WO2004107880A1

WO2004107880A1 - 調味料

Info

Publication number: WO2004107880A1
Application number: PCT/JP2004/008498
Authority: WO
Inventors: Yuki Yamada; Masashi Ogasawara; Kaoru Hiroki; Chiaki Saitoh
Original assignee: Kyowa Hakko Food Specialties Co., Ltd.
Priority date: 2003-06-10
Filing date: 2004-06-10
Publication date: 2004-12-16
Also published as: EP1637042A1; KR101116923B1; US20070190226A1; JP4476219B2; KR20060030038A; CN100525647C; JPWO2004107880A1; CN1802098A; EP1637042A4

Abstract

Ｎ末端から１および２番目のアミノ酸が、それぞれグリシンおよびＬ−プロリンであり、かつ分子量が１０００以下のペプチド、例えばＧｌｙ−Ｐｒｏ−３ＨｙｐもしくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする飲食品のこく味増強剤、調味料および該ペプチド、こく味増強剤または調味料を添加することを特徴とする飲食品のこく味増強方法に関する。

Description

明細書

調味料

技術分野

本発明は、こく味増強剤、調味料およぴ飲食品のこく味増強方法に関する。

背景技術

基本味とは、味覚の質を表すもっとも基本的な要素で、生理学的にほ甘味、塩味、 '酸味、苦味、うま味の 5種類の味をいう（丸善食品総合辞典、丸善、 P.280、 (1998) ) 。

. また、' 基本味以外の味として、こく味がある。こく味とは、.持続性のあるうま味をいい、好ましくはこれに濃厚感が付与された味をいう。

うま味調味料や、酵母エキス、蛋白加水分解物、魚介エキス、畜肉エキス等の天然調味料は、うま味等の基本味を付与することはでき'るが'、こく味を十分に付与することは難しい。

こく味を付与する方法としては、ピジン化合物類（特開平 1 1 一 3 1 3 6 3 5号公幸艮）、クノレタチオン (Bioscience Biotechnology Biochemistry, 6i, 1977-1980 (1997)) 、スルホン基含有化合物、リン酸塩およびべタイン（開平 8— 8 9 7 6 1号公報）、ゼラチンおよびトロポミォシンの酵素分解物（特開平 8— 2 2 8 7 1 5号公報）、 0_ W型の乳化組成物（特開平 1 0— 1 7 9 0 2 6号公報）、分子量 1 0 0 0〜 5 0 0 0のペプチドと力ルポ-ル化合物とのァミノ-カルボ-ル反応物（特開 2 0 0 2— 3 3 5 9 0 4号公報）等を添加する方法等が知られている。 .

ペプチドは呈味成分として知られ、甘味、苦味、塩味、うま味を有するペプチドが報告されてい 6。例えば、うま味を有するペプチドとしては、魚肉蛋白質を酵素で分解して得られた分子量 1 0 0 0以下の酸†生ペプチドで、 G l u - A s p、 T h r - G 1 u、 G 1 u - S e r 、 G 1 u - G 1 u、 G l u— A s p - G 1 u、 A s p - G 1 u - S e r 、 G l u— G l y— S e r、 S e r - G l u - G l u , G 1 u - G 1 n - G 1 uで表されるァミノ酸配列からなるぺプチド（Journal of Agricultural & Food Chemistry, 23, 49-53 (1975)) 力 S知られてレヽる。 'また、ぺプチドは基本味の強さを変.化させて味覚を変化させる作用があることが知られており、甘味を抑制する作用、苦味を抑制する作用、酸味を抑制する作用およびうま味を増強する作用を有するぺプチドが知られている。例えば、うま味を増強する作用を有するペプチド' として、 '鶏肉蛋白質をプロテアーゼ、フロメラインで処理した加水分解物中に、 G l u— G l u、 G l u—V a l 、 A l a — A s p — G l u、 A l a — G l u—A s p、 A s p— G l u—G l u、 S e r — P r o - G 1 uで表されるアミノ酸配列からなるぺプチド（Journal of Agricultural & Food Chemistry, 50, 1515-1522(2002)) 力 S報告されている。

さらに、ペプチドは、こく味を付与する作用を有することが知られている（特開平 5 - 8 4 0 5 0号公報）。このようなぺプチドとしてグルグチオン (Bioscience Biotechnology Biochemistry, 6丄—，

1977-1980 (1997)) があげられるが、グルタチオンは加熱により二量体を形成しやすく、こく味付与の機能が俾下'しゃすい等の問題がある。ぺプチドほ飲食品の味に様々な影響を与えるため、飲食品のこく味を効果的に増強することのできるぺプチドの'開発が望まれている。発明の開示

本発明の目的は、こく味増強剤、調味料およびこく味増強方法を提供することにある。

本発明は以下（ 1 ) 〜（ 1 7 ) に関する。

( 1 ) N末端から 1および 2番目のアミノ酸が、それぞれグリシンおよび L一プロリンであり、かつ分子量が 1 0 0 0以下のぺプチドを有効成分として含有することを特徴とする飲食品のこく味増強剤。

( 2) 該ペプチドが、 3、 6または 9残基のアミノ酸からなるぺプチドである、上記（ 1 ) のこく味増強剤。

( 3 ) 該ペプチドの N末端から 3番目のアミノ酸が、 L—ヒドロキシプロリンまたは Lーァラニンである、上記（ 1 ) または（ 2 ) のこく味増強剤。

(4) 該ぺプチドを構成するァミノ,酸のうちの 3分の 1以上がダリシンである、上記（ 1 ) 〜 ( 3 ) 'いずれか 1つのこく味増強剤。

( 5 ) 該ペプチドが、 G 1 y— P r 0 _ 3 H y pもしくは G 1 y— P r o— 4 H y p、または G l y— P r o— A l aで表されるァミノ酸酉' S列からなるペプチドである、上記（ 1 ) 〜（4) いずれか 1つのこく味増強剤。

( 6 ) 上記（ 1 ) 〜（ 5 ) いずれか 1つのこく味増強剤を添加してなる飲食品。

( 7 ) N末端から 1および 2番目のアミノ酸が、それぞれグリシンおよび L—プロリンであり、かつ分子量が 1 0 0 0以下のぺプチドを有効成分として含有することを特徴とする調味料。

( 8 ) 該ペプチドが、 3、 6または 9残 ¾のアミノ酸からなるぺプチドである、 '上記（ 7 ) の調味料。

( 9 ) 該ぺプチドの N末端から 3番目のァミノ酸が. Lーヒドロキシプロリンまたは L—ァラニンである、上記（ 7 ) または（ 8 ) の調味料。 '

( 1 0 ) 該ぺプチドを構成するァミノ酸のうちの 3分の 1以上がグリシンである、上記（ 7 ) 〜（ 9 ) いずれか 1つの調味料。

( 1 ,1 ) 該ぺプチドが、 G l y— P r o— 3 H y p もしくは G l y 一 P r o— 4 H y p、または G.I y - P r o - A 1 aで表されるアミノ酸配列からなるペプチド'である、上記（ 7 ) 〜（ 1 0) いずれか 1 つの調味料。

( 1 2) 上記（ 7 ) 〜（ 1 1 ) いずれか 1つの調味料を添加してなる飲食品。'

( 1 3 ) N末端から 1および 2番目のアミノ酸が、それぞれグリシンおよび L—プロリンであり、かつ分子量が 1 0 0 0以下のペプチドを飲食品に添加することを特徴とする飲食品のこく味増強方法。

( 1 4) 該ペプチドが、 3、 6または 9残基のアミノ酸からなるぺプチドである、上記（ 1 3 ) の方法。 ( 1 5 ) '該ぺプチドの N末端から 3畚目のアミノ酸が Lーヒドロキシプロリンまたは Lーァラニンである、上記（ 1 3 ) または（ 1 4) の方法。

( 1 6 ) 該ぺプチドを構成するァミノ酸のうちの 3分の 1以上がグリシンである、上記（ 1 3 ) 〜（ 1 5 ) いずれか 1つの方法。

、（ 1 7 ) 該ペプチドが、 G l y - P r o— 3 H y pもしくは G l y 一 P r o— 4 H y p、または G l y— P r o— A l aで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、上記，（ 1 3 ) 〜（ 1 6 ) いずれか 1つの方法。

本発明に用いられるぺプチド（以下、本発明のぺプチドという）は、 N末端から 1および 2番目のァミノ酸が、それぞれグリシン（G l y ) および L一プロリン（L— P r o ) であり、かつ分子量が： L 0 0 0 以下のペプチドであればいずれのペプチドも用いられる。

ペプチドを構成するアミノ酸の数は、特に限定されないが、 3、 6 または 9残基であることが好ましい。

ぺプチドを構成するァミノ酸は特に限定されないが、ぺプチドを構成するァミノ酸のうち、 3分の 1以上がグリシンであることが好ましい。

本発明のペプチドとしては、例えば、 N末端から 3番目のアミノ酸が、 L—ヒドロキシプロリンまたは Lーァラニン（ L— A 1 a ) であり、かつ分子量が 1 0 0 0以下のぺプチドがあげられる。

本発明のペプチドにおいて、 Lーヒドロキシプロリンは、 3—ヒド口キシ一 L—プロリン（ 3 H y p ) 、 4—ヒドロキシー L—プロリン ( 4 H y p ) および 5—ヒ'ドロキシー L—プロリン（ 5 H y p ) めいずれであつてもよい。

本発明のぺプチドの例としては、例えば、 G l y - P r o - X a a、

G 1 y - P r o - X a a - G 1 y - X a a - X a a、配列番号 1に示される G l y— P r o - X a a - G 1 y - X a a - X a a— G l y -

X a a -X a a等のアミノ酸配列からなるぺプチドがあげられる（ただし、 X a aは任意のアミノ酸を表すものとする）。具体的には、 G l y _ P.r o— 3 H y p、 G l y— P r o— 4 H y p、 G l y— P r o - A 1 aで表されるァミノ酸配列を有するぺプチドがあげられる力 S、これに限定されるものではない。

本発明のぺプチドは、ぺプチド合成機等を用いてぺプチド合成しても得ることができるが、コラーゲンまたはゼラチンを、タンパク質加水分解酵素で加水分解して得られる加水分解物を、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、ゲルろ過クロマトグラフィー法、超遠心分離法等の、ぺプチドを分子量により分画でき.る方法、好ましくは限外ろ法またはゲルろ過クロマトグラフィ一法を用いて、分子量 1 0 0 0以下の画分を分取して得ることができる。

ダンパク質加水分解酵素としては、クンパク質を加水分解する'ことのできる酵素であればいずれの酵素を用いてもよい。例えば、エンドぺプチ、ダーゼ、ェキソぺプチダーゼがあげられるカ、エンドべプチダーゼを用いることが好ましい。ェンドぺプチダーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン等のセリンプロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、フイシン等のチォーノレプロテアーゼ、ザ一モリシン.、コラゲナーゼ等のメタルプロテアーゼ等があげられる。

これらのタンパク質加水分解酵素は単独で用いてもよいし、 2種以上を組み合わせて用いてもよい'。

タンパク質加水分解酵素としては、上記のいずれのものであってもよいが、コラーゲンまたはゼラチンを.構成するァミノ酸配列中に存在する X a a — G l y ( X a aは任意のァミノ酸を表す）の X a a - G 1 y間のぺプチド結合、好ましくは、 X a a _ G 1 y— P r o (X a aは任意のァミノ酸を表す） X a a - G 1 y間のぺプチド結合を切断できるものが好ましく用いられる。このようなタンパク質加水分解酵素としては、例えばコラゲナーゼ.があげられる。

コフグナーセとしては、 Clostridium histolyticum、 Streptomvces parvulus, Achromobacter iophagus等の微生物由来のコラゲナーセ、脊椎動物由来のコラゲナーゼ等があげられるが、微生物由来のコラゲナーゼが好ましく用いられ、 Clostridium histolyticum由来のコラゲナーゼがより好ましく用いられる。

ゼラチンとしては、コラーゲンを酸処理して得られるゼラチン（タイブ A) と、アルカリ処理して得られるゼラチン（タイプ B) の二種類があるが、いずれのタイプの.ものを用いてもよい。

コラーゲンまたはゼラチンは、ゥシ、プタ等の動物の骨、皮、腱、軟骨、骨格筋等から常法により調製して得たものを用いてもよいし、 '市販のものを用いても"よレ、。

コラーゲンまたはゼラチンを、水性媒体中で、コラゲナーゼ、好ましくは Clostridium histolyticum由来のコラゲナーゼで加水分角した場合、 G l y— P r o— X a a、 G l y— P r o— X a a _ G l y— X a a - X a a、配列番号 1に示される G l y— P r o—X a a — G 1 y - X a a - X a a — G 1 y - X a a - X a _a等のアミノ酸配列力らなるペプチド（X a aは任意のアミノ酸を表す）を、'該水性媒体中に生成蓄積させることができる。

タンパク質加水分解酵素は、市販の精製品を用いてもよいし、該タンパク質加水分解酵素活性を有する微生物、動物、植物等の細胞から通常の酵素精製法に準じて粗精製じた酵素または精製した酵素'を用いてもよい。

また、該タンパク質加水分解酵素活性を有する細胞の培養液、該細胞の培養液を濾過もしくは遠心分離等で'固液分離して得られる細胞、または該細胞の処理物をタンパク質加水分解酵素として用いてもよレ、。該細胞の処理物としては、該タンパク質加水分解酵素活性を有する細 ' 胞の培養液を濃縮機もしくは乾燥機等で濃縮もじくは乾燥処理して得られる該細胞の培養液の濃縮物もしくは乾燥物、該細胞を乾燥機等で乾燥処理して.得られる該細胞の乾燥物、該細胞を界面活性剤および/または有機溶剤等で処理して得られる該細胞の界面活性剤および/または有機溶剤処理物、該細胞をリゾチーム等の酵素で処理して得られる該細胞の細胞溶解酵素処理物、該細胞の固定化物等があげられる。

水性媒体は、タンパク質加水分解酵素が、コラーゲ.ンまたはゼラチンを加水分解できるものであればいずれでもよく、例えば、水、各種緩衝液があげられ、タンパク質加水分解反応を阻害しなければ、他の成分、例えば、.アミノ酸、金属イオン、有機酸等を含んでいてもよい。また、該タンパク質加水分解酵素活性を有する細胞の培養液、該培養液から細胞を除去して得られる上清も、水性媒体として用いることができる。

タンパク質加水分解酵素の使用量は、コラーゲンまたはゼランの種類等によって異なるため特に限定されないが、コラーゲンまたはゼラチン 1 0 0重量部に対して 0 . 0 5〜 8重量部であることが好ましく、 0 . 1〜 6重量部であることがより ^:好ましく、 0 . 5〜 4重量部であることがさらに好ましい。

コラーゲンまたはゼラチンのタンパク質加水分解酵素による加水分解処理の p Hや反応温度等は、使用する酵素の至^条件またはそ.れに近い条件を適宜用いればよ.い。

. p Hの調整は、飲食品への使用に許容ざれる酸またはアルカリを使用することができ、酸としてほ無機酸、有機酸があげられ、無機酸としては、塩酸、リン酸等が、有機酸としては、酢酸、' 乳酸、クェン酸等があげられる。アル力リとしては、水酸化ナトリウム、水酸化力リゥム、アンモニア水等があげられる。

コラーゲンまたはゼラチンのタンパク質加水分解酵素による加水分解理時間は、使用するタンパク質加水分解酵素の使用量、温度、 p H等の諸条件により異なるが、 1〜 1 0 0時間であることが好ましく、 1〜 7 2時間であることがより好ましい。

タンパク質加水分解酵素による加水分解処理終了後、該加水分解処理液をそのまま次の処理に供することもできるが、加熱処理、酸処理等によつて酵素を失活させた後に次の処理に供することもできる。該加水分解処理液を、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、ゲルろ過クロマトグラフィ一法、超遠心分離法等の分子 *により分画することのできる公知の方法により分画し、分子量 1 0 0 0以下のペプチドを含有する画分を分取することができる。

分子量が 1 0 0 0以下のぺプチドを含有する画分を、該画分中に含まれる各ペプチドの電荷、極性、分子量、特異性等の差を利用した通常のタンパク質精製法に従って分画、 '分取することにより、分子量が

1 0 0 0以下のぺプチドを含有する] if分中に含まれる本発明のぺプチドを精製することもできる。

電荷の差により精製する方法としては、イオン交換クロマトグラフィ一法、電気泳動法、等電点電気泳動法等の方法;^あげられる。

極性の差により精製する方法としては、吸着クロマトグラフィー、濾紙クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ一等の方法があげられる。

分子量の差により精製する方法としては、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、ゲルろ過クロマトグラフィー法、超遠心分離法等の方法があげられる。

特異性の差により精製する方法と.しては、ァフィ二ティーク口マトグラフィ一法等の方法があげられる。

上記のいずれの方法も用いることが'できるが、.分子量または極性の差を利用する方法が好ましく用いられ、極性の差を利用する方法がより好ましく用いられ、逆相クロマトグラフィーがさらに好ましく用いられる。

本発明のぺプチドの N末端から 1および 2番目のアミノ酸がそれぞれグリシンおよび L一プロリンであるか否かは、以下の方法により決定することができる。

ぺプチド合成機等を用いて N末端から 1および 2番目のアミノ酸がそれぞれグリシンおよび Lー少ロリンであり、かつ分子量が 1 0 0 0 以下となるように合成したぺプチド、またはこのような配列および分子量を有する市販のぺプチドを標準物質として、本発明のぺプチドを精製'じた方法と同じ操作に供し、各べプチドが該標準物質と同じ面分に分画されるか否かを調べて同定することで決定することができる。また、同定された本発明のペプチドの量は、該精製されたペプチドが存在する画分に相当す'る画分中の標準物質の量と比較することにより定量することができる。コラーゲンまたはゼラチンのタンパク質加水分解酵素による加水分解処理'液、該加水分解処理液より分取して得られる本発明のぺプチドを含有する溶液は、本発明のペプチドを含有する溶液として、そのまま飲食品に添加しても、本発明のこく味増強剤、または本発明の調 ¾ 料に用いてもよいし、該溶液の処理物を、飲食品に添加しても、本発明のこく味増強剤または本発明の調味料に用いてもよい。該溶液の処理物としては、該溶液を活性炭等による脱色処理、減圧濃縮等による濃縮処理等をして得られる脱色液、濃縮液等の液体、該液体を減圧乾燥、噴霧乾燥等、乾燥処理して得られる固形物、粉末等としたものがあげられる。

本発明のペプチドを含有する溶液、該溶液の処理物、該溶液から精製して得られる本発明のぺプチド、 'これらを用いて得られる本発明のこく味増強剤または本発.明の調味料を飲食品に添加することにより、飲食品のうま味に持続性を付与させ、.飲食品のこく味を増強することができる。

本発明においてこく味とは、持続性のあるうま味をいい、好ましくはこれに濃厚感が付与された味をいう。

うま味としては、うま味物質が単独、または複数で呈する味があげられる。うま味物質としては、グルタミン酸ナトリウム、ァスパラギン酸、ォキシグルタミン酸、イボテン酸、トリコロミン酸、イノシン酸ナトリゥム、グァニル酸ナトリウム、コハク酸ナトリゥム等をあげることができ、特にグルタミン酸ナトリゥムによるうま味をあげるこ 'とができる。'

本発明の飲食品のこく味増強方法としては、本発明のぺプチドを使用する以外は特に限定はなく、通常用いられる飲食品の調味方法を用いることができる。

本発明の飲食品のこく味増強方法としては、例えば本発明のぺプチドを含有する溶液、該溶液の処理物、もしくは該溶液から精製して得られる本発明のぺプチドをそのまま、または本発明のこく味増強剤または本発明の調味料を、飲食品を製造する際に該飲食品の原材料の一部として添加する方法、製品となっている飲食品を加熱調理、電子レンジ調理、真空調理等の調理する際または摂食の際に添加する方法等があげられる。

本発明の飲食品のこく味増強方法の対象となる飲食品はいずれの飲食品であってもよい。例えば、味噌、醤油、たれ、だし、ドレツシ . グ、マヨネーズ、トマトケチャップ等の調味料、吸い物、コンソメスープ、卵スープ、わかめスープ、フカヒレスープ、ポタージュ、味噌汁等のスープ類、麵類（そば、うどん、ラーメン、パスタ等）のつゆ、ソース類、おかゆ、雑炊、お茶漬け等の米調理食品、ハム、ソーセ一ジ、チーズ等の畜産加工品、.かまぼこ、干物、塩から、珍味等の水産加工品、漬け物等の野菜加工品、ポテトチップス、せんべい、クッキ一等の菓子スナック類、煮物、揚げ物、焼き物、カレー、シチュー等の調理食品等があげられるが、カレー、シチュー、ハンバーグ、豚骨ラーメン等の、肉類を原材料として得られる飲食品が好逾にあげられる。

本発明のこく味増強剤'は、本発明のペプチドを含有し、必要に応じて、無機酸、有機酸、アミノ酸、核酸、糖類、調味料、香辛料、賦形剤等の飲食品に使用可能な各種添加物を含有していてもよい。 '

無機酸としては、' 食塩、塩化力リウム、塩化アンモ-ゥム等があげられる。

• 有機酸としては、.ァスコルビン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クェン酸、脂肪酸等のカルボン酸おょぴそれらの塩等があげられる。該塩としては、ナトリウムおよびカリウム塩があげられる。

アミノ酸としては、グルタミン酸ナトリウム、グリシン等があげられる。

核酸としては、イノシン酸ナトリウム、グァニル酸ナトリウム等があげられる。

糖類としては、ショ糖、ブドウ糖、乳糖等があげられる。

調味料としては、醤油、味噌、エキス等の天然調味料、香辛料としては各種の香辛料があげられる。 .賦形剤としては、澱粉加水分解物であるデキストリン、— 各種癜粉等があげられる。

これらの使用量は、使用目的に応じて適宜設定することがで'きる、例えば、本発明のペプチド 1 0 0重量部に対して、 0 . 1〜 5 0 0重量部使用できる。 .

本発明の調味料は、 *発明のぺプチドおよびうま味物質'を含有し、必要に応じて、上記の無機酸、有機酸、アミノ酸類、核酸、糖類、調味料、香辛料、賦形剤等の飲食品に使用可能な各種添加物を含有していてもよレヽ。

本発明め調味料は、こく味調味料として好適に用いられる。

本発明のこく味増強剤または本発明の調味料は、本発明のぺプチド、および必要に応じてうま味物質を配合する以外は、通常の調味料の製造方法を甩いて製造することもできる。

本発明の調味料において、うま味物質、例えばグルタミン酸ナトリゥムのうま味またはこく味を増強させるためには、グルタミン酸ナトリウム 1 0 0重量部に対して、本発明のぺプチドを 0 . 0 1〜 5 0重量部となるように配合させることが好ましい。

本発明'のこく味増強剤または本発明の調味料は、液状、粉状、顆粒状等のいずれの形状を有するものであってもよい。

本発明のこく味増強剤まだは調味料中の本発明のぺプチドの含有量は特に限定されないが、本発明のこく味増強剤または調味料 1 0 0重量部中、 0 . 0 1重量部〜 1 0 0重量部、好ましくは 0 . 0 5〜： L 0 0重量部含有されていることが好ましい。

なお、本発明のこく味増強剤または調味料中の本発明の^プチドの含有量は、上記で述べた、分子量 1 0 0 0以下のペプチド溶液中の本発明のぺプチドの定量方法と同様の方法を用いて定量することができる。

' 本発明のペプチドを含有する溶液、該溶液の処理物、該溶液から精製して得られる本発明のぺプチド、これらを用いて得られる本発明のこく味増強剤または調味料は、飲食品を製造または調理する際に添加するか、製造または調理された飲食品に添加すればよい。

飲食品に使用する本発明のぺプチドを含有する獰液、該溶液の処理物、該溶液から精製して得られる本発明のペプチド、これらを,用いて得られる本発明のこく味増強剤または本発明の調味料の量は、飲食品

1 0 0 0重量部に対して、本発明のぺプチドとして、好ましくは 1 X 1 0— ⁴〜 2重量部、さらに好ましくは 1 X 1 0— ³〜 1重量部となるように添加することが好ましい。'

以下に本発明の実施例を示す。発明を実施するための最良の形態

実施例 1

( a ) 豚ゼラチン（SIGMA社製） 5 0 gを蒸留水 1 0 0 0 m l に分散させ、 3 7 °Cに加温してゼラチンを溶解させ、 3 7 °Cで保持した。該ゼラチ溶液にコラゲナゼ (EC 3.4.24.3、 Clostridium histolyticum 由来、ナカライテスタ社製）を 2 5 0 g加えて溶解し、水酸化ナトリウムを用いて ρ Η を 7. 4に調整し、 3 7 °Cで 2時間反応を行った

。反応終了後、反応液を 1 0 0 °Cで 1 0分間加熱し、コラゲナーゼを失活させた。反応液を 5 0 0 0 r p mで、 1 0分間遠心分離し-、得られた上清をろ過し、得られたろ液をゼラチンのコラゲナーゼ分解液とした。得られたゼラチンのコ'ラゲナーゼ分解液 1 0 0 0 m l を凍結乾燥して凍結乾燥粉末約 5 0 gを得た。 '

—方、豚ゼラチン（SIGMA社製） 5 0 gを蒸留水.1 0 0 0 m l に分散させ、 3 7 °Cに加温してゼラチンを溶解させ、' 3 7 °Cで保持した。該ゼラチン溶液にペプシン A (EC 3.4.23.1、和光純薬社製）を 2 5 0 m g加えて溶解し、塩酸を用いて p H を 2. 0に調整し、 3 7 °Cで 2時間反応を行った。反応終了後、反応液を 1 0 0 °Cで 1 0分間加熱し、ペプシンを失活させた。反応液を 5 0 0 0 r p mで、 1 0分間遠心分離し、得られた上清をろ過し、得られたろ液をゼラチンのペプシン分解液とした。得られたゼラチンのペプシン分解液 1 0 0 0 m l を凍結乾燥して凍結乾燥粉末約 5 0 gを得た。コラゲナーゼ分解液の^結乾燥粉末 1 0 gを 2 0 0 m 1 の水に溶解して得られた溶液 2 0 O m 1 を、限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて限外ろ過し、分子量 1 0 0 0以下のぺプチドを含有する画分（以下、 A画分と略す）約 2 0 0 m 1 、および分子量 1 0 0 0以上のぺプチド . を含有する画分（以下、 B画分と略す）を得た。同様にゼラチンのぺプシン分解液の凍結乾燥粉末 1 0 g.を 2 0 0 m l の水に溶解して得られた溶液 2 0 0 m l を限外ろ過し、分子量 1 0 0 0以下のペプチドを含有する画分（以下、 c画分と略す）約 2 0 0 m l 、および分子量 1 ό 0 0以上のぺプチドを含有する画分（以下、 D画分と略す）を得た。

A〜D画分を凍結乾燥し、それぞれ 6 . 9 g、 2. 8 g、 1 . 9 g、 7. 8. gの凍結乾燥粉末を得た。以下の実験には、この凍結乾燥粉末を用いた。

A画分および B画分中の全窒素含量を、自動窒素分析計（サーモフィニガン社製）を用いてデユマ法により測定し、全窒素含量に 6' . 2 5をかけて A画分中のタンパク質量を算出した。一方、 A画分中の遊離アミノ酸量をアミノ酸アナライザー（日本電子デタム社製）を用いて定量した。

A画分中のタンパク質量から遊離ァミノ酸量を差し引き、 A画分の凍結乾燥粉末中の分子量 1 0 0 0以下のぺプチドの量を計算した結果、 6 . 9 gであった。

同様に、 C画分の凍結乾燥粉末中の分子量 1 0 0 0以下のペプチド量を計算した結果、 1 . 9 gで'あった。

A〜 D画分の凍結乾燥粉末をそれぞれ適量の水に溶解し、それぞれ 1 μ I の溶液を液体ク口マトグラフィ一/質量分析装置に供した。液体クロマトグラフィーのカラムは、 Inertsil C8- 3 (G L ¹イエンス社製）を用いた。移動相は、 0. 0 2 % (w/ V ) トリフルォロ酢酸水溶液、および 0 . 0 2 % (w/ V ) トリフルォロ酢酸ァセトニトリル溶液を用い、流速 0. '2 m l Z分で 1 0 0分間の濃度勾配溶出によりペプチドを分離した。検出、定量は LCQ Advantage (サーモエレクトロン社製）を用いて行った。イオン化条件を以下に示す。キヤビラリ一温度： 250°C

シースガス (Sheath Gas) ：窒素流量： 40arb

ォグジラリーガス（AUX. . Gas) ：ヘリウム流量： lOarb • スプレー電圧： 4.5kv

定量は、 0 1 ー？ 1： 0— 4117 のァミノ酸配列からなるぺプチド（Bachem社製）および G l y— P r o - A 1 aのァミノ酸配列からなるペプチド（Bachem社製）を標準物質として用い、ポジティブ、モードの選択イオンモニタリング（SIM) (分子量 244· 3および 286.3)により実施した。

分析の結果、 A画分の凍結乾燥粉末中には G 1 y - P r o - 4 H y pが' 5. 9 % (W/W) 、および G l y— P r o—A l a.がそれぞれ 1. 8 % (W/W) 含有されていた。なお、 B〜D画'分からは G l y — P r o _ 4 H y p、および G l y - P r o— A l aは検出されなかつた。

( b ) ホィトルゥ（ハチ食品社製） 4 4. 6 % (W/W) 、食塩 3. 5 % (W/W) 、グラニュー糖 5. 1 % (Wダ W) 、粉末油脂'（植田製油社 ⁽製） .1 1. .0 % (W/W) 、粉末バター (三協食品社製） 7. 1 %. (W/W) 、チーズパウダー (六甲バター社製) 7. 1 % (W/ W) 、脱脂粉乳 8. 1 % (よつば乳業社製） (W/W) 、ヮキシーコーンスターチ（日澱化学社製） 5. 1 % (W/W) 、グルタミン酸ナトリウム（協和発酵工業社製） 2. 5 % (W/W) 、 5 ' — リポヌクレオチド（協和発酵工業社製） 0. 1 % (W/W) 、チキンブイヨン

(協和発酵工業社製） 3. 5 % (W/W) 、ホワイトペッパー（カネ力サンスパイス社製） 0. 1 % (W/W) 、ローレル末（カネ力サンスパイス社製） 0. 2 % (W/W) 、野菜エキスパウダー（協和発酵社製） 2. 0 % (W/W) を含有するクリームスープの素 4 0 gに熱水を加えて全量 1 0 0 0 m l とし、クリームスープを調製した。

このクリームスープ 1 0 0 m l に、上記（ a ) で得られたゼラチンのコラゲナーゼ分解液の凍結乾燥粉末 2 0 0 m g、またはゼラチンのペプン分解液の凍結乾燥粉末 2 0 0 m gを添加し、得られたタリームスープをそれぞれスープ 1およびスープ 2 とレた。スープ 1およびスープ 2の風味について、 1 5人の熟練したパネルにより官能試験を行った。 . . '

試験は、スープ 1およびスープ 2を 5 0〜 6 0 °Cに加熱して口に含み、スープ 1 とスープ 2の「うま味の持続性」、「濃厚感」およぴこれらの総合として得られる「こく味」をそれぞれ比較し、強いと感じた方を選択する 2点評価法で行った。

結果を第 1表に示す。数字は、人数を示す。第 1表

うま味の持続性濃厚感こく味

スープ 1 13 14 13 スープ 2 2 1 2

第 1表から明らかなとおり、ゼラチンのコラゲナーゼ分解液の凍結乾燥粉末を添加したクリームスープ（スープ 1 ) は、ゼラチンのぺプシン分解液の凍結乾燥粉末を添加したクリームスープ（スープ 2 ) に比べて、明らかに「うま味の持続性」および「濃厚感」が強く、これらの総合として感じられる I こく味」も強かった。

( c ) '上記（b ) において、ゼラチンのコラゲナーゼ分解液の凍結乾燥粉末またはゼラチンのペプシン加水分解液の凍結乾燥粉末のかわり 'に、第 2表に示す添加物を、第 2表に示す量添加する以外は同様にして、官能試験を行づた。

なお、第 2表中、 G l y— P r o— 4 H y pで表されるァミノ酸配列からなるペプチド、 G 1 y - P r o— A 1 aで表ざれるァミノ酸配列からなるペプチド、または G 1 y - G 1 y - G 1 yで表ざれるアミノ酸配歹 IJ力らなるぺプチドはいずれも Bachem社製のものを用いた。第 2表

試験区添加物添加量

1 なし一

2 A画分（分子量 1000以下） 100mg

3 B画分（分子量 1000以上） 100mg

4 Gly— Pro— 4Hyp 2mg

5 Gly— Pro— Ala 2mg

6 Gly— Gly— Gly 2mg

クリームスープの「うま味の持続性」、「濃厚感」およびこれらの総合である「こく味」について、無添加のクリームスープをコント口ールとして、 1 5人の熟練したパネルにより官能検查を行った。コントロールの「うま味の持続性」、「濃厚感」および「こく味」をそれぞれ 3点とし、コントロールよりやや弱い場合を 2点、 2点の場合よりも弱い場合を 1点'とした。コントロールより強い場合は、やや強い場合を 4点、 '4点の場合よ'り強い場合を 5点、 5点の場合よりも強い場合を 6点、 6点の場合よりも強い場合を 7点として評価した。

「うま味の持続性」、「濃厚感」および「こく味」について、 1 5 人の評点の平均を求めた。

結果を第 3表に示す。第 3表

試験区うま味の持続性；辰チ ί こく味

1 3.0 3.0 3.0

2 4.4* 5.7* 5.7*

3 5.1* 4.1 4.3

4 4.7* 5.6* 5.3*

5 5. 5.4* 5.3*

6 3.6 3.4 3.3

*は危険率 1 %で有意差があることを示す

第 3表から明らかなとおり、ゼラチンのコラゲナーゼ分解液より得られた分子量 1 0 0 0以下のペプチドを含有する画分（Α画分、試験区 2 ) 、 G 1 y— P r ο— 4 H y ρで表されるアミノ酸配列からなるぺプチド（試験区 4) 、または0 1 ₇ _ ? ]： 0 — . 1 &で表されるァミノ酸配列からなるペプチド（試験区 5 ) をタリ.ームスープに添加する''こ-とにより、無添加のクリームスープに比べて、クリームスープの「うま味の持続性」および「濃厚感」が有意に増強れた。'特に「濃厚感」は顕著に増強された。また、これらの総合として感じられるクリームスープの「こく味」が有意に増強された。産業上の利用可能性

本発明により、こく味増強剤、調味料および飲食品のこく味増強方法を'提供することができる。

「配列表フリーテキスト」

配列番号 1 ： X a aはいずれかのァミノ酸をあらわす

Claims

請求の範囲

1. N末端から 1および 2番目のァミノ酸が、それぞれグリシンおよび L一プロリンであり、かつ分子量が 1 0 0 0以下のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする飲食品のこく味増強剤。

2. 該ペプチドが、 3、 6または 9残基のアミノ酸からなるぺプチドである、請求項 1記載のこく味増強剤。

3. 該ぺプチドの N末端から 3番目のァミノ酸が L—ヒドロキシプロリンまたは Lーァラニンである、請求項 1または 2記載のこく味増強剤。

4. 該ぺプチドを構成するアミノ酸のうちの 3分の 1以上がグリシンである、請求項 1〜 3いずれか 1項に記載のこく味増強剤。

5. 該ぺプチドが'、 G 1 y - P r o— 3 H y p もしくは G l y - P r o— 4 H y p、または G l y - P r o - A 1 aで表されるァミス酸配列からなるぺプチドである、請求項 1〜 4いずれか 1項に記載のこく味増強剤。

6. 請求項 1〜 5いずれか 1項に記載のこく味増強剤を添加してなる飲食品。

7. N末端から 1および 2番目のアミノ酸が、それぞれグリ'シンおよび L—プロリン'であり、かつ分子量が 1 0 0 0以下のぺプチドを有効成分として含有することを特徴とする調味料。

8. 該ペプチドが、 3、 6または 9残基のアミノ酸からなるぺプチドである、請求項 7記載の調味料。

9. 該ぺプチドの N末端から 3番目のァミノ酸が Lーヒドロキシプロリンまたは Lーァラニンである、請求項 7または 8記載の調味料。

10. 該ぺプチドを構成するァミノ酸のうちの 3分の 1以上がグリシンで'ある、請求項 7〜 9いずれか 1項に記載の調味料。

11. 該ペプチドが、 G l y _ P r o— 3 H y p もしくは G l y

— P r o— 4 H y p、または G 1 y - P r o— A l aで表されるアミノ酸配列からなるぺプチドである、請求項 7〜 1 0いずれか 1項に記載の調味料。

12. '請求項 7〜 1 1いずれか 1項に記載の調味料を添加してなる飲食品。

•13. N末端から 1および 2番目のアミノ酸が、それぞれグリシンおよび L一プロリンであり、かつ分子量が 1 0 0 0以下のペプチドを飲食品に添加することを特徴とする飲食品のこく味増強方法。

14. 該ペプチドが、 3、 6または 9残碁のアミノ酸からなるぺプチドである、請求項 1 3記載の方法。 .

15：該ぺプチドの N末端から 3番目のァミノ酸が Lーヒドロキ - シプロリンまたは Lーァラニンである、請求項 1 3または 1 4記載の ' 方法。

16. 該ペプチドを構成するァミノ酸のうちの 3分の 1以上がグリシンである、請求項 3〜 1 5いず;^か 1項に記載の方法。

17.、該ぺプチド'が、 G 1 y - P r o— 3 H y p もしくは G l y - P r o— 4 H y p、または G l y— P r o - A 1 aで表されるアミノ酸配列'からなるペプチドである、請求項 1 3〜 1 6いずれか 1項に記載の方法。