WO2004086029A1 - クロマトグラフィー用分離剤及びその製造方法 - Google Patents

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WO2004086029A1
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polysaccharide
cross
regenerated
separating agent
molecule
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PCT/JP2004/004271
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Yoshio Okamoto
Chiyo Yamamoto
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Daicel Chemical Industries, Ltd.
Nagoya Industrial Science Research Institute
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Definitions

  • the present invention relates to a separation agent for chromatography and a method for producing the same.
  • the present invention relates to a separation agent for mouth chromatography, and is particularly suitable for use as a separation agent for high performance liquid chromatography (hereinafter abbreviated as “HPLC”) for separating optical isomers.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • chromatographic separation agents utilizing chirality possessed by polysaccharide derivatives and using the same have been widely known.
  • the polysaccharide derivative used for such a separation agent for mouth chromatography include, for example, an ester derivative of cellulose or amylose and a olebamate derivative.
  • These polysaccharide derivatives are used as chromatographic separation agents in a state of being supported on a carrier such as silica gel for the purpose of increasing the packing ratio of the column, facilitating gel handling, and increasing mechanical strength. It is used.
  • Such a chromatographic separating agent using a polysaccharide derivative supported on a carrier has a high ability to separate optical isomers, and is used not only for analysis but also for the production of various pharmaceuticals. It is also used for large-volume sorting of the body.
  • the polysaccharide derivative since the polysaccharide derivative is only supported on the carrier by physical adsorption, depending on the type of elution solvent, The polysaccharide derivative may dissolve in the elution solvent and become unusable.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 4-202141 discloses a method in which a polysaccharide derivative in which a butyl group is introduced into a hydroxyl group of a polysaccharide via an ester bond or a urethane bond and a carrier in which a bur group is chemically bonded. Describes a chromatographic separating agent in which a polysaccharide derivative is chemically bonded to a carrier by copolymerization.
  • the present inventors have disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. H11-117800 that styrene and dibielbenzene are copolymerized on silica gel supporting a cellulose derivative to form a three-dimensional network structure. It proposes to prevent the cellulose derivative from being eluted by the elution solvent.
  • the present inventors further disclose in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-148247 that a polymerizable unsaturated group is introduced into a polysaccharide derivative in advance, and a silane coupling agent is used.
  • a polymerizable unsaturated group is introduced into a polysaccharide derivative in advance, and a silane coupling agent is used.
  • silica gels with 2-methacryloyloxetyl groups introduced through the intermediary, and chemically bonded them by copolymerization to provide a chromatographic separation agent with a high immobilization rate to silica gel. .
  • the polysaccharide derivative can be almost completely prevented from being eluted by the elution solvent, and the optical isomer has excellent separation ability. Furthermore, its mechanical strength is also large.
  • the present invention has been made in view of the conventional circumstances described above, and has a small risk of elution by an elution solvent, a large amount capable of performing optical resolution at a time, and a mouth chromatography capable of withstanding a large pressure.
  • An object of the present invention is to provide a single-use separating agent and a method for producing the same.
  • the separating agent for chromatography of the present invention is a separating agent for chromatography using a polysaccharide derivative derived from a polysaccharide, wherein the polysaccharide derivative has a partial hydroxyl group among hydroxyl groups present in the polysaccharide. It is cross-linked via a cross-linking molecule, and is not cross-linked among the hydroxyl groups present in the polysaccharide! /, Characterized in that the hydroxyl group has a structure modified by a modifying molecule, and the polysaccharide derivative is not carried on a carrier.
  • the present invention provides a protecting group introducing step of introducing a protecting group into some of the hydroxyl groups present in the polysaccharide, and modifying the modifying molecule into a hydroxyl group remaining in the polysaccharide into which the protecting group has been introduced.
  • a method for producing a separating agent for chromatography comprising: a modifying step; an elimination step of eliminating an introduced protective group to regenerate a hydroxyl group; and a cross-linking step of cross-linking the regenerated hydroxyl groups with a cross-linking molecule. I will provide a.
  • the polysaccharide derivative is cross-linked by the cross-linking molecule, the three-dimensional network structure significantly improves the solvent resistance. For this reason, elution solvents such as chromate form, tetrahydrofuran, and ethyl acetate, which could not be used with conventional chromatographic separation agents using polysaccharide derivatives, can also be used.
  • this chromatographic separating agent does not use any carrier, and is composed of a polysaccharide derivative which directly contributes to the separation of optical isomers. For this reason, it is possible to increase the amount of the polysaccharide derivative that can be filled in the force ram, and to increase the amount that can be optically resolved at one time. Moreover, the mechanical strength of the polysaccharide derivative is greatly increased by crosslinking, so that even if it is used as a separating agent for HPLC, it can withstand the pressure sufficiently.
  • FIG. 1 shows that each column of Example 1 and Comparative Example 1 was packed with a separation agent for chromatographic chromatography, and 2,2,2-trifluoro-11 (91-anthryl) was injected once.
  • FIG. 7 is a diagram showing a chromatogram when optical resolution was performed by changing the amount of racemic ethanol (9).
  • FIG. 2 is a secondary electron image (photograph) of the chromatographic separation agent of Example 1 by scanning electron microscope.
  • FIG. 3 is a secondary electron image (photograph) of the separating agent for chromatography of Example 1 by a scanning electron microscope.
  • FIG. 4 is a secondary electron image (photograph) of the separating agent for chromatography in Example 3 by a scanning electron microscope.
  • FIG. 5 is a secondary electron image (photograph) of the separating agent for chromatography in Example 3 by a scanning electron microscope.
  • FIG. 6 is a secondary electron image (photograph) of the chromatographic separation agent of Comparative Example 1 by a scanning electron microscope.
  • FIG. 7 is a secondary electron image (photograph) of the separating agent for chromatography of Comparative Example 1 by a scanning electron microscope.
  • FIG. 8 is a secondary electron image (photograph) of the bead A after crosslinking in Example 4 by a scanning electron microscope.
  • FIG. 9 is a secondary electron image (photograph) of the bead B after crosslinking in Example 4 by a scanning electron microscope.
  • FIG. 10 shows the results of using the column A of Example 4 and the column packed with the chromatographic separation agent of Comparative Example 1 for the injection of 2,2,2-trifluoro-1- (9-1) It is a figure which shows the chromatograph at the time of changing the amount of the racemate of (anthryl) ethanol (9), and performing optical resolution.
  • FIG. 11 is a secondary electron image (photograph) of the separating agent for chromatography of Example 5 using polystyrene as a porogen, obtained by a scanning electron microscope.
  • FIG. 12 is a secondary electron image (photograph) of the chromatographic separating agent of Example 6 using polymethyl methacrylate as a porogen by a scanning electron microscope.
  • FIG. 13 is a secondary electron image (photograph) of a separating agent for chromatography using a scanning electron microscope of Example 7 using poly-isopropylacrylamide as a porogen.
  • the separating agent for chromatography of the present invention is not limited to those for HPLC, but may be used for other liquid chromatography such as supercritical fluid chromatography, column chromatography, thin-layer chromatography, gas chromatography, and capillary chromatography. It can also be used for photography.
  • any of natural polysaccharides, synthetic polysaccharides and natural product-modified polysaccharides can be used as long as they have chirality.
  • those having a regular bonding mode are preferable because they can further enhance the ability to separate optical isomers.
  • Cellulose is a typical example of such a polysaccharide.
  • xylan, chitosan, chitin, mannan, inulin, curdlan, starch, dextran, amylopectin, busulan, glucan, galactan There are levan, bullran, agarose, alginic acid and the like, and starch containing amylose can also be used.
  • starch containing amylose can also be used.
  • cellulose, amylose, xylan, chitosan, chitin, mannan, inulin, curdlan, etc. which can be easily obtained as a high-purity polysaccharide, are preferred, and cellulose and amylose are particularly advantageously used. It becomes.
  • the number-average degree of polymerization of these polysaccharides is 5 or more, preferably 10 or more, from the viewpoint of easy handling. Generally, it is desirable to be less than 3,000.
  • the cross-linking by the cross-linking molecule is preferably performed between the hydroxyl groups at the 6-position of the pyranose ring or the furanose ring. According to the test results of the inventors, it has been found that these 6-hydroxyl moieties do not significantly affect the resolution of the optical isomers. The separation ability of the optical isomer does not decrease. In addition, since the hydroxyl group at the 6-position is rich in activity, a crosslinking reaction by a crosslinking molecule can be easily performed.
  • the separating agent for mouth chromatography is characterized in that some of the hydroxyl groups present in the polysaccharide are cross-linked via a cross-linking agent. Any compound that can crosslink hydroxyl groups can be used.
  • crosslinking agent examples include molecules having a plurality of isocyanate groups in one molecule such as 4,4′-diphenylmethane diisocyanate, tolylene diisocyanate, and hexamethylene diisocyanate.
  • dicarboxylic acids and their halides, amides, estenoles and the like can be used.
  • hydroxyl groups present in the polysaccharide may be substituted with unsaturated acid haptic compounds such as atariloyl chloride, methacryloyl chloride, and benzylbenzoyl chloride, and unsaturated isocyanates such as vinylphenyl isocyanate.
  • unsaturated acid haptic compounds such as atariloyl chloride, methacryloyl chloride, and benzylbenzoyl chloride
  • unsaturated isocyanates such as vinylphenyl isocyanate.
  • unsaturated hydrocarbon monomers such as styrene, dibibenzenebenzene, isoprene, and (meth) acrylic acid derivatives.
  • the modifying molecule for modifying the non-crosslinked hydroxyl group among the hydroxyl groups present in the polysaccharide is not particularly limited, and isocyanic acid derivative, carboxylic acid, ester, acid halide, acid amide, halide, epoxy Any compound that can modify a hydroxyl group, such as a compound, aldehyde, or alcohol, may be used. Among these compounds, compounds having one isocyanate group per molecule such as ferroisocyanate are preferred.
  • the modification of the hydroxyl group can be performed with a simple reaction operation in a high yield.
  • the separating agent for mouth chromatography according to the present invention is preferably in the form of beads. In this case, the packing ratio at the time of packing into the column can be increased, and the ability to separate optical isomers can be enhanced.
  • the “bead shape” is a substantially spherical or spherical shape.
  • the longest diameter and the shortest diameter of about 20 particles of a chromatographic separation agent are measured, the longest diameter is obtained.
  • the average value of the ratio of the shortest diameter to the shortest diameter is 1.0 to 5.0, preferably 1.0 to 2.0, and more preferably 1.0 to 1.3.
  • the separating agent for chromatography of the present invention may have a particle size of 1 to; L 0 ⁇ from the viewpoint of increasing the packing ratio when packed into a column and increasing the separation ability of optical isomers. It is more preferably 1 to 5 ⁇ , and still more preferably 3 to 20 ⁇ .
  • the particle size of the separation agent for chromatography can be adjusted by, for example, classification.
  • the separating agent for chromatography of the present invention preferably has pores from the viewpoint of increasing the surface area of the separating agent for chromatography and enhancing the ability to separate optical isomers.
  • the particle shape and particle size of the chromatographic separating agent can be determined, for example, from an image of the chromatographic separating agent taken by a scanning electron microscope (SEM).
  • SEM scanning electron microscope
  • the separating agent for mouth chromatography can be produced as follows. That is, in the first method for producing a chromatographic separating agent of the present invention, a protecting group introduction step of introducing a protecting group into some of the hydroxyl groups present in the polysaccharide, and the protecting group is introduced. A modifying step of modifying a modifying molecule to a hydroxyl group remaining in a polysaccharide; an elimination step of eliminating an introduced protecting group to regenerate a hydroxyl group; and a crosslinking step of crosslinking the regenerated hydroxyl groups with a crosslinking molecule. And a process. By introducing a protecting group in the protecting group introducing step in this way, it becomes possible to reliably bind the modifying molecule and the cross-linking molecule to a predetermined hydroxyl group.
  • the protecting group introduced in the protecting group introducing step is not particularly limited as long as it is a group which can be more easily eliminated from the hydroxyl group than the modifying molecule which modifies the hydroxyl group in the modifying step.
  • Compounds for introducing such protecting groups into hydroxyl groups include, for example, repairs. Decorating molecules can be used.
  • the compound for introducing a protecting group can be determined based on, for example, the reactivity of a hydroxyl group to be protected or modified or the reactivity of the compound with a hydroxyl group.
  • the introduction of a protecting group into a hydroxyl group, the modification of a hydroxyl group by a modifying molecule, and the crosslinking of hydroxyl groups by a crosslinking molecule can be carried out by a known appropriate reaction depending on the type of the compound to be reacted with the hydroxyl group.
  • the elimination of the protective group from the hydroxyl group in the elimination step is not particularly limited, and can be performed by a known method such as hydrolysis with an acid or an alkali.
  • all of the regenerated hydroxyl groups can be bridged by cross-linking molecules, but can be partially cross-linked.
  • the remaining hydroxyl groups are preferably modified by the same operation as in the modification step.
  • a step of dissolving the regenerated polysaccharide derivative in which the hydroxyl group has been regenerated in the elimination step in a solvent a step of dispersing porogen in the obtained regenerated polysaccharide derivative solution, Dispersing the regenerated polysaccharide derivative solution in a desired shape while removing the solvent to form a regenerated polysaccharide derivative having a desired shape; and forming the regenerated polysaccharide derivative into a porogen.
  • the porogen is a solid compound that can be dispersed in the regenerated polysaccharide derivative solution, and can be dissolved separately from the polysaccharide derivative.
  • various organic compounds and inorganic compounds can be used, and the dispersibility in the regenerated polysaccharide derivative solution and the droplets of the regenerated polysaccharide derivative solution during bead formation described later are used. It is preferable to use an organic compound from the viewpoint of the stability and the like.
  • Various polymers such as polystyrene can be used for such an organic conjugate.
  • the solvent used for the regenerated polysaccharide derivative solution may be any solvent that can dissolve the regenerated polysaccharide derivative having the hydroxyl group regenerated in the elimination step.
  • the regenerated polysaccharide derivative solution is stored in a container having a desired shape, for example, or is maintained in a desired shape by various methods such as forming droplets as in the formation of beads described later. Can be. Further, the regenerated polysaccharide derivative solution in which porogen is dispersed may be accommodated in a column tube.
  • the removal of the solvent from the regenerated polysaccharide derivative solution can be performed by heating, decompression, or both.
  • the washing solvent for dissolving the porogen from the regenerated polysaccharide derivative formed in a desired shape may be any solvent that dissolves the porogen, but a solvent that dissolves only the porogen without dissolving the polysaccharide derivative is preferable, Solvents with higher porogen solubility than polysaccharide derivatives are more preferred, and even more preferred are solvents that dissolve only porogen.
  • Such a washing solvent can be selected from known solvents according to the kind of the polysaccharide derivative and the porogen, the solubility of the solvent in these, and the like.
  • the regenerated polysaccharide derivative in which the hydroxyl group has been regenerated in the modification step is dissolved in a solvent to form a regenerated polysaccharide derivative solution, and the regenerated polysaccharide derivative solution is dropped into a surfactant solution, followed by stirring.
  • a bead-shaped regenerated polysaccharide derivative, and a bead cross-linking step in which a cross-linked molecule is cross-linked to the bead-shaped regenerated polysaccharide derivative to obtain a bead-shaped separating agent for chromatography. Is preferred. According to the test results of the inventors, a bead-shaped separating agent for chromatography can be easily produced by such a method.
  • the solvent used for the regenerated polysaccharide derivative solution in the bead forming step is a solvent that can dissolve the regenerated polysaccharide derivative in which the hydroxyl group has been regenerated in the desorption step.
  • the regenerated polysaccharide derivative solution can be obtained by further using a cosolvent that is insoluble or hardly soluble in the surfactant solution. . Even if the co-solvent is contained, the regenerated polysaccharide derivative solution is dropped into the surfactant solution to form droplets of the regenerated polysaccharide derivative solution in the surfactant solution. Further, a bead-shaped polysaccharide derivative can be formed by distilling off the solvent (and Z or cosolvent) from the regenerated polysaccharide derivative solution.
  • the surfactant is not particularly limited as long as it is a compound capable of stably causing droplets of the regenerated polysaccharide derivative solution formed in the solution of the surfactant to exist.
  • a surfactant for example, an anionic surfactant can be used. You.
  • the bead crosslinking step can be performed in the same manner as the crosslinking step.
  • the separating agent for mouth chromatography according to the present invention can also be produced as follows. That is, the second method for producing a separation agent for chromatography of the present invention comprises a crosslinking step of crosslinking some of the hydroxyl groups present in the polysaccharide with each other by a crosslinking molecule, And modifying the hydroxyl group remaining in the crosslinked polysaccharide with a modifying molecule.
  • a bead-shaped polysaccharide is commercially available, and a bead-shaped separating agent for mouth chromatography can be supplied at a low cost and in a large amount using the commercially available bead-shaped polysaccharide.
  • a compound having a plurality of cross-linking sites bonded to a hydroxyl group of a polysaccharide or a polysaccharide derivative, such as a compound having a plurality of isocyanate groups in one molecule is cross-linked.
  • the method may further include a step of modifying the free cross-linking site in the cross-linked polysaccharide or polysaccharide derivative. According to such a process, it is possible to suppress the interaction between the free crosslinking site and the optical isomer during the optical resolution.
  • the modification of the cross-linking site varies depending on the optical isomer to be subjected to optical resolution which is considered to exhibit an interaction with the cross-linking site, but it is usually preferable to use a low-polarity substituent, From the viewpoint of increasing the steric hindrance to the crosslinking site, it is preferable to use a bulky substituent.
  • a substituent include a hydrocarbon group having a branched structure such as a t-butyl group and a trityl group.
  • the modification of the cross-linking site with such a substituent can be carried out by a known appropriate reaction such as a condensation reaction in the same manner as in the protective group introduction step and the modification step described above.
  • pologen is dispersed in the regenerated polysaccharide derivative solution, and the regenerated polysaccharide derivative solution containing porogen is dropped into the surfactant solution,
  • the porogen-containing beads are washed with the washing solvent, and the lipogen of the lipogen-containing beads is dissolved. It is also possible to produce chromatographic separating agents.
  • the porogen When borogen is used, the porogen may be dissolved before or after the crosslinking step in the case of producing the desired shape of the separating agent for chromatography. In this case, it may be before or after the bead crosslinking step.
  • the chromatographic separating agent of Example 1 was in the form of beads using cellulose as a raw material polysaccharide, and was produced as follows. Protecting group introduction process>
  • the beads were collected by suction filtration, washed with warm methanol while sucking, and the generated urea was removed. After confirming the absence of urea by IR, vacuum drying was performed to obtain 0.88 g of the beads of Example 1 in which the hydroxyl group at position 6 had been crosslinked by 30%.
  • the chromatographic separating agent of Example 2 has an amount of 4,4,-that allows 15% of the hydroxyl groups to be crosslinked with the beads composed of OD (6-OH) -63 obtained by the same process as in Example 1.
  • the cross-linking reaction was carried out with diphenylmethane diisocyanate. Other operations are the same as those in the method for producing beads of Example 1.
  • the chromatographic separation agent of Example 3 was in the form of beads as a polysaccharide as a raw material. It was produced as follows using cellulose of the formula (1).
  • the beads were washed with warm methanol while performing suction filtration, and the beads were collected. The beads were vacuum-dried to obtain 1.5 g of the beads of Example 3 in which the hydroxyl group at position 6 was crosslinked by 30%.
  • the chromatographic separating agent of Comparative Example 1 was prepared by supporting a 3,5-dimethylphenyl carbamate derivative of cellulose on silica gel, and was produced as follows. That is, after drying porous silica gel (particle size 7 xm, pore size lOO nm), it was reacted with 3-aminopropyltriethoxysilane in benzene in the presence of a catalytic amount of pyridine at 80 ° C, and then methanol was added. It was washed with acetone and hexane and further dried.
  • Example 1 a column with a packing pressure of 100 kg / cm 2 (9.8 MPa) was also manufactured.
  • the chromatographic separating agent of Comparative Example 1 was packed by the same operation using the same column. However, the filling pressure was set to 400 kg / cm 2 for the first few minutes, and then to 100 kgZcm 2 .
  • the chromatographic separation agent of Comparative Example 1 was prepared by using a slurry method on a stainless steel-steel column with a length of 25 cm, an inner diameter of 0.46 cm, and a length of 25 cm, an inner diameter of 0.2 cm. And filled.
  • the eluent is hexane / 2-prono.
  • the flow rate was 0.2 m1 / min in Examples 1 to 3, and 0.5 m1 / min in Comparative Example 1 for a 0.46 cm ID column.
  • the flow rate was 0.1 m 1 / min.
  • Detection was performed using a UV detector and an optical rotation detector in combination.
  • the theoretical plate number N is calculated from the peak of benzene, and is the time t required for the eluent to pass through the column.
  • the SEM observation of the beads before and after filling showed no deformation of the beads due to the pressure applied during filling. Table 2 shows the results.
  • Table 3 shows the measurement results of the theoretical plate number. table.
  • OD OD
  • a cellulose 3,5_midimethinolefeninolecanolebame which had a hydroxyl group at the 6-position, was synthesized to crosslink using diisocyanate later.
  • the hydroxyl group at the 6-position of the glucose ring was not completely tritylated. Therefore, the derivative was again charged with 15 g of lithium chloride and 15 Om 1 of dehydrated N, N, 1-dimethylacetoamide, and a nitrogen atmosphere was added. After swelling at 80 ° C. for 24 hours, 17 g (62 mmo 1) of trifenylmethyl chloride and 150 ml of pyridine were added thereto, and reacted at 80 ° C. for 24 hours. The pyridine-soluble part was dropped into methanol, and the insoluble part was recovered. After that, vacuum drying was carried out to obtain a cellulose derivative in which the hydroxyl group at the 6-position of the glucose ring was tritylated.
  • the derivative was deprotected by stirring in 1,500 ml of 1% HC 1 Z methanol for 24 hours to return the 6-position to a hydroxyl group. After washing with methanol, vacuum drying was performed to obtain 24 g of the target cellulose 2,3-bis (3,5-dimethylphenylcarbamate).
  • OD (6-OH) -125 0.25 g was dissolved in 3 Om 1 of a mixed solvent of tetrahydrofuran Z heptanol (2/1, v / v).
  • the temperature of the water bath containing the vessel containing 500 ml of the 0.2% aqueous sodium lauryl sulfate solution was raised to 75 ° C, and 500 m of the 0.2% aqueous sodium lauryl sulfate solution was dispersed with a disperser at a shaft rotation speed of 1100 rpm. While stirring, the solution of OD (6-OH) -25 was dropped into the aqueous solution.
  • the temperature of the water bath was maintained at 75 ° C, tetrahydrofuran was distilled off, and the generated beads were collected by suction filtration and washed with water and ethanol. After washing, vacuum drying was performed to obtain OD (6-OH) -125 beads. At this time, the bead yield was about 87%.
  • the beads with a particle size of about 3 to 10 ⁇ m were collected by fractionation using a second filter.
  • the shaft of the disperser was a 6-blade type, and the container was a 1-liter beaker.
  • the obtained beads were observed with a scanning electron microscope (SEM).
  • beads were measured by solid IR to confirm that no urea was present, and then dried under vacuum to obtain 1.83 g of beads in which the hydroxyl group at position 6 was crosslinked by 25% (hereinafter referred to as beads A).
  • beads A Preparation of cross-linked beads (for column B)
  • beads B The supernatant was measured by liquid IR to confirm that the isocyanate was no longer present. Wash with warm methanol with suction. The beads were measured by solid-state IR to confirm that no urea was present, and dried under vacuum to obtain 1.0 g of beads in which the hydroxyl group at position 6 was cross-linked by 25% (hereinafter referred to as beads B).
  • the preparation of beads B involves modifying one of the two isocyanates of 4,4, diphenylmethanediisocyanate that has reacted with only one derivative with a bulky alcohol. Was treated with tert-butanol. As a result, the interaction force involved in the optical resolution of the bead B and the racemic body is expected to work more effectively without being hindered by the extra interaction.
  • OP (6—OH) Observation of 25 beads
  • beads A and B were dispersed in 30 ml of hexane / liquid paraffin (2/1), and hexane / 2-propanol (9/1) was used as an eluent.
  • a pressure of 3 to 30 kg / cm 2 was applied by a pump for HP LC, and a stainless steel-steel column having a length of 25 cm and an inner diameter of 0.2 cm was packed by a slurry method. Columns A and B, respectively. Observation of beads filled in force ram
  • Table 4 shows the mass, surface area, number of theoretical plates (N), and packing time of the beads contained in each column. In addition. When the beads before and after filling were observed by SEM, no deformation of the beads due to pressure during filling was observed. Table 4
  • Table 5 shows the results of optical resolution of the racemate shown above using columns A and B. For comparison, the results of optical resolution using a filler (Comparative Example 1) carrying a 3,5-dimethylphenylcarbamate derivative on silica gel are also shown.
  • the values in the table are the capacity ratio k 1 'and the separation coefficient ⁇ , and the sign in the table is the optical activity of the previously eluted enantiomer.
  • the force ram filled with beads has the same size as a conventional sily gel-supported column. In comparison, more polysaccharide derivatives are present in the column, and it is expected that the amount of the racemate that can be separated at a time is larger than that of the silica gel-supported column. Therefore, using a force ram A and a silica gel-supported force ram, the racemic body 2, which can be separated at a time,
  • optical resolution was performed using a 120 mg / ml solution prepared by dissolving this racemate in a solvent having the same composition as the eluent.
  • Hexane / 2-propanol (9/1) was used as the eluent, and the flow rate of the eluent was silica gel-supported.
  • the volume was 0.20 ml Zmin, and in the column A, it was 0.15 ml / min.
  • the amount of the racemate when the peaks of the two enantiomers overlap in the obtained chart was defined as the maximum amount that the force ram could split. .
  • a polymer was added as a porogen to a mixed solution of the cellulose derivative in THFZ1-heptanol, and the polymer was added dropwise to an aqueous solution of sodium lauryl sulfate while stirring, and THF was distilled off by heating.
  • the obtained beads were washed with a solvent that dissolves the polymer used for the porogen, and the porogen was washed away. As a result, pores were found in the beads. The number and size of vacancies varied depending on the type and concentration of porogen used.
  • the temperature of the water bath was maintained at 75 ° C, tetrahydrofuran was distilled off, and the generated beads were collected by suction filtration, and washed with a solvent that dissolves only water, ethanol, and porogen. After the washing, vacuum drying was carried out to obtain cell mouth source derivative beads having pores having a particle size of about 312 / m.
  • the shaft of the disperser was a 6-blade type, and the container was a 200 milliliter beaker.
  • Porogens include polystyrene (PSt, molecular weight: 17,000, Mw / Mn: 1.03), polymethyl methacrylate (PMMA, molecular weight: 42,000, Mw / Mn: 1.40), poly-N- Isopropyl acryloreamide (PNI PAM, molecular weight: 28,000, Mw / Mn: 1.85) was used.
  • the obtained beads were observed by a scanning electron microscope (SEM).
  • SEM scanning electron microscope
  • the chromatographic separating agent of the present invention has significantly improved solvent resistance and mechanical strength because the polysaccharide derivative is cross-linked by cross-linking molecules, and can be used for conventional chromatographic separation agents. It is possible to use a solvent that has a stronger solution output than the agent, and it can be used for + minutes even under high pressure conditions such as HP LC.
  • the separation agent for chromatography of the present invention does not use a carrier, the amount of the polysaccharide derivative that can be packed in the column can be increased, and the amount that can be optically resolved at one time can be increased.
  • the production 14 in the industrial production of optical isomers can be further enhanced.

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Abstract

前記多糖類に存在する水酸基の内の一部の水酸基同士が架橋分子を介して架橋されており、該多糖類に存在する該水酸基の内の架橋されていない水酸基は修飾分子によって修飾された構造とされている多糖類誘導体を、担体に担持せずに、例えばビーズ形状に成形し、クロマトグラフィー用分離剤とする。本発明によれば、溶出溶媒による溶出のおそれが少なく、一度に光学分割を行うことができる量が大きく、大きな圧力に耐えることが可能なクロマトグラフィー用分離剤を提供することができる。

Description

クロマトグラフィ一用分離剤及びその製造方法 技術分野
本発明はク口マトグラフィ一用分離剤に関し、 特に光学異性体を分離するため の高速液体クロマトグラフィー （以下 「H P L C」 と略す） 用の分離剤に用いて 好適である。 背景技術
従来より、 多糖類誘導体が有しているキラリティーを利用し、 これを用いたク ロマトグラフィー用分離剤が広く知られている。 こうしたク口マトグラフィー用 分離剤に使用される多糖類誘導体としては、 例えばセルロースやアミロースのェ ステル誘導体や力ルバメート誘導体等がある。 これらの多糖類誘導体は、 カラム への充填率を高めノ、ンドリングを容易にし、機械的強度を高める等の目的から、 シリ力ゲル等の担体に担持させた状態で、 クロマトグラフィー用分離剤として使 用されている。
こうした、 多糖類誘導体を担体に担持させて用いたクロマトグラフィー用分離 剤は、 高い光学異性体の分離能を有しており、 分析用に用いられるのみならず、 各種医薬品の製造等、 光学異性体の大量分取用としても用いられている。
しかし、 上記従来の多糖類誘導体を用いたク口マトグラフィ一用分離剤は、 多 糖類誘導体が担体に対して物理的な吸着によって担持されているだけであるため、 溶出溶媒の種類によつては多糖類誘導体がその溶出溶媒に溶解し、 使用不能とな ることもある。
特に、 光学異性体の大量分取のためには、 分離前の原料を高濃度に溶出溶媒に 溶解させる必要があり、 そうしたことが可能な溶出溶媒は、 一般に多糖類誘導体 の溶解度も大きいため、 問題となっていた。
また、 多糖類誘導体の機械的強度も小さいため、 特に H P L C用として用いた 場合には、 その圧力に耐えられないことも問題となっていた。 これらの不具合を防止するため、 多糖類誘導体を担体の表面に化学結合させ、 溶出溶媒による多糖類誘導体の溶出を防ぐとともに、 その機械的強度を高めるこ とも試みられている。
例えば特開平 4— 2 0 2 1 4 1号公報には、 多糖類の水酸基にエステル結合や ゥレタン結合を介してビュル基を導入した多糖類誘導体とビュル基を化学結合さ せた担体との間で共重合を行い、 多糖類誘導体を担体に化学結合させたクロマト グラフィ一用分離剤が記載されている。
また、 本発明者らにあっても、 先に特公平 7— 3 0 1 2 2号公報において、 ィ ソシァネート化合物を介して多糖類誘導体をシリ力ゲルに化学結合させ、 溶出溶 媒による多糖類誘導体の溶出を防止するクロマトグラフィ一用分離剤を提案して いる。
さらに、 本発明者らは、 特開平 1 1一 1 7 1 8 0 0号公報において、 セルロー ス誘導体を担持したシリカゲル上でスチレン及びジビエルベンゼンを共重合させ て 3次元網目構造とすることにより、 溶出溶媒によるセルロース誘導体の溶出を 防止することを提案している。
し力 し、 上記公報に記載のクロマトグラフィー用分離剤によっても、 担体に固 定化された多糖類誘導体の溶出溶媒による溶出を完全に防止することはできなか つた。
この点、 本発明者らは、 さらに特開 2 0 0 2—1 4 8 2 4 7号公報において、 あらかじめ多糖類誘導体に重合†生の不飽和基を導入しておくとともに、 シランカ ップリング剤を介して 2—メタクリロイロキシェチル基が導入されたシリカゲル を用意し、 これらを共重合によって化学結合させることにより、 シリカゲルに対 して固定化率の高いクロマトグラフィー用分離剤を提案している。
このクロマトグラフィー用分離剤によれば、 多糖類誘導体の溶出溶媒による溶 出をほぼ完全に防止することが可能であるとともに、 その光学異性体の分離能も 優れたものとなる。 さらに、 その機械的強度も大きなものとなる。
し力 し、 上記公報に記載のクロマトグラフィー用分離剤では、 光学異性体の分 離に寄与するために必要なキラリティーを有するのは多糖類誘導体のみであり、 キラリティーを有さないシリカゲル等の担体は、 光学異性体の分離に直接的に寄 与するものではない。 このため、 クロマトグラフィー用分離剤をカラムに充填し た場合において一度に光学分割できる量は、 シリカゲル等の担体が占めている分 だけ少なくなつてしまう。 発明の開示
本発明は、 上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、 溶出溶媒による溶出 のおそれが少なく、 一度に光学分割を行うことができる量が大きく、大きな圧力 に耐えることが可能なク口マトグラフィ一用分離剤及びその製造方法を提供する ことを解決すべき課題としている。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、 多糖類から誘導された多糖類誘導体 を用いるクロマトグラフィー用分離剤において、 前記多糖類誘導体は、 前記多糖 類に存在する水酸基の内の一部の水酸基同士が架橋分子を介して架橋されており、 該多糖類に存在する該水酸基の内の架橋されていな！/、水酸基は修飾分子によって 修飾された構造とされており、 該多糖類誘導体は担体に担持されていないことを 特徴とする。
また本発明は、 多糖類に存在する水酸基の内の一部の水酸基に保護基を導入す る保護基導入工程と、 該保護基が導入された多糖類に残存する水酸基に修飾分子 を修飾する修飾工程と、 導入された保護基を脱離させて水酸基を再生させる脱離 工程と、 再生された該水酸基同士を架橋分子によつて架橋する架橋工程とを含む クロマトグラフィ一用分離剤の製造方法を提供する。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤では、 多糖類誘導体が架橋分子によって 架橋されているため、 その 3次元網目構造によって耐溶媒性が格段に向上する。 このため、 従来の多糖類誘導体を用いたク口マトグラフィ一用分離剤では使用す ることができなかったクロ口ホルム、 テトラヒドロフラン、 酢酸ェチル等の溶出 溶媒も使用可能となる。
また、 このクロマトグラフィー用分離剤では、 担体を全く使用しておらず、 光 学異性体の分離に直接的に寄与する多糖類誘導体から成り立っている。このため、 力ラム中に充填できる多糖類誘導体の量を多くすることが可能となり、 一度に光 学分割できる量も多くなる。 しかも、 多糖類誘導体は架橋により、 その機械的強度も飛躍的に大きくされて いるため、 H P L C用分離剤として使用したとしても、 その圧力に十分耐えるこ とができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1及び比較例 1のそれぞれのク口マトグラフィ一用分離剤を充 填したカラムを用い、 一回当たりの注入される 2， 2， 2—トリフルオロー 1一 ( 9一アンスリル） エタノール ( 9 ) のラセミ体の量を変えて光学分割を行つた ときのクロマトグラフを示す図である。
図 2は、 実施例 1のクロマトグラフィ一用分離剤の走查型電子顕微鏡による二 次電子像 （写真） である。
図 3は、 実施例 1のクロマトグラフィ一用分離剤の走査型電子顕微鏡による二 次電子像 （写真） である。
図 4は、 実施例 3のクロマトグラフィ一用分離剤の走査型電子顕微鏡による二 次電子像 （写真） である。
図 5は、 実施例 3のクロマトグラフィ一用分離剤の走査型電子顕微鏡による二 次電子像 （写真） である。
図 6は、 比較例 1のクロマトグラフィ一用分離剤の走査型電子顕微鏡による二 次電子像 （写真） である。
図 7は、 比較例 1のクロマトグラフィ一用分離剤の走査型電子顕微鏡による二 次電子像 （写真） である。
図 8は、 実施例 4における架橋後のビーズ Aの走査型電子顕微鏡による二次電 子像 （写真） である。
図 9は、 実施例 4における架橋後のビーズ Bの走査型電子顕微鏡による二次電 子像 （写真） である。
図 1 0は、 実施例 4のカラム Aと比較例 1のクロマトグラフィ一用分離剤を充 填したカラムとを用い、 一回当たりの注入される 2， 2， 2—トリフルオロー 1 - ( 9一アンスリル） エタノール ( 9 ) のラセミ体の量を変えて光学分割を行つ たときのクロマトグラフを示す図である。 図 1 1は、 ポロジェンにポリスチレンを用いた実施例 5のクロマトグラフィー 用分離剤の走査型電子顕微鏡による二次電子像 （写真） である。
図 1 2は、 ポロジェンにポリメチルメタクリレートを用いた実施例 6のクロマ トグラフィー用分離剤の走査型電子顕 ί数鏡による二次電子像 （写真） である。 図 1 3は、 ポロジェンにポリ一 Ν—イソプロピルアクリルアミドを用いた実施 例 7のクロマトグラフィ一用分離剤の走査型電子顕微鏡による二次電子像 (写真） で、ある。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について説明する。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、 H P L C用に限られるものではなく、 超臨界流体クロマトグラフィー、 カラムクロマトグラフィー、 薄層クロマトダラ フィ一、 ガスクロマトグラフィー、 キヤピラリークロマトグラフィー等、 他のク 口マトグラフィー用としても用いることができる。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤の原料となる多糖類としては、 天然多糖 類、 合成多糖類及び天然物変性多糖類のいずれも問わず、 キラリティーを有する ものであれば用いることができる。 そのなかでも結合様式が規則正しいものは、 より光学異性体の分離能力を高めることが可能となり、 好適である。
このような多糖類の代表としてセルロースが挙げられるが、 その他に、 アミ口 ース、 キシラン、 キトサン、 キチン、 マンナン、 ィヌリン、 カードラン、 デンプ ン、 デキストラン、 アミロぺクチン、 ブスッラン、 グルカン、 ガラクタン、 レバ ン、 ブルラン、 ァガロース、 アルギン酸等があり、 また、 アミロースを含有する デンプンも用いることが可能である。 それらの中でも、 高純度の多糖類として容 易に入手することのできるセルロース、 アミロース、 キシラン、 キトサン、 キチ ン、 マンナン、 ィヌリン、 カードラン等が好ましく、 特にセルロース、 アミロー スが有利に用いられることとなる。
また、 これらの多糖類の数平均重合度 （1分子中に含まれるビラノース環ある いはフラノース環の平均数) は、 5以上、 好ましくは 1 0以上であり、 取り扱い の容易さ等の点から、 一般に 3， 0 0 0以下であることが望ましい。 架橋分子による架橋はピラノース環又はフラノース環の 6位の水酸基同士で行 われていることが好ましい。 発明者らの試験結果によれば、 これらの 6位の水酸 基部分は、 光学異性体の分離能にそれほど影響を与えないことが分かっており、 この部位を利用して架橋しても、 光学異性体の分離能力が低下することはない。 また、 6位の水酸基は活性に富むため、 架橋分子による架橋反応を容易に行うこ とができる。
ところで、 本発明のク口マトグラフィ一用分離剤は、 上記のような多糖類に存 在する水酸基の内の一部の水酸基同士が架橋剤を介して架橋されているのである 力 架橋剤としては水酸基同士を架橋することが可能ならば、 いかなる化合物を も使用することができる。
このような架橋剤としては、 例えば、 4 , 4 ' -ジフェニルメタンジィソシァ ネート、 トリレンジイソシァネート、 へキサメチレンジイソシァネート等の 1分 子に複数のィソシアナ一ト基を有する分子の他、 ジカルボン酸やそのハライド、 アミド、 エステノレ等を用いることができる。
また、 多糖類に存在する水酸基の内の一部の水酸基に塩化アタリロイル、 塩化 メタクリロイル、 塩化ビュルべンゾィル等の不飽和酸ハ口ゲン化物や、 ビニルフ ェニルイソシアナ一ト等の不飽和ィソシアナ一ト類によって重合可能な不飽和基 を導入しておき、 さらに、 スチレン、 ジビエルベンゼン、 イソプレン等の不飽和 炭化水素モノマーや、 （メタ） アクリル酸誘導体類等と共重合させることによつ て架橋させることもできる （特開 2 0 0 2— 1 4 8 2 4 7号公報参照） 。
以上のような架橋剤の中でも、 1分子に複数のィソシアナ一ト基を有する化合 物は容易に架橋反応が進行するとともに、 反応段数も少なく、 好適である。 また、 多糖類に存在する水酸基の内の架橋されていない水酸基を修飾するため の修飾分子としては特に限定はなく、 イソシアン酸誘導体、 カルボン酸、 エステ ル、 酸ハライド、 酸アミド、 ハロゲン化物、 エポキシ化合物、 アルデヒド、 アル コール等、 水酸基を修飾できる化合物であればよい。 それらの化合物の中でも、 フエ-ルイソシアナ一ト等の 1分子に 1つのイソシアナ一ト基を有する化合物が 好ましい。 こうであれば、 水酸基の修飾を簡単な反応操作で、 収率よく行うこと ができる。 本発明のク口マトグラフィ一用分離剤は、 ビーズ形状とされていることが好ま しい。 こうであれば、 カラムに充填したときの充填率を高めることができ、 ひい ては、 光学異性体の分離能力を高いものとすることができる。
本幾明において 「ビーズ形状」 とは、 ほぼ球状又は球状の形状であり、 例えば 2 0個程度のク口マトグラフィー用分離剤の粒子の最長直径と最短直径とを測定 したときに、 最長直径と最短直径との比の平均値が 1 . 0〜5 . 0、 好ましくは 1 . 0〜2 . 0、 より好ましくは 1 . 0〜1 . 3となる形状である。
また、 本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、 カラムに充填したときの充填 率を高め、 光学異性体の分離能力を高める観点から、 粒径が 1〜； L 0 Ο μ πιであ ることが好ましく、 1〜5 Ο μ πιであることがより好ましく、 3〜2 0 μ ιηであ ることがより一層好ましい。 クロマトグラフィ一用分離剤の粒径は、 例えば分級 によつて調整することが可能である。
また、本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、空孔を有することが、クロマト グラフィー用分離剤の表面積を大きくし、 光学異性体の分離能力を高める観点か ら好ましい。
また、 本発明において、 クロマトグラフィー用分離剤の粒子形状や粒径は、 例 えば走査型電子顕微鏡 ( S EM) で撮影されたクロマトグラフィー用分離剤の画 像から求めることが可能である。
本発明のク口マトグラフィ一用分離剤は、 次のようにして製造することができ る。 すなわち、 本発明のクロマトグラフィー用分離剤の第 1の製造方法は、 多糖 類に存在する水酸基の内の一部の水酸基に保護基を導入する保護基導入工程と、 該保護基が導入された多糖類に残存する水酸基に修飾分子を修飾する修飾工程と、 導入された保護基を脱離させて水酸基を再生させる脱離工程と、 再生された該水 酸基同士を架橋分子によって架橋する架橋工程とを有することを特徴とする。 こうして保護基導入工程によつて保護基を導入することにより、 所定の水酸基 に確実に修飾分子及び架橋分子を結合させることが可能となる。
保護基導入工程において導入される保護基は、 修飾工程において水酸基を修飾 する修飾分子よりも容易に水酸基から脱離させることが可能な基であれば特に限 定されない。 このような保護基を水酸基に導入するための化合物には、 例えば修 飾分子を用いることができる。 保護基を導入するための化合物は、 例えば保護や 修飾の対象となる水酸基の反応性や前記化合物の水酸基に対する反応性に基づい て決定することができる。
水酸基への保護基の導入、 修飾分子による水酸基の修飾、 及び架橋分子による 水酸基同士の架橋は、 水酸基と反応させる化合物の種類に応じた公知の適当な反 応によって行うことができる。 また脱離工程における前記保護基の水酸基からの 脱離は、 特に限定されず、 例えば酸やアル力リによる加水分解等の公知の方法に よって行うことができる。
なお、 架橋工程においては、 再生された水酸基のすべてを架橋分子によって架 橋することも可能ではあるが、 部分的に架橋することもできる。 この場合、 残つ た水酸基は、 修飾工程と同様の操作によって修飾することが好ましい。
本発明では、 前述した工程に加えて、 前記脱離工程において水酸基を再生させ た再生多糖類誘導体を溶媒に溶解する工程と、 得られた再生多糖類誘導体溶液に ポロジェンを分散させる工程と、 ポロジェンを分散させた前記再生多糖類誘導体 溶液を所望の形状に維持しながら前記溶媒を除去して所望の形状の再生多糖類誘 導体を形成する工程と、形成された再生多糖類誘導体を、ポロジェンを溶解する洗 浄溶媒で洗浄する工程と、 をさらに含むことにより、 空孔を有するクロマトダラ フィ一用分離剤を製造することができる。
前記ポロジェンは、 前記再生多糖類誘導体溶液中に分散可能な固体の化合物で あって、 多糖類誘導体とは別に溶かすことができる固体の化合物である。 このよ うなポロジェンには、 種々の有機化合物及び無機化合物を用いることが可能であ るが、 再生多糖類誘導体溶液中への分散性や、 後述するビーズ形成時の再生多糖 類誘導体溶液の液滴の安定性等の観点から、有機化合物を用いることが好ましい。 このような有機ィ匕合物には、 ポリスチレン等の種々のポリマーを用いることがで さる。
前記再生多糖類誘導体溶液に用いられる溶媒は、 脱離工程において水酸基を再 生させた前記再生多糖類誘導体を溶解できる溶媒であれば良い。 前記再生多糖類 誘導体溶液は、 例えば所望の形状の容器に収容することや、 後述するビーズの形 成のように、液滴を形成する等の種々の方法によって、所望の形状に維持すること ができる。 またポロジェンを分散させた前記再生多糖類誘導体溶液をカラム管に 収容しても良い。前記再生多糖類誘導体溶液からの溶媒の除去は、加熱や減圧、及 びこれら両方によって行うことができる。
所望の形状に形成された再生多糖類誘導体からポロジェンを溶解する洗浄溶媒 には、ポロジェンを溶解する溶媒であれば良いが、多糖類誘導体を溶解せずにポロ ジェンのみを溶解する溶媒が好ましく、 多糖類誘導体よりもポロジェンに対する 溶解性が高い溶媒がより好ましく、 ポロジェンのみを溶解する溶媒であることが より一層好ましい。 このような洗浄溶媒は、 多糖類誘導体及びポロジェンの種類 やこれらに対する溶媒の溶解性等に応じて、 公知の溶媒の中から選ぶことができ る。
また、 架橋工程は、 修飾工程において水酸基を再生させた再生多糖類誘導体を 溶媒に溶解して再生多糖類誘導体溶液とし、 界面活性剤の溶液中に該再生多糖類 誘導体溶液を滴下し、 さらに攪拌することによってビーズ形状の再生多糖類誘導 体とするビーズ形成工程と、 ビーズ形状の再生多糖類誘導体に架橋分子を架橋し てビーズ形状のクロマトグラフィ一用分離剤とするビーズ架橋工程とからなるこ とが好ましい。 発明者らの試験結果によれば、 こうした方法によってビーズ形状 のクロマトグラフィ一用分離剤を容易に製造することができる。
前記ビーズ形成工程において前記再生多糖類誘導体溶液に用いられる溶媒は、 脱離工程において水酸基を再生させた前記再生多糖類誘導体を溶解できる溶媒で あれば良レヽ。この溶媒が前記界面活性剤の溶液に溶解する場合では、本発明では、 界面活性剤の溶液に対して非溶性又は難溶性の助溶媒をさらに用いて前記再生多 糖類誘導体溶液とすることができる。 前記助溶媒を含有していても良レヽ前記再生 多糖類誘導体溶液を前記界面活性剤の溶液に滴下することによって、 前記界面活 性剤の溶液中に前記再生多糖類誘導体溶液の液滴を形成することができ、 さらに 再生多糖類誘導体溶液から溶媒 (及び Z又は助溶媒）を留去させることによって、 ビーズ形状の多糖類誘導体を形成することができる。
前記界面活性剤は、 前記界面活性剤の溶液中に形成される前記再生多糖類誘導 体溶液の液滴を安定して存在させることができる化合物であれば特に限定されな い。 このような界面活性剤には、 例えばァニオン界面活性剤を用いることができ る。
なお、 前記ビーズ架橋工程は、 前記架橋工程と同様に行うことができる。 本発明のク口マトグラフィ一用分離剤は、 次のようにして製造することもでき る。 すなわち、 本発明のクロマトグラフィー用分離剤の第 2の製造方法は、 多糖 類に存在する水酸基の内の一部の水酸基同士を架橋分子によつて架橋する架橋ェ 程と、 該架橋分子によつて架橋された多糖類に残存する水酸基に修飾分子を修飾 する修飾工程とを有することを特徴とする。
この方法によれば、 保護基をわざわざ導入する必要がなく、 工程数を減らすこ とができる。 このため、 製造コストの低廉化を図ることができる。 また。 ビーズ 形状の多糖類は市販されており、 この市販のビーズ形状の多糖類を用いて、 ビー ズ形状のク口マトグラフィ一用分離剤を安価かつ大量に供給することができる。 また、 本発明では、 一分子中に複数のイソシアナ一ト基を有する化合物のよう に、 多糖類又は多糖類誘導体の水酸基に対して結合する架橋部位を一分子中に複 数有する化合物を前記架橋工程において架橋剤に用いる場合では、 架橋後の多糖 類又は多糖類誘導体におけるフリーの前記架橋部位を修飾する工程をさらに含む ことが可能である。 このような工程によれば、 光学分割時において、 前記フリー の架橋部位と光学異性体との相互作用を抑制することが可能となる。
前記架橋部位の修飾は、 架橋部位と相互作用を呈すると思われる光学分割の対 象となる光学異性体に応じて異なるが、 通常は極性の低い置換基を用いて行うこ とが好ましく、 また前記架橋部位に対する立体障害性を高める観点から嵩高い置 換基を用いて行うことが好ましい。 このような置換基としては、 例えば t—プチ ル基ゃトリチル基等の分岐構造を有する炭化水素基が挙げられる。 このような置 換基による前記架橋部位の修飾は、 前述した保護基導入工程や修飾工程等と同様 に、 例えば縮合反応等の公知の適当な反応によって行うことができる。
また、 本発明では、 前記ビーズ形成工程において、 前記再生多糖類誘導体溶液 にポ口ジェンを分散させ、 ポロジェンを含有する前記再生多糖類誘導体溶液を前 記界面活性剤の溶液に滴下して、 ポ口ジェンを含有するビーズ形状の再生多糖類 誘導体 （ポロジェン含有ビーズ） を形成し、 このポロジェン含有ビーズを前記洗 浄溶媒で洗浄し、 ポ口ジェン含有ビーズのポ口ジェンを溶解することによって、 クロマトグラフィー用分離剤を製造することも可能である。
このような操作によれば、 ビーズ形状のク口マトグラフィ一用分離剤に多数の 空孔を形成することが可能となり、 クロマトグラフィー用分離剤の表面積を増や し、 又は調整することが可能となる。 これにより光学分割能の増加や調整を図る ことができる。
なお、 ボロジェンを用いる場合、 ポロジェンの溶解は、 前記所望の形状のクロ マトグラフィー用分離剤を製造する場合では架橋工程の前でも良いし後でも良く、 またビーズ形状のクロマトグラフィー用分離剤を製造する場合ではビーズ架橋ェ 程の前でも良いし後でも良い。
以下、 本発明を具体化した実施例 1〜7を説明する。 (実施例 1 )
実施例 1のクロマトグラフィー用分離剤は、 原料となる多糖類としてセルロー スを用いたビーズ形状ものであり、 以下のようにして製造した。 ぐ保護基導入工程 >
まず保護基導入工程として、 式 （ 1 ) に示すように、 6位の水酸基のトリチル ィ匕を行った。
Figure imgf000012_0001
(1)
すなわち、乾燥させたセルロース 1 3 g ( 8 6 mm o 1 )に塩化リチウム 9 . 2 gと乾燥 N, N ' —ジメチノレアセトアミド 1 3 5 m lを加え、 窒素雰囲気下、 1 0 0 °Cで 1 3 7時間膨潤させた後、 トリフエニルメチルク口ライド 5 0 g ( 1 8 0 mm o 1 )とピリジン 2 0 0 m lとを加え、 1 0 0 °Cで 2 8時間反応させた。 ピリジン可溶部をメタノール中に滴下して不溶部を回収した後、真空乾燥を行レ、、 グルコース環の 6位の水酸基がトリチル化されたセルロース誘導体を得た。 ぐ修飾工程 >
次に、 こうしてトリチルイ匕されたセルロース誘導体に対し、 式 （2 ) に示すよ うに、 残存する水酸基の力ルバモィル化を行つた。
Figure imgf000013_0001
すなわち、 保護基導入工程によって 6位の水酸基がトリチル化されたセルロー ス誘導体 1 7 gをピリジン 1 6 0 m 1に溶かし、 窒素雰囲気下で 3， 5—ジメチ ルフエ-ルイソシアナ一ト 1 9 g ( 1 2 8 mm o 1 ) を加え 8 0 °Cで 2 0時間反 応させた。 反応溶液をサンプリングして赤外吸収スペクトルを測定し、 溶液中の 未反応のィソシアナ一トの存在を確認した後、 反応溶液をメタノールに滴下して 不溶物を回収し、 真空乾燥して、 セルロース 2， 3—ビス （3， 5—ジメチル フエ-ノレカノレバモイノレ） 一 6— O—トリチノレセノレロース 2 8 gを得た。 ぐ脱離工程 >
さらに、こうして水酸基が力ルバモイル化されたセルロース誘導体から、式（3 ) に示すようにトリチル基を脱離させた。
Figure imgf000013_0002
(3) すなわち、 修飾工程によって得られた 2, 3—ビス （3， 5—ジメチノレフエ二 ルカルバモイル） 一6—0—トリチルセルロースを 1 %HC 1/メタノール 50 Om 1中で 24時間攪拌して脱保護を行って、 6位を水酸基に戻した。 その後、 反応 ΐ夜をガラスフィルタ一でろ過しながらメタノールで洗浄し、真空乾燥を行い、 セルロース 2, 3—ビス (3, 5—ジメチルフヱ二ルカルバメート) 20 gを 得た。
但し、 6位の水酸基の存在率を 1 H NMRスぺク トルから算出したところ 6 3 %程度であり、 残りは 3, 5—ジメチルフエ二ルイソシアナートによってカル バメート化されていた。 以下この誘導体を 「OD (6 -OH) -631 と略す。
<ビーズ形成工程〉
こう して得られた OD (6 -OH) —63をテトラヒ ドロフランに溶解させ、 さらに少量のへプタノールを加えた。 次に、 この溶液をラゥリル硫酸ナトリウム の水溶液へ、 6枚羽根型のスクリュ が取り付けられたディスパーザーで前記水 溶液を攪拌しながら滴下した。 滴下終了後、 前記水溶液が入った容器を収容した 水浴の温度を室温から 75 °Cまで上昇させてテトラヒドロフランを留去させ、 生 成したビーズを吸引ろ過で回収し、 水とエタノールで洗浄した。 洗浄後、 真空乾 燥を行い、 〇D (6-OH) 一 63からなるビーズを得た。 なお、 容器にはビー カーを使用した。 こうして OD (6 -OH) —63からなるビーズ
を製造した結果を表 1に示す„
Figure imgf000014_0001
くビーズ架橋工程〉 そして、 脱離工程において再生させた水酸基に対して、 式 （4) に示すよう 架橋反応を行った
Figure imgf000015_0001
(4)
すなわち、 乾燥させた OD (6-OH) 一 63からなるビーズ 0. 91 gに窒 素雰囲気下でトルエン 10 m 1を加え、 80。Cで 3時間加熱してビーズを膨潤さ せた後、 4， 4， ージフエニルメタンジイソシアナート 0. 13 g (0. 52 m mo 1 ) を加えて 6時間反応させた。 少量のビーズをサンプリングしてテトラヒ ドロフランに不溶となったことを確認した後、 過剰量の 3， 5—ジメチルフェ二 ルイソシアナート 0. 5 g (3. 4mmo 1 ) を加え 14時間反応させた。 I R 測定によつて未反応のィソシアナ一トが存在することを確認した後、 吸引ろ過を してビーズを回収し、 吸引しながら温めたメタノールで洗浄し、 生成した尿素を 除去した。 I Rによつて尿素が存在しないことを確認した後、 真空乾燥して 6位 の水酸基が 30 %架橋された実施例 1のビーズ 0. 88 gを得た。
(実施例 2)
実施例 2のクロマトグラフィー用分離剤は、 実施例 1と同様の工程によって得 た OD (6-OH) —63からなるビーズに対し、 水酸基の 15%が架橋される 量の 4， 4， ージフエニルメタンジイソシアナートによって架橋反応を行ったも のである。 他の操作は実施例 1のビーズの製法と同様である。
(実施例 3)
実施例 3のクロマ 一用分離剤は、 原料となる多糖類としてビーズ状 のセルロースを用い、 以下のようにして製造された。
すなわち、 巿販のセルロースビーズ （チッソ株式会社、 商品名 「Ce 1 1 f 1 o w C一 25」 ） 1. 0 g (6. 3mmo 1 ) に塩ィ匕リチウム 0. 68 gと N， N ' —ジメチルァセトアミド 10 ni 1を加え、 窒素雰囲気下、 80 で 60時間 膨潤させたのち、 ピリジン 10ml と 4， 4' ージフエニルメタンジイソシアナ ート 0. 47 g (1. 9讓 o 1 ) を加えてゲル化させた。 さらにピリジン 10 m 1を加え、 3， 5—ジメチルフエエルイソシアナート 3. 8 g (26mmo 1 ) を加えて 22時間反応させた。 I Rにより未反応のィソシアナ一トが存在するこ とを確認した後、 吸引ろ過しながら温めたメタノールで洗浄し、 ビーズを回収し た。 このビーズを真空乾燥して 6位の水酸基が 30 %架橋された実施例 3のビー ズ 1. 5 gを得た。
(比較例 1)
比較例 1のクロマトグラフィー用分離剤は、 セルロースの 3， 5—ジメチルフ ェニルカルバメート誘導体をシリカゲル上に担持させたものであり、 以下のよう にして製造した。 すなわち、 多孔性シリカゲル （粒形 7 xm、 孔径 l O O nm) を乾燥後、 ベンゼン中、 80 °C触媒量のピリジンの存在下、 3—ァミノプロピル トリエトキシシランと反応させた後、 これをメタノール、 アセトン、 へキサンで 洗浄し、 さらに乾燥させた。 こうしてァミノプロピル基で修飾されたシリ力ゲル 3 gに、 セルロース トリス （3， 5—ジメチルフエ二ルカルバメート) のテト ラヒ ドロフラン溶液 (0. 75 g/1 Om 1 ) を少量ずつ添加しながらふりまぜ た後、 溶媒のテトラヒドロフランを減圧下で留去することで、 セルロースの 3, 5—ジメチルフエ二ルカルバメート誘導体をシリカゲル上に担持させた比較例 1 のクロマトグラフィ一用分離剤を得た。
評 価
(光学分割試験 1)
実施例 1〜 3のクロマトグラフィー用分離剤について、 篩分によって 3 μΐη~ 15 Aimの粒径のものを分取し、 長さ 25 cm、 内径 0. 2 cmのステンレス一 スチール製のカラムにスラリー法を用いて充填した。 充填にあたっては、 分取し た実施例 1〜3のクロマトグラフィー用分離剤をへキサン Z流動パラフィン （2 1) 3 0m lに分散させ、 溶媒としてへキサン Z 2—プロパノール (9/1) を用い、 充填圧力は 50 k g/c m2 (4. 9MP a) とした。
なお、 実施例 1については、 充填圧力を 1 00 k g/cm2 (9. 8 MP a) と したカラムも作製した。
また、 比較例 1のクロマトグラフィー用分離剤についても、 同様のカラムを用 い同様の操作で充填した。 ただし、 充填圧力は始めの数分を 4 0 0 k g/c m2 とし、 その後 1 00 k gZcm2とした。
また、 比較例 1のクロマトグラフィ一用分離剤は、 長さ 2 5 cm、 内径 0. 4 6 c m及び、 長さ 25 cm、 内径 0. 2 c mのステンレス一スチール製のカラム にスラリ一法を用いて充填した。
上記の操作で得られた実施例 1〜 3及び比較例 1のクロマトグラフィ一用分離 剤を充填したカラムを用い、 以下の構造式 1から 1 0に示す 1 0種類のラセミ体 について光学分割試験を行った。 Ph
Figure imgf000017_0001
2 4
Figure imgf000017_0002
5 6
CONHPh
Co(acac)3
F¾C C 0 H PhHNOC
10 溶離液はへキサン/ 2—プロノ、。ノ一ル= 9 / 1とし、 流速は実施例 1〜 3では 0. 2 m 1 /m i nとし、 比較例 1では内径 0. 46 c mのカラムでは 0. 5 m 1/m i nとし、 内径 0. 2 cmのカラムでは 0. 1 m 1 /m i nとした。 UV 検出器と旋光検出器とを併用して検出を行った。 理論段数 Nはベンゼンのピーク から求め、溶離液がカラムを通過する時間 t。は 1 , 3, 5—トリー t e r t—ブ チルべンゼンの溶出時間から求めた。なお、充填前後のビーズの S EM観察では、 充填時の加圧によるビーズの変形などは見られなかった。 結果を表 2に示す。
¾ j ^ X· :
表 2
Figure imgf000019_0001
表 2中の Id 'は容量比を示し、 αは分離係数を示す。力つこの中の符号は先に溶 出したェナンチォマーの旋光性を示す。 表 2から、 実施例 1〜3の容量比 'は、 比較例 1 (Dl と比べて 2 . 5倍〜 3倍であることが分かる。 これは、実施例 1〜 3のク口マトグラフィー用分離剤は、 担体を使用していないことによるものと考 えられる。 したがって、 実施例 1〜3のクロマトグラフィ一用分離剤は、 1度に よりたくさんの量の光学分割を行うことが可能であると推定される。
また、 理論段数の測定結果を表 3に示す。 表。
Figure imgf000020_0001
この表から分かるように、充填圧力 5 0 k g / c m 2で実施例 1のクロマトグラ フィ一用分離剤を充填した力ラムにおいて、 比較例 1の理論段数を上回った。
(光学分割試験 2 )
長さ 2 5 c m、 内径 0 . 2 c mのステンレス一スチール製のカラムを用い、 5 0 k g / c m 2の充填圧力で充填した実施例 1のクロマトグラフィ一用分離剤及 び比較例 1のク口マトグラフィー用分離剤について、 光学異性体をワンショット で分離できる最大量を求めた。 '
すなわち、 2 , 2， 2—トリフルオロー 1― ( 9—アンスリル） エタノーノレの ラセミ体を溶離液と同じ組成の溶媒に溶かして 1 0 m g /m 1、 4 0 m g /m 1、 5 O m g /m 1の濃度の溶液を調製する。これらの溶液を用いて光学分割を行い、 得られたチヤ一トにおいて 2つのェナンチォマーのピークが重なった時のラセミ 体の量を、 そのカラムが分割できる最大量とした。 結果を図 1に示す。
図 1から分かるように、比較例 1の内径 0 . 2 c mのカラムを用いた場合では、
差換え用紙（規則 26) 6mgまでしか分離ができなかったのに対し、 実施例 1では 8mgまで、 ほぼ完 全に分離することができた。
(走査型電子顕微鏡による観察）
実施例 1、 3及び比較例 1について、 走査型電子顕微鏡による写真撮影を行つ た。 その結果、 図 2〜図 7に示すように、 実施例 1及び実施例 3のクロマトダラ フィー用分離剤は、 比較例 1のそれと同様、 ビーズ形状とされていることが分か つた o
(実施例 4)
(a) 6位に水酸基を有するセルロース 3， 5ージメチルフエ二ルカルバメ トの合成
まずビーズの材料として、 後にジイソシアナートを用いて架橋させるために、 6位に水酸基を残したセルロースの 3, 5_ミジメチノレフェニノレカノレバメ一 体、 OD (6-OH) を合成した。
Figure imgf000021_0001
乾燥させたセルロース 10 g (62mmo 1)に塩化リチウム 15 gと脱水 N, N， ージメチノレアセトアミド 150mlを加え、 窒素雰囲気下、 80°Cで 27時 間膨潤させた後、 トリフエニルメチルクロライド 32 g (1 14mmo 1 ) とピ リジン 150mlとを加え、 80 °Cで 24時間反応させた。 ピリジン可溶部をメ タノール中に滴下して不溶部として回収した後、 真空乾燥を行った。
得られた誘導体は、 グルコース環の 6位の水酸基が完全にトリチル化されてい なかったため、 再度この誘導体に、 塩化リチウム 15 gと脱水 N， N， 一ジメチ ルァセトアミド 15 Om 1をカロえ、 窒素雰囲気下、 80 °Cで 24時間膨潤させた 後、 トリフエニルメチルクロライド 17 g (62mmo 1 ) とピリジン 150m 1とをカロえ、 80 °Cで 24時間反応させた。 ピリジン可溶部をメタノーノレ中に滴 下して不溶部を回収した後、 真空乾燥を行い、 グルコース環の 6位の水酸基がト リチル化されたセルロース誘導体を得た。
次に、 得られた誘導体 21 gをピリジン 190 m 1に溶かし、 窒素雰囲気下で 3， 5—ジメチノレフエニノレイソシァ "一ト 22 g (15 Ommo 1)を加え 80°C で 30時間反応させた。 反応溶液をサンプリングして赤外吸収スぺクトルを測定 し、 溶液中の未反応のィソシアナ一トの存在を確認した後、 反応溶液をメタノー ルに滴下して不溶物を回収し、 セルロース 2, 3 -ビス (3, 5—ジメチルフ ェニルカルバモイル） 一 6— O—トリチノレセノレロースを得た。
次に、 この誘導体を、 1%HC 1 Zメタノール 1， 500ml中で 24時間攪 拌して脱保護を行って、 6位を水酸基に戻した。 メタノールで洗浄後、 真空乾燥 を行い、 目的のセルロース 2， 3—ビス （ 3 , 5ージメチルフエ-ルカルバメ ート） を 24 g得た。
OD (6— OH) - 25の合成
次に、 得られた誘導体のうち、 10 g (22mmo 1 ) をピリジン 65m lに 溶かし、窒素雰囲気下で 3， 5—ジメチルフエ二ルイソシァ "一ト 2. 5 g (1. mmo 1) を加え 80 °Cで 18時間反応させた。 反応溶液をメタノールに滴下 して不溶物を回収し、 真空乾燥を行った。 反応前の誘導体と 3， 5—ジメチルフ ェニルイソシアナ一トとの仕込み比より、 グルコース環の 6位の水酸基が 25 % 程度残っていることになり、 以下この誘導体を OD (6-OH) —25とする。 (b) OD (6— OH) —25ビーズの調製
0. 25 gの OD (6 -OH) 一 25をテトラヒ ドロフラン Zヘプタノール (2 /1, v/v) 混合溶媒 3 Om 1に溶かした。 0. 2%ラウリル硫酸ナトリウム 水溶液 500m lが入つた容器を収容している水浴の温度を 75 °Cにあげ、 0. 2%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液 500m をデイスパーザーで、 シャフト回 転数 1100 r pmで攪拌しながら、 前記 OD (6—OH) -25の溶液を前記 水溶液に滴下した。 滴下後も水浴の温度を 75 °Cに保ち、 テトラヒドロフランを 留去させ、 生成したビーズを吸引ろ過で回収し、 水とエタノールで洗浄した。 洗 浄後、 真空乾燥を行い、 OD (6-OH) 一 25のビーズを得た。 このときビー ズの収率はおよそ 87%であった。 この操作を繰り返したものを、 2 のフ ィルタ一で分別することで、 粒径 3〜 10 μ m程度のビーズを回収した。
デイスパーザーのシャフトには 6枚羽根型を、 また容器には 1リットルビーカ 一を用いた。 得られたビーズについて走査型電子顕微鏡 （SEM) による観察を 行った。
(c) OD (6-OH) -25ビーズのジィソシアナ一トによる架橋
得られた OD (6-OH) 一 25ビーズに強度を持たせるために、 6位の水酸 基と 4, 4' —ジフエニルメタンジイソシアナートを反応させて、 ビーズ内で架 橋を行った。
Figure imgf000023_0001
架橋前のビ-ス4 架橋後のビ-ス'
THFに可溶 THFに不溶
架橋ビーズの調製 （カラム A用）
乾燥させた OD (6-OH) -25ビーズ 1. 83 gに窒素雰囲気下でトルェ ン 20 m 1を加え、 80 °Cで 4時間加熱してビーズを膨潤させた後、過剰量の 4， 4' ージフエニルメタンジイソシアナート 0. 3 g (1. 2mmo 1 ) をカロえて 80 °Cで 24時間反応させた。 上澄み液を液体 I Rで測定して未反応のィソシァ ナートの存在を確認し、 また少量のビーズをサンプリングしてテトラヒドロブラ ンに不溶となったことを確認した後、 吸引ろ過をしてビーズを回収し、 過剰のィ ソシアナ一トから生成した尿素を取り除くため、 吸引しながら温めたメタノール で洗浄した。 ビーズを固体 I Rにより測定し、 尿素が存在しないことを確認した 後、 真空乾燥して 6位の水酸基を 25 %架橋したビーズ （以下ビーズ Aとする） 1. 83 gを得た。 架橋ビーズの調製 （カラム B用）
乾燥させた OD (6-OH) 一 25ビーズ 1. 0 gに窒素雰囲気下でトノレェン 11 m 1を加え、 80 °Cで 4. 5時間加熱してビーズを膨潤させた後、 過剰量の 4, 4' ージフエュノレメタンジイソシアナ一ト 0. 14 g (0. 56mmo 1 ) を加えて 80 °Cで 15時間反応させた。 上澄み液を液体 I Rで測定して未反応の ィソシアナートの存在を確認し、 また少量のビーズをサンプリングしてテトラヒ ドロフランに不溶となったことを確認した後、 残りのィソシアナ一トを修飾する ため、 過剰量の t e r t—プタノール 1 Om 1を加え 3時間反応させた。
上澄み液を液体 I Rで測定してィソシアナ一トの存在がなくなつたことを確認 した後、 吸引ろ過をしてビーズを回収し、 イソシアナ一トと t e r tーブタノ一 ルから生成した尿素を取り除くため、吸引しながら温めたメタノールで洗浄した。 ビーズを固体 I Rにより測定し、 尿素が存在しないことを確 し、 真空乾燥して 6位の水酸基を 25 %架橋したビーズ （以下ビーズ Bとする） 1. 0 gを得た。 ビーズ Aの調製とは異なり、 ビーズ Bの調製では、 4， 4， ージフエニルメタ ンジィソシアナートの二つのィソシアナ一トのうち一方だけしか誘導体と反応し ていないものを、 嵩高いアルコールで修飾するために、 t e r t—ブタノ一ノレで 処理した。このことによりビーズ Bとラセミ体の光学分割に関与する相互作用力 余分な相互作用に邪魔されず、 より効果的に働くと期待される。 OP (6— OH) — 25ビーズの観察
反応前後のビーズ A、 Bの S EM観察では、 反応前後でのビーズの大きさや表 面の状態には変化がないことがわかった。 架橋後のビーズ A、 Bの S EM画像を 図 8、 図 9に示す。
(d) ビーズのカラムへの充填
得られた二種のビーズ A、 Bを粒径分別した後に、 へキサン/流動パラフィン (2/1) 30mlに分散させ、 へキサン / 2—プロパノール （9/1) を溶離 液に用いて、 HP LC用ポンプで圧力を 3〜 30 k g/ cm2かけ、長さ 25 c m、 内径 0· 2 c mのステンレス一スチール製のカラムにスラリー法により充填した。 それぞれカラム A、 Bとする。 力ラムへ充填されたビーズの観察
各カラム中に含まれるビーズの質量と、 表面積、 理論段数 （N) 、 充填時間を 以下の表 4に示す。 なお。 .充填前後のビーズを S EMで観察したところ、 充填時 の加圧によるビーズの変形などは見られなかった。 表 4
Figure imgf000025_0001
(e) 光学分割能の評価
上記の操作で得られた 2種のビーズの力ラムを用いて、 先に示した構造式 1〜 10の 10種のラセミ体の光学分割を行った。 榕離液にはへキサン/ 2—プロパ ノール = 9/1を用いて、 流速は 0. 1 m 1 /m i nとし、 UV検出器と旋光検 出器を用いてピークの検出、 同定を行った。 なお、 理論段数 Nはベンゼンのピー クから求め、 また溶離液がカラムを素通りする時間 t。は 1 , 3， 5—トリー t e r t—ブチルベンゼンの溶出時間から求めた。
差換え用紙（親則 26) 光学分割能の評価の結果
カラム A、 Bによる先に示したラセミ体の光学分割の結果を表 5に示す。 また 比較のため、 3 , 5—ジメチルフェ二ルカルバメ一ト誘導体をシリカゲル上に担 持した充填剤 （比較例 1 ) による光学分割の結果も合わせて載せた。 表中の値は 容量比 k 1 ' と分離係数 αで、 つこの中の符号は先に溶出したェナンチォマーの 旋光性である。
Figure imgf000026_0001
カラム Aとカラム Bの結果を比較すると、 カラム Bは誘導体が多く充填されて いるにも関わらず、容量比 k i ' が全体的に小さくなり、 分離係数 aが全体的に大 きくなつた。 これは、 カラム Βが t e r t—ブタノールで処理されており、 ラセ ミ体の分離を邪魔する相互作用がなくなつたためであると考えられる。
また、全てのビーズカラムの溶出順序については通常の担持型と同じであった。 容量比 k ! ' については、 シリカゲルに担持したものと比べて 2 . 5〜4倍大きく なる結果が得られた。 これは、 シリカゲノレを用いないことでよりたくさんのセル ロース誘導体をカラム中に導入することができたためであると考えられ、 一度に よりたくさんのラセミ体を分割可能であることが期待される。
( f ) 2 , 2 , 2—トリフルオロー 1— ( 9一アンスリル） エタノールの大量分 魁
ビーズを充填した力ラムには、 従来のシリ力ゲル担持型の同サイズのカラムと 比較してカラム中により多くの多糖類誘導体が存在しており、 シリカゲル担持型 カラムよりも一度に分割可能なラセミ体の量が多いことが期待される。 そこで力 ラム Aと、 シリカゲル担持型力ラムを用いて、 一度に分割可能なラセミ体 2，
2, 2—トリフルオロー 1― (9—アンスリル） エタノール (9) について調べ た。
この際、 このラセミ体を溶離液と同じ組成の溶媒に溶かして調製した 120 m g/m 1の溶液を用いて光学分割を行った。 カラムには長さ 25 cm、 内径 0. 2 cmのカラムを用い、 溶離液にはへキサン / 2—プロパノ一ル (9/1) を用 レ、、 溶離液の流速は、 シリカゲル担持型力ラムでは 0. 20m l Zm i nとし、 カラム Aでは 0. 15m 1 /m i nとした。 得られたチャートにおいて二つのェ ナンチォマーのピークが重なった時のラセミ体の量を、 その力ラムが分割できる 最大量とした。 .
2, 2, 2—トリフルオロー 1一 （9一アンスリル） エタノールの大量分割の結 ラセミ体 2, 2, 2—トリフノレオ口一 1一 （9一アンスリル） エタノールの 大量分割を行った結果をそれぞれ図 10に示す。 測定波長は 271 nmとした。 その結果、 担持型では 6 m g、 カラム Aでは 20 m gを打ち込んだところで二つ のピークが重なった。
(実施例 5〜 7 )
空孔を有するセルロース誘導体ビーズの調製
セルロース誘導体ビーズを調製する際に、 セルロース誘導体の THFZ1—へ プタノール混合溶液に、 ポロジェンとしてポリマーを添加し、 これをラウリル硫 酸ナトリウム水溶液に攪拌しながら滴下、 その後加熱により T H Fを留去し、 得 られたビーズをポロジェンに用いたポリマーを溶解する溶媒で洗浄してポロジェ ンを洗い流したところ、 ビーズ内に空孔が認められた。 空孔の数や大きさは、 用 いるポロジェンの種類や濃度により変化した。
6位の一部に水酸基を有するセルロース 3, 5—ジメチルフエ二ルカルバメ ート 25mgをテトラヒドロフラン Zヘプタノール （2/1, v/v) 混合溶媒 3m lに溶かし、 そこへポロジェンに用いるポリマーをセルロース誘導体に対し て約 20質量0/。の割合で溶かした。 0. 2 %ラウリル硫酸ナトリウム水溶液 10 0 in 1が入つた容器を収容した水浴の温度を 75 °Cにあげ、 0. 2 %ラウリノレ硫 酸ナトリゥム水溶液 100mlをディスパーザーで、 シャフト回転数 1 100 r で攪拌しながら、 前記 OD (6-OH) —25の溶液を前記水溶液に滴下し ャ—
滴下後も水浴の温度を 75 °Cに保ち、 テトラヒドロフランを留去させ、 生成し たビーズを吸引ろ過で回収し、 水、 エタノール、 そしてポロジェンのみを溶解す る溶媒で洗浄した。 洗浄後、 真空乾燥を行い、 粒径 3 12 / m程度の空孔を有 するセル口ース誘導体ビーズを得た。
デイスパーザーのシャフトには、 6枚羽根型を、 また容器には 200ミリリツ トルビーカーを用いた。 また、 ポロジェンにはポリスチレン （PS t、 分子量： 17, 000、 Mw/Mn： 1. 03) 、ポリメチルメタクリレート （PMMA、 分子量： 42， 000, Mw/Mn ： 1. 40) 、 ポリ一 N—イソプロピルァク リノレアミ ド （PN I PAM、 分子量： 28， 000、 Mw/Mn : 1. 85) を 用いた。
得られたビーズについて走査型電子顕微鏡 (SEM) による観察を行った。 得 られたビーズの S EM画像を図 1 1 13に示す。 産業上の利用の可能性
本宪明のクロマトグラフィー用分離剤は、 多糖類誘導体が架橋分子によって架 橋されていることから、 耐溶媒性が格段に向上し、 また機械的強度も向上し、 従 来のクロマトグラフィー用分離剤に比べて、 より溶出力の強い溶媒を用いること ができ、 また HP L C等の高圧条件下でも+分に使用することができる。
また、 本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、 担体を使用していないことか ら、 カラム中に充填できる多糖類誘導体の量を多くすることができ、 一度に光学 分割できる量を多くすることができ、 例えば光学異性体の工業的な製造における 生産 14をより一層高めることができる。

Claims

請求の範囲
1 . 多糖類から誘導された多糖類誘導体を用いるクロマ 一用分離剤【： おいて、
前記多糖類誘導体は、 前記多糖類に存在する水酸基の内の一部の水酸基同士が 架橋分子を介して架橋されており、 該多糖類に存在する該水酸基の内の架橋され ていない水酸基は修飾分子によって修飾された構造とされており、 該多糖類誘導 体は担体に担持されていないことを特徴とするクロマトグラフィ一用分離剤。
2 . 多糖類はセルロースであることを特徴とする請求項 1記載のクロマトグラフ ィー用分離剤。
3 . 多糖類はアミロースであることを特徴とする請求項 1記載のクロマトグラフ ィー用分離剤。
4. 架橋分子による架橋はピラノース環又はフラノース環の 6位の水酸基同士で 行われていることを特徴とする請求項 1乃至 3のいずれか 1項記載のクロマトグ ラフィー用分離剤。
5 . 架橋分子は 1分子に複数のィソシアナ一ト基を有する化合物であることを特 徴とする請求項 1乃至 4のいずれか 1項記載のクロマトグラフィー用分離剤。
6 . 修飾分子は 1分子に 1つのィソシアナ一ト基を有する化合物であることを特 徴とする請求項 1乃至 5の ヽずれか 1項記載のクロマトグラフィ一用分離剤。
7. ビーズ形状とされていることを特徴とする請求項 1乃至 6のいずれか 1項記 載のクロマトグラフィ一用分離剤。
8 . 空孔を有することを特徴とする請求項 1乃至 7のいずれか 1項に記載のク口 マトグラフィー用分離剤。
9 . 多糖類に存在する水酸基の内の一部の水酸基に保護基を導入する保護基導入 工程と、
該保護基が導入された多糖類に残存する水酸基に修飾分子を修飾する修飾工程 と、
導入された保護基を脱離させて水酸基を再生させる脱離工程と、
再生された該水酸基同士を架橋分子によって架橋する架橋工程とを有すること を特徴とするクロマトグラフィー用分離剤の製造方法。
1 0 . 前記脱離工程において水酸基を再生させた再生多糖類誘導体を溶媒に溶解 する工程と、
得られた再生多糖類誘導体溶液にポ口ジェンを分散させる工程と、
ポロジェンを分散させた前記再生多糖類誘導体溶液を所望の形状に維持しなが ら前記溶媒を除去して所望の形状の再生多糖類誘導体を形成する工程と、 形成された再生多糖類誘導体を、ポロジェンを溶解する洗浄溶媒で洗浄するェ 程と、 をさらに含むことを特徴とする請求項 9記載のクロマトグラフィー用分離 剤の製造方法。
1 1 . 架橋工程は、
修飾工程にお Vヽて水酸基を再生させた再生多糖類誘導体を溶媒に溶解して再生 多糖類誘導体溶液とし、 界面活性剤の溶液中に該再生多糖類誘導体溶液を滴下し さらに攪拌することによってビーズ形状の再生多糖類誘導体とするビーズ形成ェ 程と、
ビーズ形状の再生多糖類誘導体に架橋分子を架橋してビーズ形状のクロマトグ ラフィ一用分離剤とするビーズ架橋工程とからなることを特徴とする請求項 9記 載のクロマトグラフィ一用分離剤の製造方法。
1 2 . ビーズ形成工程における前記再生多糖類誘導体溶液にポロジェンを分散さ せ、
前記ビーズ形状の再生多糖類誘導体を、 ポロジェンを溶解する洗浄溶媒で洗浄 する工程をさらに含むことを請求項 1 1記載のクロマトグラフィ一用分離剤の製 造方法。
1 3 . 多糖類に存在する水酸基の内の一部の水酸基同士を架橋分子によって架橋 する架橋工程と、
該架橋分子によって架橋された多糖類に残存する水酸基に修飾分子を修飾する 修飾工程とを有することを特徴とするクロマトグラフィ一用分離剤の製造方法。
1 4 . 架橋工程において架橋分子によって架橋される多糖類は、 ビーズ形状とさ れていることを特徴とする請求項 1 3記載のクロマトグラフィ一用分離剤の製造 方法。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006121060A1 (ja) 2005-05-09 2006-11-16 National University Corporation Nagoya University 光学異性体分割用ビーズ及びその製造方法
WO2007129659A1 (ja) 2006-05-09 2007-11-15 National University Corporation Nagoya University 光学異性体分離用充填剤
WO2008136512A1 (ja) 2007-05-07 2008-11-13 National University Corporation Nagoya University 光学異性体用分離剤
JP2010254995A (ja) * 2010-04-05 2010-11-11 Daicel Chem Ind Ltd 多孔質多糖誘導体の製造方法
JP2015083696A (ja) * 2008-03-31 2015-04-30 旭化成せんい株式会社 セルロース誘導体微粒子、その分散液、その分散体及び診断薬

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9028684B2 (en) * 2009-04-30 2015-05-12 Daicel Chemical Industries, Ltd. Separating agent for optical isomer

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03170501A (ja) * 1989-11-29 1991-07-24 Fukui Kagaku Kogyo Kk セルロース多孔質球状粒子
JPH03197503A (ja) * 1989-08-31 1991-08-28 Dow Corning Corp 非常に吸着性のポリマーの製造方法
JPH03261729A (ja) * 1990-03-12 1991-11-21 Chisso Corp 光学異性体分離剤
JPH0859702A (ja) * 1993-06-22 1996-03-05 Daicel Chem Ind Ltd 光学異性体用分離剤およびその製造法
JPH10245409A (ja) * 1997-03-03 1998-09-14 Amcol Internatl Corp 吸油性・吸水性ポリマーおよびその製造方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3272354B2 (ja) * 1991-02-28 2002-04-08 ダイセル化学工業株式会社 新規な多糖誘導体及び分離剤
US5677407A (en) * 1995-06-07 1997-10-14 Amcol International Corporation Process for producing an oil sorbent polymer and the product thereof
SE9601368D0 (sv) * 1996-04-11 1996-04-11 Pharmacia Biotech Ab Process for the production of a porous cross-linked polysaccharide gel
JP4320068B2 (ja) * 1997-10-03 2009-08-26 ダイセル化学工業株式会社 光学異性体用分離剤及びその製造法
FR2784108A1 (fr) * 1998-09-11 2000-04-07 Inst Francais Du Petrole Nouveaux polymeres reticules a base de derives bis-silanes, bis-thioethers, bis-sulfoxydes, bis-sulfones et butane di-yl de polysaccharides et d'oligosaccharides, et leur mise en forme en materiaux supports
SE0102369D0 (sv) * 2001-07-03 2001-07-03 Monocell Ab New method
FR2838430B1 (fr) * 2002-04-10 2005-07-22 Laureano Pablo Oliveros Derives de polysaccharides insolubilises par pontage de leurs chaines. leur utilisation comme phases stationnaires chirales et membranes enantioselectives pour la separation d'enantiomeres

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03197503A (ja) * 1989-08-31 1991-08-28 Dow Corning Corp 非常に吸着性のポリマーの製造方法
JPH03170501A (ja) * 1989-11-29 1991-07-24 Fukui Kagaku Kogyo Kk セルロース多孔質球状粒子
JPH03261729A (ja) * 1990-03-12 1991-11-21 Chisso Corp 光学異性体分離剤
JPH0859702A (ja) * 1993-06-22 1996-03-05 Daicel Chem Ind Ltd 光学異性体用分離剤およびその製造法
JPH10245409A (ja) * 1997-03-03 1998-09-14 Amcol Internatl Corp 吸油性・吸水性ポリマーおよびその製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1637864A4 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7745616B2 (en) 2005-05-09 2010-06-29 National University Corporation, Nagoya University Bead for enantiomeric isomer resolution and process for producing the same
WO2006121060A1 (ja) 2005-05-09 2006-11-16 National University Corporation Nagoya University 光学異性体分割用ビーズ及びその製造方法
JP5007669B2 (ja) * 2005-05-09 2012-08-22 国立大学法人名古屋大学 光学異性体分割用ビーズ及びその製造方法
JP5540368B2 (ja) * 2006-05-09 2014-07-02 国立大学法人名古屋大学 光学異性体分離用充填剤
CN101490544B (zh) * 2006-05-09 2013-11-20 国立大学法人名古屋大学 用于旋光异构体分离的填料
WO2007129659A1 (ja) 2006-05-09 2007-11-15 National University Corporation Nagoya University 光学異性体分離用充填剤
WO2008136512A1 (ja) 2007-05-07 2008-11-13 National University Corporation Nagoya University 光学異性体用分離剤
CN101679529B (zh) * 2007-05-07 2012-10-10 国立大学法人名古屋大学 旋光异构体分离剂
JP5531288B2 (ja) * 2007-05-07 2014-06-25 国立大学法人名古屋大学 光学異性体用分離剤
US10836834B2 (en) 2007-05-07 2020-11-17 Daicel Corporation Separating agent for optical isomer
JP2015083696A (ja) * 2008-03-31 2015-04-30 旭化成せんい株式会社 セルロース誘導体微粒子、その分散液、その分散体及び診断薬
JP5952522B2 (ja) * 2008-03-31 2016-07-13 旭化成株式会社 セルロース誘導体微粒子、その分散液、その分散体及び診断薬
JP2010254995A (ja) * 2010-04-05 2010-11-11 Daicel Chem Ind Ltd 多孔質多糖誘導体の製造方法

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