WO2005073381A2 - Procede de surproduction d'une proteine recombinante determinee par des souches monocaryotiques de pycronoporus cinnabarinus - Google Patents

Procede de surproduction d'une proteine recombinante determinee par des souches monocaryotiques de pycronoporus cinnabarinus Download PDF

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Alexandra M.C.R. Alves
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Anne Lomascolo
Jean-Claude Sigoillot
Marcel Asther
Han A.B. WÖSTEN
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Institut National De La Recherche Agronomique
Universite De Provence
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    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to the use of monocaryotic strains of filamentous fungi of the species Pycnoporus of the basidiomycete group, for the implementation of a process for the preparation of a specific recombinant protein, said process being carried out by overexpression of the gene coding for this protein in the aforementioned monocaryotic strain of Pycnoporus.
  • two fungal models are preferably used by large industrial groups in the context of the production of enzymes involved in plant biotransformations, such as metalloenzymes. These are ⁇ HAspergillus, and Trichoderma, which belong to the group of deuteromycetes.
  • the present invention stems from the demonstration by the inventors that the transformation of monocaryotic strains of P. cinnabarinus deficient for laccase activity using vectors containing the gene coding for this laccase and whose expression is under the control of a promoter identical to the endogenous pLac promoter of P. cinnabarinus laccase, leads to an equivalent production of laccase only when implementing a process of overproduction of laccase by induction of the endogenous promoter of this laccase by action ethanol on monocaryotic strains of P. cinnabarinus not deficient in laccase activity, and which equals g / 1.
  • the subject of the present invention is a process for preparing a specific recombinant protein, said process being carried out by overexpression of the gene coding for this determined protein in a monocaryotic strain of filamentous fungi of the species Pycnoporus of the basidiomycete group, and comprises: - a step of culturing the aforementioned monocaryotic strain of Pycnoporus, said strain being transformed using an expression vector containing the gene coding for the determined recombinant protein, the expression of which is placed under the control of a promoter corresponding to an endogenous promoter of the above-mentioned fungi, or of a different promoter (also called exogenous promoter), said promoter constituting or inducible, - where appropriate a step of inducing the above-mentioned
  • a more particular subject of the invention is a method as described above, characterized in that the monocaryotic strain of Pycnoporus used for the overexpression of the gene coding for the determined recombinant protein is as obtained by culturing the original dicaryotic strain at 30 ° C in the dark for 15 days, followed by an exposure step on day 2 to 3 weeks at room temperature until the formation of fruiting bodies corresponding to differentiated hyphae called basides , within which karyogamy then takes place (fusion of the nuclei), followed by meiosis which leads to the formation of four sexual spores, or genetically different haploid basidiospores, which, after germination, generates a monocaryotic mycelium.
  • the monocaryotic strain of Pycnoporus used in the above-mentioned method of the invention is a strain of Pycnoporus cinnabarinus.
  • the recombinant proteins determined to be overexpressed within the framework of the implementation of the method according to the invention correspond either to endogenous proteins of Pycnoporus, or to exogenous proteins different from the endogenous proteins of the strain of Pycnoporus used for the production of said proteins.
  • these exogenous proteins correspond to endogenous proteins of basidiomycetes other than Pycnoporus, such as the enzymes basidiomycetes involved in plant biotransformations, or correspond to endogenous proteins of strains of Pycnoporus different from the strain of Pycnoporus used for the production of said proteins.
  • the invention more particularly relates to a process as described above, characterized in that the determined recombinant proteins correspond: - to the following endogenous Pycnoporus proteins: * the metalloenzymes, such as laccase, or tyrosinase, * or cellobiose dehydrogenase, xylanase, ⁇ -glycosidase, invertase, or ⁇ -amylase, - with exogenous proteins chosen from the following: * tyrosinases from strains of Pycnoporus different from the strain of Pycnoporus used for production of said proteins, such as the tyrosinase of Pycnoporus sanguineus when the strain of Pycnoporus used for the production of this tyrosinase is different from Pycnoporus sanguineus, * laccases of basidiomycetes other than Pycnoporus, such as laccase of haloc
  • the monocaryotic strain of Pycnoporus used is deficient for the gene coding for the endogenous protein to which the determined recombinant protein corresponds, so as not to have to separating the determined recombinant protein from the endogenous protein to which it corresponds during the purification of said recombinant protein.
  • the monocaryotic strain of Pycnoporus used may not be deficient for the gene coding for the endogenous protein to which the determined recombinant protein corresponds, said strain. then being transformed using an expression vector containing the gene coding for the determined recombinant protein marked in order to distinguish it from the endogenous protein during the purification step.
  • the determined recombinant protein can be labeled with a histidine tag (His-tag).
  • the invention more particularly relates to a process for the preparation of recombinant laccases corresponding to the endogenous laccases of Pycnoporus, characterized in that it comprises: - a step of culturing a monocaryotic strain of Pycnoporus, the if necessary deficient for the gene coding for the endogenous laccase of Pycnoporus, transformed using an expression vector containing the gene coding for a laccase for Pycnoporus, if necessary marked, and whose expression is placed under the control of a promoter corresponding to the endogenous promoter of this laccase, a step of inducing the above-mentioned promoter, in particular by adding ethanol, or agricultural by-products containing lignocellulose such as wheat straw, corn bran and beet pulp, or compounds with an aromatic cycle such as 2,5-xylidine, veratrylic acid, gua ⁇ col, veratrylic alcohol, syringaldazin
  • the invention relates more particularly to a process as defined above, for the preparation of the recombinant laccase corresponding to the endogenous laccase of Pycnoporus cinnabarinus represented by SEQ ID NO: 2, characterized in that it comprises: - a stage of culturing a monocaryotic strain of Pycnoporus cinnabarinus, if necessary deficient for the gene coding for the endogenous laccase of Pycnoporus cinnabarinus, transformed using a vector of expression containing the nucleotide sequence (or nucleic acid) SEQ LD NO: 1 coding for the recombinant laccase represented by SEQ JO NO: 2, where appropriate marked, in particular by a His-tag label, and the expression of
  • a more particular subject of the invention is a process for the preparation of recombinant laccases corresponding to the endogenous laccases of Pycnoporus, characterized in that it comprises: - a step of culturing a monocaryotic strain of Pycnoporus, if necessary deficient for the gene coding for the endogenous laccase of Pycnoporus, transformed using an expression vector containing the gene coding for a laccase of Pycnoporus, the expression of which is placed under the control of an exogenous promoter chosen from: * the gpd promoter for the expression of the gene coding for glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from the common Schizophyllum, the nucleotide sequence of which is represented by SEQ ID NO: 4, * or the sc3 promoter of the expression of the gene coding for the common Schizophyllum hydrophobin, the nucleotide sequence of which is represented by SEQ ID NO: 4,
  • the invention relates more particularly to a process as defined above, for preparing the laccase corresponding to the endogenous laccase of Pycnoporus cinnabarinus represented by SEQ ID NO: 2, characterized in that it comprises: - a step of setting in culture of a monocaryotic strain of Pycnoporus cinnabarinus, if necessary deficient for the gene coding for the endogenous laccase of Pycnoporus cinnabarinus, transformed using an expression vector containing the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 coding for the recombinant laccase represented by SEQ ID NO: 2, where appropriate marked, in particular by a His-tag label, the expression of which is placed under the control of the exogenous promoter gpd or sc3, - the recovery, and, where appropriate, the purification of the recombinant laccase, where appropriate labeled, represented by SEQ ID NO: 2 produced in the culture medium
  • the invention more particularly relates to a process as defined above, for the preparation of recombinant tyrosinase corresponding to the tyrosinase of Pycnoporus sanguineus represented by SEQ JD NO: 16, characterized in that it comprises: - a step of setting in culture of a monocaryotic strain of Pycnoporus cinnabarinus transformed using an expression vector containing the nucleotide sequence SEQ ID NO: 15 coding for the recombinant tyrosinase represented by SEQ JD NO: 16, where appropriate labeled sequence SEQ JD NO: 15 being advantageously preceded by the nucleotide sequence delimited by the nucleotides located at positions 128 and 190 of SEQ ID NO: 1 coding for the signal peptide of Pycnoporus cinnabarinus delimited by the first 21 amino acids of SEQ ID NO: .2 , and the expression of which is placed
  • the invention relates more particularly to a process as defined above, for the preparation of recombinant laccase corresponding to the laccase of halocyphina villosa shown in FIG. 12 (SEQ JD NO: 18), characterized in that it comprises: - a step of culturing a monocaryotic strain of Pycnoporus cinnabarinus, if necessary deficient for the gene coding for the endogenous lcase of Pycnoporus cinnabarinus, transformed using an expression vector containing the nucleotide sequence represented on the FIG.
  • SEQ JD NO: 17 coding for the recombinant laccase represented by SEQ ID NO: 18, where appropriate marked, and the expression of which is placed under the control of the pLac promoter corresponding to the endogenous promoter of the laccase of Pycnoporus cinnabarinus , the sequence of said pLac promoter being represented by SEQ JD NO: 3, - a step of induction with ethanol of the aforementioned pLac promoter, - recovery, and, where appropriate, the purification of the recombinant laccase, where appropriate labeled, represented by SEQ ID NO: 18 produced in the culture medium.
  • the subject of the invention is also the nucleotide sequence coding for the promoter pLac of the endogenous laccase of Pycnoporus cinnabarinus, and corresponding to the sequence SEQ ID NO: 3, or any sequence derived from this promoter by substitution, addition or deletion of a or several nucleotides and retaining the property of being a promoter of the expression of sequences.
  • the invention also relates to any expression vector, such as the plasmid pELP, characterized in that it comprises the sequence SEQ ID NO: 3 of the aforementioned pLac promoter, or a derived sequence as defined above.
  • the subject of the invention is more particularly any expression vector as defined above, characterized in that it comprises a gene coding for a specific recombinant protein, and the expression of which is placed under the control of the aforementioned pLac promoter , or a derived sequence as defined above.
  • the invention relates more particularly to any expression vector as defined above, characterized in that the determined recombinant protein is a protein corresponding: - to the following endogenous Pycnoporus proteins: * the metalloenzymes, such as laccase, or the tyrosinase, * or cellobiose dehydrogenase, xylanase, ⁇ -glycosidase, invertase, or ⁇ -amylase, - with exogenous proteins chosen from the following: * tyrosinases of strains of Pycnoporus different from the strain of Pycnoporus used for the production of said proteins, such as the tyrosinase of Pycnoporus sanguineus when the strain of Pycnoporus used for the production of this tyrosinase is different from Pycnoporus sanguineus, * the laccases of basidiomycetes other than Pycnoporus
  • the invention also relates to any host cell transformed using an expression vector as defined above.
  • the subject of the invention is more particularly any host cell mentioned above, corresponding to monocaryotic cells of Pycnoporus strains, such as the Pycnoporus cinnabarinus strains.
  • the subject of the invention is also the use of expression vectors as defined above, or of host cells mentioned above, for the implementation of a method of overproduction of a determined recombinant protein as defined above. above.
  • Pycnoporus cinnabarinus Expression System namely the development of an efficient fungal expression model making it possible to overcome the industrial models currently used by major European groups (Aspergillus and Trichoderma).
  • Pycnoporus cinnabarinus Expression System namely the development of an efficient fungal expression model making it possible to overcome the industrial models currently used by major European groups (Aspergillus and Trichoderma).
  • it is a eukaryotic expression system and more specifically a filamentous fungus of the basidiomycete group, Pycnoporus cinnabarinus, which has been developed by the inventors for the overexpression of proteins of industrial interest.
  • the purpose of this step is to isolate and then select haploid cell lines from the sexual spores of a filamentous fungus, Pycnoporus cinnabarinus, which will be used as a host for the expression of the genes of interest.
  • P. cinnabarinus is a heterothallic fungus which is found in the wild in the dicaryotic form (two unpaired nuclei per cell) from which monocaryotic lines are selected (one nucleus per cell), potentially more stable and therefore usable for transformation genetic.
  • lac " laccase
  • the fungus can multiply vegetatively (Fig. 1).
  • basides Within differentiated hyphae called basides, then takes place karyogamy (fusion of nuclei), followed by meiosis which leads to the formation of four sexual spores, or genetically different haploid basidiospores. After germination, each basidiospore generates a monocaryotic mycelium. A simple colorimetric test then makes it possible to select only the strains lacking laccase activity.
  • the fruiting medium is composed of 2% malt extract (PN) and agar (1.6% P / N).
  • the cultures are sown in Petri dishes and kept at 30 ° C in the dark for 15 days before exposing them to the day 2 to 3 weeks at room temperature.
  • the f uctification body appears orange-red.
  • the monospores are then harvested with sterile water on the lid of the Petri dish.
  • the suspension is diluted and cultured in Petri dishes containing MA2 medium (2% P / N malt and 2% P / N agar) in order to isolate colonies. Isolated pure cultures are pricked and kept in MA2 medium at 30 ° C for 5 days and stored at 4 ° C.
  • reaction mixture 100 ng of genomic DNA; 0.2 mM dATP, dCTP, dTTP, and dGTP; 25 pmol of each nucleotide primer; 0.1 volume of 10X Pfu polymerase buffer (100 mM Tris-HCl, 15mM MgCl, 500 mM KCl, pH 8.3) and 1 U of Pfu polymerase.
  • 10X Pfu polymerase buffer 100 mM Tris-HCl, 15mM MgCl, 500 mM KCl, pH 8.3
  • the reaction conditions are as follows: 5 cycles of 94 ° C, 5 min; 55 ° C, 30 s; and 72 ° C, 4 min; then 25 cycles of 94 ° C, 30 s; 55 ° C, 30 s, and 72 ° C, 3 min.
  • a step of 10 min at 72 ° C. is carried out in order to finish the reaction.
  • a band of 1.64 kbp was obtained corresponding to the central part of the laccase gene.
  • the DNA sequence was cloned into pGEM-T in order to sequence this part of the gene.
  • the PCR reaction is carried out with 150 ng of DNA cut by PstI and recircularized on itself by ligation and the nucleotide primers Fex (SEQ ID NO: 8; GGATAACTACTGGATCCGCG) and Rex (SEQ ID NO: 9; CGCAGTATTGCGTGGAGAG).
  • the reaction conditions are as follows: 5 cycles of 94 ° C, 5 min; 55 ° C, 30 s; and 72 ° C, 5 min; then 25 cycles of 94 ° C, 30 s; 55 ° C, 30 s, and 72 ° C, 4 min with a final step of 10 min at 72 ° C.
  • the amplified DNA fragment corresponds to a 2.7 kbp band which has been cloned into pGEM-T and sequenced.
  • the entire gene coding for laccase was then defined by combining the central part and the amplified 5 'and 3' parts.
  • the entire gene was amplified (3.331 kbp, FIG. 4) with the nucleotide primers Fin (SEQ JD NO: 10; GACATCTGGAGCGCCTGTC) and Rin (SEQ ID NO: 11; ATCGAAGGTTCCGATGACTGACATGAC) from genomic DNA of P. cinnabarinus.
  • This gene was also cloned from the genomic DNA of P. cinnabarinus ss3 and was found to be identical to that isolated in P. cinnabarinus I-937.
  • a terminator of the gene coding for hydrophobin sc3 from Schizophyllum commune was placed downstream in order to complete the transcription step.
  • This vector called pELP will be used for the homologous expression of laccase (Fig. 6).
  • Two other heterologous promoters were used in this study. They are the promoters of the genes coding for glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (gpd) and hydrophobin (sc3) from Schizophyllum commune (Fig. 6), constituting respectively the pEGT and pESC expression vectors.
  • the fungus culture is centrifuged for 10 min at 2000 rpm in an oscillating rotor (50 ml tube). Sixteen g (wet weight) are washed in 40 ml of a 0.5 M MgSO 4 solution or 0.5 M sucrose. In the case of the use of sucrose, the lyric enzyme used to digest the walls is diluted in sucrose. The mycelium is then centrifuged 10 min at 2000 rpm and the supernatant removed.
  • the supernatant containing the protoplasts is carefully transferred to a new 50 ml.
  • the remaining pellet may be re-incubated with 25 ml of a 0.5 M MgSO 4 solution to recover the maximum of protoplasts (the centrifugation step is then repeated).
  • a volume of sorbitol 1 M equal to that of the preparation of the protoplasts, is added to it.
  • the protoplasts are allowed to release the water.
  • This preparation is then centrifuged 10 min at 2000 rpm.
  • the supernatant is removed, while leaving a little sorbitol.
  • the protoplasts are transferred to a new tube.
  • the previous tube is rinsed with the 1M sorbitol solution and the protoplasts recovered, added to the new tube.
  • the protoplasts are counted and centrifuged for 10 min at 2000 rpm. They are then diluted to a concentration of
  • Two and a half ml of regeneration medium (per 100 ml: glucose 2 g, MgSO 4 , 7H 2 0 12.5 g, K ⁇ 2 PO 4 0.046 g, K 2 HPO 4 0.1 g, bacto peptone 0.2 g , yeast extract 0.2 g) are added to the protoplasts which are incubated overnight at 30 ° C.
  • Selection boxes (YM medium containing phleomycin at 7 ⁇ g / ml, square boxes) are preheated to 37 ° C.
  • top agar Low Melting Point agarose 1% diluted in YM medium containing phleomycin 7 to 10 ⁇ g / ml
  • the regeneration medium containing the protoplasts are poured onto the dishes. preheated selection.
  • the dishes are incubated at 30 ° C for 4 days. The transformants are then transferred to new selection boxes.
  • the activity over time was followed for the transformants GPD14 and 1.2.7 (Fig. 11).
  • the activity is detectable from 3-4 days and increases up to 12 days to reach approximately 1200 nkatal / ml or 72000 U / l with addition of ethanol in the culture medium.
  • Figure 1 Isolation of monocaryotic strain deficient for laccase activity.
  • Figure 2 Isolation of the gene coding for the laccase of Pycnoporus cinnabarinus laccase.
  • Figure 3 Southern blot study of the gene coding for the laccase of Pycnoporus cinnabarinus.
  • Figure 4 Sequence of the gene coding for the laccase of Pycnoporus cinnabarinus.
  • Figure 5 Sequence of the pLac promoter sequence of the gene coding for the laccase of Pycnoporus cinnabarinus (up to the ATG coding for the methionine of laccase).
  • Figure 6 Physical map of the three expression vectors pEGT, pESC, pELP, used for the production of laccase in Pycnoporus cinnabarinus.
  • Figure 7 Nucleotide sequence of the pEGT vector, containing the promoter of the gpd gene (4480-5112), a marker of resistance to phleomycin (507-1822) and the terminator of the sc3 gene (71-507).
  • Figure 8 Nucleotide sequence of the vector pESC, containing the promoter of the sc3 gene (1-1033), a marker for resistance to phleomycin (1540-2855) and the terminator of the sc3 gene (1104-1540). - ,, --- ,, PCT / FR2005 / 000093 15
  • Figure 9 Nucleotide sequence of the pELP vector, containing the promoter of the laccase gene (4457-6983), a marker of resistance to phleomycin (507-1822) and the terminator of the sc3 gene (71-507)
  • Figure 10 Production results of transformants with the most important activities. The culture was carried out with or without (control) ethanol.
  • Figure 11 Monitoring of the laccase activities of transformants GPD 14 and 12.7 as a function of time with or (control) without ethanol.
  • Figure 12 Sequence of the gene coding for halocyphina villosa laccase.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation de souches monocaryotiques de champignons filamenteux de l'espèce Pycnoporus du groupe basidiomycète, pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation d'une protéine recombinante déterminée, ledit procédé étant effectué par surexpression du gène codant pour cette protéine dans la souche monocaryotique susmentionnée de Pycnoporus

Description

PROCEDE DE SURPRODUCTION D'UNE PROTEINE RECOMBINANTE DETERMINEE PAR DES SOUCHES MONOCARYOTIQUES DE P. CINNABARINUS
La présente invention concerne l'utilisation de souches monocaryotiques de champignons filamenteux de l'espèce Pycnoporus du groupe basidiomycète, pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation d'une protéine recombinante déterminée, ledit procédé étant effectué par surexpression du gène codant pour cette protéine dans la souche monocaryotique susmentionnée de Pycnoporus. . A l'heure actuelle, deux modèles fongiques sont utilisés préférentiellement par les grands groupes industriels dans le cadre de la production d'enzymes intervenant dans les biotransformations végétales, telles que les métalloenzymes. Il s'agit ôHAspergillus, et de Trichoderma, qui appartiennent au groupe des deutéromycètes. Toutefois, les rendements de production à l'aide de ces modèles, notamment en production de laccases, n'excèdent pas les 150 mg/1. La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs du fait que la transformation de souches monocaryotiques de P. cinnabarinus déficientes pour F activité laccase à l'aide de vecteurs contenant le gène codant pour cette laccase et dont l'expression est sous le contrôle d'un promoteur identique au promoteur pLac endogène de la laccase de P. cinnabarinus, conduit à une production équivalente de laccase que lors de la mise en œuvre d'un procédé de surproduction de laccase par induction du promoteur endogène de cette laccase par action de l'éthanol sur des souches monocaryotiques de P. cinnabarinus non déficientes pour l'activité laccase, et qui égale le g/1. Des résultats similaires ont été obtenus par les Inventeurs en utilisant le promoteur gpd, et le promoteur sc3 de Schizophyllum commune, en lieu et place du promoteur pLac susmentionné. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une protéine recombinante déterminée, ledit procédé étant effectué par surexpression du gène codant pour cette protéine déterminée dans une souche monocaryotique de champignons filamenteux de l'espèce Pycnoporus du groupe basidiomycète, et comprend : - une étape de mise en culture de la souche monocaryotique de Pycnoporus susmentionnée, ladite souche étant transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine recombinante déterminée, dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur correspondant à un promoteur endogène des champignons susmentionnés, ou d'un promoteur différent (encore désigné promoteur exogène), ledit promoteur étant constitutif ou inductible, - le cas échéant une étape d'induction du promoteur susmentionné, lorsque celui-ci est inductible, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la protéine recombinante déterminée, produite dans le milieu de culture. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce que la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée pour la surexpression du gène codant pour la protéine recombinante déterminée, est telle qu'obtenue par mise en culture de la souche dicaryotique d'origine à 30°C dans le noir pendant 15 jours, suivie d'une étape d'exposition au jour 2 à 3 semaines à température ambiante jusqu'à la formation d'organes de fructification correspondant à des hyphes différenciées appelées basides, au sein desquels a alors lieu la caryogamie (fusion des noyaux), suivie de la méiose qui conduit à la formation de quatre spores sexuées, ou basidiospores haploïdes génétiquement différentes, qui, après germination, engendre un mycélium monocaryotique. Avantageusement, la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée dans le procédé susmentionné de l'invention, est une souche de Pycnoporus cinnabarinus. Les protéines recombinantes déterminées surexprimées dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, correspondent soit à des protéines endogènes de Pycnoporus, soit à des protéines exogènes différentes des protéines endogènes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines. Notamment ces protéines exogènes correspondent à des protéines endogènes de basidiomycètes autres que Pycnoporus, telles que les enzymes basidiomycètes intervenant dans les biotransformations végétales, ou correspondent à des protéines endogènes de souches de Pycnoporus différentes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce que les protéines recombinantes déterminées correspondent : - aux protéines endogènes de Pycnoporus suivantes : * les métalloenzymes, telles que la laccase, ou la tyrosinase, * ou la cellobiose déshydrogénase, la xylanase, la β-glycosidase, l'invertase, ou l'α-amylase, - aux protéines exogènes choisies parmi les suivantes : * les tyrosinases de souches de Pycnoporus différentes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines, telle que la tyrosinase de Pycnoporus sanguineus lorsque la souche de Pycnoporus utilisée pour la production de cette tyrosinase est différente de Pycnoporus sanguineus, * les laccases de basidiomycètes autres que Pycnoporus, telle que la laccase d'halocyphina villosa (basidiomycète halophile), * les cinnamoyl estérases A (numéro EMBL Y09330) et B (numéro EMBL ANI309807) dAspergillus niger. Avantageusement, notamment dans le cas de la préparation de protéines recombinantes déterminées correspondant aux protéines endogènes de Pycnoporus, la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée est déficiente pour le gène codant pour la protéine endogène à laquelle correspond la protéine recombinante déterminée, afin de ne pas avoir à séparer la protéine recombinante déterminée de la protéine endogène à laquelle elle correspond lors de la purification de ladite protéine recombinante. En variante, notamment dans le cas de la préparation de protéines recombinantes déterminées correspondant aux protéines endogènes de Pycnoporus, la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée peut ne pas être déficiente pour le gène codant pour la protéine endogène à laquelle correspond la protéine recombinante déterminée, ladite souche étant alors transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine recombinante déterminée marqμée afin de la distinguer de la protéine endogène lors de l'étape de purification. A titre d'illustration, la protéine recombinante déterminée peut être marquée par une étiquette histidine (His-tag). A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation de laccases recombinantes correspondant aux laccases endogènes de Pycnoporus, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour une laccase de Pycnoporus, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur correspondant au promoteur endogène de cette laccase, - une étape d'induction du promoteur susmentionné, notamment par addition d'éthanol, ou de sous-produits agricoles contenant de la lignocellulose comme la paille de blé, les sons de maïs et la pulpe de betterave, ou des composés à cycle aromatique comme la 2,5-xylidine, l'acide vératrylique, le guaïcol, l'alcool vératrylique, la syringaldazine, l'acide férulique, l'acide caféique et les lignosulfonates, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus susmentionnée produite dans le milieu de culture, notamment selon la méthode décrite dans Sigoillot J.C., Herpoel L, Frasse P., Moukha S., Lesage-Meessen L., Asther M. 1999 ; Laccase production by a monokaryotic strain Pycnoporus cinnabarinus derived from a dikaryotic strain ; World Journal of Microbiology and Biotechnology 15, 481- 484. L'invention concerne plus particulièrement un procédé tel que défini ci-dessus, de préparation de la laccase recombinante correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus représentée par SEQ ID NO : 2, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique (ou acide nucléique) SEQ LD NO : 1 codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ JO NO : 2, le cas échéant marquée, notamment par une étiquette His-tag, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase susmentionnée, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ ID NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 2 produite dans le milieu de culture, notamment selon la méthode décrite dans Sigoillot J.C., et al. (1999) susmentionné. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation de laccases recombinantes correspondant aux laccases endogènes de Pycnoporus, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour une laccase de Pycnoporus dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur exogène choisi parmi : * le promoteur gpd de l'expression du gène codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate déhydrogénase de Schizophyllum commune, dont la séquence nucléotidique est représentée par SEQ ID NO : 4, * ou le promoteur sc3 de l'expression du gène codant pour l'hydrophobine de Schizophyllum commune, dont la séquence nucléotidique est représentée par SEQ ID NO : 5, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus susmentionnée produite dans le milieu de culture, notamment selon la méthode, décrite dans Sigoillot J.C., et al. (1999) susmentionné. • L'invention concerne plus particulièrement un procédé tel que défini ci-dessus, de préparation de la laccase correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus représentée par SEQ ID NO : 2, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ ID NO : 2, le cas échéant marquée, notamment par une étiquette His-tag, dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur exogène gpd ou sc3, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 2 produite dans le milieu de culture, notamment selon la méthode décrite dans Sigoillot J.C., et al. (1999) susmentionné. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, de préparation de tyrosinase recombmante correspondant à la tyrosinase de Pycnoporus sanguineus représentée par SEQ JD NO : 16, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 15 codant pour la tyrosinase recombinante représentée par SEQ JD NO : 16, le cas échéant marquée, la séquence SEQ JD NO : 15 étant avantageusement précédée par la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 128 et 190 de SEQ ID NO : 1 codant pour le peptide signal de Pycnoporus cinnabarinus délimité par les 21 premiers aminoacides de SEQ ID NO :.2, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase de Pycnoporus cinnabarinus, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ JD NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la tyrosinase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ JD NO : 16 produite dans le milieu de culture. L'invention concerne plus particulièrement un procédé tel que défini ci-dessus, de préparation de laccase recombinante correspondant à la laccase d'halocyphina villosa représentée sur la figure 12 (SEQ JD NO : 18), caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique représentée sur la figure 12 (SEQ JD NO : 17) codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ ID NO : 18, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase de Pycnoporus cinnabarinus, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ JD NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 18 produite dans le milieu de culture. L'invention a également pour objet la séquence nucléotidique codant pour le promoteur pLac de la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, et correspondant à la séquence SEQ ID NO : 3, ou toute séquence dérivée de ce promoteur par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides et conservant la propriété d'être un promoteur de l'expression de séquences. L'invention concerne également tout vecteur d'expression, tel que le plasmide pELP, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID NO : 3 du promoteur pLac susmentionné, ou une séquence dérivée telle que définie ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet tout vecteur d'expression tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour une protéine recombinante déterminée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac susmentionné, ou d'une séquence dérivée telle que définie ci-dessus. L'invention concerne plus particulièrement tout vecteur d'expression tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la protéine recombinante déterminée est une protéine correspondant : - aux protéines endogènes de Pycnoporus suivantes : * les métalloenzymes, telles que la laccase, ou la tyrosinase, * ou la cellobiose déshydrogénase, la xylanase, la β-glycosidase, l'invertase, ou l'α-amylase, - aux protéines exogènes choisies parmi les suivantes : * les tyrosinases de souches de Pycnoporus différentes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines, telle que la tyrosinase de Pycnoporus sanguineus lorsque la souche de Pycnoporus utilisée pour la production de cette tyrosinase est différente de Pycnoporus sanguineus, * les laccases de basidiomycètes autres que Pycnoporus, telle que la laccase d'halocyphina villosa (basidiomycète halophile), * les cinnamoyl estérases A et B d'Aspergillus niger. L'invention concerne également toute cellule hôte transformée à l'aide d'un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet toute cellule hôte susmentionnée, correspondant à des cellules monocaryotiques de souches de Pycnoporus, telles que les souches de Pycnoporus cinnabarinus. L'invention a également pour objet l'utilisation de vecteurs d'expression tels que définis ci-dessus, ou de cellules hôtes susmentionnées, pour la mise en oeuvre d'un procédé de surproduction d'une protéine recombinante déterminée telle que définie ci- dessus. L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit du SEPC : Système d'Expression Pycnoporus cinnabarinus, à savoir du développement d'un modèle d'expression fongique performant permettant de s'affranchir des modèles industriels utilisés actuellement par les grands groupes européens (Aspergillus et Trichoderma). En résumé, il s'agit d'un système d'expression eucaryote et plus spécifiquement de champignon filamenteux du groupe basidiomycète, Pycnoporus cinnabarinus, qui a' été développé par les Inventeurs pour la surexpression de protéines d'intérêt industriel. Ce travail a été fait dans le cadre de l'étude de métalloenzymes, telles que les laccases, et en particulier a permis de cloner les gènes impliqués pour leur surexpression, et de surproduction des laccases en grande quantité à l'aide de fermenteurs, ceci afin de les utiliser dans des applications industrielles à usage alimentaire (panification, préparation de boissons afin de moduler la couleur du thé, aider à la clarification des jus de fruits et des boissons alcoolisées, formation d' agropolymères) et non alimentaire (traitement des «jeans », dégradation de polluants aromatiques dans les sols, bioblanchiment des fibres lignocellulosiques dans le domaine des pâtes à papier).
I) Obtention de lignées monocaryotiques de Pycnoporus cinnabarinus pour la transformation du champignon et la surproduction de gènes d'intérêt.
Cette étape a pour but d'isoler puis de sélectionner des lignées cellulaires haploïdes issues des spores sexuées d'un champignon filamenteux, Pycnoporus cinnabarinus, qui seront utilisées en temps qu'hôte pour l'expression des gènes d'intérêt. P. cinnabarinus est un champignon hétérothallique qui se trouve à l'état sauvage sous forme dicaryotique (deux noyaux non appariés par cellule) à partir duquel des lignées monocaryotiques sont sélectionnées (un noyau par cellule), potentiellement plus stable et donc utilisable pour la transformation génétique. Dans le cadre de cette étude les Inventeurs se sont attachés à sélectionner de lignées monocaryotiques déficientes pour l'activité laccase (lac"). A l'état dicaryotique, le champignon peut se multiplier par voie végétative (Fig. 1). Mais, sous l'influence de conditions environnementales particulières, on peut induire, en laboratoire, la formation d'organes de fructification. Au sein d'hyphes différenciées appelées basides, a alors lieu la caryogamie (fusion des noyaux), suivie de la méiose qui conduit à la formation de quatre spores sexuées, ou basidiospores haploïdes génétiquement différentes. Après germination, chaque basidiospore engendre un mycélium monocaryotique. Un simple test colorimétrique permet ensuite de ne sélectionner que les souches dépourvues d'activité laccase.
1) Isolement des souches monocaryotiques Le milieu de fructification est composé d'extrait de malt 2% (PN) et de l'agar (1,6% P/N). Les cultures sont ensemencées dans des boites de Pétri et gardées à 30°C dans le noir pendant 15 jours avant de les exposer au jour 2 à 3 semaines à température ambiante. Le corps de f uctification apparaît orange-rouge. Les monospores sont alors récoltées avec de l'eau stérile sur le couvercle de la boite de Pétri. La suspension est diluée et mise en culture dans des boites de Pétri contenant un milieu MA2 (malt 2% P/N et agar 2% P/N) dans le but d'isoler des colonies. Des cultures pures isolées sont piquées et gardées dans du milieu MA2 à 30°C pendant 5 jours et stockées à 4°C. Dans ces conditions, une souche monocaryotique déficiente pour l'activité laccase a été sélectionnée pour la transformation avec le vecteur d'expression dans le but de surexprimer le gène de la laccase. Une étude en Southern blot a été effectuée et a permis de démontrer que cette souche est déficiente pour le gène codant pour la laccase chez P . cinnabarinus.
2) Test rapide de détection de l'activité laccase des colonies monospores Un morceau de mycélium est déposé dans une boite de Pétri et recouvert d'une goutte de syringaldazine 0,1% (P/N) en solution éthanolique ; Après 15 minutes, un changement de couleur est observé. Le 2,2-azino-bis-[3-ethylthiazoline-6-sulfonate] (ABTS) peut-être utilisé également comme substrat pour révéler une activité laccase.
3) Conditions de cultures pour produire la laccase Un inoculum est prélevé des précultures qui ont poussé 10 jours à 30°C dans des fioles de Roux contenant 200 mL d'un milieu synthétique avec la composition suivante pour IL : maltose (20 g), tartrate de diammoriium (1,84 g), tartrate de disodium (2,3 g), KH2PO4 (1,33 g), CaCl2, H2O (0,1 g), MgSO4, 7H2O (0,5 g), FeSO4,7H2O (0,07 g), ZnSO4,7H2O (0,046 g), MnSO4,H2O (0,035 g), CuSO4,5H2O (0,1 g), extrait de levure (1 g), solution de vitamines (1 mL/L) selon Tatum et al. (Biochemical mutant strams of Neurospora produced by physical and chemical treatment. American Journal of Botany, 37 : 38-46, 1950). Le mycélium de deux fioles est collecté, mélangé à 100 mL d'eau stérile et broyés au mixeur Ultraturax 60 sec. Pour produire de la laccase, le milieu synthétique est inoculé par 1 mL de la suspension de mycélium. Le milieu (100 mL) est ensuite incubé à 30°C dans des fioles erlenmeyer bafflées de 250 mL sous agitation (120 rpm).°
II) Clonage du gène codant pour la laccase de Pycnoporus cinnabarinus et de son promoteur en vue de la construction d'un vecteur d'expression
Il s'agit d'un système d'expression eucaryote et plus particulièrement de champignon filamenteux, Pycnoporus cinnabarinus, du groupe basidiomycète pour la surproduction de protéines recombinantes déterminées. Le modèle d'étude sélectionné est celui de la laccase de P. cinnabarinus. A l'heure actuelle, deux modèles fongiques sont utilisés préférentiellement par les grands groupes industriels. Il s'agit d'Aspergillus et de Trichoderma qui appartiennent au groupe des Deutéromycètes. Ce système d'expression est donc tout à fait original et devrait combler la lacune concernant le développement de système d'expression basidiomycète compatible avec les exigences des industriels (possibilité de production à grande échelle de protéines sécrétées dans le milieu extra-cellulaire et culture du champignon producteur en fermenteur).
1) Clonage de gène de la laccase de Pycnoporus cinnabarinus et de son promoteur Dans une première étape, les Inventeurs ont amplifié un fragment du gène codant pour la laccase à l'aide d'amorces nucléotidiques dégénérées (Fig. 2). Les amorces dégénérées amont F2 (SEQ JD NO : 6 ; CAYTGGCAYGGRTTCTTCC) et aval R8 (SEQ ID NO : 7 ; GAGRTGGAAGTCRATGTGRC) ont été déduites, respectivement , des régions de liaison au cuivre I et IN des laccases d'organismes voisins et utilisées dans une réaction de PCR (Polymerase Chain Reaction) en utilisant l'ADΝ génomique de P. cinnabarinus 1-937. A 10 μl de mélange réactionnel sont ajoutés : 100 ng d'ADN génomique; 0.2 mM de dATP, dCTP, dTTP, and dGTP; 25 pmol de chaque amorce nucléotidique; 0.1 volume de tampon 10X Pfu polymerase (100 mM Tris-HCl, 15mM MgCl , 500 mM KCl, pH 8,3) and 1 U de polymerase Pfu. Le mélange est chauffé à 94°C pendant 5 min avant d'ajouter la polymerase. Les conditions de la réaction sont les suivantes : 5 cycles de 94 °C, 5 min; 55 °C, 30 s; et 72 °C, 4 min; puis 25 cycles of 94 °C, 30 s; 55 °C, 30 s, et 72 °C, 3 min. Une étape de 10 min à 72°C est effectuée afin de finir la réaction. Une bande de 1,64 kpb a été obtenue correspondant à la partie centrale du gène de la laccase. La séquence ADN a été clonée dans pGEM-T afin de séquencer cette partie du gène. Par une technique de Southern blot (Fig. 3), nous avons défini les sites de restriction appropriés afin d'obtenir un fragment d'ADN minimum, pouvant contenir l'intégralité de gène de la laccase, et qui sont susceptibles de servir à amplifier les extrémités 5' et 3' manquantes. Un Southern blot a été effectué avec F ADN génomique de P. cinnabarinus avec les enzymes, BamΗI, Eco I, PstI, PvuII, Sacï, Smal and Xba I et a permis de sélectionner PstI qui donne une bande de 3.5 kpb par digestion de l' ADN génomique. Afin d'amplifier les parties manquantes du gène, une technique de PCR inverse a été utilisée avec un mélange de PCR contenant des amorces nucléotidiques spécifiques de la partie centrale précédemment isolée et de TADN génomique de P. cinnabarinus. La réaction de PCR est effectuée avec 150 ng d'ADN coupé par PstI et recircularisé sur lui-même par ligation et les amorces nucléotidiques Fex (SEQ ID NO : 8 ; GGATAACTACTGGATCCGCG) et Rex (SEQ ID NO : 9 ; CGCAGTATTGCGTGGAGAG). Les conditions de la réaction sont les suivantes : 5 cycles de 94 °C, 5 min; 55 °C, 30 s; et 72 °C, 5 min; puis 25 cycles of 94 °C, 30 s; 55 °C, 30 s, et 72 °C, 4 min avec une étape finale de 10 min à 72 °C. Le fragment d'ADN amplifié correspond à une bande de 2,7 kpb qui a été clone dans pGEM-T et séquence. L'intégralité du gène codant pour la laccase a été ensuite définie en combinant la partie centrale et les parties 5' et 3' amplifiées. Afin de vérifier cette séquence, l'intégralité du gène a été amplifié (3,331 kpb, Fig. 4) avec les amorces nucléotidiques Fin (SEQ JD NO : 10 ; GACATCTGGAGCGCCTGTC) et Rin (SEQ ID NO : 11 ; ATCGAAGGTTCCGATGACTGACATGAC) à partir de l'ADN génomique de P. cinnabarinus. Ce gène a été également clone à partir de l'ADN génomique de P. cinnabarinus ss3 et s'est avéré être identique à celui isolé chez P. cinnabarinus I- 937.
2) Construction du vecteur d'expression utilisant le promoteur du gène de la laccase A partir de la séquence du gène de la laccase, les Inventeurs ont clone le promoteur de ce gène en utilisant la même stratégie employée précédemment pour l'isolement du gène, c'est-à-dire avec une technique de PCR inverse sur un fragment d'ADN génomique (3,5 kpb) coupé cette fois-ci par l'enzyme de restriction BgïïL (Fig. 5). Deux mille cinq cent vingt sept kpb en avant du gène de la laccase ont été ainsi clone par PCR inverse et séquence. Ce promoteur a été placé dans un vecteur une résistance à l'ampicilline pour son sous-clonage dans la bactérie et une résistance à la phléomycine utilisé comme marqueur de sélection dans le champignon. Un terminateur du gène codant pour Thydrophobine sc3 de Schizophyllum commune a été placé en aval afin de terminer l'étape de transcription. Ce vecteur appelé pELP sera utilisé pour l'expression homologue de la laccase (Fig. 6). Deux autres promoteurs hétérologues ont été utilisés dans cette étude. Ce sont les promoteurs des gènes codant pour la glycéraldéhyde 3- phosphate déshydrogénase (gpd) et l'hydrophobine (sc3) de Schizophyllum commune (Fig. 6), constituant respectivement les vecteurs d'expression pEGT et pESC. L'intégralité des séquences nucléotidiques de vecteurs pEGT (SEQ JD NO : 12), pESC (SEQ ID NO : 13), et pELP (SEQ ID NO : 14), se trouvent dans les figures 7, 8 et 9 avec les positions du promoteur, du marqueur de sélection et du terminateur.
III) Transformation de la souche monocaryotique avec les vecteurs d'expression (modèle d'étude : la laccase de Pycnoporus cinnabarinus)
1) Préparation du mycélium pour l'obtention de protoplastes Un quart d'une colonie cultivée en milieu solide (10 jours) est homogénéisé avec un mixeur (type Ultraturax, vitesse lente) pendant une minute dans 50 ml de milieu YM (par litre : glucose 10 g, peptone 5 g, extrait de levure 3 g, extrait de malt 3 g). Le broyât est transféré dans un erlenmeyer de 250 ml stérile où l'on rajoute50 ml de milieu YM, puis incubé à 30°C et sous agitation (225 rpm) pendant 20 heures. La culture est une nouvelle fois homogénéisée pendant 1 min (vitesse lente) et on rajoute 100 ml de milieu YM. Le broyât est transféré dans un erlenmeyer de 500 ml et mis en culture pendant une nuit à 30°C.
2) Préparation des protoplastes La culture de champignon est centrifugée pendant 10 min à 2000 rpm dans un rotor oscillant (tube de 50 ml). Seize g (poids humide) sont lavés dans 40 ml d'une solution de MgSO4 0,5 M ou de saccharose 0,5 M. Dans le cas de l'utilisation du saccharose, l'enzyme lyrique utilisée pour digérer les parois est diluée dans le saccharose. Le mycélium est ensuite centrifugé 10 min à 2000 rpm et le surnageant éliminé. Concernant la lyse des parois fongiques, on ajoute au mycélium provenant de 50 ml de culture, 10 ml d'enzyme lyrique (Glucanex, Sigma) dilué à 1 mg/ml dans une solution de MgSO4 0,5 M . La digestion se fait dans un erlenmeyer de 500 ml à 30°C sous faible agitation pendant 3 à 4 heures. Pendant cette incubation, l'apparition des protoplastes est contrôlée au microscope. Dix ml d'eau stérile sont rajoutés, puis mélangés délicatement. Les protoplastes sont laissés 10 min, le temps que l'équilibre avec l'eau se fasse (les protoplastes vont flotter à la surface). Ils sont ensuite centrifugés 10 min à 2000 rpm dans un rotor oscillant. Le surnageant contenant les protoplastes est transféré délicatement dans un nouveau de 50 ml. Le culot restant peut-être re-incubé avec 25 ml d'une solution de MgSO4 0,5M pour récupérer le maximum de protoplastes (on répète alors l'étape de centrifugation). Un volume de sorbitol 1 M, égal à celui de la préparation des protoplastes, lui est rajouté. Pendant 10 min, on laisse les protoplastes relarguer l'eau. Cette préparation est ensuite centrifugée 10 min à 2000 rpm. Le surnageant est éliminé, tout en laissant un peu de sorbitol. Les protoplastes sont transférés dans un nouveau tube. Le précédent tube est rincé avec la solution de sorbitol 1M et les protoplastes récupérés, ajoutés dans le nouveau tube. Les protoplastes sont comptés et centrifugés 10 min à 2000 rpm. Ils sont ensuite dilués à une concentration de
2. 10 protoplastes par ml dans la solution de sorbitol 1M. Une solution de CaC12 à 0,5 M (1/10) est rajoutée aux protoplastes.
3) Transformation des protoplastes Pour la transformation, 100 μl de protoplastes sont transformés avec 5 à 10 μg de vecteur (volume maximum de 10 μl) dans un tube stérile de 10 ml. Ils sont alors incubés 10 à 15 min dans la glace. Un volume d'une solution de PEG 4000 à 40% est ajouté, puis mélangé et les protoplastes sont incubés 5 min à température ambiante. Deux et demi ml de milieu de régénération (pour 100 ml : glucose 2 g, MgSO4,7H20 12,5 g, KΗ2PO4 0,046 g, K2HPO4 0,1 g, bacto peptone 0,2 g, extrait de levure 0,2 g) sont rajoutés aux protoplastes qui sont incubés une nuit à 30°C. Des boites de sélection (milieu YM contenant de la phléomycine à 7 μg/ml , boites carrées) sont préchauffées à 37°C. Sept et demi ml d'un mélange de top agar (Low Melting Point agarose 1% dilué dans un milieu YM contenant de la phléomycine 7 à 10 μg/ml) sont ajoutés au milieu de régénération contenant les protoplastes et sont versés sur les boites de sélection préchauffées. Quand la solution de top agar s'est solidifiée, les boites sont incubées à 30°C pendant 4 jours. Les transformants sont alors transférés sur de nouvelles boites de sélection.
4) Ciblage des transformants A partir de 16 g de mycélium, on obtient généralement de l'ordre de 1 à 2.107 protoplastes. Le pourcentage de régénération est de 10 %. Concernant le vecteur pESC, les monokaryons ont été transformés avec le vecteur contenant le cDNA (BRFM 472, 473 et 474) ou le gène codant pour la laccase de P. cinnabarinus (BRFM 470 et 471) (Fig. 10). En parallèle, d'autres monokaryons ont été transformés avec les promoteurs pEGT (GPDll, 12 et 13) ou avec le vecteur pELP (12.3, 12.7 et 12.8) contenant le gène codant pour la laccase (Fig. 10). Au vu des résultats deux transformants se dégagent du lot avec des activités équivalentes, les transformants 12.7 et GPD14. L'activité au cours du temps a été suivie pour les transformants GPD14 etl2.7 (Fig. 11). L'activité est détectable à partir de 3-4 jours et augmentent jusqu'à 12 jours pour atteindre approximativement 1200 nkatal/ml soit 72000 U/l avec ajout d'éthanol dans le milieu de culture.
Légende des figures
Figure 1 : Isolement de souche monocaryotique déficiente pour l'activité laccase.
Figure 2 : Isolement du gène codant pour la laccase de Pycnoporus cinnabarinus laccase.
Figure 3 : Etude en Southern blot du gène codant pour la laccase de Pycnoporus cinnabarinus.
Figure 4 : Séquence du gène codant pour la laccase de Pycnoporus cinnabarinus.
Figure 5 : Séquence de la séquence promotrice pLac du gène codant pour la laccase de Pycnoporus cinnabarinus (jusqu'à l'ATG codant pour la méthionine de la laccase).
Figure 6 : Carte physique des trois vecteurs d'expression pEGT, pESC, pELP, utilisés pour la production de la laccase chez Pycnoporus cinnabarinus.
Figure 7 : Séquence nucléotidique du vecteur pEGT, contenant le promoteur du gène gpd (4480-5112), un marqueur de résistance à la phléomycine (507-1822) et le terminateur du gène sc3 (71-507).
Figure 8 : Séquence nucléotidique du vecteur pESC, contenant le promoteur du gène sc3 (1-1033), un marqueur de résistance à la phléomycine (1540-2855) et le terminateur du gène sc3 (1104-1540). -,,---,, PCT/FR2005/000093 15
Figure 9 : Séquence nucléotidique du vecteur pELP, contenant le promoteur du gène laccase (4457-6983), un marqueur de résistance à la phléomycine (507-1822) et le terminateur du gène sc3 (71-507)
Figure 10 : Résultats de production des transformants présentant les activités les plus importantes. La culture a été effectuée avec ou sans (témoin) éthanol.
Figure 11 : Suivi des activités laccase des transformants GPD 14 et 12.7 en fonction du temps avec ou (témoin) sans éthanol.
Figure 12 : Séquence du gène codant pour la laccase àϋhalocyphina villosa.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'une protéine recombinante déterminée, ledit procédé étant effectué par surexpression du gène codant pour cette protéine déterminée dans une souche monocaryotique de champignons filamenteux de l'espèce Pycnoporus du groupe basidiomycète, et comprend : - une étape de mise en culture de la souche monocaryotique de Pycnoporus susmentionnée, ladite souche étant transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine recombinante déterminée, dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur correspondant à un promoteur endogène des champignons susmentionnés, ou d'un promoteur différent (encore désigné promoteur exogène), ledit promoteur étant constitutif ou inductible, - le cas échéant une étape d'induction du promoteur susmentionné, lorsque celui-ci est inductible, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la protéine recombinante déterminée, produite dans le milieu de culture.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée pour la surexpression du gène codant pour la protéine recombinante déterminée est telle qu'obtenue par mise en culture de la souche dicaryotique d'origine à 30°C dans le noir pendant 15 jours, suivie d'une étape d'exposition au jour 2 à 3 semaines à température ambiante jusqu'à la formation d'organes de fructification correspondant à des hyphes différenciées appelées basides, au sein desquels a alors lieu la caryogamie, suivie de la méiose qui conduit à la formation de quatre spores sexuées, ou basidiospores haploïdes génétiquement différentes, qui, après germination, engendre un mycélium monocaryotique.
3. Procédé selon la revendication 1 ou , 2, caractérisé en ce que la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée est une souche de Pycnoporus cinnabarinus.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les protéines recombinantes déterminées surexprimées correspondent à des protéines endogènes de Pycnoporus, ou à des protéines exogènes, notamment à des protéines exogènes correspondant à des protéines endogènes de basidiomycètes autres que Pycnoporus, telles que les enzymes basidiomycètes intervenant dans les biotransformations végétales, ou correspondant à des protéines endogènes de souches de Pycnoporus différentes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les protéines recombinantes déterminées correspondent : - aux protéines endogènes de Pycnoporus suivantes : * les métalloenzymes, telles que la laccase, ou la tyrosinase, * ou la cellobiose déshydrogénase, la xylanase, la β-glycosidase, l'invertase, ou l'α-amylase, - aux protéines exogènes choisies parmi les suivantes : * les tyrosinases de souches de Pycnoporus différentes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines, telle que la tyrosinase de Pycnoporus sanguineus lorsque la souche de Pycnoporus utilisée pour la production de cette tyrosinase est différente de Pycnoporus sanguineus, * les laccases de basidiomycètes autres que Pycnoporus, telle que la laccase d'halocyphina villosa (basidiomycète halophile), * les cinnamoyl estérases A et B d'Aspergillus niger.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, de préparation de protéines recombinantes déterminées correspondant aux protéines endogènes de Pycnoporus, caractérisé en ce que la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée est déficiente pour le gène codant pour la protéine endogène à laquelle correspond la protéine recombinante déterminée.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, de préparation de protéines recombinantes déterminées correspondant aux protéines endogènes de Pycnoporus, caractérisé en ce que la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée est transformée a l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine recombinante déterminée marquée, notamment par un marqueur histidine.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, de préparation de laccases recombinantes correspondant aux laccases endogènes de Pycnoporus, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour une laccase de Pycnoporus, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur correspondant au promoteur endogène de cette laccase, - une étape d'induction du promoteur susmentionné, notamment par addition d'éthanol, ou de sous-produits agricoles contenant de la lignocellulose comme la paille de blé, les sons de maïs et la pulpe de betterave, ou des composés à cycle aromatique comme la 2,5-xylidine, l'acide vératrylique, le guaïcol, l'alcool vératrylique, la syringaldazine, l'acide férulique, l'acide caféique et les lignosulfonates, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus susmentionnée produite dans le milieu de culture.
9. Procédé selon la revendication 8, de préparation de la laccase recombinante correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus représentée par SEQ ID NO : 2, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ ID NO : 2, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase susmentionnée, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ JD NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ JD NO : 2 produite dans le milieu de culture.
10. Procédé de préparation de laccases recombinantes correspondant aux laccases endogènes de Pycnoporus selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour une laccase de Pycnoporus, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur exogène choisi parmi : * le promoteur gpd de l'expression du gène codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate déhydrogénase de Schizophyllum commune, dont la séquence nucléotidique est représentée par SEQ ID NO : 4, * ou le promoteur sc3 de l'expression du gène codant pour l'hydrophobine de Schizophyllum commune, dont la séquence nucléotidique est représentée par SEQ ID NO : 5, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus susmentionnée produite dans le milieu de culture.
11. Procédé selon la revendication 10, de préparation de la laccase recombinante correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus représentée par SEQ ID NO : 2, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ ID NO : 2 le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur exogène gpd ou sc3, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ JD NO : 2 produite dans le milieu de culture.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, de préparation de tyrosinase recombinante correspondant à la tyrosinase de Pycnoporus sanguineus représentée par SEQ TD NO : 16, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 15 codant pour la tyrosinase recombinante représentée par SEQ ID NO : 16, le cas échéant marquée, la séquence SEQ TD NO : 15 étant avantageusement précédée par la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 128 et 190 de SEQ JD NO : 1 codant pour le peptide signal de Pycnoporus cinnabarinus délimité par les 21 premiers aminoacides de SEQ TD NO : 2, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase de Pycnoporus cinnabarinus, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ TD NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la tyrosinase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ TD NO : 16 produite dans le milieu de culture.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, de préparation de laccase recombinante correspondant à la laccase d'halocyphina villosa représentée sur la figure 12 (SEQ TD NO : 18), caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique représentée sur la figure 12 (SEQ TD NO : 17) codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ TD NO : 18, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase de Pycnoporus cinnabarinus, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ TD NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 18 produite dans le milieu de culture.
14. Séquence nucléotidique codant pour le promoteur pLac de la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, et correspondant à la séquence SEQ TD NO : 3, ou toute séquence dérivée de ce promoteur par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides et conservant la propriété d'être un promoteur de l'expression de séquences.
15. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ TD NO: 3 du promoteur pLac selon la revendication 14.
16. Vecteur d'expression selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour une protéine recombinante déterminée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac selon la revendication 14.
17. Vecteur d'expression selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que la protéine recombinante déterminée est une protéine correspondant : - aux protéines endogènes de Pycnoporus suivantes : * les métalloenzymes, telles que la laccase, ou la tyrosinase, * ou la cellobiose déshydrogénase, la xylanase, la β-glycosidase, l'invertase, ou l'α-amylase, - aux protéines exogènes choisies parmi les suivantes : * les tyrosinases de souches de Pycnoporus différentes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines, telle que la tyrosinase de Pycnoporus sanguineus lorsque la souche de Pycnoporus utilisée pour la production de cette tyrosinase est différente de Pycnoporus sanguineus, * les laccases de basidiomycètes autres que Pycnoporus, telle que la laccase Shalocyphina villosa (basidiomycète halophile), * les cinnamoyl estérases A et B dAspergillus niger.
18. Cellule hôte transformée à l'aide d'un vecteur d'expression selon l'une des revendications 15 à 17.
19. Cellule hôte selon la revendication 18, correspondant à des cellules monocaryotiques de souches de Pycnoporus, telles que les souches de Pycnoporus cinnabarinus.
20. Utilisation de vecteurs d'expression selon l'une des revendications 15 à 17, ou de cellules hôtes selon la revendication 18 ou 19, pour la mise en oeuvre d'un procédé de surproduction d'une protéine recombinante déterminée selon l'une des revendications l à 13.
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