WO2005044857A1

WO2005044857A1 - ヒト化抗cd47抗体

Info

Publication number: WO2005044857A1
Application number: PCT/JP2004/016744
Authority: WO
Inventors: Yasufumi Kikuchi; Shinsuke Uno; Yasuko Kinoshita; Shigeyuki Iijima; Naoshi Fukushima; Masayuki Tsuchiya
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2003-11-11
Filing date: 2004-11-11
Publication date: 2005-05-19
Also published as: KR20060121150A; EP1693385A1; US8759025B2; US20120156724A1; JPWO2005044857A1; JP4637749B2; US8101719B2; AU2004287722A1; CA2545166A1; CN101133083A; US20080107654A1; EP1693385A4

Abstract

　本発明は、CD47に結合するヒト化抗体；Diabodyを構成するフラグメント間にジスルフィド結合が存在することを特徴とする、ヒトCD47に結合するDiabody抗体；前記いずれかの抗体をコードする遺伝子；前記遺伝子を含むベクター；前記ベクターを含む宿主細胞；前記宿主細胞を培養する工程を含む抗体の製造方法；及び前記抗体を含む血液疾患治療薬に関する。

Description

明細書

ヒト化抗 CD47抗体

技術分野

[0001] 本発明は、 CD47に結合するヒト化抗体に関する。当該ヒト化抗 CD47抗体は、白血病等の血液疾患の治療薬として有用である。

背景技術

[0002] CD47は Integrin Associated Protein (IAP)とも呼ばれる膜タンパク質である。インテダリンは細胞と細胞外マトリックス及び細胞細胞間の接着を司る接着分子の 1つであり、 α鎖と j8鎖の異なる 2つのサブユニットよりヘテロダイマーを構成する。近年、ィンテグリン関連分子として、 α V |8 3インテグリンと複合体を形成する CD47 (ΙΑΡ)が注目されており、これに対する抗体の医薬用途も研究されている。

[0003] WO97Z32601は、脾臓間質細胞を識別し得る特定の抗体を開発することを目標として当該脾臓間質細胞株を感作抗原とするモノクローナル抗体の作製を試み、抗原としてマウス CD47を認識する新規モノクローナル抗体の取得を記載して、る。また、 WO97Z32601は、前記モノクローナル抗体が骨髄系細胞にアポトーシスを誘起する特性を有することを開示して、る。

[0004] W099Z12973は、ヒトの CD47 (以下ヒト CD47とする； J. Cell Biol, 123, 485—496, 1993にアミノ酸配列及び塩基配列が記載; Journal of Cell Science, 108, 3419-3425, 1995)を抗原とするモノクローナル抗体であって、当該ヒト CD47を有する有核血液細胞 (骨髄系細胞及びリンパ球）にアポトーシスを誘起させる特性を有するモノクローナル MABL— 1抗体、 MABL— 2抗体、これを産生するハイブリドーマ、 MABL— 1 (FE RM BP— 6100)及び MABL— 2 (FERM BP— 6101)を記載している。

[0005] WO02/33072, WO02Z33073は、ヒト CD47を抗原とするモノクローナル抗体から、ヒト CD47を有する有核血液細胞にアポトーシスを誘起する特性を有する一本鎖の Fv領域を有する一本鎖 Fvを得たことを開示している。

[0006] し力しながら、ヒト CD47を抗原とするモノクローナル抗体を治療薬として用いる場合、抗原性を低下させ、なおかつ CD47への結合活性及びアポトーシス誘起活性を維持させる必要がある。

特許文献 1： WO97/32601

特許文献 2:W099Z12973

特許文献 3 :WO02Z33072、 WO02/33073

非特許文献 1 : J. Cell Biol, 123, 485-496, 1993

非特許文献 2 Journal of Cell Science, 108, 3419-3425, 1995

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 本発明の課題は、抗原性が低下したヒト化抗 CD47抗体を提供することである。また、本発明の他の課題は、前記得られたヒト化抗 CD47抗体の低分子化抗体を提供することである。さらに、本発明の課題は前記得られた低分子ヒト化抗体を安定化させた抗体を提供することである。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、抗原性が低下し、かつ CD47への結合活性及びアポトーシス誘起活性が維持されており、従って血液疾患治療薬として有用なヒト化抗 CD47抗体を見いだした。

[0009] すなわち、本発明は以下のものを提供する。

[1] CD47に結合するヒト化抗体。

[2] CD47がヒト CD47である前記 [1]に記載のヒトイ匕抗体。

[3] ヒトイ匕抗体の CDRがマウス抗体由来である前記 [1ほたは [2]に記載のヒト化抗体。

[4] 以下の配列のいずれかを含む前記 [1]一 [3]のいずれかに記載のヒト化抗体：

(1)配列番号 7のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3)

(2)配列番号 10のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3)

(3)配列番号 13のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3)

(4)配列番号 16のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3)

(5)配列番号 19のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3)

(6)配列番号 22のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3)

(7)配列番号 30のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3)

(8)配列番号 37のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3)

(9)配列番号 40のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3)

(10)配列番号 43のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3)

(11)配列番号 46のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3)

(12)配列番号 49のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3)

(13)配列番号 52のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3)

(14)配列番号 57のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3)

(15)配列番号 64のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3)

(16)配列番号 67のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3)。

[5] 以下の配列の、ずれかを含む前記 [1]一 [3]の、ずれかに記載のヒト化抗体： (1)配列番号 7のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2) 、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4) (2)配列番号 10のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2 )、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4)

(3)配列番号 13のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2 )、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4)

(4)配列番号 16のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2 )、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4)

(5)配列番号 19のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2 )、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4)

(6)配列番号 22のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2 )、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4)

(7)配列番号 30のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2 )、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4)

(8)配列番号 37のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（FR2 )、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)

(9)配列番号 40のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（FR2 )、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)

(10)配列番号 43のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（ FR2)、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)

(11)配列番号 46のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（ FR2)、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)

(12)配列番号 49のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（ FR2)、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)

(13)配列番号 52のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（ FR2)、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)

(14)配列番号 57のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（ FR2)、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)

(15)配列番号 64のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（ FR2)、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4) (16)配列番号 67のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（ FR2)、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)。

[6] 低分子化抗体である前記 [1]一 [5]の、ずれかに記載のヒト化抗体。

[7] ダイアポディ (Diabody)である請前記 [6]記載のヒト化抗体。

[8] 一本鎖 Diabodyである前記 [7]記載のヒト化抗体。

[9] Diabodyを構成するフラグメント間にジスルフイド結合が存在することを特徴とする前記 [7]または [8]に記載のヒト化抗体。

[10] 以下の特徴を有する前記 [9]記載のヒト化抗体：

(1)配列番号 90に記載のアミノ酸配列を有する抗体；又は

(2)アミノ酸配列（1)において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したアミノ酸配列を有し、かつ CD47への結合活性を有する抗体。

[11] 以下の特徴を有する前記 [9]記載のヒト化抗体：

(1)配列番号 92に記載のアミノ酸配列を有する抗体；又は

[12] Diabodyを構成するフラグメント間にジスルフイド結合が存在することを特徴とする、ヒト CD47に結合する Diabody抗体。

[13] 以下の配列の、ずれかを含む前記 [12]に記載の Diabody抗体：

(5)配列番号 19のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3) (6)配列番号 22のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3)

[14] 以下の配列を含む CD47に結合するヒト化抗体：

(1)配列番号 30のアミノ酸番号 1一 117の配列の配列を含む H鎖 V領域:及び

(2)配列番号 57のアミノ酸番号 1一 112の配列の配列を含む L鎖 V領域。

[15] 以下の配列を含む CD47に結合するヒト化抗体：

(1)配列番号 64のアミノ酸番号 1一 117の配列を含む H鎖 V領域:及び

(2)配列番号 67のアミノ酸番号 1一 112の配列を含む L鎖 V領域。 [16] 以下のいずれかの配列を含む CD47に結合する抗体：

(1)配列番号 73のアミノ酸番号 1一 234の配列

(2)配列番号 74のアミノ酸番号 1一 234の配列

(3)配列番号 78のアミノ酸番号 1一 483の配列

(4)配列番号 79のアミノ酸番号 1一 483の配列。

[17] 前記 [1]一 [16]のいずれかに記載の抗体をコードする遺伝子。

[18] 前記 [17]に記載の遺伝子を含むベクター。

[19] 前記 [18]に記載のベクターを含む宿主細胞。

[20] 前記 [19]に記載の宿主細胞を培養する工程を含む抗体の製造方法。

[21] 前記 [1]一 [16]のいずれかに記載の抗体を含む血液疾患治療薬。

[22] 血液疾患が急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人 T細胞白血病、多発性骨髄腫、 Mixed Leukemia, Hairy cell

Leukemia等の白血病、悪性リンパ腫（Hodgkin病、非 Hodgkinリンパ腫）、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、及び真性多血症から選択される前記 [21]記載の治療薬。図面の簡単な説明

[図 1]図 1は、ヒトイ匕 H鎖バージョン 1.1、 1.2、 1.3とキメラ L鎖を組み合わせた抗体は、キメラ抗体と同程度のヒ HAP結合活性を有することを示すグラフである。

[図 2]図 2は、ヒトイ匕 H鎖バージョン 1.1、 1.2、 1.3とキメラ L鎖を組み合わせた抗体は MABL-2による結合阻害活性ではバージョン 1.2、 1.3はキメラ抗体とほぼ同等の阻害活性を有することを示すグラフである。

[図 3]図 3は、ヒトイ匕 H鎖バージョン 1.4、 1.5とキメラ L鎖を組み合わせた抗体の結合活性はキメラ抗体およびバージョン 1.3と同等であることを示すグラフである。

[図 4]図 4は、ヒトイ匕 H鎖バージョン 1.4、 1.5とキメラ L鎖を組み合わせた抗体の結合阻害活性はキメラ抗体およびバージョン 1.3より弱いことを示すグラフである。

[図 5]図 5は、ヒトイ匕 H鎖バージョン 2.1はキメラ抗体とほぼ同等の MABL-2による結合阻害活性を有することを示すグラフである。

[図 6]図 6は、ヒト化 L鎖バージョン 1.1、 1.2、 1.3とキメラ H鎖を組み合わせた抗体は三種ともキメラ抗体より弱いヒ HAPに対する結合活性を示すグラフである。 [図 7]図 7は、ヒト化 L鎖バージョン 1.1、 1.2、 1.3とキメラ H鎖を組み合わせた抗体は MABL-2による結合阻害活性では、ずれもキメラ抗体に比べて弱、ことを示すグラフである。

[図 8]図 8は、ヒト化 L鎖バージョン 1.4、 1.5とキメラ H鎖を組み合わせた抗体のうちバージョン 1.4はキメラ抗体と同様な結合活性を有することを示すグラフである。

[図 9]図 9は、ヒト化 L鎖バージョン 1.4、 1.5とキメラ H鎖を組み合わせた抗体のうちバージョン 1.4は結合阻害活性についてもキメラ抗体に近づいたことを示すグラフである。

[図 10]図 10は、ヒト化 L鎖バージョン 2.1とキメラ H鎖を組み合わせた抗体は、キメラ抗体と同程度の MABL-2による結合阻害活性を有することを示すグラフである。

[図 11]図 11は、ヒト化 H鎖バージョン 2.1とヒト化 L鎖バージョン 2.1を組み合わせたヒト化 MABL-2抗体は、キメラ抗体と同程度の MABL-2による結合阻害活性を有することを示すグラフである。

[図 12]図 12は、ヒト化 H鎖バージョン 2.1とヒト化 L鎖バージョン 2.1を組み合わせたヒト化 MABL-1抗体は、キメラ抗体と同程度の MABL-1による結合阻害活性を有することを示すグラフである。

[図 13]図 13Aは、ヒト化 MABL- 1抗体、図 13Bは、ヒト化 MABL- 2抗体力ヒト IAP遺伝子を導入した L1210細胞に細胞死を誘導することを示すグラフである。

[図 14]図 14は、ヒト化 MABL- 1抗体 HL5産生 CHO細胞の培養上清を SP- Sepharose F.F. columnにより精製した際のクロマトグラムである。網目をかけた部分は精製画分として次工程で使用したことを示す。

[図 15]図 15は、ヒト化 MABL- 1抗体 HL5の精製過程において、 SP- Sepharose F.F. columnで得られた画分を Hydroxyapatite columnにより精製した際のクロマトグラムである。網目をかけた部分は精製画分として次工程で使用したことを示す。

[図 16]図 16は、ヒトイ匕 MABL- 1抗体 HL5の精製過程において、 Hydroxyapatite columnで得られた画分を Superdex200 columnにより精製した際のクロマトグラムである。網目を力 4ナた部分を最終精製標品と回収したことを示す。

[図 17]図 17は、精製した 4種類のヒト化 MABL-1抗体 HL5および sc(Fv)、ヒトイ匕

2

MABL-2抗体 HL5および sc(Fv)の、 Superdex 200 columnにより分析ゲルろ過の結果を示す。いずれもシングルピークで、ヒト化 MABL-1抗体 HL5および sc(Fv)は見かけ

2 上の分子量は約 42 kDaを、ヒト化 MABL-2抗体 HL5および sc(Fv)は、見かけ上の分

2

子量約 40 kDaを示した。

[図 18]図 18は、精製したヒトイ匕 MABL-1抗体 HL5および sc(Fv)の還元と非還元条件

2

SDS-PAGE分析の結果を示す。 HL5は両条件とも monomerの分子量位置（約 30 kDa )に単一のバンドを示し、 sc(Fv)は両条件とも monomerの分子量位置（約 55 kDa)に

2

単一のバンドを示した。

[図 19]図 19は、精製したヒトイ匕 MABL-2抗体 HL5および sc(Fv)の還元と非還元条件

2

単一のバンドを示した。

[図 20]図 20は、ヒト化 MABL- 2抗体 HL5及び sc(Fv)、ヒト化 MABL-1抗体 HL5及び

2

sc(Fv)が MOLT4細胞に細胞死を誘導することを示すグラフである。

2

[図 21]図 21は、ヒト化 MABL— 1抗体 sc(Fv)2がヒト白血病マウスモデルにおいて、延命効果を有することを示した図である。

[図 22]図 22は、 S-S結合導入ヒト化 MABL- 2 HL5の作製を示す模式図である。

[図 23]図 23は、精製したヒト化 MABL- 2抗体 HL5 SS44および SS105の Superdex 200 columnにより分析ゲルろ過の結果を示す。いずれもシングルピークで、見かけ上の分子量約 40 kDaを示した。

[図 24]図 24は、精製したヒト化 MABL-2抗体 HL5 SS44および SS105の還元と非還元条件 SDS-PAGE分析の結果を示す。 SS44および SS105は還元条件で monomerの分子量位置（約 26 kDa)に単一のバンドを示し、非還元条件で dimerの分子量位置（約 45 kDa)に単一のバンドを示した。

[図 25]図 25は、ヒト化 MABL- 2 HL5 SS44およびヒト化 MABL- 2 HL5がヒ HAP遺伝子を導入した L1210細胞に細胞死を誘導することを示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

CD47

本発明で用いられる CD47は特に限定されず、どのような動物由来の CD47でもよい力好ましくは哺乳動物由来 CD47であり、さらに好ましくはヒト CD47である。ヒト CD47 のアミノ酸配列 ·塩基配列は既に公知である (J. Cell. Biol, 123, 485-496,(1993)、 Journal of Cell Science, 108, 3419—3425, (1995)、 GenBank : Z25521)_G

[0012] 本発明において抗 CD47抗体は、 CD47への結合能を有する限り特に制限はなぐマウス抗体、ヒト抗体、ゥサギ抗体、ヒッジ抗体等を適宜用いることができる。また、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え抗体、例えばキメラ（Chimeric)抗体、ヒトイ匕（Humanized)抗体等も使用できる。さらに、本発明の抗 CD47抗体は、 CD47を発現している細胞 (例えば、骨髄系細胞、リンパ球など）にアポトーシスを誘起させる特性を有して、ることが好ま、。

ヒト化杭体

本発明は、抗 CD47抗体のヒト化抗体に関するものである。

[0013] 抗体の L鎖及び H鎖の各可変領域 (V領域）は抗原結合部位を形成し、 L鎖及び H 鎖上の可変領域は共通性のある比較的保存された 4個のフレームワーク領域（ framework region ; FR)と 3個の超可変又は相補性決定領域（CDR; complementarity determining region)により連結されている (Kabat, E. A.り、「¾equences of Proteins of Immunological mterestj U¾ Dept. Health ana Human services, 1983)。

[0014] 前記 4個のフレームワーク領域 (FR)の多くの部分は |8—シート構造をとり、その結果 3個の CDRはループを形成し、 CDRは場合により |8—シート構造の一部分を形成することもある。 3個の CDRは FRによって相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そして対をなす領域の 3個の CDRと共に抗原結合部位の形成に寄与する。

[0015] これらの CDR領域は、得られた抗体の V領域のアミノ酸配列と既知抗体の V領域の既知アミノ酸配列とを照合することによって、 Kabat, E. A.ら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest]の経験則から見出すことができる。

[0016] ヒト化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、これは、非ヒト動物由来抗体（例えばマウス抗体など)の相補性決定領域 (CDR)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号 EP 125023号公報、 WO 96/02576号公報参照）。

[0017] 具体的には、非ヒト動物がマウスの場合、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームヮーク領域とを連結するように設計した DNA配列を、 CDR及び FR両方の末端領域にォ一バーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて PCR法により合成する (W098/13388号公報に記載の方法を参照）。

[0018] CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.etal., CancerRes. (1993) 53, 851-856)。

[0019] ヒト化抗体の L鎖 V領域は、ヒト由来抗体の L鎖 V領域のフレームワーク領域 (FR)と非ヒト動物由来抗体の L鎖 V領域の CDRを含み、ヒト化抗体の H鎖 V領域はヒト由来抗体の H鎖 V領域のフレームワーク領域 (FR)と非ヒト動物由来抗体の H鎖 V領域の CDRを含む。

[0020] ヒト化抗体の C領域には、通常、ヒト抗体のものが使用され、例えば H鎖では、 C γ 1 、 C γ 2、 C γ 3、 C γ 4を、 L鎖では C κ、 C λを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体 C領域を修飾してもよ、。

[0021] 非ヒト動物由来抗体は、特に限定されず、マウス抗体、ラット抗体、ハムスター抗体、ィヌ抗体、サル抗体など、ヒト以外のいかなる動物由来の抗体でもよいが、好ましくは非ヒト哺乳類由来抗体であり、さらに好ましくはげつ歯類由来抗体であり、特に好ましくはマウス抗体である。

[0022] ヒト由来の FRおよび非ヒト動物由来の CDRのアミノ酸配列は、一部改変（例えば、欠失、置換又は付加）してもょ、。

[0023] CD47への結合活性を有する限り、本発明のヒトイ匕抗 CD47抗体の CDR、 FRのァミノ酸配列は特に限定されず、どのような配列を用いてもよい。 CDRとしては以下のいずれかのアミノ酸配列をもつものが好まし！/ヽ：

(2)配列番号 10のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3) (3)配列番号 13のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3)

(16)配列番号 67のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3)。また、 FRとしては以下の!/、ずれかのアミノ酸配列をもつものが好まし!/ヽ：

(1)配列番号 7のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2) 、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4)

(2)配列番号 10のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2 )、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4)

(15)配列番号 64のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（ FR2)、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4)

(16)配列番号 67のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（ FR2)、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)。

抗 CD47抗体の作製及び CDR配列

非ヒト動物由来抗体の CDR配列は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。

[0025] まず、当業者に公知の方法により抗 CD47抗体を作製する。例えば、 CD47タンパク質又はその部分ペプチドを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にした力 Sつて免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングする。具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。

[0026] まず、抗体取得の感作抗原として使用される CD47タンパク質を、 GenBank:Z25521 等に開示された CD47遺伝子 Zアミノ酸配列を参考に発現させる。すなわち、 CD47をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的の CD47タンパク質を公知の方法で精製する。

[0027] 次に、この精製 CD47タンパク質を感作抗原として用いる。ある、は、 CD47の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドは CD47のアミノ酸配列より化学合成により得ることも可能である。

[0028] 抗 CD47抗体の認識する CD47分子上のェピトープは特定のものに限定されず、 CD47分子上に存在するェピトープならばどのェピトープを認識してもよい。従って、抗 CD47抗体を作製するための抗原は、 CD47分子上に存在するェピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可能である。

[0029] 感作抗原で免疫される非ヒト動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一般的にはげつ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ノ、ムスター、あるいはゥサギ、サル等が使用される。

[0030] 感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を非ヒト動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline)や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に 4-21日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。

[0031] このように非ヒト動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、非ヒト動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付される力好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

[0032] 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、 P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550)、 P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1—7)、 NS— 1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J.

Immunol. (1976) 6, 511- 519)、 MPC- 11 (Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405- 415)、 SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269- 270)、 FO (deSt. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1—21)、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313— 323)、 R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133)等が好適に使用される。

[0033] 前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルスティンらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、 Methods Enzymol. ( 1981) 73, 3-46)等に準じて行うことができる。

[0034] より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール (PEG )、センダイウィルス (HVJ)等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

[0035] 免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を 1-10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI1640培養液、 MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。

[0036] 細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め 37°C程度に加温した PEG溶液 (例えば平均分子量 1000-6000程度）を通常 30-60% (w/v)の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞 (ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。

[0037] このようにして得られたノヽイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選択される。上記 HAT培養液での培養は、目的とするハイプリドーマ以外の細胞 (非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日一数週間)継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニングおよび単一クローユングを行う。

[0038] このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するノ、イブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。

[0039] 当該ノ、イブリドーマ力モノクローナル抗体を取得するには、当該ハイプリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイプリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

[0040] 次に、抗 CD47抗体を産生するハイブリドーマから、抗 CD47抗体の可変 (V)領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グァ-ジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294- 5299)、グァ-ジンン' チオシァネート ·ホット'フエノール法、グァ-ジン ·チオシァネートグァ-ジン ·塩酸法、グァ-ジン'チオシァネート'塩ィ匕セシウム法、アルカリショ糖密度勾配遠心分離法、 AGPC法（Chomczynski, P.et al, Anal. Biochem. (1987) 162, 156- 159)等により行って全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等を使用して目的の mRNAを調製する。また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製）を用いること〖こより mRNAを直接調製することもできる。

[0041] 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生ィ匕学工業社製）等を用いて行う。また、 cDNAの合成および増幅を行うには、 5'-AmpliFINDER RACE Kit (Clontech製）および PCRを用いた 5'-1^じ5法 1"01^1& M. A.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998—9002、 Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919- 2932)等を使用することができる。

[0042] 得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、ベクター DNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とする DNAの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデォキシヌクレオチドチェインターミネーシヨン法等により確認する。

FR配列

ヒト由来 FR配列は既にアミノ酸配列が解明されている既知のヒト抗体の配列を使用することが可能である。例えば、 Protein Data bankに登録されている天然ヒト抗体の配列を利用することが可能である。

[0043] 使用する FR配列は、 CDR配列の由来となっている抗体の FR配列と最も同一性の高い配列を H鎖 'L鎖それぞれ別々に選択する方法、単一のヒト抗体の H鎖 'L鎖の組み合わせをそのまま選択する方法、同一サブグループ内から H鎖 'L鎖の配列をそれぞれ別々に選択する方法など、いかなる方法により選択されてもよい。

体修飾 ·

本発明の抗体には、抗体に各種分子を結合させた抗体修飾物も含まれる。抗体の修飾物として、細胞傷害性物質やポリエチレングリコール (PEG)等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。細胞障害性物質としては、例えば、放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等を挙げることができる。本発明における「抗体」には、このような他の物質と結合している抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野にぉ、てすでに確立されて、る。

[0044] さら〖こ、二重特異性抗体 (bispecific antibody)であってもよ!/ヽ。二重特異性抗体は CD47分子上の異なるェピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位力 SCD47を認識し、他方の抗原結合部位が細胞傷害性物質などの他の物質を認識してもよ、。二重特異性抗体は遺伝子工学的手法により作製することが可能である。

又、抗体の細胞障害活性を増強させる目的で、抗体の糖鎖を改変する技術も知られている（例えば、 WO/0061739, WO02/31140など）。本発明の抗体は、低分子化されて!/、る低分子化抗体が好まし、。

[0045] 本発明にお!/、て低分子化抗体とは、全長抗体 (whole andibody,例えば whole IgG 等)の一部分が欠損してヽる抗体断片を含み、抗原への結合能を有してヽれば特に限定されない。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域 (VH)又は軽鎖可変領域 (VL)を含んでいることが好ましぐ特に好ましいのは VHと VLの両方を含む断片である。抗体断片の具体例としては、例えば、 Fab、 Fab'、 F(ab')2、 Fv、 scFv (シングルチェイン Fv)、などを挙げることができるが、好ましくは scFv (Huston, J. S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883、 Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies] Vol.113, Resenburg及び Moore編， Springer Verlag, New York, pp.269- 315, (1994》である。このような抗体断片を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、 Co, M. S. et al" J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976； Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476 - 496； Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515； Lamoyi, E.， Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663； Rousseaux, J. et al" Methods Enzymol. (1986) 121, 663—669； Bird, R. E. and Walker, B. W" Trends Biotechnol. (1991) 9, 132- 137参照）。 [0046] 本発明にお!/、て好ま、低分子化抗体は Diabodyである。 Diabodyは、可変領域と可変領域をリンカ一等で結合したフラグメント (例えば、 scFv等）（以下、 Diabodyを構成するフラグメント）を 2つ結合させて二量体ィ匕させたものであり、通常、 2つの VLと 2 つの VHを含む (P.Holliger et al" Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90, 6444-6448 (1993)、 EP404097号、 W093/11161号、 Johnson et al., Method in Enzymology, 203, 88-98, (1991)、 Holliger et al., Protein Engineering, 9, 299—305, (1996)、 Perisic et al., Structure, 2, 1217-1226, (1994)、 John et al., Protein Engineering, 12(7), 597-604, (1999)、 Holliger et al,. Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 6444-6448, (1993)、 Atwell et al" Mol.Immunol. 33, 1301-1312, (1996》。

[0047] Diabodyを構成するフラグメントは、 VLと VHを結合したもの、 VLと VLを結合したもの、 VHと VHを結合したもの等を挙げることができる力好ましくは VHと VLを結合したものである。 Diabodyを構成するフラグメント中において、可変領域と可変領域を結合するリンカ一は特に制限されないが、同一フラグメント中の可変領域の間で非共有結合がおこらな、程度に短、リンカ一を用いることが好まし、。そのようなリンカ一の長さは当業者が適宜決定することができる力通常 2— 14アミノ酸、好ましくは 3— 9ァミノ酸、特に好ましくは 4一 6アミノ酸である。この場合、同一フラグメント上にコードされる VLと VHとは、その間のリンカ一が短いため、同一鎖上の VLと VHの間で非共有結合がおこらず、単鎖 V領域フラグメントが形成されない為、他のフラグメントとの二量体を形成することができる。二量体を形成する際、 Diabodyを構成するフラグメント間の結合は非共有結合でも共有結合でよぐ又、共有結合と非共有結合の両方でもよい。共有結合は互いに外殻電子を共有することによって安定ィヒされる結合をいう（例えば、ジスルフイド結合など)。非共有結合は、共有結合を除いた原子間、分子間の相互作用をいい、水素結合、静電的相互作用、ファンデルワールス力が含まれる。

[0048] Diabodyを構成するフラグメント同士をリンカ一などで結合して、一本鎖 Diabody( sc(Fv) )とすることも可能である。その際、 Diabodyを構成するフラグメント同士を 15—

2

20アミノ酸程度の長、リンカ一を用いて結合すると、同一鎖上に存在する Diabodyを構成するフラグメント同士で非共有結合が可能となり、二量体を形成することができる。一本鎖 Diabodyの例としては、以下のような配置を挙げることができる。 [VH] linker(5) [VL] linker(15) [VH] linker(5) [VL]

[VL] linker(5) [VH] inker(15) [VH] linker(5) [VL]

[VH] linker(5) [VL] linker(15) [VL] linker(5) [VH]

[VH] linker(5) [VH] linker(15) [VL] linker(5) [VL]

さらに、 Diabody作製と同じ原理で、 Diabodyを構成するフラグメントを 3つ以上結合させて、トリマー、テトラマーなどの多量体ィ匕させた抗体を作製することも可能である。安定ィ Diabodv

本発明はさらに、安定化された Diabodyを提供する。本発明において安定化された Diabodyとは、 Diabodyを構成するフラグメント間に共有結合が存在する Diabodyのことをいう。 Diabodyを構成するフラグメント間に存在する共有結合は、特に限定されずどのような共有結合でもよ、が、本発明におヽてはジスルフイド結合を好適に用いることができる。ジスルフイド結合は当業者に公知の方法で Diabodyに導入することが可能であり、例えば、国際公開公報 WO94/29350の方法で行うことが可能である。

[0049] ジスルフイド結合は通常、 Diabody中の選択されたアミノ酸をシスティンに置換することにより Diaobodyに導入される力他の方法により導入してもよい。 Diabodyに導入されるジスルフイド結合の数は限定されず、幾つ導入してもよいが、好ましくは 2つのジスルフイド結合が Diabodyに導入される。この場合、通常、第一の Diabodyを構成するフラグメントの VHに導入されたシスティンと第二の Diabodyを構成するフラグメントの VLに導入されたシスティンが 1つ目のジスルフイド結合を形成し、第一の Diaobodyを構成するフラグメントの VLに導入されたシスティンと第二の Diabodyを構成するフラグメントの VHに導入されたシスティンが 2つ目のジスルフイド結合を形成する。

[0050] ジスルフイド結合が導入される位置は特に限定されず、適宜選択した位置に導入することが可能である力 CDRにジスルフイド結合が導入されると Diabodyの結合活性に影響を与える可能性があるので、一般的には、 FRにジスルフイド結合が導入される。国際公開公報 WO94/29350では、ジスルフイド結合を導入する好ましい位置として、以下の位置が挙げられている。

VH44 VL100

VH105— VL43 VH105— VL42

VH44 VL101

VH106— VL43

VH104 - VL43

VH44 VL99

VH45 VL98

VH46 VL98

VH103— VL43

VH103— VL44

VH103— VL45

上記アミノ酸番号の位置は Kabat and Wuにより利用される番号付け系における位置である。本発明においては、好ましい位置としては VH44 - VL100、 VH105 - VL43を挙げることができる。

リンカ一

本発明にお、て、 H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結するリンカ一又は一本鎖 Diabody を作製する際の Diabodyを構成するフラグメント同士を連結するリンカ一としては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカ一、又は合成化合物リンカ一、例えば、 Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカ一を用いることができる。例えば、ペプチドリンカ一の場合：

¾er

Gly Ser

GlyGly Ser

Ser-GlyGly

Gly GlyGly Ser

Ser-GlyGlyGly

Gly -Gly -Gly -Gly Ser

Ser- Gly -Gly -Gly -Gly

Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly

Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser

Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly

(Gly · Gly · Gly · Gly · Ser)n

(Ser · Gly · Gly · Gly · Gly)n

[nは 1以上の整数である]等を挙げることができる。リンカ一ペプチドの長さは目的に応じて当業者が適宜選択することができる。

[0051] 本発明における合成化学物リンカ一 (化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えば N—ヒドロキシスクシンイミド（NHS)、ジスクシンィミジルスベレート（DSS)、ビス（スルホスクシンィミジル)スべレート（BS³)、ジチォビス（スクシンィミジルプロピオネート）（DSP)、ジチオピス（スルホスクシンィミジルプロピオネート ) (DTSSP)、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS)、ェチレングリコールビス（スルホスクシンィミジルスクシネート）（スルホー EGS)、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST)、ジスルホスクシンィミジル酒石酸塩 (スルホー DST)、ビス [2— (スクシンイミドォキシカルボ-ルォキシ）ェチル]スルホン（BSOCOES)、ビス [2—（スルホスクシンイミドォキシカルボ-ルォキシ）ェチル]スルホン（スルホ— BSOCOES )などであり、これらの架橋剤は市販されている。

[0052] 特に、 Diabodyを作製する場合、宿主細胞で産生された Diabodyを構成するフラグメントを培地等の溶液中で、 20%以上、好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 80%以上、最も好ましくは 90%以上ダイマー化するのに適したリンカ一を選択することが好ましい。

ί本の 1¾告

前記のようにして得られた本発明の抗体をコードする遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモータ一、発現させる抗体遺伝子、その 3'側下流にポリ Αシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター Zェンハンサ一としては、ヒトサイトメガロウイノレス目 ij期プロモ¹ ~~タ' ~~ z工ンノヽンサ■ ~" ( human cytomegalovirus immediate early promoter/ enhancer)をけこと力できる。 [0053] また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター，サ一として、レトロウイルス、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、シミアンウィルス 40 ( SV40)等のウイノレスプロモーター Zェンハンサー、ある、はヒトェロンゲーシヨンファタター 1 α (HEF1 α )などの哺乳類細胞由来のプロモーター Ζェンハンサ一等が挙げられる。

[0054] SV40プロモーター Ζェンハンサーを使用する場合は Mulliganらの方法（Nature ( 1979) 277, 108)〖こより、また、 HEF1 αプロモーター Zェンハンサーを使用する場合は Mizushimaらの方法（Nucleic AcidsRes. (1990) 18, 5322)〖こより、容易に遺伝子発現を行うことができる。

[0055] 大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えば laczプロモーター、 araBプロモーターを挙げることができる。 laczプロモーターを使用する場合は Wardらの方法（Nature (1098) 341, 544-546； FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)〖こより、あるいは araBプロモーターを使用する場合は Betterらの方法（Science (1988) 240, 1041-1043)により発現することができる。

[0056] 抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)を使用すればよい。そして、ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して (refold)使用する。

[0057] 複製起源としては、 SV40、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウイルス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH)遺伝子、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラーゼ (Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる。

[0058] 本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば榭立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。

[0059] 好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えば CHO、 COS,ミエ口一マ、 BHKゝ Vero、 HeLa細胞中で発現される。

[0060] 次に、形質転換された宿主細胞を in vitroまたは in vivoで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、 DMEM、 MEM, RPMI1640, IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS)等の血清補液を併用することもできる。

[0061] 前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はァフィユティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテイン Aカラムを用いたカラムとして、 Hyper D、 POROS、 Sepharose F.F. (Pharmacia製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何ら限定されるものではない。例えば、上記ァフィユティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製すること力できる (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane,し old bpnng Harbor Laboratory, 1988)。

杭体の活件の確認

抗体の饥原結合活'性 (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手段を使用することができる。

[0062] 抗原結合活性を測定する方法として、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法)、 EIA (酵素免疫測定法)、 RIA (放射免疫測定法)あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、 CD47をコーティングしたプレートに、抗 CD47抗体を含む試料、例えば、抗 CD47抗体産生細胞の培養上清や精製抗体をカロえる。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをィンキュペートし、洗浄した後、トロフエ-ル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。アポトーシス誘起活件の確認

アポトーシスを誘起するか否かの確認は、当業者に公知の方法で行うことが可能である（例えば、日本公開公報:特開平 9-295999など)。具体的には、実施例に記載の方法や、ヒト白血病細胞や CD47遺伝子を導入した Jurkat細胞 'L1210細胞 'JOK-1細胞などの CD47発現細胞を、被検抗体の存在下で培養し、 MTS法やフローサイトメトリ一によりアポトーシスを検出する方法などにより行うことが可能である。本発明はまた、本発明の抗体を有効成分として含有する血液疾患治療薬に関する。本発明の血液疾患治療薬は、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人 T細胞白血病、多発性骨髄腫、 Mixed Leukemia, Hairy cell Leukemia等の白血病、悪性リンパ腫（Hodgkin病、非 Hodgkinリンパ腫)、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、真性多血症などの血液疾患の治療に有用である。

[0063] 本発明の抗体を血液疾患治療薬として用いる場合、有効投与量は、一回につき体重 lkgあたり O.OOlmg力も lOOOmgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり 0.01— 100000mg/bodyの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明のヒトイ匕抗 CD47 抗体を含有する治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。

[0064] また、本発明の治療剤の投与時期としては、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず投与することができる。

[0065] 本発明の治療剤は 1日 1一 3回、一週間に 1日一 7日投与することが可能である。また、点滴注入のように持続投与することも可能であり、例えば 1一 3日間投与することが可能である。

[0066] 本発明の治療剤は、通常、非経口投与で、例えば注射剤 (皮下注、静注、筋注、腹腔内注など)で投与されるが、特に限定されず、経皮、経粘膜、経鼻、経肺、経口などで投与してもよ、。

[0067] し力しながら、本発明の治療剤は上記投与量、投与方法などに限定されるものではない。

[0068] 本発明の本発明の抗体を有効成分として含有する治療剤は、常法にしたがって製剤ィ匕すること力 Sでき (Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton,米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。

[0069] このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビュルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセル口ース、ェチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA)、マン-トール、ソルビトール、ラタトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。

[0070] 実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる力もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えば Tween80、 Tween20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよぐ凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マン-トール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。

[0071] 本発明のヒト化抗 CD47抗体は、ヒト CD47遺伝子を導入した L1210細胞、 MOLT4細胞、 JOK-1細胞に著しい細胞死を誘導した。また、ヒト白血病マウスモデルを用いて試験した結果、本発明のヒト化抗 CD47抗体は抗腫瘍効果を示すことが確認された。

[0072] 本発明のヒトイ匕抗 CD47抗体は、 whole IgGに比べて組織、腫瘍への移行性に優れており、さらに赤血球の凝集という副作用が顕著に低減されたか又は生じないため、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人 T細胞白血病、多発'性骨髄腫、 Mixed Leukemia, Hairy cell Leukemia 等の白血病、悪性リンパ腫 (Hodgkin病、非 Hodgkinリンパ腫)、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、真性多血症などの血液疾患の治療薬としての利用が期待される。また、 RI標識による造影剤としての利用も期待され、 RI化合物やトキシンと結合させることにより、効力を増強させることも可能である。

[0073] 本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。

実施例

[0074] 実施例 1：ヒト化 MABL-2抗体の構築

マウスモノクローナル抗体の CDRがヒト抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体の FRとヒト抗体の FRとの間に高、相同性が存在することが望ましい。従って、マウス MABL-2抗体 (WO00/53634)の L鎖および H 鎖の V領域を、 Protein Data Bankを用いて構造が解明されている既知の天然ヒト抗体の V領域と比較した。

[0075] (1)ヒト化抗体 H鎖の構築

( 1次デザイン

マウス MABL-2抗体の H鎖 V領域と 4クローンが 75.9%の相同性を示した。このうち、 CDR近辺のアミノ酸は抗原結合に大きく関与している可能性があるため、 CDR1の直前の 30位が保存されているヒト抗体 AF216824 (Miklos J.A.ら、 Blood,95, 3878-3884, 2000)由来の FRを用いることとした。ヒト化 MABL-2抗体 H鎖（バージョン" 1.Γ)において、 FR1力 FR4まではヒト抗体 AF216824の FR1力 FR4と同一であり、そして CDR はマウス MABL- 2抗体の H鎖 V領域中の CDRと同一とした。 AF216824には Leader配列の情報がなかったため、 Leader配列はマウス MABL-2 Vのものを用いた。

H

[0076] ヒト化 MABL- 2抗体 H鎖（バージョン" 1.Γ)を PCR法による CDRグラフティングにより作製した。ヒトイ匕 MABL- 2抗体 H鎖（バージョン" 1.Γ)の作製のために 4個の合成オリゴ DNAを使用した。合成オリゴ DNA、 HuMHalS (配列番号 1)及び HuMHa3S (配列番号 2)はセンス DNA配列を有し、 HuMHa2AS (配列番号 3)及び HuMHa4AS (配列番号 4)はアンチセンス DNA配列を有する。外部プライマー HuMHS (配列番号 5)及び HuMHAS (配列番号 6)は合成オリゴ DNA、 HuMHalS及び HuMHa4ASとホモロジ一を有する。 [0077] PCRは、 KOD -Plus- (東洋紡社）を用い、 100 mLの反応混合液に合成オリゴ DNA HuMHalS、 HuMHa2AS、 HuMHa3Sおよび HuMHa4ASをそれぞれ 5 pmol、 0.2 mmol/Lの dNTP並びに 2 Uの KOD -Plus-を含む条件で、添付緩衝液を使用して 94 °Cにて 15秒間、 50°Cにて 30秒間、 68°Cにて 1分間の温度サイクルで 5回行った。さらに 40 pmolの外部プライマー HuMHS及び HuMHASをカ卩え、同じ温度サイクルを 35回行った。 PCR法により増幅した DNA断片を 1.2%ァガロースを用いたァガロースゲル電気泳動により分離した。

[0078] 438 bp長の DNA断片を含有するァガロース片を切取り、 QIAquick PCR Purification

Kit (QIAGEN)を用い、キット添付の処方に従い DNA断片を精製した。精製した DN Aをエタノールで沈殿させた後、 10 mmol Tris- HCl (pH7.4) , 1 mmol/L EDTA溶液 50 μ Lに溶解した。得られた PCR反応混合物を、 BamHIおよび Hindlllで消化することにより調製した HEF発現ベクター HEF-VH-g y 1にサブクローユングし、塩基配列を決定した。正ヽ H鎖 V領域のアミノ酸配列を有する DNA断片を含むプラスミドを HEF-huM2H 1.1#1と命名した。本プラスミド HEF- huM2Hl .1#1に含まれる H鎖 V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号 7に示す。

[0079] ヒト化 MABL- 2抗体 H鎖 V領域の各バージョン 1.2, 1.3, 1.4, 1.5を以下のようにして作製した。

[0080] バージョン 1.2は変異原プライマーとして 72位のアルギニンがセリンに変異するように設計した HuMHbS (配列番号 8)および HuMHbAS (配列番号 9)を用い、プラスミド HEF- huM2Hl.l#lを铸型 DNAとして、 PCR法により増幅し、プラスミド

HEF- huM2H1.2#lを得た。本プラスミド HEF- huM2H1.2#lに含まれる H鎖 V領域のァミノ酸配列および塩基配列を配列番号 10に示す。

[0081] バージョン 1.3は変異原プライマーとして 30位のァラニンがトレォニンに変異するように設計した HuMHcS (配列番号 11)および HuMHcAS (配列番号 12)を用い、プラスミド HEF- huM2H1.2#lを铸型 DNAとして、 PCR法により増幅し、プラスミド

HEF- huM2H1.3#2を得た。本プラスミド HEF- huM2H1.3#2に含まれる H鎖 V領域のァミノ酸配列および塩基配列を配列番号 13に示す。

[0082] バージョン 1.4は変異原プライマーとして 67位のアルギニンがリジンに変異するように設計した HuMHdS (配列番号 14)および HuMHdAS (配列番号 15)を用い、プラスミド HEF- huM2H1.2#lを铸型 DNAとして、 PCR法により増幅し、プラスミド

HEF- huM2H1.4#lを得た。本プラスミド HEF- huM2H1.4#lに含まれる H鎖 V領域のァミノ酸配列および塩基配列を配列番号 16に示す。

[0083] バージョン 1.5は変異原プライマーとして 70位のメチォニンがロイシンに変異するように設計した HuMHeS (配列番号 17)および HuMHeAS (配列番号 18)を用い、プラスミド HEF- huM2H1.2#lを铸型 DNAとして、 PCR法により増幅し、プラスミド

HEF- huM2H1.5#lを得た。本プラスミド HEF- huM2H1.5#lに含まれる H鎖 V領域のァミノ酸配列および塩基配列を配列番号 19に示す。

[0084] (ii) 2次デザイン

ヒト化 MABL- 2抗体 H鎖バージョン" 1.3〃について、 72位のアミノ酸の保存および FR2のできる限りの保存を考慮し、再度相同性を検索した。このうち、 72位が保存されているヒト抗体 HUMIGHDJCD (Chai S. K.ら、 Unpublished 1994)由来の FRを用いることとした。ヒト化 MABL- 2抗体 H鎖バージョン" 2.Γにおいて、 FR1力も FR4まではヒト抗体 HUMIGHDJCDの FR1から FR4と同一であり、そして CDRはマウス MABL- 2抗体の H 鎖 V領域中の CDRと同一とした。 HUMIGHDJCDにも Leader配列の情報がなかったため、 Leader配列はマウス MABL- 2 Vのものを用いた。

H

[0085] ヒト化 MABL- 2抗体 H鎖バージョン" 2.1"はバージョン" 1.3"の 89位のァスパラギン酸をァスパラギンに変異させたバージョン 2.0を铸型 DNAとして用いた。

[0086] まず、バージョン 2.0はバージョン" 1.3"の 89位のグルタミン酸をァスパラギン酸に変異するように設計した HuMHgS (配列番号 20)および HuMHgAS (配列番号 21)を用い、プラスミド HEF-huM2H1.3#2を铸型 DNAとして、 PCR法により増幅し、プラスミド HEF-huM2H2.0#lを得た。本プラスミド HEF-huM2H2.0#lに含まれる H鎖 V領域のァミノ酸配列および塩基配列を配列番号 22に示す。

[0087] ヒト化 MABL- 2抗体 H鎖（バージョン" 2.Γ)を PCR法による CDRグラフティングにより作製した。ヒトイ匕 MABL-2抗体 H鎖（バージョン" 2.Γ)の作製のために 8個の合成オリゴ DNA (PCRプライマー）を使用した。合成オリゴ DNA、 HuMHS (配列番号 5)、 HuMHlSl (配列番号 23)、 HuMHlS2 (配列番号 24)、及び HuMHS3 (配列番号 25)はセンス DNA配列を有し、 HuMHfASl (配列番号 26)、 HuMHfAS2 (配列番号 27)、 HuMHfAS3 (配列番号 28)、及び HuMHfAS (配列番号 29)はアンチセンス DNA配列を有する。

[0088] 第一 PCR段階では次の PCRプライマーの組み合わせにて、 HEF-huM2H2.0#lを铸型 DNAとして用いた。 4つの反応 HuMHS/HuMHfASl、 HuMHlSl/HuMHfAS2, HuMHlS2/HuMHfAS, HuMHS3/HuMHfAS3を行い、各 PCR生成物を精製した。各生成物 huM2H2.1- 1、 huM2H2.1- 2、 huM2H2.1- 3、 huM2H2.1- 4を、

huM2H2.1-l/huM2H2.1-2, huM2H2.1-3/huM2H2.1-4の組み合わせで混合し、それぞれそれら自体の相補性によりアッセンプリさせ、第二 PCRを行った。 PCRプライマ一はそれぞれ HuMHS/HuMHfAS2、 HuMI~HS2/HuMHfAS3を用いて行い、各 PCR生成物を精製した。更に、第二 PCRからの 2つの PCR生成物をそれぞれそれら自体の相補性によりアッセンブリさせ、 PCRプライマー HuMHSと HuMHfAS3をカ卩えて、ヒトイ匕 MABL-2抗体 H鎖（バージョン" 2. Γ)をコードする全長 DNAを増幅した（第三 PCR)。

[0089] 第一 PCR段階にぉ、て、 50 mLの反応混合液に各 PCRプライマーをそれぞれ 20 pmol、 0.2 mmol/Lの dNTP、 1 mmol/L MgSO、 5 ngの铸型 DNA並びに 1 Uの KOD

4

-Plus-を含む条件で、添付緩衝液を使用して 94°Cにて 15秒間、 50°Cにて 30秒間、 68°Cにて 1分間の温度サイクルで 35回行い、次に 68°Cで 7分間インキュベートした。 PCR生成物を QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)を用い、キット添付の処方に従い DNA断片を精製した。第二 PCRにおいては 1 mLの各第一 PCR生成物および 2 Uの KOD -Plus-を含有する 100 mLの反応混合液を 94°Cにて 15秒間、 50°Cにて 30秒間、 68°Cにて 1分間の温度サイクルで 5回インキュベートし、 68°Cで 5分間インキュべートした後、各 PCRプライマーを 40 pmolずつ添カ卩した。続いて、第一 PCRと同一の条件にて 35回の PCRを行い、 PCR生成物を 1.2%ァガロースゲル電気泳動により分離精製した。第三 PCRは第二 PCR生成物と各 PCRプライマーとを用いて、第二 PCRと同一の方法にて行った。

[0090] 第三 PCRにより生じた 438 bpの DNA断片を 1.2%ァガロースゲル電気泳動により分離精製した。精製した DNAを BamHIおよび Hindlllで消化することにより調製した HEF 発現ベクター HEF-VH-g y 1にサブクローユングし、塩基配列を決定した。正しい H鎖 V領域のアミノ酸配列を有する DNA断片を含むプラスミドを HEF-huM2H2.1#3と命名した。本プラスミド HEF-huM2H2.1#3に含まれる H鎖 V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号 30に示す。

[0091] (2)ヒト化 MABL-2抗体 L鎖の構築

( 1次デザイン

マウス MABL-2抗体の L鎖 V領域と 2クローン力 3.8%の相同性を示した。このうち、 CDR3のサイズが等しいヒト抗体 HSJCllVJ (Kennedy M.A.、 J. Exp. Med, 173 (4), 1033-1036, 1991)由来の FRを用いることとした。ヒト化 MABL-2抗体 L鎖（バージョン "1.1")において、 FR1力 FR4まではヒト抗体 HSJC11VJの FR1力 FR4と同一であり、そして CDRはマウス MABL- 2抗体の L鎖 V領域中の CDRと同一とした。 Leader配列はヒト抗体 HSJC11VJのものを用いた。

[0092] ヒト化 MABL- 2抗体 L鎖（バージョン" 1.Γ)を PCR法による CDRグラフティングにより作製した。ヒトイ匕 MABL- 2抗体 L鎖（バージョン" 1.Γ)の作製のために 4個の合成オリゴ DNAを使用した。合成オリゴ DNA、 HuMLalS (配列番号 31)及び HuMLa3S (配列番号 32)はセンス DNA配列を有し、 HuMLa2AS (配列番号 33)及び HuMLa4AS (配列番号 34)はアンチセンス DNA配列を有する。外部プライマー HuMLS (配列番号 35) 及び HuMLAS (配列番号 36)は合成オリゴ DNA、 HuMLalS及び HuMLa4ASとホモロジ一を有する。

[0093] PCRは、 KOD -Plus- (東洋紡社）を用い、 100 mLの反応混合液に合成オリゴ DNA HuMLalSゝ HuMLa2ASゝ HuMLa3Sおよび HuMLa4ASをそれぞれ 5 pmol、 0.2 mmol/L の dNTP並びに 2 Uの KOD -Plus-を含む条件で、添付緩衝液を使用して 94°Cにて 15秒間、 50°Cにて 30秒間、 68°Cにて 1分間の温度サイクルで 5回行った。さらに 40 pmolの外部プライマー HuMLS及び HuMLASを加え、同じ温度サイクルを 35回行った。 PCR法により増幅した DNA断片を 1.2%ァガロースを用いたァガロースゲル電気泳動により分離した。

[0094] 426 bp長の DNA断片を含有するァガロース片を切取り、 QIAquick PCR Purification

Kit (QIAGEN)を用い、キット添付の処方に従い DNA断片を精製した。精製した DN Aをエタノールで沈殿させた後、 10 mmol Tris- HCl (pH7.4) , 1 mmol/L EDTA溶液 50 mLに溶解した。得られた PCR反応混合物を、 BamHIおよび Hindlllで消化することにより調製した HEF発現ベクター HEF-VL-g κ 1 (W092/19759)にサブクローユングし、塩基配列を決定した。正しい L鎖 V領域のアミノ酸配列を有する DNA断片を含むプラスミドを HEF- huM2Ll .1#3と命名した。本プラスミド HEF- huM2Ll .1#3に含まれる L 鎖 V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号 37に示す。

[0095] ヒト化 MABL-2抗体 L鎖 V領域の各バージョン 1.2, 1.3, 1.4, 1.5を以下のようにして作製した。

[0096] バージョン 1.2は変異原プライマーとして 51位のアルギニンがロイシンに変異するように設計した HuMLbS (配列番号 38)および HuMLbAS (配列番号 39)を用い、プラスミド HEF- huM2Ll . l#3を铸型 DNAとして、 PCR法により増幅し、プラスミド

HEF- huM2L1.2#lを得た。本プラスミド HEF- huM2L1.2#lに含まれる L鎖 V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号 40に示す。

[0097] バージョン 1.3は変異原プライマーとして 92位のチロシンがフエ-ルァラニンに変異するように設計した HuMLcS (配列番号 41)および HuMLcAS (配列番号 42)を用い、プラスミド HEF- huM2Ll . l#3を铸型 DNAとして、 PCR法により増幅し、プラスミド

HEF- huM2L1.3#lを得た。本プラスミド HEF- huM2L1.3#lに含まれる L鎖 V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号 43に示す。

[0098] バージョン 1.4は変異原プライマーとして 41位のフエ-ルァラニンがチロシンに変異するように設計した HuMLdS (配列番号 44)および HuMLdAS (配列番号 45)を用い、プラスミド HEF- huM2Ll . l#3を铸型 DNAとして、 PCR法により増幅し、プラスミド

HEF- huM2L1.4#lを得た。本プラスミド HEF- huM2L1.4#lに含まれる L鎖 V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号 46に示す。

[0099] バージョン 1.5は変異原プライマーとして 42位のグルタミンがロイシンに変異するように設計した HuMLeS (配列番号 47)および HuMLeAS (配列番号 48)を用い、プラスミド HEF-huM2Ll . l#3を铸型 DNAとして、 PCR法により増幅し、プラスミド

HEF- huM2L1.5#lを得た。本プラスミド HEF- huM2L1.5#lに含まれる L鎖 V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号 49に示す。

[0100] (ii) 2次デザインヒト化 MABL- 2抗体 L鎖につ!、て、 FR2の WYLQ- PGQSP- - LIYと!、う配列の保存を考慮し、再度相同性を検索した。このうち、相同性の最も高力つたヒト抗体 1802359A( Pascual V.ら、 J. Immunol, 146(12), 4385-4391, 1991)由来の FRを用いることとした。ヒト化 huM2抗体 L鎖バージョン〃 2.Γにおいて、 FR1力 FR4まではヒト抗体 1802359A の FR1から FR4と同一であり、そして CDRはマウス MABL-2抗体の L鎖 V領域中の CDR と同一とした。 1802359Aの Leader配列の情報はなかったため、 1次デザインで用いたヒト抗体 HSJC11VJのものを用いた。

[0101] ヒト化 MABL-2抗体 L鎖バージョン" 2.1"はバージョン" 1.1"の FR2のみをヒト抗体

1802359Aの FR2へ置換したバージョン 2.0を铸型 DNAとして用いた。

[0102] まず、バージョン 2.0は変異原プライマーとしてヒト化 MABL-2抗体 L鎖バージョン

〃1.1"の FR2がヒト抗体 1802359Aの FR2に変異するように設計した HuMUS (配列番号 50)および HuMLfAS (配列番号 51)を用い、プラスミド HEF-huM2Ll.l#3を铸型 DNA として、 PCR法により増幅し、プラスミド HEF-huM2L2.0#lを得た。本プラスミド

HEF_huM2L2.0#lに含まれる L鎖 V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号 52に示す。

[0103] 次にヒト化 MABL-2抗体 L鎖バージョン" 2.Γを PCR法による CDRグラフティングにより作製した。ヒトイ匕 MABL-2抗体 H鎖（バージョン" 2.Γ)の作製のために 6個の合成ォリゴ DNA(PCRプライマー）を使用した。合成オリゴ DNA、 HuMLS (配列番号 35)、 HuMLgSO (配列番号 53)、 HuMLgS (配列番号 54)はセンス DNA配列を有し、 HuMLAS (配列番号 36)、 HuMLgASO (配列番号 55)、 HuMLgAS (配列番号 56)はァンチセンス DNA配列を有する。

[0104] 第一 PCR段階では次の PCRプライマーの組み合わせにて、 HEF-huM2L2.0#lを铸型 DNAとして用いた。 HuMLS/HuMLgASO、 HuMLgSO/HuMLgAS,

HuMLgS/HuMLASにて PCRを行い、各 PCR生成物を精製した。各生成物

huM2L2.1-l、 huM2L2.1-2、 huM2L2.1-3をそれぞれそれら自体の相補性によりアツセンブリさせ、 PCRプライマー HuMLSと HuMLASをカ卩えて、ヒト化 MABL- 2抗体 L鎖（バ一ジョン" 2.Γ)をコードする全長 DNAを増幅した（第二 PCR)。

[0105] 第一 PCR段階にぉ、て、 50 mLの反応混合液に各 PCRプライマーをそれぞれ 20 pmol、 0.2 mmol/Lの dNTP、 1 mmol/L MgSO

4、 5 ngの铸型 DNA並びに 1 Uの KOD

-Plus-を含む条件で、添付緩衝液を使用して 94°Cにて 15秒間、 50°Cにて 30秒間、 68°Cにて 1分間の温度サイクルで 35回行い、次に 68°Cで 7分間インキュベートした。 PCR生成物を QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)を用い、キット添付の処方に従い DNA断片を精製した。第二 PCRにおいては 1 mLの各第一 PCR生成物および 2 Uの KOD -Plus-を含有する 100 mLの反応混合液を 94°Cにて 15秒間、 50°Cにて 30秒間、 68°Cにて 1分間の温度サイクルで 5回インキュベートし、 68°Cで 5分間インキュべートした後、各 PCRプライマーを 40 pmolずつ添カ卩した。続いて、第一 PCRと同一の条件にて 35回の PCRを行い、 PCR生成物（426 bp)を 1.2%ァガロースゲル電気泳動により分離精製した。

[0106] 精製した DNAを BamHIおよび Hindlllで消化することにより調製した HEF発現べクタ一 HEF-VL-g K 1にサブクローユングし、塩基配列を決定した。正しい L鎖 V領域のァミノ酸配列を有する DNA断片を含むプラスミドを HEF_huM2L2.1#lと命名した。本プラスミド HEF_huM2L2.1#lに含まれる L鎖 V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号 57に示す。

[0107] (3) COS-7細胞へのトランスフエクシヨン

ヒト化抗体の各鎖の抗原結合活性を評価するため、前記発現プラスミドと陽性対照としてキメラ MABL-2抗体を COS-7細胞で一過性に発現させた。すなわち H鎖の一過性発現では、ヒト化 MABL- 2抗体 H鎖発現ベクター (HEF-huM2Hl.l#l,

HEF-huM2H1.2#l, HEF-huM2H1.3#2, HEF-huM2H1.4#l, HEF-huM2H1.5#l, HEF-huM2H2.1#3)とキメラ L鎖発現ベクター HEF- M2L3 (WO00/53634)との組み合わせを、 L鎖の一過性発現では、ヒトイ匕 MABL-2抗体 L鎖発現ベクター（

HEF-huM2Ll.l#3, HEF-huM2L1.2#l, HEF-huM2L1.3#l, HEF-huM2L1.4#l, HEF— huM2L1.5#l、 HEF-huM2L2.1#l)とキメラ H鎖 HEF— M2H3 (WO00/53634)との糸且み合わせを、それぞれ Fugene 6 Transfection Reagent (ロシュ'ダイァグノスティックス）を用いて COS-7細胞に同時形質導入した。 1.5 X 10⁵細胞を 10%のゥシ胎児血清（ GIBCO)を含む DMEM培養液（GIBCO) 2 mLにてー晚培養した。そこへ室温で 1時間反応させた、各プラスミド 2 mgずっと Fugene 6 Transfection Reagent 6 mLを含む総量 100 mLの DMEM培養液を添カ卩した。 37°C、 5%COの条件下でー晚培養した後、

2

1% HT supplement (GIBCO)を含む CHO-S-SFMII培地（GIBCO) 2 mLへ培地交換を行った。 37°C、 5%COの条件下で 72時間培養した後、培養上清を集め、遠心分離に

2

より細胞破片を除去し、 ELISAの試料に供した。

[0108] キメラ MABL- 2抗体の一過性発現では、キメラ H鎖 HEF- M2H3とキメラ L鎖

HEF-M2L3を用いて、前記の場合と同様の方法により COS-7細胞にトランスフエクシヨンし、得られた培養上清を ELISAに供した。

[0109] また、ヒト化 MABL-2抗体を評価するため、ヒト化 huM2抗体 H鎖発現ベクター

HEF- huM2H2.1#3とヒト化 MABL- 2抗体 L鎖発現ベクター HEF- huM2L 2.1#1との組み合わせを用いて、前記の場合と同様の方法により COS-7細胞にトランスフエクションし、得られた培養上清を ELISAに供した。

[0110] (4)抗体濃度の測定

得られた抗体の濃度測定は ELISAにより行った。 ELISA用 96穴プレート（Maxsorp,

NUNC)の各穴を固相化バッファー（0.1 mol/L NaHCO , 0.02% NaN )で 2 mg/mLの

3 3

濃度に調製したマウス抗ヒト Kappa Light Chain (Zymed) 100 mLで固相化し、 300 mLの希釈バッファー（50 mmol/L Tris— HC1、 1 mmol/L MgCl 、 0.15 mol/L NaCl、

2

0.05% Tween20、 0.02% NaN 、 1%牛血清アルブミン（BSA)、 pH8.1)でブロッキングの

3

後、キメラ抗体またはヒト化抗体を発現させた COS-7細胞の培養上清を段階希釈して各穴に 100 mLずつ加えた。 1時間室温にてインキュベートし洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ャギ抗ヒト IgG抗体 (Zymed) 100 mLを加えた。室温にてインキュベートし洗浄の後、 1 mg/mLの基質溶液（Sigmal04、 p—-トロフエ-ルリン酸、 SIGMA)をカロえ、次に 405 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Bio- Rad)で測定した。濃度測定のスタンダードとして、ヒト IgGl, kappa (SIGMA)を用いた。

[0111] (5)ヒト化抗体の活性測定

ヒト化抗体は下記の抗原結合活性および結合阻害活性にて評価を行った。

[0112] (i)抗原結合活性の測定

抗原結合活性測定のための ELISAプレートを、次のようにして調製した。 ELISA用 96 穴プレートの各穴を固相化バッファーで 3 μ g/mLの濃度に調製した抗 FLAG抗体（ SIGMA) 100 Lで固相化した。 300 Lの希釈バッファーでブロッキングの後、 1 μ g/mLの濃度に調製した FLAG標識可溶型ヒト CD47 (WO00/53634)を 100 μ L加え、室温で 1時間インキュベーションした。洗浄後、キメラ抗体またはヒト化抗体を発現させた COS-7細胞の培養上清を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキュベートし洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ャギ抗ヒ HgG抗体 (Zymed) lOO Lを加えた。室温にてインキュベートし洗浄の後、 1 mg/mLの基質溶液（Sigmal04、 p—-トロフエ二ルリン酸、 SIGMA)をカ卩え、次に 405 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ Bio-Rad)で測定した。

[0113] (ii)結合阻害活性の測定

結合阻害活性測定のためのプレートは以下のようにして調製した。抗原結合活性と同様、 ELISA用 96穴プレートの各穴を固相化バッファーで 3 μ g/mLの濃度に調製した抗 FLAG抗体（SIGMA) 100 Lで固相化した。 300 Lの希釈バッファーでブロッキングの後、 1 /^/½しの濃度に調製した1^\0標識可溶型ヒトじ047 (\^000/53634) を 100 /z Lカロえ、室温で 1時間インキュベーションした。洗浄後、キメラ抗体またはヒト化抗体を発現させた COS-7細胞の培養上清を段階希釈したものと 0.6 μ g/mLのビォチン標識 MABL-2を等量混合した溶液を 100 μ Lずつ加えた。室温にてインキュべートし洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン (Zymed) 100 Lを加えた。室温にてインキュベートし洗浄の後、 1 mg/mLの基質溶液（Sigmal04、 p—-トロフエ-ルリン酸、 SIGMA)を加え、次に 405 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ Bio-Rad)で測定した。

[0114] (6)活性確認

(0ヒト化 H鎖の評価

ヒト化 H鎖バージョン 1.1、 1.2、 1.3とキメラ L鎖を組み合わせた抗体は、キメラ抗体と同程度のヒト CD47結合活性を示した（図 1)。しかし、 MABL-2による結合阻害活性ではバージョン 1.1の阻害活性はバージョン 1.2、 1.3に比べて弱かった。また、バージョン 1.3はキメラ抗体とほぼ同等の阻害活性を持ち、バージョン 1.2と同等もしくは若干強い阻害活性を示した（図 2)。この結果は、 72位のアミノ酸残基の保存が重要であり、 30位のアミノ酸残基はトレオニン (バージョン 1.3)でも良、ことを示す。 [0115] さらなる活性の上昇を考慮し、新たに H鎖バージョン 1.4、 1.5を作製した。 H鎖バージョン 1.4、 1.5とキメラ L鎖を組み合わせた抗体の結合活性はキメラ抗体およびパージヨン 1.3と同等であった（図 3)力阻害活性はより弱力つた（図 4)。この結果は 67位、 70 位のアミノ酸残基は保存すべきであることを示唆する。

[0116] バージョン 1.1一 1.5の結果を踏まえて二次デザインを行い、バージョン 2.1を作製した。バージョン 2.1は MABL-2による結合阻害活性ではキメラ抗体とほぼ同等であった (図 5)。この結果より、ヒトイ匕 H鎖はバージョン 2.1で十分であることが示唆された。

[0117] (ii)ヒト化 L鎖の評価

ヒト化 L鎖バージョン 1.1、 1.2、 1.3とキメラ H鎖を組み合わせた抗体は三種ともほぼ同等のヒト CD47に対する結合活性を示したが、キメラ抗体より弱い活性を示した（図 6)。さらに、 MABL-2による結合阻害活性では三種いずれもキメラ抗体に比べて弱力つた (図 7)。この結果は、 51位、 92位のアミノ酸残基は特に重要ではなぐ他に置換すベきアミノ酸残基が存在することを示唆する。

[0118] L鎖の FR2は H鎖との interfaceにあたる（Chothia C.ら、 J. Mol. Biol. 186, 651-663, 1985)ことから、 FR2の CDR近傍のアミノ酸を調べた。バージョン 1.4はほぼキメラ抗体と同様な結合活性を示した。バージョン 1.5は 1.4より弱力つた力 1.はり強力つた。 ( 図 8)。結合阻害活性についてもバージョン 1.4は 1.はりも大幅に改善し、阻害活性がキメラ抗体に近づいた（図 9)。バージョン 1.5はキメラ抗体よりは明らかに弱いが、 1.1 に比べるとやや改善していた（図 9)。この結果はやはり FR2は重要であり、特に 41位、 42位近傍のアミノ酸残基が活性の向上に必須であることが示唆された。

[0119] バージョン 1.1一 1.5の結果を踏まえて二次デザインを行い、バージョン 2.1を作製した。ヒト化 L鎖バージョン 2.1とキメラ H鎖を組み合わせた抗体は、キメラ抗体と同程度の MABL-2による結合阻害活性を示した（図 10)。この結果より、ヒト化 L鎖はバージョン 2.1で十分であることが示唆された。

[0120] (iii)ヒト化 MABL- 2抗体の評価

ヒト化 H鎖バージョン 2.1とヒト化 L鎖バージョン 2.1を組み合わせた抗体は、キメラ抗体と同程度もしくはそれ以上の MABL-2による結合阻害活性、すなわち hCD47に対する親和性を示した（図 11)。これより、 FRに関して H鎖、 L鎖とも単一の天然ヒト抗体の配列を持つ、ヒトイ匕 MABL-2抗体の構築ができた。

実施例 2：ヒト化 MABL-1抗体の構築

マウス MABL- 1抗体（WO00/53634)についてもヒト化を行った。マウス MABL- 1抗体とマウス MABL-2抗体における CDRのアミノ酸配列は H鎖で 3残基、 L鎖で 4残基異なるのみである。これより、マウス MABL-1抗体のヒト化抗体の構築は〔実施例 1〕に示したマウス MABL- 2抗体の二次デザイン（huM2Hバージョン 2.1、 huM2L2.1バージョン 2.1)をもとに構築することとした。

[0121] (1)ヒト化 MABL-1抗体 H鎖の構築

ヒト化 MABL-1抗体 H鎖バージョン〃 2.1"の作製のために 8個の合成オリゴ DNAを使用した。合成オリゴ DNA、 HuMHS (配列番号 5)、 M1CH1MS (配列番号 58)、 M1CH2GS (配列番号 59)、 M1CH3SS (配列番号 60)はセンス DNA配列を有し、 M1CH1MAS (配列番号 61)、 M1CH2GAS (配列番号 62)、 M1CH3SAS (配列番号 63) 、 HuMHAS (配列番号 6)はアンチセンス DNA配列を有する。

[0122] 第一 PCR段階では次の PCRプライマーの組み合わせにて、 HEF-huM2H2.1#3を铸型 DNAとして用いた。 4つの反応 HUMHS/M1CH1MAS、 M1CH1MS/M1CH2GAS, M1CH2GS/M1CH3SAS, MlCH3SS/HuMHASを行い、各 PCR生成物を精製した。各生成物をそれぞれそれら自体の相補性によりアッセンプリさせ、 PCRプライマー HuMHSと HuMHASをカ卩えて、ヒト化 MABL- 1抗体 H鎖バージョン" 2.1〃をコードする全長 DNAを増幅した (第二 PCR)。実施例 1と同様に行い、 HEF発現ベクター

HEF-VL-gglにサブクローユングし、塩基配列を決定した。正しい H鎖 V領域のァミノ酸配列を有する DNA断片を含むプラスミドを HEF-huMlH2.1#lと命名した。本プラスミド HEF-huMlH2.1#1に含まれる H鎖 V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号 64に示す。

[0123] (2)ヒト化 MABL-1抗体 L鎖の構築

ヒト化 MABL-1抗体 L鎖バージョン〃 2.1"の作製のために 4個の合成オリゴ DNAを使用した。合成オリゴ DNA、 HuMLS (配列番号 5)、 MlCLlaS (配列番号 65)はセンス D NA配列を有し、 MlCLlaAS (配列番号 66)、 HuMLAS (配列番号 6)はアンチセンス D NA配列を有する。 [0124] 第一 PCR段階では次の PCRプライマーの組み合わせにて、 HEF-huM2L2.1#lを铸型 DNAとして用いた。 HuMHS/MlCLlaAS、 MlCLlaS/HuMLASにて PCRを行い、各 PCR生成物を精製した。各生成物をそれぞれそれら自体の相補性によりアッセンプリさせ、 PCRプライマー HuMLSと HuMLASをカ卩えて、ヒト化 MABL- 1抗体 L鎖バージョン "2.1"をコードする全長 DNAを増幅した (第二 PCR)。実施例 1と同様に行い、 HEF発現ベクター HEF-VL-g K 1にサブクローユングし、塩基配列を決定した。正しい L鎖 V 領域のアミノ酸配列を有する DNA断片を含むプラスミドを HEF_huMlL2.1#lと命名した。本プラスミド HEF-huMlL2.1#lに含まれる L鎖 V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号 67に示す。

[0125] (3)ヒト化 MABL-1抗体の発現

ヒト化 MABL-1抗体 H鎖発現ベクター HEF-huMlL2.1#lとヒト化 MABL-1抗体 L鎖発現ベクター HEF- huMlL2.1#lを用いて、上記 COS-7細胞へのトランスフエクシヨンの方法に従ってヒト化 MABL-1抗体を調製した。また、抗体濃度の測定、抗体の活性測定も実施例 1に示した方法に従って行った。

[0126] (4)ヒト化 MABL- 1抗体の活性確認

ヒト化 H鎖バージョン 2.1とヒト化 L鎖バージョン 2.1を組み合わせた抗体は、キメラ抗体と同程度もしくはそれ以上の MABL-1による結合阻害活性、すなわち hCD47に対する親和性を示した（図 12)。これより、 FRに関して H鎖、 L鎖とも単一の天然ヒト抗体の配列を持つ、ヒトイ匕 MABL-1抗体の構築ができた。

実施例 3：ヒトイ匕 MABL-1抗体、ヒトイ匕 MABL-2抗体のアポトーシス誘起効果ヒト CD47遺伝子を導入した L1210細胞を用い、ヒト化 MABL-1抗体、ヒト化 MABL-2 抗体のアポトーシス誘起作用を Annexin-V (ロシュ'ダイァグノステイタス)染色により検討した。細胞 1 X 10⁵個に、各ヒト抗体発現 COS-7細胞培養上清を抗体濃度として 300 ng/mL, 100 ng/mL, 33.3 ng/mLずつ添カ卩し、 24時間培養した。その後、 Annexin- V 染色を行い、 FACScan装置（BECTON DICKINSON)にて蛍光強度を測定した。その結果、ヒト CD47遺伝子を導入した L1210細胞に著しい細胞死を誘導した（図 13)。実施例 4:ヒトイ匕 MABL-1抗体及びヒトイ匕 MABL-2抗体由来一本鎖 Fvの作製

(1)ヒト化 MABL- 2抗体一本鎖 Fv(HL5)の作製 5 merのペプチドリンカ一を有し、 N末端より [H鎖] [L鎖]の順となるように V領域を連結したヒト化 MABL-2抗体一本鎖 Fv(HL5)を次の様にして作製した。ヒトイ匕 MABL-2抗体 H鎖 V領域、及びヒト化 MABL-2抗体 L鎖 V領域をそれぞれ PCR法にて増幅し、連結することにより、ヒトイ匕 MABL-2抗体 HL5を作製した。ヒトイ匕 MABL-2抗体 HL5の作製のために 4個の PCRプライマー（A— D)を使用した。プライマー A、 C はセンス配列を有し、プライマー B、 Dはアンチセンス配列を有する。

[0127] H鎖 V領域のための前方プライマー Sa卜 huHS (プライマー A、配列番号 68)は、 H鎖 V領域の N末端をコードする DNAにハイブリダィズし且つ Sail制限酵素認識部位を有するように設計した。 H鎖 V領域のための後方プライマー huMHAS-A (プライマー B 、配列番号 69)は、 H鎖 V領域の C末端をコードする DNAにハイブリダィズし且つリンカーとオーバーラップするように設計した。

[0128] L鎖 V領域のための前方プライマー X5-huLgS (プライマー C、配列番号 70)は、 H鎖 V領域の C末端をコードする DNAにハイブリダィズし、 Gly Gly Gly Gly Ser (配列番号 72)力なる 5merリンカ一領域をコードする DNA配列を含み、且つ L鎖 V領域の N末端をコードする DNAにオーバーラップするように設計した。 L鎖 V領域のための後方プライマー NothuLAS (プライマー D、配列番号： 71)は、 L鎖 V領域の C末端をコードする DNAにハイブリダィズし 2個の転写停止コドン及び Notl制限酵素認識部位を有するように設計した。

[0129] 第一 PCR段階において A/B、 C/Dのプライマーの組み合わせにて 2つの反応を行い、各 PCR生成物（huM2Db-lおよび huM2Db-2)を精製した。第一 PCRから得られた 2つの PCR生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブルさせ、プライマー A及び Dを加えて、ヒト化 MABL-2抗体 HL5をコードする全長 DNAを増幅した（第二 PCR ) oなお、第一 PCRにおいては、ヒトイ匕 MABL-2抗体 H鎖 V領域をコードするプラスミド HEF-huM2H2.1#3 (実施例 1を参照）、及びヒト化 MABL-2抗体 L鎖 V領域をコードするプラスミド HEF-huM2L2.1#l (実施例 1を参照）をそれぞれ铸型として用いた。

[0130] 第一 PCR段階にぉ、て、 50 mLの反応混合液に各 PCRプライマーをそれぞれ 20 pmol、 0.2 mmol/Lの dNTP、 1 mmol/L MgSO

4、 5 ngの铸型 DNA並びに 1 Uの KOD

-Plus-を含む条件で、添付緩衝液を使用して 94°Cにて 15秒間、 50°Cにて 30秒間、 68°Cにて 1分間の温度サイクルで 35回行い、次に 68°Cで 7分間インキュベートした。

[0131] PCR生成物 A— B (huM2Db-l)及び C D (huM2Db- 2)を 1.2%ァガロースゲル電気泳動により分離精製し、第二 PCRでアッセンブルした。第二 PCRにおいて、铸型として lmLの huM2Db- 1及び lmLの huM2Db- 2、 2 Uの KOD -Plus-を含有する 100 mLの反応混合液を 94°Cにて 15秒間、 50°Cにて 30秒間、 68°Cにて 1分間の温度サイクルで 5回インキュベートし、 68°Cで 5分間インキュベートした後、各 PCRプライマーを 40 pmol ずつ添カ卩した。続いて、第一 PCRと同一の条件にて 35回の PCRを行い、 PCR生成物を QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 Sail及び Notlで消化し、得られた DNA断片を pCHOl— Igsベクター（WO00/53634)にクローユングした。なお、本発現ベクター pCHOl— Igsは、哺乳動物細胞分泌発現系に適するマウス IgGlシグナル配列（Nature, 332, 323-327, 1988)を含んでいる。 DNA配列決定の後、ヒト化 MABL-2抗体 HL5の正し!/、アミノ酸配列をコードする DNA断片を含むプラスミドを pCHOhuM2Dbと命名した。本プラスミド pCHOhuM2Dbに含まれるヒトイ匕 MABL-2抗体 HL5の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号 73に示す。

[0132] (2)ヒト化 MABL-1抗体一本鎖 Fv (HL5)の作製

ヒトイ匕 MABL-1抗体 HL5を前記ヒトイヒ MABL-2抗体一本鎖 Fv (HL5)の作製に従って作製した。第一 PCRにおいては、 HEF- huM2H2.1#3の代わりにヒト化 MABL- 1抗体 H 鎖 V領域をコードするプラスミド HEF-huMlH2.1#l (実施例 2を参照）、及び

HEF-huM2L2.1#lの代わりにヒト化 MABL-1抗体抗体 L鎖 V領域をコードするプラスミド HEF-huMlL2.1#l (実施例 2を参照）を使用し、 PCR生成物 huMlDb-Ιおよび huMlDb-2を得た。これらを用いた第二 PCRにより、ヒト化 MABL-1抗体 HL5の正しいアミノ酸配列をコードする DNA断片を含むプラスミド pCHOhuMlDbを得た。本プラスミド pCHOhuMlDbに含まれるヒト化 MABL-1抗体 HL5の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号 74に示す。

実施例 5： 2つの H鎖 V領域及び 2つの L鎖 V領域を含む sc(Fv)の作製

2

(1)ヒトイ匕 MABL— 2抗体 sc(Fv)2発現プラスミドの構築

5 mer、 15 mer、 5 merのペプチドリンカ一を有し、 N末端より [H鎖]—[L鎖]—[H鎖] — [L鎖]の順となるように V領域を連結したヒト化 MABL— 2抗体 sc(Fv)2を発現するプラスミドを作製するため、前述の PCR生成物 huM2Db-lおよび huM2Db-2を以下に示す通り PCR法により更に修飾し、得られた DNA断片を pCHOl— Igsベクターに導入した。

[0133] ヒト化 MABL-2抗体 sc(Fv)2の作製のために前述の PCRプライマー A— Dに加え、 2 個の PCRプライマー E、 Fを使用した。プライマー Eはセンス配列を有し、プライマー F はアンチセンス配列を有する。

[0134] H鎖 V領域のための前方プライマー X15huHS (プライマー E、配列番号 75)は、以下に記載の 15merリンカ一の一部とオーバーラップし、且つ H鎖 V領域の N末端をコードする DNAにノ、イブリダィズするように設計した。また、 L鎖 V領域のための後方ブライマ一 X15huLAS (プライマー F、配列番号 76)は、 L鎖 V領域の C末端をコードする D NAにハイブリダィズし且つ Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (配列番号 77)からなる 15merリンカ一領域をコードする D NA配列にハイブリダィズするように設計した。

[0135] 第一 PCR段階において C/F、 E/Bのプライマーの組み合わせにて 2つの反応を行い、各 PCR生成物（huM2Db-3および huM2Db-4)を精製した。なお、第一 PCRにおいては、ヒト化 MABL-2抗体 L鎖 V領域をコードする PCR生成物 huM2Db-2 (実施例 4 を参照）、及びヒトイ匕 MABL-2抗体 H鎖 V領域をコードする PCR生成物 huM2Db-l (実施例 4を参照）をそれぞれ铸型として用いた。第二 PCRにおいて、前述の huM2Db-l と huM2Db-3、および huM2Db-2と huM2Db-4の組み合わせでそれら自体の相補性によりアッセンブルさせた。次にプライマー Aと F、および Eと Dを各々に加えて、ヒトイ匕 MABL- 2抗体 sc(Fv)2をコードする 2つの断片 DNA(huM2Db- 13と huM2Db- 24)を増幅した (第二 PCR)。

[0136] 第一 PCR段階にぉ、て、 50 mLの反応混合液に各 PCRプライマーをそれぞれ 20 pmol、 0.2 mmol/Lの dNTP、 1 mmol/L MgSO、各 1 mLの铸型 DNA並びに 1 Uの KOD

4

[0137] PCR生成物 C F (huM2Db-3)及び E— B (huM2Db-4)を 1.2%ァガロースゲル電気泳動により分離精製し、第二 PCRで huM2Db-l及び huM2Db-2とともにアッセンブルに用いた。第二 PCRにおいて、铸型として各 lmLの huM2Db-lと huM2Db-3あるいは各 lmLの huM2Db- 2と huM2Db- 4、 2 Uの KOD -Plus-を含有する 100 mLの反応混合液を 94°Cにて 15秒間、 50°Cにて 30秒間、 68°Cにて 1分間の温度サイクルで 5回インキュペートし、 68°Cで 5分間インキュベートした後、各 PCRプライマーを 40 pmolずつ添カロした。続いて、第一 PCRと同一の条件にて 35回の PCRを行い、 PCR生成物を

QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 huM2Db- 13を Sail及び BamHIで、 huM2Db-24を BamHI及び Notlで消化し、得られた DNA断片を pCHO 1 Igsベクターにクローユングした。 DNA配列決定の後、ヒト化 MABL- 2抗体 sc(Fv)2 の正しいアミノ酸配列をコードする DNA断片を含むプラスミドを pCHOhuM2scDbと命名した。本プラスミド pCHOhuM2scDbに含まれるヒト化 MABL-2抗体 sc(Fv)2の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号 78に示す。

[0138] (3)ヒトイ匕 MABL— 1抗体 sc(Fv)2発現プラスミドの構築

5 mer、 15 mer、 5 merのペプチドリンカ一を有し、 N末端より [H鎖]—[L鎖]—[H鎖] — [L鎖]の順となるように V領域を連結したヒト化 MABL— 1抗体 sc(Fv)2を発現するプラスミドを作製するため、前記ヒト化 MABL— 2抗体 sc(Fv)2発現プラスミドの構築に従い、行った。

[0139] 第一 PCRにお!/、ては、 PCR生成物 huM2Db- 2の代わりにヒト化 MABL- 1抗体 L鎖 V 領域をコードする PCR生成物 huMlDb-2、及び PCR生成物 huM2Db-lの代わりにヒト化 MABL-1抗体 H鎖 V領域をコードする PCR生成物 huMlDb-1を使用し、ヒトイ匕 MABL-1抗体 sc(Fv)2の正しいアミノ酸配列をコードする DNA断片を含むプラスミド pCHOhuMlscDbを得た。本プラスミド pCHOhuMlscDbに含まれるヒト化 MABL- 1抗体 sc(Fv)2の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号 79に示す。

[0140] (4) CHO安定産生細胞株の榭立

前記 MABL- 2抗体 HL5及び sc(Fv)、 MABL-1抗体 HL5及び sc(Fv)の恒常的発

2 2

現 CHO細胞株を榭立するため、 pCHOhuMlDb、 pCHOhuMlscDb, pCHOhuM2Db 、 pCHOhuM2scDbベクターを CHO細胞に遺伝子導入した。

[0141] 各ベクターを、 G_ene Pulser装置（BioRad社製）を用いてエレクト口ポレーシヨンにより CHO細胞に形質転換した。 DNA (10 μ g)と PBSに懸濁した CHO細胞（1 X 10⁷細胞 ZmL)の 0.75 mLを混合したものをキュベットに加え、 1.5kV、 25 /z Fの容量にてパルスを与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 10%のゥシ胎児血清を含有する核酸含有 a -MEM培地 (GIBCO BRL 社製）に加え培養した。一夜培養後、培養上清を除去し、 PBSにてリンスした後、 10 %のゥシ胎児血清を含有する核酸不含 ex MEM培地 (GIBCO BRL社製)を加え培養した。結合標的とする可溶型ヒト CD47を BIACOREセンサーチップ CM5(Biacore AB)にァミンカップリング法で固定ィ匕し、選択培養により得られたクローンから回収した培養上清をこのセンサーチップへ注入した。このときの結合量から発現濃度を定量し、高発現のクローンをヒト化 MABL— 1および 2抗体由来の HL5及び sc(Fv)の産

2 生細胞株として選択した。 10nM methotrexate (SIGMA社製）を含む無血清培地 C HO-S-SFM IKGIBCO BRL社製）にて培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去して回収培養上清を得た。

[0142] (5)ヒト化 MABL- 1とヒト化 MABL- 2の HL5及び sc(Fv)の精製

2

前記 (4)で得られた培養上清から、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアバタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの 3つの工程によりヒト化 MABL-1 とヒトイ匕 MABL-2のそれぞれ HL5及び sc(Fv)の精製 (計 4種類)を行った。いずれの 4種

2

類の抗体も全く同じ方法で精製をした。ヒトイ匕 MABL-1及びヒトイ匕 MABL-2の違!、、 HL5及び sc(Fv)の違いにより、精製結果はほとんど変わらな力つた。このため精製方

2

法についてはまとめて記載した。図はヒトイ匕 MABL-1抗体 HL5の場合の精製例のみを示した。

[0143] 培養上清は、 0.02% Tween20を含む 20 mM酢酸ナトリウム緩衝液、 pH 5.5で 2倍に希釈した後、 1 M酢酸で pHを 5.5に調整した。この後、 0.02% Tween20を含む 20 mM 酢酸ナトリウム緩衝液、 pH 5.5で平衡化した SP Sepharose Fast Flow column (アマシャムバイオサイエンス)〖こかけ、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液中 0 Mから 0.6 M までの NaClの直線濃度勾配で、カラムに吸着したポリペプチドを溶出した。得られた画分を SDS-PAGEで分析し、 HL5及び sc(Fv)を含む画分を集めた（図 14)。

2

[0144] 第一工程で得られた HL5及び sc(Fv)画分は、 0.1 M NaOHにより pH 6.0— 6.5の範

2

囲内に調整した後、それぞれ 0.02% Tween20を含む 10 mMリン酸緩衝液、 pH 7.0で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム (BIO- RAD、タイプ I、 20 mm)に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、リン酸緩衝液濃度を 200 mMまで直線的に上げ、カラムに吸着したポリペプチドを溶出した。得られた画分を SDS-PAGEで分析し、目的のポリべプチドが含まれる画分を集めた（図 15)。

[0145] 第二工程で得られた各画分をそれぞれ Centriprep YM- 10(ミリポア)で濃縮し、

0.02% Tween20及び 0.15 M NaClを含む 20 mM酢酸緩衝液、 pH 6.0で平衡化した HiLoad 26/60 Superdex 200 pg column (アマシャムバイオサイエンス)に添カ卩した。それぞれメインピークとして溶出した画分を精製画分とした（図 16)。 HL5は sc(Fv)とほ

2 とんど同じ位置に溶出され、 HL5のモノマーと考えられる分子は認められな力つた。

[0146] 精製した 4種類のヒト化 MABL- 1抗体 HL5および sc(Fv)、ヒト化 MABL- 2抗体 HL5お

2

よび sc(Fv)は、 Superdex 200 PC 3.2/30 column (アマシャムバイオサイエンス)を使用

2

し分析ゲルろ過を行った。いずれもシングルピークで、ヒトイ匕 MABL-1抗体 HL5および sc(Fv)は見かけ上の分子量は約 42 kDaを、ヒト化 MABL-2抗体 HL5および sc(Fv)は

2 2

、見かけ上の分子量約 40 kDaを示した（図 17)。以上のことから、ヒトイ匕 MABL-1,2抗体の HL5は一本鎖 Fvの-分子からなるダイマーで、ヒト化 MABL-1,2抗体 sc(Fv)は

2 一本鎖 Fvのモノマーであることが分かった。

[0147] ヒトイ匕 MABL-1抗体 HL5は還元と非還元条件 SDS-PAGE分析の結果、両条件とも monomerの分子量位置（約 30 kDa)に単一のバンドを示した。ヒト化 MABL- 1抗体 sc(Fv)は、還元と非還元の両条件で monomerの分子量位置（約 55 kDa)に単一のバ

2

ンドを示した（図 18)。ヒト化 MABL-2抗体 HL5および sc(Fv)についても還元と非還元

2

条件 SDS-PAGE分析の結果、ヒトイ匕 MABL-1抗体と全く同様の結果が得られた。（図 19)。以上のことから、ヒトイ匕 MABL-1,2抗体 HL5は分子間には S-S架橋はなぐ非共有結合性ダイマーを形成して、ることが分力つた。

実施例 6 :ヒト化 MABL- 1抗体 HL5及び sc(Fv)、ヒト化 MABL- 2抗体 HL5及び sc(

2

Fv)の in vitroでのアポトーシス誘起効果

2

ヒト CD47遺伝子を導入した L1210細胞、 MOLT4細胞 (ATCC)、 JOK- 1細胞（林原生物化学研究所藤崎細胞センター）を用い、ヒトイ匕 MABL-1抗体 HL5および sc(Fv)

2

、ヒトイ匕 MABL- 2抗体 HL5および sc(Fv)のアポトーシス誘起作用を Annexin- V (ロシュ · I染色により検討した。細胞 1 X 10^s個に、各抗体を 50 nmol/Lから 10倍希釈ずつ 0.005 nmol/Lまで、もしくは抗体の代わりに PBS (-)を添カ卩し、 24時間培養した。その後、 Annexin- V染色を行い、 FACSCaribur装置（BECTON DICKINSON) にて蛍光強度を測定した。その結果、いずれの細胞においても細胞死を誘導した。図 20に MOLT4細胞における結果を示した。

実施例 7：ヒトイ匕 MABL— 1抗体 sc(Fv)2の白血病モデル動物での薬効試験

( 1)ヒト白血病マウスモデルの作製

ヒト白血病マウスモデルは以下のように作製した。 SCIDマウス（日本クレア）を用いて JOK-1細胞 (林原生物化学研究所藤崎細胞センター）を RPMI1640培地（ GIBCO BRL社製）で 2.5 X 10⁷個/ mLになるように調製した。あらかじめ前日抗ァシァロ GM1抗体（和光純薬社製、 1バイアルを 5mLで溶解） 100 Lを皮下投与した S CIDマウス（ォス、 6週齢）（日本クレア）に上記 JOK- 1細胞懸濁液 200 μ L (5 X 10⁶個 Zマウス)を尾静脈より注入した。

[0148] (2)投与抗体の調製

ヒト化 MABL— 1抗体 sc(Fv)2を投与当日、濾過滅菌した PBS (—)を用いて、 1 mgZ mL、になるように調製し、投与試料とした。

(3)抗体投与

( 1)で作製したヒト白血病マウスモデルに対し、 JOK- 1細胞移植後 3日目より、 1日 2 回、 5日間、上記 (2)で調製した投与試料を 10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。陰性対照として、濾過滅菌した PBS (—)を同様に 1日 2回、 5日間、 10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。いずれの群も、 1群 7匹で行った。

(4)抗腫瘍効果の評価

ヒトイ匕 MABL— 1抗体 sc(Fv)2のヒト白血病マウスモデルにおける抗腫瘍効果については生存期間で評価した。その結果、図 21に示すとおり、ヒトイ匕 MABL— 1抗体 sc(Fv)2投与群では PBS (—)投与群と比較して生存期間の延長が認められた。

[0149] 以上より、ヒトイ匕 MABL— 1抗体 sc(Fv)2がヒト白血病マウスモデルに対して、抗腫瘍効果を有することが示された。この抗腫瘍効果は、当該ヒト化抗体が有するアポトーシス誘起作用に基づくと考えられる。実施例 8 : S-S結合導入ヒト化 MABL-2 HL5の作製

(1)ヒト化 MABL-2抗体 HL5への S-S結合配列導入

実施例 4で構築したヒト化 MABL-2抗体 HL5の 2ケ所のアミノ酸をシスティン残基に変換し、 Diabodyの S-S結合による安定ィ匕のための実験を行った（図 22)。

以下に、 (i)Cys44(VH) / Cys 100(VL)、 (ii)Cys 105(VH) I Cys 43(VL)の組み合わせでの 2種の S-S体構築のためのプライマー配列を示す。

Ctcgaggaattcccaccatgggatggagctgtatcatcc 5F44-100 (#iB) (目 il列番号 80)

Gggggcctgtcgcagccagtgaataac 5R44- 100 (目 3列番号 81 J

Gggcagtcagtgtatacggccgtgtcgtcagatctgagactgctc 5R105- 43 (酉己列号 82)

Gggcaatgccttgagtggatgggatatatttatcc 3F44- 100 (酉己歹 [J番号 83)

Ί cattatttgatctcaagcttggtcccgcagccaaacgtgtacggaacatgtgt 3R44- 100 (目己列 ¾·号 84) Ί actattgtgctagagggggttactatacttacgacgactggggctgcgcaaccctggtcacagtctc MP丄 C — 43 (配列番号 85)

Gggcttctgcagataccaatgtaaataggtctttc MR105- 43 (酉己列番 86)

Gggcagtgcccaagactcctgatctacaaagtttcc 105—43 (目歹号 87)

Ί cattatttgatctcaagcttggtcccctggccaaac 3R105- (目列 ¾·号 88)

PCR反応は KODポリメラーゼ（東洋紡）、铸型とし pCHOhuM2Dbを用い、 94°C、 1分の変性後、 98°C 30秒、 65°C 2秒、 74°C 30秒を 30サイクル行った。

(i) Cys44(VH) / Cys 100(VL)用の変異の導入は、 5F44-100 / 5R44-100、 3F44-100 I 3R44-100のプライマーの組み合わせで PCR反応を行い、 pBluescriptSK+ ( Stratagene社）の Smal部位に 3'側断片、 5'断片の順に Rapid DNA ligation kit (Roche 社)を用いて逐次連結した。

(ii) Cys 105(VH) I Cys 43(VL)用の変異の導入は、 5F44-100 / 5R105-43、

MF105-43 I MR105- 43、 3F105- 43 I 3R105- 43のプライマーの組み合わせで PCRを行い、 5F44-100 I 5R105- 43、 3F105- 43 / 3R105- 43で得た PCR断片を

pBluescriptSK+の Smal部位に逐次連結し、その後 5R105-43および MF105-43に予め保存的変異を導入してデザインした BsT107I部位と Smal部位を利用して MF105-43 / MR105-43断片を連結して得た。構築したそれぞれのプラスミドを大腸菌 DH5a株 (東洋紡社)に導入し、得られた組換え大腸菌カゝらプラスミドを精製 (QIAGEN社)し、 ABI3100 Genetic Analyzerで解析を行った。

[0151]

ィ匕 MABL- 2 HL5 SS44および MABL- 2 HL5 SS105と呼ぶものとする。なお、 MABL- 2 HL5 SS44の塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 89と配列番号 90に、 MABL-2 HL5 SS105の塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 91と配列番号 92 に示す。

[0152] 動物細胞発現用に、 SS44および SS105の遺伝子を pBluescriptSK+より BamHI、 Xhol で切り出し、発現ベクター pcDNA3.1(Hygro-) (Invitrogen社）の同部位に連結した。これらを phMABL2(SS44)および phMABL2(SS105)と呼ぶものとする。

[0153] (2) CHO (DXBll)細胞を用いた S-S結合導入ヒト化 MABL-2 HL5の生産細胞の作 phMABL2(SS44)および phMABL2(SS105)のそれぞれ 10mgを 4 X 10⁶細胞の CHO細胞（DXB11)へとエレクト口ポレーシヨン法 [サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133

(1990)]により導入した。導入後細胞は 50 mLの aMEM- FBSに縣濁し、 95ゥエルプレート（Corning社） 5枚にゥエルあたり 100 mLずつ分注した。 5%C02インキュベーター内で 37°C、 24時間培養した後、培地を lOOmg/mLの HygromycinBを含む aMEM- FBSに代え、さらに HygromaycinB濃度を段階的に 200 mg/mL、 400mg/mLに上げ、選抜を行った。

[0154] 得られた耐性株はさらに DHFR遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増カロさせる目的で MTX (SIGMA社製）を 10 nM MTX、 400 mg/mL HygromaycinB含む aMEM-FBSで 2週間培養を行い、 10 nM MTX耐性を示す形質転換体を得た。増殖が認められたゥエルの形質転^ ¾は、さらに MTX濃度を 50 nM、 100 nM、 200 nMに上げ、最終的に 400 mg/mLの HygromacinB、 200 nMの MTXを含む aMEM- FBS培地中で培養した。結合標的とする可溶型ヒト CD47を BIACOREセンサーチップ

CM5(Biacore AB)にァミンカップリング法で固定化し、選択培養により得られたクローンから回収した培養上清をこのセンサーチップへ注入した。このときの抗体結合量から発現濃度を定量し、高発現のクローンをヒト化 MABL-2 HL5 SS44および SS105の産生細胞株として選択した。

[0155] 3) S-S結合導入ヒト化 MABL-2 HL5の生産細胞の培養

上記（2)で得られたヒト化 MABL-2 HL5 SS44および SS105の産生細胞株を 100 nM MTX、 400 mg/mL Hygromycin Bを含む無血清培地 CHO- S- SFII (GIBCO BRL社製 )で 100 mLのスピナ一フラスコで 2週間培養し、馴化を行った。馴化した細胞は拡大培養のため、 1 L (培地量 700 mL、）または 8 Lスピナ一フラスコ (培地量 6L)にそれぞれ 1 X 10⁷、 1 X 10⁸の細胞を巻き込み、 3または 7日間培養して、培養上清を回収した

[0156] (4) S- S結合導入ヒト化 MABL- 2 HL5の精製

上記（3)で得られた培養上清から、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアバタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの 3つの工程によりヒトイ匕

MABL-2HL5の SS44及び SS105精製 (2種類)を行った。、ずれの 2種類の抗体も全く同じ方法で精製をした力精製結果に違いはほとんど見られな力たため、区別せずに記述した。

[0157] 培養上清は、 0.02% Tween20を含む 20 mM酢酸ナトリウム緩衝液、 pH 5.5で 2倍に希釈した後、 1 M酢酸で pHを 5.5に調整した。この後、 0.02% Tween20を含む 20 mM 酢酸ナトリウム緩衝液、 pH 5.5で平衡化した SP Sepharose Fast Flow column (アマシャムバイオサイエンス)〖こかけ、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液中 0 Mから 0.6 M までの NaClの直線濃度勾配で、カラムに吸着したポリペプチドを溶出した。得られた画分を SDS-PAGEで分析し、ヒト化 MABL-2HL5の SS44及び SS105を含む画分を集めた。

[0158] 第一工程で得られたヒト化 MABL- 2HL5の SS44および SS105は、 0.1 M NaOHにより pH 6.0— 6.5の範囲内に調整した後、それぞれ 0.02% Tween20を含む 10 mMリン酸緩衝液、 pH 7.0で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム (BIO- RAD、タイプ I、 20 mm) に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、リン酸緩衝液濃度を 200 mMまで直線的に上げ、カラムに吸着したポリペプチドを溶出した。得られた画分を SDS-PAGEで分析し、目的のポリペプチドが含まれる画分が含まれる画分を集めた。

[0159] 第二工程で得られた各画分をそれぞれ Centricon YM-10(ミリポア)で濃縮し、 0.02% Tween20及び 0.15 M NaClを含む 20 mM酢酸緩衝液、 pH 6.0で平衡化した pH 6.0で平衡化した HiLoad 16/60 Superdex 200 pg column (アマシャムバイオサイエンス)に添カロした。得られた画分を SDS-PAGEで分析し目的のポリペプチドが含まれるメインピークを精製画分とした。

[0160] 精製した 2種類のヒト化 MABL- 2HL5の SS44および SS105は、 Superdex 200 PC

3.2/30 column (アマシャムバイオサイエンス)を使用し分析ゲルろ過を行った。いずれもシングルピークで、見かけ上の分子量約 40 kDaを示した（図 23)。

[0161] ヒト化 MABL-2HL5の SS44および SS105は還元と非還元条件 SDS-PAGE分析の結果、還元条件では monomerの分子量位置（約 26 kDa)に単一のバンドを示し、非還元条件では dimerの分子量位置（約 45 kDa)に単一のバンドを示した（図 24)。以上のこと力、ヒト化 MABL- 2HL5の SS44および SS105は一本鎖 Fvの 2分子力 S架橋で結合したダイマーであることが分力つた。

実施例 9 : S-S結合導入ヒト化 MABL-2抗体 HL5の in vitroでのアポトーシス誘起効果

ヒト CD47遺伝子を導入した L1210細胞、 JOK-1細胞 (林原生物化学研究所藤崎細胞センター）を用い、 S-S結合導入ヒト化 MABL-2抗体 HL5のアポトーシス誘起作用を Annexin-V (ロシュ'ダイァグノステイタス)染色により検討した。細胞 1 x 10⁵個に、各抗体を 50 nmol/Lから 10倍希釈ずつ 0.005 nmol/Lまで、もしくは抗体の代わりに PBS (-)を添カ卩し、 24時間培養した。その後、 Annexin- V染色を行い、 FACSCaribur装置（BECTON DICKINSON)にて蛍光強度を測定した。その結果、いずれの細胞にも細胞死を誘導した。図 25にヒト化 MABL-2 HL5 SS44のヒト CD47遺伝子を導入した L1210細胞に対するアポトーシス誘導効果の結果を示した。

Claims

請求の範囲 [1] CD47に結合するヒト化抗体。 [2] CD47がヒト CD47である請求項 1に記載のヒト化抗体。 [3] ヒトイ匕抗体の CDRがマウス抗体由来である請求項 1または 2に記載のヒト化抗体。 [4] 以下の配列のいずれかを含む請求項 1一 3のいずれかに記載のヒトイ匕抗体： (1)配列番号 7のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3) (2)配列番号 10のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3) (3)配列番号 13のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3) (4)配列番号 16のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3) (5)配列番号 19のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3) (6)配列番号 22のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3) (7)配列番号 30のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3) (8)配列番号 37のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3) (9)配列番号 40のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3) (10)配列番号 43のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3) (11)配列番号 46のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3) (12)配列番号 49のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3) (13)配列番号 52のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3) (14)配列番号 57のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3) (15)配列番号 64のアミノ酸番号 31— 35の配列（CDR1)、アミノ酸番号 50— 66の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 99一 106の配列 (CDR3) (16)配列番号 67のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3)。 [5] 以下の配列のいずれかを含む請求項 1一 3のいずれかに記載のヒトイ匕抗体： (1)配列番号 7のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2) 、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4) (2)配列番号 10のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2 )、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4) (3)配列番号 13のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2 )、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4) (4)配列番号 16のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2 )、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4) (5)配列番号 19のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2 )、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4) (6)配列番号 22のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2 )、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4) (7)配列番号 30のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（FR2 )、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4) (8)配列番号 37のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（FR2 )、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4) (9)配列番号 40のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（FR2 )、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番吾 103— 112の配列 (FR4) (10)配列番号 43のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（ FR2)、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)(11)配列番号 46のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（ FR2)、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)(12)配列番号 49のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（ FR2)、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)(13)配列番号 52のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（ FR2)、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)(14)配列番号 57のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（ FR2)、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)(15)配列番号 64のアミノ酸番号 1一 30の配列（FR1)、アミノ酸番号 36— 49の配列（ FR2)、アミノ酸番号 67— 98の配列 (FR3)、アミノ酸番号 107— 117の配列 (FR4)(16)配列番号 67のアミノ酸番号 1一 23の配列（FR1)、アミノ酸番号 40— 54の配列（ FR2)、アミノ酸番号 62— 93の配列 (FR3)、アミノ酸番号 103— 112の配列 (FR4)。 [6] 低分子化抗体である請求項 1一 5のいずれかに記載のヒト化抗体。 [7] ダイアポディ (Diabody)である請求項 6記載のヒト化抗体。 [8] 一本鎖 Diabodyである請求項 7記載のヒト化抗体。 [9] Diabodyを構成するフラグメント間にジスルフイド結合が存在することを特徴とする請求項 7または 8に記載のヒト化抗体。 [10] 以下の特徴を有する請求項 9記載のヒト化抗体： (1)配列番号 90に記載のアミノ酸配列を有する抗体；又は (2)アミノ酸配列（1)において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したアミノ酸配列を有し、かつ CD47への結合活性を有する抗体。 [11] 以下の特徴を有する請求項 9記載のヒト化抗体： (1)配列番号 92に記載のアミノ酸配列を有する抗体；又は (2)アミノ酸配列（1)において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したアミノ酸配列を有し、かつ CD47への結合活性を有する抗体。 [12] Diabodyを構成するフラグメント間にジスルフイド結合が存在することを特徴とする、ヒト CD47に結合する Diabody抗体。 [13] 以下の配列のいずれかを含む請求項 12に記載の Diabody抗体：

(13)配列番号 52のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3) (14)配列番号 57のアミノ酸番号 24— 39の配列（CDR1)、アミノ酸番号 55— 61の配列（ CDR2)、アミノ酸番号 94一 102の配列 (CDR3)

[14] 以下の配列を含む CD47に結合するヒト化抗体：

[15] 以下の配列を含む CD47に結合するヒト化抗体：

(2)配列番号 67のアミノ酸番号 1一 112の配列を含む L鎖 V領域。

[16] 以下のいずれかの配列を含む CD47に結合する抗体：

(1)配列番号 73のアミノ酸番号 1一 234の配列

(2)配列番号 74のアミノ酸番号 1一 234の配列

(3)配列番号 78のアミノ酸番号 1一 483の配列

(4)配列番号 79のアミノ酸番号 1一 483の配列。

[17] 請求項 1一 16のいずれかに記載の抗体をコードする遺伝子。

[18] 請求項 17に記載の遺伝子を含むベクター。

[19] 請求項 18に記載のベクターを含む宿主細胞。

[20] 請求項 19に記載の宿主細胞を培養する工程を含む抗体の製造方法。

[21] 請求項 1一 16のいずれかに記載の抗体を含む血液疾患治療薬。

[22] 血液疾患が急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人 T細胞白血病、多発性骨髄腫、 Mixed Leukemia, Hairy cell Leukemia等の白血病、悪性リンパ腫（Hodgkin病、非 Hodgkinリンパ腫）、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、及び真性多血症から選択される請求項 21記載の治療薬