CN110461872A - Cd47抗原结合单元及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了特异性结合CD47的抗原结合单元。本文进一步公开了编码所述抗原结合单元的多核酸、包含所述多核酸的载体以及包含所述载体的杂交瘤和宿主细胞。本文进一步提供了诱导表达CD47的细胞的吞噬作用的方法。

Description

CD47抗原结合单元及其用途
交叉引用
本申请要求2017年1月26日提交的国际申请PCT/CN2017/072738的优先权，该国际申请的内容在此通过引用整体并入本文。
背景技术
CD47是决定巨噬细胞吞噬作用的关键分子，其通过SIRPα——在巨噬细胞和其它髓系细胞上表达的跨膜受体——发送抑制信号而起作用。CD47广泛表达，并且充当“自身的标志物”，以防止巨噬细胞吞噬。癌细胞采用同样的机制来逃避免疫根除。事实上，CD47表达在若干人类癌症中升高，这些癌症包括实体瘤，如乳腺癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、脑癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、黑素瘤，以及血癌，如AML、ALL、CLL、CML、DLBL、FL、MCL、MM等。CD47与SIRPα——髓系细胞如巨噬细胞上的抑制性跨膜受体——相互作用。CD47/SIRPα相互作用导致双向信号传导，从而导致不同的细胞-细胞反应，包括对巨噬细胞的吞噬作用的抑制。因此，这种相互作用的破坏可以去除这种抑制，由此诱导吞噬作用。破坏这种相互作用的现有药剂存在许多缺点。其中包括对CD47的亲和力和/或选择性相对较低，以及诱导不希望的血细胞凝集的高倾向。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物或专利申请通过引用而并入。
发明内容
对替代CD47结合剂存在相当大的需求。本发明满足了这一需求，并且提供了相关的优点。
本文公开了包含轻链CDR和重链CDR的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元(a)特异性结合CD47；(b)与CD47结合后诱导表达CD47的细胞的吞噬作用；并且(c)当以范围为1.5ng/ml至30μg/ml所述抗原结合单元的浓度与红细胞混合时，缺乏诱导实质性血细胞凝集的能力。在一些方面，所述抗原结合单元与CD47的结合阻止了CD47与在巨噬细胞上表达的SIRPα的结合。在一些方面，与具有SEQ ID NO：240-241的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。在一些方面，与具有SEQ ID NO：242-243的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。在一些方面，与具有SEQ ID NO：244-245的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。在一些方面，当在利用表达CD47的细胞的体外结合试验中测定时，与具有SEQ ID NO：240-241的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元表现出更高的对CD47的结合亲和力。在一些方面，当在利用表达CD47的细胞的体外结合试验中测定时，与具有SEQ ID NO：242-243的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元表现出更高的对CD47的结合亲和力。在一些方面，当在利用表达CD47的细胞的体外结合试验中测定时，与具有SEQ ID NO：244-245的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元表现出更高的对CD47的结合亲和力。在一些方面，与具有SEQ ID NO：240-241的氨基酸序列的抗原结合单元所诱导的血细胞凝集相比，红细胞与所述抗原结合单元接触后所诱导的血细胞凝集至少低1倍。在一些方面，与具有SEQ ID NO：242-243的氨基酸序列的抗原结合单元所诱导的血细胞凝集相比，红细胞与所述抗原结合单元接触后所诱导的血细胞凝集至少低1倍。在一些方面，与具有SEQ ID NO：244-245的氨基酸序列的抗原结合单元所诱导的血细胞凝集相比，红细胞与所述抗原结合单元接触后所诱导的血细胞凝集至少低1倍。在一些方面，所述轻链CDR包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；并且所述重链CDR包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；其中所述LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：1-22和162-190的序列；并且其中所述HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：23-44和191-237的序列。在一些方面，所述轻链CDR包含选自以下LC-CDR序列组合的氨基酸序列：a)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：21；b)SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16；c)SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：17；d)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：20；e)SEQ ID NO：7、SEQID NO：11和SEQ ID NO：15；f)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：22；g)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；h)SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：180；i)SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：181；k)SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：177和SEQID NO：182；1)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：183；m)SEQ ID NO：163、SEQ IDNO：172和SEQ ID NO：184；n)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：185；o)SEQ IDNO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：186；p)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：187；q)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：187；r)SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：175和SEQ ID NO：187；s)SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；t)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；u)SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；v)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：179和SEQ ID NO：187；w)SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：176和SEQ ID NO：188；x)SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：189；以及y)SEQ IDNO：167、SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：190。在一些方面，所述重链CDR包含选自以下HC-CDR序列组合的氨基酸序列：a)SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：38；b)SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：39；c)SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：40；d)SEQID NO：29、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：43；e)SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42；f)SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：41；g)SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31和SEQID NO：44；h)SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：207和SEQ ID NO：226；i)SEQ ID NO：192、SEQ IDNO：222和SEQ ID NO：237；j)SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：233；k)SEQ IDNO：194、SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：228；1)SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：221和SEQ ID NO：229；m)SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：225；n)SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：232；o)SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：232；p)SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；q)SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：234；r)SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：234；s)SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；t)SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：222和SEQ ID NO：230；u)SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；v)SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：216和SEQ ID NO：224；w)SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：234；x)SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：227；y)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：211和SEQ ID NO：224；z)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：217和SEQ ID NO：224；aa)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：225；bb)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：215和SEQ ID NO：235；cc)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：236；dd)SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：209和SEQ ID NO：224；ee)SEQ IDNO：205、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；ff)SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：223和SEQ IDNO：231；以及gg)SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224。在一些方面，所述抗原结合单元是单克隆抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些方面，所述抗原结合单元是sFc、Fv、Fab或(Fab)2。在一些方面，所述抗原结合单元竞争结合被具有以下氨基酸序列的抗原结合单元识别的表位：1)SEQ ID NO：240-241，2)SEQ ID NO：242-243，或3)SEQ ID NO：244-245。
本文公开了包含轻链CDR和重链CDR的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元(a)以比参考抗原结合单元更高的结合亲和力特异性结合CD47，并且阻止CD47与SIRPα的结合；并且(b)当以范围为1.5ng/ml至30μg/ml抗原结合单元的浓度与红细胞混合时，缺乏诱导实质性血细胞凝集的能力，其中所述参考抗原结合单元具有以下氨基酸序列：1)SEQ ID NO：240-241，2)SEQ ID NO：242-243，或3)SEQ ID NO：244-245。在一些方面，所述轻链CDR包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；并且所述重链CDR包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；其中所述LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：1-22和162-190的序列；并且其中所述HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：23-44和191-237的序列。在一些方面，所述轻链CDR包含选自以下LC-CDR序列组合的氨基酸序列：a)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：21；b)SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16；c)SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：17；d)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：20；e)SEQ ID NO：7、SEQID NO：11和SEQ ID NO：15；f)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：22；g)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；h)SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：180；i)SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：181；k)SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：177和SEQID NO：182；1)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：183；m)SEQ ID NO：163、SEQ IDNO：172和SEQ ID NO：184；n)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：185；o)SEQ IDNO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：186；p)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：187；q)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：187；r)SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：175和SEQ ID NO：187；s)SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；t)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；u)SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；v)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：179和SEQ ID NO：187；w)SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：176和SEQ ID NO：188；x)SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：189；以及y)SEQ IDNO：167、SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：190。在一些方面，所述重链CDR包含选自以下HC-CDR序列组合的氨基酸序列：a)SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：38；b)SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：39；c)SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：40；d)SEQID NO：29、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：43；e)SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42；f)SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：41；g)SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31和SEQID NO：44；h)SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：207和SEQ ID NO：226；i)SEQ ID NO：192、SEQ IDNO：222和SEQ ID NO：237；j)SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：233；k)SEQ IDNO：194、SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：228；1)SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：221和SEQ ID NO：229；m)SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：225；n)SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：232；o)SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：232；p)SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；q)SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：234；r)SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：234；s)SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；t)SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：222和SEQ ID NO：230；u)SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；v)SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：216和SEQ ID NO：224；w)SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：234；x)SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：227；y)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：211和SEQ ID NO：224；z)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：217和SEQ ID NO：224；aa)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：225；bb)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：215和SEQ ID NO：235；cc)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：236；dd)SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：209和SEQ ID NO：224；ee)SEQ IDNO：205、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；ff)SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：223和SEQ IDNO：231；以及gg)SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224。在一些方面，所述抗原结合单元是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。在一些方面，所述抗原结合单元是sFc、Fv、Fab或(Fab)2。
本文公开了包含轻链CDR和重链CDR的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元(a)特异性结合CD47；并且(b)与参考抗原结合单元相比，在与CD47结合后更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用，其中所述参考抗原结合单元具有以下氨基酸序列：1)SEQ ID NO：240-241，2)SEQ ID NO：242-243，或3)SEQ ID NO：244-245。在一些方面，与具有SEQ ID NO：240-241的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。在一些方面，与具有SEQ ID NO：242-243的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。在一些方面，与具有SEQ ID NO：244-245的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。在一些方面，所述轻链CDR包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；并且所述重链CDR包含重链HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；其中所述LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：1-22和162-190的序列；并且其中所述HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：23-44和191-237的序列。在一些方面，所述轻链CDR包含选自以下LC-CDR序列组合的氨基酸序列：a)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：21；b)SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16；c)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：17；d)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：20；e)SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15；f)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：22；g)SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：14和SEQ ID NO：19；h)SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：180；i)SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：181；k)SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：177和SEQ ID NO：182；1)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：183；m)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：184；n)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：185；o)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：186；p)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：187；q)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：187；r)SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：175和SEQ ID NO：187；s)SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；t)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；u)SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；v)SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：179和SEQ ID NO：187；w)SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：176和SEQ ID NO：188；x)SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：189；以及y)SEQ IDNO：167、SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：190。在一些方面，所述重链CDR包含选自以下HC-CDR序列组合的氨基酸序列：a)SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：38；b)SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：39；c)SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：40；d)SEQID NO：29、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：43；e)SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42；f)SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：41；g)SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31和SEQID NO：44；h)SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：207和SEQ ID NO：226；i)SEQ ID NO：192、SEQ IDNO：222和SEQ ID NO：237；j)SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：233；k)SEQ IDNO：194、SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：228；1)SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：221和SEQ ID NO：229；m)SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：225；n)SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：232；o)SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：232；p)SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；q)SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：234；r)SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：234；s)SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；t)SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：222和SEQ ID NO：230；u)SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；v)SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：216和SEQ ID NO：224；w)SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：234；x)SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：227；y)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：211和SEQ ID NO：224；z)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：217和SEQ ID NO：224；aa)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：225；bb)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：215和SEQ ID NO：235；cc)SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：236；dd)SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：209和SEQ ID NO：224；ee)SEQ IDNO：205、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；ff)SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：223和SEQ IDNO：231；以及gg)SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224。在一些方面，所述抗原结合单元是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。在一些方面，所述抗原结合单元是sFc、Fv、Fab或(Fab)2。
本文公开了包含轻链CDR和重链CDR的抗原结合单元，其中所述轻链CDR包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；并且所述重链CDR包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3各自包含与选自SEQ ID NO：1-22和162-190的序列具有至少80％序列同源性的序列，并且其中所述HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3各自包含与选自SEQ ID NO：23-44和191-237的序列具有至少80％序列同源性的序列。在一些方面，所述轻链CDR和所述重链CDR分别包含选自下组的LC-CDR和HC-CDR：a)SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55；b)SEQ IDNO：65和SEQ ID NO：63；c)SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：64；d)SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：60；e)SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：61；f)SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：62；g)SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：59；h)SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：86；i)SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88；j)SEQID NO：89和SEQ ID NO：90；k)SEQ ID NO：91和SEQ ID NO：92；1)SEQ ID NO：93和SEQ IDNO：94；m)SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96；n)SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98；o)SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100；p)SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：102；q)SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104；r)SEQ ID NO：105和SEQ ID NO：106；s)SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108；t)SEQ IDNO：109和SEQ ID NO：110；u)SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：112；v)SEQ ID NO：113和SEQ IDNO：114；w)SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116；x)SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118；y)SEQ IDNO：119和SEQ ID NO：120；z)SEQ ID NO：121和SEQ ID NO：122；aa)SEQ ID NO：123和SEQ IDNO：124；bb)SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126；cc)SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128；dd)SEQID NO：129和SEQ ID NO：130；ee)SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：132；ff)SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：134；gg)SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136；hh)SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138；ii)SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140；jj)SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142；kk)SEQ IDNO：143和SEQ ID NO：144；ll)SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：146；mm)SEQ ID NO：147和SEQID NO：148；nn)SEQ ID NO：238和SEQ ID NO：239oo)SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：70；pp)SEQID NO：49和SEQ ID NO：73；qq)SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：51；rr)SEQ ID NO：50和SEQ IDNO：74；ss)SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：53；tt)SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：72；uu)SEQ IDNO：69和SEQ ID NO：52；vv)SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：77；wW)SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：78；xx)SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：79；yy)SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：75；zz)SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：76；-aaa)SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：80，以及bbb)表1中列出的任何序列对。在一些方面，所述抗原结合单元是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。在一些方面，所述抗原结合单元是sFc、Fv或Fab。
本文公开了包含任一种本文所公开的抗原结合单元和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本文公开了编码任一种本文所公开的抗原结合单元的分离的核酸。
本文公开了包含编码任一种本文所公开的抗原结合单元的核酸序列的载体。
本文公开了表达任一种本文所公开的抗原结合单元的宿主细胞。
本文公开了包含编码任一种本文所公开的抗原结合单元的核酸的宿主细胞。
本文公开了产生任一种本文所公开的抗原结合单元的方法，其包括：在适合表达抗原结合单元的条件下培养任何本文所公开的宿主细胞；以及分离由该宿主细胞表达的所述抗原结合单元。
本文公开了诱导表达CD47的细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括使所述细胞与任一种本文所公开的抗原结合单元接触。在一些方面，表达CD47的细胞的吞噬作用以至少5％的效率发生。在一些方面，所述抗原结合单元不会引起显著的血细胞凝集。在一些方面，所述细胞是癌细胞。在一些方面，所述细胞是非淋巴瘤且非白血病癌细胞。
本文公开了在人类受试者中诱导表达CD47的细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用任一种本文所公开的药物组合物。在一些方面，表达CD47的细胞的吞噬作用以至少5％的效率发生。在一些方面，所述抗原结合单元不会引起显著的血细胞凝集。在一些方面，所述细胞是癌细胞。在一些方面，所述细胞是非淋巴瘤且非白血病癌细胞。在一些方面，所述细胞是血液系统癌细胞或实体瘤细胞。
本文中公开了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的任一种本文所公开的抗原结合单元。在一些方面，所述方法进一步包括施用治疗性抗体。在一些方面，所述治疗性抗体是抗CD20抗体。在一些方面，治疗癌症包括减小肿瘤体积。在一些方面，与具有SEQ ID NO：240和241或SEQ ID NO：242和243或SEQ ID NO：244和245的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述肿瘤体积被更大程度地减小。
本文中公开了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的的任一种本文所公开的药物组合物。在一些方面，所述癌症是血液系统癌症或实体瘤。在一些方面，所述方法进一步包括施用治疗性抗体。在一些方面，所述治疗性抗体是抗CD20抗体。在一些方面，治疗癌症包括减小肿瘤体积。在一些方面，与具有SEQ ID NO：240和241或SEQ ID NO：242和243或SEQ ID NO：244和245的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述肿瘤体积被更大程度地减小。
附图说明
图1描绘了来自示例吞噬实验的数据。
图2A-2B描绘了来自示例吞噬实验的数据。
图3A-3B描绘了来自示例抗体结合实验的数据。
图4描绘了来自示例吞噬实验的数据。
图5描绘了来自示例吞噬实验的数据。
图6描绘了来自示例红细胞结合实验的数据。
图7A-7B描绘了来自示例血细胞凝集实验的数据。
图8描绘了来自示例血细胞凝集实验的数据。
图9描绘了来自示例抗体结合实验的数据。
图10描绘了来自示例抗体中和实验的数据
图11描绘了来自示例吞噬实验的数据。
图12A、12B和12C描绘了来自示例抗体结合实验的数据。
图13A、13B、13C和13D描绘了来自示例抗体结合实验的数据。
图14A-14B描绘了来自示例抗体结合实验的数据。
图15A描绘了来自示例抗体结合实验的数据。
图15B和15C描绘了来自示例阻断实验的数据。
图16A描绘了来自示例结合试验的数据。
图16B描绘了来自示例阻断试验的数据。
图17描绘了来自示例血细胞凝集试验的数据。
图18描绘了来自示例结合试验的数据。
图19A、19B和19C描绘了来自示例吞噬试验的数据。
图20A、20B、20C和20D描绘了来自示例红细胞和血小板结合试验的数据。
图21描绘了来自示例异种移植实验的数据。
图22A描绘了来自示例阻断试验的数据。
图22B描绘了来自示例RBC结合试验的数据。
图22C描绘了来自示例血小板结合试验的数据。
图22D描绘了来自示例血细胞凝集试验的数据。
图23描绘了来自示例异种移植实验的数据。
图24描绘了来自示例异种移植实验的数据。
具体实施方式
虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这样的实施方案只是通过示例的方式提供的。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，在实施本发明的过程中可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。旨在用以下权利要求限定本发明的范围，因此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
当提供数值范围时，应当理解，在此范围的上限与下限之间的每个中间值(精确到下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定)以及在所述范围内的其它任何所指出的或中间的值都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，而且也包含在本发明内，除了所述范围内任何具体排除的限值。当所述范围包含一个或两个限值时，除去任一或两个包含在内的限值的范围也包含在本发明中。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链、环状或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。该术语还包括已经被修饰的氨基酸聚合物，该修饰例如是通过硫酸化、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、碘化、甲基化、氧化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加(如精氨酸化)、遍在蛋白化，或其它任何操作，如与标记组分的缀合。如本文所用的，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和拟肽。由指定蛋白质“衍生”的多肽或氨基酸序列是指多肽的起源。优选地，多肽具有与序列中编码的多肽的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，或其部分，其中该部分由至少10-20个氨基酸或至少20-30氨基酸或至少30-50个氨基酸组成，或者其可用序列中编码的多肽免疫学地标识。该术语还包括从指定核酸序列表达的多肽。
如本文所用的术语“抗原结合单元”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(“免疫反应”)的抗原结合位点的分子。术语“抗原结合单元”内也包括多种物种起源(包括无脊椎动物和脊椎动物)的免疫球蛋白分子。在结构上，最简单的天然存在的抗体(例如，IgG)包含四条多肽链：通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。免疫球蛋白代表分子的一个大家族，其包括几种类型的分子，如IgD、IgG、IgA、IgM和IgE。术语“免疫球蛋白分子”包括，例如，杂合抗体，或改变的抗体，及其片段。已经显示，抗体的抗原结合功能可以由天然存在的抗体的片段来执行。这些片段被统称为“抗原结合单元”。术语“抗原结合单元”内还涵盖任何下述含多肽链的分子结构，其具有适配于表位并且识别表位的特定形状，其中一个或多个非共价结合相互作用使得该分子结构与表位之间的复合物变稳定。
如果相比与包括多肽或其它物质在内的其它参考抗原的结合，抗原结合单元以更高的亲和力或亲合力结合某抗原，则称该抗原结合单元与该抗原“特异性结合”或“免疫反应”。
如本文所用的“抗原”是指被抗原结合单元识别并特异性结合的物质。抗原可以包括肽、蛋白质、糖蛋白、多糖和脂质；其部分，及其组合。非限制性的示例性抗原包括来自人、鼠的CD47，以及它们的其它同源物。另外的抗原示例是来自人、鼠的SIRPα以及它们的其它同源物。
“嵌合”蛋白质含有至少一个融合多肽，该融合多肽在序列中与自然界中所发生的位置不同的位置处包含区域。该区域在正常情况下可以存在于单独的蛋白质中，而在融合多肽中被放在一起；或者它们在正常情况下可以存在于同一蛋白质中，但在融合多肽中以新的布置放置。例如，嵌合蛋白质可以通过化学合成，或通过创建并翻译其中肽区域以所希望的关系进行编码的多核苷酸来创建。
“结构域”是指蛋白质的一部分，它在物理上或功能上与该蛋白质或肽的其它部分区分开。物理上定义的结构域包括极具疏水性或亲水性的氨基酸序列，如那些膜结合的或细胞质结合的序列。结构域还可以通过例如由基因复制引起的内部同源性来定义。功能上定义的结构域具有不同的生物学功能。例如，受体的配体结合域是与配体结合的结构域。抗原结合域是指抗原结合单元或抗体中与抗原结合的部分。功能上定义的结构域不需要由连续的氨基酸序列编码。功能上定义的结构域可以含有一个或多个物理上定义的结构域。例如，受体通常被分为胞外配体结合域、跨膜结构域和胞内效应结构域。
“宿主细胞”包括可以是或已经是本发明载体的接受者的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。由于自然的、偶然的或有意的突变，该后代可以不必与原始亲本细胞(在形态学上或在基因组或总DNA互补性上)完全相同。宿主细胞包括在体内用本发明的载体转染的细胞。“宿主细胞”可以指原核细胞、真核细胞或作为单细胞实体培养的细胞系，其可以用作或已经用作重组载体或其它转移多核苷酸的接受者，并且包括已经转染的原始细胞的后代。应当理解，由于自然的、偶然的或有意的突变，单细胞的后代可以不必在形态学上或在基因组或总DNA互补性上与原始亲本完全相同。
“细胞系”或“细胞培养物”是指在体外生长或维持的细菌、植物、昆虫或高等真核细胞。细胞的后代与亲本细胞可以不完全相同(在形态学、基因型或表型上)。
如本文所用的，术语“分离的”是指与细胞的和其它方面的成分分离的，其中在自然界中，多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段在正常情况下与之相关联。本领域技术人员知晓，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”来与其天然存在的对应物区分开来。另外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段与其天然存在的对应物是可区分的，因为每单位体积的分子浓度或数目大于(“浓缩的”)或小于从其天然存在的对应物(“分离的”)。富集可基于绝对量来测量，例如每单位体积的溶液的重量，或者其可相对于来源混合物中存在的第二、可能干扰性的物质来测量。本发明实施方案的逐渐增加的富集是逐渐更优选的。因此，例如，2倍富集是优选的，10倍富集是更加优选的，100倍富集是更加优选的，1000倍富集是更加优选的。物质还可以通过人工装配过程(如通过化学合成或重组表达)以分离的状态提供。
“连接”和“融合的”或“融合”在本文中可互换使用。这些术语是指两个以上的化学元件或组件以任何手段接合在一起，这些手段包括化学缀合或重组手段。“框内融合”是指两个或更多个开放阅读框(ORF)以保持原始ORF的正确阅读框的方式连接起来形成连续的更长的ORF。因此，所得到的重组融合蛋白是含有两个或更多个与原始ORF所编码的多肽相对应的区段的单一蛋白质(这些区段在自然界中通常不会如此连接)。虽然这样使得阅读框在整个融合区段中成为连续的，但是这些区段可以在物理上或空间上被例如框内连接体序列(例如，“flexon”)隔开。
在多肽的情况下，“序列”是多肽中的氨基酸在从氨基末端到羧基末端方向上的顺序，其中该序列中彼此相邻的残基在该多肽的一级结构中是连续的。序列也可以是已知在一个或两个方向上包含额外残基的多肽的一部分的线性序列。
“异源的”表示从与所比较的实体的其余部分在基因型上不同的实体衍生而来。例如，从其天然编码序列中取出并与该天然序列之外的编码序列可操作地连接的启动子是异源启动子。当应用于多核苷酸、多肽时，术语“异源的”意味着该多核苷酸或多肽衍生自与所比较的实体的其余部分在基因型上不同的实体。例如，异源多核苷酸或抗原可以来自不同的物种来源、不同的细胞类型以及不同个体的相同类型的细胞。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸(无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、从连锁分析确定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针、引物、寡核苷酸或合成的DNA。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物装配之前或之后赋予。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。
当应用于多核苷酸时，“重组的”意味着该多核苷酸是克隆、限制酶切消化和/或连接步骤以及产生与自然界中发现的多核苷酸不同的构建体的其它程序的各种组合的产物。
术语“基因”或“基因片段”在本文中可互换使用。它们是指含有至少一个开放阅读框的多核苷酸，该开放阅读框能够在转录和翻译后编码特定蛋白质。基因或基因片段可以是基因组的、cDNA或合成的，只要该多核苷酸含有至少一个开放阅读框，该开放阅读框可以覆盖整个编码区或其区段。
术语“可操作地连接”或“有效连接”是指并置，其中这样描述的组件所处的关系允许它们以其预期方式发挥作用。例如，如果启动子序列促进编码序列的转录，则该启动子序列与该编码序列可操作地连接。
“融合基因”是由连接在一起的至少两个异源多核苷酸组成的基因。
基因“数据库”表示一组存储的数据，其代表包括核苷酸和肽序列的序列集合，该序列集合又代表生物参考材料的集合。
如本文所用的，“表达”是指多核苷酸被转录为mRNA的过程，和/或转录的mRNA(也称为“转录物”)随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽统称为基因产物。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接
“载体”是一种核酸分子，优选自我复制性的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。该术语包括主要功能是将DNA或RNA插入细胞中的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，以及功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供超过一种上述功能的载体。“表达载体”是在引入合适的宿主细胞中时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常表示包含能够用来产生所需表达产物的表达载体的合适的宿主细胞。
术语“生物样品”包括多种从生物体获得的样品类型，并且可以在诊断或监测试验中使用。该术语包括血液和生物起源的其它液体样品，固体组织样品，如活检标本或组织培养物，或由其衍生的细胞及其后代。该术语包括在获得后已经以任何方式进行处理的样品，例如通过用试剂处理、溶解或针对某些组分进行富集。该术语包括临床样品，并且还包括在细胞培养物、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品中的细胞。
术语“治疗”、“处理”等在本文中用来泛指获得所需的药理学和/或生理学效果。该效果就完全或部分防止疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全稳定或治愈疾病和/或归因于该疾病的不良反应而言可以是治疗性的。如本文所用的“治疗”涵盖在哺乳动物中对疾病的任何治疗，该哺乳动物例如是小鼠、大鼠、兔、猪、灵长类动物，包括人类和其它猿类，特别是人，并且该术语包括：(a)防止疾病或症状在可能易患该疾病或症状但尚未发生诊断的受试者中发生；(b)抑制疾病症状；(C)阻止疾病的发展；(d)缓解疾病症状；(e)引起疾病或症状消退；或其任意组合。
术语“接受者”、“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指希望对其进行诊断、处理或治疗的任何哺乳动物受试者，特别是人类。
术语“癌症”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌”在本文中可互换使用，是指这样的细胞：它们表现出相对自主的生长，使得它们表现出异常生长表型，其特征在于细胞增殖的显著失控。通常，在本申请中用于检测或治疗的目标细胞包括癌前(例如，良性)、恶性、转移前、转移性和非转移性细胞。在“正常细胞”的语境中使用的“正常”一词是指表型未转化的细胞，或表现出所检查的组织类型的未转化细胞的形态学的细胞。“癌性表型”通常是指癌细胞特有的多种生物现象中的任何现象，该现象可以随癌症类型而变化。癌性表型通常通过例如细胞生长或增殖的异常(例如，不受控制的生长或增殖)、细胞周期的调节、细胞运动性、细胞-细胞相互作用或转移等来确定。
吞噬细胞或噬细胞是可互换的术语，并且是指能够吞噬的细胞。吞噬细胞的非限制性类别包括巨噬细胞、单个核细胞(例如，组织细胞和单核细胞)、多形核白细胞(例如，嗜中性粒细胞)和树突细胞。
组合物
在一个实施方案中，本公开提供一种包含轻链CDR和重链CDR的抗原结合单元，其中该抗原结合单元(a)特异性结合CD47；(b)与CD47结合后诱导表达CD47的细胞的吞噬作用；并且(c)当以范围为约1.5ng/ml至约30μg/ml本文公开的抗原结合单元的浓度与红细胞混合时，缺乏诱导实质性血细胞凝集的能力。
在另一个实施方案中，本公开提供一种包含轻链CDR和重链CDR的抗原结合单元，其中该抗原结合单元(a)以比参考抗原结合单元更高的结合亲和力特异性结合CD47，并且阻止CD47与SIRPα的结合；并且(b)当以范围为约1.5ng/ml至约30μg/ml所述抗原结合单元的浓度与红细胞混合时，缺乏诱导实质性血细胞凝集的能力，其中所述参考抗原结合单元具有1)SEQ ID NO：240-241、2)SEQ ID NO：242-243或3)SEQ ID NO：244-245所示的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，本公开提供一种包含轻链CDR和重链CDR的抗原结合单元，其中该抗原结合单元元(a)特异性结合CD47；并且(b)与参考抗原结合单元相比，在与CD47结合后更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用，其中所述参考抗原结合单元具有1)SEQ ID NO：240-241、2)SEQ ID NO：242-243或3)SEQ ID NO：244-245所示的氨基酸序列。
在再一个实施方案中，本公开提供了包含轻链CDR和重链CDR的抗原结合单元，其中该轻链CDR包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，并且该重链CDR包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3各自包含与选自SEQ ID NO：1-22和162-190的序列具有至少80％序列同源性的序列，并且其中所述HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3各自包含与选自SEQ ID NO：23-44和191-237的序列具有至少80％序列同源性的序列。
在一些方面，抗原结合单元可以竞争结合被参考抗原结合单元识别的表位。例如，抗原结合单元可以竞争结合被参考抗原结合单元识别的表位，其中该参考抗原结合单元具有1)SEQ ID NO：240-241、2)SEQ ID NO：242-243或3)SEQ ID NO：244-245所示的氨基酸序列。所选抗体的表位分箱(binning)用表达CD47的CHO细胞与商品化的抗CD47阻断抗体进行。简言之，使用流式细胞术，根据与表达CD47的CHO细胞的竞争性结合来对七种中和CD47抗体和两种参考抗体(阳性1和阳性2)进行分析和分组。首先使用生物素化抗体计算90％结合的浓度，然后对9种CD47抗体进行系列稀释，并与预先确定的90％结合浓度的生物素化抗体之一混合。使用SA-APC检测生物素化抗体的结合。所有抗体都彼此并与对照进行比较。显示结合没有变化的抗体被分类为同一组。显示细胞表面结合变化的抗体被分类为不同的组。鉴定了在表达CD47的CHO上的三个结合谱，并对六个命中物进行如下三组处理。一组由ABU1、ABU6、阳性1组成。第二组由ABU4、ABU5和阳性1组成。第三组由ABU2、ABU3、阳性1和阳性2组成。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元包含轻链CDR。轻链CDR可以是抗原结合单元的轻链的互补决定区。轻链CDR可包含氨基酸残基的连续序列，或被非互补决定区如构架区隔开的氨基酸残基的两个或更多个连续序列，任选地其侧翼为非互补决定区，如构架区。在一些实例中，轻链CDR包含两个或更多个轻链CDR，其可以被称为轻链CDR-1、CDR-2，以此类推。在有利的实例中，轻链CDR包含三个轻链CDR，其可以分别被称为轻链CDR-1、轻链CDR-2和轻链CDR-3。在一些实例中，存在于共同轻链上的一组CDR可以被统称为轻链CDR。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元包含重链CDR。重链CDR可以是抗原结合单元的重链的互补决定区。重链CDR可以包含氨基酸残基的连续序列，或被非互补决定区如构架区隔开的氨基酸残基的两个或更多个连续序列，任选地其侧翼为非互补决定区，如构架区。在一些实例中，重链CDR包含两个或更多个重链CDR，其可以被称为重链CDR-1、CDR-2，以此类推。在有利的实例中，重链CDR包含三个重链CDR，其可以分别被称为重链CDR-1、重链CDR-2和重链CDR-3。在一些实例中，存在于共同重链上的一组CDR可以被统称为重链CDR。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，本发明抗原结合单元特异性结合CD47。如本文所用的CD47也可以指直向同源物、同源物、密码子优化的形式、截短形式、片段化形式、突变形式或已知CD47序列的其它任何已知的衍生物形式。例如，CD47可以是人CD47，其由GenBank登录号CEJ95640表示，并且包含SEQ ID NO：81的序列。CD47可以是鼠CD47，其由GenBank登录号BAA25401.1表示，并且包含SEQ ID NO：82的序列。在一些语境中，CD47被称为整联蛋白相关蛋白(IAP)。人IAP由GenBank登录号CAA80977.1表示，并且包含SEQ ID NO：83的序列。鼠IAP由GenBank登录号ADQ12919.1表示，并且包含SEQ ID NO：84的序列。另外，CD47可包含与SEQ ID NO：81-84中的任一个具有至少50％同一性的序列。CD47可包含与SEQID NO：81-84中的任一个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％的同一性的序列。
结合特异性可以由互补决定区或CDR如轻链CDR或重链CDR来决定。在许多情况下，结合特异性由轻链CDR和重链CDR来决定。重链CDR和轻链CDR的给定组合提供了给定的结合口袋，其相比于其它参考抗原对CD47赋予更大的亲和力和/或特异性。
在本文公开的实施方案的一些方面，抗原结合单元以比参考抗原结合单元更高的结合亲和力特异性结合CD47。这类参考抗原结合单元包括但不限于具有1)SEQ ID NO：240-241、2)SEQ ID NO：242-243或3)SEQ ID NO：244-245所示的氨基酸序列的抗原结合单元。
抗原结合单元与CD47的结合可通过本领域已知的任何方法来表征或表示。例如，结合可以用结合亲和力来表征，结合亲和力可以是抗原结合单元与抗原之间的相互作用的强度。结合亲和力可通过本领域中已知的任何方法，如体外结合试验来确定。例如，可在利用表达CD47的细胞的体外结合试验中测定时确定本文公开的抗原结合单元的结合亲和力。本发明抗原结合单元的结合亲和力可按照Kd来表示，Kd是抗体与其相应抗原之间的平衡解离常数。在一些情况下，如本文公开的抗原结合单元以约10μM至约1fM范围内的Kd特异性结合CD47。例如，抗原结合单元可以以小于约10μM、1μM、0.1μM、10nM、1nM、0.1nM、10pM、1pM、0.1pM、10fM、1fM、0.1fM或小于0.1fM的Kd特异性结合CD47。在一些实例中，与具有1)SEQ IDNO：240-241、2)SEQ ID NO：242-243或3)SEQ ID NO：244-245所示的氨基酸序列的参考抗原结合单元相比，本发明抗原结合单元表现出更高的对CD47的结合亲和力。
在本文公开的实施方案的一些方面，抗原结合单元减少或甚至防止CD47与SIRPα的结合，由此诱导表达SIRPα的巨噬细胞细胞的吞噬作用。通常，这样的吞噬作用在抗原结合单元与CD47结合时得到诱导。
在一些方面，与参考抗原结合单元相比，本发明抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。这样的参考抗原结合单元可具有1)SEQ ID NO：240-241、2)SEQID NO：242-243或3)SEQ ID NO：244-245所示的氨基酸序列。吞噬作用可以通过本领域中已知的任何方法来定性评估。在一些情况下，吞噬作用的程度根据巨噬细胞群体中执行吞噬的巨噬细胞(称为吞噬细胞)的数目来确定。例如，可以确定每100个巨噬细胞的吞噬细胞数目，使得吞噬作用的程度可以表示为百分比或吞噬指数。
诱导表达CD47的细胞的吞噬作用可通过在本文公开的抗原结合单元的存在下这些细胞的吞噬水平的增加来证明。在一些实例中，与不存在所述组合物的情况下观察到的吞噬水平相比，这类细胞的吞噬水平增加了至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、500％、1000％或大于1000％。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元缺乏诱导实质性血细胞凝集的能力。在一些情况下，当以范围为约1.5ng/ml至约30μg/ml所述抗原结合单元的浓度与红细胞混合时，抗原结合单元缺乏诱导实质性血细胞凝集的能力。例如，当抗原结合单元的浓度为约0.1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、250ng/mL、300ng/mL、350ng/mL、400ng/mL、450ng/mL、500ng/mL、550ng/mL、600ng/mL、650ng/mL、700ng/mL、750ng/mL、800ng/mL、850ng/mL、900ng/mL、950ng/mL、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml或更多所述抗原结合单元时，在与红细胞混合时，本发明抗原结合单元可能缺乏诱导实质性血细胞凝集的能力。在其它实例中，抗原结合单元的浓度可以小于1.5ng/mL。在其它实例中，抗原结合单元的浓度可以大于30μg/ml。
在一些情况下，与具有1)SEQ ID NO：240-241、2)SEQ ID NO：242-243或3)SEQ IDNO：244-245所示的氨基酸序列的参考抗原结合单元所诱导的血细胞凝集相比，在红细胞与本发明抗原结合单元接触后所诱导的血细胞凝集至少低1倍。在一些情况下，与具有1)SEQID NO：240-241、2)SEQ ID NO：242-243或3)SEQ ID NO：244-245所示的氨基酸序列的参考抗原结合单元所诱导的血细胞凝集相比，在红细胞与本发明抗原结合单元接触后所诱导的血细胞凝集至少低1倍、至少低2倍、至少低3倍、至少低4倍、至少低5倍、至少低6倍、至少低7倍、至少低8倍、至少低9倍或至少低10倍。在一些情况下，与具有1)SEQ ID NO：240-241、2)SEQ ID NO：242-243或3)SEQ ID NO：244-245所示的氨基酸序列的参考抗原结合单元所诱导的血细胞凝集相比，在红细胞与本发明抗原结合单元接触后所诱导的血细胞凝集至少低10倍以上。
在一些情况下，血细胞凝集的证据根据RBC未沉降的存在来证明。在出现点状红点而不是雾状(haze)时，表明缺乏实质性血细胞凝集。
在一些方面，血细胞凝集可以量化，并表示为血细胞凝集指数。血细胞凝集指数可以根据在存在或不存在本发明抗原结合单元的情况下红细胞沉淀物的面积来量化。例如，可以手动确定或使用计算机软件如Image J确定红细胞沉淀物的直径。当使用计算机软件时，可以通过对组成沉淀物的像素数进行计数来确定红细胞沉淀物的面积。然后可以手动计算或通过使用软件如Excel计算该面积。在一些情况下，然后可以将该面积相对于对照数据集进行归一化，并表示为相对于最大血细胞凝集指数的百分比。在这样的实例中，本发明抗原结合单元可以诱导最大血细胞凝集指数的约0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％或更多。在一些实例中，本发明抗原结合单元诱导最大血细胞凝集指数的小于100％。例如，本发明抗原结合单元可以诱导最大血细胞凝集指数的小于约100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更小。
在一些方面，当抗原结合单元被添加到红细胞(RBC)的溶液中，其中RBC在合适的缓冲液如PBS中构成超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％RBC时，本发明抗原结合单元缺乏诱导实质性血细胞凝集的能力。在一些实例中，该溶液在合适的缓冲液如PBS中大于20％RBC。
在一些方面，在含有RBC的溶液中——其中抗原结合单元以约100μg/mL至约1pg/mL的浓度存在，本发明抗原结合单元缺乏诱导RBC的实质性血细胞凝集的能力。例如，当抗原结合单元的浓度为至少约0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL、0.4ng/mL、0.5ng/mL、0.6ng/mL、0.7ng/mL、0.8ng/mL、0.9ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL或更高时，观察实质性血细胞凝集的缺乏。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，在抗原结合单元被添加到红细胞，并孵育约10分钟至约10小时之后，抗原结合单元缺乏诱导实质性血细胞凝集的能力。例如，在约10min、15min、30min、45min、1hr、1.5hr、2hr、2.5hr、3hr、3.5hr、4hr、4.5hr、5hr、5.5hr、6hr、6.5hr、7hr、7.5hr、8hr、8.5hr、9hr、9.5hr、10hr或超过10hr的孵育时间之后未观察到实质性血细胞凝集。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元包含轻链CDR和重链CDR。本发明抗原结合单元可以包含表1中列出的任何LC-CDR或HC-CDR。另外或备选地，本发明抗原结合单元可以包含LC-CDR或HC-CDR，它们与表1中列出的任何LC-CDR或HC-CDR具有至少60％的同一性。在一些方面，本发明LC-CDR或HC-CDR可以表现出与表1中列出的任何SEQ IDNO至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高的序列同一性。
表1
在一些情况下，轻链(LC)CDR包含轻链LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；并且重链(HC)CDR包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3。在一些实例中，所述LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：1-22和162-190的序列。在一些实例中，所述HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：23-44和191-237的序列。在一些实例中，所述LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：1-22和162-190的序列，并且所述HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：23-44和191-237的序列。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元包含轻链CDR，其中所述轻链(LC)CDR包含三个LC-CDR，即LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的组合。3个LC-CDR的组合可以包含表2中列出的任何组合。
表2
实施例LC-CDR LC-CDR1 LC-CDR2 LC-CDR3
实施例1 SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：21
实施例2 SEQ ID NO：5 SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：16
实施例3 SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：17
实施例4 SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：20
实施例5 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：15
实施例6 SEQ ID NO：1 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：22
实施例7 SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：19
实施例8 SEQ ID NO：169 SEQ ID NO：173 SEQ ID NO：180
实施例9 SEQ ID NO：168 SEQ ID NO：173 SEQ ID NO：181
实施例10 SEQ ID NO：165 SEQ ID NO：177 SEQ ID NO：182
实施例11 SEQ ID NO：163 SEQ ID NO：178 SEQ ID NO：183
实施例12 SEQ ID NO：163 SEQ ID NO：172 SEQ ID NO：184
实施例13 SEQ ID NO：163 SEQ ID NO：178 SEQ ID NO：185
实施例14 SEQ ID NO：163 SEQ ID NO：178 SEQ ID NO：186
实施例15 SEQ ID NO：163 SEQ ID NO：170 SEQ ID NO：187
实施例16 SEQ ID NO：163 SEQ ID NO：174 SEQ ID NO：187
实施例17 SEQ ID NO：164 SEQ ID NO：175 SEQ ID NO：187
实施例18 SEQ ID NO：162 SEQ ID NO：178 SEQ ID NO：187
实施例19 SEQ ID NO：163 SEQ ID NO：178 SEQ ID NO：187
实施例20 SEQ ID NO：164 SEQ ID NO：178 SEQ ID NO：187
实施例21 SEQ ID NO：163 SEQ ID NO：179 SEQ ID NO：187
实施例22 SEQ ID NO：166 SEQ ID NO：176 SEQ ID NO：188
实施例23 SEQ ID NO：167 SEQ ID NO：171 SEQ ID NO：189
实施例24 SEQ ID NO：167 SEQ ID NO：171 SEQ ID NO：190
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元包含重链CDR，其中所述重链(HC)CDR包含三个HC-CDR，即HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的组合。3个HC-CDR的组合可以包含表3中列出的任何组合。
表3
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元包含轻链CDR和重链CDR，其中所述轻链CDR和所述重链CDR分别包含选自表2中列出的任何LC-CDR组合和表3中列出的任何HC-CDR组合的LC-CDR和HC-CDR。
在一些方面，本发明抗原结合单元是单克隆抗原结合单元、多克隆抗原结合单元、人源化抗原结合单元、嵌合抗原结合单元、单价抗原结合单元、多价抗原结合单元、双特异性抗原结合单元或其任意组合。抗原结合单元可以采取多种形式，包括但不限于sFC、Fv、ccFv、Fab’、F(ab’)2和Fd。此类抗原结合单位可以通过蓖麻毒素、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其它蛋白酶切割从完整的免疫球蛋白生成。
另外，可以利用重组免疫球蛋白技术设计抗原结合单元。例如，用于本发明的“Fv”免疫球蛋白可以通过经由肽连接体将可变轻链区与可变重链区连接来产生。例如，肽连接体可以是聚甘氨酸或另一种不形成α-螺旋或β-折叠基序的序列。Fv也可以在VH与VL区之间包含稳定的二硫键，如在美国专利6,147,203中所描述的，其通过引用全部并入本文。任何这些抗原结合单元可以在本发明中使用。在一些方面，抗原结合单元可以是具有与两条重链配对的两条轻链的完整免疫球蛋白。
抗原结合单元可以是包含轻链多肽和重链多肽的异源多聚体。抗原结合单元的实例包括但不限于(i)美国专利6,833,441公开的通过异二聚化序列稳定的ccFv片段，该美国专利整体并入本文；(ii)如本文所述包含至少一个ccFv片段的其它任何单价和多价分子；(iii)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(vi)F(ab′)2片段——包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；和(vii)双抗体。
可以通过向生产动物注射抗原组合物，经由标准方案产生多克隆抗体。参见，例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。当使用完整蛋白质或蛋白质的较大部分时，可以通过用蛋白质和合适的佐剂(例如，弗氏佐剂、弗氏完全佐剂、水包油乳剂等)免疫生产动物来产生抗体。当使用较小的肽时，将肽与较大的分子缀合以制备免疫刺激性缀合物是有利的。对于此类应用可商购获得的常用缀合蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)和匙孔血蓝蛋白(KLH)。为了产生针对特定表位的抗体，可以使用衍生自完整序列的肽。或者，为了生成针对蛋白质靶标的相对较短肽部分的抗体，如果多肽与载体蛋白质如卵清蛋白、BSA或KLH结合，则可以引发优异的免疫应答。
多克隆或单克隆抗原结合单元或抗体可以从经过遗传改变以产生人免疫球蛋白的动物产生。通过最初产生不产生动物天然抗体的“敲除”动物，并且用人抗体基因座(例如，通过使用人类人工染色体)稳定地转化该动物，可以产生转基因动物。在这类情况下，该动物仅产生人抗体。生成这类动物并从中获得抗体的技术在美国专利6,162,963和6,150,584中有描述，其通过引用整体并入于此。此类抗体可称为人类异种抗体。
或者，可以从含有人类可变区的噬菌体文库中产生抗原结合单元。参见美国专利6,174,708，其通过引用整体并入于此。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元由杂交瘤产生。例如，本文公开的抗原结合单元可由选自下组的杂交瘤产生：表达表1中列出的抗原结合单元之一的杂交瘤。例如，该杂交瘤可以是在[日期]以参考编号[插入参考编号]保藏的任何杂交瘤。
对于单克隆抗原结合单元或单克隆抗体，杂交瘤可以如下形成：分离经刺激的免疫细胞，如来自接种动物的脾脏的免疫细胞。然后，这些细胞可以与能够在细胞培养中无限复制的无限增殖化细胞如骨髓瘤细胞或经转化的细胞融合，从而产生无限增殖的免疫球蛋白分泌细胞系。使用的无限增殖细胞系可以被选择为缺乏对于利用某些营养物所必需的酶。许多此类细胞系(如骨髓瘤)是本领域技术人员已知的，并且包括，例如：胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)。这些缺陷允许根据融合细胞在例如次黄嘌呤氨基蝶呤胸苷培养基(HAT)上生长的能力来选择融合细胞。
此外，抗原结合单元可以通过遗传工程产生。本发明使用人源化的、嵌合的或异种的人抗原结合单元，其在施用于人时产生较少的免疫应答。
本文公开的抗原结合单元可具有降低的诱导人类不期望的免疫应答(例如，过敏性休克)的倾向，并且还可表现出降低的引发免疫应答(例如，人抗鼠抗体“HAMA”应答)的倾向，这将会防止抗体治疗剂或成像剂的重复剂量。此类抗原结合单元包括但不限于人源化的、嵌合的或异种的人抗原结合单元。
嵌合抗原结合单元或嵌合抗体可以例如经由重组手段，通过将从鼠(或来源于其它动物的)杂交瘤克隆获得的鼠可变轻链和重链区(VK和VH)与人恒定轻链和重链区组合以产生主要具有人类结构域的抗体而制备。这类嵌合抗体的产生是本领域公知的，并且可以通过标准手段实现(例如，如美国专利5,624,659所述，其通过引用整体并入本文)。
应用于非人(例如啮齿动物或灵长类动物)抗体的术语“人源化”是杂合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段，它们含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或灵长类动物的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR的残基所代替。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基所代替。此外，人源化抗体可以包含在接受体抗体和输入的CDR或构架序列中均未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改善和优化抗体性能，并使引入人体时的免疫原性最小化。在一些实例中，人源化抗体将包含至少一个(通常两个)可变域中的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR区都对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且全部或基本上全部FR区都是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。
可将人源化抗体工程化为含有人样免疫球蛋白结构域，并且仅并入动物来源的抗体的互补决定区。这可以通过仔细检查单克隆抗原结合单元或单克隆抗体的可变区的超变环序列，并将其装配到人抗原结合单元或人抗体链的结构来实现。参见，例如，美国专利6,187,287，其通过引用整体并入本文。
非人抗体的人源化方法是本领域公知的。“人源化”抗体是至少部分序列已经从其初始形式发生改变以使其更像人免疫球蛋白的抗体。在一些形式中，重(H)链和轻(L)链恒定(C)区被人序列代替。这可以是包含可变(V)区和异源免疫球蛋白C区的融合多肽。在一些形式中，互补决定区(CDR)包含非人抗体序列，而V构架区也已转化为人序列。参见，例如，EP0329400。在一些形式中，通过设计人和小鼠V区的共有序列，并转换CDR之外的在共有序列之间不同的残基，而对V区进行人源化。
原则上，来自人源化抗体的构架序列可以充当CDR移植的模板；然而，已经证明，直接CDR替代到这样的构架中可导致对抗原的结合亲和力的显著丧失。Glaser等人(1992)J.Immunol.149：2606；Tempest等人(1992)Biotechnology 9：266；和Shalaby等人(1992)J.Exp.Med.17：217。人抗体(HuAb)与原始鼠抗体(muAb)的同源性越高，人构架就越不可能将可降低亲和力的失真引入鼠CDR中。基于针对抗体序列数据库的序列同源性搜索，HuAbIC4提供了与muM4TS.22的良好构架同源性，不过其它高度同源的HuAb也是合适的，尤其是来自人亚群I的κL链或来自人亚群III的H链。Kabat等人(1987)。各种计算机程序如ENCAD(Levitt等人(1983)J.Mol.Biol.168：595)可用于预测V区的理想序列。因此，本发明包括具有不同可变(V)区的HuAb。确定合适的V区序列并优化这些序列在本领域技术人员的能力范围内。获得具有降低的免疫原性的抗体的方法还在美国专利5,270,202和EP 699,755中描述。
通过使用亲本和人源化序列的三维模型来分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程，可以制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是本领域技术人员熟悉的。可获得说明并显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可以从共有序列和输入序列中选择并组合FR残基，从而实现期望的抗体特性，如增加的靶抗原亲和力。
本发明抗原结合单元的人源化过程可以如下。基于用于移植的人抗体种系的同源性、规范结构和物理性质来选择最适合的种系接受者重链和轻链可变区。对mVH/VL与移植的hVH/VL进行计算机建模，并生成原型人源化抗体序列。如果建模表明需要构架回复突变，则生成具有指示的FW变化的第二变体。合成编码所选种系构架和鼠CDR的DNA片段。将合成的DNA片段亚克隆至IgG表达载体中，并通过DNA测序确认序列。使人源化抗体在诸如293F等细胞中表达，并在例如MDM吞噬试验和抗原结合试验中测试蛋白质。例如通过对表达靶抗原的细胞进行FACS将人源化抗原结合单元与亲本抗原结合单元在抗原结合亲和力方面进行比较。如果亲和力比亲本抗原结合单元低2倍以上，则可以生成第二轮人源化变体，并如上所述进行测试。
如上所述，抗原结合单元可以是“单价的”或“多价的”。前者的每个抗原结合单元有一个结合位点，后者含有多个结合位点，能够结合相同或不同种类的多于一个抗原。根据结合位点的数目，抗原结合单元可以是二价的(具有两个抗原结合位点)、三价的(具有三个抗原结合位点)、四价的(具有四个抗原结合位点)等。
多价抗原结合单元可以基于其结合特异性进一步分类。“单特异性”抗原结合单元是能够结合一种或多种相同类型抗原的分子。“多特异性”抗原结合单元是对至少两种不同抗原具有结合特异性的分子。虽然这些分子通常仅结合两种不同的抗原(即双特异性抗原结合单元)，但当在本文中使用时，该表达涵盖具有额外特异性的抗体，如三特异性抗体。本公开进一步提供了多特异性抗原结合单元。多特异性抗原结合单元是能够结合至少两种不同抗原的多价分子。优选的多特异性抗原结合单元是双特异性分子和三特异性分子，它们分别表现出对两种和三种不同抗原的结合特异性。
在本文公开的实施方案的一些方面，抗原结合单元是双特异性抗原结合单元，其中该抗原结合单元特异性结合CD47和第二抗原。在一些实例中，第二抗原不是CD47。在一些实例中，第二抗原是PD1或PD-L1。在一些实例中，第二抗原是其它免疫检查点分子，包括CTLA-4、OX40、OX40L、4-1BB(CD137)、CD40、CD40L、ICOS、CD70、CD27、GITR、GITRL、TL1A、TNFRSF25、VISTA、TIM-3、LAG-3、TIGIT、CD112、CD112R、CD226、CD96、B7-H3、B7-H4、CD48、CD244、CD200R、CD200、HVEM、BTLA、CD160、LIGHT、HHLA2、TMIGD2、BTNL2、CD39、CD73、NKG2A、NKG2D、MICA/B、KIR2DL-1、KIR2DL-2、KIR2DL-3和KIR3DL2。在一些实例中，第二抗原是EGFR。在一些实例中，第二抗原是CD19、CD20、CD22、CD33、CD44、CD52、CD79b、CD96、CD97、CD99、CD123、CD138、CD155、CD171、PTHR2、HAVCR2或其它已知的癌细胞标志物。合适的第二抗原的其它实例包括但不限于FcγRI、CD 15、p185HER2、HER3、FcγRIII(CD16)、CD3、恶性B细胞(1D10)、P97、密蛋白(claudin)18.2、OVCAR-3、磷脂酰肌醇聚糖-3、间皮素、L-D1(结肠癌)、Trop2、黑素细胞刺激激素类似物、ErbB2、CAMA1、MoV18、CAIX(羧基酸酐酶IX)、DCC、UNC5A、MET、TrkC、TrkA、RET、ALK、神经细胞粘附分子(NCAM)、叶酸结合蛋白(FBP)、GD2、GD3、EpCAM、EGP-40、VEGFR2、MUC-1、MUC-16、STEAP1(前列腺的六跨膜上皮抗原)、PSMA、PSCA(前列腺干细胞抗原)、GPC-3、LMP-1、DNAM-1(DNAX辅助分子-1)、泛癌相关抗原(AMOC-31)、皂草素、Id-1、CD7、CD38、CD30、CD44v7/8、CEA、蓖麻毒素A链、干扰素α(IFN-α)、杂交瘤独特型、长春花生物碱、碱性磷酸酶、纤维蛋白、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、低密度脂蛋白(LDL)、Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)、单纯疱疹病毒(HSV)、T细胞受体、流感、FcγR、HIV、EOTUBE、DPTA、半抗原、兔IgG、铁蛋白、辣根过氧化物酶(HRP)、激素、促生长素抑制素、P物质、FITC和β-半乳糖苷酶。其它合适的第二抗原包括但不限于肿瘤细胞抗原、细胞毒性触发分子、毒素、纤维蛋白溶解剂、细胞表面受体、感染性疾病靶标、疫苗佐剂、诊断剂、检测分子和报道分子。
本发明的多核苷酸和载体
在一些实施方案中，本公开提供了编码任何本文公开的抗原结合单元的分离的核酸。在另一个实施方案中，本公开提供了包含编码任何本文公开的抗原结合单元的核酸序列的载体。在一些实施方案中，本发明提供了分离的核酸，其编码本文公开的抗原结合单元的轻链CDR和重链CDR。
可以通过重组DNA技术、合成化学技术或其组合来制备本发明抗原结合单元。例如，通常使用本领域已知的标准分子技术将编码抗原结合单元的所需组分的序列(包括轻链CDR和重链CDR)组装克隆至表达载体中。这些序列可以从编码所需蛋白质序列的其它载体组装，使用各自模板核酸从PCR生成的片段组装，或通过编码所需序列的合成寡核苷酸组装而成。通过用包含目标抗原结合单元的表达载体转染合适的细胞，可以创建表达系统。
可以使用常规技术，包括但不限于杂交、PCR和DNA测序，容易地获得对应于现有抗体的轻链或重链的各个区的核苷酸序列并将其测序。产生单克隆抗体的杂交瘤细胞用作抗体核苷酸序列的优选来源。大量产生一系列单克隆抗体的杂交瘤细胞可以从公共或私有保藏库获得。最大的保藏机构是美国模式培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(atcc.org)，它提供多种良好表征的杂交瘤细胞系。或者，抗体核苷酸可以从经免疫的或未免疫的啮齿动物或人获得，并形成器官如脾脏和外周血淋巴细胞。在Orlandi等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86：3833-3837；Larrick等人(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.160：1250-1255；Sastry等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.86：5728-5732；和美国专利5,969,108中描述了适用于提取和合成抗体核苷酸的具体技术。
编码抗原结合单元的多核苷酸也可以被修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源非人序列而进行置换。以这种方式，制备嵌合抗体，其保留了原始抗原结合单元的结合特异性。
还应理解，本发明中体现的多核苷酸包括编码示例性多肽的功能等同物及其片段的多核苷酸。功能等同的多肽包括增强、降低或不显著影响所编码多肽性质的多肽。功能等同物可以是具有保守氨基酸置换的多肽，包含融合的类似物，和突变体。
由于遗传密码的简并性，抗原结合单元编码序列的核苷酸以及适合构建本发明的多核苷酸和载体的序列可以有相当大的变异。序列变体可具有修饰的DNA或氨基酸序列，一个或多个置换、缺失或添加，其净效应是保留所需的抗原结合活性。例如，可以在编码区中进行各种置换，其不改变编码的氨基酸且不导致保守变化。这些置换包括在本发明中。保守氨基酸置换包括以下组别内的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。虽然保守置换确实有效改变了将会产生的多肽中包含的一个或多个氨基酸残基，但该置换预计不会干扰将会产生的所得抗原结合单元的抗原结合活性。不改变编码的氨基酸残基的核苷酸置换可用于优化不同系统中的基因表达。适当的置换是本领域技术人员已知的，并且为了例如反映表达系统中的优选密码子使用而进行适当的置换。
如果需要，重组多核苷酸可包含有助于检测基因产物表达和基因产物纯化的异源序列。此类序列的实例是本领域已知的，并且包括编码报告蛋白的序列，该报告蛋白例如是β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物。其它促进纯化的异源序列可编码表位，如Myc、HA(源自流感病毒血凝素)、His-6、FLAG，或免疫球蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和麦芽糖结合蛋白(MBP)的Fc部分。
本文公开的多核苷酸可与上述多种化学功能部分缀合。常用的部分包括能够产生可检测信号的标记、信号肽、增强免疫反应性的药剂、促进与固体支持物偶联的试剂、疫苗载体、生物反应调节剂、顺磁标记和药物。这些部分可以通过重组或其它本领域已知的手段共价连接至多核苷酸。
本发明的多核苷酸可包含另外的序列，如相同转录单位内的另外的编码序列，控制元件如启动子，核糖体结合位点，以及多腺苷酸化位点，在相同或不同启动子控制下的另外的转录单位，允许宿主细胞克隆、表达和转化的序列，以及对于提供本发明实施方案而言可能需要的任何此类构建体。
本发明中体现的多核苷酸可以使用化学合成、重组克隆方法、PCR或其任何组合获得。化学多核苷酸合成方法是本领域公知的，不需要在此详细描述。本领域技术人员可以使用本文提供的序列数据，通过使用DNA合成仪或从商业服务进行订购来获得所需的多核苷酸。
可以将包含所需序列的多核苷酸插入合适的载体中，进而可将该载体引入合适的宿主细胞中进行复制和扩增。因此，本发明包括多种载体，其包含本发明的一种或多种多核苷酸。还提供了可选择的表达载体文库，其包含编码本文公开的抗原结合单元的至少一种载体。
本发明的载体通常包含表达抗原结合单元所需的转录或翻译控制序列。合适的转录或翻译控制序列包括但不限于转录和翻译的复制起点、启动子、增强子、阻抑物结合区、转录起始位点、核糖体结合位点、翻译起始位点和终止位点。
启动子的选择在很大程度上取决于载体所引入的宿主细胞。还可以利用通常与所需轻链或重链基因相关联的启动子，条件是这类控制序列与宿主细胞系统兼容。还可以使用细胞特异性或组织特异性启动子。本领域技术人员已经描述并使用了各种各样的组织特异性启动子。在选择性动物细胞中起作用的示例性启动子包括肝细胞特异性启动子和心肌特异性启动子。根据接受者细胞类型的选择，本领域技术人员将知道适用于构建本发明表达载体的其它合适的细胞特异性或组织特异性启动子。
使用已知的分子克隆或遗传工程技术，可将适当的转录控制序列、增强子、终止子或本领域已知的其它任何遗传元件整合成操作关系，任选地，另外，其中完整的可选融合基因将根据本发明进行表达。除上述元件之外，载体还可含有选择标记(例如，编码对用载体转化的宿主细胞生存或生长所必需的蛋白质的基因)，尽管这样的标记基因也可以在共同引入宿主细胞中的另一种多核苷酸序列上携带。
本发明的多核苷酸和载体具有几种特定用途。它们可用于例如产生抗原结合单元的表达系统。此类多核苷酸可用作引物，以实现所需多核苷酸的扩增。此外，本发明的多核苷酸还可用于药物组合物，包括疫苗、诊断剂和药物。
本发明的宿主细胞尤其可用作本发明多核苷酸的储存库、载体或用作根据其抗原结合特异性产生和筛选所需抗原结合单元的媒介物。
因此，本发明提供了一种鉴定与所需抗原具有免疫反应性的抗原结合单元的方法。这样的方法可包括以下步骤：(a)制备抗原结合单元的遗传多样性文库，其中该文库包含至少一种本发明抗原结合单元；(b)使该抗原结合单元文库与所需抗原接触；(c)检测抗原结合单元与抗原之间的特异性结合，从而鉴定与所需抗原具有免疫反应性的抗原结合单元。
抗原结合单元特异性结合所需抗原的能力可通过本领域熟知的多种程序来测试。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York；Gherardi等人(1990)J.Immunol.Meth.126：61-68。通常，表现出所需结合特异性的抗原结合单元可以通过免疫测定直接检测，例如，通过使标记的抗原结合单元与固定在固体支持物或基底上的抗原反应。通常，抗原所附着的基底由免疫测定期间表现出低水平的非特异性结合的材料制造。示例性固体支持物由以下类型材料中的一种或多种制成：塑料聚合物、玻璃、纤维素、硝化纤维素、半导体材料和金属。在一些实例中，基底是培养皿、色谱珠、磁珠等。
对于此类固相测定，通过洗涤除去未反应的抗原结合单元。然而，在液相测定中，通过一些其它分离技术如过滤或色谱法来除去未反应的抗原结合单元。在将抗原与标记的抗原结合单元结合后，确定结合的标记的量。该技术的一个变化形式是竞争性测定，其中抗原与原始结合分子结合至饱和。当一群本发明抗原结合单元引入至复合物时，只有表现出较高结合亲和力的那些才能竞争，从而保持与抗原结合。
或者，可通过细胞分选来评估与给定抗原的特异性结合，细胞分选涉及在待分选细胞上呈递所需抗原，然后用与可检测试剂偶联的抗原结合单元标记靶细胞，随后在细胞分选仪中将标记的细胞与未标记的细胞分离。荧光激活细胞分选(FACS)是一种复杂的细胞分离方法。使在细流中以单列行进的细胞通过激光束，然后测量由荧光标记的抗原结合单元结合的每个细胞的荧光。
洗脱下来的抗原结合单元的后续分析可涉及用于描述轻链和重链的氨基酸序列的蛋白质测序。基于推导的氨基酸序列，然后编码抗体多肽的cDNA可以通过重组克隆方法获得，该重组克隆方法包括PCR、文库筛查、现有核酸数据库中的同源性搜索或其任何组合。常用的数据库包括但不限于GenBank、EMBL、DDBJ、PDB、SWISS-PROT、EST、STS、GSS和HTGS。
当在噬菌体或细菌颗粒上展示抗原结合单元文库时，优选使用亲和色谱法进行选择。该方法通常继续将噬菌体抗原结合单元文库与抗原包被的板、柱基质、细胞或溶液中的生物素化抗原结合，然后捕获。洗涤与固相结合的噬菌体或细菌，然后通过可溶性半抗原、酸或碱洗脱该噬菌体或细菌。或者，增加抗原浓度可用来将抗原结合单元与亲和基质解离。如WO 92/01047所述，对于对抗原具有极高亲和力或亲合力的某些抗原结合单元，有效洗脱可能需要高pH或温和的还原溶液。
选择效率可能取决于多种因素的组合，包括洗涤期间的解离动力学，以及单个噬菌体或细菌上的多个抗原结合单元是否可以同时与固体支持物上的抗原结合。例如，具有快速解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可以通过在固体支持物上使用短洗涤、多价展示和抗原的高包被密度来保留。相反，通过使用长洗涤、单价噬菌体和抗原的低包被密度可有利于选择具有缓慢解离动力学(和良好结合亲和力)的抗原结合单元。
如果需要，可以针对不相关抗原对抗原结合单元文库进行预先选择，以反选不需要的抗原结合单元。还可以针对相关抗原对文库进行预先选择，以分离例如抗独特型抗原结合单元。
本发明的宿主细胞
在一些实施方案中，本公开提供了表达本文公开的任何一种抗原结合单元的宿主细胞。本发明的宿主细胞通常包含编码本文公开的任何一种抗原结合单元的核酸。
本发明提供了用上述多核苷酸、载体或载体文库转染的宿主细胞。可以通过多种适当手段中的任一种将载体引入合适的原核或真核细胞中，包括电穿孔、微粒轰击；脂质转染、感染(其中载体与感染因子偶联)，使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质转染。引入载体的方法的选择通常将取决于宿主细胞的特征。
对于大多数动物细胞，上述任何手段都适用于载体递送。优选的动物细胞是能够大量(例如，以毫克水平)表达外源引入的基因产物的脊椎动物细胞，优选哺乳动物细胞。优选细胞的非限制性实例是NIH3T3细胞、COS、HeLa和CHO细胞。
一旦被引入合适的宿主细胞中，抗原结合单元的表达可以使用本领域已知的任何核酸或蛋白质测定来确定。例如，可使用与抗原结合单元多核苷酸的任何区互补的探针，通过常规杂交测定(例如Northern印迹分析)、扩增程序(例如RT-PCR)、SAGE(美国专利5,695,937)和基于阵列的技术(参见例如美国专利5,405,783、5,412,087和5,445,934)来检测和/或量化轻链CDR或重链CDR的转录mRNA，或抗原结合单元的存在。
载体的表达还可以通过检查表达的抗原结合单元来确定。本领域中有多种技术可用于蛋白质分析。它们包括但不限于放射免疫测定、ELISA(酶联免疫放射测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、原位免疫测定(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、western印迹分析、免疫沉淀测定、免疫荧光测定和SDS-PAGE。
抗原结合单元的制备
在一些实施方案中，本公开提供了产生任何本文公开的抗原结合单元的方法，其中该方法包括在适于表达抗原结合单元的条件下培养表达抗原结合单元的宿主细胞，以及分离由宿主细胞表达的抗原结合单元。
所表达的抗原结合单元可以使用本领域已知的多种蛋白质纯化技术分离。通常，抗原结合单元作为分泌的多肽从培养基中分离，尽管它们也可在无信号肽的情况下直接产生时从宿主细胞裂解物或细菌周质中回收。如果抗原结合单元是膜结合的，它们可以通过本领域技术人员常用的适当去污剂溶液溶解。回收的抗原结合单元可以通过盐沉淀(例如，用硫酸铵)、离子交换色谱法(例如在中性pH下在阳离子或阴离子交换柱上运行并用离子强度增加的步骤梯度洗脱)、凝胶过滤色谱法(包括凝胶过滤HPLC)以及标签亲和柱色谱法，或亲和树脂如蛋白A、蛋白G、羟基磷灰石和抗免疫球蛋白进一步纯化。
另外，在本发明的方法和组合物中可以使用添加了以下部分的衍生免疫球蛋白：化学连接体，可检测部分如荧光染料，酶，底物，化学发光部分，特异性结合部分如链霉亲和素、亲和素或生物素，或药物缀合物。
另外，本文还公开了与化学功能部分缀合的抗原结合单元。通常，该部分是能够产生可检测信号的标记。这些缀合的抗原结合单元可用于例如检测系统，如肿瘤负荷的定量、转移灶的成像和肿瘤成像。此类标记是本领域已知的，并且包括但不限于放射性同位素、酶、荧光化合物、化学发光化合物、生物发光化合物底物辅因子和抑制剂。教导使用此类标签的专利的实例参见美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。该部分可以与抗原结合单元共价连接、重组连接或通过第二试剂如第二抗体、蛋白A或生物素-亲和素复合物与抗原结合单元缀合。
其它功能部分包括信号肽、增强免疫反应性的试剂、促进与固体支持物偶联的试剂、疫苗载体、生物反应调节剂、顺磁标记和药物。信号肽是短氨基酸序列，其引导新合成的蛋白质通过细胞膜(通常是真核细胞中的内质网)以及细菌的内膜或内膜和外膜二者。信号肽可以位于多肽的N-末端部分或多肽的C-末端部分，并且信号肽可以在多肽的生物合成与分泌之间从细胞酶促除去。这类肽可以被引入抗原结合单元中，以允许合成分子的分泌。
增强免疫反应性的试剂包括但不限于细菌超抗原。促进与固体支持物偶联的试剂包括但不限于生物素或亲和素。免疫原载体包括但不限于任何生理学上可接受的缓冲液。生物反应调节剂包括细胞因子，特别是肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-2、白介素-4、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和γ-干扰素。
合适的药物部分包括抗肿瘤剂。非限制性实例包括放射性同位素、长春花生物碱(如长春碱、长春新碱和硫酸长春地辛)、阿霉素、硫酸博来霉素、卡铂、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、盐酸柔红霉素、盐酸多柔比星、依托泊苷、氟尿嘧啶、洛莫司汀、盐酸氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、喷司他丁、哌泊澳烷、盐酸丙卡巴肼、链脲霉素、紫杉醇、硫鸟嘌呤和尿嘧啶氮芥。
免疫毒素，包括抗原结合单元，可以通过重组手段产生。各种免疫毒素的产生在本领域中是公知的，并且方法可见于例如，“Monoclonal Antibody-toxin Conjugates：Aiming the Magic Bullet，”Thorpe等人(1982)Monoclonal Antibodies in ClinicalMedicine，Academic Press，pp.168-190；Vitatta(1987)Science 238：1098-1104；以及Winter和Milstein(1991)Nature 349：293-299。合适的毒素包括但不限于蓖麻毒素、放射性核素、商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒素A链、真菌毒素如局限曲菌素，和磷脂酶。通常参见“Chimeric Toxins，”Olsnes和Pihl，Pharmac.Ther.15：355-381(1981)；以及“Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy，”Baldwin和Byers著，pp.159-179，224-266，Academic Press(1985)。
化学功能部分可以重组制备，例如通过产生编码抗原结合单元和功能部分的融合基因。或者，抗原结合单元可以通过各种熟知的化学程序中的任何一种化学键合到该部分。例如，当该部分是蛋白质时，连接可以通过异双官能交联剂，例如，SPDP、碳二亚胺戊二醛等。该部分可以通过第二试剂，如第二抗体、蛋白A或生物素-亲和素复合物共价连接或缀合。顺磁部分及其与抗体的缀合在本领域中是公知的。参见，例如，Miltenyi等人(1990)Cytometry 11：231-238。
使用和治疗方法
CD47特异性抗原结合单元和包含该抗原结合单元的药物组合物可以具有广泛的应用，包括但不限于治疗和诊断。
在一个实施方案中，本公开提供了包含药学上可接受的赋形剂和任何本文公开的抗原结合单元的药物组合物。
在另一个实施方案中，本公开提供了诱导表达CD47的细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括使表达CD47的细胞与任何本文公开的抗原结合单元接触。在一些方面，该细胞是癌细胞。在一些方面，该细胞是非淋巴瘤癌细胞。在一些方面，该细胞是非白血病癌细胞。在一些方面，该细胞是非淋巴瘤且非白血病癌细胞。在一些方面，该细胞是血液系统癌细胞。血液系统癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。作为非限制性实例，白血病的某些形式包括，急性淋巴细胞性白血病(ALL)；急性髓样白血病(AML)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；慢性髓性白血病(CML)；骨髓增生性疾病/赘生物(MPDS)；和骨髓增生异常综合征。作为非限制性实例，淋巴瘤的某些形式包括，霍奇金淋巴瘤、无痛性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。作为非限制性实例，骨髓瘤的某些形式包括，多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤以及轻链或Bence-Jones骨髓瘤。实体瘤包括，例如，乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、黑素瘤、结直肠肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、膀胱肿瘤、平滑肌肉瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、脑肿瘤、食道肿瘤、胃肿瘤、肝肿瘤和肾肿瘤。
在另一个实施方案中，本公开提供了在人类受试者中诱导表达CD47的细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括对该人类受试者施用包含药学上可接受的赋形剂和任何本文公开的抗原结合单元的药物组合物。在一些方面，该细胞是癌细胞。在一些方面，该细胞是非淋巴瘤癌细胞。在一些方面，该细胞是非白血病癌细胞。在一些方面，该细胞是非淋巴瘤且非白血病癌细胞。在一些方面，该细胞是血液系统癌细胞。血液系统癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。作为非限制性实例，白血病的某些形式包括，急性淋巴细胞性白血病(ALL)；急性髓样白血病(AML)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；慢性髓性白血病(CML)；骨髓增生性疾病/赘生物(MPDS)；和骨髓增生异常综合征。作为非限制性实例，淋巴瘤的某些形式包括，霍奇金淋巴瘤、无痛性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。作为非限制性实例，骨髓瘤的某些形式包括，多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤以及轻链或Bence-Jones骨髓瘤。实体瘤包括，例如，乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、黑素瘤、结直肠肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、膀胱肿瘤、平滑肌肉瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、脑肿瘤、食道肿瘤、胃肿瘤、肝肿瘤和肾肿瘤。
在本文公开的诱导吞噬作用的方法的一些方面，表达CD47的细胞的吞噬作用以1％至100％范围内的效率发生。在一些实例中，吞噬作用以约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的效率发生。在一些实例中，吞噬作用以至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的效率发生。在本文公开的任何实施方案的一些方面，与参考抗原结合单元相比，抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。这样的参考抗原结合单元可以具有1)SEQ ID NO：240-241、2)SEQ ID NO：242-243或3)SEQ ID NO：244-245所示的氨基酸序列，或其它任何已知的抗-CD47抗原结合单元。吞噬作用的程度可以通过本领域已知的任何方法来确定。在一些情况下，吞噬作用的程度根据巨噬细胞群体中执行吞噬的巨噬细胞(称为吞噬细胞)的数目来确定。例如，可以确定每100个巨噬细胞的吞噬细胞数目，使得吞噬作用的程度可以表示为百分比或吞噬指数。
在本文公开的诱导吞噬作用的方法的一些方面，在所述方法中使用的抗原结合部不引起显著的血细胞凝集。在一些情况下，与具有1)SEQ ID NO：240-241、2)SEQ ID NO：242-243或3)SEQ ID NO：244-245所示的氨基酸序列的参考抗原结合单元所诱导的血细胞凝集相比，在所述使用任何本文公开的抗原结合单元的方法中诱导的血细胞凝集至少低1倍。在一些情况下，与具有1)SEQ ID NO：240-241、2)SEQ ID NO：242-243或3)SEQ ID NO：244-245所示的氨基酸序列的参考抗原结合单元所诱导的血细胞凝集相比，在红细胞与本发明抗原结合单元接触后所诱导的血细胞凝集至少低1倍、至少低2倍、至少低3倍、至少低4倍、至少低5倍、至少低6倍、至少低7倍、至少低8倍、至少低9倍或至少低10倍。在一些情况下，与具有1)SEQ ID NO：240-241、2)SEQ ID NO：242-243或3)SEQ ID NO：244-245所示的氨基酸序列的参考抗原结合单元所诱导的血细胞凝集相比，在红细胞与本发明抗原结合单元接触后所诱导的血细胞凝集至少低10倍以上。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法。在一些方面，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的任何本文公开的抗原结合单元。在一些方面，该癌症是非淋巴瘤癌症。在一些方面，该癌症是非白血病癌症。在一些方面，该癌症是非淋巴瘤且非白血病癌症。在一些方面，所述细胞是血液系统癌细胞。该血液系统癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。作为非限制性实例，白血病的某些形式包括，急性淋巴细胞性白血病(ALL)；急性髓样白血病(AML)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；慢性髓性白血病(CML)；骨髓增生性疾病/赘生物(MPDS)；和骨髓增生异常综合征。作为非限制性实例，淋巴瘤的某些形式包括，霍奇金淋巴瘤、无痛性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。作为非限制性实例，骨髓瘤的某些形式包括，多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤、以及轻链或Bence-Jones骨髓瘤。实体瘤包括，例如，乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、黑素瘤、结直肠肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、膀胱肿瘤、平滑肌肉瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、脑肿瘤、食道肿瘤、胃肿瘤、肝肿瘤和肾肿瘤。在大多数情况下，有效量经由本领域中公知的测试方法凭经验确定。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法。在一些方面，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含药学上可接受的赋形剂和任何本文公开的抗原结合单元的药物组合物。在一些方面，该癌症是非淋巴瘤癌症。在一些方面，该癌症是非白血病癌症。在一些方面，该癌症是非淋巴瘤且非白血病癌症。在一些方面，所述细胞是血液系统癌细胞。该血液系统癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。作为非限制性实例，白血病的某些形式包括，急性淋巴细胞性白血病(ALL)；急性髓样白血病(AML)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；慢性髓性白血病(CML)；骨髓增生性疾病/赘生物(MPDS)；和骨髓增生异常综合征。作为非限制性实例，淋巴瘤的某些形式包括，霍奇金淋巴瘤、无痛性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。作为非限制性实例，骨髓瘤的某些形式包括，多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤以及轻链或Bence-Jones骨髓瘤。实体瘤包括，例如，乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、黑素瘤、结直肠肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、膀胱肿瘤、平滑肌肉瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、脑肿瘤、食道肿瘤、胃肿瘤、肝肿瘤和肾肿瘤。在大多数情况下，有效量经由本领域中公知的测试方法凭经验确定。
通过本发明的方法治疗的目标癌症包括但不限于白血病；急性白血病，如T-ALL、B-ALL、AML等；淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)；肉瘤；黑素瘤；腺瘤；实体组织癌，包括卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、鳞状细胞癌、移行细胞癌等，低氧性肿瘤，口、喉、咽和肺的鳞状细胞癌，泌尿生殖系统癌症，如宫颈癌和膀胱癌，造血系统癌症，头颈癌，和神经系统癌症，如神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤等，良性病变，如乳头状瘤等。
癌症的治疗可通过降低癌细胞生长来证明，包括但不限于降低癌细胞的增殖，以及降低非癌性细胞成为癌细胞的发生率。癌细胞生长的降低是否已经实现可使用任何已知的测定容易地确定，该测定包括但不限于[3H]-胸苷掺入；经过一段时间的细胞数计数；检测和/或测量与AML等相关的标志物。物质或该物质的具体量是否可有效治疗癌症可以使用多种已知癌症诊断试验中的任何一种来评估，包括但不限于活检、造影射线照相研究、CAT扫描和与个体血液中的癌症相关的肿瘤标志物的检测。该物质可以全身或局部施用，通常是全身施用。
在一些方面，癌症的治疗可以通过减小的肿瘤体积来证明。可以使用任何本领域已知的方法来确定肿瘤体积。例如，可通过使用卡尺测量肿瘤来确定肿瘤体积。在这类情况下，可以测量肿瘤的两个维度，并且可以使用公式V＝0.5a x b2来确定肿瘤体积，其中a和b是第一和第二直径。在一些情况下，第一直径是长径或两个直径中的较大者。在一些情况下，第二直径是短径或两个直径中的较小者。
在一些方面，癌症的治疗可以通过减小的肿瘤体积来证明。在一些情况下，肿瘤体积减小1％至100％范围内的百分比。在一些实例中，肿瘤体积减小约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实例中，肿瘤体积减小至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单元可以比参考抗原结合单元更大程度地减小肿瘤体积。这样的参考抗原结合单元可以具有1)SEQ ID NO：240-241、2)SEQ ID NO：242-243或3)SEQ ID NO：244-245所示的氨基酸序列，或其它任何已知的抗-CD47抗原结合单元。
在一些方面，本发明抗原结合单元与参考抗原结合单元的效果比较可通过计算抗肿瘤有效性来确定。在这类情况下，肿瘤体积可以是如上所述的量度。或者，可以确定或测量肿瘤大小的不同参数或肿瘤的其它合适的特征。当采用可定量的特征如肿瘤体积时，抗肿瘤效果可以使用下式来确定：T/C，其中T是针对治疗组所选择的测量(例如，肿瘤体积)，而C是针对对照组所选择的测量(例如，肿瘤体积)。抗肿瘤效果可以在任何希望的时间段内确定，并且可以使用来自任何所需数目的样品的平均值来确定。抗肿瘤效果可以表示为数字或百分比。在一些实例中，抗肿瘤效果可以是约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实例中，抗肿瘤效果可以是最多1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实例中，抗肿瘤效果可以是至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
本文公开的组合物，例如抗原结合单元和药物组合物，可以使用任何医学上合适的程序来施用，例如，血管内(静脉内、动脉内、毛细血管内)给药、注射到淋巴结内等。血管内注射可以通过静脉内或动脉内注射。将要给予特定患者的组合物的有效量将取决于多种因素，其中一些因素在患者之间不同，并且可以根据经验来确定。该组合物的剂量将取决于所确定的治疗方案、给药途径、治疗剂的性质、肿瘤对治疗剂的敏感性，等等。利用LD50动物数据，以及对于本文公开的抗原结合单元可获得的其它信息，临床医生能够确定用于个体的最大安全剂量，这取决于给药途径。例如，静脉内施用的剂量可以比局部施用的剂量多，这是考虑到所施用治疗性组合物的体液的量更大。类似地，从身体中快速清除的组合物可以以较高的剂量施用，或者以重复剂量施用，以维持治疗浓度。利用普通技术，主管医生能够优化具体组合物的剂量。
在一些方面，提供了一种癌症治疗方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的任何上述包含本发明抗原结合单元的药物组合物。在一些实施方案中，该癌症为白血病、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌(包括非小细胞肺癌或癌症)、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈癌、结直肠癌、皮肤癌、脑瘤或肝细胞癌(HCC)。在一些方面，该癌症是白血病。该癌症可以是实体瘤。该癌症可以是混合谱系白血病(MLL)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性单核细胞性白血病(AML)、毛细胞性白血病和/或其它白血病；骨髓增生性疾病/赘生物(MPDS)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤、轻链或Bence-Jones骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤。该癌症可以是淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的所有亚型。
本公开还提供了联合治疗方法，其中已知会调节其它途径或相同途径的其它组分的药剂，或者甚至重叠组的靶酶，与本发明抗原结合单元或包含本发明抗原结合单元的药物组合物联合使用。在一方面，这样的治疗包括但不限于一种或多种本公开的抗原结合单元与化疗剂、治疗性抗体和放射治疗的组合，以提供协同的或累加的治疗效果。
当需要时，本发明抗原结合单元可以与Notch抑制剂和/或c-Myb抑制剂联合使用。当需要时，本公开的抗原结合单元或药物组合物可以与MLL-WDR5抑制剂和/或Dotl1抑制剂联合使用。
许多化疗剂是目前本领域已知的，并且可与本发明抗原结合单元联合使用。在一些实施方案中，该化疗剂选自有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素(intercalating antibiotics)、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物反应调节剂、抗激素、血管生成抑制剂和抗雄激素。
非限制性实例为化疗剂、细胞毒性剂和非肽小分子如(甲磺酸伊马替尼)、(硼替佐米)、Casodex(比卡鲁胺)、(吉非替尼)和阿霉素以及许多化疗剂。化疗剂的非限制性实例包括烷化剂，如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲蜜胺类，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酸胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素如阿克那霉素、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素、CasodexTM、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷，雄激素类，如卡芦睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素类，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；安吖啶；贝塔布辛(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elfomithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSK.RTM.；丙亚胺；西左非兰；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2，2′，2左非三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二澳甘露醇；二澳卫矛醇；哌泊澳烷；加胞嘧啶；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOLTM，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他赛(TAXOTERETM，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。合适的化疗细胞调节剂还包括用来调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬(NolvadexTM)、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲奥昔芬、雷洛昔芬、LY 117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素类，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；喜树碱-11(CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)。需要时，本公开的抗原结合单元或药物组合物可与常开出的抗癌药联合使用，该抗癌药如 ABVD、AVICINE、阿巴伏单抗、吖啶甲酰胺、阿德木单抗、17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、Alpharadin、阿伏西地(Alvocidib)、3-氨基吡啶-2-甲醛缩氨基硫脲、氨萘非特、蒽二酮、抗-CD22免疫毒素、抗肿瘤药、抗肿瘤发生药草、阿帕齐醌、阿替莫德、硫唑嘌呤、贝洛替康、苯达莫司汀、BIBW 2992、比立考达、澳他利星、苔藓抑素、丁硫氨酸亚砜胺、CBV(化疗)、花萼海绵诱癌素、细胞周期非特异性抗肿瘤剂、二氯乙酸、盘皮海绵内酯、依沙芦星、依诺他滨、埃博霉素、艾日布林、依维莫司、依沙替康、依昔舒林、弥罗松酚、呋咯地辛、磷雌酚、ICE化疗方案、IT-101、伊美克、咪喹莫德、吲哚并咔唑、伊罗夫文、拉尼喹达、拉罗他赛、来那度胺、硫恩酮、勒托替康、马磷酰胺、米托唑胺、萘福昔定、奈达铂、奥拉帕利、奥他赛、PAC-1、木瓜、匹克生琼、蛋白酶体抑制剂、蝴蝶霉素、瑞喹莫德、芦比替康、SN-38、放线菌酰胺A(Salinosporamide A)、沙帕他滨、Stanford V、苦马豆素、他拉泊芬、他立喹达、喃氟啶-尿嘧啶、替莫唑胺、替司他赛、四硝酸三铂(Triplatin tetranitrate)、三(2-氯乙基)胺、曲沙他滨、乌拉莫司汀、伐地美生、长春氟宁、ZD6126或佐舒喹达。
本公开还涉及使用本文提供的抗原结合单元或药物组合物联合放射治疗在哺乳动物中抑制异常细胞生长或治疗过度增生性病症的方法。施用放射治疗的技术是本领域已知的，并且这些技术可在本文所述的联合治疗中使用。
放射治疗可通过以下几种方法之一或方法的组合施用，包括但不限于外线束治疗、内辐射治疗、植入辐射、立体定向放射手术、全身放射治疗、放疗和永久或临时的间质内近距离放射治疗。如本文所用的术语“近距离放射治疗”是指由插入体内肿瘤或其它增生组织疾病部位处或附近的空间限定的放射性物质所提供的放射治疗。本术语旨在包括但不限于暴露于放射性同位素(例如At-211、I-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32和Lu的放射性同位素)。用作本公开的细胞调节物的合适的放射源包括固体和液体两者。作为非限制性的实例，辐射源可以是放射性核素，如I-125、I-131、Yb-169、作为固体源的Ir-192，作为固体源的I-125，或其它发射光子、β粒子、γ辐射或其它治疗射线的放射性核素。放射性物质也可以是由任何放射性核素的溶液形成的流体，例如I-125或I-131的溶液，或可使用含有固体放射性核素(如Au-198，Y-90)小颗粒的合适的流体浆产生放射性流体。此外，放射性核素可包含在凝胶或放射性微球中。
本公开的抗原结合单元或药物组合物可与一定量的一种或多种物质联合使用，该物质选自抗血管生成剂、信号转导抑制剂、抗增殖剂、糖酵解抑制剂或自噬抑制剂。
抗血管生成剂，如MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂和COX-11(环加氧酶11)抑制剂，可与本公开的抗原结合单元和本文所述的药物组合物结合使用。抗血管生成剂包括，例如，雷帕霉素、西罗莫司(CCI-779)、依维莫司(RAD001)、索拉非尼、舒尼替尼和贝伐珠单抗。有用的COX-II抑制剂的实例包括CELEBREXTM(alecoxib)、伐地考昔和罗非昔布。有用的基质金属蛋白酶抑制剂的实例描述于WO 96/33172(公布于1996年10月24日)、WO 96/27583(公布于1996年3月7日)、欧洲专利申请97304971.1(提交于1997年7月8日)、欧洲专利申请99308617.2(提交于1999年10月29日)、WO 98/07697(公布于1998年2月26日)、WO 98/03516(公布于1998年1月29日)、WO 98/34918(公布于1998年8月13日)、WO 98/34915(公布于1998年8月13日)、WO 98/33768(公布于1998年8月6日)、WO 98/30566(公布于1998年7月16日)、欧洲专利公开606,046(公布于1994年7月13日)、欧洲专利公开931，788(公布于1999年7月28日)、WO 90/05719(公布于1990年5月31日)、WO 99/52910(公布于1999年10月21日)、WO 99/52889(公布于1999年10月21日)、WO99/29667(公布于1999年6月17日)、PCT国际专利申请PCT/IB98/01113(提交于1998年7月21日)、欧洲专利申请99302232.1(提交于1999年3月25日)、英国专利申请9912961.1(提交于1999年6月3日)、美国临时申请60/148,464(提交于1999年8月12日)、美国专利5,863,949(于1999年1月26日授权)、美国专利5,861,510(于1999年1月19日授权)和欧洲专利公开780,386(公布于1997年6月25日)中，所有这些都通过引用整体并入本文。优选的MMP-2和MMP-9抑制剂是没有或具有很少的抑制MMP-1的活性的那些抑制剂。更优选的是相对于其它基质-金属蛋白酶(例如，MAP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12和MMP-13)选择性地抑制MMP-2和/或AMP-9的那些抑制剂。在本公开中有用的MMP抑制剂的一些具体实例是AG-3340、RO 32-3555和RS 13-0830。
自噬抑制剂包括但不限于氯喹、3-甲基腺嘌呤、羟氯喹(PlaquenilTM)、巴弗洛霉素A1、5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷(AICAR)、冈田酸、抑制2A型或1型蛋白磷酸酶的自噬抑制性藻毒素、cAMP的类似物，以及提升cAMP水平的药物，如腺苷、LY204002、N6-巯基嘌呤核苷和长春碱。此外，还可以使用抑制蛋白质表达的反义或siRNA，该蛋白质包括但不限于ATG5(与自噬有关)。
在一些实施方案中，本文描述的抗原结合单元和药物组合物与也被称为润滑剂的液体或固体组织屏障一起配制或施用。组织屏障的实例包括但不限于多糖、蛋白多糖、seprafilm、INTERCEED和透明质酸。
在一些实施方案中，与本发明抗原结合单元一起施用的药物包括任何合适的可以通过吸入有效递送的药物，例如，诸如可待因、二氢吗啡、麦角胺、芬太尼或吗啡的镇痛药；诸如地尔硫的心绞痛制剂；诸如色甘酸盐、酮替芬或奈多罗米的抗变态反应药；诸如头孢菌素类、青霉素类、链霉素、磺胺类、四环素类或喷他脒的抗感染药；诸如美沙吡林的抗组胺药物；诸如倍氯米松、氟尼缩松、布地奈德、替泼尼旦、曲安奈德或氟替卡松的抗炎药；诸如那可丁的止咳药；支气管扩张剂，如麻黄素、肾上腺素、非诺特罗、福莫特罗、异丙肾上腺素、异丙喘宁、去氧肾上腺素、苯丙醇胺、吡布特罗、瑞普特罗、利米特罗、沙丁胺醇、沙美特罗、特布他林、异他林、妥洛特罗、异丙喘宁或(-)-4-氨基-3，5-二氯-α-[[[6-[2-(2-吡啶基)乙氧基]己基]-氨基]甲基]苯甲醇；诸如阿米洛利的利尿剂；诸如异丙托品、阿托品或氧托品的抗胆碱能药；诸如可的松、氢化可的松或泼尼松龙的激素；诸如氨茶碱、胆茶碱、赖氨酸茶碱或茶碱的黄嘌呤类；以及诸如胰岛素和胰高血糖素的治疗性蛋白质和肽类。本领域技术人员将清楚，在适当的情况下，药物以盐形式(例如作为碱金属盐或胺盐，或作为酸加成盐)或作为酯(例如，低级烷基酯)或溶剂化物(例如水合物)使用，以优化药物的活性和/或稳定性。
其它可用于联合疗法的示例性治疗剂包括但不限于如上所述的药剂、放射治疗、激素拮抗剂、激素及其释放因子、甲状腺和抗甲状腺药物、雌激素和孕激素、雄激素、促肾上腺皮质激素；肾上腺皮质类固醇及其合成类似物；肾上腺皮质激素的合成和作用的抑制剂、胰岛素、口服降血糖药及内分泌胰腺药理学，影响钙化和骨转换的药剂：钙、磷酸盐、甲状旁腺激素、维生素D、降钙素、维生素(如水溶性维生素、复合维生素B、抗坏血酸、脂溶性维生素、维生素A、K和E)、生长因子、细胞因子、趋化因子、毒蕈碱受体激动剂和拮抗剂；抗胆碱酯酶剂；作用于神经肌肉接点和/或自主神经节的药剂；儿茶酚胺，拟交感神经药，和肾上腺素能受体激动剂或拮抗剂；和5-羟色胺(5-HT，血清素)受体激动剂和拮抗剂。
治疗剂还可包括用于疼痛和炎症的药剂，如组胺和组胺拮抗剂、缓激肽和缓激肽拮抗剂、5-羟色胺(血清素)、由膜磷脂的选择性水解产物的生物转化所产生的脂质物质、类花生酸、前列腺素、血栓烷、白三烯、阿司匹林、非甾体抗炎剂、解热镇痛剂、抑制前列腺素和血栓烷的合成的药剂、可诱导型环加氧酶的选择性抑制剂、可诱导型环加氧酶-2的选择性抑制剂、自体有效物质、旁分泌激素、促生长素抑制素、胃泌素、介导体液和细胞免疫应答涉及的相互作用的细胞因子、脂质衍生的自体有效物质、类花生酸、β-肾上腺素能激动剂、异丙托铵、糖皮质激素、甲基黄嘌呤、钠通道阻滞剂、阿片受体激动剂、钙通道阻滞剂、膜稳定剂和白三烯抑制剂。
本文考虑到的其它治疗剂包括利尿剂、血管加压素、影响肾对水的保持的药剂、凝乳酶、血管紧张素、用于治疗心肌缺血的药剂、抗高血压剂、血管紧张素转化酶抑制剂、β-肾上腺素能受体拮抗剂、用于治疗高胆固醇血症的药剂、用于治疗血脂异常的药剂。
考虑到的其它治疗剂包括用于控制胃液酸度的药物、用于治疗消化性溃疡的药剂、用于治疗胃食管反流病的药剂、胃动力药、止吐药、用于肠易激综合征的药剂、用于腹泻的药剂、用于便秘的药剂、用于炎性肠病的药剂、用于胆道疾病的药剂、用于胰腺疾病的药剂。用于治疗原虫感染的治疗剂、用于治疗疟疾、阿米巴病、贾第虫病、滴虫病、锥虫病和/或利什曼病的药物、和/或用于蠕虫病的化学治疗的药物。其它治疗剂包括抗微生物剂，磺胺，甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑喹诺酮，和用于尿路感染的药剂，青霉素，头孢菌素等，β-内酰胺抗生素，包含氨基糖苷的药剂，蛋白质合成抑制剂，在肺结核、鸟复合分枝杆菌病以及麻风病的化疗中使用的药物，抗真菌剂，抗病毒剂，包括非逆转录病毒药剂和抗逆转录病毒药剂。
可与本公开的抗原结合单元联合的治疗性抗体的实例包括但不限于抗受体酪氨酸激酶抗体(西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗)、抗CD20抗体(利妥昔单抗、托西莫单抗)和其它抗体，如阿仑珠单抗、贝伐珠单抗和吉妥珠单抗。
此外，本发明的方法也考虑用于免疫调节的治疗剂，如免疫调节剂、免疫抑制剂、耐受原和免疫刺激剂。此外，还有作用于血液和造血器官的治疗剂、血液生成剂、生长因子、矿物质和维生素、抗凝剂、溶解血栓剂和抗血小板药物。
为了治疗肾癌，可以将本公开的抗原结合单元与索拉非尼和/或阿瓦斯丁(Avastin)组合。为了治疗子宫内膜病症，可以将本公开的抗原结合单元与多柔比星、泰素帝(紫杉醇)和/或顺铂(卡铂)组合。为了治疗卵巢癌，可以将本公开的抗原结合单元与顺铂(卡铂)、泰索帝、多柔比星、托泊替康和/或他莫昔芬组合。为了治疗乳腺癌，可以将本公开的抗原结合单元与泰索帝(紫杉醇)、吉西他滨(卡培他滨)、他莫昔芬、来曲唑、特罗凯、拉帕替尼、PD0325901、阿瓦斯丁、赫赛汀(herceptin)、OSI-906和/或OSI-930组合。为了治疗肺癌，可以将本公开的抗原结合单元与泰索帝(紫杉醇)、吉西他滨、顺铂、培美曲塞、特罗凯、PD0325901和/或阿瓦斯丁组合。
可与本公开的抗原结合单元联合的其它治疗剂可见于Goodman和Gilman的“ThePharmacological Basis of Therapeutics”第十版，Hardman，Limbird和Gilman编，或Physician’s Desk Reference，这两者均通过引用整体并入本文。
根据所治疗的状况，本文所述的抗原结合单元可与本文公开的药剂或其它合适的药剂联合使用。因此，在一些实施方案中，一种或多种本公开的抗原结合单元将与如上所述的其它药剂共同施用。当在联合治疗中使用时，本文所述的抗原结合单元可与第二药剂同时或分开施用。这种联合施用可包括两种药剂在同一剂型中同时施用，在分开的剂型中同时施用，以及分开施用。也就是说，本文所述的抗原结合单元和任何上述药剂可以在同一剂型中配制在一起并同时施用。或者，本公开的抗原结合单元和任何上述药剂可同时施用，其中两种药剂存在于分开的制剂中。在另一种替代方案中，可以施用本公开的抗原结合单元，随后紧接着施用任何上述药剂，或者相反。在分开施用方案的一些实施方案中，本公开的抗原结合单元和任何上述药剂间隔数分钟或间隔数小时或间隔数天施用。
在下面的实施例部分提供了本发明的抗原结合单元、多核苷酸、载体和宿主细胞的开发和使用的进一步说明。提供这些实施例作为本领域普通技术人员的指导，而不意味着以任何方式进行限制。
实施例
给出以下实施例是为了说明本发明的各个实施方案，而不是意味着以任何方式限制本发明。这些实施例以及本文所述的方法目前代表优选的实施方案，是示例性的，并非旨在作为对本发明的范围的限制。本领域技术人员将会想到包含在由权利要求的范围所限定的本发明范围内的改变和其它应用。
实施例1.抗原结合单元生成和筛选
使用两个不同的小鼠品系(BALB/c和C57/BL6)进行免疫，以产生抗CD47单克隆抗体。CD47的重组片段，SEQ ID NO：161，在293F细胞中表达，并用于免疫。分析来自连续或终末血液样品的血清中特异性抗体的存在。使用血清滴度数据来选择用于杂交瘤融合的小鼠。
从最佳反应动物的脾脏制备单细胞悬浮液，并与骨髓瘤细胞进行电融合，之后在96孔板中接种并培养。杂交瘤然后在选择培养基中培养7天，之后进行上清液筛选。
产生的抗原结合单元通过以下组合进行表征：通过ELISA测定杂交瘤上清液与CD47蛋白的结合，使用流式细胞术测定Raii细胞表达的人CD47，以及中和ELISA。抗原结合单元进一步在CD47-SIRPα相互作用测定中通过其阻断功效进行表征。商业化的抗CD47mAb，被称为“阳性1”，用作阳性对照，而稀释的免疫前血清用作阴性参考。
进行亚克隆以获得单克隆杂交瘤细胞系。
实施例2.巨噬细胞吞噬试验
所选的抗体命中物在巨噬细胞吞噬试验中进行评估，以证实体外功能活性。人单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)与用荧光染料CSFE标记的靶肿瘤细胞HL-60共培养。孵育两小时后由Cellomics分析吞噬作用。计算含有肿瘤细胞的巨噬细胞的百分比，并表示为吞噬指数。来自一个代表性实验的结果示于图1中。在图1中，抗体以3微克/毫升的浓度存在；白色箭头指向被吞噬的AML细胞的实例；人前髓细胞性白血病HL-60细胞被标记为绿色；人巨噬细胞标记为红色。
对于该试验，用CD14 Miltenyi细胞分离珠从人PBMC纯化人单核细胞。将纯化的CD14+单核细胞在M-CSF(100ng/ml)的存在下在T75烧瓶中培养7-10天。通过在解离缓冲液中孵育5分钟，然后轻轻刮擦，来收获单核细胞衍生的巨噬细胞。然后，用PKH26(红色)标记M2细胞，将1×104个巨噬细胞接种在平底96孔组织培养板中含有10％FBS的IMDM中24小时，将培养基替换为无血清培养基再孵育2小时。在所示抗体的存在下向孔中加入5×104个CFSE标记的HL-60细胞，保持2小时。用IMDM洗孔3次，并用2％PFA固定细胞。然后在Cellomics机器上分析荧光标记的细胞。
吞噬指数通过计算每100个巨噬细胞的吞噬细胞数目来确定，该数据在OfficeExcel中计算并在Prism5中绘图，如图2A-2B所示。EC50基于最大吞噬指数的百分数计算，如表4所示。
表4
ABU EC50(nM)
ABU1 +++
ABU2 +++
ABU3 ++
ABU4 +++
ABU5 ++
ABU6 +++
ABU7 +
阳性1 ++
阳性2 ++
+++：<lnM：++：>lnM且<5nM；+：>5nM
实施例3.CD47结合试验
所选抗体(ABU-#)和嵌合抗体(C-ABU-#)的抗体的结合亲和力通过利用ELISA或流式细胞术使用表达CD47的CHO细胞和Jurkat细胞两者来测定。使用Biacore T100(GEHealthcare)通过SPR研究抗原结合单元的蛋白质结合动力学。可商购的参考抗体用作对照。
对于基于ELISA的结合分析，将浓度为1μg/mL的人SIRPA(Novoprotein，目录号C385)在96-半孔板的底部4℃包被过夜。在用PBST(含有0.05％吐温20的PBS(Sangon，目录号9005-64-5))洗涤3次后，用PBS中的3％脱脂乳(DOUBLE HELIX，目录号P10033)在室温下封闭1小时。将系列稀释的人CD47蛋白(Novoprotein，目录号CG18)加入到孔中，并在室温下孵育1小时；PBST洗涤3次后，用HRP缀合的针对人IgG-Fc的山羊多克隆第二抗体(Abcam，目录号ab98624)检测结合的CD47蛋白，然后在PBST洗涤3次后用TMB底物(Biopanda，目录号TMB-S-003)显色，随后测量OD450。通过GraphPad Prism分析结合曲线(OD450对CD47浓度)，并计算EC90用于CD47中和研究。结合结果在以下表5中示出。
表5
++++：<0.05nM：+++：>0.05nM且<1nM：++：>1nM且<10nM+：>10nM且<40nM；-：>40nM；ND：未测定
使用来自不同物种的表达CD47的细胞，通过流式细胞术研究抗体的交叉反应性。食蟹猴红细胞用于猴交叉反应性。表达小鼠CD47的CHO细胞用于小鼠交叉反应性研究。对于基于流式细胞术的结合分析，产生表达人SIRPa的CHO细胞系，并通过CD47-Fc蛋白(Novoprotein，目录号CG18)或生物素标记的多组氨酸标记的CD47蛋白(Novoprotein，目录号321)的结合评价SIRPa表达。简言之，表达人SIRPα的CHO细胞用胰蛋白酶-EDTA解离缓冲液解离，并用FACS缓冲液(含有2％FBS的PBS缓冲液)洗涤3次。将细胞接种到96孔板中并旋转所准备的细胞。使用系列稀释的CD47蛋白(用于鼠抗体的Fc标记的蛋白质和用于嵌合/人源化抗体的生物素标记的多氨酸标记的CD47蛋白)重悬浮细胞，并在4℃下孵育一小时，然后在洗出那些未结合的蛋白质后用APC标记的抗人Fc抗体染色。在4℃孵育1小时和3次洗涤后，在Guava HL6T机器上分析细胞，并且使用FlowJo软件分析数据。以1μg/mL的浓度在96-半孔板的底部4℃包被过夜。通过GraphPad Prism分析结合曲线(平均荧光强度对CD47浓度)，并计算EC90用于CD47中和研究。来自示例实验的数据在图3A和3B中示出。
实施例4.中和ELISA
使用SIRPα包被的板，通过ELISA分析所选抗体的中和作用。简言之，用SIRPα蛋白包被微量滴定板，并以系列稀释度加入CD47-hFc蛋白质，以建立对应的EC90。对所选抗体进行系列稀释，并以其EC90浓度与hCD47-hFc融合蛋白混合，并用HRP标记的针对CD47-hFc的抗hIgG抗体检测它们的剂量依赖性阻断作用。
简言之，将人SIRPA(Novoprotein，目录号C385)以1μg/mL的浓度在96-半孔板的底部4℃包被过夜。用PBS中的3％脱脂乳(DOUBLE HELIX，目录号P10033)在室温下封闭1小时。同时，12.5μL的2.5μg/mL人CD47(Novoprotein，目录号CG18)与杂交瘤上清液或抗CD47抗体梯度(“阳性1”(eBioscience，目录号14-0479)作为阳性对照，和“阴性1”(eBioscience，目录号14-0478)作为阴性对照)在室温下预孵育1小时，然后将其施加到每个封闭孔在室温下保持1小时。用HRP缀合的针对人IgG-Fc的山羊多克隆第二抗体(Abcam，目录号ab98624)检测封闭效果，然后在PBST洗涤3次后用TMB底物(Biopanda，目录号TMB-S-003)显色，随后测量OD450。通过GraphPad Prism分析中和活性(OD 450对抗体浓度)，并计算IC50以供评价。
还通过流式细胞术分析了所选抗体的中和作用。生成表达人SIRPa的CHO细胞系，并通过CD47-Fc蛋白结合来评价SIRPa表达。简言之，表达人SIRPα的CHO细胞用胰蛋白酶-EDTA解离缓冲液解离，并用FACS缓冲液(含有2％FBS的PBS缓冲液)洗涤3次。将细胞接种到96孔板中并旋转所准备的细胞。12.5μL的2.5μg/mL人CD47-Fc或生物素化的CD47蛋白与杂交瘤上清液或抗CD47抗体梯度(B6H12(eBioscience，目录号14-0479)作为阳性对照，和2D3(eBioscience，目录号14-0478)作为阴性对照)在室温下预孵育1小时，然后重悬浮细胞沉淀物，并在4度下孵育1小时。然后在洗出那些未结合的蛋白质后，用APC标记的抗人Fc抗体或APC-链霉亲和素染色。在4度孵育1小时和3次洗涤后，在Guava HL6T机器上分析细胞，并使用Flowjo软件分析数据。通过GraphPad Prism分析中和活性(平均荧光强度对抗体浓度)，并计算IC50以供评价。来自实施例中和ELISA实验的结果总结于表6中。
表6
抗体 ABU 2 ABU 3 ABU 4 ABU 5 Abu 6 阳性1(Pos.1)
IC50(nM) ++++ ++ +++ ++++ + ++++
++++：<8nM；+++：>8nM且<15nM；++：>15nM且<20nM；+：>20nM
实施例5.抗CD47抗体依赖性吞噬
分析所选抗体对体外吞噬作用的剂量依赖性效果以获得EC50。
用CD14Miltenyi细胞分离珠从人PBMC纯化人单核细胞。将纯化的CD14+单核细胞在M-CSF(100ng/ml)的存在下在T75烧瓶中培养7-10天。通过在解离缓冲液中孵育5分钟，然后轻轻刮擦，来收获单核细胞衍生的巨噬细胞。然后，用PKH26(红色)标记M2细胞，将1×104个巨噬细胞接种在平底96孔组织培养板中含有10％FBS的IMDM中24小时，将培养基替换为无血清培养基再孵育2小时。在所示抗体的存在下向孔中加入5×104个CFSE标记的HL-60细胞，保持2小时。用IMDM洗孔3次，并用2％PFA固定细胞。然后在Cellomics机器上分析荧光标记的细胞。
吞噬指数通过计算每100个巨噬细胞的吞噬细胞数目来确定，该数据在OfficeExcel中计算并在Prism5中绘图。EC50基于最大吞噬指数的百分数计算。
来自使用HL60细胞系细胞的示例吞噬实验的数据在图4中示出。计算EC50并总结在表7中。来自使用DLD-1人结肠癌细胞系的示例吞噬实验的数据在图5中示出。
表7
Ab ID ABU 1 ABU 2 ABU 3 ABU 4 ABU 5 ABU 6 阳性1 阳性2
IC50(nM) +++ ++ + ++ + ++ + +
+++：<0.6nM；++：>0.6nM且<1nM：+：>1nM
实施例6.CD47命中抗体的表位分箱
这些命中物的表位分箱用表达CD47的CHO细胞与包含SEQ ID NO：240和SEQ IDNO：241的商品抗CD47阻断抗体阳性1、包含SEQ ID NO：242和SEQ ID NO：243的基准类似物抗体阳性2以及包含SEQ ID NO：244和SEQ ID NO：245的类似物抗体阳性3进行。阳性1还包含SEQ ID NO：149-154。阳性2还包含SEQ ID NO：155-160。简言之，使用流式细胞术，根据与表达CD47的CHO细胞的竞争性结合来对七种中和CD47抗体和3种参考抗体进行分析和分组。首先使用生物素化抗体计算90％结合的浓度，然后对CD47抗体进行系列稀释，并与预先确定的90％结合浓度的生物素化抗体之一混合。使用SA-APC检测生物素化抗体的结合。按照实验设计，标记的抗体的结合应该受到同一箱元(bin)的抗体的影响，因此被分类为一组。如果标记的抗体的结合不受影响，则这些测试抗体不在同一箱元中，因此被表征为不同的组。鉴定了在表达CD47的CHO上的三个结合谱，并对六个命中物进行以下表8所示的两组处理。ABU4和ABU5属于一个表位结合组，而另一个包括阳性3，属于不同的组。阳性1干扰两组对细胞的结合。
表8
ABU 表位组
ABU4 A
ABU5 A
ABU1 B
ABU2 B
ABU3 B
ABU6 B
阳性2 B
阳性3 B
阳性1 A/B
实施例7.红细胞结合和血细胞凝集试验
CD47广泛表达，在红细胞上特别高表达。为了评价对人红细胞的结合亲和力，使用来自几个供体的RBC进行RBC结合试验。来自示例实验的结合曲线和EC50在图6中示出。
所选抗体也在血细胞凝集试验中测试，以鉴定显示出强血细胞凝集作用的抗体。将待测试的抗体按所示浓度在PBS中稀释，并将系列稀释的90ul抗体加入V形底培养板中在37℃下孵育1小时。然后加入10uL人红细胞(RBC)，在PBS中为10％终浓度。RBC与抗体在37℃下孵育，并在2-4小时内观察到血凝素。血凝素的证据通过存在未沉降的RBC来证明，与未血凝的RBC的点状红点相比，其呈雾状。
血细胞凝集指数根据在存在或不存在mAb的情况下RBC沉淀物的面积来量化，RBC沉淀物的直径通过在像素中使用ImageJ软件来确定，然后在Excel中计算面积。计算出的数据相对于同型IgG进行归一化。浓度的对数相对于指数在Prism5中作图，并在图7A-7B中示出。
来自示例实验的图像在图8中示出。人类红细胞的显著血细胞凝集诱导通过孔中的雾状外观来证明。在图8中，同种型muIgG1用作阴性对照；虚线标出空白对照；阳性血细胞凝集对照是蓝色圆圈；阴性血细胞凝集对照是黄色圆圈。
实施例8.嵌合抗CD47抗体的表征
为了产生嵌合抗体，挑取和扩充所选择的抗原结合单元，回收V区序列。将V区合成并亚克隆到载体中以获得人IgG4(S228P)嵌合体。S228P是指如Aalberse RC andSchuurman J(2002)IgG4breaking the rules.Immunology 105：9-19(整体并入本文)所述IgG4被分割处的氨基酸位置。将人IgG4序列克隆到所选抗体的轻链可变区序列和重链可变区序列的C末端。嵌合hIgG4抗体在293F细胞中表达，并纯化为人IgG4形式以供功能验证。使用IgG1恒定区代替IgG4区域也产生嵌合抗体。
使用表达CD47的细胞系，通过流式细胞术测量嵌合抗体的结合亲和力。来自示例实验的结果在图9中示出。
使用表达CD47的细胞系，分析所选嵌合抗体的中和作用。简言之，将人嵌合IgG4抗体稀释，并与生物素化的人CD47蛋白混合。然后对C-ABU1、C-ABU2和C-ABU 4检测剂量依赖性SIRPα结合阻断作用。来自示例实验的结果在图10中示出。
所选择的嵌合抗体进一步在如上所述进行的DLD-1细胞吞噬试验中表征。来自示例实验的结果在图11中示出，星号表示基于通过Dunnett检验后单向ANOVA计算的p值的统计显著性。
实施例9.另外的抗CD47Fab的噬菌体选择
使用以下基于噬菌体的方法生成抗CD47Fab。从经免疫小鼠的脾脏制备总RNA。寡聚(dT)引发的反转录后，通过PCR扩增抗体可变区VL和VH。然后将鼠VL和VH区分别与轻链和重链的人恒定区CL和CH1融合。将嵌合轻链和重链片段的组合克隆到噬菌粒载体pComb3X中，并产生在噬菌体上展示的鼠/人Fab文库。
然后针对抗CD47特异性Fab筛查生成的噬菌体文库。与链霉亲和素缀合的Dynabead首先通过在室温下与含有3％BSA的PBS孵育1小时来封闭。大约1μL封闭的Dynabead与含量逐渐降低的生物素化CD47-Fc(第1、2和3轮分别为100nM、50nM和25nM)孵育30分钟以捕获抗原。将噬菌体文库预吸附到另外大约1μL在含有3％BSA的PBS中的封闭Dynabead上30分钟，接着用在含有3％BSA的PBS中的大约1μg/mL人Fc片段进行消耗。然后将消耗的噬菌体文库与抗原包被的Dynabead在室温下混合1小时，头对头地轻柔旋转。然后使用磁力分离器，用含有0.05％吐温20的1mL PBS洗涤Dynabead(1、2和3轮分别为5、10和15次)。结合的噬菌体通过与500μL洗脱缓冲液在室温下孵育10分钟来洗脱，随后用50μL中和缓冲液中和。洗脱的噬菌体通过感染大肠杆菌TG1细胞来拯救，并制备噬菌体文库以供下一轮筛选。
通过各种ELISA测定对所选的Fab进行了表征。诱导可溶性Fab片段，并通过以下方法制备周质级分。从琼脂板中挑取来自第三轮筛选的单个克隆，并在含有2YT的微量滴定板中培养过夜。将各5μL过夜培养物转移至含有150μL 2YT、2％葡萄糖、50μg/mL羧苄青霉素的微量滴定板，并在37℃下生长3小时。将异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)加入到每孔中至1mM的终浓度。在25℃下振摇过夜生长后，将板离心，并在结合ELISA中直接使用上清液。为了制备周质级分，将细胞沉淀物重悬并在冰上孵育20分钟。这些周质级分然后用于通过流式细胞术和阻断ELISA测定检测特异性。
在含有50μg/ml羧苄青霉素和2％葡萄糖的2YT中以50ml的规模进行来自单个克隆的可溶性Fab片段的大规模诱导。在37℃下生长至OD600为0.9后，添加IPTG至终浓度为1mM。在25℃生长过夜后，收获细胞沉淀物，并如上所述制备周质级分。
根据制造商的说明，使以上所述的合并的大规模周质级分通过1mL Ni树脂。该柱用缓冲液洗涤，并通过应用缓冲液洗脱蛋白质。对洗脱下来的蛋白质进行过滤以将缓冲液改变为PBS。然后通过非还原以及还原条件下的SDS-PAGE分析纯化的Fab，并采用分光光度法测定浓度。
通过ELISA筛选所选择的Fab。微量滴定板用PBS中1μg/ml浓度的人CD47-Fc在4摄氏度下包被过夜，用PBS/0.05％吐温20洗涤三次，用PBS/3％脱脂乳在室温下封闭1小时，然后与来自单个克隆的50μL上清液在室温下孵育1小时。用PBS/0.05％吐温20洗涤3次后，加入50μL 1∶5000稀释的HRP缀合的特异性抗人IgG F(ab)2，并在室温下孵育1小时。用PBS/0.05％吐温20洗涤3次，加入50μL TMB底物用于显色。通过加入50μL HCl终止反应，并且用微量滴定板读数器测量OD450。
阻断CD47与每个克隆的SIRPa相互作用的活性通过抑制ELISA来进行。微量滴定板用PBS中1μg/ml浓度的人SIRPa在4℃下包被过夜，用PBS/0.05％吐温20洗涤三次，用PBS/3％脱脂乳在室温下封闭1小时。每个克隆50μL周质级分与大约1μL人CD47混合，并在室温下孵育1小时，随后将50μL所述混合物添加到微量滴定板的封闭的孔中。在室温下孵育1小时，以下步骤与上述完全相同。
使用细胞解离缓冲液使得用人SIRPa稳定转染的CHO细胞脱壁。将含有105个细胞的200μL等分试样分配到U形底96孔板的孔中。用FACS缓冲液(在PBS中的2％FBS)洗涤三次后，在存在FACS缓冲液中系列稀释浓度的Fab下加入0.07μg/mL生物素化的CD47以重悬细胞，并在4℃下孵育30分钟。然后，将细胞用FACS缓冲液洗涤三次，然后与1∶1000稀释的APC标记的SA(Invitrogen)在4℃下孵育30分钟。洗涤3次后，在Guava HL6T机器上测定结合。来自示例实验的数据显示在图12A和表9中。
使用细胞解离缓冲液使得用人SIRPa稳定转染的CHO细胞脱壁。将含有104个细胞的200μL等分试样分配到U形底96孔板的孔中。用FACS缓冲液(在PBS中的2％FBS)洗涤三次后，在存在FACS缓冲液中系列稀释浓度的Fab下加入0.07μg/mL His标记的CD47以重悬细胞，并在4℃下孵育30分钟。然后，将细胞用FACS缓冲液洗涤三次，然后与1∶1000稀释的抗His-APC(GenScript#A01802)在4℃下孵育30分钟。洗涤3次后，在Guava HL6T机器上测定结合。来自示例实验的数据显示在图12B-12C和表10中。
表9
ABU8 ABU9 ABU11 ABU14 ABU16 ABU40 ABU20 ABU24 C-ABU1
IC50(nM) ++ +++ ++ ++ + ++ ++ + +
+++：<10nM；++：>10nM且<65nM；+：>65nM
表10
+++：<2nM；++：>2nM且<2.7nM；+：>2.7nM
所选择的Fab还通过细胞结合试验进行了表征。将含有105个HL60细胞或DLD1细胞的200μL等分试样分配到U形底96孔板的孔中。用FACS缓冲液(在PBS中的2％FBS)洗涤三次后，将细胞重悬浮在FACS缓冲液中系列稀释浓度的Fab或IgG中，并在4℃下孵育30分钟。然后，将细胞用FACS缓冲液洗涤三次，然后分别与大约3倍稀释的APC标记的抗人(Fab)2特异性抗体或APC标记的山羊抗人IgG在4℃下孵育30分钟。洗涤3次后，在Guava HL6T机器上测定结合。来自使用HL60细胞和Fab的示例实验的数据显示在图13A和表11中。来自使用DLD1细胞和Fab的示例实验的数据显示在图13B和表12中。使用DLD1细胞和IgG的附加实验显示在图13C和13D和表13中。
表11
+++：<1nM；++：>1nM且<7nM；+：>7nM
表12
+++：<5nM；++：>5nM且<60nM；+：>60nM
表13
+++：<2nM：++：>2nM且<20nM；+：>20nM
产生所选Fab的嵌合形式，并进行ELISA测定。对FcRn阻断的表达CD47的DLD1细胞进行等分，使得大约104个细胞被分配到U形底96孔板的孔中。用FACS缓冲液(在PBS中的2％FBS)洗涤三次后，在存在FACS缓冲液中系列稀释浓度的Fab下加入100nM生物素化的SIRPα-Fc以重悬细胞，并在4℃下孵育30分钟。然后，将细胞用FACS缓冲液洗涤三次，然后与稀释的APC标记的SA(Invitrogen)在4℃下孵育30分钟。洗涤3次后，在Guava HL6T机器上测定结合。来自示例实验的数据显示在图14A和14B和表14中。
表14
+++：<1nM：++：>1nM且<20nM；+：>20nM
实施例10.抗CD47抗体的人源化
使用结构建模对抗体序列进行概况分析，以确定最佳匹配的种系和回复突变位点。合成优化的突变体，并产生重组抗体以供通过ELISA测定结合亲和力。移植和反向突变后，人源化抗体的亲和力得到保留或改善(图15A)，通过FACS筛查诱变文库使H-ABU2进一步亲和力成熟，以选择与相应的嵌合亲本抗体相比能够更好地结合抗原(在一些情况下可达10倍)的克隆。
所选择的亲和力成熟的人源化抗体在如前所述的阻断实验中进一步表征。来自使用Raji细胞的示例实验的数据在图15B-15C和表15中示出。
表15
+++：<1nM；++：>1nM且<20nM；+：>20nM
另一组人源化抗体在如前所述的结合试验进行了分析。进行的结合试验是与使用CD47包被板的实施例3所述类似的ELISA结合EC50研究。来自示例实验的数据在图16A和表16中示出。一组这些抗体在如前所述的使用Raji细胞的SIRP-α阻断实验进一步表征。阻断试验与实施例4所述类似地进行。来自示例实验的数据在图16B和表17中示出。
表16
+：<0.06μg/mL
表17
+：<0.6nM
所选择的鼠、嵌合和人源化抗体如前所述进行血细胞凝集试验。简言之，对单克隆抗体进行系列稀释，并孵育1小时，之后添加全血至10％的最终血液浓度。孵育2-4小时后，用扫描仪检查血细胞凝集效果。
所选择的鼠、嵌合和人源化抗体也进行红细胞和血小板结合试验。其中人源化抗体是包含人IgG1恒定区的H-ABU 2-G1，和包含人IgG4恒定区的H-ABU 2-G4。血液用DPBS稀释1∶100。对以10μg/mL开始的单克隆抗体进行系列稀释，并以1∶2的体积比添加至稀释的血液(20μl抗体和40μl稀释的血液)。将混合物在40摄氏度下孵育30分钟，然后用DPBS洗涤两次。然后加入第二抗体，即APC抗人或APB-抗小鼠单克隆抗体(分别为Jackson ImmunoResearch 315-606-046或109-605-088)，和FITC标记的抗人CD61(BD，555753)以供血小板结合。加入第二抗体后，将混合物在4摄氏度下孵育30分钟。将细胞用DPBS洗涤两次，并且使用流式细胞仪评估结合亲和力。
使用如前所述的血细胞凝集试验分析所选择的人源化抗体。使用来自两个不同供体的样品和所列浓度的指示抗体或对照的示例实验的数据在图17中示出。血细胞凝集试验与实施例7所述类似地进行。如上所述，缺乏雾状晕轮外观的血细胞的不同斑点表明没有发生显著的血细胞凝集。许多人源化抗体显示没有显著的血细胞凝集效应。
接下来使用表达CD47的食蟹猴红细胞，通过结合试验测试所选择的抗体，以测试猴交叉反应性。该试验与实施例3所述类似地进行。来自示例实验的数据在图18中示出。在该实施例中，测试具有IgG的两个变异的抗体。即，所使用的IgG4是两个不同的Fcγ受体变体之一：具有S228P突变的IgG4(SEQ ID NO：37)，或具有S228P和L235E突变的IgG(SEQ IDNO：18)。阳性3-IgG4-PE抗体包含SEQ ID NO：305和SEQID NO：306。阳性-3-IgG4-P抗体包含SEQ ID NO：307和SEQ ID NO：308。
使用如前所述的吞噬试验测试所选择的抗体。这些试验与实施例5所述类似地进行。在这些实验中使用DLD-1细胞、CCRF-CEM细胞或Raji细胞中的任一种。来自示例实验的数据在图19A-19C中示出。
采用如前所述的结合试验进一步测试所选择的抗体。测试抗体对RBC(图20A和20B)或血小板(图20C或20D)的结合水平。在该实施例中，测试具有IgG的两个变异的抗体。即，所使用的IgG4是两个不同的Fcγ受体变体之一：具有S228P突变的IgG4(SEQ ID NO：37)，或具有S228P和L235E突变的IgG(SEQ ID NO：18)。
实施例11.体内CDX模型和人源化抗体的体内抗肿瘤活性
Raji细胞在空气中5％CO2的气氛中和37℃下，在体外作为培养物维持在补充有10％热灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中。肿瘤细胞例行每周传代培养两次。收获在指数生长期生长的细胞并对肿瘤接种物进行计数。每只小鼠在右胁皮下接种在0.1ml PBS中的Raji肿瘤细胞(3x 106)以供发展肿瘤。在肿瘤接种后第8天开始治疗，此时平均肿瘤大小达到大约113mm3。每组由7或8只荷瘤小鼠组成。
在常规监测时，每天对动物检查治疗对肿瘤生长和正常行为的任何影响，如运动性、食物和水的消耗(仅通过目测)、体重增加/减轻(体重每周测量两次)、眼睛/毛发失光泽以及方案中规定的其它任何异常影响。基于每个亚组内的动物的编号记录死亡和观察到的临床体征。
每周两次使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并且使用以下公式以mm3表示体积：V＝0.5a x b2其中a和b分别为肿瘤的长径和短径别。然后用肿瘤大小计算T/C值。T/C值(百分比)是抗肿瘤有效性的指示；T和C是治疗组和对照组分别在给定日期的平均体积。
进行单向ANOVA以比较各组之间的肿瘤体积，并且当获得显著的F统计量(治疗差异与误差差异之比)时，使用Games-Howell检验进行组间比较。所有数据都使用Graphpad5.0进行分析。P＜0.05被认为是统计学显著的。
如上所述在体内测试所选择的人源化抗体，以确定它们对肿瘤大小的影响。简言之，将大约300万个Raji细胞皮下移植到NOD/SCID小鼠中。抗CD47抗体的剂量为10mpk，腹膜内(i.p.)，每周3次。抗体的给药在肿瘤体积达到100mm3时开始。来自示例实验的数据在图21中示出。
实施例12：IgG4P和IgG4PE形式的比较
通过测试包含IgG的两个变异之一的变体进一步表征所选择的人源化抗体，即，所使用的IgG4是两个不同的Fcγ受体变体之一：具有S228P突变的IgG4(SEQ ID NO：37，P变体)，或具有S228P和L235E突变的IgG(SEQ ID NO：18，PE变体)。图22A描绘了来自使用Raji细胞通常如前所述进行的示例阻断试验的结果。图22B和23C分别描绘了来自通常如前所述进行的示例RBC和血小板结合试验的数据。图22D描绘了来自通常如前所述进行的示例血细胞凝集试验的数据。如上所述，缺乏雾状晕轮外观的血细胞的不同斑点表明没有发生显著的血细胞凝集。
实施例13.人源化抗体和组合疗法的表征和抗肿瘤活性
如上所述在体内测试所选择的人源化抗体，以确定它们对肿瘤大小的影响。来自示例实验的数据在图23中示出。通常如实施例10所述进行异种移植物实验。简言之，将大约300万个Raji细胞皮下移植到NOD/SCID小鼠中。抗CD47抗体的剂量为10mpk，腹腔内，每周3次。当肿瘤体积达到100mm3时开始测定。在该实施例中，测试具有不同IgG的抗CD47抗体具有两个变异的抗体。即，所使用的IgG4是两个不同的Fcγ受体变体之一：具有S228P突变的IgG4(SEQ ID NO：37)，或具有S228P和L235E突变的IgG(SEQ ID NO：18)。
所选择的抗体与抗CD20抗体组合在异种移植实验中使用，以便如上所述确定其对肿瘤大小的影响。将三百万个Raji细胞皮下移植到NOD/SCID小鼠中。当肿瘤体积达到100mm3时，每隔一天以10mg/kg腹膜内注射C-ABU 1抗体、抗CD20或两者的组合，并记录肿瘤大小。与C-ABU 1和抗CD20的组合显著防止肿瘤的进展。来自示例实验的数据总结在图24中。如表18中所总结的，施用每种抗体或对照物。抗CD20和抗CD47抗体的剂量为10mpk，腹膜内，每周3次。当肿瘤体积达到100mm3时开始测定。在该实施例中，测试具有不同IgG的抗CD47抗体具有两个变异的抗体。即，所使用的IgG4是两个不同的Fcγ受体变体之一：具有S228P突变的IgG4(SEQ ID NO：37)，或具有S228P和L235E突变的IgG(SEQ ID NO：18)。在该试验中使用的抗CD20是人IgG1形式。
表18
尽管本文已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案均可用于实施本发明。旨在用以下权利要求来限定本发明的范围，由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
序列表
SEQ ID NO：1 KSSQSLLYSSNQKNYLA
SEQ ID NO：2 RASKNIGKYLA
SEQ ID NO：3 KASQDIKSYLS
SEQ ID NO：4 SASSSVSYMN
SEQ ID NO：5 RSSQSIVYSNGNTYLE
SEQ ID NO：6 KASENVGTYVS
SEQ ID NO：7 RSSQSIVHSNGNTYLE
SEQ ID NO：8 DTSKLAS
SEQ ID NO：9 GASNRYT
SEQ ID NO：10 KVSNRFS
SEQ ID NO：11 RVANRFS
SEQ ID NO：12 SGSTLQS
SEQ ID NO：13 WASTRDS
SEQ ID NO：14 YATSLAD
SEQ ID NO：15 FQGSHVPWT
SEQ ID NO：16 FQGSHVPYT
SEQ ID NO：17 GQSYSYPLT
SEQ ID NO：18
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：19 LQHGESPFT
SEQ ID NO：20 QQHNEYPYT
SEQ ID NO：21 QQWNSNPPT
SEQ ID NO：22 QQYYSYPLT
SEQ ID NO：23 DFYIN
SEQ ID NO：24 DTYMH
SEQ ID NO：25 DYGMA
SEQ ID NO：26 GYYMN
SEQ ID NO：27 NYWIA
SEQ ID NO：28 NYWMN
SEQ ID NO：29 NYWMQ
SEQ ID NO：30 DFYPGNTSTNYNEKFKT
SEQ ID NO：31 EINPSTGGTTYNQKFKA
SEQ ID NO：32 FISNLAKRIYYVDTVTG
SEQ ID NO：33 MIDPSDSESRLNQKFKD
SEQ ID NO：34 RIDPAKDNTKYDPKFQG
SEQ ID NO：35 RIDPYDSETLYNQKFKD
SEQ ID NO：36 WIYLGSGNTKYNEKFKG
SEQ ID NO：37
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：38 AYRYALDY
SEQ ID NO：39 GGKGGFGY
SEQ ID NO：40 GHYGSSYVVY
SEQ ID NO：41 REERGFAY
SEQ ID NO：42 RGRGGSSY
SEQ ID NO：43 RGSPMITSFAY
SEQ ID NO：44 YDGYEGFAY
SEQ ID NO：45
DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDIKSYLSWYQQKPWKSPKTLIYYATSLADGVPSRFSGSGSGQHYSLTISSLESDDTATYYCLQHGESPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO：46
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKNIGKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：47
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：48
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：49
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：50
DVQITQSPSFLAASPGETITINCRASKNIGKYLAWFQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAIYYCQOHNEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：51
EVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPGKGPECVAFISNLAKRIYYVDTVTGRFTISRENAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCTRAYRYALDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：52
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFTIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAKDNTKYDPKFQGKATITLDTSSNIAYLQLSSLTSEDTAVYFCARGHYGSSYVVYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：53
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMNWVKQSPEKSLEWIGEINPSTGGTTYNQKFKAKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTFEDSAVYYCAIYDGYEGFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：54
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWNSNPPTFGTGTKLELK
SEQ ID NO：55
EVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPGKGPECVAFISNLAKRIYYVDTVTGRFTISRENAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCTRAYRYALDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：56
DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDIKSYLSWYQQKPWKSPKTLIYYATSLADGVPSRFSGSGSGQHYSLTISSLESDDTATYYCLQHGESPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO：57
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：58
NILMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSYPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：59
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMNWVKQSPEKSLEWIGEINPSTGGTTYNQKFKAKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTFEDSAVYYCAIYDGYEGFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：60
QVQLQQSGPQLVRPGASVKISCKTSGYSFTNYWMQWVKQRPGQGLEWIGMIDPSDSESRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTFEDSAVYYCARRGSPMITSFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：61
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYWIAWVKRRPGQGLEWIGDFYPGNTSTNYNEKFKTKATLTIDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRGRGGSSYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：62
QIQLQQSGPELVKPGASVKISCKVSGYIFTDFYINWVKQRPGQGLEWIGWIYLGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARREERGFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：63
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTNYWMNWFKQRPEQGLEWIGRIDPYDSETLYNQKFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAGGGKGGFGYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：64
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFTIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAKDNTKYDPKFQGKATITLDTSSNIAYLQLSSLTSEDTAVYFCARGHYGSSYVVYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：65
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：66
DVLMTQTPLSLPVSLGEQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVANRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：67
DVLMTQTPLSLPVSLGEQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVANRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：68
DVQITQSPSFLAASPGETITINCRASKNIGKYLAWFQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAIYYCQQHNEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：69
NILMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSYPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：70
QIQLQQSGPELVKPGASVKISCKVSGYIFTDFYINWVKQRPGQGLEWIGWIYLGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARREERGFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：71
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWNSNPPTFGTGTKLELK
SEQ ID NO：72
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYWIAWVKRRPGQGLEWIGDFYPGNTSTNYNEKFKTKATLTIDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRGRGGSSYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：73
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTNYWMNWFKQRPEQGLEWIGRIDPYDSETLYNQKFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAGGGKGGFGYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：74
QVQLQQSGPQLVRPGASVKISCKTSGYSFTNYWMQWVKQRPGQGLEWIGMIDPSDSESRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTFEDSAVYYCARRGSPMITSFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：75
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：76
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNTKYNEKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：77
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQWVRQAPGQGLEWMGMIDPSDSESRLNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELS SLRSEDTAVYYCARRGSPMITSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：78
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQWVRQAPGQGLEWMGMIDPSDSESRLNQKFKDRVTMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGSPMITSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：79
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYWMQWVRQAPGQGLEWMGMIDPSDSESRLNQKFKDRVTMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGSPMITSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：80
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTDFYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNTKYNEKFKGRVTITVDTSASTAYMELS SLRSEDTAVYYCARREERGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：81
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVE
SEQ ID NO：82
MWPLAAALLLGSCCCGSAQLLFSNVNSIEFTSCNETVVIPCIVRNVEAQSTEEMFVKWKLNKSYIFIYDGNKNSTTTDQNFTSAKISVSDLINGIASLKMDKRDAMVGNYTCEVTELSREGKTVIELKNRTAFNTDQGSACSYEEEKGGCKLVSWFSPNEKILIVIFPILAILLFWGKFGILTLKYKSSHTNKRIILLLVAGLVLTVIVVVGAILLIPGEKPVKNASGLGLIVISTGILILLQYNVFMTAFGMTSFTIAILITQVLGYVLALVGLCLCIMACEPVHGPLLISGLGIIALAELLGLVYMKFVASNQRTIQPPRNR
SEQ ID NO：83
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRNN
SEQ ID NO：84
MWPLAAALLLGSCCCGSAQLLFSNVNSIEFTSCNETVVIPCIVRNVEAQSTEEMFVKWKLNKSYIFIYDGNKNSTTTDQNFTSAKISVSDLINGIASLKMDKRDAMVGNYTCEVTELSREGKTVIELKNRTVSWFSPNEKILIVIFPILAILLFWGKFGILTLKYKSSHTNKRIILLLVAGLVLTVIVVVGAILLIPGEKPVKNASGLGLIVVSTGILILLQYNVFMTAFGMTSFTIAILITQVLGYVLALVGLCLCIMACEPVHGPLLISGLGIIALAELLGLVYMKFVASNQRTIQPPRNR
SEQ ID NO：85
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKIKSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGGGTKLELK
SEQ ID NO：86
EVQLQQSGTELVKPGASVKLSCKASGYTFISYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGNTNYNEKFKTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCVRDYYGNYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：87
DIKMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLSWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：88
EVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGFTFTNYYIHWVKQRPGQGPEWIGWIYLGSGNTKYNEKFKGKATLTADTSSSTAYLQLSTLISEDSAVYYCARYDYDLYLDSWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：89
DIQMMQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHHYGTPLAFGAGTKLEIK
SEQ ID NO：90
EVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYSFTAYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDSHYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYTQLNSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：91
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENVYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYKANTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGTYYCQHHYGTPLTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO：92
EVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYSFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDSHYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYLQLNSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：93
DIQMIQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLRINTLQPEDLGTYYCQHHYGAPLSFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：94
EVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDSHYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：95
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO：96
EVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDAHYSEEFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：97
DIQINQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLSWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO：98
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTNYHIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGMAILTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYDYDLYLHSWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：99
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO：100
EVQLQQPGTEVVKPGASVKLSCKASGYSFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDSHYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：101
RHCFNQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSNYPFTFGSGTKLELK
SEQ ID NO：102
RVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASAYAFTNYLIEWVKKRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGDGYGSLFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：103
DIQMIQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYGAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGIPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO：104
EVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFISYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGNTNYNEKFKTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCVRDYYGNYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO：105
DIQMIQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKLGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTHFSLKINSLQPEDFGTYYCQHHYGNSLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：106
EVQLQQSGTELVKPGASVKLSCKASGYPFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGGTNYNEKFKTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDYYGNYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：107
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO：108
EVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKTSGYSFVTYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDSHYSEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCVRDYYGAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：109
DAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTNNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHLVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO：110
PRGKVQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYINYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCARGYYYGSSYGYWYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID NO：111
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLADGVPSRFSGSRSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO：112
EVQLQQPGTELAKPGASVKLSCKASGYTFISYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGGTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCVRDYYGSYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：113
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYKAKTLVEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO：114
RGPTAATWTELVKPGTSVKLSCKASGYTFISYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDTSYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGQGTSVTVSA
SEQ ID NO：115
DIQMMQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHHYGTPLTFGSGTKLELK
SEQ ID NO：116
EVQLQQPGTELVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDSHYSEKFRSKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：117
DAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVSTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO：118
EVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNVVPNNDGTNYNEKFRNKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAVTYFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：119
DIQMMQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：120
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYsFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGSAHYNEKFKSKATLTVDKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：121
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTHFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：122
EVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFISYWIHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGSSNYNEKFKNKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：123
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHHYGTPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO：124
EVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYSFITYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDSHYSEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCVRDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：125
DIKINQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYKAKTLVEGVPSRFSGSGSGTQFSLKISSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：126
EVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFISYWMHWVRQRPGQGLEWIGNINPSSGNTNYNEKFKTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCVRDYYGNYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO：127
GIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYKAKTLVEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：128
EVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFISYWIHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGGTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCARDYYGNYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：129
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASDNIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTSAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：130
EVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYSFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDSHYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：131
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINNLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLEMK
SEQ ID NO：132
EVQLQQSGAEHVRPGSSVKLSCKASGYSFITYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDSHYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：133
DIKMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLSWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPLTFGTGTKLEIK
SEQ ID NO：134
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGDSFTSDHIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTADTSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYYCVTYDYDLYFDNWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：135
STLMTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFILNIHPVEEEDAATYYCLHSRELPFTFGSGTKLELK
SEQ ID NO：136
EVKLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARPDDGYYGFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：137
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENVYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：138
EVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYSFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDSHYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：139
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVFNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTHFSLKINNLQPEDFGTYYCQHHYGTPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO：140
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYSFISYWIHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGGNTYNEKFKNKATLTVDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYYCTRDYYGAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：141
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLAFGSGTKLELK
SEQ ID NO：142
EVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYSFITYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSGGDSHYSEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCVRDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：143
DIQMIQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVFNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO：144
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYSFISYWIHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGGSSYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRDYYGAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：145
DIVLSQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTLSSMAAEDAATYSCQQWSGNSPTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO：146
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMHWVRQAPGKGLEWVARIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSIVYLQMNNLKTEDTAMYYCVRAWDYGSSWDYFDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO：147
DIQMMQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAQTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQSEDIGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：148
RGPTQQPGTELVKPGASVKLSRKASGYTFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDSHYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：149 GYGMS
SEQ ID NO：150 TITSGGTYTYYPDSVKG
SEQ ID NO：151 SLAGNAMDY
SEQ ID NO：152 RASQTISDYLH
SEQ ID NO：153 FASQSIS
SEQ ID NO：154 QNGHGFPRT
SEQ ID NO：155 NYNMH
SEQ ID NO：156 TIYPGNDDTSYNQKFKD
SEQ ID NO：157 GGYRAMDY
SEQ ID NO：158 RSSQSIVYSNGNTYLG
SEQ ID NO：159 KVSNRFS
SEQ ID NO：160 FQGSHVPYT
SEQ ID NO：161
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSP
SEQ ID NO：162 DNIYSY
SEQ ID NO：163 ENIYSY
SEQ ID NO：164 ENVYSY
SEQ ID NO：165 ESVDSYGNSF
SEQ ID NO：166 QNINVW
SEQ ID NO：167 SSVSY
SEQ ID NO：168 TGAVSTSNY
SEQ ID NO：169 TGAVTTNNY
SEQ ID NO：170 AAT
SEQ ID NO：171 DTS
SEQ ID NO：172 GAK
SEQ ID NO：173 GTN
SEQ ID NO：174 KAK
SEQ ID NO：175 KAN
SEQ ID NO：176 KAS
SEQ ID NO：177 LAS
SEQ ID NO：178 NAK
SEQ ID NO：179 NAQ
SEQ ID NO：180 ALWYSNHLV
SEQ ID NO：181 ALWYSNHWV
SEQ ID NO：182 LHSRELPFT
SEQ ID NO：183 QHHYGAPLS
SEQ ID NO：184 QHHYGIPLT
SEQ ID NO：185 QHHYGNSLT
SEQ ID NO：186 QHHYGTPLA
SEQ ID NO：187 QHHYGTPLT
SEQ ID NO：188 QQGQSYPLT
SEQ ID NO：189 QQWSGNSPT
SEQ ID NO：190 QQWSNYPFT
SEQ ID NO：191 AYAFTNYL
SEQ ID NO：192 GDSFTSDH
SEQ ID NO：193 GFTFNTYA
SEQ ID NO：194 GFTFSDYG
SEQ ID NO：195 GFTFTNYY
SEQ ID NO：196 GYPFTSYW
SEQ ID NO：197 GYSFISYW
SEQ ID NO：198 GYSFITYW
SEQ ID NO：199 GYSFTAYW
SEQ ID NO：200 GYSFTNYH
SEQ ID NO：201 GYSFTTYW
SEQ ID NO：202 GYSFVTYW
SEQ ID NO：203 GYSITSGYY
SEQ ID NO：204 GYTFISYW
SEQ ID NO：205 GYTFTSYW
SEQ ID NO：206 GYTFTTYW
SEQ ID NO：207 INPGSGGT
SEQ ID NO：208 INPSGGDS
SEQ ID NO：209 INPSSGDA
SEQ ID NO：210 INPSSGDS
SEQ ID NO：211 INPSSGDT
SEQ ID NO：212 INPSSGGN
SEQ ID NO：213 INPSSGGS
SEQ ID NO：214 INPSSGGT
SEQ ID NO：215 INPSSGNT
SEQ ID NO：216 INPSSGSA
SEQ ID NO：217 INPSSGSS
SEQ ID NO：218 INYDGSN
SEQ ID NO：219 IRSKSSNYAT
SEQ ID NO：220 ISSGSSTI
SEQ ID NO：221 IYLGSGNT
SEQ ID NO：222 IYPGSGNT
SEQ ID NO：223 VVPNNDGT
SEQ ID NO：224 ARDYYGAY
SEQ ID NO：225 ARDYYGNY
SEQ ID NO：226 ARGDGYGSLFAY
SEQ ID NO：227 ARGYYYGSSYGYWYFDV
SEQ ID NO：228 ARPDDGYYGFAY
SEQ ID NO：229 ARYDYDLYLDS
SEQ ID NO：230 ARYDYDLYLHS
SEQ ID NO：231 AVTYFAY
SEQ ID NO：232 TRDYYGAY
SEQ ID NO：233 VRAWDYGSSWDYFDY
SEQ ID NO：234 VRDYYGAY
SEQ ID NO：235 VRDYYGNY
SEQ ID NO：236 VRDYYGSY
SEQ ID NO：237 VTYDYDLYFDN
SEQ ID NO：238
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：239
EVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYSFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSSGDSHYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARDYYGAYWGHGTLVTVSA
SEQ ID NO：240
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYGMSWVRQTPDKRLEWVATITSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQIDSLKSEDTAIYFCARSLAGNAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO：241
DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQTISDYLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHGFPRTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：242
QVQLQQPGAELVKPGASVMMSCKASGYTFTNYNMHWVKQTPGQGLEWIGTIYPGNDDTSYNQKFKDKATLTADKSSSAAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGYRAMDYWGQTSVTVSS
SEQ ID NO：243
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYHCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：244
QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDQGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO：245
NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKVPKHLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：246
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYINWVRQAPGQRLEWMGWIYTGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：247
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDIYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNVKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREDRGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：248
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDNYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：249
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：250
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDHYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREDRGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：251
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDNYINWVRQAPGQRLEWMGWVYLGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：252
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDLYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：253
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDNYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：254
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYINWVRQAPGQRLEWMGWIYPGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：255
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYIHWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREEDGFAHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：256
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDNYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRKERGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：257
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDTYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNIKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：258
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREDRGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：259
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDTYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNVKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：260
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDLYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNVKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：261
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYINWVRQAPGQRLEWMGWIYGGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTTYMELSSLRSEDTAVYYCARREEDGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：262
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYINWVRQAPGQRLEWMGWIYGGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：263
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYINWVRQAPGQRLEWMGWIYLGSGNVKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRIERGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：264
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYINWVRQAPGQRLEWMGWVYLGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREERGFAVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：265
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSILYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYHYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：266
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLSSNQKYYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQFYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：267
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLYSSNKKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：268
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQFYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：269
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLSSSQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：270
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNKKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYHYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：271
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLVSSSQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：272
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLSSSQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQFYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：273
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQFYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：274
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYKSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQLYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：275
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYHYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：276
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLSSSQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASGRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：277
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLTSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：278
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYHYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：279
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQFYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：280
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：281
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLYTSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：282
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYNSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYHYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：283
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYKSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQFYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：284
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLYSSSQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：285
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYNSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYHYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：286
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASVRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYHYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：287
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKNIGKYLAWFQQKPGKAPKSLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：288
DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRASKNIGKYLAWFQQKPGKAPKSLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：289
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKNIGKYLAWFQQKPGKAPKSLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：290
DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRASKNIGKYLAWFQQKPGKAPKSLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：291
DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRASKNIGKYLAWFQQKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：292
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQWVRQAPGQGLEWMGMIDPSDSESRLNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGSPMITSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：293
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYSFTNYWMQWVRQAPGQGLEWMGMIDPSDSESRLNQKFKDRVTMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGSPMITSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：294
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQWVRQAPGQGLEWIGMIDPSDSESRLNQKFKDRATLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGSPMITSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：295
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYSFTNYWMQWVRQAPGQGLEWIGMIDPSDSESRLNQKFKDRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGSPMITSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：296
QVQLQQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYSFTNYWMQWVRQAPGQGLEWIGMIDPSDSESRLNQKFKDKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGSPMITSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：297
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQSYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：298
DIQITQSPSSVSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQSYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：299
DIQITQSPSSVSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKIPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQSYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：300
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYHIHWVRQAPGQRLEWMGWIYPGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYDLYLHSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：301
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTNYHIHWVRQAPGQRLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYDLYLHSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：302
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTNYHIHWVRQAPGQRLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYDLYLHSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：303
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTNYHIHWVRQAPGQRLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGMATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYDLYLHSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：304
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTNYHIHWVKQAPGQRLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGMATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYDLYLHSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：305
QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDQGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：306
″QMTQSPSAMSASVGDRVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKVPKHLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：307
QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDQGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：308
″QMTQSPSAMSASVGDRVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKVPKHLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：309
DVQITQSPSFLAASPGETITINCRASKNIGKYLAWFQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAIYYCQQHNEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：310
QVQLQQSGPQLVRPGASVKISCKTSGYSFTNYWMQWVKQRPGQGLEWIGMIDPSDSESRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTFEDSAVYYCARRGSPMITSFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：311
DIQINQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLSWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：312
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTNYHIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGMAILTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYDYDLYLHSWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Claims (56)

1.一种包含轻链CDR和重链CDR的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元(a)特异性结合CD47；(b)与CD47结合后诱导表达CD47的细胞的吞噬作用；并且(c)当以范围为1.5ng/ml至30μg/ml所述抗原结合单元的浓度与红细胞混合时，缺乏诱导实质性血细胞凝集的能力。
2.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元与CD47的结合阻止了CD47与在巨噬细胞上表达的SIRPα的结合。
3.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中与具有SEQ ID NO：240-241的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。
4.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中与具有SEQ ID NO：242-243的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。
5.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中与具有SEQ ID NO：244-245的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。
6.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中当在利用表达CD47的细胞的体外结合试验中测定时，与具有SEQ ID NO：240-241的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元表现出更高的对CD47的结合亲和力。
7.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中当在利用表达CD47的细胞的体外结合试验中测定时，与具有SEQ ID NO：242-243的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元表现出更高的对CD47的结合亲和力。
8.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中当在利用表达CD47的细胞的体外结合试验中测定时，与具有SEQ ID NO：244-245的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元表现出更高的对CD47的结合亲和力。
9.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中与具有SEQ ID NO：240-241的氨基酸序列的抗原结合单元所诱导的血细胞凝集相比，红细胞与所述抗原结合单元接触后所诱导的血细胞凝集至少低1倍。
10.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中与具有SEQ ID NO：242-243的氨基酸序列的抗原结合单元所诱导的血细胞凝集相比，红细胞与所述抗原结合单元接触后所诱导的血细胞凝集至少低1倍。
11.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中与具有SEQ ID NO：244-245的氨基酸序列的抗原结合单元所诱导的血细胞凝集相比，红细胞与所述抗原结合单元接触后所诱导的血细胞凝集至少低1倍。
12.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中所述轻链CDR包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；并且所述重链CDR包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；
其中所述LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：1-22和162-190的序列；并且
其中所述HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：23-44和191-237的序列。
13.根据权利要求12所述的抗原结合单元，其中所述轻链CDR包含选自以下LC-CDR序列组合的氨基酸序列：
i.SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：21；
ii.SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16；
iii.SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：17；
iv.SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：20；
v.SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15；
vi.SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：22；
vii.SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；
viii.SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：180；
ix.SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：181；
x.SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：177和SEQ ID NO：182；
xi.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：183；
xii.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：184；
xiii.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：185；
xiv.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：186；
xv.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：187；
xvi.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：187；
xvii.SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：175和SEQ ID NO：187；
xviii.SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；
xix.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；
xx.SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；
xxi.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：179和SEQ ID NO：187；
xxii.SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：176和SEQ ID NO：188；
xxiii.SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：189；以及
xxiv.SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：190。
14.根据权利要求12所述的抗原结合单元，其中所述重链CDR包含选自以下HC-CDR序列组合的氨基酸序列：
i.SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：38；
ii.SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：39；
iii.SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：40；
iv.SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：43；
v.SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42；
vi.SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：41；
vii.SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：44；
viii.SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：207和SEQ ID NO：226；
ix.SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：222和SEQ ID NO：237；
x.SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：233；
xi.SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：228；
xii.SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：221和SEQ ID NO：229；
xiii.SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：225；
xiv.SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：232；
xv.SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：232；
xvi.SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；
xvii.SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：234；
xviii.SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：234；
xix.SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；
xx.SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：222和SEQ ID NO：230；
xxi.SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；
xxii.SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：216和SEQ ID NO：224；
xxiii.SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：234；
xxiv.SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：227；
xxv.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：211和SEQ ID NO：224；
xxvi.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：217和SEQ ID NO：224；
xxvii.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：225；
xxviii.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：215和SEQ ID NO：235；
xxix.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：236；
xxx.SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：209和SEQ ID NO：224；
xxxi.SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；
xxxii.SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：223和SEQ ID NO：231；以及
xxxiii.SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224。
15.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元是单克隆抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
16.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元是sFc、Fv、Fab或(Fab)2。
17.根据权利要求1所述的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元竞争结合被具有以下氨基酸序列的抗原结合单元识别的表位：1)SEQ ID NO：240-241，2)SEQ ID NO：242-243，或3)SEQ ID NO：244-245。
18.一种包含轻链CDR和重链CDR的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元(a)以比参考抗原结合单元更高的结合亲和力特异性结合CD47，并且阻止CD47与SIRPα的结合；并且(b)当以范围为1.5ng/ml至30μg/ml抗原结合单元的浓度与红细胞混合时，缺乏诱导实质性血细胞凝集的能力，其中所述参考抗原结合单元具有以下氨基酸序列：1)SEQ ID NO：240-241，2)SEQ ID NO：242-243，或3)SEQ ID NO：244-245。
19.根据权利要求18所述的抗原结合单元，其中所述轻链CDR包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；并且所述重链CDR包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；
其中所述LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：1-22和162-190的序列；并且
其中所述HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：23-44和191-237的序列。
20.根据权利要求19所述的抗原结合单元，其中所述轻链CDR包含选自以下LC-CDR序列组合的氨基酸序列：
i.SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：21；
ii.SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16；
iii.SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：17；
iv.SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：20；
v.SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15；
vi.SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：22；
vii.SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；
viii.SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：180；
ix.SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：181；
x.SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：177和SEQ ID NO：182；
xi.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：183；
xii.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：184；
xiii.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：185；
xiv.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：186；
xv.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：187；
xvi.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：187；
xvii.SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：175和SEQ ID NO：187；
xviii.SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；
xix.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；
xx.SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；
xxi.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：179和SEQ ID NO：187；
xxii.SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：176和SEQ ID NO：188；
xxiii.SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：189；以及
xxiv.SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：190。
21.根据权利要求19所述的抗原结合单元，其中所述重链CDR包含选自以下HC-CDR序列组合的氨基酸序列：
i.SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：38；
ii.SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：39；
iii.SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：40；
iv.SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：43；
v.SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42；
vi.SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：41；
vii.SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：44；
viii.SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：207和SEQ ID NO：226；
ix.SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：222和SEQ ID NO：237；
x.SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：233；
xi.SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：228；
xii.SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：221和SEQ ID NO：229；
xiii.SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：225；
xiv.SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：232；
xv.SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：232；
xvi.SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；
xvii.SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：234；
xviii.SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：234；
xix.SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；
xx.SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：222和SEQ ID NO：230；
xxi.SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；
xxii.SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：216和SEQ ID NO：224；
xxiii.SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：234；
xxiv.SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：227；
xxv.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：211和SEQ ID NO：224；
xxvi.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：217和SEQ ID NO：224；
xxvii.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：225；
xxviii.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：215和SEQ ID NO：235；
xxix.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：236；
xxx.SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：209和SEQ ID NO：224；
xxxi.SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；
xxxii.SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：223和SEQ ID NO：231；以及
xxxiii.SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224。
22.根据权利要求18所述的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
23.根据权利要求18所述的抗原结合单元，其中所述的抗原结合单元是sFc、Fv、Fab或(Fab)2。
24.一种包含轻链CDR和重链CDR的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元(a)特异性结合CD47；并且(b)与参考抗原结合单元相比，在与CD47结合后更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用，其中所述参考抗原结合单元具有以下氨基酸序列：1)SEQ ID NO：240-241，2)SEQ ID NO：242-243，或3)SEQ ID NO：244-245。
25.根据权利要求24所述的抗原结合单元，其中与具有SEQ ID NO：240-241的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。
26.根据权利要求24所述的抗原结合单元，其中与具有SEQ ID NO：242-243的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。
27.根据权利要求24所述的抗原结合单元，其中与具有SEQ ID NO：244-245的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述抗原结合单元更大程度地诱导表达CD47的细胞的吞噬作用。
28.根据权利要求24所述的抗原结合单元，其中所述轻链CDR包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；并且所述重链CDR包含重链HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；
其中所述LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：1-22和162-190的序列：并且
其中所述HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3各自具有选自SEQ ID NO：23-44和191-237的序列。
29.根据权利要求28所述的抗原结合单元，其中所述轻链CDR包含选自以下LC-CDR序列组合的氨基酸序列：
i.SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：21；
ii.SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16；
iii.SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：17；
iv.SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：20；
v.SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15；
vi.SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：22；
vii.SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19；
viii.SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：180；
ix.SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：181；
x.SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：177和SEQ ID NO：182；
xi.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：183；
xii.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：184；
xiii.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：185；
xiv.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：186；
xv.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：187；
xvi.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：187；
xvii.SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：175和SEQ ID NO：187；
xviii.SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；
xix.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；
xx.SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：187；
xxi.SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：179和SEQ ID NO：187；
xxii.SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：176和SEQ ID NO：188；
xxiii.SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：189；以及
xxiv.SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：190。
30.根据权利要求28所述的抗原结合单元，其中所述重链CDR包含选自以下HC-CDR序列组合的氨基酸序列：
i.SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：38；
ii.SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：39；
iii.SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：40；
iv.SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：43；
v.SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42；
vi.SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：41；
vii.SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：44；
viii.SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：207和SEQ ID NO：226；
ix.SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：222和SEQ ID NO：237；
x.SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：233；
xi.SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：228；
xii.SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：221和SEQ ID NO：229；
xiii.SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：225；
xiv.SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：232；
xv.SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：232；
xvi.SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；
xvii.SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：234；
xviii.SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：234；
xix.SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；
xx.SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：222和SEQ ID NO：230；
xxi.SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；
xxii.SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：216和SEQ ID NO：224；
xxiii.SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：234；
xxiv.SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：227；
xxv.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：211和SEQ ID NO：224；
xxvi.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：217和SEQ ID NO：224；
xxvii.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：225；
xxviii.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：215和SEQ ID NO：235；
xxix.SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：236；
xxx.SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：209和SEQ ID NO：224；
xxxi.SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224；
xxxii.SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：223和SEQ ID NO：231；以及
xxxiii.SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：224。
31.根据权利要求24所述的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
32.根据权利要求24所述的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元是sFc、Fv、Fab或(Fab)2。
33.一种包含轻链CDR和重链CDR的抗原结合单元，其中所述轻链CDR包含LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；并且所述重链CDR包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3各自包含与选自SEQ ID NO：1-22和162-190的序列具有至少80％序列同源性的序列，并且其中所述HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3各自包含与选自SEQ ID NO：23-44和191-237的序列具有至少80％序列同源性的序列。
34.根据权利要求33所述的抗原结合单元，其中所述轻链CDR和所述重链CDR分别包含选自下组的LC-CDR和HC-CDR：
a.SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55；
b.SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：63；
c.SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：64；
d.SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：60；
e.SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：61；
f.SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：62；
g.SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：59；
h.SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：86；
i.SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88；
j.SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90；
k.SEQ ID NO：91和SEQ ID NO：92；
l.SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94；
m.SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96；
n.SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98；
o.SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100；
p.SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：102；
q.SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104；
r.SEQ ID NO：105和SEQ ID NO：106；
s.SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108；
t.SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110；
u.SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：112；
v.SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：114；
w.SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116；
x.SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118；
y.SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：120；
z.SEQ ID NO：121和SEQ ID NO：122；
aa.SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：124；
bb.SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126；
cc.SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128；
dd.SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：130；
ee.SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：132；
ff.SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：134；
gg.SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136；
hh.SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138；
ii.SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140；
jj.SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142；
kk.SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：144；
ll.SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：146；
mm.SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148；
nn.SEQ ID NO：238和SEQ ID NO：239
oo.SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：70；
pp.SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：73；
qq.SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：51；
rr.SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：74；
ss.SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：53；
tt.SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：72；
uu.SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：52；
vv.SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：77；
ww.SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：78；
xx.SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：79；
yy.SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：75；
zz.SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：76；
aaa.SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：80；以及
bbb.表1中列出的任何序列对。
35.根据权利要求33所述的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
36.根据权利要求33所述的抗原结合单元，其中所述抗原结合单元是sFc、Fv或Fab。
37.一种药物组合物，其包含权利要求1-36中任一项的抗原结合单元和药学上可接受的赋形剂。
38.一种分离的核酸，其编码权利要求1-36中任一项的抗原结合单元。
39.一种载体，其包含编码权利要求1-36中任一项的抗原结合单元的核酸序列。
40.一种宿主细胞，其表达权利要求1-36中任一项的抗原结合单元。
41.一种宿主细胞，其包含编码权利要求1-36中任一项的抗原结合单元的核酸。
42.一种产生权利要求1-36中任一项的抗原结合单元的方法，其包括：在适合表达所述抗原结合单元的条件下培养权利要求40或41的宿主细胞；以及分离由所述宿主细胞表达的所述抗原结合单元。
43.一种诱导表达CD47的细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1-36中任一项的抗原结合单元接触。
44.一种在人类受试者中诱导表达CD47的细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用权利要求37的药物组合物。
45.根据权利要求43或44中任一项所述的方法，其中表达CD47的细胞的吞噬作用以5％的效率发生。
46.根据权利要求43或44中任一项所述的方法，其中所述抗原结合单元不引起显著的血细胞凝集。
47.根据权利要求43或44中任一项所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
48.根据权利要求43或44中任一项所述的方法，其中所述细胞是非淋巴瘤且非白血病癌细胞。
49.根据权利要求43或44中任一项所述的方法，其中所述细胞是血液系统癌细胞或实体瘤细胞。
50.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-36中任一项的抗原结合单元。
51.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求37的药物组合物。
52.根据权利要求50-51中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液系统癌症或实体瘤。
53.根据权利要求52所述的方法，其中治疗所述癌症包括减小肿瘤体积。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其进一步包括施用治疗性抗体。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述治疗性抗体是抗CD20抗体。
56.根据权利要求53-55中任一项所述的方法，其中与具有SEQ ID NO：240和241或SEQID NO：242和243或SEQ ID NO：244和245的氨基酸序列的抗原结合单元相比，所述肿瘤体积被更大程度地减小。
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