WO2004101734A1 - 細胞培養用マイクロチャンバー - Google Patents

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Kenji Yasuda
Kazunori Takahashi
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Definitions

  • the present invention relates to a micro-chamber for cell culture, and more particularly, to a micro-chamber for cell culture capable of culturing a single cell unit while observing the state of cells under a microscope.
  • Conventional technology a micro-chamber for cell culture capable of culturing a single cell unit while observing the state of cells under a microscope.
  • the lowering of the medium level is performed.
  • the nutrient state can be kept constant by the mechanism for supplying the culture medium and discharging the culture medium when the level rises to the above high level (Japanese Patent Application Laid-Open No. H10-1991).
  • the culture vessel insert one end of the introduction pipe for introducing the new culture medium into the culture vessel, one discharge pipe for discharging the culture medium of the culture vessel to the outside, and one end of the trachea connecting the gas part of the culture vessel and the pump.
  • the introduction tube, the discharge tube, and the trachea for preventing the invasion of bacteria into the culture vessel, the nutritional state of the culture tank can be kept constant (Japanese Patent Laid-Open No. —1 7 2 9 5 6).
  • the culture could not be performed while controlling the solution environment of the cultured cells and the physical contact between the cells.
  • the optical tweezers technique used in the above-mentioned document has a force that can be captured is about piconewton, which captures floating cells. The power was sufficient, but not enough to capture cells that migrated on their own. In addition, it was difficult to selectively recover the electrophoretic cells in the culture from the culture part. Therefore, the present inventors have further studied the above-mentioned microchamber, and by reversibly changing the shape of the microchamber during culturing, it is possible to selectively recover the electrophoretic cells in the microchamber. Provide a new microchamper that can open and close the road.
  • the present invention provides a cell culture region, at least two flow paths connecting the region with the outside, opening / closing means for the flow path, and means for optically observing opening / closing of the cell culture area and the flow path.
  • a microchannel for cell culture wherein one channel is a channel for injecting a culture solution that may contain cells into the cell culture region, and the other channel is a cell from the cell culture region.
  • a microchamber for cell culture characterized in that the channel is opened or closed or its width is changed by pushing or pulling in a direction substantially perpendicular to the direction.
  • optical observation means examples include an optical microscope, a video recording device, and a camera. These may be connected to a personal computer or the like to perform image processing. In addition, a light irradiation device may be used together to facilitate observation.
  • the width of the flow channel is substantially the same as the target cell size. Therefore, the appropriate width of the flow path depends on the size of the target cell. Also, if the width of the channel is slightly smaller than the size of the target cell when the opening / closing means is not operated, the cell will not pass through this channel in the normal state and the channel will be opened. It is suitable for cell separation because it only passes through the cell when it is needed.
  • the opening / closing means may be any means that applies an external force to the flow path to open or close the flow path or change its width. Any material may be used, such as a device that mechanically applies a force or a device that changes the volume by providing a gap.
  • the opening / closing means has a gap adjacent to the flow path, and the gap is filled with gas or liquid, and by changing the pressure, the size of the gap is changed. It is preferable to change the opening and closing of the flow path or the width thereof. It is easiest to fill this gap with air and use this gap as an air reservoir to control the opening and closing of the flow path by the air pressure.
  • the entire flow path may be surrounded by an elastic material, or only the opening / closing means may be made of an elastic material. It is preferable to form the periphery of the gap and the periphery of the flow path with the same material, and arrange them so that a change in the size of the gap immediately affects the width of the flow path.
  • the elastic material may be any elastic material, and it is convenient to use a synthetic polymer that does not adversely affect cell culture, and it is particularly preferable to use a silicone resin.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the basic configuration of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating an example of a process of opening and closing a flow channel.
  • FIG. 3 shows a micrograph illustrating an example of a process for processing the culture microphone mouth champer.
  • FIG. 4 is a photomicrograph illustrating an example of the type I and polymer culture microchambers used in the processing process of the culture microchamber.
  • FIG. 5 is a micrograph showing an example of the open / closed state of the flow path of the culture microchamber.
  • FIG. 6 shows a micrograph of a case where cells pass through the flow channel in the culture microchamber with the flow channel open. Arrows indicate cells.
  • cell culture microchamber of the present invention will be described in detail, but the cell culture microchamber of the present invention is not limited thereto.
  • the cell culture microchamber 100 of the present invention is a slide glass or the like.
  • Air reservoirs 105 and 106 for adjusting the opening / closing status of the air reservoir by expansion or contraction, air passages 103 and 104 for pressurizing or depressurizing the air reservoir, and connection joints 101 and 102 for connecting to the air pressure control unit are arranged.
  • the solution (culture solution containing cells) can flow continuously in the direction of flow 107.
  • the culture area 110 can capture or discharge cells cultured therein, depending on whether the two flow paths 108 and 109 are open or closed.
  • the opening and closing of the flow path is controlled by controlling the pressure of the air in the air reservoir, so that the polymer wall surface surrounding the flow path expands or contracts, and the width of the flow path 111 is adjusted.
  • the flow path is arranged in a plane on a horizontal plane perpendicular to the optical axis of the optical microscope so that the width of the flow path can be measured by optical measuring means.
  • optical measuring means for example, by using an optical microscope, it is possible to confirm the width of the flow path, that is, the open state by simply observing the sample without actually flowing the sample. Therefore, this open status is visually checked.
  • FIG. Figures 2a and 2b are horizontal and vertical cross-sections, respectively, with the flow path appropriately closed and only the solution passing through the flow path 201 but not the cells 203. It is.
  • the flow path 204 is closed, and the size of cells passing through can be adjusted according to the degree of pressurization.
  • FIGS. 2c and 2d are a horizontal section and a vertical section, respectively, in a state where the flow path is opened and not only the solution but also the cells pass through the flow path 201.
  • the flow path 204 is opened, and all the cells can be passed through depending on the degree of the pressure reduction.
  • FIG. 3 shows an example of a process for actually manufacturing a cell culture microchamber.
  • a mold is formed by microfabrication technology such as photolithography (1 in Fig. 3).
  • photolithography 1 in Fig. 3
  • SU-8 a light-resisting thick resist material
  • the shape of the mold can be transferred to the polymer by curing an optically transparent and elastic polymer on the mold (2) (Fig. 3, 2).
  • a silicone resin such as polydimethylsiloxane).
  • a through hole is created using a punch to allow air and solution to flow, and the polymer is removed from the mold (Fig. 3, 3).
  • the polymer onto which the microstructure is transferred is adhered to a glass substrate 304, and a connector for air pressure control and a solution introduction / drainage unit are attached to use it as a cell culture microchamber. it can.
  • Fig. 4 shows the mold (Fig. 4a) of the cell culture microchamber (1) (Fig. 4a), which was actually made using Kou-Dai-Dani's raw resin SU-8, which was made by the process of Fig. 3.
  • Fig. 4b This is an example of a transferred polymer microstructure (Fig. 4b). From this optical micrograph, it can be seen that the ⁇ -shaped fine structure can be accurately transferred to the polymer.
  • Fig. 5 shows a series of microscopes showing the function of the flow path in this cell culture microchamber. It is a photograph.
  • Fig. 5a air is pressurized into the air reservoir to close the channel and prevent cells and solution from flowing.
  • Fig. 5b the air reservoir is sucked at a negative pressure to open the flow path to the extent that cells do not flow.
  • the flow of the solution draws the cells to the flow channel, but cannot pass through the flow channel.
  • the amount of opening of the flow path can be visually checked with an optical microscope. Therefore, the open value of the flow path can be adjusted only by visual observation without actually flowing the cells.
  • Fig. 5c shows the flow of cells by further opening the flow path.
  • FIG. 6 shows a micrograph of the process in which cells actually pass through the flow channel.
  • the cells (arrows) on the left side of the channel (1 in Fig. 6) pass through the channel (2 in Fig. 6) and pass to the right side of the channel (3 in Fig. 6).
  • the microchamber for cell culture according to the present invention has the following features: — Since the cell culture region and the outside are connected only by the flow path, the cells do not come into contact with a switchgear, etc. No extra load on the cells.
  • the opening / closing means is substantially perpendicular to the observation direction of the opening and closing of the flow path, the observation is not affected by the opening and closing of the flow path, and the cells that pass or do not pass through the flow path, and the opening / closing state of the flow path And can be observed simultaneously.

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Abstract

培養中にマイクロチャンバーの形状を可逆に変化させることで、マイクロチャンバー内の泳動細胞を選択的に回収できる流路を開閉することのできる新しいマイクロチャンバーを提供する。　スライドガラス等の光学的に透明な基板１１２上に、光学的に可視領域で透明で、かつ弾性高分子中に形成された細胞培養領域１１０と、その両端に位置する流路１０８，１０９と、この開閉状況を膨張・収縮によって調節する空気溜１０５，１０６と、この空気溜へ加圧、減圧を行うための空気の流路１０３，１０４と、空気圧制御部との接続ジョイント１０１、１０２が配置されており、細胞を含む培養液は流れ１０７の方向に連続的に流れることができる。

Description

明 細 書 細胞培養用マイクロ 技術分野
この発明は、 細胞培養用のマイクロチャンバ一に関し、 より詳細には、 細胞の 状態を顕微鏡観察しながら 1細胞単位で培養することのできる細胞培養用のマイ クロチャンパ一に関する。 従来技術
従来、 細胞の状態の変化や、 細胞の薬物等に対する応答を観察するのに、 細胞 集団の値の平均値をあたかも一細胞の特性であるかの様に観察してきた。し力、し、 実際には細胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、 各々の細 胞が異なった周期でタンパク質を発現している。
これらの問題を解決するべく、 同調培養等の手法が開発されているが、 培養さ れた細胞の由来が全く同一の一細胞からではないことから、 培養前の由来細胞 各々の遺伝子の違いがタンパク質発現の違いを生み出す可能性があり、 実際に刺 激に対する応答の結果を解析するときに、 そのゆらぎが細胞の反応機構自体が普 遍的に持つ応答のゆらぎに由来するものなのか、 細胞の違い （すなわち遺伝情報 の違い） に由来するゆらぎなのか明らかにすることは難しかった。
また、 同様の理由から、 細胞株についても、 一般には完全に一細胞から培養し たものではないため、 刺激に対する応答の再現性が細胞各々の遺伝子の違いによ つてゆらぐものか明らかにするのは難しかった。
更にまた、 細胞に対する刺激 (シグナル) は、 細胞周辺の溶液に含まれるシグ ナル物質、 栄養、 溶存気体の量によって与えられるものと、 他の細胞との物理的 接触によるものの 2種類があることからも、 ゆらぎにっ 、ての判断が難しいのが 実情であった。
一方、 従来より、 バイオテクノロジ一の研究分野において細胞の観察を行う場 合には、 大型培養器にて培養された細胞群の一部を一時的に培養器から取り出し て顕微鏡にセットし、 観察を行う力 あるいは、 顕微鏡全体をプラスチックの容 器で囲い温度を管理し、 その中に小さい別の容器を用い二酸ィ匕炭素濃度、 及び湿 度を管理しつつ、 顕微鏡観察を行っていた。 このとき、 細胞を培養しながら、 古 くなった培養液と新鮮な培養液を交換することで溶液条件を一定にすることがェ 夫されてきている。
たとえば、 循環ポンプを用いて、 基材表面に対する培地のレベルを基材の上端 縁高さより高いレベルと下端縁高さより低いレベルとの間で上げ ·下げ操作する ことにより、 上記低レベルに下がると培地を供給し、 上記高レベルに上がると培 地を排出する機構によって栄養状態を一定に保つことができる （特開平 1 0— 1 9 1 9 6 1 )。
また、 培養容器内に、 新たな培地を培養容器に導入する導入管と、 培養容器の 培地を外部に排出する排出管と、 培養容器の気体部分とポンプとを連通する気管 の各一端を挿入し、 前記導入管、 排出管及び気管の夫々の管路に培養容内への菌 の侵入を阻止するフィルターを設けることにより、 培養槽の栄養状態を一定に保 つことができる （特開平 8—1 7 2 9 5 6 )。
し力 し、 培養細胞の溶液環境と、 細胞間の物理的接触を制御しながら培養する ことができなかった。
そこで、 本発明者らは、 これらの問題点を解決し、 新たに特定の一細胞のみを 選択し、 その一細胞を細胞株として培養する技術、 及び細胞を観察する場合に、 細胞の溶液環境条件を制御し、かつ、容器中での細胞濃度を一定に制御する技術、 あるいは相互作用する細胞を特定しながら培養観察する技術を出願した （特開 2 0 0 2— 1 5 3 2 6 0 )。 発明が解決しょうとする課題
し力 し、 上記文献 （特開 2 0 0 2— 1 5 3 2 6 0 ) で用いた光ピンセット技術 は、 捕獲できる力の大きさがピコニュートン程度であり、 これは浮遊する細胞を 捕獲する力としては十分であるが、 自ら泳動する細胞を捕獲するには不十分であ つた。 また、 培養中の泳動細胞を選択的に培養部から回収することは困難であつ た。 そこで、本発明者らは、 上記のマイクロチャンバ一について更なる検討を加え、 培養中にマイクロチヤンバーの形状を可逆に変化させることで、 マイクロチャン パー内の泳動細胞を選択的に回収できる流路を開閉することのできる新しいマイ クロチャンパ一を提供する。
課題を解決するための手段
即ち、 本発明は、 細胞培養領域、 該領域と外部とを連結する少なくとも 2つの 流路、 該流路の開閉手段、 並びに該細胞培養領域及ぴ流路の開閉を光学的に観察 する手段から成る細胞培養用マイクロチャンバ一であって、 一の流路が細胞培養 領域に細胞を含んでもよい培養液を注入することができる流路であり、 他の一の 流路が細胞培養領域から細胞を含んでもよい培養液を排出することができる流路 であり、 該流路の少なくとも一部が弾性材料により囲まれて成り、 該開閉手段が 該流路を外部から前記観察手段の観察方向に対してほぼ直角方向に押す又は引く ことにより該流路を開閉又はその幅を変更するものであることを特徴とする細胞 培養用マイクロチャンバ一である。
この光学的観察手段として、 光学的顕微鏡、 ビデオ録画装置、 カメラなどが 挙げられ、 これらはパソコン等に繋いで画像処理を行うものであってもよい。 また、 観察を容易にするため、 光照射装置を共に用いてもよい。
この開閉手段を作動させていない時の、 前記流路の幅が対象となる細胞サイ ズと同程度であることが好ましい。 従って、 適当な流路の幅は、 対象となる細 胞のサイズによって異なる。 また、 開閉手段を作動させていない時の、 流路の 幅を、 対象となる細胞のサイズより若干狭くしておくと、 細胞が通常状態では この流路を通過せず、 流路を開けたときのみ通過するようになるため、 細胞の 分離に適する。
開閉手段は、 流路に外部から力を加えて、 流路を開閉又はその幅を変更させる ものであればよい。 機械的に力を加えるものや、 空隙を設けてその体積を変化さ せるもの等いかなるものであってもよい。
また、 前記開閉手段が前記流路に隣接する空隙を有し、 該空隙が気体又は液体 で満たされ、 その圧を変更することにより、 該空隙の大きさを変更し、 その結果 該流路開閉又はその幅を変更するものであることが好ましい。 この空隙を空気で 満たし、 この空隙を空気溜として、 その空気圧で流路の開閉を制御することが最 も簡便である。
流路は、 その全部を弾性材料で囲まれるようにしてもよいし、 その開閉手段側 のみを弾十生材料で作つてもよい。 上記の空隙の周りとこの流路の回りとを同じ材 料で作り、 その空隙の大きさの変化が直ちに流路の幅に影響するようにこれらを 配置することが好ましい。
. この弾性材料は、 いかなる弾性材料であってよく、 細胞培養に悪影響の無い合 成高分子を用いるのが簡便であり、 特に、 シリコーン系樹脂であることが好まし い。
また、 この細胞培養用マイクロチャンバ一の細胞培養領域と流路の開閉を光学 的に観察するため、 必要な部分のみ透明材料で作ることが好ましい。 全体を透明 弾性材料で作ってもよい。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明の基本構成の一例を示す模式図である。
第 2図は、 流路の開閉プロセスの一例を説明した模式図である。
第 3図は、 培養マイク口チャンパ一加工プロセスの一例を説明した顕微鏡写真 を示す。
第 4図は、 培養マイクロチャンバ一加工プロセスで用いた铸型と高分子培養マ イクロチャンバーの一例を説明した顕微鏡写真を示す。
第 5図は、 培養マイクロチヤンバーの流路の開閉状態の例を示す顕微鏡写真を 示す。
第 6図は、 培養マイクロチャンバ一の流路が開状態で細胞が流路を通過する場 合の顕微鏡写真を示す。 矢印は細胞を示す。
図中の符号の説明
1 0 1、 1 0 2 空気圧制御部との接続ジョイント
1 0 3、 1 0 4 空気の通路
1 0 5、 1 0 6、 2 0 2 空気溜 107 溶液 （細胞を含む培養液） の流れ
108、 109、 111、 201、 204 流路
1 10 細胞培養領域
1 12、 302、 304 ガラス基板
1 13, 303 高分子 （シリコーン系樹脂）
203 細胞
301 醒
305 空気圧調節部への接続コネクタ 発明の実施の形態
以下、 本発明の細胞培養用マイクロチャンバ一を詳細に説明するが、 本発明の 細胞培養用マイクロチャンバ一はこれらに限定されるものではない。
まず、本発明の細胞培養マイクロチヤンバーの基本構成の一例を第 1図に示す。 第 1図 aの （B— B) 水平断面図及ぴ、 第 1図 bの （A— A) 縦斬面図に例示す ように、 本発明の細胞培養マイクロチャンバ一 100は、 スライドガラス等の光 学的に透明な基板 112上に、 光学的に可視領域で透明かつ弾性の高分子中に形 成された細胞培養領域 110と、 その両端に位置する流路 108, 109、 1 1 1の開閉状況を膨張又は収縮によって調節する空気溜 105, 106と、 この空 気溜へ加圧又は減圧を行うための空気の通路 103， 104と、 空気圧制御部と の接続ジョイント 101、 102が配置されており、溶液 （細胞を含む培養液） は流れ 107の方向に連続的に流れることができる。
第 1図に示すように、 培養領域 1 10は、 2つの流路 108、 109の開放又 は閉鎖状況によって、 その中で培養している細胞を捕獲することも、 排出するこ とも可能である。ここで、流路の開閉は、空気溜の空気の圧力を制御することで、 流路を囲む高分子壁面を膨張又は収縮させ、 流路 1 11の幅を調節する。 このと き、 流路の幅を光学的計測手段によって計測できるよう、 流路を、 光学顕微鏡の 光軸とは垂直な、 水平面上に平面的に配置している。 これによつて、 たとえば光 学顕微鏡を用いることで、 流路の幅、 すなわち開放状況を実際に試料を流さなく ても観察するだけで確認することができる。 従って、 この開放状況を目視で確認 しながら、 空気溜 1 0 5、 1 0 6の空気圧を調整することが可能である。 また、 この開放状態を画像処理によって自動的に計測することによって、 あらかじめ予 定した開放状態にフィードパック制御することもできる。
次に、 第 2図を用いて、 流路の開閉について説明する。 第 2図 a、 bはそれぞ れ、 流路を適度に閉じて、 溶液だけは流路 2 0 1を通過するが、 細胞 2 0 3は通 過させない状態での、 水平断面と垂直断面図である。 空気溜 2 0 2に空気を導入 して加圧することで、 流路 2 0 4は閉じ、 その加圧の程度によって通過する細胞 のサイズを調節することができる。
他方、 第 2図 c、 dはそれぞれ、 流路を開放して、 溶液だけでなく細胞も流路 2 0 1を通過する状態での、 水平断面と垂直断面である。 空気溜 2 0 2から空気 を排出することで、 流路 2 0 4は開き、 その減圧の程度によって細胞をすベて通 過させることができる。
第 3図は、 実際に細胞培養マイクロチャンバ一を製作するプロセスの一例を示 すものである。 まず、 フォトリソグラフ技術等の微細加工技術によって錄型を形 成する （第 3図の 1 )。 たとえば、光硬ィ匕性肉厚レジスト材、 S U— 8を用いるこ とで、 ガラス基板 3 0 2上に光学的に S U— 8を硬化させた鎵型 3 0 1を作成す ることができる。 次に、 铸型の上に、 光学的に透明で、 かつ、 弾性高分子を流し 込に硬化させることで、 錶型の形状を高分子に転写することができる（第 3図の 2 )。 ここで、 たとえば光学的に可視領域で透明でかつ弾力性を持つ素材として は、 シリコーン樹脂 （ポリジメチルシロキサン等） がある。 高分子が硬化した後 に、 空気や溶液を流すための貫通穴を穿孔機を用いて作成し、 錶型から高分子を はがす（第 3図の 3 )。最後に、 この微細構造を転写した高分子をガラス基板 3 0 4上に接着させ、 空気圧調節部への接続コネクタや溶液の導入、 排出部を取り付 けることで細胞培養マイクロチャンバとして用いることができる。
第 4図は、 実際に第 3図のプロセスで作成した光硬ィ匕 '生樹脂 S U— 8を用いて 作成した細胞培養マイクロチャンバ一の錶型 （第 4図 a ) と、 この鑄型を転写し て作成した高分子微細構造（第 4図 b )の一例である。 この光学顕微鏡写真から、 錶型の微細構造を正確に高分子に転写することができることがわかる。
第 5図は、 この細胞培養マイクロチヤンバ中の流路の機能を示す一連の顕微鏡 写真である。 第 5図 aでは、 空気溜に空気を加圧することで、 流路を閉じ、 細胞 も溶液も流れないようにしたところである。 第 5図 bでは、 空気溜を陰圧で吸引 することで、 流路を細胞が流れない程度に開放したところである。 この顕微鏡写 真からもわかるように、 溶液の流れによって細胞は流路まで引き寄せられるが、 流路を通過することはできない。 また、 流路の開放量は光学顕微鏡によって目視 で確認することができる。 従って、 細胞を実際に流さなくても、 流路の開放値を 目視のみで調節することができる。 第 5図 cは、 更に流路を開放することで、 細 胞を流したところである。
第 6図には、 更に実際に細胞が流路を通過する過程が顕微鏡写真で示されてい る。 流路の左側にあった細胞 （矢印） は （第 6図の 1 )、 流路を通過して （第 6図 の 2 )、 流路の右側に通過する （第 6図の 3 )。 発明の効果
本発明の細胞培養用マイクロチヤンバ一は以下のような特徴を持つ： —細胞培養領域と外部とが流路によつてのみ連結されるため、 細胞が開閉装置な どに接することがなく、 細胞に余分な負荷がかからない。
一開閉手段が、 流路の開閉の観察方向とほぼ直角であるため、 観察が流路の開閉 に影響されることが無く、 また流路を通過又は通過しない細胞と、 流路の開閉状 態とを同時に観察することができる。
これらの特徴により、細胞の培養液から単一細胞を分離することが可能になる。 そのため、 従来不可能であった、 泳動する生物細胞等を容器内の細胞数を制御 しながら培養することが可能となる。 また、 容器の内部の細胞を選択的に回収す ることが可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 細胞培養領域、 該領域と外部とを連結する少なくとも 2つの流路、 該流路 の開閉手段、 並びに該細胞培養領域及ぴ流路の開閉を光学的に観察する手段から 成る細胞培養用マイクロチャンバ一であって、 一の流路が細胞培養領域に細胞を 含んでもよい培養液を注入することができる流路であり、 他の一の流路が細胞培 養領域から細胞を含んでもよい培養液を排出することができる流路であり、 該流 路の少なくとも一部が弾性材料により囲まれて成り、 該開閉手段が該流路を外部 力 ら前記観察手段の観察方向に対してほぼ直角方向に押す又は引くことにより該 流路を開閉又はその幅を変更するものであることを特徴とする細胞培養用マイク 口チャンパ一。
2 . 前記開閉手段を作動させていない時の、 前記流路の幅が対象となる細胞サ ィズと同程度である請求項 1に記載の細胞培養用マイクロチヤンバー。
3 . 前記開閉手段が前記流路に隣接する空隙を有し、 該空隙が気体又は液体で 満たされ、 その圧を変更することにより、 該空隙の大きさを変更し、 その結果、 該流路を開閉又はその幅を変更するものである請求項 1又は 2に記載の細胞培養 用マイクロチャンバ一。 ·
4 . 前記弾性材料がシリコーン系樹脂である請求項 1〜 3のいずれか一項に記 載の細胞培養用マイクロ；
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