。

[0012] すなわち、本発明は第 1に、市販のバチルス属製剤が十分な効果を示さない低温条件下で高い病害防除能を有するバチルス属（Bacillus sp.)に属する微生物を含有することを特徴とする植物病害防除剤組成物であり、第 2に低温条件が、 10 15°C であることを特徴とする 1記載の植物病害防除組成物であり、第 3に植物病害が、灰色かび病、菌核病、うどんこ病、炭疽病、輪斑病、青かび病、緑かび病、軟腐病、かレ、よう病の少なくともいずれかであることを特徴とする 1または 2記載の植物病害防除剤組成物であり、第 4にバチルス属（Bacillus sp.)に属する微生物が、バチルスズブチリス（Bacillus subtilis) 4_5_1_1株 No. 30であることを特徴とする 1から 3のいずれかに記載の植物病害防除剤組成物であり、第 5にバチルス属（Bacillus sp.)に属する微生物が、バチルスエスピー（Bacillus sp.) 4— 5— 21 0306株であることを特徴とする 1から 3のいずれかに記載の植物病害防除剤組成物であり、第 6にバチルス属（ Bacillus sp.)に属する微生物力バチルスズブチリス（Bacillus subtilis) 4—5—1—1株 No. 30に主として由来し，そのごく一部の特性を変更させた菌株であることを特徴とする 1から 3のいずれかに記載の植物病害防除剤組成物であり、第 7にバチルス属（ Bacillus sp.)に属する微生物力バチルスエスピー（Bacillus sp.) 4-5-21 0306 株に主として由来し，そのごく一部の特性を変更させた菌株であることを特徴とする 1 力 3のいずれかに記載の植物病害防除剤組成物であり、第 8に 1から 7のいずれかに記載の植物病害防除剤組成物を用いて、植物及び/又は土壌を処理することを特徴とする植物病害の防除方法であり、第 9にバチルスズブチリス（Bacillus subtilis ) 4— 5— 1—1株 No. 30であり、第 10にバチルスエスピー（Bacillus sp.) 4—5—21 0 306株であり、第 11にバチノレスズブチリス（Bacillus subtilis) 4— 5— 1—1株 No. 30 に主として由来し，そのごく一部の特性を変更させた菌株であり、第 12にバチルスエスピー（Bacillus sp.) 4—5—21 0306株に主として由来し，そのごく一部の特性を変更させた菌株であり、第 13に次の a— dの連続した各工程からなる）記載の低温で高い活性を有するバチルス属（Bacillus sp.)に属する微生物の選抜方法である。

a.菌株分離源力菌体を採取する工程

b.常温（18 25°C)で灰色かび病（Botrytis cinerea)に対して防除効果を有する菌株を選抜する工程

c.低温 (8 12°C)で生育可能な菌株を選抜する工程

d.低温（13 15°C)で灰色かび病（Botrytis cinerea)に対して防除効果を有する菌株を再選抜する工程

発明の効果

本発明の植物病害防除剤組成物は、市販のバチルス属製剤が十分な効果を示さない低温条件下で高い病害防除能を有する微生物を含有することにより市販のバチノレス属製剤が十分な効果を示さない低温条件下で高い病害防除能を示すと共に、長期にわたり病害防除能を保持することができ、また、一度に多種類の病害を防除すること力 Sできる。かかる植物病害防除剤組成物を用いた本発明の植物病害の防除方法によれば、植物病害防除剤組成物を各種農園芸作物等の植物や、土壌に散布する等の方法により、植物の病害、特に灰色かび病に対して効果的に防除することができる。また本発明の選抜方法によれば、市販のバチルス属製剤が十分な効果を示さない低温条件下で高い病害防除能を有する微生物を効率よく選抜できる。

発明を実施するための最良の形態

[0014] 本発明の植物病害防除剤組成物としては、茶葉から分離することができ、灰色かび病（Botrytis cinerea)に対して防除効果を有し、且つ全ての病害発生温度域、特に低温域で一定した優れた防除能を有するバチルス属（Bacillus sp.)に属する微生物、バチルスズブチリス（Bacillus subtilis) 4_5_l_l株 No. 30 (FERM BP—1024 4)、ノチノレスエスピー（Bacillus sp.) 4— 5— 21 0306株（FERM BP— 10245)力ら選ばれる少なくとも 1種を含有することを特徴とする植物病害防除剤組成物であれば特に制限されることはなレ、が、上記バチルス属（Bacillus sp.)に属する微生物が、菌核'病囷 (S.sclerotiorum)炭疽病囷 (C.lagenarium)、輪斑 Γ丙菌 (P.longiseta)、 ¾力び病菌（P.digitatum)、青かび病菌（P.italicum)、軟腐病（E.carotovora)、力レ、よう病（ X.campestris)等に対して防除効果を有するものが好ましい。

[0015] 本発明の植物病害防除剤組成物は、灰色かび病ゃ菌核病、うどんこ病、炭疽病、輪斑病、青かび病、緑かび病、軟腐病、かいよう病等に対して特に有効に用いることができる。

[0016] 本発明の植物病害防除剤組成物の製造には、バチルス属（Bacillus sp.)に属する微生物を固体培養あるいは液体培養等の公知の手段で増殖させた菌体を用いることができる。力かる微生物の増殖方法としては、菌体が増殖する方法であれば、特に培地の種類や培養条件等を問わず、いずれの方法でもよいが、例えば、固体培養の場合、標準寒天培地や普通寒天培地、ポテトデキストロース寒天培地等における 25 一 35°Cでの静置培養を、液体培養の場合、上記寒天培地から寒天を除いた各種液体培地等における 25— 35°Cでの振盪 ·攪拌培養等を挙げることができる。本発明の菌体とは栄養細胞または胞子等バチルス属の微生物が通常とりうるあらゆる形態を示す。また、菌体の使用形態としては、菌体自体のほか、その懸濁液ないし培養液又はこれらの濃縮物、ペースト状物、乾燥物、希釈物等のいずれの形態であっても適用することができる。

[0017] 本発明の病害防除剤組成物におけるバチルス属（Bacillus sp.)に属する菌の濃度は、特に制限されるものではないが、 1000 2000倍に希釈した際に、菌体濃度に換算して、 1 X 10¹¹一 1 X 10² cfu/ml、好ましくは 1 X 10⁹— 1 X 10⁴ cfuZmlの範囲を好適に例示することができる。また、本発明の病害防除剤組成物には通常使用される担体、界面活性剤、分散剤、補助剤等を配合させることができ、その形態としては通常の農薬のとり得る形態、例えば、粉剤、水和剤、乳剤、フロアブル剤、粒剤等の形態を採用することができる。

[0018] 本発明の農薬製剤には、例えば、炭酸カルシウムや塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、硫酸アンモニゥム等の無機塩類、クェン酸、リンゴ酸、ステアリン酸等の有機酸及びそれらの塩、乳糖、ショ糖等の糖類等、アルミナ粉、シリカゲル、ゼオライト、ヒドロキシアパタイト、リン酸ジノレコニゥム、リン酸チタン、酸化チタン、酸化亜鉛、ハイド口タルサイト、カオリナイト、モンモリロナイト、タルク、クレー、珪藻土、ベントナイト、ホワイトカーボン、カオリン、バーミキユライト等の固体担体を挙げることができる。また、必要に応じて、酸化防止剤、着色剤、滑剤、紫外線吸収剤、耐電防止剤などを添加することができる。更に、補助剤として、例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、アラビアゴム、澱粉等を添加することができる。

[0019] 界面活性剤および分散剤としては、通常の農薬用製剤に使用できるものであれば特に限定されるものではなぐ具体的には、非イオン性界面活性剤としてはソルビタン脂肪酸エステル (C )， POEソルビタン脂肪酸エステル (C )，ショ糖脂肪酸

12—18 12—18

エステルなどの糖エステル型で界面活性剤、 POE脂肪酸エステル（C ) , P〇E樹

12—18 脂酸エステル， POE脂肪酸ジエステル (C )などの脂肪酸エステル型界面活性剤

12—18

、 POEアルキルエーテル（C )等のアルコール型界面活性斉 [j

12—18 、 P〇Eアルキノレ（C

8

)フヱニルエーテル， P〇Eジアルキル（C )フヱニルエーテル， POEアルキル（ c )フエニルエーテルホルマリン縮合物などのアルキルフエノール型界面活性剤、

8— 12

ポリオキシエチレン 'ポリオキシプロピレンブロックポリマー，アルキル（C )ポリオキ

12— 18 シエチレン.ポリオキシプロピレンブロックポリマーエーテルなどのポリオキシエチレン

'ポリオキシプロピレンブロックポリマー型界面活性斉 1J、 POEアルキルアミン（C )，

12—18

POE脂肪酸アミド（C )などのアルキルアミン型界面活性剤、 POE脂肪酸ビスフヱ

12— 18

ニルエーテルなどのビスフエノール型界面活性剤、 POAベンジルフヱニル（またはフェユルフェ二ノレ）エーテル， P〇Aスチリルフエニル（またはフエユルフェ二ノレ）エーテルなどの多芳香環型界面活性剤、 P〇Eエーテルおよびエステル型シリコンおよびフッ素系界面活性剤などのシリコン系、フッ素系界面活性剤、 P〇Eヒマシ油， P〇E硬化ヒマシ油などの植物油型界面活性剤、ァニオン性界面活性剤としてはアルキルサルフェート（C , Na， NH , アルカノールァミン）， POEアルキルエーテルサルフエ

12—18 4

ート（C , Na， NH ,アルカノールァミン）， Ρ〇Εアルキルフヱニルエーテルサル

12—18 4

フェート（C , ΝΗ , アルカノールァミン, Ca) , POEベンジル（またはスチリル）フ

12—18 4

ェニル（またはフエエルフェニル）エーテルサルフェート（Na, NH ,アル力ノールアミ

4

ン），ポリオキシエチレン，ポリオキシプロピレンブロックポリマーサルフェート（Na, N H ,アルカノールァミン）などのサルフェート型界面活性剤、パラフィン（アルカン)ス

4

ルホネート（C ， Na， Ca，アルカノールァミン）， A〇S (C ， Na，アル力ノール

12—22 14—16

ァミン），ジアルキルスルホサクシネート（C ， Na， Ca, Mg)，アルキルベンゼンス

8—12

ルホネート（C ， Na， Ca, Mg, NH ，アルキルァミン，アル力ノール,ァミン，シクロ

12 4

へキシルァミン），モノまたはジアルキル（C )ナフタレンスルホネート（Na， NH ，

3—6 4 アルカノールァミン, Ca， Mg) ,ナフタレンスルホネート ·ホルマリン縮合物（Na， NH

4

)，アルキル（C )ジフヱニルエーテルジスルホネート（Na， NH )，リグニンスルホ

8—12 4

ネート（Na， Ca) , P〇Eアルキノレ（C )フエニルエーテルスルホネート（Na)， POE

8—12

ァノレキノレ（C )エーテルスルホコハク酸ハーフエステル（Na)などのスルホネート

12—18

型界面活性剤、カルボン酸型脂肪酸塩（C ， Na, K， NH ,アルカノールァミン）

12—18 4

, Ν-メチル-脂肪酸サルコシネート（C , Na)，樹脂酸塩 (Na, K)など P〇Eアル

12—18

キル（C )エーテルホスフェート（Na，アルカノールァミン）、 POEモノまたはジアル

12—18

キル（C )フエニルエーテルホスフェート（Na，アルカノールァミン）， POEベンジル (またはスチリル）化フエニル（またはフエエルフェニル）エーテルホスフェート（Na, ァルカノールァミン），ポリオキシエチレン 'ポリオキシプロピレンブロックポリマー（Na, アルカノールァミン），ホスファチジルコリン'ホスファチジルエタノールイミン（レシチン ) ,アルキル（C )ホスフェートなどのホスフェート型界面活性剤、カチオン性界面

8—12

活性剤としてはアルキルトリメチルアンモニゥムクロライド（C ) ,メチル ·ポリオキシ

12—18

エチレン ·アルキルアンモニゥムクロライド（C )，アルキル ·Ν-メチルピリジゥムブ

12—18

ロマイド（C )，モノまたはジアルキル（C )メチル化アンモニゥムクロライド，ァ

12—18 12—18

12—18 、 · 活性剤、アルキルジメチルベンザルコニゥムクロライド（C )，ベンゼトニゥムクロラ

12—18

イド（ォクチルフヱノキシエトキシェチルジメチルベンジルアンモニゥムクロライド）などのベンザルコニゥム型界面活性斉 ij、両性界面活性剤としてはジアルキル (C )ジァ

8—12 ミノェチルベタイン、アルキル（C )ジメチルベンジルベタイン等のベタイン型界面

12—18

活性剤、ジアルキル（C )ジアミノエチルグリシン、アルキル（C )ジメチルベンジ

8—12 12—18

ルグリシンなどのグリシン型界面活性剤等を例示することができる。これらは、 1種単独で、または 2種以上を混合して用いることができる。

[0020] その他、通常の化学農薬や生物農薬の製剤に用いられる手法及び担体や界面活性剤、分散剤等の材料を用いて、例えば粉剤、水和剤、乳剤、フロアブル剤、粒剤等の形態とすることが出来る。

[0021] 本発明の植物病害の防除方法は、上記本発明の植物病害防除剤組成物を用いて植物病害を防除する方法であれば、特に制限されるものではなぐ本発明の植物病害防除剤組成物を通常の化学農薬と同様、各種農園芸作物等の植物体や土壌に散布処理等する方法を挙げることができる。また、特開 2001—302407記載のように、該製剤を施設内に送風する送風装置の送風口付近に設置し、送風口から送出される空気とともに農薬を散布することもできる。散布処理に当たっては、本発明の植物病害防除剤組成物を適当量の水等で希釈して使用することができ、散布量としては、バチルス属（Bacillus sp.)に属する菌体濃度に換算して、通常 1 X 10¹¹一 1 X 10 2 cfu/ml,好ましくは 1 X 10⁹一 1 X 10⁴ cfuZmlの範囲とすることができる。

[0022] 本発明の市販のバチルス属製剤が十分な効果を示さない低温条件下とは具体的には、 10— 15°Cを示すことができる。また、本発明の特定の菌株に主として由来しそのごく一部の特性を変更させた菌株とは、自然的又は人為的に生じた変異体を選抜する方法、別の遺伝子を導入し形質を転換させた菌株を得る方法、細胞融合のうち非対称融合により得られた菌株を得る方法等により得られた菌株を示すことができる

[0023] 本発明の次の a dの連続した各工程からなる低温で高い活性を有するバチルスエスピー（Bacillus sp.)の選抜方法は具体的には次のような方法を示すことができる。工程 aの.菌株分離源から菌体を採取する工程は通常の菌学的に知られている方法を適用できる。工程 bの常温とは対象の植物病原菌が通常生育できる温度を示し、具体的には 16— 25°C、好ましくは 20°Cである。工程 cの低温とは、対象の植物病原菌の増殖が停止する最低温度近辺を示し、具体的には 8— 12°C、好ましくは 10°Cである。工程 dの低温とは常温と工程 cの低温との中間の温度を示し、具体的には 13— 1 5°C、好ましくは 14°Cである。

[0024] 以下、本発明の植物病害防除剤組成物や、これを用いた植物病害防除方法を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではなぐ本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、バチルス属（Bacillus sp.)の菌の種類、製剤の組成割合、剤型等を自由に変更することができる。また、以下の実施例では、バチルス属（Bacillus sp.)として FERM BP— 10244、 FERM BP—10245の 2菌株を用いた。

実施例 1

[0025] バチルス'ズブチリス菌の選抜

日本曹達株式会社榛原フィールドリサーチセンターの各圃場力採取した茶葉から、植物病害防除能を有する候補微生物を単離した。各圃場から採取した茶葉の葉面を少量の滅菌水内で洗浄し、その洗浄水を標準寒天培地（日水製薬社製）上に塗抹して、生育してきた微生物のコロニーを採取し、更に単一のコロニーとなるように分離'取得した。これらの微生物の中から、常温（20°C)で灰色かび病（Botrytis cinerea )に対して防除効果を有する菌株を選抜した。選抜された菌株について低温（10°C) で生育可能な菌株を更に選抜し、再度低温（14°C)で灰色かび病に対して防除効果を有するバチルスズブチリス（Bacillus subtilis) 4— 5— 1一 1株 No. 30、および、バチルスエスピー（Bacillus sp.) 4—5—21 0306株を見出した。

実施例 2

[0026] バチルス'ズブチリス菌体懸濁液の調製

300ml容三角フラスコに標準液体培地（酵母エキス 0. 25%,ペプトン 0. 5%,グノレコース 0. 1 %, pH7. 0) 150mlを入れ、加熱滅菌後、バチルスズブチリス（ Bacillus subtilis) 4—5—1—1株 No. 30、バチルスエスピー（Bacillus sp.) 4—5—21 0306株の前培養物 0. 1mlをそれぞれ接種し、往復振盪機中 28°C、 lOOrpmで 3日間培養した。培養液を水道水で洗浄する操作を 3回繰り返し、バチルスズブチリス（ Bacillus subtilis) 4—5—1—1株 No. 30、バチルスエスピー（Bacillus sp.) 4—5—21

0306株の菌体懸濁液を調製した。

実施例 3

[0027] 植物病害防除水和剤組成物の製造

実施例 2で調製したそれぞれのバチルス属菌体懸濁液を乾燥した。その乾燥物の生菌数は、それぞれ、 6 X 10^1Qcfu/g、 5. 5 X 10^1Qcfu/gであった。それぞれの菌体乾燥物 10重量部とラウリルサルフェートナトリウム塩 2重量部、ナフタレンスルホン酸（ナトリウム）ホルムアルデヒド縮合物 9重量部、硫酸カルシウム及びその水和物 79 重量部を均一に混合し、水和剤 A， Bを得た。水和剤 A， Bは、それぞれバチルスズプチリス（Bacillus subtilis) 4_5_1_1株 No. 30、バチルスエスピー（Bacillus sp.) 4-5-21 0306株を有効成分とした組成物である。

実施例 4

[0028] 植物病害防除剤組成物の灰色かび病防除効果試験 (室内試験）

実施例 3で得られたそれぞれの水和剤 A, Bを水道水で 1000倍に希釈して処理液を調製した。また、比較例として市販製剤であるボトキラー水和剤（出光興産株式会社製）とインプレッション水和剤（株式会社エス ·ディー ·エスバイオテック製）をそれぞれ水道水で 1000倍及び 500倍に希釈して処理液を調製した。それぞれの処理液をインゲンの花器に散布した。その後、花器をインゲン葉の上に置き灰色かび病の発生温度の低温域である 15°Cでインキュベートし、 24時間後灰色かび病の病原菌であるボトリシス'シネレア（Botrytis cinerea)の分生胞子懸濁液（5· 0 X 10⁵cfu/ml) をインゲンの花器に散布した。散布処理後、 15°Cで 5日間インキュベートした。また、無処理を対照とし、ボトリシス ·シネレア（Botrytis cinerea)の分生胞子懸濁液（5· 0 X 10⁵cfu/ml)のみを散布処理した。調查は、インゲン葉に形成された病斑直径を計測した。

[0029] [数 1] 防除価 = ( 1一（処理区の病斑直径無処理区の病斑直径)） X 1 0 0

[0030] 表 1から明らかなように、それぞれのバチルス属（Bacillus spj 2菌株は、インゲンの葉に対して病斑は認められず、インゲン灰色かび病に対して防除効果を有することが認められた。それに対し、ボトキラー水和剤とインプレッション水和剤は、インゲン灰色かび病に対し、それぞれ 19. 5, 19. 8と低い防除価であった。

[0031] [表 1] 表 1

実施例 5

[0032] 植物病害防除水和剤組成物のインゲンの灰色かび病防除効果試験（ポット試験) 実施例 3で得られたそれぞれの水和剤 A, Bを水道水で 1000倍に希釈して処理液を調製した。また、比較例としてボトキラー水和剤（出光興産株式会社)を水道水で 1 000倍に希釈して処理液を調製した。それぞれの処理液をインゲンのポットに散布処理した。 3日間隔で 2回散布処理し、 14°Cのインキュベーター内で栽培した。 2回散布の翌日灰色かび病の病原菌であるボトリシス 'シネレア（Botrytis dnerea)の分生胞子懸濁液（5. 0 X 10⁵cfuZml)をインゲンのポットに散布処理した。その後再び 14 °Cのインキュベーター内で栽培し、 1週間後健全及び発病幼果数を計測した。

[0033] 表 2から明らかなように、それぞれのバチルス属（Bacillus sp.) 2菌株は、インゲンの灰色かび病に対し、それぞれ 86. 4及び 82. 5と高い防除価が得られ、低温条件においてもインゲンの灰色かび病に対して高い防除効果を有することが認められた。それに対し、ボトキラー水和剤は、防除価 14. 4と不充分であった。

[0034] [表 2] 表 2

実施例 6

植物病害防除水和剤組成物のカンキッ果実の灰色かび病防除効果試験（圃場試験 )

実施例 3で得られた水和剤 A、 Bを水道水で 1000倍に希釈して処理液を調製した。また、比較例としてボトキラー水和剤（出光興産株式会社製）とインプレッション水和剤 (株式会社エス'ディー ·エスバイオテック製）を水道水で 1000倍及び 500倍に希釈して処理液を調製した。それぞれの処理液をビニルハウス内に植栽してあるナスに散布処理した。約 7日間隔で 2回散布処理し、最終散布 7日後に灰色かび病発病果数と健全果数を調査し、防除果を算出した。なお、感染源としてボトリシス.シネレア（ Botrytis cinerea)を感染させたカンキッ果実を試験ハウス内に点在させた。また、その試験期間中の気温を記録した。

[0036] 図 1に示したようにこのときの気温変化を見てみると最低気温は 15°Cを下回り、平均気温をとつても試験期間の半分以上は 15°Cを下回っている。また、 10。Cを下回る日も幾日か見受けられる。さらに最高気温を見ても試験初期は 25°Cに近い気温を示したが、中盤からは 16— 17°C、後半は 15°Cを下回り、気温の低い状態が続いている状況であった。このような低気温条件の中、表 3から明らかなように、バチルスズブチリス（Bacillus subtilis)4_5_l_l株 No. 30とバチルスエスピー（Bacillus sp.) 4_ 5-21 0306株は、ナス灰色かび病に対し、それぞれ 68. 1及び 80.4と高い防除価を示し、低気温条件に於いてもナス灰色かび病に対して高い防除効果を有することが認められた。それに対し、ボトキラー水和剤とインプレッション水和剤の防除価は、それぞれ 53. 1及び 59· 5と必ずしも十分とはいえないものであった。

[0037] [表 3] 表 3

ナス灰色かび病供試微生物発病果率防除価バチルスズブチリス（Bacillus 14. 0 68. 1 subtilis) 4一 5—1— 1株 No.

30

F ERM BP - 10244

バチルスエスピー（Bacillus sp. ) 8. 6 80. 4 4- 5- 21 0306株

F ERM BP - 10245

,ボトキラー水和剤 20. 6 53. 1 インプレッション水和剤 17, 8 59. 5 無処理 43. 9 実施例 7

[0038] 植物病害防除剤組成物の灰色かび病防除効果試験 (室内試験）

実施例 2と同様に培養'調製したバチルスズブチリス（Bacillus subtilis) 4-5-1-1 株 No. 30 FERM BP—10244菌体懸濁液の凍結乾燥物（1.0 X lCTcfuZg) 10%と昭和クレー 40%,塩ィ匕カリウム 40%,ニューカルゲン PS— P10%を均一に混合した後、粉砕して水和剤 Cを得た。それを水道水で 1000倍， 2000倍， 4000倍に希釈して処理液を調製した。また、比較例として市販製剤であるボトキラー水和剤（出光興産株式会社製）とインプレッション水和剤（株式会社エス ·ディー ·エスバイオテツク製）をそれぞれ水道水で 1000倍， 2000倍， 4000倍及び 500倍， 1000倍， 2000 倍に希釈して処理液を調製した。それぞれの処理液をインゲンの花器に散布した。その後、花器をインゲン葉の上に置き灰色かび病の発生温度の低温域である 15°C でインキュベートし、 24時間後灰色かび病の病原菌であるボトリシス.シネレア（ Botrytis cinerea)の分生胞子懸濁液（5· 0 X 10⁵cfu/ml)をインゲンの花器に散布した。散布処理後、 15°Cで 5日間インキュベートした。また、無処理を対照とし、ボトリシス'シネレア（Botrytis cinerea)の分生胞子懸濁液（5 · 0 X 10⁵cfu/ml)のみを散布処理した。調查は、インゲン葉に形成された病斑直径を計測した。

[0039] 表 4から明らかなように、バチルスズブチリス（Bacillus subtilis) 4—5—1—1株は、ボトキラー水和剤やインプレッション水和剤に比べ、散布液中の菌体濃度が少なくても高い灰色かび病防除活性を示すことが認められた。

[表 4]

表 4

供試薬剤希釈倍数インゲン葉病斑直径防除価バチルスズブチリス（Bacillus X1000 1. 6 95. 5 subtilis) X2000 1 0. 6 70. 1

4— 5— 1— 1株 No. 30 FE X4000 4. 4 87. 6 M BP— 10244

1. 0 X 10¹⁰ c f u/g

ボトキラー水和剤 X1000 12. 0 66. 1 1. 0 X 1 0 ^{χ 1}ο f u/g X2000 1 9. 2 45. 8

X 000 29. 8 15. 8 ィンプレツシヨン水和剤 X500 1 7. 8 49. 7 5. 0 X 10⁹c f u/g X1000 15. 0 57. 6

X2000 23. 6 33. 3 無処理 - 35. 4 実施例 8

[0040] 植物病害防除剤組成物のかんきつかいよう病菌防除効果試験 (室内試験）

実施例 7で使用した水和剤 Cを水道水で 1000倍に希釈し、傷を付けたレモン切取葉を浸漬処理した。加湿状態で 6時間静置後、傷口にかんきつかいよう病菌懸濁液 ( A = 0. 5)を滴下した。 25°Cで 10日間インキュベートした。また、無処理を対照と

600

し、かんきつ力、いよう病菌懸濁液のみを滴下処理した。調查は、下記基準に基づいて発病度を求めた。

接種 1週間後に発病度を

0 :かいようが認められない

1 :僅かに認められる

2 :認められる

3 :顕著に認められる

の 4段階に分類し、防除価を求めた。

[0041] 表 5から明らかなように、バチルスズブチリス（Bacillus subtilis) 4_5_l_l株 No.

30は、カンキッ力いよう病に対し、高い防除活性があることが認められることが明らかとなった。

[表 5]

表 5

実施例 9

植物病害防除剤組成物の軟腐病防除効果試験 (室内試験）

実施例 7で使用した水和剤 Cを水道水で 1000倍に希釈し、レタス切片を浸漬処理した。加湿状態で 6時間静置後、切片傷口に軟腐病菌懸濁液 (A—__ = 0. 5)を滴下した。 25°Cで 7日間インキュベートした。また、無処理を対照とし、軟腐病菌懸濁液のみを滴下処理した。調査は、下記基準に基づいて発病度を求め、防除価を算出した処理 7日後に発病度を

0 :病変なし

1：病変が接種部付近に留まる

2：病変が中肋部全体に及ぶが外皮の内側に留まる

3 :病変が外皮に及ぶ力左右の広がりが中肋部よりそれぞれ lcm未満

4 :病変が外皮に及び、中肋部より lcm以上広がる

の 5段階に分類し、防除価を求めた。

表 6から明らかなように、バチルスズブチリス（Bacillus subtilis) 4—5—1—1株 No. 30は、野菜類の軟腐病に対し、防除効果が認められることが明らかとなった。

[表 6]

表 6

産業上の利用可能性

本発明の植物病害防除剤組成物は、各種農園芸作物等の植物の病害、特に灰色かび病ゃ菌核病，うどんこ病，炭疽病，輪斑病，青かび病，緑かび病、軟腐病、かいよう病等種々様々な病害に対して、市販のバチルス属製剤が十分な効果を示さない低温条件下に於いても安定して優れた防除能を有する微生物を含有することにより長期に亘り病害防除能を保持することができ、また、一度に他種類の病害を防除すること力 Sできる。かかる植物病害防除剤組成物を用いた本発明の植物病害の防除方法によれば、植物病害防除剤組成物を各種農園芸作物等の植物や、土壌に散布する等の方法により、植物の病害、特に灰色かび病ゃ菌核病，うどんこ病，炭疽病，輪斑病，青かび病，緑かび病、軟腐病、かいよう病に対して効果的に防除することができる。

図面の簡単な説明

園 1]試験期間中の気温の変化を示した図である（実施例 6)

Claims

請求の範囲

[I] 市販のバチルス属製剤が十分な効果を示さない低温条件下で高い病害防除能を有するバチルス属（Bacillus sp.)に属する微生物を含有することを特徴とする植物病害防除剤組成物。

[2] 低温条件が、 10 15°Cであることを特徴とする請求項 1記載の植物病害防除組成物。

[3] 植物病害が、灰色かび病、菌核病、うどんこ病、炭疽病、輪斑病、青かび病、緑かび病、軟腐病、力いよう病の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項 1または 2 記載の植物病害防除剤組成物。

[4] バチルス属（Bacillus sp.)に属する微生物が、バチルスズブチリス（Bacillus subtilis)

4-5-1-1株 No. 30であることを特徴とする請求項 1から 3のいずれかに記載の植物病害防除剤組成物。

[5] バチルス属（Bacillus sp.)に属する微生物が、バチルスエスピー（Bacillus sp.) 4— 5 -21 0306株であることを特徴とする請求項 1から 3のいずれかに記載の植物病害防除剤組成物。

[6] バチルス属（Bacillus sp.)に属する微生物が、バチルスズブチリス（Bacillus subtilis) 4_5_1_1株 No. 30に主として由来し，そのごく一部の特性を変更させた菌株であることを特徴とする請求項 1から 3のいずれかに記載の植物病害防除剤組成物。

[7] バチルス属（Bacillus sp.)に属する微生物が、バチルスエスピー（Bacillus sp.) 4_5 -21 0306株に主として由来し，そのごく一部の特性を変更させた菌株であることを特徴とする請求項 1から 3のいずれかに記載の植物病害防除剤組成物。

[8] 請求項 1から 7のいずれかに記載の植物病害防除剤組成物を用いて、植物及び Z 又は土壌を処理することを特徴とする植物病害の防除方法。

[9] バチルスズブチリス（Bacillus subtilis) 4—5—1—1株 No. 30。

[10] バチルスエスピー（Bacillus sp.) 4_5_21 0306株。

[I I] バチルスズブチリス（Bacillus subtilis) 4_5_l_l株 No. 30に主として由来し，そのごく一部の特性を変更させた菌株。

[12] バチルスエスピー（Bacillus sp.) 4—5—21 0306株に主として由来し，そのごく一部の特性を変更させた菌株。

次の a— dの連続した各工程からなる請求項 1記載の低温で高い活性を有するバチルス属（Bacillus sp.)に属する微生物の選抜方法。

a.菌株分離源から菌体を採取する工程

c.低温 (8 12°C)で生育可能な菌株を選抜する工程