JP4409511B2 - クロマトグラフィー用分離剤及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明はクロマトグラフィー用分離剤に関し、特に光学異性体を分離するための高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」と略す）用の分離剤に用いて好適である。

従来より、多糖類誘導体が有しているキラリティーを利用し、これを用いたクロマトグラフィー用分離剤が広く知られている。こうしたクロマトグラフィー用分離剤に使用される多糖類誘導体としては、例えばセルロースやアミロースのエステル誘導体やカルバメート誘導体等がある。これらの多糖類誘導体は、カラムへの充填率を高め、ハンドリングを容易にし、機械的強度を高める等の目的から、シリカゲル等の担体に担持させた状態で、クロマトグラフィー用分離剤として使用されている。
こうした、多糖類誘導体を担体に担持させて用いたクロマトグラフィー用分離剤は、高い光学異性体の分離能を有しており、分析用に用いられるのみならず、各種医薬品の製造等、光学異性体の大量分取用としても用いられている。
しかし、上記従来の多糖類誘導体を用いたクロマトグラフィー用分離剤は、多糖類誘導体が担体に対して物理的な吸着によって担持されているだけであるため、溶出溶媒の種類によっては多糖類誘導体がその溶出溶媒に溶解し、使用不能となることもある。
特に、光学異性体の大量分取のためには、分離前の原料を高濃度に溶出溶媒に溶解させる必要があり、そうしたことが可能な溶出溶媒は、一般に多糖類誘導体の溶解度も大きいため、問題となっていた。
また、多糖類誘導体の機械的強度も小さいため、特にＨＰＬＣ用として用いた場合には、その圧力に耐えられないことも問題となっていた。
これらの不具合を防止するため、多糖類誘導体を担体の表面に化学結合させ、溶出溶媒による多糖類誘導体の溶出を防ぐとともに、その機械的強度を高めることも試みられている。
例えば特開平４−２０２１４１号公報には、多糖類の水酸基にエステル結合やウレタン結合を介してビニル基を導入した多糖類誘導体とビニル基を化学結合させた担体との間で共重合を行い、多糖類誘導体を担体に化学結合させたクロマトグラフィー用分離剤が記載されている。
また、本発明者らにあっても、先に特公平７−３０１２２号公報において、イソシアネート化合物を介して多糖類誘導体をシリカゲルに化学結合させ、溶出溶媒による多糖類誘導体の溶出を防止するクロマトグラフィー用分離剤を提案している。
さらに、本発明者らは、特開平１１−１７１８００号公報において、セルロース誘導体を担持したシリカゲル上でスチレン及びジビニルベンゼンを共重合させて３次元網目構造とすることにより、溶出溶媒によるセルロース誘導体の溶出を防止することを提案している。
しかし、上記公報に記載のクロマトグラフィー用分離剤によっても、担体に固定化された多糖類誘導体の溶出溶媒による溶出を完全に防止することはできなかった。
この点、本発明者らは、さらに特開２００２−１４８２４７号公報において、あらかじめ多糖類誘導体に重合性の不飽和基を導入しておくとともに、シランカップリング剤を介して２−メタクリロイロキシエチル基が導入されたシリカゲルを用意し、これらを共重合によって化学結合させることにより、シリカゲルに対して固定化率の高いクロマトグラフィー用分離剤を提案している。
このクロマトグラフィー用分離剤によれば、多糖類誘導体の溶出溶媒による溶出をほぼ完全に防止することが可能であるとともに、その光学異性体の分離能も優れたものとなる。さらに、その機械的強度も大きなものとなる。
しかし、上記公報に記載のクロマトグラフィー用分離剤では、光学異性体の分離に寄与するために必要なキラリティーを有するのは多糖類誘導体のみであり、キラリティーを有さないシリカゲル等の担体は、光学異性体の分離に直接的に寄与するものではない。このため、クロマトグラフィー用分離剤をカラムに充填した場合において一度に光学分割できる量は、シリカゲル等の担体が占めている分だけ少なくなってしまう。

本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、溶出溶媒による溶出のおそれが少なく、一度に光学分割を行うことができる量が大きく、大きな圧力に耐えることが可能なクロマトグラフィー用分離剤及びその製造方法を提供することを解決すべき課題としている。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、多糖類から誘導された多糖類誘導体を用いるクロマトグラフィー用分離剤において、前記多糖類誘導体は、前記多糖類に存在する水酸基の内の一部の水酸基同士が架橋分子を介して架橋されており、該多糖類に存在する該水酸基の内の架橋されていない水酸基は修飾分子によって修飾された構造とされており、該多糖類誘導体は担体に担持されていないことを特徴とする。
また本発明は、多糖類に存在する水酸基の内の一部の水酸基に保護基を導入する保護基導入工程と、該保護基が導入された多糖類に残存する水酸基に修飾分子を修飾する修飾工程と、導入された保護基を脱離させて水酸基を再生させる脱離工程と、再生された該水酸基同士を架橋分子によって架橋する架橋工程とを含むクロマトグラフィー用分離剤の製造方法を提供する。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤では、多糖類誘導体が架橋分子によって架橋されているため、その３次元網目構造によって耐溶媒性が格段に向上する。このため、従来の多糖類誘導体を用いたクロマトグラフィー用分離剤では使用することができなかったクロロホルム、テトラヒドロフラン、酢酸エチル等の溶出溶媒も使用可能となる。
また、このクロマトグラフィー用分離剤では、担体を全く使用しておらず、光学異性体の分離に直接的に寄与する多糖類誘導体から成り立っている。このため、カラム中に充填できる多糖類誘導体の量を多くすることが可能となり、一度に光学分割できる量も多くなる。
しかも、多糖類誘導体は架橋により、その機械的強度も飛躍的に大きくされているため、ＨＰＬＣ用分離剤として使用したとしても、その圧力に十分耐えることができる。

図１は、実施例１及び比較例１のそれぞれのクロマトグラフィー用分離剤を充填したカラムを用い、一回当たりの注入される２，２，２−トリフルオロ−１−（９−アンスリル）エタノール（９）のラセミ体の量を変えて光学分割を行ったときのクロマトグラフを示す図である。
図２は、実施例１のクロマトグラフィー用分離剤の走査型電子顕微鏡による二次電子像（写真）である。
図３は、実施例１のクロマトグラフィー用分離剤の走査型電子顕微鏡による二次電子像（写真）である。
図４は、実施例３のクロマトグラフィー用分離剤の走査型電子顕微鏡による二次電子像（写真）である。
図５は、実施例３のクロマトグラフィー用分離剤の走査型電子顕微鏡による二次電子像（写真）である。
図６は、比較例１のクロマトグラフィー用分離剤の走査型電子顕微鏡による二次電子像（写真）である。
図７は、比較例１のクロマトグラフィー用分離剤の走査型電子顕微鏡による二次電子像（写真）である。
図８は、実施例４における架橋後のビーズＡの走査型電子顕微鏡による二次電子像（写真）である。
図９は、実施例４における架橋後のビーズＢの走査型電子顕微鏡による二次電子像（写真）である。
図１０は、実施例４のカラムＡと比較例１のクロマトグラフィー用分離剤を充填したカラムとを用い、一回当たりの注入される２，２，２−トリフルオロ−１−（９−アンスリル）エタノール（９）のラセミ体の量を変えて光学分割を行ったときのクロマトグラフを示す図である。
図１１は、ポロジェンにポリスチレンを用いた実施例５のクロマトグラフィー用分離剤の走査型電子顕微鏡による二次電子像（写真）である。
図１２は、ポロジェンにポリメチルメタクリレートを用いた実施例６のクロマトグラフィー用分離剤の走査型電子顕微鏡による二次電子像（写真）である。
図１３は、ポロジェンにポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを用いた実施例７のクロマトグラフィー用分離剤の走査型電子顕微鏡による二次電子像（写真）である。

以下、本発明について説明する。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、ＨＰＬＣ用に限られるものではなく、超臨界流体クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、キャピラリークロマトグラフィー等、他のクロマトグラフィー用としても用いることができる。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤の原料となる多糖類としては、天然多糖類、合成多糖類及び天然物変性多糖類のいずれも問わず、キラリティーを有するものであれば用いることができる。そのなかでも結合様式が規則正しいものは、より光学異性体の分離能力を高めることが可能となり、好適である。
このような多糖類の代表としてセルロースが挙げられるが、その他に、アミロース、キシラン、キトサン、キチン、マンナン、イヌリン、カードラン、デンプン、デキストラン、アミロペクチン、ブスツラン、グルカン、ガラクタン、レバン、ブルラン、アガロース、アルギン酸等があり、また、アミロースを含有するデンプンも用いることが可能である。それらの中でも、高純度の多糖類として容易に入手することのできるセルロース、アミロース、キシラン、キトサン、キチン、マンナン、イヌリン、カードラン等が好ましく、特にセルロース、アミロースが有利に用いられることとなる。
また、これらの多糖類の数平均重合度（１分子中に含まれるピラノース環あるいはフラノース環の平均数）は、５以上、好ましくは１０以上であり、取り扱いの容易さ等の点から、一般に３，０００以下であることが望ましい。
架橋分子による架橋はピラノース環又はフラノース環の６位の水酸基同士で行われていることが好ましい。発明者らの試験結果によれば、これらの６位の水酸基部分は、光学異性体の分離能にそれほど影響を与えないことが分かっており、この部位を利用して架橋しても、光学異性体の分離能力が低下することはない。また、６位の水酸基は活性に富むため、架橋分子による架橋反応を容易に行うことができる。
ところで、本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、上記のような多糖類に存在する水酸基の内の一部の水酸基同士が架橋剤を介して架橋されているのであるが、架橋剤としては水酸基同士を架橋することが可能ならば、いかなる化合物をも使用することができる。
このような架橋剤としては、例えば、４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート、トリレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート等の１分子に複数のイソシアナート基を有する分子の他、ジカルボン酸やそのハライド、アミド、エステル等を用いることができる。
また、多糖類に存在する水酸基の内の一部の水酸基に塩化アクリロイル、塩化メタクリロイル、塩化ビニルベンゾイル等の不飽和酸ハロゲン化物や、ビニルフェニルイソシアナート等の不飽和イソシアナート類によって重合可能な不飽和基を導入しておき、さらに、スチレン、ジビニルベンゼン、イソプレン等の不飽和炭化水素モノマーや、（メタ）アクリル酸誘導体類等と共重合させることによって架橋させることもできる（特開２００２−１４８２４７号公報参照）。
以上のような架橋剤の中でも、１分子に複数のイソシアナート基を有する化合物は容易に架橋反応が進行するとともに、反応段数も少なく、好適である。
また、多糖類に存在する水酸基の内の架橋されていない水酸基を修飾するための修飾分子としては特に限定はなく、イソシアン酸誘導体、カルボン酸、エステル、酸ハライド、酸アミド、ハロゲン化物、エポキシ化合物、アルデヒド、アルコール等、水酸基を修飾できる化合物であればよい。それらの化合物の中でも、フェニルイソシアナート等の１分子に１つのイソシアナート基を有する化合物が好ましい。こうであれば、水酸基の修飾を簡単な反応操作で、収率よく行うことができる。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、ビーズ形状とされていることが好ましい。こうであれば、カラムに充填したときの充填率を高めることができ、ひいては、光学異性体の分離能力を高いものとすることができる。
本発明において「ビーズ形状」とは、ほぼ球状又は球状の形状であり、例えば２０個程度のクロマトグラフィー用分離剤の粒子の最長直径と最短直径とを測定したときに、最長直径と最短直径との比の平均値が１．０〜５．０、好ましくは１．０〜２．０、より好ましくは１．０〜１．３となる形状である。
また、本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、カラムに充填したときの充填率を高め、光学異性体の分離能力を高める観点から、粒径が１〜１００μｍであることが好ましく、１〜５０μｍであることがより好ましく、３〜２０μｍであることがより一層好ましい。クロマトグラフィー用分離剤の粒径は、例えば分級によって調整することが可能である。
また、本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、空孔を有することが、クロマトグラフィー用分離剤の表面積を大きくし、光学異性体の分離能力を高める観点から好ましい。
また、本発明において、クロマトグラフィー用分離剤の粒子形状や粒径は、例えば走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影されたクロマトグラフィー用分離剤の画像から求めることが可能である。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、次のようにして製造することができる。すなわち、本発明のクロマトグラフィー用分離剤の第１の製造方法は、多糖類に存在する水酸基の内の一部の水酸基に保護基を導入する保護基導入工程と、該保護基が導入された多糖類に残存する水酸基に修飾分子を修飾する修飾工程と、導入された保護基を脱離させて水酸基を再生させる脱離工程と、再生された該水酸基同士を架橋分子によって架橋する架橋工程とを有することを特徴とする。
こうして保護基導入工程によって保護基を導入することにより、所定の水酸基に確実に修飾分子及び架橋分子を結合させることが可能となる。
保護基導入工程において導入される保護基は、修飾工程において水酸基を修飾する修飾分子よりも容易に水酸基から脱離させることが可能な基であれば特に限定されない。このような保護基を水酸基に導入するための化合物には、例えば修飾分子を用いることができる。保護基を導入するための化合物は、例えば保護や修飾の対象となる水酸基の反応性や前記化合物の水酸基に対する反応性に基づいて決定することができる。
水酸基への保護基の導入、修飾分子による水酸基の修飾、及び架橋分子による水酸基同士の架橋は、水酸基と反応させる化合物の種類に応じた公知の適当な反応によって行うことができる。また脱離工程における前記保護基の水酸基からの脱離は、特に限定されず、例えば酸やアルカリによる加水分解等の公知の方法によって行うことができる。
なお、架橋工程においては、再生された水酸基のすべてを架橋分子によって架橋することも可能ではあるが、部分的に架橋することもできる。この場合、残った水酸基は、修飾工程と同様の操作によって修飾することが好ましい。
本発明では、前述した工程に加えて、前記脱離工程において水酸基を再生させた再生多糖類誘導体を溶媒に溶解する工程と、得られた再生多糖類誘導体溶液にポロジェンを分散させる工程と、ポロジェンを分散させた前記再生多糖類誘導体溶液を所望の形状に維持しながら前記溶媒を除去して所望の形状の再生多糖類誘導体を形成する工程と、形成された再生多糖類誘導体を、ポロジェンを溶解する洗浄溶媒で洗浄する工程と、をさらに含むことにより、空孔を有するクロマトグラフィー用分離剤を製造することができる。
前記ポロジェンは、前記再生多糖類誘導体溶液中に分散可能な固体の化合物であって、多糖類誘導体とは別に溶かすことができる固体の化合物である。このようなポロジェンには、種々の有機化合物及び無機化合物を用いることが可能であるが、再生多糖類誘導体溶液中への分散性や、後述するビーズ形成時の再生多糖類誘導体溶液の液滴の安定性等の観点から、有機化合物を用いることが好ましい。このような有機化合物には、ポリスチレン等の種々のポリマーを用いることができる。
前記再生多糖類誘導体溶液に用いられる溶媒は、脱離工程において水酸基を再生させた前記再生多糖類誘導体を溶解できる溶媒であれば良い。前記再生多糖類誘導体溶液は、例えば所望の形状の容器に収容することや、後述するビーズの形成のように、液滴を形成する等の種々の方法によって、所望の形状に維持することができる。またポロジェンを分散させた前記再生多糖類誘導体溶液をカラム管に収容しても良い。前記再生多糖類誘導体溶液からの溶媒の除去は、加熱や減圧、及びこれら両方によって行うことができる。
所望の形状に形成された再生多糖類誘導体からポロジェンを溶解する洗浄溶媒には、ポロジェンを溶解する溶媒であれば良いが、多糖類誘導体を溶解せずにポロジェンのみを溶解する溶媒が好ましく、多糖類誘導体よりもポロジェンに対する溶解性が高い溶媒がより好ましく、ポロジェンのみを溶解する溶媒であることがより一層好ましい。このような洗浄溶媒は、多糖類誘導体及びポロジェンの種類やこれらに対する溶媒の溶解性等に応じて、公知の溶媒の中から選ぶことができる。
また、架橋工程は、修飾工程において水酸基を再生させた再生多糖類誘導体を溶媒に溶解して再生多糖類誘導体溶液とし、界面活性剤の溶液中に該再生多糖類誘導体溶液を滴下し、さらに攪拌することによってビーズ形状の再生多糖類誘導体とするビーズ形成工程と、ビーズ形状の再生多糖類誘導体に架橋分子を架橋してビーズ形状のクロマトグラフィー用分離剤とするビーズ架橋工程とからなることが好ましい。発明者らの試験結果によれば、こうした方法によってビーズ形状のクロマトグラフィー用分離剤を容易に製造することができる。
前記ビーズ形成工程において前記再生多糖類誘導体溶液に用いられる溶媒は、脱離工程において水酸基を再生させた前記再生多糖類誘導体を溶解できる溶媒であれば良い。この溶媒が前記界面活性剤の溶液に溶解する場合では、本発明では、界面活性剤の溶液に対して非溶性又は難溶性の助溶媒をさらに用いて前記再生多糖類誘導体溶液とすることができる。前記助溶媒を含有していても良い前記再生多糖類誘導体溶液を前記界面活性剤の溶液に滴下することによって、前記界面活性剤の溶液中に前記再生多糖類誘導体溶液の液滴を形成することができ、さらに再生多糖類誘導体溶液から溶媒（及び／又は助溶媒）を留去させることによって、ビーズ形状の多糖類誘導体を形成することができる。
前記界面活性剤は、前記界面活性剤の溶液中に形成される前記再生多糖類誘導体溶液の液滴を安定して存在させることができる化合物であれば特に限定されない。このような界面活性剤には、例えばアニオン界面活性剤を用いることができる。
なお、前記ビーズ架橋工程は、前記架橋工程と同様に行うことができる。
本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、次のようにして製造することもできる。すなわち、本発明のクロマトグラフィー用分離剤の第２の製造方法は、多糖類に存在する水酸基の内の一部の水酸基同士を架橋分子によって架橋する架橋工程と、該架橋分子によって架橋された多糖類に残存する水酸基に修飾分子を修飾する修飾工程とを有することを特徴とする。
この方法によれば、保護基をわざわざ導入する必要がなく、工程数を減らすことができる。このため、製造コストの低廉化を図ることができる。また。ビーズ形状の多糖類は市販されており、この市販のビーズ形状の多糖類を用いて、ビーズ形状のクロマトグラフィー用分離剤を安価かつ大量に供給することができる。
また、本発明では、一分子中に複数のイソシアナート基を有する化合物のように、多糖類又は多糖類誘導体の水酸基に対して結合する架橋部位を一分子中に複数有する化合物を前記架橋工程において架橋剤に用いる場合では、架橋後の多糖類又は多糖類誘導体におけるフリーの前記架橋部位を修飾する工程をさらに含むことが可能である。このような工程によれば、光学分割時において、前記フリーの架橋部位と光学異性体との相互作用を抑制することが可能となる。
前記架橋部位の修飾は、架橋部位と相互作用を呈すると思われる光学分割の対象となる光学異性体に応じて異なるが、通常は極性の低い置換基を用いて行うことが好ましく、また前記架橋部位に対する立体障害性を高める観点から嵩高い置換基を用いて行うことが好ましい。このような置換基としては、例えばｔ−ブチル基やトリチル基等の分岐構造を有する炭化水素基が挙げられる。このような置換基による前記架橋部位の修飾は、前述した保護基導入工程や修飾工程等と同様に、例えば縮合反応等の公知の適当な反応によって行うことができる。
また、本発明では、前記ビーズ形成工程において、前記再生多糖類誘導体溶液にポロジェンを分散させ、ポロジェンを含有する前記再生多糖類誘導体溶液を前記界面活性剤の溶液に滴下して、ポロジェンを含有するビーズ形状の再生多糖類誘導体（ポロジェン含有ビーズ）を形成し、このポロジェン含有ビーズを前記洗浄溶媒で洗浄し、ポロジェン含有ビーズのポロジェンを溶解することによって、クロマトグラフィー用分離剤を製造することも可能である。
このような操作によれば、ビーズ形状のクロマトグラフィー用分離剤に多数の空孔を形成することが可能となり、クロマトグラフィー用分離剤の表面積を増やし、又は調整することが可能となる。これにより光学分割能の増加や調整を図ることができる。
なお、ポロジェンを用いる場合、ポロジェンの溶解は、前記所望の形状のクロマトグラフィー用分離剤を製造する場合では架橋工程の前でも良いし後でも良く、またビーズ形状のクロマトグラフィー用分離剤を製造する場合ではビーズ架橋工程の前でも良いし後でも良い。
以下、本発明を具体化した実施例１〜７を説明する。

実施例１のクロマトグラフィー用分離剤は、原料となる多糖類としてセルロースを用いたビーズ形状ものであり、以下のようにして製造した。
＜保護基導入工程＞
まず保護基導入工程として、式（１）に示すように、６位の水酸基のトリチル化を行った。

すなわち、乾燥させたセルロース１３ｇ（８６ｍｍｏｌ）に塩化リチウム ９．２ｇと乾燥Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド１３５ｍｌを加え、窒素雰囲気下、１００℃で１３７時間膨潤させた後、トリフェニルメチルクロライド５０ｇ（１８０ｍｍｏｌ）とピリジン２００ｍｌとを加え、１００℃で２８時間反応させた。ピリジン可溶部をメタノール中に滴下して不溶部を回収した後、真空乾燥を行い、グルコース環の６位の水酸基がトリチル化されたセルロース誘導体を得た。
＜修飾工程＞
次に、こうしてトリチル化されたセルロース誘導体に対し、式（２）に示すように、残存する水酸基のカルバモイル化を行った。

すなわち、保護基導入工程によって６位の水酸基がトリチル化されたセルロース誘導体１７ｇをピリジン１６０ｍｌに溶かし、窒素雰囲気下で３，５−ジメチルフェニルイソシアナート１９ｇ（１２８ｍｍｏｌ）を加え８０℃で２０時間反応させた。反応溶液をサンプリングして赤外吸収スペクトルを測定し、溶液中の未反応のイソシアナートの存在を確認した後、反応溶液をメタノールに滴下して不溶物を回収し、真空乾燥して、セルロース ２，３−ビス（３，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−６−Ｏ−トリチルセルロース２８ｇを得た。
＜脱離工程＞
さらに、こうして水酸基がカルバモイル化されたセルロース誘導体から、式（３）に示すようにトリチル基を脱離させた。

すなわち、修飾工程によって得られた２，３−ビス（３，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−６−Ｏ−トリチルセルロースを１％ＨＣｌ／メタノール５００ｍｌ中で２４時間攪拌して脱保護を行って、６位を水酸基に戻した。その後、反応液をガラスフィルターでろ過しながらメタノールで洗浄し、真空乾燥を行い、セルロース ２，３−ビス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）２０ｇを得た。
但し、６位の水酸基の存在率を１Ｈ ＮＭＲスペクトルから算出したところ６３％程度であり、残りは３，５−ジメチルフェニルイソシアナートによってカルバメート化されていた。以下この誘導体を「ＯＤ（６−ＯＨ）−６３」と略す。
＜ビーズ形成工程＞
こうして得られたＯＤ（６−ＯＨ）−６３をテトラヒドロフランに溶解させ、さらに少量のヘプタノールを加えた。次に、この溶液をラウリル硫酸ナトリウムの水溶液へ、６枚羽根型のスクリューが取り付けられたディスパーザーで前記水溶液を攪拌しながら滴下した。滴下終了後、前記水溶液が入った容器を収容した水浴の温度を室温から７５℃まで上昇させてテトラヒドロフランを留去させ、生成したビーズを吸引ろ過で回収し、水とエタノールで洗浄した。洗浄後、真空乾燥を行い、ＯＤ（６−ＯＨ）−６３からなるビーズを得た。なお、容器にはビーカーを使用した。こうしてＯＤ（６−ＯＨ）−６３からなるビーズ
を製造した結果を表１に示す。

＜ビーズ架橋工程＞
そして、脱離工程において再生させた水酸基に対して、式（４）に示すように架橋反応を行った。

すなわち、乾燥させたＯＤ（６−ＯＨ）−６３からなるビーズ０．９１ｇに窒素雰囲気下でトルエン１０ｍｌを加え、８０℃で３時間加熱してビーズを膨潤させた後、４，４’−ジフェニルメタンジイソシアナート０．１３ｇ（０．５２ｍｍｏｌ）を加えて６時間反応させた。少量のビーズをサンプリングしてテトラヒドロフランに不溶となったことを確認した後、過剰量の３，５−ジメチルフェニルイソシアナート０．５ｇ（３．４ｍｍｏｌ）を加え１４時間反応させた。ＩＲ測定によって未反応のイソシアナートが存在することを確認した後、吸引ろ過をしてビーズを回収し、吸引しながら温めたメタノールで洗浄し、生成した尿素を除去した。ＩＲによって尿素が存在しないことを確認した後、真空乾燥して６位の水酸基が３０％架橋された実施例１のビーズ０．８８ｇを得た。

実施例２のクロマトグラフィー用分離剤は、実施例１と同様の工程によって得たＯＤ（６−ＯＨ）−６３からなるビーズに対し、水酸基の１５％が架橋される量の４，４’−ジフェニルメタンジイソシアナートによって架橋反応を行ったものである。他の操作は実施例１のビーズの製法と同様である。

実施例３のクロマトグラフィー用分離剤は、原料となる多糖類としてビーズ状のセルロースを用い、以下のようにして製造された。
すなわち、市販のセルロースビーズ（チッソ株式会社、商品名「Ｃｅｌｌｆｌｏｗ Ｃ−２５」）１．０ｇ（６．３ｍｍｏｌ）に塩化リチウム０．６８ｇとＮ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド１０ｍｌを加え、窒素雰囲気下、８０℃で６０時間膨潤させたのち、ピリジン１０ｍｌと４，４’−ジフェニルメタンジイソシアナート０．４７ｇ（１．９ｍｍｏｌ）を加えてゲル化させた。さらにピリジン１０ｍｌを加え、３，５−ジメチルフェニルイソシアナート３．８ｇ（２６ｍｍｏｌ）を加えて２２時間反応させた。ＩＲにより未反応のイソシアナートが存在することを確認した後、吸引ろ過しながら温めたメタノールで洗浄し、ビーズを回収した。このビーズを真空乾燥して６位の水酸基が３０％架橋された実施例３のビーズ１．５ｇを得た。
（比較例１）
比較例１のクロマトグラフィー用分離剤は、セルロースの３，５−ジメチルフェニルカルバメート誘導体をシリカゲル上に担持させたものであり、以下のようにして製造した。すなわち、多孔性シリカゲル（粒形７μｍ、孔径１００ｎｍ）を乾燥後、ベンゼン中、８０℃触媒量のピリジンの存在下、３−アミノプロピルトリエトキシシランと反応させた後、これをメタノール、アセトン、ヘキサンで洗浄し、さらに乾燥させた。こうしてアミノプロピル基で修飾されたシリカゲル３ｇに、セルロース トリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）のテトラヒドロフラン溶液（０．７５ｇ／１０ｍｌ）を少量ずつ添加しながらふりまぜた後、溶媒のテトラヒドロフランを減圧下で留去することで、セルロースの３，５−ジメチルフェニルカルバメート誘導体をシリカゲル上に担持させた比較例１のクロマトグラフィー用分離剤を得た。
評 価
（光学分割試験１）
実施例１〜３のクロマトグラフィー用分離剤について、篩分によって３μｍ〜１５μｍの粒径のものを分取し、長さ２５ｃｍ、内径０．２ｃｍのステンレス−スチール製のカラムにスラリー法を用いて充填した。充填にあたっては、分取した実施例１〜３のクロマトグラフィー用分離剤をヘキサン／流動パラフィン（２／１）３０ｍｌに分散させ、溶媒としてヘキサン／２−プロパノール（９／１）を用い、充填圧力は５０ｋｇ／ｃｍ^２（４．９ＭＰａ）とした。
なお、実施例１については、充填圧力を１００ｋｇ／ｃｍ^２（９．８ＭＰａ）としたカラムも作製した。
また、比較例１のクロマトグラフィー用分離剤についても、同様のカラムを用い同様の操作で充填した。ただし、充填圧力は始めの数分を４００ｋｇ／ｃｍ^２とし、その後１００ｋｇ／ｃｍ^２とした。
また、比較例１のクロマトグラフィー用分離剤は、長さ２５ｃｍ、内径０．４６ｃｍ及び、長さ２５ｃｍ、内径０．２ｃｍのステンレス−スチール製のカラムにスラリー法を用いて充填した。
上記の操作で得られた実施例１〜３及び比較例１のクロマトグラフィー用分離剤を充填したカラムを用い、以下の構造式１から１０に示す１０種類のラセミ体について光学分割試験を行った。

溶離液はヘキサン／２−プロパノール＝９／１とし、流速は実施例１〜３では０．２ｍｌ／ｍｉｎとし、比較例１では内径０．４６ｃｍのカラムでは０．５ｍｌ／ｍｉｎとし、内径０．２ｃｍのカラムでは０．１ｍｌ／ｍｉｎとした。ＵＶ検出器と旋光検出器とを併用して検出を行った。理論段数Ｎはベンゼンのピークから求め、溶離液がカラムを通過する時間ｔ_０は１，３，５−トリ−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼンの溶出時間から求めた。なお、充填前後のビーズのＳＥＭ観察では、充填時の加圧によるビーズの変形などは見られなかった。結果を表２に示す。

表２中のＫ_１’は容量比を示し、αは分離係数を示す。かっこの中の符号は先に溶出したエナンチオマーの旋光性を示す。表２から、実施例１〜３の容量比ｋ_１’は、比較例１のｋ_１’と比べて２．５倍〜３倍であることが分かる。これは、実施例１〜３のクロマトグラフィー用分離剤は、担体を使用していないことによるものと考えられる。したがって、実施例１〜３のクロマトグラフィー用分離剤は、１度に
よりたくさんの量の光学分割を行うことが可能であると推定される。
また、理論段数の測定結果を表３に示す。

この表から分かるように、充填圧力５０ｋｇ／ｃｍ^２で実施例１のクロマトグラフィー用分離剤を充填したカラムにおいて、比較例１の理論段数を上回った。
（光学分割試験２）
長さ２５ｃｍ、内径０．２ｃｍのステンレス−スチール製のカラムを用い、５０ｋｇ／ｃｍ^２の充填圧力で充填した実施例１のクロマトグラフィー用分離剤及び比較例１のクロマトグラフィー用分離剤について、光学異性体をワンショットで分離できる最大量を求めた。
すなわち、２，２，２−トリフルオロ−１−（９−アンスリル）エタノールのラセミ体を溶離液と同じ組成の溶媒に溶かして１０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製する。これらの溶液を用いて光学分割を行い、得られたチャートにおいて２つのエナンチオマーのピークが重なった時のラセミ体の量を、そのカラムが分割できる最大量とした。結果を図１に示す。
図１から分かるように、比較例１の内径０．２ｃｍのカラムを用いた場合では、６ｍｇまでしか分離ができなかったのに対し、実施例１では８ｍｇまで、ほぼ完全に分離することができた。
（走査型電子顕微鏡による観察）
実施例１、３及び比較例１について、走査型電子顕微鏡による写真撮影を行った。その結果、図２〜図７に示すように、実施例１及び実施例３のクロマトグラフィー用分離剤は、比較例１のそれと同様、ビーズ形状とされていることが分かった。

（ａ）６位に水酸基を有するセルロース ３，５−ジメチルフェニルカルバメー トの合成
まずビーズの材料として、後にジイソシアナートを用いて架橋させるために、６位に水酸基を残したセルロースの３，５−ジメチルフェニルカルバメート誘導体、ＯＤ（６−ＯＨ）を合成した。

乾燥させたセルロース１０ｇ（６２ｍｍｏｌ）に塩化リチウム１５ｇと脱水Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド１５０ｍｌを加え、窒素雰囲気下、８０℃で２７時間膨潤させた後、トリフェニルメチルクロライド３２ｇ（１１４ｍｍｏｌ）とピリジン１５０ｍｌとを加え、８０℃で２４時間反応させた。ピリジン可溶部をメタノール中に滴下して不溶部として回収した後、真空乾燥を行った。
得られた誘導体は、グルコース環の６位の水酸基が完全にトリチル化されていなかったため、再度この誘導体に、塩化リチウム１５ｇと脱水Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド１５０ｍｌを加え、窒素雰囲気下、８０℃で２４時間膨潤させた後、トリフェニルメチルクロライド１７ｇ（６２ｍｍｏｌ）とピリジン１５０ｍｌとを加え、８０℃で２４時間反応させた。ピリジン可溶部をメタノール中に滴下して不溶部を回収した後、真空乾燥を行い、グルコース環の６位の水酸基がトリチル化されたセルロース誘導体を得た。
次に、得られた誘導体２１ｇをピリジン１９０ｍｌに溶かし、窒素雰囲気下で３，５−ジメチルフェニルイソシアナート２２ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を加え８０℃で３０時間反応させた。反応溶液をサンプリングして赤外吸収スペクトルを測定し、溶液中の未反応のイソシアナートの存在を確認した後、反応溶液をメタノールに滴下して不溶物を回収し、セルロース ２，３−ビス（３，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−６−Ｏ−トリチルセルロースを得た。
次に、この誘導体を、１％ＨＣｌ／メタノール１，５００ｍｌ中で２４時間攪拌して脱保護を行って、６位を水酸基に戻した。メタノールで洗浄後、真空乾燥を行い、目的のセルロース ２，３−ビス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）を２４ｇ得た。
ＯＤ（６−ＯＨ）−２５の合成
次に、得られた誘導体のうち、１０ｇ（２２ｍｍｏｌ）をピリジン６５ｍｌに溶かし、窒素雰囲気下で３，５−ジメチルフェニルイソシアナート２．５ｇ（１．７ｍｍｏｌ）を加え８０℃で１８時間反応させた。反応溶液をメタノールに滴下して不溶物を回収し、真空乾燥を行った。反応前の誘導体と３，５−ジメチルフェニルイソシアナートとの仕込み比より、グルコース環の６位の水酸基が２５％程度残っていることになり、以下この誘導体をＯＤ（６−ＯＨ）−２５とする。
（ｂ）ＯＤ（６−ＯＨ）−２５ビーズの調製
０．２５ｇのＯＤ（６−ＯＨ）−２５をテトラヒドロフラン／ヘプタノール（２／１，ｖ／ｖ）混合溶媒３０ｍｌに溶かした。０．２％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液５００ｍｌが入った容器を収容している水浴の温度を７５℃にあげ、０．２％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液５００ｍｌをディスパーザーで、シャフト回転数１１００ｒｐｍで攪拌しながら、前記ＯＤ（６−ＯＨ）−２５の溶液を前記水溶液に滴下した。滴下後も水浴の温度を７５℃に保ち、テトラヒドロフランを留去させ、生成したビーズを吸引ろ過で回収し、水とエタノールで洗浄した。洗浄後、真空乾燥を行い、ＯＤ（６−ＯＨ）−２５のビーズを得た。このときビーズの収率はおよそ８７％であった。この操作を繰り返したものを、２０μｍのフィルターで分別することで、粒径３〜１０μｍ程度のビーズを回収した。
ディスパーザーのシャフトには６枚羽根型を、また容器には１リットルビーカーを用いた。得られたビーズについて走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による観察を行った。
（ｃ）ＯＤ（６−ＯＨ）−２５ビーズのジイソシアナートによる架橋
得られたＯＤ（６−ＯＨ）−２５ビーズに強度を持たせるために、６位の水酸基と４，４’−ジフェニルメタンジイソシアナートを反応させて、ビーズ内で架橋を行った。

架橋ビーズの調製（カラムＡ用）
乾燥させたＯＤ（６−ＯＨ）−２５ビーズ１．８３ｇに窒素雰囲気下でトルエン２０ｍｌを加え、８０℃で４時間加熱してビーズを膨潤させた後、過剰量の４，４’−ジフェニルメタンジイソシアナート０．３ｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加えて８０℃で２４時間反応させた。上澄み液を液体ＩＲで測定して未反応のイソシアナートの存在を確認し、また少量のビーズをサンプリングしてテトラヒドロフランに不溶となったことを確認した後、吸引ろ過をしてビーズを回収し、過剰のイソシアナートから生成した尿素を取り除くため、吸引しながら温めたメタノールで洗浄した。ビーズを固体ＩＲにより測定し、尿素が存在しないことを確認した後、真空乾燥して６位の水酸基を２５％架橋したビーズ（以下ビーズＡとする）１．８３ｇを得た。
架橋ビーズの調製（カラムＢ用）
乾燥させたＯＤ（６−ＯＨ）−２５ビーズ１．０ｇに窒素雰囲気下でトルエン１１ｍｌを加え、８０℃で４．５時間加熱してビーズを膨潤させた後、過剰量の４，４’−ジフェニルメタンジイソシアナート０．１４ｇ（０．５６ｍｍｏｌ）を加えて８０℃で１５時間反応させた。上澄み液を液体ＩＲで測定して未反応のイソシアナートの存在を確認し、また少量のビーズをサンプリングしてテトラヒドロフランに不溶となったことを確認した後、残りのイソシアナートを修飾するため、過剰量のｔｅｒｔ−ブタノール１０ｍｌを加え３時間反応させた。
上澄み液を液体ＩＲで測定してイソシアナートの存在がなくなったことを確認した後、吸引ろ過をしてビーズを回収し、イソシアナートとｔｅｒｔ−ブタノールから生成した尿素を取り除くため、吸引しながら温めたメタノールで洗浄した。ビーズを固体ＩＲにより測定し、尿素が存在しないことを確認し、真空乾燥して６位の水酸基を２５％架橋したビーズ（以下ビーズＢとする）１．０ｇを得た。
ビーズＡの調製とは異なり、ビーズＢの調製では、４，４’−ジフェニルメタンジイソシアナートの二つのイソシアナートのうち一方だけしか誘導体と反応していないものを、嵩高いアルコールで修飾するために、ｔｅｒｔ−ブタノールで処理した。このことによりビーズＢとラセミ体の光学分割に関与する相互作用が、余分な相互作用に邪魔されず、より効果的に働くと期待される。
ＯＤ（６−ＯＨ）−２５ビーズの観察
反応前後のビーズＡ、ＢのＳＥＭ観察では、反応前後でのビーズの大きさや表面の状態には変化がないことがわかった。架橋後のビーズＡ、ＢのＳＥＭ画像を図８、図９に示す。
（ｄ）ビーズのカラムへの充填
得られた二種のビーズＡ、Ｂを粒径分別した後に、ヘキサン／流動パラフィン（２／１）３０ｍｌに分散させ、ヘキサン／２−プロパノール（９／１）を溶離液に用いて、ＨＰＬＣ用ポンプで圧力を３〜３０ｋｇ／ｃｍ^２かけ、長さ２５ｃｍ、内径０．２ｃｍのステンレス−スチール製のカラムにスラリー法により充填した。それぞれカラムＡ、Ｂとする。
カラムへ充填されたビーズの観察
各カラム中に含まれるビーズの質量と、表面積、理論段数（Ｎ）、充填時間を以下の表４に示す。なお。充填前後のビーズをＳＥＭで観察したところ、充填時の加圧によるビーズの変形などは見られなかった。

（ｅ）光学分割能の評価
上記の操作で得られた２種のビーズのカラムを用いて、先に示した構造式１〜１０の１０種のラセミ体の光学分割を行った。溶離液にはヘキサン／２−プロパノール＝９／１を用いて、流速は０．１ｍｌ／ｍｉｎとし、ＵＶ検出器と旋光検出器を用いてピークの検出、同定を行った。なお、理論段数Ｎはベンゼンのピークから求め、また溶離液がカラムを素通りする時間ｔ_０は１，３，５−トリ−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼンの溶出時間から求めた。
光学分割能の評価の結果
カラムＡ、Ｂによる先に示したラセミ体の光学分割の結果を表５に示す。また比較のため、３，５−ジメチルフェニルカルバメート誘導体をシリカゲル上に担持した充填剤（比較例１）による光学分割の結果も合わせて載せた。表中の値は容量比ｋ_１’と分離係数αで、かっこの中の符号は先に溶出したエナンチオマーの旋光性である。

カラムＡとカラムＢの結果を比較すると、カラムＢは誘導体が多く充填されているにも関わらず、容量比ｋ_１’が全体的に小さくなり、分離係数αが全体的に大きくなった。これは、カラムＢがｔｅｒｔ−ブタノールで処理されており、ラセミ体の分離を邪魔する相互作用がなくなったためであると考えられる。
また、全てのビーズカラムの溶出順序については通常の担持型と同じであった。容量比ｋ_１’については、シリカゲルに担持したものと比べて２．５〜４倍大きくなる結果が得られた。これは、シリカゲルを用いないことでよりたくさんのセルロース誘導体をカラム中に導入することができたためであると考えられ、一度によりたくさんのラセミ体を分割可能であることが期待される。
（ｆ）２，２，２−トリフルオロ−１−（９−アンスリル）エタノールの大量分 割
ビーズを充填したカラムには、従来のシリカゲル担持型の同サイズのカラムと比較してカラム中により多くの多糖類誘導体が存在しており、シリカゲル担持型カラムよりも一度に分割可能なラセミ体の量が多いことが期待される。そこでカラムＡと、シリカゲル担持型カラムを用いて、一度に分割可能なラセミ体 ２，２，２−トリフルオロ−１−（９−アンスリル）エタノール（９）について調べた。
この際、このラセミ体を溶離液と同じ組成の溶媒に溶かして調製した１２０ｍｇ／ｍｌの溶液を用いて光学分割を行った。カラムには長さ２５ｃｍ、内径０．２ｃｍのカラムを用い、溶離液にはヘキサン／２−プロパノール（９／１）を用い、溶離液の流速は、シリカゲル担持型カラムでは０．２０ｍｌ／ｍｉｎとし、カラムＡでは０．１５ｍｌ／ｍｉｎとした。得られたチャートにおいて二つのエナンチオマーのピークが重なった時のラセミ体の量を、そのカラムが分割できる最大量とした。
２，２，２−トリフルオロ−１−（９−アンスリル）エタノールの大量分割の結 果
ラセミ体 ２，２，２−トリフルオロ−１−（９−アンスリル）エタノールの大量分割を行った結果をそれぞれ図１０に示す。測定波長は２７１ｎｍとした。その結果、担持型では６ｍｇ、カラムＡでは２０ｍｇを打ち込んだところで二つのピークが重なった。

実施例５〜７

空孔を有するセルロース誘導体ビーズの調製
セルロース誘導体ビーズを調製する際に、セルロース誘導体のＴＨＦ／１−ヘプタノール混合溶液に、ポロジェンとしてポリマーを添加し、これをラウリル硫酸ナトリウム水溶液に攪拌しながら滴下、その後加熱によりＴＨＦを留去し、得られたビーズをポロジェンに用いたポリマーを溶解する溶媒で洗浄してポロジェンを洗い流したところ、ビーズ内に空孔が認められた。空孔の数や大きさは、用いるポロジェンの種類や濃度により変化した。
６位の一部に水酸基を有するセルロース ３，５−ジメチルフェニルカルバメート２５ｍｇをテトラヒドロフラン／ヘプタノール（２／１，ｖ／ｖ）混合溶媒３ｍｌに溶かし、そこへポロジェンに用いるポリマーをセルロース誘導体に対して約２０質量％の割合で溶かした。０．２％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液１００ｍｌが入った容器を収容した水浴の温度を７５℃にあげ、０．２％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液１００ｍｌをディスパーザーで、シャフト回転数１１００ｒｐｍで攪拌しながら、前記ＯＤ（６−ＯＨ）−２５の溶液を前記水溶液に滴下した。
滴下後も水浴の温度を７５℃に保ち、テトラヒドロフランを留去させ、生成したビーズを吸引ろ過で回収し、水、エタノール、そしてポロジェンのみを溶解する溶媒で洗浄した。洗浄後、真空乾燥を行い、粒径３〜１２μｍ程度の空孔を有するセルロース誘導体ビーズを得た。
ディスパーザーのシャフトには、６枚羽根型を、また容器には２００ミリリットルビーカーを用いた。また、ポロジェンにはポリスチレン（ＰＳｔ、分子量：１７，０００、Ｍｗ／Ｍｎ：１．０３）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、分子量：４２，０００、Ｍｗ／Ｍｎ：１．４０）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ、分子量：２８，０００、Ｍｗ／Ｍｎ：１．８５）を用いた。
得られたビーズについて走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による観察を行った。得られたビーズのＳＥＭ画像を図１１〜１３に示す。

産業上の利用の可能性

本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、多糖類誘導体が架橋分子によって架橋されていることから、耐溶媒性が格段に向上し、また機械的強度も向上し、従来のクロマトグラフィー用分離剤に比べて、より溶出力の強い溶媒を用いることができ、またＨＰＬＣ等の高圧条件下でも十分に使用することができる。
また、本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、担体を使用していないことから、カラム中に充填できる多糖類誘導体の量を多くすることができ、一度に光学分割できる量を多くすることができ、例えば光学異性体の工業的な製造における生産性をより一層高めることができる。

Claims (2)

1. 多糖類に存在する水酸基の内の一部の水酸基に保護基を導入する保護基導入工程と、
   該保護基が導入された多糖類に残存する水酸基に修飾分子を修飾する修飾工程と、
   導入された保護基を脱離させて水酸基を再生させる脱離工程と、
   再生された該水酸基同士を、多糖類誘導体の水酸基に対して結合する架橋部位を一分子中に複数有する架橋分子によって架橋する架橋工程と、
   架橋後の多糖類誘導体におけるフリーの前記架橋部位を、分岐構造を有する炭化水素基を用いて修飾する工程を有し、
   架橋工程は、
   脱離工程において水酸基を再生させた再生多糖類誘導体を溶媒に溶解して再生多糖類誘導体溶液とし、界面活性剤の溶液中に該再生多糖類誘導体溶液を滴下しさらに攪拌することによってビーズ形状の再生多糖類誘導体とするビーズ形成工程と、
   ビーズ形状の再生多糖類誘導体に架橋分子を架橋してビーズ形状のクロマトグラフィー用分離剤とするビーズ架橋工程とからなることを特徴とする、多糖類誘導体が担体に担持されていないクロマトグラフィー用分離剤の製造方法。
2. ビーズ形成工程における前記再生多糖類誘導体溶液にポロジェンを分散させ、
   前記ビーズ形状の再生多糖類誘導体を、ポロジェンを溶解する洗浄溶媒で洗浄する工程をさらに含むことを請求項１記載のクロマトグラフィー用分離剤の製造方法。

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