JPH09500543A

JPH09500543A - アスペルギルス発現システム

Info

Publication number: JPH09500543A
Application number: JP7515688A
Authority: JP
Inventors: エム．バーカ，ランディ; ヨダー，ウェンディ; タカギ，シノブ; チェッティアーブーミナザン，カラッパン
Original assignee: ノボノルディスクバイオテック，インコーポレイティド
Priority date: 1993-12-01
Filing date: 1994-11-29
Publication date: 1997-01-21
Anticipated expiration: 2015-12-18
Also published as: US5667990A; WO1995015391A2; WO1995015391A3; AU1101995A; EP0730655A1; AU695766B2; CA2178007A1; FI962288A; FI962288A0; JP2001025393A; JP3117997B2; CN1139457A

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ａ．ジャポニカス（A．japonicus）型種を異種タンパク質の発現のための宿主細胞として使用する新規発現系に関する。

Description

【発明の詳細な説明】アスペルギルス発現システム発明の分野本発明は、組換えタンパク質の生産に有用な宿主細胞に関する。特に、本発明は、組換えタンパク質、特に酵素の高レベル発現に利用できるアスペルギルス属の真菌宿主細胞に関する。発明の背景異種タンパク質の発現に組換え宿主細胞を使うことは、近年、他の方法ではそれらの天然源からの精製によってのみ得られる商業的に有益なタンパク質の大量生産を大きく単純化した。現在、特定の任意のタンパク質の生産のためには原核および真核宿主を含む様々な発現系の選択肢がある。適当な発現系の選択は、しばしば活性状態で妥当な収率でタンパク質を生産できる宿主細胞の能力に依存するだけでなく、タンパク質の意図する最終用途によっても大きく左右されるだろう。哺乳動物細胞と酵母細胞が最も汎用されている真核宿主であるが、糸状菌が組換えタンパク質生産用の宿主細胞として非常に有用であると現在認識され始めている。現在使われているかまたはそのような用途に提案されている糸状菌の中には、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）、トリポクラジウム・ゲオデス（Tolypocl adium geodes ）、ムーコル・サーシネロイデス（Mucor circinelloides）およびトリコデルマ・レーセイ（Trichoderma reesei）がある。加えて、アスペルギルス属の幾つかの種は組換えタンパク質生産のための宿主細胞として有効に使われている。アスペルギルスは、分生子柄から成る灌水器状物が頂嚢で終わり、この頂嚢が小柄またはフィアリド（小梗）と色々な名前で呼ばれる一層もしくは二層の同時形成された特殊細胞を生み、そして分生子と呼ばれる無性胞子を形成することにより特徴づけられる。アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）種は組換えプラスミドにより形質転換されると報告されている（Ballance他、Biochem．Biophys．Re s．Comm．112: 284-289，1983）が、形質転換はかなり低い頻度で起こることがわかった。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）とアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）両種も組換えタンパク質生産において有用であると記載されている。しかしながら、他のアスペルギルス種は異種タンパク質の発現に有用であると示されておらず、実際に、貧弱な発現および／またはプロテアーゼもしくはマイコトキシンの過剰生産のために、アスペルギルスの全ての種がこの目的に宿主細胞として適するわけではないし、或る種から判断して次の種へとこの能力を予測することもできない。理想的な発現系は、プロテアーゼおよびマイコトキシン並びに多量の内因性的に作られる分泌タンパク質の生産が実質的になく、且つ既知の宿主細胞よりも高いレベルの発現が可能であるものである。本発明は、それらの要件を満たす新規アスペルギルス発現系を提供する。発明の要約本発明は、異種タンパク質をコードする核酸配列を含有する、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）型種、例えばアスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus Japonicus）、アスペルギルス・アクレータス（Asperg illus aculeatus ）またはアスペルギルス・ジャポニカス変種アクレータス（Aspergillus japonicus var ．aculeatus ）種の宿主細胞を提供する。「異種タンパク質」とは、宿主細胞にとって生来でないタンパク質、または生来の配列を変更する修正が行われている生来のタンパク質を意味する。好ましい態様では、該タンパク質は異種酵素である。該核酸配列は、選択された宿主細胞中で該核酸配列の転写を指令することのできる適当なプロモーター配列に作用可能に連結される。本発明はまた、組換えタンパク質の生産方法であって、異種タンパク質をコードする核酸配列を含有する上述した種のうちの１つの宿主細胞を、該タンパク質の発現を促す条件下で培養し、そして培養物から該タンパク質を回収することを含んで成る方法にも関する。好ましい態様では、該タンパク質は真菌タンパク質であり、最も好ましくは真菌酵素である。本発明の宿主細胞および方法は、意外にも、他の既知のアスペルギルス種、例えばＡ．オリゼよりも、幾つかの真菌酵素の組換え生産においてより優れている。発明の詳細な説明アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ジャポニカス変種アクレータス（Aspergillus japonicus var．aculeatus）またはアスペルギルス・アクレータス（Aspergillus aculeatus）種は全て、アスペルギルス属の黒色（Nigri）部門に属する。アスペルギルス・ニガー（Aspergi llus niger ）により代表されるような黒色部門のメンバーは、放射状分生子頭と黒色気味の分生子集団；球状頂嚢；滑らかで透明な、または頂嚢の下が着色している菌柄；存在するかまたは欠けており、しばしば着色しているメツラ（基底梗子）により特徴づけられる（“The Genus Aspergillus”，K.B．RaperおよびD.I．Fennel 著，The William s & WiKins Company，Baltimore，1965）。胞子色と装飾物、または他の微視形態的特徴が異なるそれらの株の変異体もこの部門に含められる。アスペルギルス属の黒色部門では、主な分類法が第一に基礎にしている（即ち、Raper およびFe nnel，前掲）コロニーの色と分生子形成構造が多様であるため、分類群の境界は論争中である。Raper およびFennelにより認められたＡ．ジャポニカス関連分類群はＡ．ジャポニカスとＡ．アクレータスである。SamsonおよびGams（“Advanc es In Penicillium and Aspergillus Systematics”，SamsonおよびPitt編，198 5）はＡ．ジャポニカスのみを認め、そしてAl-Mussallam（“Revision of the B lack Asperg-illus Species”，Ph.D．Thesis，University of Utrecht，1980）はＡ．ジャポニカス変種ジャポニカスとＡ．ジャポニカス変種アクレータスを認めている。Ａ．ジャポニカス種は一般に、一列の小柄および球状〜半球状の顕著な棘状の分生子により特徴づけられる。頂嚢は普通20〜35μであるが15〜45μにも及ぶ。この種はSaito，Botan．Mag．20:61-63，1906により最初に記載された。より詳しくは、この種は次のように特徴づけられる。Czapek溶液寒天上のコロニーは室温（24〜26℃）で迅速に増殖し、ほとんどの株は10日間で5.0 〜6.0 cm、株によってはより小さいことがあり、密集した、白色の、不規則にしわの寄った基底菌糸から成り、該菌糸はゆっくりと茶紫または黒紫色を帯びた分生子構造の密集鎖になり、株によってはコロニーの中央領域に豊富な白〜クリーム色の球状菌核を生成し；裏側は最初は無色で後に紫茶色になり、時には僅かに黄緑色を帯び；滲出物が無く；臭いは時折非常に強いが特有ではない。分生子頭は多様で、小さく、放射状であるかまたは幾つかの不明瞭な柱状部に割れ、まれに10日で直径300 μを越えるが、老齢期には時々明瞭な円柱状で且つ長さが600 〜700 μまでであり、または同様な長さの２つの分岐した柱状部に割れ；分生子柄は滑らかかまたは限られた表面粒点を有し、無色であるかまたは特に頂嚢のすぐ下がわずかに着色しており、波状で、大部分が500 〜1000μ×５〜10μであるが、それらの寸法は大きく異なり；頂嚢はいくらか黄褐色気味に着色しており、しばしば幾分伸びた形であるが、加齢または成長と共に頭部はほとんど球状になり、大部分は20〜30μ×25〜35μで、直径は15μ未満から45μまで異なり、正常な頭部ではそれらの表面の大部分が稔性であるが小さな頭部では頂点のみが稔性であり；梗子は一列で、5.5 〜 8.0μ×3.0 〜4.5μ、まれにそれらの正常サイズの二倍に膨張し；分生子は大部分が球状、時に半球状で、多棘状であり、棘は分離し規則的な間隔を有し、通常長さ0.5 μで時にはそれより長く、胞子体は大部分が 3.0 〜3.5 μであり；菌核は豊富に、ある株ではゆっくりと、白〜クリーム色で球状の直径500 μまで生成する。肉エキス寒天上のコロニーは、迅速に室温で10 日日で直径７〜８cmに成長し、Czapek上よりも迅速に且つ多量に胞子形成し；分生子頭はCzapek上よりも通常大きく且つ顕著な円柱状塊に割れ、通常10日間で50 0 μの直径に達し、頂嚢および軸測定値がより狭い範囲を示し；梗子および分生子は上述した通りである。Ａ．ジャポニカス変種アクレータス亜種は次の特徴により区別される。Czapek寒天上のコロニーは14日間で直径5.5 cmになり、かなり密集した、不規則的にしわの寄った、白色の基底フェルト状物から成り；ある株は羊毛状気菌糸を生成し；裏側は最初は無色で加齢と共に茶色になり；分生子頭は塊状で、Quaker Drab およびDusky Drabに近い紫がかった茶色で、球状〜放射状で、明瞭に分離した柱状部に割れており、直径200 〜300 μであり；柄のある分生子柄は滑らかで、透明かまたは軸のところがわずかに着色しており、直立で、長さ350 〜4500μ、通常は1000〜 2000μ、幅9.0 〜13.5μであり；頂嚢は褐色で、直径30〜90μ、通常45〜67μであり、大きな頂嚢では全面に密集したフィアリドを有しそして小さな頂嚢では上側の3/4 にフィアリドを有し；フィアリドは7.5 〜10μ×4 〜5 μであり；分生子は透明〜褐色で、多棘状で、半球状であるが大部分は楕円体で、4 〜5μ×3.5 〜4.5 μであり；ある株では密集帯に、球状〜半球状、直径450 〜675 μ、しかし800 μまでの菌核が豊富に生じる。密接に関連した種であるＡ．アクレータスは、一列の梗子、および半球状から明瞭な楕円形の多棘状の分生子により一般的に特徴づけられる。頂嚢は通常60〜 80μで、35〜100 μに及ぶ。より詳しくは、この種は次のように定義される。Cz apek溶液寒天上のコロニーは室温（24〜26℃）で迅速に増殖し、12日間で直径５〜６cmであり、平坦であり、分生子構造の密集鎖を生じ、紫茶または紫黒色味を帯びて全体に渡り激しく胞子形成し、しばしば淡い灰色−黄褐色表面の「花」を有し；裏側は無色であるかまたはかなり棘状でコロニー中心が黄色から黒に近い色を帯び、黄色色素が広がっており；滲出物または臭いは無く；株によっては白色〜クリーム色の梗子がコロニー中心および隣接した縁のところに最も豊富に生じる。分生子頭は、最初は球状で、次いで比較的数の少ない分離した密集型柱状部に割れ、直径は１mmまでに達するが通常は500 〜700 μであり、脱落性の柱状部によって容易に粉々になり、個々の頭部はしばしば色が多様であり、頂嚢に最も近い分生子は淡い黄褐色を帯びており；分生子柄は無色であるかまたは頂嚢の下がわずかに褐色であり、通常は１〜２mm×９〜13μであるが、長さは2.5 mmまでそして直径は18〜29μまでに及び、厚さ2.0 〜2.5 μまでの壁を有し、平滑であるかまたは時折粒状物質の限定付着を示すことがあり；頂嚢は、若い時は幾分伸びた形であるが、十分に発達した時には球状またはほとんど球状であり、厚い壁を有し、普通は褐色気味に着色しそして直径60〜80μであるが、35 〜100 μに及ぶことができ、全面に渡り稔性であり；梗子は一列で、密に詰まっており、6.5 〜10.0μ×3.0 〜4.4 μであり；分生子は明瞭な楕円形から球状またはほとんど球状で、株間でまたは株内で異なり、大部分は3.5 〜4.0 μ×4.5 〜5.0 μであるが、時には細胞が４×７μほどの大きい寸法を示すことがあり、数が増えると紫がかった色合いを示し、分離し且つより広く間隔のあいた棘を有する多棘状である。この種はIizuka，J．Agr．Chem．Soc．Japan 27: 806，195 3中に最初に記載された。本明細書および請求の範囲を通して、用語「Ａ．ジャポニカス型種」の使用が、上述した３つの種に含まれる生物だけでなく、既に記載されているかまたは別の分類法において現在他の種と指定されているが、上記に定義したものと同じ形態的および培養的特徴を有し、Ａ．ジャポニカス、Ａ．ジャポニカス変種アクレータスまたはＡ．アクレータスの別名であるかもしれないそれらの種も包含することは理解されよう。例えば、Ａ．ジャポニカス／Ａ．ジャポニカス変種アクレータスの別名としては、次のものが挙げられる（しかしそれらに限定されない）：Ａ．ジャポニカス・サイトウ・変種カピラタス．ナカザワ，タケダおよびスエマツ（A．Japonicus Saito var.capillatus Nakazawa，Takeda and Suematsu）、Ａ．マルバセウス・モサリー（A．malvaceus Mosseray）、Ａ．アトロビオラセウス・モサリー（A．atro-violaceus Mosseray）、Ａ．アトロフスカス・モサリー（A．atrofuscus Mosseray）、Ａ．ビオラセオフスカス・ガスペリーニ（A ．violaceo-fuscus Gasperini）、Ａ．ブルネオビオラセウス・バトおよびマイア（A．brunneo-violaceus Bat．and Maia）（Al-Mussallam，前掲）；およびＡ．ジャポニカス変種アトロフスカス・イイズカ（A．japonicus var．atrofuscus Iizuka）（J．Agr ．Chem．Soc．Japan 27: 807，1953）。Ａ．アクレータス／Ａ．ジャポニカス変種アクレータスの別名としては、Ａ．エゾエンシス・ササキ（A．yezoensis Sa saki）（Al-Mussallam，前掲）、Ａ．ジャポニカ変種ビリジフラブス・イイズカ（A．japonicus var．viridiflavus Iizuka）（J．Agr．Chem．Soc．Japan 27:8 07，1953）およびＡ．ビオラセオフスカス・ガスペリーニ（A．violaceo-fuscus Gasperini）（Att．Soc．Toscana Sci．Nat．Pisa，8(2):326-328，1887）が挙げられる（がそれらに限定されない）。宿主細胞候補の最初の決定は、アスペルギルス属の異なる分類部門に属する15 以上の種からの様々な単離物により生産されるプロテアーゼのレベルの評価によって行う。これは、各単離物を酸性、中性およびアルカリ性ｐＨでのカゼイン透明化平板アッセイにおいて試験することにより達成される。驚くべきことに、黒色（Nigri）部門の幾つかのメンバーが、生産される任意の組換えタンパク質の分解を潜在的に引き起こし得るプロテアーゼを最少量生産したという点で、最も良く働くことがわかった。この基準に基づいて、更なる研究のために次の６種を選択する：Ａ．ジャポニカス（A．japo-nicus）、Ａ．ジャポニカス変種アクレータス（A．japonicus var.aculeatus）、Ａ．アクレータス（A．aculeatus）、Ａ．タマリィ（A．tamarii）、Ａ．カルボナリウス（A．carbonarius）およびＡ．フェニシス（A．phoenicis）。次いで、選択された種を形質転換することを試みる。最初の努力は標準的なＡ．オリゼ（A．orizae）形質転換技術の使用に集中する（Christensen他，Bio/Te chnology 6: 1419-1422，1988；EP出願第87 103 806.3号）。簡単に言えば、プロトプラスト形成、形質転換、およびamdSまたはヒグロマイシンＢ（hygB）マーカー遺伝子についての選択に向けて、Ａ．オリゼのプロトコールを使って同時形質転換体を得る。発現ベクターは、異種コード配列に加えて、Ａ．オリゼのTAKA−アミラーゼ遺伝子と、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子からの転写終結シグナルを含有する。形質転換頻度は、ＤＮＡ１μｇあたり１未満から約10まで異なる。下記の実施例に詳述されるような発現ベクターを使った同時形質転換実験では、同時形質転換の頻度は０〜60％の範囲である。次いで形質転換された種を観察して様々な異種酵素の発現レベルを測定する。試験した異種酵素としては、フミコーラ・ラヌギノーザ（Humicola lanuginosa ）リパーゼ（ＨＬＬ）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）キシラナーゼ（キシラナーゼ）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ（セルラーゼ）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）ペルオキシダーゼ（ＣｉＰ）およびカンジダ・アンタークティカ（Candida antarc tica ）リパーゼＡが挙げられる。驚くべきことに、Ａ．ジャポニカス様群の３つの種は上記酵素の１または複数について良好な発現を示し、ある場合には、対照のＡ．オリゼ株よりも良い酵素収率を示した。特にＡ．アクレータス、Ａ．ジャポニカスおよびＡ．ジャポニカス変種アクレータスの各々の多数の株が振盪フラスコ培養において非常に高いレベルのＨＬＬ（約１ｇ／ｌ）を生産する。加えて、Ａ．ジャポニカスは、Ａ．オリゼ株およびＡ．ニガー株中でのこの酵素の生産と比較して優れたキシラナーゼ生産を示す。更に、振盪フラスコ中のＡ．アクレータスは約1.0ｇ／ｌの範囲でカンジダ・アンタークティカのリパーゼＡを生産し、このレベルは、同じ条件下で培養した対応するＡ．オリゼ形質転換体よりも約３〜４倍高い。それらの試験結果の要約は表２に与えられる。結果が明らかに示すように、各種の数個の単離物が異種タンパク質を生産することができる。よって、この能力は単一の単離物または株に限定されるのではなく、むしろ全体としてこの種の集団の特徴であると理解される。当業者は、それらの種の他の株または単離物も異種酵素の発現に利用できると認識するだろう。各種の多数の株がATCC（the American Type Culture Collection； 12301 Park-lawn Drive，Rockville Maryland 20852）；NRRL（Agricultural Re search Service Culture Collection；1815 North University Street，Peoria ，Illinois 61604）；FGSC（Fungal Genetics Stock Center；Kansas）；DSM（D eutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen；Mascheroder Weg 1 B，D-3300 Braunschweig，Germany）；IAM（Institute of Applied Microbiolog y；113東京都文京区弥生町１丁目１−１、東京大学）；IFO（Institute for Fer mentation；532 大阪府淀川区十三本町２丁目17−85）およびCBS（Centraal Bur eau voor Schimmelcultures；Oosterstraat 1,3740 AG Baarn，Netherlands）の寄託機関において公に入手可能である。当業者は、本明細書中に記載の宿主種の好結果の形質転換が、特に例示されたベクター、プロモーターおよび選択マーカーの使用に限定されないことも認識するだろう。一般的に言って、Ａ．オリゼ、Ａ．ニガーおよびＡ．ニデュランスの形質転換において有用であるそれらの技術は、本発明の宿主細胞にも有用である。例えば、amdSおよびhygB選択マーカーが好ましいけれども、他の有用な選択マーカーとしてargB（Ａ．ニデュランスまたはＡ．ニガー）、trpC（Ａ．ニガーまたはＡ．ニデュランス）、またはpyrG（Ａ．ニガーまたはＡ．ニデュランス）マーカーが挙げられる。プロモーターは、それらの種において強力な転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であることができ、そして細胞外と細胞内の両方のタンパク質、例えばアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼおよび解糖酵素をコードする遺伝子から誘導することができる。そのような適当なプロモーターは、Ａ．オリゼのTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehe i ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ、Ａ．ニガーの中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸安定性α−アミラーゼ、およびリゾムーコル・ミーヘイのリパーゼをコードする遺伝子から誘導することができる。解糖酵素の遺伝子からのプロモーターの例は、ＴＰＩ，ＡＤＨおよびＰＧＫである。プロモーターは同種プロモーター、即ち生来のＡ．ジャポニカス型遺伝子のプロモーターであってもよい。本発明の好ましいプロモーターは、Ａ．オリゼの TAKAアミラーゼプロモーターである。TAKAアミラーゼは公知のα−アミラーゼである（Toda他，Proc．Japan Acad．58 Ser.B.：208-212，1982）。プロモーター配列と着目の遺伝子または選択されたシグナルペプチドまたはプレ領域との連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的で、プロモーター配列にリンカーを提供してもよい。ターミネーターとポリアデニル化配列もプロモーターと同じ源から誘導することができる。構成物中にエンハンサー配列を挿入することもできる。発現産物を獲得するのに細胞を破壊する必要性を回避するために、および細胞内で起こりうる発現産物の分解の量を最小にするために、該産物が細胞の外に分泌されることが好ましい。このために、好ましい態様では、着目の遺伝子は、発現産物を細胞の分泌経路に差し向けることができるプレ領域、例えばシグナルペプチドまたはリーダーペプチドに連結される。プレ領域は任意の生物からの任意の分泌タンパク質の遺伝子から誘導してもよく、または生来のプレ領域であってもよい。そのようなプレ領域のための有用な入手源の中には、アスペルギルス種からのグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、バシラス（Bacillus）種からのアミラーゼ遺伝子、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）からのリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）からのα−因子遺伝子、または子牛のプロキモシン遺伝子がある。最も好ましくは、プレ領域はＡ．オリゼのTAKAアミラーゼ遺伝子、Ａ．ニガーの中性α−アミラーゼ遺伝子、Ａ．ニガーの酸安定性α−アミラーゼ遺伝子、Ｂ．リヘニフォルミス（B．Iicheniform is ）のα−アミラーゼ遺伝子、バシラスNCIB 11837からのマルトース産生アミラーゼ遺伝子、Ｂ．ステアロサーモフィラス（B．stearothermophilus）のα−アミラーゼ遺伝子、またはＢ．リヘニフォルミス（B．Iicheniformis）のズブチリシン遺伝子である。有効なシグナル配列はＡ．オリゼのTAKAアミラーゼシグナル、リゾムーコル・ミーヘイのアスパラギン酸プロテアーゼシグナル、およびリゾムーコル・ミーヘイのリパーゼシグナルである。代わりのものとして、発現させようとする遺伝子にとって生来であるプレ領域を使ってもよい。プロモーターおよびターミネーター配列に作用可能に連結された所望の生成物の遺伝子は、選択マーカーを含むベクター中に含めることができ、または宿主株のゲノム中に組み込むことができる別個のベクターもしくはプラスミド上に置くことができる。ベクター系は単一のベクターもしくはプラスミドであることができ、またはゲノム中に組み込もうとする全ＤＮＡを一緒になって含有する２以上のベクターもしくはプラスミドであることができる。ベクターまたはプラスミドは直鎖状分子であっても閉環状分子であってもよい。本発明の好ましい態様によれば、１つが選択マーカーを含み、そしてもう１つがプロモーター、所望のタンパク質をコードする遺伝子並びに転写ターミネーターおよびポリアデニル化配列を含む導入しようとする残りの異種ＤＮＡを含んで成る、２つのベクターを使って宿主を形質転換させる。本発明の宿主細胞種は、任意の原核または真核生物の着目の異種タンパク質を発現させるのに用いることができ、好ましくは、真核生物のタンパク質を発現させるのに使われる。共に食品産業における使用が認可されているという点で、Ａ．ジャポニカス種とＡ．アクレータス種が特に有用である（Regulatory Aspects of Microbial Food Enzymes，Third Edition，The Association of Microbial Food Enzyme Producers，Brussels，Belgium）。それらの種について特に着目されるのは、異種タンパク質、特に真菌酵素の発現におけるそれらの利用である。カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼおよび他のタンパク質分解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α− ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼ、並びにデオキシリボヌクレエアーゼのような酵素を発現させるのに本発明の新規発現系を使うことができる。用語「真菌酵素」は生来の真菌酵素だけでなく、アミノ酸の置換、削除、付加、または活性、熱安定性、ｐＨ耐容性等を増強するために行うことができる他の修正により変更されているそれらの真菌酵素も包含することは、当業者により理解されるだろう。本発明の宿主細胞は、宿主細胞にとって生来であるタンパク質の組換え生産にも用いることができる。そのような用法の非限定的例としては、タンパク質の発現を増強するため、シグナル配列の使用によって着目の生来のタンパク質の細胞外への輸送を促進するため、または主題の宿主細胞により通常生産されるタンパク質のコピー数を増加させるために、異なるプロモーターの調節下にＡ．ジャポニカス型の生来のタンパク質を置くことが挙げられる。よって、本発明は、そのような発現が宿主細胞にとって生来でない遺伝要素の使用、または宿主細胞中に通常は見られない様式で働くように操作されている生来の要素の使用を含む限り、そのような同種タンパク質の組換え生産も包含する。本発明を次の非限定例により更に説明する。Ｉ．プロテアーゼアッセイ少なくとも15の異なる種からの50以上の株を試験し、各単離物により生産されるプロテアーゼの量を測定し、そしてそれらの細胞外タンパク質分布も観察する。培養接種試料を調製するために、９cmのペトリ皿中の各株の７〜10日培養物に 10mlの滅菌蒸留水を加え、菌糸から静かに胞子をかき取り、濃厚な懸濁液を作る。この懸濁液2.57 mlを使って100 mlのASPO4 培地に接種する〔ASPO4 培地は、水道水中に1 g/l のCaCl₂、2 g/l の酵母エキス、1 g/l のMgSO₄、5 g/l のKH₂P O₄、2 g/l のクエン酸、0.57 mlの微量金属溶液（14.3g/l のZnSO₄・7H₂O，CuSO₄ ・5H₂O，0.5g/l のNiCl₂・6H₂O，13.8g/l のFeSO₄・7H₂O，8.5g/l のMnSO₄・H₂ Oおよび3 g/l のクエン酸から成る）、1 g/l の尿素、2 g/l の(NH₄)₂SO₄、20 g /lのマルトデキストリン（８mlの25％原液、加圧滅菌後に加える）を含んで成り、加圧滅菌前にｐＨを4.5 または6.5 に調整し、次いで加圧滅菌後に100 mlあたり８mlの0.1 Ｍクエン酸を使ってpH 4.5に調整した〕。フラスコを、200 rpm で軌道振盪器上で振盪させながら、連続した光の中で30および／または37℃で５日間インキュベートする。各々の培養ブロスからの上清を2500 rpmで５分間遠心し、そしてカゼイン透明化平板アッセイで使用し、様々な真菌種から生産されるプロテアーゼのレベルを測定して組換えタンパク質発現の有力な候補として評価する。カゼイン透明化平板アッセイは次のようにして行われる。平板培地は、20 g/l の脱脂粉乳、20 g/lのアガロース、およびpH 5とpH 7で行われる試験には0.2 M のクエン酸塩−リン酸塩緩衝液、pH 9で行われる試験にはグリシン−NaOH緩衝液から成る。脱脂粉乳を100 mlの緩衝液と混合し、60℃に維持する。アガロースを 400 mlの緩衝液と混合し、そして５分間加圧滅菌する。わずかに冷却した後、温かい脱脂粉乳混合物を添加し、混合物を穏やかに２〜３回反転させて混合する。平板あたり50〜70mlを使ってこの培地を150 mmの平板に注ぎ、使用まで５℃で貯蔵する。使用直前に、寒天の中に平板あたり12個の穴を作る。各株の醗酵物からの上清 25μｌを各pHの平板１枚に加え、37℃で一晩インキュベートする。pH 9の平板には、0.5 Ｍ氷酢酸を加えてカゼインを沈澱させ、どんな透明帯でも可視化する。次いで各平板を透明帯のサイズ（即ち、透明帯なしから直径＞２cmまで）と透明帯の型（即ち、透明、不透明または両方の型）について評価する。各培養物の上清を使って、株の細胞外タンパク質生産も評価する。製造業者の取扱説明書に従って調製したNovex（San Diego，CA）8 〜16％勾配ゲルを使ってタンパク質分布を評価する。培養上清の75μｌ（３日および５日）試料を、20μ ｌの５×解離緩衝液（解離緩衝液＝4 mlの1 M Tris-HCl，pH 6.8，1 g のSDS，6 17mgのジチオスレイトールを滅菌蒸留水で10mlにする）とグリセロール／ブロモフェノールブルー（約10mlの80〜90％グリセロールに10〜20mgを加え、沸騰した湯の中に１〜２時間置いて溶解させたもの）に添加し、５分間煮沸し、冷却し、負荷し、そしてブロモフェノールブルー追跡色素がゲルの下端に達するまで60〜200 Ｖで泳動する。Biorad Silver Stain Plusプロトコール（Biorad L aboratories，Hercules，CA）に従ってゲルを銀染色する。多数のバンドを示すそれらの単離物は有力な新規宿主としてあまり適当でないと見なし、一方でわずか１〜４本の少量バンドを有する比較的きれいな分布を示すものは更なる試験にかける。プロテアーゼアッセイとタンパク質分布の組合せ結果を吟味すると、適当な有力候補の大部分は黒色（Nigri）部門のメンバーの中に見つかる。それらの結果に基づいて、次の単離物を形質転換実験のために選択した：Ａ．ジャポニカス A 1438（CBS 568.65）、Ａ．アクレータス N1136（CBS 101.43）、Ａ．アクレータス A1454（CBS 172.66）、Ａ．アクレータス A1455（CBS 186.67）、Ａ．ジャポニカス変種アクレータス N0956（IAM 13871）、Ａ．フェニシスA528（CBS 139.4 8）、Ａ．フェニシス A530（CBS 137.52）、Ａ．フェニシス E419（CBS 137.52 ）、Ａ．カルボナリウス A3993（IBT 4977）、Ａ．カルボナリウス ATCC 1025、Ａ．タマリィ E112（ATCC 10836）、Ａ．タマリィ N2266（IFO 4358）およびＡ．タマリィ N2267（IFO 4142）。それらの培養物は、ノボ・ノルディスク・バイオテック・カルチャー・コレクション（Novo Nordisk Biotech Culture Collect ion；Davis，Callifornia）の一部としても維持される。 II．ベクターの作製Ａ．選択マーカーベクター。ベクターpJaL77とpJaL154をヒグロマイシンＢ耐性選択マーカーによる宿主細胞の形質転換に使用する。このマーカーはＥ．コリのヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子に基づいており、pJaL77中ではTAKAプロモーターの調節下にそしてpJaL154 中では amdSプロモーターの調節下に置かれる。簡単に言えば、それらのベクターは次のようにして作製される。ヒグロマイシンＢに対する耐性を付与する遺伝子を、Bo ehringer MannheimからプラスミドpHph-1として購入する。この遺伝子に、プライマー：5'-GCT CAG AAGCTT CCATCC TAC ACC TCA GCA ATG TCG CCT GAA CTC ACC GCG ACG TCT-3'（Ｎ−末端）と3'-CGT CCG AGG GCA AAG GAA TAG CTCCAG AGATC T CAT GCT-5'（Ｃ−末端）を使って、ＰＣＲによりアミノ末端とカルボキシ末端に適当な制限部位並びにＡＴＧコドンを取り付ける。ＰＣＲ断片を制限酵素BamH IとXhoIで切断し、次いでアスペルギルス発現ベクターpToC68（WP 91/17243中に記載されている）中の対応部位にクローニングしてpJaL77を作製する。プラスミドpJaL154 は次のようにして作製する。次のプライマー（下線領域は amdSプロモーターとの相同性を示す）CCT GGA TCC TCT GTG TTA GCT TAT AGおよびCTT GCA TGC CGC CAG GAC CGA GCA AGを使ったＰＣＲにより、プラスミドpCaH j406からamdSプロモーター変異体Ｉ₉＋Ｉ₆₆₆（Hynes他，Mol．Cell．Biol．3(8) : 1430-1439，1983およびKatz 他，Mol．Gen．Gent．220: 373-376，1990）をクローニングする。amdSプロモーターを含む694 bpのＰＣＲ断片をBamHI とSphIで切断し、pJaL77のTAKAプロモーターがamdSプロモーターで置換されるようにpJaL 77中の対応部位にクローニングする。 amdSマーカーを含むプラスミドpToC90は、p3SR2 （Hynes他，前掲）からの2.7 Rb XbaI 断片を、XbaIで切断しそして脱リン酸したpUC19 プラスミド中にクローニングすることにより作製する。pToC186と命名された誘導体は、プロモーター領域がamdS遺伝子の発現を増強することが知られている２つの変異体（Ｉ₉とＩ₆₆₆）を含むこと以外はpT oC90と同じである（Hynes 他，前掲；Corrick 他，Gene 53: 63-71，1987）。Ｂ．発現ベクター。 1. カンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）リパーゼ。カンジダ・アンタークティカのリパーゼＡの発現のために、Ｃ．アンタークティカ株LFO5 8(DSM 3855)の染色体ＤＮＡをYelton他の方法（PNAS USA 81: 1470-1474，1984 ）に従って抽出する。精製したＤＮＡをSau3A で部分的に切断しそしてアガロースゲル電気泳動した後、3-9 kbの範囲の断片を単離する。サイジングされたSau3 A 断片を、BamHI で切断し脱リン酸したプラスミドpBR322（New Eng-land Biola bs）中に連結せしめる。連結混合物を用いてＥ．コリMT172 を形質転換させる。約50,000のＥ．コリ形質転換体を得、その80％がLFO58 のＤＮＡ挿入断片を含有する。標準的なコロニーハイブリダイゼーション技術により、成熟Ｃ．アンタークティカリパーゼから決定したＮ末端配列に基づいた縮重17マーである³²Ｐ−リン酸化オリゴヌクレオチドプローブNOR 440を使って、それらのコロニーをスクリーニングする。34個のコロニーが低緊縮性での洗浄（41℃および６×ＳＳＣ）後に陽性を示す。それらのコロニーからプラスミドを調製し、そしてBstNI での制限後にサザンハイブリダイゼーションにより分析する。サザン用プローブは、コロニーハイブリダイゼーションで使ったNOR 440プローブかまたは³²Ｐ−標識プローブNOR 438である。NOR 438プローブは、13番目の塩基が酵母と糸状菌のコドン用法に基づいて選択されている、リパーゼのアミノ酸配列に相当するオリゴヌクレオチドである。推測位置が指示されている。唯一のプラスミドpMT1076 が、低緊縮性でNOR 440および幾分高い緊縮性（55 ℃および１×ＳＳＣ）でNOR 438の両方にハイブリダイズするバンドを含む。 pMT1076 の制限地図を作成し、Maxam-Gilbert 法により配列を決定する。その配列を配列表の配列番号１に示す。転写解読枠は21アミノ酸の推定上のシグナルと、成熟リパーゼのＮ末端の前にある10アミノ酸のプロペプチドもコードする。該プロペプチドの最後の２つのアミノ酸は、Ｓ．セレビシエ（S．cerevisiae）K EX-2 型の酵素によるタンパク質内分解プロセシングのための典型的な開裂部位であるArg-Arg である。アミノ酸配列は配列表の配列番号２に与えられる。多数の標準的なプラスミド操作（Maniatis他，Molecular Cloning．Cold Spring Har bor，NY，1982）を経て、Ｃ．アンタークティカのリパーゼＡの転写解読枠をＡ．オリゼのα−アミラーゼプロモーターとＡ．ニガーのグルコアミラーゼ転写ターミネーターの間に正しい方向で配置する。得られた発現プラスミドはpMT1229 である。 2. フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）キシラナーゼ。ベクターpHD414はプラスミドp775（EP 238 023）の誘導体である。このプラスミドとは異なり、pHD414はTAKAプロモーターとAMG ターミネーターの間に一連のユニークな制限部位を有する。該プラスミドは、ターミネーターの３′末端の長さ約200 bpの断片（望ましくないＲＥ部位を含む）の除去に続き、プロモーターの５′ 末端の長さ約250 bpの断片（同じく望ましくない部位を含む）の除去により作製される。NarI（pUCベクター中に存在する）とXbaI （ターミネーターのすぐ３′ 側）での消化により200 bp領域を除去し、次いで生成した末端をクレノウＤＮＡポリメラーゼ＋dNTPを使ってフィルインし、ベクター断片をゲル上で精製し、そしてベクター断片を再連結する。このプラスミドをpHD413と命名する。pHD413を StuI（プロモーターの５′末端に位置する）とPvuII（pUCベクター中）で切断し、ゲル上で分画しそして再連結し、pHD414を得る。pYES中に約1,100 bpのキシラナラーゼHindIII／XbaI cDNA 断片を含有するＥ．コリの株をDSM 6995としてDSM に寄託する。該キシラナーゼcDNA断片をHindIII／XbaIでの開裂によりクローンの１つから単離する。該断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出させ、連結反応に向けて準備する。該cDNA断片をpHD414中に連結してpAXX40-1-1 を作製する。キシラナーゼ遺伝子およびタンパク質の配列は配列表の配列番号３と４に与えられる。該遺伝子をDSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen un d ZellKulturen GmbH)6995として寄託する。 3. フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ。フミコーラ・インソレンスのセルラーゼの詳細な特徴づけはWO91/17243中に見つかる。セルラーゼ発現に使った発現ベクターpCaHJ418は、制限酵素BamHI とSaIIでの開裂によりpCaHj201から926 bpセルラーゼコード領域断片を切除することにより作製される。この断片を標準技術を使った調製用ゲル電気泳動により精製し、そして BamHI とXhoIで処理しておいたpHD414（上述）と連結せしめる。得られた発現ベクターpCaHj418は、Ａ．オリゼのTAKAアミラーゼプロモーターとＡ．ニガーのグルコアミラーゼターミネーター領域の転写調節下にセルラーゼ遺伝子を含有する。 4. フミコーラ・ラヌギノーザ（Humicola lanuginosa）リパーゼ。Ｈ．ラヌギノーザのリパーゼ遺伝子の単離および発現はEP 305216 中とUS出願第07/236,6 05号中に報告されており、その内容は参考として本明細書中に組み込まれる。簡単に言えば、ホモジナイズしたＨ．ラヌギノーザ菌糸からBoel他（EMBO J．3: 1 097-1102，1984）とChirgwin他（Biochemistry 18: 5294-5299，1979）により記載された方法を使って全ＲＮＡを抽出する。AvivおよびLeder（PNAS USA 69: 14 08-1412，1972）により記載されたようなオリゴ（ｄＴ）−セルロース上での２度のアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを得る。次いでOkayama およびBerg（Mol．Cell．Biol．2:161-170，1982）により記載された方法と、Noma他（Nature 319:640-646，1986）により記載されたベクターpS P62-K2とpCDVI-PLを使ってcDNAを合成する。合成したcDNAをＥ．コリMC1000のhs dR^-，M⁺誘導体（Casadaban およびCohen，J．Mol．Biol．138: 179-207，1980）中に形質転換せしめ、組換えクローンを作製する。 32個のペンタデカマー（15マー）オリゴデオキシリボヌクレオチドの混合物（その１つは、Phe-Asn-Gln-Phe-Asn をコードする領域がＨ．ラヌギノーザのリパーゼmRNAと相補的である）をApplied Biosystems，Inc.のＤＮＡ合成装置上で合成し、PAGEにより精製する。Ｈ．ラヌギノーザcDNAライブラリーからの約10,0 00のＥ．コリ組換え体をWhatman 540 フイルターに移す。Gergen他（Nucleic Ac ids Res．7:2115-2135，1979）により記載されたようにコロニーを溶解させ固定化する。Boel他（EMBO J．3: 1097-1102，1984）により記載された通りに該フィルターを³²Ｐ−標識Ｈ．ラヌギノーザリパーゼ特異的ペンタデカマー混合物とハイブリダイズさせる。フィルターのハイブリダイゼーションと洗浄をそれぞれ37℃と43℃で行い、次いで映像強化膜を使って24時間オートラジオグラフィーを行う。標準手順（BirnboimおよびDoly，Nucleic Acids Res．7:151 3-1523，1979）により２つのハイブリダイズしているコロニーpHLL 702.3 とpHL L 702.4 からMiniprepプラスミドＤＮＡを単離し、そしてMaxam およびGilbert （Methods Enzymol．65: 499-560，1980）の手順により該ＤＮＡ挿入断片のＤＮＡ配列を決定する。該cDNAを使った作製作業を更に容易にするために、次のようにしてユニーク制限部位を含むＤＮＡ配列を該cDNAの５′末端と３′末端に付加する。３′非翻訳領域中でcDNAを消化するSau961でpHLL 702.3を消化し、生じた末端をＥ．コリＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片）と４つのdNTPを使ってフィルインする。このＤＮＡを次いで該cDNAのメチオニン開始コドンのすぐ３′側を１回切断するSacI で消化する。得られた0.9kb cDNA 断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出し、そして連結反応に備える。５′アダプターとして２つのオリゴヌクレオチド927 と928 を合成する。このアダプターは、cDNAのMet 開始コドンのすぐ５′にHindIIIとBamHI 部位を付加するようにデザインされる。この２つのオリゴをＡＴＰとＴ₄ポリヌクレオチドキナーゼを使ってリン酸化し、互いにアニーリングし、そしてHindIIIとHincIIで消化し0.7 ％アガロースゲル上で精製したpUC19 ベクター中の精製0.9 kb cDNA 配列に連結せしめる。得られたプラスミドは、ポータブル0.9 kb BamHI断片としてＨ．ラヌギノーザのリパーゼcDNAを担持している。BamHI 消化とアガロースゲル上での0.9 kb cDNA 断片の精製の後、その断片をBamHI で消化されリン酸化されたp775と連結せしめ、p960を作製する。p960中では、リパーゼcDNAがＡ．オリゼからのTAKAプロモーターとＡ．ニガーからのAMG ターミネーターの転写調節下に置かれている。 pMHan37 を調製するために、フミコーラ・ラヌギノーザのリパーゼ遺伝子のすぐ上流のＡ．オリゼTAKAプロモーターの５′非翻訳領域の60塩基対を、Ａ．ニデュランスのtpiA遺伝子（McKnight他，Cell 46: 143-147，1986）からの対応領域により置換することにより、p960を変更する。非翻訳領域のすぐ外側にp960配列と相同である20塩基対により各端において隣接されたＡ．ニデュランスのtpiA遺伝子からの５′非翻訳領域を含む合成オリゴヌクレオチドを、TAKAプロモーター領域中にBssHII部位を含む別のプライマーと一緒にＰＣＲ反応に使用する。変異誘発プライマーはATG 開始コドンの近くにBamHI 部位を含むので、ＰＣＲ断片を BamHI とBssHIIで消化し、そしてBssHIIで消化しBamHI で部分消化したp960中に再クローニングする。MHan37中のATG コドンの上流の200 塩基をＤＮＡ配列分析により確認する。p960とpMHan37 との配列の相違を下記に示す： BamHI 部位を包含するプライマーの配列： 5. コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）ペルオキシダーゼ。コプリナス・シネレウスのペルオキシダーゼ遺伝子の単離および発現はWO 92/16634 中に記載されている。簡単に言えば、Boel他（EMBO J．3:1097-1102，1984）とC hirgwin他（BioChemistry 18: 5294-5299，1979）により記載された通りに最大ペルオキシダーゼ活性の時期に収集しホモジナイズしたコプリナス・シネレウス（IFO 8371）菌糸から全ＲＮＡを抽出する。AvivおよびLeder（PNAS USA 69: 1408-1412，1972）により記載されたようなオリゴ（ｄＴ）−セルロース上での２度のアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを得る。製造業者の取扱説明書に従ってInvitrogenからのcDNA合成キットを使ってcDNAを合成する。コプリナス・シネレウスcDNAライブラリーからの約50,000のＥ．コリ形質転換体をWhatman 540 濾紙に移す。Gergen他（Nucleic Acids Res．7:2115-2135，1979）により記載されたようにコロニーを溶解させ固定化する。該フィルターを0.2×ＳＳＣ，0.1 ％ＳＤＳ中で³²Ｐ−標識430 塩基対ペルオキシダーゼ特異的プローブとハイブリダイズさせる。フィルターのハイブリダイゼーションと洗浄を65℃で行い、次いで映像強化膜を使って24時間オートラジオグラフィーを行う。オートラジオグラフィー後、増加する温度でフィルターを洗浄し、次いで映像強化膜を使って24時間オートラジオグラフィーを行う。こうして、50以上の陽性クローンが同定される。ハイブリダイズしているコロニーから標準手順（BirnboimおよびDoly，Nucl ．Acids Res．7:1513-1523，1979）によりMiniprepプラスミドＤＮＡを単離し、そしてSangerのジデオキシ法（Sanger他，PNAS USA 74:5463-5467，1977）によりcDNA挿入断片のＤＮＡ配列を決定する。このペルオキシダーゼcDNA断片をHind III／XhoIでの開裂によりベクターから切り出し、アガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出し、そして連結反応に備える。該cDNA断片をHindIII／XhoI で消化されたHD414 中に連結せしめ、該cDNAがＡ．オリゼからのTAKAプロモーターとＡ．ニガーからのAMG ターミネーターの転写調節下に置かれているpCipを作製する。pCiPから、ペルオキシダーゼ開始コドンのすぐ上流のSacI，KpnI，HindIII，PstI，SaIIおよびBamHI 制限部位が削除されているプラスミドpJVi9 を調製する。コプリナス・シネレウスのペルオキシダーゼをコードするcDNA配列は配列表の配列番号５と６に示される。作製した発現ベクターの要約を表１に与える。 III．アスペルギルス宿主の形質転換例外を表記しない限り、試験した全ての株の形質転換において次の一般手順を使用する。 100 mlのMY50培地に形質転換しようとする株の胞子を接種し、34℃で振盪しながら１〜２日間インキュベートする。ミラクロス（Miracloth）を通した濾過により菌糸を収集し、200 mlの0.6M MgSO₄で洗浄する。菌糸を15mlの1.2M MgSO₄， 10 mM NaH₂PO₄，pH=5.8中に懸濁する。この懸濁液を氷上で冷却し、それに120 m gの mlＢＳＡ（Sigma H25 型）を加え、顕微鏡下で観察した時に試料中に多数のプロトプラストが見えるようになるまで穏やかに攪拌しながら37℃で1.5〜2.5時間インキュベーションを続ける。この懸濁液をミラクロスを通して濾過し、濾液を無菌試験管に移し、その上に５mlの0.6 M ソルビトール，100 mM Tris-HCl，pH ＝7.0 を重層する。2500 rpm で15分間遠心を行い、MgSO₄クッションの上部からプロトプラストを収集する。２容のＳＴＣ（1.2 M ソルビトール，10 mM Tris-HCl pH ＝7.5，10 mM CaCl₂）をプロトプラスト懸濁液に加え、混合物を1000×g で５分間遠心する。プロトプラスト・ペレットを37mlのＳＴＣ中に再懸濁し、再びペレット化する。これを繰り返した後、プロトプラストを0.2 〜１mlのＳＴＣに再懸濁する。 100μｌのプロトプラスト懸濁液を10μｌのＳＴＣ中の５〜25μgの適当なＤＮＡと混合する。着目の構造遺伝子を含む発現ベクター（表１参照）と選択マーカーを含むプラスミドを使って各株を同時形質転換せしめる。プラスミドpToC90と pToC186はＡ．ニデュランスamdS遺伝子を含み、形質転換および唯一の窒素源としてのアセトアミド上での増殖についての選択に使われる。プラスミドpJaL77と pJaL154 は形質転換およびヒグロマイシンＢ耐性の選択に使われる。混合物を室温で25分間維持する。0.2 mlの60％PEG 4000（BDH 29576），10mM CaCl₂および10mM Tris-HCl pH ＝7.5 を加え、注意深く２度混合し、最後に同じ溶液0.85mlを加え、注意深く混合する。この混合物を室温で25分間維持し、2500 ×g で15分間遠心し、ペレットを２mlの1.2 M ソルビトール中に再懸濁する。もう１回沈澱させた後、プロトプラストを適当な平板上に塗抹する。1.0 M ショ糖，pH＝7.0、窒素源としての10 mM アセトアミド（amdSが選択マーカーである時）およびバックグラウンド増殖を阻害するための 20 mM CsClを含有する最少培地（Cove，Biochem．Biophys．Acta 113: 51-56，1 966）上にプロトプラストを塗抹する。hygBが選択マーカーである時、培地は窒素源として10 mM 亜硝酸ナトリウムを使いそして150 μg/mlのヒグロマイシンＢが存在する点で異なる。最終遠心段階、再懸濁および塗抹に代わるものとして、８mlのＳＴＣを加えてプロトプラストと混合し、３枚の選択用平板の各々に３ml を加え、次いで渦巻状に動かして平板全体に広げる。37℃で４〜７日間インキュベートした後、分生子を有するコロニーを取り、滅菌蒸留水に懸濁し、そして単一コロニーの選択のために塗抹する。この手順を繰り返し、２回目の再単離後の単一コロニーの胞子を限定された形質転換体として保存する。 IV．組換えタンパク質発現の評価上記手順の後、選択された株の個々の単離物を表１に記載の発現ベクターのうちの１つと前の実施例で言及した選択マーカーを含むプラスミドのうちの１つを使って同時形質転換させる。次いで各々の同時形質転換体を適当なアッセイにより試験して着目の遺伝子の発現を調べる。Ａ．リパーゼリパーゼ活性の同時形質転換体を、１ｌの蒸留水中、50 g/lのマルトデキストリン，2 g/l のMgSO₄・7H₂O，2 g/l のKH₂PO₄，3 g/lのK₂SO₄，4 g/lのクエン酸，8 g/l の酵母エキス，3 g/l の(NH₄)₂SO₄，0.57mlの微量金属溶液，４mlの50 ％尿素溶液（別々に加圧滅菌したもの），pH 6.0から成るM400Da培地中で培養し、そして5 g/l の酵母エキスを水道水中に800ml作製する。加圧滅菌後、166mlの濾過滅菌済の1 M 尿素（10 g/lの最終濃度を与える）と35.3mlの濾過滅菌済の1M NaNO₃（0.3 ％の最終濃度を与える）を加える。基質としてｐ−ニトロフェニルブチレート(pNB)を使って培養濾液中のリパーゼ活性を測定する。pNB の原液は、104.6μｌのpNB を５mlのDMSOに加えることにより調製する。ミクロタイタープレートの各ウエルに90μｌの50 mM Tris，pH 7を加える。各ウエルに10μｌの試料を加え、ミクロタイタープレートを約１分間振盪することにより混合する。アッセイの直前に、20μｌのpNB 原液を970 μ ｌの50 mM Tris緩衝液，pH 7と混合する。市販のプレートリーダーを使ってリパーゼ活性についてアッセイする直前に、100 μｌのpNB −Tris混合物を各試料ウエルに加え、３分間に渡り405 nmで吸光度を測定する。アッセイは温度感受性であるので、各試料セットと共に内部標準を使用する。各試料について決定された傾きはリパーゼ活性と正比例する；アッセイの直線領域は約0.005 〜5 μg リパーゼ／mlである。この型のアッセイにおいて、Ｈ．ラヌギノーザのリパーゼの比活性は約4000 LU/mgであると決定され、一方でカンジダのリパーゼＡの比活性は約400 LU/ mgである。Ｂ．キシラナーゼ全てのキシラナーゼ形質転換体は次の組成（g/l で）を有する培地中で増殖させる：マルトデキストリン，50；MgSO₄・7H₂O，2.0；KH₂PO₄，10.0；K₂SO₄，2.0 ；クエン酸，2.0；酵母エキス，10.0；AMG 微量金属溶液，0.5 ml；尿素2.0；pH 6.0。全ての形質転換体は34℃で深部攪拌培養物として増殖させる。培養ブロス中のキシラナーゼ活性は、クエン酸塩−リン酸塩緩衝液，pH 6.5中に懸濁した 0.2％AZCL−キシラン（Megazyme Co.，Australia）を使って測定する。培養液を通常は100 倍希釈し、希釈した培養液10μｌを１mlの 0.2％AZCL− キシラン基質と混合する。この混合物を42℃で30分間インキュベートする。反応混合物を５分毎によく混合する。インキュベーションの終わりに、10,000 rpmでの５分間の遠心により未消化の基質を沈澱させる。基質から放出された青色色素を595 nmでの吸光度により定量し、そして既知の活性を有する酵素調製物を使って作った標準曲線から培養ブロス中の酵素活性の量を計算する。同一条件下で調製した酵素標準物と比較してエンドキシラナーゼ単位(EXU)を決定する。Ｃ．セルラーゼセルラーゼ形質転換体をMY50培地（50 g/lのマルトデキストリン，2 g/l のMg SO₄・7H₂O，10 g/lのKH₂PO₄，2 g/l のK₂SO₄，2 g/lのクエン酸，10 g/lの酵母エキス，0.5 mlの微量金属溶液，2.0 g の尿素）中で深部培養物として34℃で増殖させる。セルラーゼ活性は、0.1 M クエン酸塩−リン酸塩緩衝液，pH 6.5中に懸濁した 0.2％AZCL−HE−セルロース（Megazyme）を基質として使って測定する。培養液を0.1 M クエン酸塩緩衝液，pH 6.5中に希釈し、希釈した培養液10μｌを１mlの 0.2％AZCL−HE−セルロースと混合する。この混合物を振盪しながら42℃で30分間インキュベートする。反応混合物を５分毎によく混合する。インキュベーション後、10,000 rpmでの５分間の遠心により未消化の基質を沈澱させる。上清中の青色色素を595 nmで分光光度的に定量し、そして既知のセルラーゼ標準物を使って作った標準曲線から酵素活性の量を決定する。同一条件下で調製した酵素標準物と比較してエンドセルラーゼ単位(ECU)を決定する。Ｄ．ペルオキシダーゼ CiP の同時形質転換体は、１ｌの蒸留水中、50 g/lのマルトデキストリン，2 g/l のMgSO₄・7H₂O，2 g/l のKH₂PO₄，3 g/l のK₂SO₄，4 g/l のクエン酸，8 g/ l の酵母エキス，3 g/l の(NH₄)₂SO₄，0.5 mlの微量金属溶液，４mlの50％尿素溶液（別々に加圧滅菌したもの），pH 6.0から成るM400Da培地中で培養する。基質としてABTSを使ってまたは既知濃度の標準物に比較したロケット免疫電気泳動により、ペルオキシダーゼ発現をモニタリングする。免疫拡散法のために、ＴＭ緩衝液（1.3 g/l のTris塩基，0.6 g/lのマレイン酸，pH 7）中の１％アガロースを溶融し次いで55℃に冷却する。400 μｌのCiP に対するウサギ抗血清を 15mlのアガロースと混合し、10cm×10cmの平板上に塗抹しそして凝固させる。ＣＤＭ中で37℃で７日間増殖させたCiP 形質転換体のＣＤＭ寒天（1 g/l のK₂PO₄ ，30 g/l のショ糖，0.3 g/l のNaNO₃，0.05 g/lのKCl，0.05 g/l のMgSO₄・7H₂ O，0.001 g/l のFeSO₄・7H₂O，0.001 g/l のZnSO₄・7H₂O，0.0005 g/lのCuSO₄・ 5H₂O，20 g/lのマルトデキストリン，15 g/lのアガロース）培養試料を、寒天平板上に作った５mmの穴に適用する。タンパク質を48時間拡散させる。該平板をクーマシーブルーＲで染色してタンパク質−抗体沈澱帯を可視化する。標準溶液として、500，1000および2000ペルオキシダーゼ単位（PODU）／mlの濃度で精製物質を使用する。１PODUは、標準条件下で１分あたり１μモルの過酸化水素の変換を触媒する酵素の量である。 ABTS〔２，２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート）〕法によりペルオキシダーゼを測定するために、２mlの2 mM ABTS〔0.1 M リン酸塩緩衝液（10.63 g のリン酸水素二ナトリウム二水和物 p.a．M6580 と5. 49 gのリン酸二水素カリウムp.a．M4873を脱イオン水中に溶かして１ｌにしたもの）中の0.110 g のABTS，Boehringer Mannheim No．102946〕を30℃で10分間予熱する。これにガラス試験管中の10.6 mM H₂O₂溶液（1.0 g のして25mlにしたもの）と0.2 mlの試料または標準物質（標準物質＝5.0 mgのKem- En-Tec，grade 1，No．4140Aをリン酸塩緩衝液に溶かして25mlに調整し、それを400 倍希釈したもの）を加える。反応を30℃で３分間行う。試料の吸光度をMilli Q 脱イオン水に対して418 nmで測定し、３分間監視する。ペルオキシダーゼ活性の最良の反映は吸光度差：ΔＡ＝Ａ_{(75 sec)}−Ａ₍₁ _{5 sec)} により与えられる。吸光度差は試料では0.05〜0.1 PODU/mlに相当する0.1 5〜0.30の間にあるだろう。 VI．結果および考察表２は、本発明の代用宿主により生産される様々な異種真菌酵素の発現レベルを要約する。全ての株が少なくとも１つの着目の遺伝子の発現に成功したことがこの表から明らかである。幾つかの場合には、新規宿主株が意外にも高レベルの酵素を与える。例えば、Ａ．アクレータス、Ａ．ジャポニカスおよびＡ．ジャポニカス変種アクレータスの各々の少なくとも１つの株が振盪フラスコ培養において驚くほど高いレベルのＨＬＬを生産し（１ｌあたり約１ｇ）、それらの種が多量の異種タンパク質を発現できることを証明する。実際、それらの形質転換体により生産されるＨＬＬの生産レベルは、Ａ．オリゼの最良の一次形質転換体と同じ位またはそれより高いと思われる。Ａ．ジャポニカスもまた、Ａ．オリゼおよびＡ．ニガー Bo80 に比べてキシラナーゼの生産のための優れた宿主であることがわかる。この酵素についての振盪フラスコ収率は、最良のＡ．オリゼ形質転換体に見られるレベルの約２倍である。Ａ．アクレータス A1455株もカンジダ・アンタークティカのリパーゼＡの良好な生産を示し、同じ条件下で培養した対応するＡ．オリゼー次形質転換体よりも約３〜４倍優れている、ｇ／ｌ範囲の振盪フラスコ収率を与える。与えられたデータからわかるように、Ａ．ジャポニカス型種の多数の株が様々な異種タンパク質を相当量生産することができ、従って標準的なＡ．ニガーおよびＡ．オリゼ宿主系の代替物として有用であると確立され、またそれらの既知宿主の使用よりも好ましい場合がある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者タカギ，シノブアメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, ディビス，＃128，コウェルブールバード 1880 (72)発明者ブーミナザン，カラッパンチェッティアーアメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, ディビス，ハンボルトアベニュ 2233

Claims

【特許請求の範囲】１．プロモーターに作用可能に連結された異種タンパク質をコードする核酸配列を含んで成る、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）型宿主細胞。２．前記タンパク質が真菌タンパク質である、請求項１の宿主細胞。３．前記プロモーターが真菌プロモーターである、請求項２の宿主細胞。４．前記タンパク質が真菌酵素である、請求項２の宿主細胞。５．前記酵素が、カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼおよび他のタンパク質分解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼ、並びにデオキシリボヌクレアーゼから成る群より選択される、請求項４の宿主細胞。６．選択マーカーを更に含んで成る、請求項１の宿主細胞。７．前記マーカーがargB，trpC，pyrG，amdSおよびhygBから成る群より選択される、請求項６の宿主細胞。８．前記プロモーターが、Ａ．オリゼ（A．oryzae）のTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（A．niger）のグルコアミラーゼ、Ａ．ニガー（A．niger）の中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの（A．niger ）酸安定性α−アミラーゼおよびリゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei ）のリパーゼからのプロモーターから成る群より選択される、請求項２の宿主細胞。９．Ａ．ジャポニカス（A．japonicus）、Ａ．アクレータス（A．aculeatus）またはＡ．ジャポニカス変種アクレータス（A．japonicus var．aculeatus）種のメンバーである、請求項１の宿主細胞。 10．真菌プロモーターに作用可能に連結された異種真菌酵素をコードする核酸配列および選択マーカーを含んで成る、アスペルギルス・ジャポニカス（Asperg illus japonicus ）型宿主細胞。 11．リパーゼ、キシラナーゼおよびセルラーゼから成る群より選択された真菌酵素を含んで成る、請求項10の宿主細胞。 12．前記プロモーターが、Ａ．オリゼ（A．oryzae）のTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（A．niger）のグルコアミラーゼ、Ａ．ニガー（A．niger）の中性α −アミラーゼ、Ａ．ニガーの（A．niger）酸安定性α−アミラーゼおよびリゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）のリパーゼからのプロモーターから成る群より選択される、請求項10の宿主細胞。 13．前記選択マーカーが、argB，trpC，pyrG，amdSおよびhygBから成る群より選択される、請求項12の宿主細胞。 14．前記宿主細胞がＡ．ジャポニカス（A．japonicus）、Ａ．アクレータス（A．aculeatus ）またはＡ．ジャポニカス変種アクレータス（A．japonicus var．aculeatus ）種のメンバーである、請求項10の宿主細胞。 15．TAKA−アミラーゼプロモーターに作用可能に連結された真菌キシラナーゼをコードする核酸配列を含んで成り、そしてamdSまたはhygBマーカーを更に含んで成る、Ａ．ジャポニカス宿主細胞である、請求項10の宿主細胞。 16．TAKA−アミラーゼプロモーターまたはAMG プロモーターに作用可能に連結された真菌リパーゼをコードする核酸配列を含んで成り、そしてamdSマーカーを更に含んで成る、Ａ．ジャポニカス変種アクレータス宿主細胞である、請求項10 の宿主細胞。 17．TAKA−アミラーゼプロモーターに作用可能に連結された真菌リパーゼをコードする核酸配列を含んで成り、そしてamdSマーカーを更に含んで成る、Ａ．アクレータス宿主細胞である、請求項10の宿主細胞。 18．着目のタンパク質の生産方法であって、プロモーターに作用可能に連結された異種タンパク質をコードする核酸配列を含んで成るアスペルギルス・ジャポニカス型宿主細胞を、該タンパク質の発現を可能にする条件下で培養し、そして培養物から該タンパク質を回収することを含んで成る方法。 19．前記タンパク質が真菌タンパク質である、請求項18の方法。 20．前記プロモーターが真菌プロモーターである、請求項18の方法。 21．前記タンパク質が真菌酵素である、請求項20の方法。 22．前記酵素が、カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼおよび他のタンパク質分解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α −グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼ、並びにデオキシリボヌクレアーゼから成る群より選択される、請求項21の方法。 23．選択マーカーを更に含んで成る、請求項18の方法。 24．前記マーカーがargB，trpC，pyrG，amdSおよびhygBから成る群より選択される、請求項23の方法。 25．前記プロモーターが、Ａ．オリゼのTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ、Ａ．ニガーの中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸安定性α−アミラーゼおよびリゾムーコル・ミーヘイのリパーゼからのプロモーターから成る群より選択される、請求項18の方法。 26．前記宿主細胞がＡ．ジャポニカス、Ａ．アクレータスまたはＡ．ジャポニカス変種アクレータス種のメンバーである、請求項18の方法。 27．プロモーターに作用可能に連結された異種タンパク質をコードする組換え核酸配列を含んで成る、アスペルギルス・ジャポニカス型宿主細胞。 28．着目のタンパク質の生産方法であって、プロモーターに作用可能に連結された異種タンパク質をコードする組換え核酸配列を含んで成るアスペルギルス・ジャポニカス型宿主細胞を、該タンパク質の発現を可能にする条件下で培養し、そして培養物から該タンパク質を回収することを含んで成る方法。