JP2001025393A

JP2001025393A - アスペルギルス発現システム

Info

Publication number: JP2001025393A
Application number: JP2000185449A
Authority: JP
Inventors: Randy M Berka; エム．バーカ，ランディ; Wendy Yoder; ヨダー，ウェンディ; Shinobu Takagi; タカギ，シノブ; Karuppan Chettier Boominathan; チェッティアーブーミナザン，カラッパン
Original assignee: Novo Nordisk Biotech Inc
Current assignee: Novozymes Inc
Priority date: 1993-12-01
Filing date: 2000-05-17
Publication date: 2001-01-30
Also published as: US5667990A; WO1995015391A2; WO1995015391A3; AU1101995A; EP0730655A1; AU695766B2; CA2178007A1; JPH09500543A; FI962288A; FI962288A0; JP3117997B2; CN1139457A

Abstract

(57)【要約】〈課題〉本発明は新規の異種タンパク質発現系の提供を
課題とする。〈解決方法〉本発明は、Ａ．ジャポニカス（Ａ．ｊａｐ
ｏｎｉｃｕｓ）型種を異種タンパク質の発現のための宿
主細胞として使用する新規発現系に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、組換えタンパク質の生産に有用な宿主細胞に
関する。特に、本発明は、組換えタンパク質、特に酵素
の高レベル発現に利用できるアスペルギルス属の真菌宿
主細胞に関する。

【０００２】発明の背景異種タンパク質の発現に組換え宿主細胞を使うことは、
近年、他の方法ではそれらの天然源からの精製によって
のみ得られる商業的に有益なタンパク質の大量生産を大
きく単純化した。現在、特定の任意のタンパク質の生産
のためには原核および真核宿主を含む様々な発現系の選
択肢がある。適当な発現系の選択は、しばしば活性状態
で妥当な収率でタンパク質を生産できる宿主細胞の能力
に依存するだけでなく、タンパク質の意図する最終用途
によっても大きく左右されるだろう。

【０００３】哺乳動物細胞と酵母細胞が最も汎用されて
いる真核宿主であるが、糸状菌が組換えタンパク質生産
用の宿主細胞として非常に有用であると現在認識され始
めている。現在使われているかまたはそのような用途に
提案されている糸状菌の中には、ニューロスポラ・クラ
ッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）、アクレ
モニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈ
ｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、トリポクラジウム・ゲオデス
（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍｇｅｏｄｅｓ）、ムー
コル・サーシネロイデス（Ｍｕｃｏｒｃｉｒｃｉｎｅ
ｌｌｏｉｄｅｓ）およびトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒ
ｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）がある。加えて、
アスペルギルス属の幾つかの種は組換えタンパク質生産
のための宿主細胞として有効に使われている。アスペル
ギルスは、分生子柄から成る灌水器状物が頂嚢で終わ
り、この頂嚢が小柄またはフィアリド（小梗）と色々な
名前で呼ばれる一層もしくは二層の同時形成された特殊
細胞を生み、そして分生子と呼ばれる無性胞子を形成す
ることにより特徴づけられる。アスペルギルス・ニデュ
ランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）
種は組換えプラスミドにより形質転換されると報告され
ている（Ｂａｌｌａｎｃｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１２：２８４−２８
９，１９８３）が、形質転換はかなり低い頻度で起こる
ことがわかった。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）とアスペルギルス・オリゼ
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）両種も組換
えタンパク質生産において有用であると記載されてい
る。しかしながら、他のアスペルギルス種は異種タンパ
ク質の発現に有用であると示されておらず、実際に、貧
弱な発現および／またはプロテアーゼもしくはマイコト
キシンの過剰生産のために、アスペルギルスの全ての種
がこの目的に宿主細胞として適するわけではないし、或
る種から判断して次の種へとこの能力を予測することも
できない。理想的な発現系は、プロテアーゼおよびマイ
コトキシン並びに多量の内因性的に作られる分泌タンパ
ク質の生産が実質的になく、且つ既知の宿主細胞よりも
高いレベルの発現が可能であるものである。本発明は、
それらの要件を満たす新規アスペルギルス発現系を提供
する。

【０００４】発明の要約本発明は、異種タンパク質をコードする核酸配列を含有
する、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）型種、例えばアスペル
ギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｊａ
ｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレータス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｃｕｌｅａｔｕｓ）またはア
スペルギルス・ジャポニカス変種アクレータス（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓｖａｒ．ａｃ
ｕｌｅａｔｕｓ）種の宿主細胞を提供する。「異種タン
パク質」とは、宿主細胞にとって生来でないタンパク
質、または生来の配列を変更する修正が行われている生
来のタンパク質を意味する。好ましい態様では、該タン
パク質は異種酵素である。該核酸配列は、選択された宿
主細胞中で該核酸配列の転写を指令することのできる適
当なプロモーター配列に作用可能に連結される。

【０００５】本発明はまた、組換えタンパク質の生産方
法であって、異種タンパク質をコードする核酸配列を含
有する上述した種のうちの１つの宿主細胞を、該タンパ
ク質の発現を促す条件下で培養し、そして培養物から該
タンパク質を回収することを含んで成る方法にも関す
る。好ましい態様では、該タンパク質は真菌タンパク質
であり、最も好ましくは真菌酵素である。

【０００６】本発明の宿主細胞および方法は、意外に
も、他の既知のアスペルギルス種、例えばＡ．オリゼよ
りも、幾つかの真菌酵素の組換え生産においてより優れ
ている。

【０００７】発明の詳細な説明アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニ
カス変種アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｊａ
ｐｏｎｉｃｕｓｖａｒ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）または
アスペルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓａｃｕｌｅａｔｕｓ）種は全て、アスペルギルス属
の黒色（Ｎｉｇｒｉ）部門に属する。アスペルギルス・
ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）により
代表されるような黒色部門のメンバーは、放射状分生子
頭と黒色気味の分生子集団；球状頂嚢；滑らかで透明
な、または頂嚢の下が着色している菌柄；存在するかま
たは欠けており、しばしば着色しているメツラ（基底梗
子）により特徴づけられる（“ＴｈｅＧｅｎｕｓＡｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ”，Ｋ．Ｂ．ＲａｐｅｒおよびＤ．
Ｉ．Ｆｅｎｎｅｌ著，ＴｈｅＷｉｌｌｉａｍｓ＆
ＷｉｋｉｎｓＣｏｍｐａｎｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，
１９６５）。胞子色と装飾物、または他の微視形態的特
徴が異なるそれらの株の変異体もこの部門に含められ
る。アスペルギルス属の黒色部門では、主な分類法が第
一に基礎にしている（即ち、ＲａｐｅｒおよびＦｅｎｎ
ｅｌ，前掲）コロニーの色と分生子形成構造が多様であ
るため、分類群の境界は論争中である。Ｒａｐｅｒおよ
びＦｅｎｎｅｌにより認められたＡ．ジャポニカス関連
分類群はＡ．ジャポニカスとＡ．アクレータスである。
ＳａｍｓｏｎおよびＧａｍｓ（“ＡｄｖａｎｃｅｓＩ
ｎＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍａｎｄＡｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓＳｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ”，Ｓａｍｓｏｎお
よびＰｉｔｔ編，１９８５）はＡ．ジャポニカスのみを
認め、そしてＡｌ−Ｍｕｓｓａｌｌａｍ（“Ｒｅｖｉｓ
ｉｏｎｏｆｔｈｅＢｌａｃｋＡｓｐｅｒｇ−ｉ
ｌｌｕｓＳｐｅｃｉｅｓ”，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉ
ｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＵｔｒｅｃｈｔ，１
９８０）はＡ．ジャポニカス変種ジャポニカスとＡ．ジ
ャポニカス変種アクレータスを認めている。

【０００８】Ａ．ジャポニカス種は一般に、一列の小柄
および球状〜半球状の顕著な棘状の分生子により特徴づ
けられる。頂嚢は普通２０〜３５μであるが１５〜４５
μにも及ぶ。この種はＳａｉｔｏ，Ｂｏｔａｎ．Ｍａ
ｇ．２０：６１−６３，１９０６により最初に記載され
た。より詳しくは、この種は次のように特徴づけられ
る。Ｃｚａｐｅｋ溶液寒天上のコロニーは室温（２４〜
２６℃）で迅速に増殖し、ほとんどの株は１０日間で
５．０〜６．０ｃｍ、株によってはより小さいことがあ
り、密集した、白色の、不規則にしわの寄った基底菌糸
から成り、該菌糸はゆっくりと茶紫または黒紫色を帯び
た分生子構造の密集鎖になり、株によってはコロニーの
中央領域に豊富な白〜クリーム色の球状菌核を生成し；
裏側は最初は無色で後に紫茶色になり、時には僅かに黄
緑色を帯び；滲出物が無く；臭いは時折非常に強いが特
有ではない。分生子頭は多様で、小さく、放射状である
かまたは幾つかの不明瞭な柱状部に割れ、まれに１０日
で直径３００μを越えるが、老齢期には時々明瞭な円柱
状で且つ長さが６００〜７００μまでであり、または同
様な長さの２つの分岐した柱状部に割れ；分生子柄は滑
らかかまたは限られた表面粒点を有し、無色であるかま
たは特に頂嚢のすぐ下がわずかに着色しており、波状
で、大部分が５００〜１０００μ×５〜１０μである
が、それらの寸法は大きく異なり；頂嚢はいくらか黄褐
色気味に着色しており、しばしば幾分伸びた形である
が、加齢または成長と共に頭部はほとんど球状になり、
大部分は２０〜３０μ×２５〜３５μで、直径は１５μ
未満から４５μまで異なり、正常な頭部ではそれらの表
面の大部分が稔性であるが小さな頭部では頂点のみが稔
性であり；梗子は一列で、５．５〜８．０μ×３．０〜
４．５μ、まれにそれらの正常サイズの二倍に膨張し；
分生子は大部分が球状、時に半球状で、多棘状であり、
棘は分離し規則的な間隔を有し、通常長さ０．５μで時
にはそれより長く、胞子体は大部分が３．０〜３．５μ
であり；菌核は豊富に、ある株ではゆっくりと、白〜ク
リーム色で球状の直径５００μまで生成する。肉エキス
寒天上のコロニーは、迅速に室温で１０日日で直径７〜
８ｃｍに成長し、Ｃｚａｐｅｋ上よりも迅速に且つ多量
に胞子形成し；分生子頭はＣｚａｐｅｋ上よりも通常大
きく且つ顕著な円柱状塊に割れ、通常１０日間で５００
μの直径に達し、頂嚢および軸測定値がより狭い範囲を
示し；梗子および分生子は上述した通りである。Ａ．ジ
ャポニカス変種アクレータス亜種は次の特徴により区別
される。Ｃｚａｐｅｋ寒天上のコロニーは１４日間で直
径５．５ｃｍになり、かなり密集した、不規則的にしわ
の寄った、白色の基底フェルト状物から成り；ある株は
羊毛状気菌糸を生成し；裏側は最初は無色で加齢と共に
茶色になり；分生子頭は塊状で、ＱｕａｋｅｒＤｒａ
ｂおよびＤｕｓｋｙＤｒａｂに近い紫がかった茶色
で、球状〜放射状で、明瞭に分離した柱状部に割れてお
り、直径２００〜３００μであり；柄のある分生子柄は
滑らかで、透明かまたは軸のところがわずかに着色して
おり、直立で、長さ３５０〜４５００μ、通常は１００
０〜２０００μ、幅９．０〜１３．５μであり；頂嚢は
褐色で、直径３０〜９０μ、通常４５〜６７μであり、
大きな頂嚢では全面に密集したフィアリドを有しそして
小さな頂嚢では上側の３／４にフィアリドを有し；フィ
アリドは７．５〜１０μ×４〜５μであり；分生子は透
明〜褐色で、多棘状で、半球状であるが大部分は楕円体
で、４〜５μ×３．５〜４．５μであり；ある株では密
集帯に、球状〜半球状、直径４５０〜６７５μ、しかし
８００μまでの菌核が豊富に生じる。

【０００９】密接に関連した種であるＡ．アクレータス
は、一列の梗子、および半球状から明瞭な楕円形の多棘
状の分生子により一般的に特徴づけられる。頂嚢は通常
６０〜８０μで、３５〜１００μに及ぶ。より詳しく
は、この種は次のように定義される。Ｃｚａｐｅｋ溶液
寒天上のコロニーは室温（２４〜２６℃）で迅速に増殖
し、１２日間で直径５〜６ｃｍであり、平坦であり、分
生子構造の密集鎖を生じ、紫茶または紫黒色味を帯びて
全体に渡り激しく胞子形成し、しばしば淡い灰色−黄褐
色表面の「花」を有し；裏側は無色であるかまたはかな
り棘状でコロニー中心が黄色から黒に近い色を帯び、黄
色色素が広がっており；滲出物または臭いは無く；株に
よっては白色〜クリーム色の梗子がコロニー中心および
隣接した縁のところに最も豊富に生じる。分生子頭は、
最初は球状で、次いで比較的数の少ない分離した密集型
柱状部に割れ、直径は１ｍｍまでに達するが通常は５０
０〜７００μであり、脱落性の柱状部によって容易に粉
々になり、個々の頭部はしばしば色が多様であり、頂嚢
に最も近い分生子は淡い黄褐色を帯びており；分生子柄
は無色であるかまたは頂嚢の下がわずかに褐色であり、
通常は１〜２ｍｍ×９〜１３μであるが、長さは２．５
ｍｍまでそして直径は１８〜２９μまでに及び、厚さ
２．０〜２．５μまでの壁を有し、平滑であるかまたは
時折粒状物質の限定付着を示すことがあり；頂嚢は、若
い時は幾分伸びた形であるが、十分に発達した時には球
状またはほとんど球状であり、厚い壁を有し、普通は褐
色気味に着色しそして直径６０〜８０μであるが、３５
〜１００μに及ぶことができ、全面に渡り稔性であり；
梗子は一列で、密に詰まっており、６．５〜１０．０μ
×３．０〜４．４μであり；分生子は明瞭な楕円形から
球状またはほとんど球状で、株間でまたは株内で異な
り、大部分は３．５〜４．０μ×４．５〜５．０μであ
るが、時には細胞が４×７μほどの大きい寸法を示すこ
とがあり、数が増えると紫がかった色合いを示し、分離
し且つより広く間隔のあいた棘を有する多棘状である。
この種はＩｉｚｕｋａ，Ｊ．Ａｇｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．Ｊａｐａｎ２７：８０６，１９５３中に最初に記
載された。

【００１０】本明細書および請求の範囲を通して、用語
「Ａ．ジャポニカス型種」の使用が、上述した３つの種
に含まれる生物だけでなく、既に記載されているかまた
は別の分類法において現在他の種と指定されているが、
上記に定義したものと同じ形態的および培養的特徴を有
し、Ａ．ジャポニカス、Ａ．ジャポニカス変種アクレー
タスまたはＡ．アクレータスの別名であるかもしれない
それらの種も包含することは理解されよう。例えば、
Ａ．ジャポニカス／Ａ．ジャポニカス変種アクレータス
の別名としては、次のものが挙げられる（しかしそれら
に限定されない）：Ａ．ジャポニカス・サイトウ・変種
カピラタス・ナカザワ，タケダおよびスエマツ（Ａ．ｊ
ａｐｏｎｉｃｕｓＳａｉｔｏｖａｒ．ｃａｐｉｌｌ
ａｔｕｓＮａｋａｚａｗａ，ＴａｋｅｄａａｎｄＳ
ｕｅｍａｔｓｕ）、Ａ．マルバセウス・モサリー（Ａ．
ｍａｌｖａｃｅｕｓＭｏｓｓｅｒａｙ）、Ａ．アトロ
ビオラセウス・モサリー（Ａ．ａｔｒｏ−ｖｉｏｌａｃ
ｅｕｓＭｏｓｓｅｒａｙ）、Ａ．アトロフスカス・モ
サリー（Ａ．ａｔｒｏｆｕｓｃｕｓＭｏｓｓｅｒａ
ｙ）、Ａ．ビオラセオフスカス・ガスペリーニ（Ａ．ｖ
ｉｏｌａｃｅｏ−ｆｕｓｃｕｓＧａｓｐｅｒｉｎ
ｉ）、Ａ．ブルネオビオラセウス・バトおよびマイア
（Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｖｉｏｌａｃｅｕｓＢａｔ．
ａｎｄＭａｉａ）（Ａｌ−Ｍｕｓｓａｌｌａｍ，前
掲）；およびＡ．ジャポニカス変種アトロフスカス・イ
イズカ（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓｖａｒ．ａｔｒｏｆ
ｕｓｃｕｓＩｉｚｕｋａ）（Ｊ．Ａｇｒ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ２７：８０７，１９５３）。Ａ．
アクレータス／Ａ．ジャポニカス変種アクレータスの別
名としては、Ａ．エゾエンシス・ササキ（Ａ．ｙｅｚｏ
ｅｎｓｉｓＳａｓａｋｉ）（Ａｌ−Ｍｕｓｓａｌｌａ
ｍ，前掲）、Ａ．ジャポニカ変種ビリジフラブス・イイ
ズカ（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓｖａｒ．ｖｉｒｉｄｉ
ｆｌａｖｕｓＩｉｚｕｋａ）（Ｊ．Ａｇｒ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ２７：８０７，１９５３）お
よびＡ．ビオラセオフスカス・ガスペリーニ（Ａ．ｖｉ
ｏｌａｃｅｏ−ｆｕｓｃｕｓＧａｓｐｅｒｉｎｉ）
（Ａｔｔ．Ｓｏｃ．ＴｏｓｃａｎａＳｃｉ．Ｎａｔ．
Ｐｉｓａ，８（２）：３２６−３２８，１８８７）が挙
げられる（がそれらに限定されない）。

【００１１】宿主細胞候補の最初の決定は、アスペルギ
ルス属の異なる分類部門に属する１５以上の種からの様
々な単離物により生産されるプロテアーゼのレベルの評
価によって行う。これは、各単離物を酸性、中性および
アルカリ性ｐＨでのカゼイン透明化平板アッセイにおい
て試験することにより達成される。驚くべきことに、黒
色（Ｎｉｇｒｉ）部門の幾つかのメンバーが、生産され
る任意の組換えタンパク質の分解を潜在的に引き起こし
得るプロテアーゼを最少量生産したという点で、最も良
く働くことがわかった。この基準に基づいて、更なる研
究のために次の６種を選択する，：Ａ．ジャポニカス
（Ａ．ｊａｐｏ−ｎｉｃｕｓ）、Ａ．ジャポニカス変種
アクレータス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓｖａｒ．ａｃ
ｕｌｅａｔｕｓ）、Ａ．アクレータス（Ａ．ａｃｕｌｅ
ａｔｕｓ）、Ａ．タマリィ（Ａ．ｔａｍａｒｉｉ）、
Ａ．カルボナリウス（Ａ．ｃａｒｂｏｎａｒｉｕｓ）お
よびＡ．フェニシス（Ａ．ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）。

【００１２】次いで、選択された種を形質転換すること
を試みる。最初の努力は標準的なＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒ
ｉｚａｅ）形質転換技術の使用に集中する（Ｃｈｒｉｓ
ｔｅｎｓｅｎ他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：
１４１９−１４２２，１９８８；ＥＰ出願第８７１０
３８０６．３号）。簡単に言えば、プロトプラスト形
成、形質転換、およびａｍｄＳまたはヒグロマイシンＢ
（ｈｙｇＢ）マーカー遺伝子についての選択に向けて、
Ａ．オリゼのプロトコールを使って同時形質転換体を得
る。発現ベクターは、異種コード配列に加えて、Ａ．オ
リゼのＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子と、Ａ．ニガーのグ
ルコアミラーゼ遺伝子からの転写終結シグナルを含有す
る。形質転換頻度は、ＤＮＡ１μｇあたり１未満から約
１０まで異なる。下記の実施例に詳述されるような発現
ベクターを使った同時形質転換実験では、同時形質転換
の頻度は０〜６０％の範囲である。

【００１３】次いで形質転換された種を観察して様々な
異種酵素の発現レベルを測定する。試験した異種酵素と
しては、フミコーラ・ラヌギノーザ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ
ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（ＨＬＬ）、フミコ
ーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅ
ｎｓ）キシラナーゼ（キシラナーゼ）、フミコーラ・イ
ンソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）セ
ルラーゼ（セルラーゼ）、コプリナス・シネレウス（Ｃ
ｏｐｒｉｎｕｓｃｉｎｅｒｅｕｓ）ペルオキシダーゼ
（ＣｉＰ）およびカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎ
ｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡが挙げら
れる。驚くべきことに、Ａ．ジャポニカス様群の３つの
種は上記酵素の１または複数について良好な発現を示
し、ある場合には、対照のＡ．オリゼ株よりも良い酵素
収率を示した。特にＡ．アクレータス、Ａ．ジャポニカ
スおよびＡ．ジャポニカス変種アクレータスの各々の多
数の株が振盪フラスコ培養において非常に高いレベルの
ＨＬＬ（約１ｇ／ｌ）を生産する。加えて、Ａ．ジャポ
ニカスは、Ａ．オリゼ株およびＡ．ニガー株中でのこの
酵素の生産と比較して優れたキシラナーゼ生産を示す。
更に、振盪フラスコ中のＡ．アクレータスは約１．０ｇ
／ｌの範囲でカンジダ・アンタークティカのリパーゼＡ
を生産し、このレベルは、同じ条件下で培養した対応す
るＡ．オリゼ形質転換体よりも約３〜４倍高い。それら
の試験結果の要約は表２に与えられる。

【００１４】結果が明らかに示すように、各種の数個の
単離物が異種タンパク質を生産することができる。よっ
て、この能力は単一の単離物または株に限定されるので
はなく、むしろ全体としてこの種の集団の特徴であると
理解される。当業者は、それらの種の他の株または単離
物も異種酵素の発現に利用できると認識するだろう。各
種の多数の株がＡＴＣＣ（ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；１
２３０１Ｐａｒｋ−ｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅＭａｒｙｌａｎｄ２０８５２）；ＮＲＲ
Ｌ（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳ
ｅｒｖｉｃｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ；１８１５ＮｏｒｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳ
ｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ６１６
０４）；ＦＧＳＣ（ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔｉｃｓＳ
ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ；Ｋａｎｓａｓ）；ＤＳＭ（Ｄ
ｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒ
ｅｎ；ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１Ｂ，Ｄ−３
３００Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）；ＩＡＭ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｐｐｌｉ
ｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；１１３東京都文京
区弥生町１丁目１−１、東京大学）；ＩＦＯ（Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅｆｏｒＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；５３
２大阪府淀川区十三本町２丁目１７−８５）およびＣ
ＢＳ（ＣｅｎｔｒａａｌＢｕｒｅａｕｖｏｏｒＳ
ｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ；Ｏｏｓｔｅｒｓｔｒ
ａａｔ１，３７４０ＡＧＢａａｒｎ，Ｎｅｔｈｅ
ｒｌａｎｄｓ）の寄託機関において公に入手可能であ
る。

【００１５】当業者は、本明細書中に記載の宿主種の好
結果の形質転換が、特に例示されたベクター、プロモー
ターおよび選択マーカーの使用に限定されないことも認
識するだろう。一般的に言って、Ａ．オリゼ、Ａ．ニガ
ーおよびＡ．ニデュランスの形質転換において有用であ
るそれらの技術は、本発明の宿主細胞にも有用である。
例えば、ａｍｄＳおよびｈｙｇＢ選択マーカーが好まし
いけれども、他の有用な選択マーカーとしてａｒｇＢ
（Ａ．ニデュランスまたはＡ．ニガー）、ｔｒｐＣ
（Ａ．ニガーまたはＡ．ニデュランス）、またはｐｙｒ
Ｇ（Ａ．ニガーまたはＡ．ニデュランス）マーカーが挙
げられる。プロモーターは、それらの種において強力な
転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であることができ、そ
して細胞外と細胞内の両方のタンパク質、例えばアミラ
ーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セ
ルラーゼおよび解糖酵素をコードする遺伝子から誘導す
ることができる。そのような適当なプロモーターは、
Ａ．オリゼのＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムーコル・ミー
ヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）のアスパ
ラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガーのグルコアミラー
ゼ、Ａ．ニガーの中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸
安定性α−アミラーゼ、およびリゾムーコル・ミーヘイ
のリパーゼをコードする遺伝子から誘導することができ
る。解糖酵素の遺伝子からのプロモーターの例は、ＴＰ
Ｉ，ＡＤＨおよびＰＧＫである。プロモーターは同種プ
ロモーター、即ち生来のＡ．ジャポニカス型遺伝子のプ
ロモーターであってもよい。本発明の好ましいプロモー
ターは、Ａ．オリゼのＴＡＫＡアミラーゼプロモーター
である。ＴＡＫＡアミラーゼは公知のα−アミラーゼで
ある（Ｔｏｄａ他，Ｐｒｏｃ．ＪａｐａｎＡｃａｄ．
５８Ｓｅｒ．Ｂ．：２０８−２１２，１９８２）。プ
ロモーター配列と着目の遺伝子または選択されたシグナ
ルペプチドまたはプレ領域との連結を容易にする特定の
制限部位を導入する目的で、プロモーター配列にリンカ
ーを提供してもよい。ターミネーターとポリアデニル化
配列もプロモーターと同じ源から誘導することができ
る。構成物中にエンハンサー配列を挿入することもでき
る。

【００１６】発現産物を獲得するのに細胞を破壊する必
要性を回避するために、および細胞内で起こりうる発現
産物の分解の量を最小にするために、該産物が細胞の外
に分泌されることが好ましい。このために、好ましい態
様では、着目の遺伝子は、発現産物を細胞の分泌経路に
差し向けることができるプレ領域、例えばシグナルペプ
チドまたはリーダーペプチドに連結される。プレ領域は
任意の生物からの任意の分泌タンパク質の遺伝子から誘
導してもよく、または生来のプレ領域であってもよい。
そのようなプレ領域のための有用な入手源の中には、ア
スペルギルス種からのグルコアミラーゼもしくはアミラ
ーゼ遺伝子、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種からのア
ミラーゼ遺伝子、リゾムーコル・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏ
ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）からのリパーゼもしくはプ
ロテイナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）か
らのα−因子遺伝子、または子牛のプロキモシン遺伝子
がある。最も好ましくは、プレ領域はＡ．オリゼのＴＡ
ＫＡアミラーゼ遺伝子、Ａ．ニガーの中性α−アミラー
ゼ遺伝子、Ａ．ニガーの酸安定性α−アミラーゼ遺伝
子、Ｂ．リヘニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ）のα−アミラーゼ遺伝子、バシラスＮＣＩＢ
１１８３７からのマルトース産生アミラーゼ遺伝子、
Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のα−アミラーゼ遺伝子、または
Ｂ．リヘニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ）のズブチリシン遺伝子である。有効なシグナル配列
はＡ．オリゼのＴＡＫＡアミラーゼシグナル、リゾムー
コル・ミーヘイのアスパラギン酸プロテアーゼシグナ
ル、およびリゾムーコル・ミーヘイのリパーゼシグナル
である。代わりのものとして、発現させようとする遺伝
子にとって生来であるプレ領域を使ってもよい。

【００１７】プロモーターおよびターミネーター配列に
作用可能に連結された所望の生成物の遺伝子は、選択マ
ーカーを含むベクター中に含めることができ、または宿
主株のゲノム中に組み込むことができる別個のベクター
もしくはプラスミド上に置くことができる。ベクター系
は単一のベクターもしくはプラスミドであることがで
き、またはゲノム中に組み込もうとする全ＤＮＡを一緒
になって含有する２以上のベクターもしくはプラスミド
であることができる。ベクターまたはプラスミドは直鎖
状分子であっても閉環状分子であってもよい。本発明の
好ましい態様によれば、１つが選択マーカーを含み、そ
してもう１つがプロモーター、所望のタンパク質をコー
ドする遺伝子並びに転写ターミネーターおよびポリアデ
ニル化配列を含む導入しようとする残りの異種ＤＮＡを
含んで成る、２つのベクターを使って宿主を形質転換さ
せる。

【００１８】本発明の宿主細胞種は、任意の原核または
真核生物の着目の異種タンパク質を発現させるのに用い
ることができ、好ましくは、真核生物のタンパク質を発
現させるのに使われる。共に食品産業における使用が認
可されているという点で、Ａ．ジャポニカス種とＡ．ア
クレータス種が特に有用である（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ
ＡｓｐｅｃｔｓｏｆＭｉｃｒｏｂｉａｌＦｏｏ
ｄＥｎｚｙｍｅｓ，ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｔ
ｈｅＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｂｉ
ａｌＦｏｏｄＥｎｚｙｍｅＰｒｏｄｕｃｅｒｓ，
Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）。それらの種につ
いて特に着目されるのは、異種タンパク質、特に真菌酵
素の発現におけるそれらの利用である。カタラーゼ、ラ
ッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オ
キシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペル
オキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラー
ゼ、クチナーゼ、プロテアーゼおよび他のタンパク質分
解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダー
ゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペ
クチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−
ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコ
シダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソ
メラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボ
ヌクレアーゼ、キチナーゼ、並びにデオキシリボヌクレ
エアーゼのような酵素を発現させるのに本発明の新規発
現系を使うことができる。用語「真菌酵素」は生来の真
菌酵素だけでなく、アミノ酸の置換、削除、付加、また
は活性、熱安定性、ｐＨ耐容性等を増強するために行う
ことができる他の修正により変更されているそれらの真
菌酵素も包含することは、当業者により理解されるだろ
う。

【００１９】本発明の宿主細胞は、宿主細胞にとって生
来であるタンパク質の組換え生産にも用いることができ
る。そのような用法の非限定的例としては、タンパク質
の発現を増強するため、シグナル配列の使用によって着
目の生来のタンパク質の細胞外への輸送を促進するた
め、または主題の宿主細胞により通常生産されるタンパ
ク質のコピー数を増加させるために、異なるプロモータ
ーの調節下にＡ．ジャポニカス型の生来のタンパク質を
置くことが挙げられる。よって、本発明は、そのような
発現が宿主細胞にとって生来でない遺伝要素の使用、ま
たは宿主細胞中に通常は見られない様式で働くように操
作されている生来の要素の使用を含む限り、そのような
同種タンパク質の組換え生産も包含する。本発明を次の
非限定例により更に説明する。

【００２０】Ｉ．プロテアーゼアッセイ少なくとも１５の異なる種からの５０以上の株を試験
し、各単離物により生産されるプロテアーゼの量を測定
し、そしてそれらの細胞外タンパク質分布も観察する。
培養接種試料を調製するために、９ｃｍのペトリ皿中の
各株の７〜１０日培養物に１０ｍｌの滅菌蒸留水を加
え、菌糸から静かに胞子をかき取り、濃厚な懸濁液を作
る。この懸濁液２．５ｍｌを使って１００ｍｌのＡＳＰ
Ｏ４培地に接種する〔ＡＳＰＯ４培地は、水道水中に１
ｇ／ｌのＣａＣｌ_２、２ｇ／ｌの酵母エキス、１ｇ／ｌ
のＭｇＳＯ_４、５ｇ／ｌのＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ｌのク
エン酸、０．５ｍｌの微量金属溶液（１４．３ｇ／ｌの
ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ，０．５
ｇ／ｌのＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ，１３．８ｇ／ｌのＦｅ
ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，８．５ｇ／ｌのＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ
および３ｇ／ｌのクエン酸から成る）、１ｇ／ｌの尿
素、２ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２０ｇ／ｌのマル
トデキストリン（８ｍｌの２５％原液、加圧滅菌後に加
える）を含んで成り、加圧滅菌前にｐＨを４．５または
６．５に調整し、次いで加圧滅菌後に１００ｍｌあたり
８ｍｌの０．１Ｍクエン酸を使ってｐＨ４．５に調整し
た〕。フラスコを、２００ｒｐｍで軌道振盪器上で振盪
させながら、連続した光の中で３０および／または３７
℃で５日間インキュベートする。各々の培養ブロスから
の上清を２５００ｒｐｍで５分間遠心し、そしてカゼイ
ン透明化平板アッセイで使用し、様々な真菌種から生産
されるプロテアーゼのレベルを測定して組換えタンパク
質発現の有力な候補として評価する。

【００２１】カゼイン透明化平板アッセイは次のように
して行われる。平板培地は、２０ｇ／ｌの脱脂粉乳、２
０ｇ／ｌのアガロース、およびｐＨ５とｐＨ７で行われ
る試験には０．２Ｍのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液、ｐ
Ｈ９で行われる試験にはグリシン−ＮａＯＨ緩衝液から
成る。脱脂粉乳を１００ｍｌの緩衝液と混合し、６０℃
に維持する。アガロースを４００ｍｌの緩衝液と混合
し、そして５分間加圧滅菌する。わずかに冷却した後、
温かい脱脂粉乳混合物を添加し、混合物を穏やかに２〜
３回反転させて混合する。平板あたり５０〜７０ｍｌを
使ってこの培地を１５０ｍｍの平板に注ぎ、使用まで５
℃で貯蔵する。

【００２２】使用直前に、寒天の中に平板あたり１２個
の穴を作る。各株の醗酵物からの上清２５μｌを各ｐＨ
の平板１枚に加え、３７℃で一晩インキュベートする。
ｐＨ９の平板には、０．５Ｍ氷酢酸を加えてカゼインを
沈澱させ、どんな透明帯でも可視化する。次いで各平板
を透明帯のサイズ（即ち、透明帯なしから直径＞２ｃｍ
まで）と透明帯の型（即ち、透明、不透明または両方の
型）について評価する。

【００２３】各培養物の上清を使って、株の細胞外タン
パク質生産も評価する。製造業者の取扱説明書に従って
調製したＮｏｖｅｘ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）８〜
１６％勾配ゲルを使ってタンパク質分布を評価する。培
養上清の７５μｌ（３日および５日）試料を、２０μｌ
の５×解離緩衝液（解離緩衝液＝４７ｍｌの１ＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，１ｇのＳＤＳ，６１７ｍｇ
のジチオスレイトールを滅菌蒸留水で１０ｍｌにする）
とグリセロール／ブロモフェノールブルー（約１０ｍｌ
の８０〜９０％グリセロールに１０〜２０ｍｇを加え、
沸騰した湯の中に１〜２時間置いて溶解させたもの）に
添加し、５分間煮沸し、冷却し、負荷し、そしてブロモ
フェノールブルー追跡色素がゲルの下端に達するまで６
０〜２００Ｖで泳動する。ＢｉｏｒａｄＳｉｌｖｅｒ
ＳｔａｉｎＰｌｕｓプロトコール（Ｂｉｏｒａｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）
に従ってゲルを銀染色する。多数のバンドを示すそれら
の単離物は有力な新規宿主としてあまり適当でないと見
なし、一方でわずか１〜４本の少量バンドを有する比較
的きれいな分布を示すものは更なる試験にかける。

【００２４】プロテアーゼアッセイとタンパク質分布の
組合せ結果を吟味すると、適当な有力候補の大部分は黒
色（Ｎｉｇｒｉ）部門のメンバーの中に見つかる。それ
らの結果に基づいて、次の単離物を形質転換実験のため
に選択した：Ａ．ジャポニカスＡ１４３８（ＣＢＳ５
６８．６５）、Ａ．アクレータスＮ１１３６（ＣＢＳ１
０１．４３）、Ａ．アクレータスＡ１４５４（ＣＢＳ
１７２．６６）、Ａ．アクレータスＡ１４５５（ＣＢＳ
１８６．６７）、Ａ．ジャポニカス変種アクレータス
Ｎ０９５６（ＩＡＭ１３８７１）、Ａ．フェニシスＡ
５２８（ＣＢＳ１３９．４８）、Ａ．フェニシスＡ５
３０（ＣＢＳ１３７．５２）、Ａ．フェニシスＥ４１
９（ＣＢＳ１３７．５２）、Ａ．カルボナリウスＡ３
９９３（ＩＢＴ４９７７）、Ａ．カルボナリウスＡＴ
ＣＣ１０２５、Ａ．タマリィＥ１１２（ＡＴＣＣ１
０８３６）、Ａ．タマリィＮ２２６６（ＩＦＯ４３５
８）およびＡ．タマリィＮ２２６７（ＩＦＯ４１４
２）。それらの培養物は、ノボ・ノルディスク・バイオ
テック・カルチャー・コレクション（ＮｏｖｏＮｏｒ
ｄｉｓｋＢｉｏｔｅｃｈＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ；Ｄａｖｉｓ，Ｃａｌｌｉｆｏｒｎｉａ）
の一部としても維持される。

【００２５】ＩＩ．ベクターの作製Ａ．選択マーカーベクター。ベクターｐＪａＬ７７とｐ
ＪａＬ１５４をヒグロマイシンＢ耐性選択マーカーによ
る宿主細胞の形質転換に使用する。このマーカーはＥ．
コリのヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝
子に基づいており、ｐＪａＬ７７中ではＴＡＫＡプロモ
ーターの調節下にそしてｐＪａＬ１５４中ではａｍｄＳ
プロモーターの調節下に置かれる。簡単に言えば、それ
らのベクターは次のようにして作製される。ヒグロマイ
シンＢに対する耐性を付与する遺伝子を、Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍからプラスミドｐＨｐｈ−
１として購入する。この遺伝子に、プライマー：５’−
ＧＣＴＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＣＣＴＡＣ
ＡＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＧＴＣＧＣＣＴＧ
ＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＣＧＴＣＴ−３’
（Ｎ−末端）と３’−ＣＧＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡ
ＡＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴ
ＣＡＴＧＣＴ−５’（Ｃ−末端）を使って、ＰＣＲ
によりアミノ末端とカルボキシ末端に適当な制限部位並
びにＡＴＧコドンを取り付ける。ＰＣＲ断片を制限酵素
ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、次いでアスペルギルス
発現ベクターｐＴｏＣ６８（ＷＰ９１／１７２４３中
に記載されている）中の対応部位にクローニングしてｐ
ＪａＬ７７を作製する。

【００２６】プラスミドｐＪａＬ１５４は次のようにし
て作製する。次のプライマー（下線領域はａｍｄＳプロ
モーターとの相同性を示す）：ＣＣＴＧＧＡＴＣＣ
ＴＣＴＧＴＧＴＴＡＧＣＴＴＡＴＡＧおよ
びＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＧＣＣＡＧＧＡＣＣ
ＧＡＧＣＡＡＧを使ったＰＣＲにより、プラスミド
ｐＣａＨｊ４０６からａｍｄＳプロモーター変異体Ｉ_９
＋Ｉ_６６６（Ｈｙｎｅｓ他，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３（８）：１４３０−１４３９，１９８３およびＫ
ａｔｚ他，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．２２０：３７３
−３７６，１９９０）をクローニングする。ａｍｄＳプ
ロモーターを含む６９４ｂｐのＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ
とＳｐｈＩで切断し、ｐＪａＬ７７のＴＡＫＡプロモー
ターがａｍｄＳプロモーターで置換されるようにｐＪａ
Ｌ７７中の対応部位にクローニングする。

【００２７】ａｍｄＳマーカーを含むプラスミドｐＴｏ
Ｃ９０は、ｐ３ＳＲ２（Ｈｙｎｅｓ他，前掲）からの
２．７ｋｂＸｂａＩ断片を、ＸｂａＩで切断しそして
脱リン酸したｐＵＣ１９プラスミド中にクローニングす
ることにより作製する。ｐＴｏＣ１８６と命名された誘
導体は、プロモーター領域がａｍｄＳ遺伝子の発現を増
強することが知られている２つの変異体（Ｉ_９とＩ
_６６６）を含むこと以外はｐＴｏＣ９０と同じである
（Ｈｙｎｅｓ他，前掲；Ｃｏｒｒｉｃｋ他，Ｇｅｎｅ５
３：６３−７１，１９８７）。

【００２８】Ｂ．発現ベクター。１．カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ
ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ。カンジダ・アンター
クティカのリパーゼＡの発現のために、Ｃ．アンターク
ティカ株ＬＦＯ５８（ＤＳＭ３８５５）の染色体ＤＮ
ＡをＹｅｌｔｏｎ他の方法（ＰＮＡＳＵＳＡ８１：
１４７０−１４７４，１９８４）に従って抽出する。精
製したＤＮＡをＳａｕ３Ａで部分的に切断しそしてアガ
ロースゲル電気泳動した後、３−９ｋｂの範囲の断片を
単離する。サイジングされたＳａｕ３Ａ断片を、Ｂａｍ
ＨＩで切断し脱リン酸したプラスミドｐＢＲ３２２（Ｎ
ｅｗＥｎｇ−ｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）中に連結せ
しめる。連結混合物を用いてＥ．コリＭＴ１７２を形質
転換させる。約５０，０００のＥ．コリ形質転換体を
得、その８０％がＬＦＯ５８のＤＮＡ挿入断片を含有す
る。

【００２９】標準的なコロニーハイブリダイゼーション
技術により、成熟Ｃ．アンタークティカリパーゼから決
定したＮ末端配列に基づいた縮重１７マーである^３２Ｐ
−リン酸化オリゴヌクレオチドプローブＮＯＲ４４０
を使って、それらのコロニーをスクリーニングする。３
４個のコロニーが低緊縮性での洗浄（４１℃および６×
ＳＳＣ）後に陽性を示す。それらのコロニーからプラス
ミドを調製し、そしてＢｓｔＮＩでの制限後にサザンハ
イブリダイゼーションにより分析する。サザン用プロー
ブは、コロニーハイブリダイゼーションで使ったＮＯＲ
４４０プローブかまたは^３２Ｐ−標識プローブＮＯＲ
４３８である。ＮＯＲ４３８プローブは、１３番目
の塩基が酵母と糸状菌のコドン用法に基づいて選択され
ている、リパーゼのアミノ酸配列に相当するオリゴヌク
レオチドである。推測位置が指示されている。

【００３０】唯一のプラスミドｐＭＴ１０７６が、低緊
縮性でＮＯＲ４４０および幾分高い緊縮性（５５℃お
よび１×ＳＳＣ）でＮＯＲ４３８の両方にハイブリダ
イズするバンドを含む。

【００３１】ｐＭＴ１０７６の制限地図を作成し、Ｍａ
ｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により配列を決定する。その
配列を配列表の配列番号１に示す。転写解読枠は２１ア
ミノ酸の推定上のシグナルと、成熟リパーゼのＮ末端の
前にある１０アミノ酸のプロペプチドもコードする。該
プロペプチドの最後の２つのアミノ酸は、Ｓ．セレビシ
エ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＥＸ−２型の酵素に
よるタンパク質内分解プロセシングのための典型的な開
裂部位であるＡｒｇ−Ａｒｇである。アミノ酸配列は配
列表の配列番号２に与えられる。多数の標準的なプラス
ミド操作（Ｍａｎｉａｔｉｓ他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ，ＮＹ，１９８２）を経て、Ｃ．アンタークティカの
リパーゼＡの転写解読枠をＡ．オリゼのα−アミラーゼ
プロモーターとＡ．ニガーのグルコアミラーゼ転写ター
ミネーターの間に正しい方向で配置する。得られた発現
プラスミドはｐＭＴ１２２９である。

【００３２】２．フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍ
ｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）キシラナーゼ。ベクタ
ーｐＨＤ４１４はプラスミドｐ７７５（ＥＰ２３８
０２３）の誘導体である。このプラスミドとは異なり、
ｐＨＤ４１４はＴＡＫＡプロモーターとＡＭＧターミネ
ーターの間に一連のユニークな制限部位を有する。該プ
ラスミドは、ターミネーターの３′末端の長さ約２００
ｂｐの断片（望ましくないＲＥ部位を含む）の除去に続
き、プロモーターの５′末端の長さ約２５０ｂｐの断片
（同じく望ましくない部位を含む）の除去により作製さ
れる。ＮａｒＩ（ｐＵＣベクター中に存在する）とＸｂ
ａＩ（ターミネーターのすぐ３′側）での消化により２
００ｂｐ領域を除去し、次いで生成した末端をクレノウ
ＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＮＴＰを使ってフィルインし、
ベクター断片をゲル上で精製し、そしてベクター断片を
再連結する。このプラスミドをｐＨＤ４１３と命名す
る。ｐＨＤ４１３をＳｔｕＩ（プロモーターの５′末端
に位置する）とＰｖｕＩＩ（ｐＵＣベクター中）で切断
し、ゲル上で分画しそして再連結し、ｐＨＤ４１４を得
る。ｐＹＥＳ中に約１，１００ｂｐのキシラナラーゼＨ
ｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩｃＤＮＡ断片を含有するＥ．
コリの株をＤＳＭ６９９５としてＤＳＭに寄託する。
該キシラナーゼｃＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａ
Ｉでの開裂によりクローンの１つから単離する。該断片
をアガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出さ
せ、連結反応に向けて準備する。該ｃＤＮＡ断片をｐＨ
Ｄ４１４中に連結してｐＡＸＸ４０−１−１を作製す
る。キシラナーゼ遺伝子およびタンパク質の配列は配列
表の配列番号３と４に与えられる。該遺伝子をＤＳＭ
（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉ
ｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔ
ｕｒｅｎＧｍｂＨ）６９９５として寄託する。

【００３３】３．フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍ
ｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ。フミコー
ラ・インソレンスのセルラーゼの詳細な特徴づけはＷＯ
９１／１７２４３中に見つかる。セルラーゼ発現に使っ
た発現ベクターｐＣａＨｊ４１８は、制限酵素ＢａｍＨ
ＩとＳａｌＩでの開裂によりｐＣａＨｊ２０１から９２
６ｂｐセルラーゼコード領域断片を切除することにより
作製される。この断片を標準技術を使った調製用ゲル電
気泳動により精製し、そしてＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処
理しておいたｐＨＤ４１４（上述）と連結せしめる。得
られた発現ベクターｐＣａＨｊ４１８は、Ａ．オリゼの
ＴＡＫＡアミラーゼプロモーターとＡ．ニガーのグルコ
アミラーゼターミネーター領域の転写調節下にセルラー
ゼ遺伝子を含有する。

【００３４】４．フミコーラ・ラヌギノーザ（Ｈｕｍ
ｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ。Ｈ．ラ
ヌギノーザのリパーゼ遺伝子の単離および発現はＥＰ３
０５２１６中とＵＳ出願第０７／２３６，６０５号中に
報告されており、その内容は参考として本明細書中に組
み込まれる。簡単に言えば、ホモジナイズしたＨ．ラヌ
ギノーザ菌糸からＢｏｅｌ他（ＥＭＢＯＪ．３：１０
９７−１１０２，１９８４）とＣｈｉｒｇｗｉｎ他（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：５２９４−５２９９，
１９７９）により記載された方法を使って全ＲＮＡを抽
出する。ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ（ＰＮＡＳＵＳＡ
６９：１４０８−１４１２，１９７２）により記載さ
れたようなオリゴ（ｄＴ）−セルロース上での２度のア
フィニティークロマトグラフィーにより、ポリ（Ａ）含
有ＲＮＡを得る。次いでＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ
（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０，
１９８２）により記載された方法と、Ｎｏｍａ他（Ｎａ
ｔｕｒｅ３１９：６４０−６４６，１９８６）により
記載されたベクターｐＳＰ６２−Ｋ２とｐＣＤＶＩ−Ｐ
Ｌを使ってｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡを
Ｅ．コリＭＣ１０００のｈｓｄＲ⁻，Ｍ^＋誘導体（Ｃａ
ｓａｄａｂａｎおよびＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１３８：１７９−２０７，１９８０）中に形質転換
せしめ、組換えクローンを作製する。

【００３５】３２個のペンタデカマー（１５マー）オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドの混合物

【化１】（その１つは、Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎをコードする領域がＨ．ラヌギノーザのリパーゼｍＲ
ＮＡと相補的である）をＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のＤＮＡ合成装置上で合成し、ＰＡ
ＧＥにより精製する。Ｈ．ラヌギノーザｃＤＮＡライブ
ラリーからの約１０，０００のＥ．コリ組換え体をＷｈ
ａｔｍａｎ５４０フィルターに移す。Ｇｅｒｇｅｎ他
（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．７：２１１５
−２１３５，１９７９）により記載されたようにコロニ
ーを溶解させ固定化する。Ｂｏｅｌ他（ＥＭＢＯＪ．
３：１０９７−１１０２，１９８４）により記載された
通りに該フィルターを^３２Ｐ−標識Ｈ．ラヌギノーザリ
パーゼ特異的ペンタデカマー混合物とハイブリダイズさ
せる。フィルターのハイブリダイゼーションと洗浄をそ
れぞれ３７℃と４３℃で行い、次いで映像強化膜を使っ
て２４時間オートラジオグラフィーを行う。標準手順
（ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．７：１５１３−１５２３，１９７
９）により２つのハイブリダイズしているコロニーｐＨ
ＬＬ７０２．３とｐＨＬＬ７０２．４からＭｉｎｉｐｒ
ｅｐプラスミドＤＮＡを単離し、そしてＭａｘａｍおよ
びＧｉｌｂｅｒｔ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．６
５：４９９−５６０，１９８０）の手順により該ＤＮＡ
挿入断片のＤＮＡ配列を決定する。

【００３６】該ｃＤＮＡを使った作製作業を更に容易に
するために、次のようにしてユニーク制限部位を含むＤ
ＮＡ配列を該ｃＤＮＡの５′末端と３′末端に付加す
る。３′非翻訳領域中でｃＤＮＡを消化するＳａｕ９６
１でｐＨＬＬ７０２．３を消化し、生じた末端をＥ．コ
リＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片）と４つのｄＮＴ
Ｐを使ってフィルインする。このＤＮＡを次いで該ｃＤ
ＮＡのメチオニン開始コドンのすぐ３′側を１回切断す
るＳａｃＩで消化する。得られた０．９ｋｂｃＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出
し、そして連結反応に備える。５′アダプターとして２
つのオリゴヌクレオチド９２７と９２８を合成する。こ
のアダプターは、ｃＤＮＡのＭｅｔ開始コドンのすぐ
５′にＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位を付加するよう
にデザインされる。この２つのオリゴをＡＴＰとＴ_４ポ
リヌクレオチドキナーゼを使ってリン酸化し、互いにア
ニーリングし、そしてＨｉｎｄＩＩＩとＨｉｎｃＩＩで
消化し０．７％アガロースゲル上で精製したｐＵＣ１９
ベクター中の精製０．９ｋｂｃＤＮＡ配列に連結せし
める。得られたプラスミドは、ポータブル０．９ｋｂ
ＢａｍＨＩ断片としてＨ．ラヌギノーザのリパーゼｃＤ
ＮＡを担持している。ＢａｍＨＩ消化とアガロースゲル
上での０．９ｋｂｃＤＮＡ断片の精製の後、その断片
をＢａｍＨＩで消化されリン酸化されたｐ７７５と連結
せしめ、ｐ９６０を作製する。ｐ９６０中では、リパー
ゼｃＤＮＡがＡ．オリゼからのＴＡＫＡプロモーターと
Ａ．ニガーからのＡＭＧターミネーターの転写調節下に
置かれている。

【００３７】ｐＭＨａｎ３７を調製するために、フミコ
ーラ・ラヌギノーザのリパーゼ遺伝子のすぐ上流のＡ．
オリゼＴＡＫＡプロモーターの５′非翻訳領域の６０塩
基対を、Ａ．ニデュランスのｔｐｉＡ遺伝子（ＭｃＫｎ
ｉｇｈｔ他，Ｃｅｌｌ４６：１４３−１４７，１９８
６）からの対応領域により置換することにより、ｐ９６
０を変更する。非翻訳領域のすぐ外側にｐ９６０配列と
相同である２０塩基対により各端において隣接された
Ａ．ニデュランスのｔｐｉＡ遺伝子からの５′非翻訳領
域を含む合成オリゴヌクレオチドを、ＴＡＫＡプロモー
ター領域中にＢｓｓＨＩＩ部位を含む別のプライマーと
一緒にＰＣＲ反応に使用する。変異誘発プライマーはＡ
ＴＧ開始コドンの近くにＢａｍＨＩ部位を含むので、Ｐ
ＣＲ断片をＢａｍＨＩとＢｓｓＨＩＩで消化し、そして
ＢｓｓＨＩＩで消化しＢａｍＨＩで部分消化したｐ９６
０中に再クローニングする。ＭＨａｎ３７中のＡＴＧコ
ドンの上流の２００塩基をＤＮＡ配列分析により確認す
る。ｐ９６０とｐＭＨａｎ３７との配列の相違を下記に
示す：

【化２】

【００３８】ＢａｍＨＩ部位を包含するプライマーの配
列：

【化３】

【００３９】５．コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒ
ｉｎｕｓｃｉｎｅｒｅｕｓ）ペルオキシダーゼ。コプ
リナス・シネレウスのペルオキシダーゼ遺伝子の単離お
よび発現はＷＯ９２／１６６３４中に記載されてい
る。簡単に言えば、Ｂｏｅｌ他（ＥＭＢＯＪ．３：１
０９７−１１０２，１９８４）とＣｈｉｒｇｗｉｎ他
（Ｂｉｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ１８：５２９４−５２９
９，１９７９）により記載された通りに最大ペルオキシ
ダーゼ活性の時期に収集しホモジナイズしたコプリナス
・シネレウス（ＩＦＯ８３７１）菌糸から全ＲＮＡを
抽出する。ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ（ＰＮＡＳＵＳ
Ａ６９：１４０８−１４１２，１９７２）により記載
されたようなオリゴ（ｄＴ）−セルロース上での２度の
アフィニティークロマトグラフィーにより、ポリ（Ａ）
含有ＲＮＡを得る。製造業者の取扱説明書に従ってＩｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎからのｃＤＮＡ合成キットを使ってｃ
ＤＮＡを合成する。コプリナス・シネレウスｃＤＮＡラ
イブラリーからの約５０，０００のＥ．コリ形質転換体
をＷｈａｔｍａｎ５４０濾紙に移す。Ｇｅｒｇｅｎ他
（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．７：２１１５
−２１３５，１９７９）により記載されたようにコロニ
ーを溶解させ固定化する。該フィルターを０．２×ＳＳ
Ｃ，０．１％ＳＤＳ中で^３２Ｐ−標識４３０塩基対ペル
オキシダーゼ特異的プローブとハイブリダイズさせる。
フィルターのハイブリダイゼーションと洗浄を６５℃で
行い、次いで映像強化膜を使って２４時間オートラジオ
グラフィーを行う。オートラジオグラフィー後、増加す
る温度でフィルターを洗浄し、次いで映像強化膜を使っ
て２４時間オートラジオグラフィーを行う。こうして、
５０以上の陽性クローンが同定される。ハイブリダイズ
しているコロニーから標準手順（Ｂｉｒｎｂｏｉｍおよ
びＤｏｌｙ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．７：１５
１３−１５２３，１９７９）によりＭｉｎｉｐｒｅｐプ
ラスミドＤＮＡを単離し、そしてＳａｎｇｅｒのジデオ
キシ法（Ｓａｎｇｅｒ他，ＰＮＡＳＵＳＡ７４：５
４６３−５４６７，１９７７）によりｃＤＮＡ挿入断片
のＤＮＡ配列を決定する。このペルオキシダーゼｃＤＮ
Ａ断片をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩでの開裂によりベク
ターから切り出し、アガロースゲル電気泳動により精製
し、電気溶出し、そして連結反応に備える。該ｃＤＮＡ
断片をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで消化されたＨＤ４１
４中に連結せしめ、該ｃＤＮＡがＡ．オリゼからのＴＡ
ＫＡプロモーターとＡ．ニガーからのＡＭＧターミネー
ターの転写調節下に置かれているｐＣｉｐを作製する。
ｐＣｉＰから、ペルオキシダーゼ開始コドンのすぐ上流
のＳａｃＩ，ＫｐｎＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ，Ｓ
ａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限部位が削除されているプラ
スミドｐＪＶｉ９を調製する。

【００４０】コプリナス・シネレウスのペルオキシダー
ゼをコードするｃＤＮＡ配列は配列表の配列番号５と６
に示される。作製した発現ベクターの要約を表１に与え
る。

【００４１】

【表１】

【００４２】ＩＩＩ．アスペルギルス宿主の形質転換例外を表記しない限り、試験した全ての株の形質転換に
おいて次の一般手順を使用する。１００ｍｌのＭＹ５０
培地に形質転換しようとする株の胞子を接種し、３４℃
で振盪しながら１〜２日間インキュベートする。ミラク
ロス（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）を通した濾過により菌糸を
収集し、２００ｍｌの０．６ＭＭｇＳＯ_４で洗浄す
る。菌糸を１５ｍｌの１．２ＭＭｇＳＯ_４，１０ｍＭ
ＮａＨ_２ＰＯ_４，ｐＨ＝５．８中に懸濁する。この懸
濁液を氷上で冷却し、それに１２０ｍｇのｍｌＢＳＡ（ＳｉｇｍａＨ２５型）を加え、顕微鏡下
で観察した時に試料中に多数のプロトプラストが見える
ようになるまで穏やかに攪拌しながら３７℃で１．５〜
２．５時間インキュベーションを続ける。

【００４３】この懸濁液をミラクロスを通して濾過し、
濾液を無菌試験管に移し、その上に５ｍｌの０．６Ｍソ
ルビトール，１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝
７．０を重層する。２５００ｒｐｍで１５分間遠心を行
い、ＭｇＳＯ_４クッションの上部からプロトプラストを
収集する。２容のＳＴＣ（１．２Ｍソルビトール，１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ＝７．５，１０ｍＭＣ
ａＣｌ_２）をプロトプラスト懸濁液に加え、混合物を１
０００×ｇで５分間遠心する。プロトプラストペレット
を３ｍｌのＳＴＣ中に再懸濁し、再びペレット化する。
これを繰り返した後、プロトプラストを０．２〜１ｍｌ
のＳＴＣに再懸濁する。

【００４４】１００μｌのプロトプラスト懸濁液を１０
μｌのＳＴＣ中の５〜２５μｇの適当なＤＮＡと混合す
る。着目の構造遺伝子を含む発現ベクター（表１参照）
と選択マーカーを含むプラスミドを使って各株を同時形
質転換せしめる。プラスミドｐＴｏＣ９０とｐＴｏＣ１
８６はＡ．ニデュランスａｍｄＳ遺伝子を含み、形質転
換および唯一の窒素源としてのアセトアミド上での増殖
についての選択に使われる。プラスミドｐＪａＬ７７と
ｐＪａＬ１５４は形質転換およびヒグロマイシンＢ耐性
の選択に使われる。混合物を室温で２５分間維持する。
０．２ｍｌの６０％ＰＥＧ４０００（ＢＤＨ２９５
７６），１０ｍＭＣａＣｌ_２および１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌｐＨ＝７．５を加え、注意深く２度混合し、
最後に同じ溶液０．８５ｍｌを加え、注意深く混合す
る。この混合物を室温で２５分間維持し、２５００×ｇ
で１５分間遠心し、ペレットを２ｍｌの１．２Ｍソルビ
トール中に再懸濁する。もう１回沈澱させた後、プロト
プラストを適当な平板上に塗抹する。１．０Ｍショ糖，
ｐＨ＝７．０、窒素源としての１０ｍＭアセトアミド
（ａｍｄＳが選択マーカーである時）およびバックグラ
ウンド増殖を阻害するための２０ｍＭＣｓＣｌを含有
する最少培地（Ｃｏｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ１１３：５１−５６，１９６６）上にプ
ロトプラストを塗抹する。ｈｙｇＢが選択マーカーであ
る時、培地は窒素源として１０ｍＭ亜硝酸ナトリウムを
使いそして１５０μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢが存在
する点で異なる。最終遠心段階、再懸濁および塗抹に代
わるものとして、８ｍｌのＳＴＣを加えてプロトプラス
トと混合し、３枚の選択用平板の各々に３ｍｌを加え、
次いで渦巻状に動かして平板全体に広げる。３７℃で４
〜７日間インキュベートした後、分生子を有するコロニ
ーを取り、滅菌蒸留水に懸濁し、そして単一コロニーの
選択のために塗抹する。この手順を繰り返し、２回目の
再単離後の単一コロニーの胞子を限定された形質転換体
として保存する。

【００４５】ＩＶ．組換えタンパク質発現の評価上記手順の後、選択された株の個々の単離物を表１に記
載の発現ベクターのうちの１つと前の実施例で言及した
選択マーカーを含むプラスミドのうちの１つを使って同
時形質転換させる。次いで各々の同時形質転換体を適当
なアッセイにより試験して着目の遺伝子の発現を調べ
る。

【００４６】Ａ．リパーゼリパーゼ活性の同時形質転換体を、１ｌの蒸留水中、５
０ｇ／ｌのマルトデキストリン，２ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４
・７Ｈ_２Ｏ，２ｇ／ｌのＫＨ_２ＰＯ_４，３ｇ／ｌのＫ_２
ＳＯ_４，４ｇ／ｌのクエン酸，８ｇ／ｌの酵母エキス，
３ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，０．５ｍｌの微量金属
溶液，４ｍｌの５０％尿素溶液（別々に加圧滅菌したも
の），ｐＨ６．０から成るＭ４００Ｄａ培地中で培養
し、そして５ｇ／ｌの酵母エキスを水道水中に８００ｍ
ｌ作製する。加圧滅菌後、１６６ｍｌの濾過滅菌済の１
Ｍ尿素（１０ｇ／ｌの最終濃度を与える）と３５．３ｍ
ｌの濾過滅菌済の１ＭＮａＮＯ_３（０．３％の最終濃
度を与える）を加える。基質としてｐ−ニトロフェニル
ブチレート（ｐＮＢ）を使って培養濾液中のリパーゼ活
性を測定する。ｐＮＢの原液は、１０４．６μｌのｐＮ
Ｂを５ｍｌのＤＭＳＯに加えることにより調製する。ミ
クロタイタープレートの各ウエルに９０μｌの５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，ｐＨ７を加える。各ウエルに１０μｌの試
料を加え、ミクロタイタープレートを約１分間振盪する
ことにより混合する。アッセイの直前に、２０μｌのｐ
ＮＢ原液を９７０μｌの５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液，ｐ
Ｈ７と混合する。市販のプレートリーダーを使ってリパ
ーゼ活性についてアッセイする直前に、１００μｌのｐ
ＮＢ−Ｔｒｉｓ混合物を各試料ウエルに加え、３分間に
渡り４０５ｎｍで吸光度を測定する。アッセイは温度感
受性であるので、各試料セットと共に内部標準を使用す
る。各試料について決定された傾きはリパーゼ活性と正
比例する；アッセイの直線領域は約０．００５〜５μｇ
リパーゼ／ｍｌである。この型のアッセイにおいて、
Ｈ．ラヌギノーザのリパーゼの比活性は約４０００Ｌ
Ｕ／ｍｇであると決定され、一方でカンジダのリパーゼ
Ａの比活性は約４００ＬＵ／ｍｇである。

【００４７】Ｂ．キシラナーゼ全てのキシラナーゼ形質転換体は次の組成（ｇ／ｌで）
を有する培地中で増殖させる：マルトデキストリン，５
０；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，２．０；ＫＨ_２ＰＯ_４，１
０．０；Ｋ_２ＳＯ_４，２．０；クエン酸，２．０；酵母
エキス，１０．０；ＡＭＧ微量金属溶液，０．５ｍｌ；
尿素２．０；ｐＨ６．０。全ての形質転換体は３４℃で
深部攪拌培養物として増殖させる。

【００４８】培養ブロス中のキシラナーゼ活性は、クエ
ン酸塩−リン酸塩緩衝液，ｐＨ６．５中に懸濁した０．
２％ＡＺＣＬ−キシラン（ＭｅｇａｚｙｍｅＣｏ．，
Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使って測定する。培養液を通常
は１００倍希釈し、希釈した培養液１０μｌを１ｍｌの
０．２％ＡＺＣＬ−キシラン基質と混合する。この混合
物を４２℃で３０分間インキュベートする。反応混合物
を５分毎によく混合する。インキュベーションの終わり
に、１０，０００ｒｐｍでの５分間の遠心により未消化
の基質を沈澱させる。基質から放出された青色色素を５
９５ｎｍでの吸光度により定量し、そして既知の活性を
有する酵素調製物を使って作った標準曲線から培養ブロ
ス中の酵素活性の量を計算する。同一条件下で調製した
酵素標準物と比較してエンドキシラナーゼ単位（ＥＸ
Ｕ）を決定する。

【００４９】Ｃ．セルラーゼセルラーゼ形質転換体をＭＹ５０培地（５０ｇ／ｌのマ
ルトデキストリン，２ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，
１０ｇ／ｌのＫＨ_２ＰＯ_４，２ｇ／ｌのＫ_２ＳＯ_４，２
ｇ／ｌのクエン酸，１０ｇ／ｌの酵母エキス，０．５ｍ
ｌの微量金属溶液，２．０ｇの尿素）中で深部培養物と
して３４℃で増殖させる。セルラーゼ活性は、０．１Ｍ
クエン酸塩−リン酸塩緩衝液，ｐＨ６．５中に懸濁した
０．２％ＡＺＣＬ−ＨＥ−セルロース（Ｍｅｇａｚｙｍ
ｅ）を基質として使って測定する。培養液を０．１Ｍク
エン酸塩緩衝液，ｐＨ６．５中に希釈し、希釈した培養
液１０μｌを１７ｍｌの０．２％ＡＺＣＬ−ＨＥ−セル
ロースと混合する。この混合物を振盪しながら４２℃で
３０分間インキュベートする。反応混合物を５分毎によ
く混合する。インキュベーション後、１０，０００ｒｐ
ｍでの５分間の遠心により未消化の基質を沈澱させる。
上清中の青色色素を５９５ｎｍで分光光度的に定量し、
そして既知のセルラーゼ標準物を使って作った標準曲線
から酵素活性の量を決定する。同一条件下で調製した酵
素標準物と比較してエンドセルラーゼ単位（ＥＣＵ）を
決定する。

【００５０】Ｄ．ペルオキシダーゼＣｉＰの同時形質転換体は、１ｌの蒸留水中、５０ｇ／
ｌのマルトデキストリン，２ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４・７Ｈ
_２Ｏ，２ｇ／ｌのＫＨ_２ＰＯ_４，３ｇ／ｌのＫ_２Ｓ
Ｏ_４，４ｇ／ｌのクエン酸，８ｇ／ｌの酵母エキス，３
ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，０．５ｍｌの微量金属溶
液，４７ｍｌの５０％尿素溶液（別々に加圧滅菌したも
の），ｐＨ６．０から成るＭ４００Ｄａ培地中で培養す
る。

【００５１】基質としてＡＢＴＳを使ってまたは既知濃
度の標準物に比較したロケット免疫電気泳動により、ペ
ルオキシダーゼ発現をモニタリングする。免疫拡散法の
ために、ＴＭ緩衝液（１．３ｇ／ｌのＴｒｉｓ塩基，
０．６ｇ／ｌのマレイン酸，ｐＨ７）中の１％アガロー
スを溶融し次いで５５℃に冷却する。４００μｌのＣｉ
Ｐに対するウサギ抗血清を１５ｍｌのアガロースと混合
し、１０ｃｍ×１０ｃｍの平板上に塗抹しそして凝固さ
せる。ＣＤＭ中で３７℃で７日間増殖させたＣｉＰ形質
転換体のＣＤＭ寒天（１ｇ／ｌのＫ_２ＰＯ_４，３０ｇ／
ｌのショ糖，０．３ｇ／ｌのＮａＮＯ_３，０．０５ｇ／
ｌのＫＣｌ，０．０５ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，
０．００１ｇ／ｌのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．００１
ｇ／ｌのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．０００５ｇ／ｌの
ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ，２０ｇ／ｌのマルトデキストリ
ン，１５ｇ／ｌのアガロース）培養試料を、寒天平板上
に作った５ｍｍの穴に適用する。タンパク質を４８時間
拡散させる。該平板をクーマシーブルーＲで染色してタ
ンパク質−抗体沈澱帯を可視化する。標準溶液として、
５００，１０００および２０００ペルオキシダーゼ単位
（ＰＯＤＵ）／ｍｌの濃度で精製物質を使用する。１Ｐ
ＯＤＵは、標準条件下で１分あたり１μモルの過酸化水
素の変換を触媒する酵素の量である。

【００５２】ＡＢＴＳ〔２，２′−アジノビス（３−エ
チルベンゾチアゾリン−６−スルホネート）〕法により
ペルオキシダーゼを測定するために、２ｍｌの２ｍＭ
ＡＢＴＳ〔０．１Ｍリン酸塩緩衝液（１０．６３ｇのリ
ン酸水素二ナトリウム二水和物ｐ．ａ．Ｍ６５８０と
５．４９ｇのリン酸二水素カリウムｐ．ａ．Ｍ４８７３
を脱イオン水中に溶かして１ｌにしたもの）中の０．１
１０ｇのＡＢＴＳ，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈ
ｅｉｍＮｏ．１０２９４６〕を３０℃で１０分間予熱
する。これにガラス試験管中の１０．６ｍＭＨ_２Ｏ_２
溶液（１．０ｇのして２５ｍｌにしたもの）と０．２ｍｌの試料または標
準物質（標準物質＝５．０ｍｇのＫｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅ
ｃ，ｇｒａｄｅ１，Ｎｏ．４１４０Ａをリン酸塩緩衝
液に溶かして２５ｍｌに調整し、それを４００倍希釈し
たもの）を加える。反応を３０℃で３分間行う。試料の
吸光度をＭｉｌｌｉＱ脱イオン水に対して４１８ｎｍ
で測定し、３分間監視する。ペルオキシダーゼ活性の最
良の反映は吸光度差：ΔＡ＝Ａ_{（７５ｓｅｃ）}−Ａ
_{（１５ｓｅｃ）}により与えられる。吸光度差は試料で
は０．０５〜０．１ＰＯＤＵ／ｍｌに相当する０．１
５〜０．３０の間にあるだろう。

【００５３】ＶＩ．結果および考察表２は、本発明の代用宿主により生産される様々な異種
真菌酵素の発現レベルを要約する。全ての株が少なくと
も１つの着目の遺伝子の発現に成功したことがこの表か
ら明らかである。幾つかの場合には、新規宿主株が意外
にも高レベルの酵素を与える。例えば、Ａ．アクレータ
ス、Ａ．ジャポニカスおよびＡ．ジャポニカス変種アク
レータスの各々の少なくとも１つの株が振盪フラスコ培
養において驚くほど高いレベルのＨＬＬを生産し（１ｌ
あたり約１ｇ）、それらの種が多量の異種タンパク質を
発現できることを証明する。実際、それらの形質転換体
により生産されるＨＬＬの生産レベルは、Ａ．オリゼの
最良の一次形質転換体と同じ位またはそれより高いと思
われる。

【００５４】Ａ．ジャポニカスもまた、Ａ．オリゼおよ
びＡ．ニガーＢｏ８０に比べてキシラナーゼの生産のた
めの優れた宿主であることがわかる。この酵素について
の振盪フラスコ収率は、最良のＡ．オリゼ形質転換体に
見られるレベルの約２倍である。

【００５５】Ａ．アクレータスＡ１４５５株もカンジダ
・アンタークティカのリパーゼＡの良好な生産を示し、
同じ条件下で培養した対応するＡ．オリゼ一次形質転換
体よりも約３〜４倍優れている、ｇ／ｌ範囲の振盪フラ
スコ収率を与える。

【００５６】

【表２】

【００５７】与えられたデータからわかるように、Ａ．
ジャポニカス型種の多数の株が様々な異種タンパク質を
相当量生産することができ、従って標準的なＡ．ニガー
およびＡ．オリゼ宿主系の代替物として有用であると確
立され、またそれらの既知宿主の使用よりも好ましい場
合がある。

【００５８】生物学的材料の寄託下記の生物学的材料をＮＲＲＬ（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅＣｕｌｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；１８１５Ｎｏｒｔｈ
ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，
Ｉｌｌｉｎｏｉｓ６１６０４）に寄託した。

【００５９】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:66） (72)発明者ヨダー，ウェンディアメリカ合衆国，カリフォルニア 95694, ウィンターズ，プレザントバレー 8503 (72)発明者タカギ，シノブアメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, ディビス，＃128，コウェルブールバード 1880 (72)発明者ブーミナザン，カラッパンチェッティアーアメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, ディビス，ハンボルトアベニュ 2233

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プロモーターに作用可能に連結された異
種タンパク質をコードする核酸配列を含んで成る、アス
ペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）型宿主細胞。
【請求項２】前記タンパク質が真菌タンパク質であ
る、請求項１の宿主細胞。
【請求項３】前記プロモーターが真菌プロモーターで
ある、請求項２の宿主細胞。
【請求項４】前記タンパク質が真菌酵素である、請求
項２の宿主細胞。
【請求項５】前記酵素が、カタラーゼ、ラッカーゼ、
フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダ
クターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダー
ゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナー
ゼ、プロデアーゼおよび他のタンパク質分解酵素、アミ
ノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィター
ゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン分解酵
素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β
−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、イ
ンベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアー
ゼ、キチナーゼ、並びにデオキシリボヌクレアーゼから
成る群より選択される、請求項４の宿主細胞。
【請求項６】選択マーカーを更に含んで成る、請求項
１の宿主細胞。
【請求項７】前記マーカーがａｒｇＢ，ｔｒｐＣ，ｐ
ｙｒＧ，ａｍｄＳおよびｈｙｇＢから成る群より選択さ
れる、請求項６の宿主細胞。
【請求項８】前記プロモーターが、Ａ．オリゼ（Ａ．
ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムーコル・
ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）のア
スパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇ
ｅｒ）のグルコアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅ
ｒ）の中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの（Ａ．ｎｉｇ
ｅｒ）酸安定性α−アミラーゼおよびリゾムーコル・ミ
ーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）のリパ
ーゼからのプロモーターから成る群より選択される、請
求項２の宿主細胞。
【請求項９】Ａ．ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃ
ｕｓ）、Ａ．アクレータス（Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）
またはＡ．ジャポニカス変種アクレータス（Ａ．ｊａｐ
ｏｎｉｃｕｓｖａｒ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）種のメン
バーである、請求項１の宿主細胞。
【請求項１０】真菌プロモーターに作用可能に連結さ
れた異種真菌酵素をコードする核酸配列および選択マー
カーを含んで成る、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）型宿主細
胞。
【請求項１１】リパーゼ、キシラナーゼおよびセルラ
ーゼから成る群より選択された真菌酵素を含んで成る、
請求項１０の宿主細胞。
【請求項１２】前記プロモーターが、Ａ．オリゼ
（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムー
コル・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅ
ｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー
（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ、Ａ．ニガー
（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー
の（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼおよびリ
ゾムーコル・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅ
ｈｅｉ）のリパーゼからのプロモーターから成る群より
選択される、請求項１０の宿主細胞。
【請求項１３】前記選択マーカーが、ａｒｇＢ，ｔｒ
ｐＣ，ｐｙｒＧ，ａｍｄＳおよびｈｙｇＢから成る群よ
り選択される、請求項１２の宿主細胞。
【請求項１４】前記宿主細胞がＡ．ジャポニカス
（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ａ．アクレータス（Ａ．
ａｃｕｌｅａｔｕｓ）またはＡ．ジャポニカス変種アク
レータス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓｖａｒ．ａｃｕｌ
ｅａｔｕｓ）種のメンバーである、請求項１０の宿主細
胞。
【請求項１５】ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターに
作用可能に連結された真菌キシラナーゼーをコードする
核酸配列を含んで成り、そしてａｍｄＳまたはｈｙｇＢ
マーカーを更に含んで成る、Ａ．ジャポニカス宿主細胞
である、請求項１０の宿主細胞。
【請求項１６】ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターま
たはＡＭＧプロモーターに作用可能に連結された真菌リ
パーゼをコードする核酸配列を含んで成り、そしてａｍ
ｄＳマーカーを更に含んで成る、Ａ．ジャポニカス変種
アクレータス宿主細胞である、請求項１０の宿主細胞。
【請求項１７】ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターに
作用可能に連結された真菌リパーゼをコードする核酸配
列を含んで成り、そしてａｍｄＳマーカーを更に含んで
成る、Ａ．アクレータス宿主細胞である、請求項１０の
宿主細胞。
【請求項１８】着目のタンパク質の生産方法であっ
て、プロモーターに作用可能に連結された異種タンパク
質をコードする核酸配列を含んで成るアスペルギルス・
ジャポニカス型宿主細胞を、該タンパク質の発現を可能
にする条件下で培養し、そして培養物から該タンパク質
を回収することを含んで成る方法。
【請求項１９】前記タンパク質が真菌タンパク質であ
る、請求項１８の方法。
【請求項２０】前記プロモーターが真菌プロモーター
である、請求項１８の方法。
【請求項２１】前記タンパク質が真菌酵素である、請
求項２０の方法。
【請求項２２】前記酵素が、カタラーゼ、ラッカー
ゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシド
レダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチ
ナーゼ、プロテアーゼおよび他のタンパク質分解酵素、
アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィタ
ーゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン分解
酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、
β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、
インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアー
ゼ、キチナーゼ、並びにデオキシリボヌクレアーゼから
成る群より選択される、請求項２１の方法。
【請求項２３】選択マーカーを更に含んで成る、請求
項１８の方法。
【請求項２４】前記マーカーがａｒｇＢ，ｔｒｐＣ，
ｐｙｒＧ，ａｍｄＳおよびｈｙｇＢから成る群より選択
される、請求項２３の方法。
【請求項２５】前記プロモーターが、Ａ．オリゼのＴ
ＡＫＡアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイのアスパラ
ギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガーのグルコアミラー
ゼ、Ａ．ニガーの中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸
安定性α−アミラーゼおよびリゾムーコル・ミーヘイの
リパーゼからのプロモーターから成る群より選択され
る、請求項１８の方法。
【請求項２６】前記宿主細胞がＡ．ジャポニカス、
Ａ．アクレータスまたはＡ．ジャポニカス変種アクレー
タス種のメンバーである、請求項１８の方法。
【請求項２７】プロモーターに作用可能に連結された
異種タンパク質をコードする組換え核酸配列を含んで成
る、アスペルギルス・ジャポニカス型宿主細胞。
【請求項２８】着目のタンパク質の生産方法であっ
て、プロモーターに作用可能に連結された異種タンパク
質をコードする組換え核酸配列を含んで成るアスペルギ
ルス・ジャポニカス型宿主細胞を、該タンパク質の発現
を可能にする条件下で培養し、そして培養物から該タン
パク質を回収することを含んで成る方法。