CN1774292B - 色谱分离剂及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

色谱分离剂，它包括具有其中存在于多糖类中的一部分羟基通过交联分子彼此交联和存在于多糖类中的未交联羟基各自用改性分子改性的结构的多糖类衍生物。该多糖类衍生物不是以担载于载体的状态存在，并且已经成形为例如珠粒。该分离剂在洗脱溶剂中不容易溶解，可以一次光学离析大量化合物。它能够耐受高压。

Description

色谱分离剂及其生产方法
技术领域
本发明涉及色谱分离剂(separating agent)，更具体地涉及适合用作分离旋光异构体的高效液相色谱法(下文缩写为“HPLC”)的分离剂的色谱分离剂。
背景技术
通常，利用多糖类衍生物的手性的色谱分离剂是众所周知的。用作色谱分离剂的多糖类衍生物的实例是纤维素或直链淀粉的酯衍生物或氨基甲酸酯衍生物。该多糖类衍生物通过担载于载体比如硅胶上而用作色谱分离剂，用于增加分离剂在柱子中的填充比，方便它的处理，增强它的机械强度等。
使用担载于载体上的多糖类衍生物的这种色谱分离剂具有高的旋光异构体分离能力，并且不仅用于旋光异构体的分析，而且用于旋光异构体的大规模制备分离，比如在各种药物的制备中。
然而，采用多糖类衍生物的现有色谱分离剂具有仅仅通过物理吸附担载于载体上的多糖类衍生物。因此，因洗脱溶剂的种类不同，该多糖类衍生物可能溶于洗脱溶剂中从而变得不能使用。
尤其，旋光异构体的大规模分离要求原料在分离之前以高浓度溶于洗脱溶剂。能够进行这种溶解的洗脱溶剂存在的问题是多糖类衍生物在洗脱溶剂中的溶解性通常是高的。
此外，多糖类衍生物具有低机械强度，因此存在的问题是，当该多糖类衍生物尤其用作HPLC的分离剂时，该多糖类衍生物不能耐受HPLC中的压力。
为了避免此类问题，人们尝试了将多糖类衍生物以化学键连接于载体的表面，用于防止多糖类衍生物在洗脱溶剂中洗脱，以及提高多糖类衍生物的机械强度。
例如，JP-A-04-202141公开了通过具有经酯键或脲烷键引入到多糖类的羟基上的乙烯基的多糖类衍生物和具有以化学键连接的乙烯基的载体的共聚，从而使多糖类衍生物和载体以化学键连接而获得的色谱分离剂。
此外，在JP-B-07030122中，本发明的发明人此前提出了通过经由异氰酸酯化合物使多糖类衍生物以化学键连接于硅胶，从而防止多糖类衍生物在洗脱溶剂中洗脱所获得的色谱分离剂。
在JP-A-11-171800中，本发明的发明人提出了通过经由苯乙烯和二乙烯基苯在担载了纤维素衍生物的硅胶上的共聚而形成三维网络结构来防止纤维素衍生物在洗脱溶剂中的洗脱。
然而，在上述各专利文件中公开的色谱分离剂不能完全防止固定于载体上的多糖类衍生物在洗脱溶剂中的洗脱。
在这方面，本发明的发明人在JP-A-2002-148247中已经提出了通过下列步骤获得的具有高的多糖类衍生物在硅胶上的固定比的色谱分离剂：预先将可聚合的不饱和基团引入到多糖类衍生物中；制备通过硅烷偶联剂引入了2-甲基丙烯酰氧基乙基的硅胶；以及通过共聚使多糖类衍生物和硅胶化学键合。
该色谱分离剂几乎能完全防止多糖类衍生物在洗脱溶剂中的洗脱，具有优异的旋光异构体分离能力，并且具有高的机械强度。
然而，在上述专利文件中披露的色谱分离剂中，只有多糖类衍生物具有分离旋光异构体所必需的手性，而不具有手性的载体比如硅胶不直接协助旋光异构体的分离。因此，在将色谱分离剂填充到柱子中的情况下，一次可以光学拆分的化合物的量将减少硅胶等载体所占的分量。
发明内容
考虑到以往的情况，提出了本发明，所要完成的本发明的目的是提供：能够防止在洗脱溶剂中洗脱，允许一次可以光学离析大量化合物，并且耐受高压的色谱分离剂；以及生产该色谱分离剂的方法。
本发明的色谱分离剂包括由多糖类衍生的多糖类衍生物，其中：该多糖类衍生物具有其中存在于多糖类中的一部分羟基通过交联分子彼此交联和存在于多糖类中的未交联羟基各自用改性分子改性的结构；以及该多糖类衍生物不担载于载体上。
此外，本发明提供了制备色谱分离剂的方法，包括下列步骤：将保护基引入到存在于多糖类中的一部分羟基上的步骤；用改性分子改性在引入了保护基的多糖类中保留的各羟基的步骤；脱去所引入的保护基，复原羟基的步骤；以及通过交联分子使复原的羟基彼此交联的步骤。
在本发明的色谱分离剂中，多糖类衍生物用交联分子交联，形成三维网络结构，这显著改进了耐溶剂性。因此，本发明的色谱分离剂允许使用洗脱溶剂比如氯仿，四氢呋喃或乙酸乙酯，而上述这些洗脱溶剂不能用于采用现有多糖类衍生物的色谱分离剂。
该色谱分离剂完全不使用载体，由直接提供旋光异构体的分离的多糖类衍生物组成。因此，能填充到柱子中的多糖类衍生物的量可以增加，从而一次光学离析的化合物的量也可以增加。
此外，该多糖类衍生物具有由于交联带来的显著提高的机械强度，因此，用作HPLC分离剂的该多糖类衍生物可以充分耐受HPLC中的压力。
附图简述
图1是显示了色谱的图，该色谱图通过使用分别填充了实施例1和对比实施例1的色谱分离剂的柱子并改变一次注入的外消旋体的量来光学离析2，2，2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇(9)的外消旋体所获得。
图2是用扫描电子显微镜拍摄的实施例1的色谱分离剂的二次电子图像(照片)。
图3是用扫描电子显微镜拍摄的实施例1的色谱分离剂的二次电子图像(照片)。
图4是用扫描电子显微镜拍摄的实施例3的色谱分离剂的二次电子图像(照片)。
图5是用扫描电子显微镜拍摄的实施例3的色谱分离剂的二次电子图像(照片)。
图6是用扫描电子显微镜拍摄的对比实施例1的色谱分离剂的二次电子图像(照片)。
图7是用扫描电子显微镜拍摄的对比实施例1的色谱分离剂的二次电子图像(照片)。
图8是用扫描电子显微镜拍摄的交联后的实施例4的珠粒A的二次电子图像(照片)。
图9是用扫描电子显微镜拍摄的交联后的实施例4的珠粒B的二次电子图像(照片)。
图10是显示了色谱的图，该色谱图通过使用实施例4的柱子A和填充了对比实施例1的色谱分离剂的柱子并改变一次注入的外消旋体的量来光学离析2，2，2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇(9)的外消旋体所获得。
图11是用扫描电子显微镜拍摄的使用聚苯乙烯作为生孔剂(porogen)的实施例5的色谱分离剂的二次电子图像(照片)。
图12是用扫描电子显微镜拍摄的使用聚甲基丙烯酸甲酯作为生孔剂(porogen)的实施例6的色谱分离剂的二次电子图像(照片)。
图13是用扫描电子显微镜拍摄的使用聚-N-异丙基丙烯酰胺作为生孔剂的实施例7的色谱分离剂的二次电子图像(照片)。
实施本发明的最佳方式
下文，将描述本发明。
本发明的色谱分离剂不限于用于HPLC，还可以用于其它色谱技术比如超临界流体色谱法，柱色谱法，薄层色谱法，气相色谱法，和毛细管色谱法。
用作本发明的色谱分离剂的原料的多糖类可以是天然多糖类，合成多糖类，或天然改性多糖类，只要该多糖类具有手性。在这些当中，多糖类优选具有高度规律的成键模式，以便提高旋光异构体分离能力。
多糖类的典型实例是纤维素，但它们的其它实例包括直链淀粉，木聚糖，脱乙酰壳多糖，壳多糖，甘露聚糖，菊粉，凝胶多糖，淀粉，右旋糖酐，支链淀粉，石耳素，葡聚糖，半乳聚糖，果聚糖，支链淀粉，琼脂糖，和藻酸。此外，还可以使用含有直链淀粉的淀粉。在这些当中，纤维素，直链淀粉，木聚糖，脱乙酰壳多糖，壳多糖，甘露聚糖，菊粉，凝胶多糖等是优选的，因为它们各自是容易获得的高纯度多糖类。尤其，有利地使用纤维素和直链淀粉。
多糖类的数均聚合度(1个分子中的吡喃糖环或呋喃糖环的平均数)是≥5，优选≥10。一般，从容易处理来看，它的数均聚合度理想地是≤3,000。
用交联分子的交联优选在吡喃糖环或呋喃糖环的第6位羟基和另一吡喃糖环或呋喃糖环的第6位的羟基之间进行。根据本发明的发明人的实验结果，证明第6位羟基对旋光异构体分离能力具有非常小的影响。因此，第6位羟基的交联不降低旋光异构体分离能力。此外，第6位羟基活性很高，从而有利于用交联分子的交联反应。
顺便提一下，本发明的色谱分离剂包括通过交联剂彼此交联的存在于如上所述的多糖类中的一部分羟基。可以使用能够使羟基彼此交联的任何化合物作为交联剂。
交联剂的实例包括：比如4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯，亚甲苯基二异氰酸酯和六亚甲基二异氰酸酯等在1个分子中具有多个异氰酸酯基的分子；以及二羧酸；二羧酰卤；二羧酰胺；和二羧酸酯等。
此外，可聚合不饱和基团可以预先通过使用不饱和酰卤比如丙烯酰氯，甲基丙烯酰氯，或乙烯基苯甲酰氯，或不饱和异氰酸酯化合物比如异氰酸乙烯基苯基酯而引入到存在于多糖类的一部分羟基上。然后，产物可以通过与不饱和烃单体比如苯乙烯，二乙烯基苯，或异戊二烯；(甲基)丙烯酸衍生物；或类似物共聚来交联(参见JP-A-2002-148247)。
在这些交联剂中，在1个分子中具有多个异氰酸酯基的化合物是优选的，因为交联反应容易进行和反应步骤的数目较少。
用于改性存在于多糖类中的各非交联羟基的改性分子不是特别限制的。改性分子仅要求是能够改性各羟基的化合物，如异氰酸衍生物，羧酸，酯，酰卤，酰胺，卤化物，环氧化合物，醛，或醇。在这些当中，为了可以通过简单反应操作以高收率改性各羟基，在分子中具有一个异氰酸酯基的化合物是优选的。
本发明的色谱分离剂优选被成形为珠粒的形状，从而提高它在柱子中的填充比和提供高的旋光异构体分离能力。
在本发明中，术语“珠粒的形状”是指基本上球形或球形，也就是说，具有1.0-5.0，优选1.0-2.0，更优选1.0-1.3的最大直径与最小直径的平均比率的形状，该比率通过测定大约20粒色谱分离剂颗粒各自的最大直径和最小直径来获得。
此外，从提高在柱子中的填充比和增强旋光异构体分离能力的观点来看，本发明的色谱分离剂优选具有1-100μm，更优选1-50μm，特别优选3-20μm的粒径。色谱分离剂的粒度例如可以通过分类来调节。
从增加色谱分离剂的表面积和增强旋光异构体分离能力的观点来看，本发明的色谱分离剂优选具有孔。
在本发明中，色谱分离剂的颗粒形状或粒度可以通过例如用扫描电子显微镜(SEM)拍摄的色谱分离剂的图像来测定。
本发明的色谱分离剂可以如下所述来生产。也就是说，生产本发明的色谱分离剂的第一方法包括下列步骤：将保护基引入到存在于多糖类的一部分羟基上的步骤；用改性分子改性在引入了保护基的多糖类中保留的各羟基的步骤；脱去所引入的保护基，复原羟基的步骤；以及通过交联分子使复原的羟基彼此交联的步骤。
在保护基引入步骤中引入保护基使改性分子和交联分子可靠地键接于预定羟基。
所要在保护基引入步骤中引入的保护基不是特别限制的，只要它们是在改性步骤中比用于改性各羟基的改性分子更容易从羟基上脱去的基团。例如，改性分子可以用作用于将保护基引入到羟基上的化合物。用于引入保护基的化合物可以根据所要保护或改性的羟基的反应性，或该化合物与羟基的反应性来确定。
将保护基引入到羟基上，用改性分子改性各羟基，以及通过交联分子交联羟基可以根据所要与羟基反应的化合物的类型通过已知的适当反应来进行。在脱去步骤中从羟基上脱去保护基不是特别限制的，可以通过已知方法比如水解例如用酸或碱来进行。
在交联步骤中，所有复原的羟基可以通过交联分子彼此交联，或者复原的羟基的一部分可以彼此交联。在该情况下，剩余羟基优选通过类似于改性步骤的操作来改性。
在本发明中，具有孔的色谱分离剂可以通过除了上述步骤以外进一步包括以下步骤的方法来生产：在溶剂中溶解通过在脱去步骤中复原羟基所获得的复原多糖类衍生物的步骤；在所得复原的多糖类衍生物的溶液中分散生孔剂(porogen)的步骤；将分散有生孔剂的复原多糖类衍生物的溶液保持在所需形状和除去溶剂，形成所需形状的复原多糖类衍生物的步骤；以及用能够溶解生孔剂的洗涤溶剂洗涤所形成的复原多糖类衍生物的步骤。
生孔剂是指能够分散于复原多糖类衍生物的溶液中，并且能够与多糖类衍生物分开溶解的固体化合物。各种有机化合物或无机化合物可以用作生孔剂，但从在复原的多糖类衍生物的溶液中的分散性，复原多糖类衍生物的溶液的液滴在如下所述的珠粒形成过程中的稳定性等来看，有机化合物是优选使用的。各种聚合物比如聚苯乙烯可以用作有机化合物。
用于复原多糖类衍生物的溶液的溶剂仅仅要求是能够溶解通过在脱去步骤中复原羟基所获得的复原多糖类衍生物的溶剂。复原多糖类衍生物的溶液可以通过各种方法保持在所需形状，这些方法例如包括：将该溶液引入到所需形状的容器内；以及如在以下所述的珠粒形成中形成液滴。此外，分散有生孔剂的复原多糖类的溶液可以引入到柱形管中。从复原多糖类衍生物的溶液中除去溶剂可以通过加热或减压、以及这两种方法的组合来进行。
用于将生孔剂溶解在成形为所需形状的复原多糖类中的洗涤溶剂仅仅要求是能够溶解该生孔剂的溶剂。然而，该溶剂优选是不溶解多糖类衍生物和仅仅溶解生孔剂的溶剂，更优选生孔剂的溶解度高于多糖类衍生物的溶解度的溶剂，特别优选仅仅溶解生孔剂的溶剂。这种洗涤溶剂可以根据多糖类衍生物和生孔剂的类型，多糖类衍生物和生孔剂在溶剂中的溶解度等从已知溶剂中选择。
此外，该交联步骤优选包括下列步骤：通过在溶剂中溶解由在脱去步骤中复原羟基所获得的复原多糖衍生物，形成复原多糖衍生物的溶液，将复原多糖衍生物的溶液滴入到表面活性剂的溶液中，以及搅拌该整个体系，而形成珠粒形状的复原多糖衍生物的步骤；以及通过交联分子交联珠粒形状的复原多糖衍生物，形成珠粒形状的色谱分离剂的步骤。根据本发明的发明人的实验的结果，已经确定，珠粒形状的色谱分离剂可以容易地通过这种方法来生产。
在珠粒形成步骤中用于复原多糖类衍生物的溶液的溶剂仅仅要求是能够溶解通过在脱去步骤中复原羟基所获得的复原多糖类衍生物的溶剂。在该溶剂溶于表面活性剂的溶液的情况下，可以另外使用在表面活性剂的溶液中不溶或几乎不溶的助溶剂，从而形成复原多糖类衍生物的溶液。将可以含有助溶剂的复原多糖类衍生物的溶液滴入到表面活性剂的溶液中，从而形成复原多糖类衍生物在表面活性剂的溶液中的溶液的液滴。然后，从复原多糖类衍生物的溶液中蒸馏掉溶剂(和/或助溶剂)，从而形成珠粒形状的多糖类衍生物。
该表面活性剂不是特别限制的，只要它是允许在表面活性剂的溶液中形成的复原多糖类衍生物的溶液的液滴的稳定存在的化合物。阴离子表面活性剂例如可以用作该表面活性剂。
珠粒交联步骤可以以类似于上述交联步骤的方式进行。
本发明的色谱分离剂还可以如下所述来制备。也就是说，生产本发明的色谱分离剂的第二方法包括下列步骤：通过交联分子使存在于多糖类的一部分羟基彼此交联的步骤；以及用改性分子改性在通过交联分子交联的多糖类中保留的各羟基的步骤。
该方法不需要引入保护基，并且可以减少步骤的数目，从而降低了生产成本。此外，珠粒形状的多糖类可以市购。可以使用珠粒形状的市购多糖类，从而可以低成本供应大量的珠粒形状的色谱分离剂。
在使用1个分子中具有多个异氰酸酯基的化合物，比如在分子中具有键接于多糖类或多糖类衍生物的羟基的多个交联位点的化合物作为交联步骤中的交联剂的情况下，该方法可以进一步包括在交联之后改性多糖类或多糖类衍生物的自由交联位点的步骤。这种步骤可以抑制在光学离析过程中在自由交联位点和旋光异构体之间的相互作用。
交联位点的改性根据假定与交联位点相互作用和所要光学离析的旋光异构体来改变。然而，一般，从提高交联位点的位阻来看，它们的改性优选通过使用具有低极性的取代基来进行，以及优选通过使用庞大取代基来进行。取代基的实例包括各自具有支化结构的烃基比如叔丁基和三苯甲基。交联位点用这种取代基的改性可以通过已知的适当反应比如缩合反应来进行，类似于上述保护基引入步骤，改性步骤等。
此外，在本发明中，色谱分离剂还可以通过在珠粒形成步骤中将生孔剂分散于复原多糖类衍生物的溶液中；将含有生孔剂的复原多糖类衍生物的溶液滴入到表面活性剂的溶液中，从而形成含有生孔剂的珠粒形状的复原多糖类衍生物(含有生孔剂的珠粒)；并用洗涤溶剂洗涤含生孔剂的珠粒，溶解含生孔剂的珠粒中的生孔剂。
此类操作使得可以在珠粒形状的色谱分离剂中形成大量的孔，从而增加或调节色谱分离剂的表面积。因此，可以提高或调节光学离析力。
在使用生孔剂的情况下，可以在用于生产所需形状的色谱分离剂的交联步骤之前或之后；或者在用于生产珠粒形状的色谱分离剂的珠粒交联步骤之前或之后进行生孔剂的溶解。
下文，在实施例1-7中给出了本发明的具体实施例的说明。
(实施例1)
实施例1的色谱分离剂具有如下所述通过使用纤维素作为多糖类的原料生产的珠粒的形状。
<保护基引入步骤>
首先，如式(1)所示，作为保护基引入步骤进行第6位的羟基的三苯甲基化。
Figure GSB00000540216900091
也就是说，将9.2g的氯化锂和135ml的干燥N，N’-二甲基乙酰胺加入到13g(86mmol)的干燥纤维素中，以及让该混合物在氮气氛围中在100℃下溶胀137小时。然后，将50g(180mmol)的三苯甲基氯和200ml的吡啶加入到其中，在100℃下反应28小时。将吡啶可溶部分滴入到甲醇中，以及收集不溶部分。然后，所得物在真空下干燥，从而获得在葡萄糖环的第6位上具有三苯甲基化羟基的纤维素衍生物。
<改性步骤>
接下来，如式(2)所示，进行在这样三苯甲基化纤维素衍生物中保留的羟基的氨基甲酰化。
Figure GSB00000540216900092
也就是说，将17g的其中第6位羟基在保护基引入步骤中三苯甲基化的纤维素衍生物溶于160ml的吡啶中，再于氮气氛围将19g(128mmol)的异氰酸3，5-二甲基苯基酯加入到其中，在80℃下反应20小时。取反应溶液的样品进行红外吸收光谱测定，确定在该溶液中存在未反应的异氰酸酯。然后，将该反应溶液滴入到甲醇，用于收集不溶物质，所得物在真空下干燥，从而获得了28g的纤维素-2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酰基)-6-O-三苯甲基纤维素。
<脱去步骤>
然后，如式(3)所示，从其中羟基照这样氨基甲酰化的纤维素衍生物中脱去三苯甲基。
也就是说，将在改性步骤中获得的2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酰基)-6-O-三苯甲基纤维素在50ml的1％HCl/甲醇中搅拌24小时，用于去保护，从而使第6位的基团复原为羟基。然后，在用玻璃滤器过滤的同时，用甲醇洗涤反应液体，在真空下干燥所得物，从而获得20g的纤维素2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。
注意，第6位的羟基的丰度比是大约63％，由1H NMR谱计算，以及剩余羟基用异氰酸3，5-二甲基苯基酯进行氨基甲酸酯化。下文，该衍生物被缩写为“OD(6-OH)-63”。
<珠粒形成步骤>
将这样获得的OD(6-OH)-63溶于四氢呋喃中，以及将少量的庚醇加入到其中。接下来，将所得溶液滴入到月桂基硫酸钠的水溶液中，同时该水溶液用装有6叶片型螺旋的分散器搅拌。在滴加结束后，包括含有水溶液的容器在内的水浴的温度从室温提高到75℃，以蒸馏出四氢呋喃。所形成的珠粒通过吸滤来收集，并用水和乙醇洗涤。在洗涤之后，所得物在真空下干燥，从而获得由OD(6-OH)-63组成的OD(6-OH)-63珠粒。要指出的是，使用烧杯作为容器。表1示出了生产OD(6-OH)-63珠粒的结果。
表1
Figure GSB00000540216900111
<珠粒交联步骤>
然后，如式(4)所示，进行在脱去步骤中复原的羟基的交联反应。
Figure GSB00000540216900112
也就是说，在氮气氛围中，将10ml的甲苯加入到0.91g的干燥OD(6-OH)-63中，以及将该混合物在80℃下加热3小时，以溶胀这些珠粒。然后，将0.13g(0.52mmol)的4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯加入到其中，反应6小时.取少量珠粒样品，确定这些珠粒变成不溶于四氢呋喃。然后，将0.5g(3.4mmol，过量)的异氰酸3，5-二甲基苯基酯加入到其中，反应14小时。未反应的异氰酸酯的存在通过IR测量来确定，然后通过吸滤收集珠粒。这些珠粒用温甲醇洗涤，同时抽吸，从而除去所形成的脲。通过IR测量确定不存在脲，然后将珠粒在真空下干燥，从而获得0.88g的具有30％的彼此交联的第6位羟基的实施例1的珠粒。
(实施例2)
实施例2的色谱分离剂通过在按与实施例1相同方式获得的OD(6-OH)-63珠粒和用于交联OD(6-OH)-63的羟基的15％的量的4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯之间的交联反应来获得。其它操作按照与实施例1的生产珠粒的方法相同的方式进行。
(实施例3)
实施例3的色谱分离剂如下所述通过使用珠粒形状的纤维素作为多糖类原料来生产。
也就是说，将0.68g的氯化锂和10ml的N，N’-二甲基乙酰胺加入到1.0g(6.3mmol)的市购纤维素珠粒(“Cellflow C-25”，商品名，由Chisso Corporation供应)中，以及将珠粒在氮气氛围下在80℃下溶胀60小时。然后，将10ml的吡啶和0.47g(1.9mmol)的4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯加入到其中用于凝胶化。将10ml的吡啶和3.8g(26mmol)的异氰酸3，5-二甲基苯基酯加入到其中，反应22小时。通过IR测量证实了未反应异氰酸酯的存在，以及珠粒用温甲醇洗涤，同时通过抽吸过滤，从而收集了珠粒。将这些珠粒在真空下干燥，从而获得1.5g的实施例3的珠粒，其中第6位羟基的30％彼此交联。
(对比实施例1)
对比实施例1的色谱分离剂包括担载于硅胶的纤维素的3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯衍生物，并且如下所述来生产。也就是说，将多孔硅胶(7μm的粒度，和100nm的孔径)干燥，再与3-氨基丙基三乙氧基硅烷在苯中在80℃下在催化量的吡啶的存在下反应。所得物用甲醇、丙酮和己烷洗涤，再干燥。将纤维素三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的四氢呋喃溶液(0.75g/10ml)逐步加入到3g的用氨基丙基这样改性的硅胶中，并摇动整个体系。然后，在减压下蒸馏出溶剂四氢呋喃，从而获得包括担载于硅胶的纤维素的氨基甲酸3，5-二甲基苯基酯衍生物的对比实施例1的色谱分离剂。
评价
(光学离析试验1)
具有3-15μm的粒度的实施例1-3的各色谱分离剂通过筛分来取样，再通过淤浆法填充到具有25cm的长度和0.2mm的内径的不锈钢柱子中。该填充通过将实施例1-3各自的取样色谱分离剂分散于30ml的己烷/液体链烷烃(2/1)中；使用己烷/2-丙醇(9/1)作为溶剂；以及将填充压力设定在50kg/cm2(4.9MPa)来进行。
对于实施例1，还生产在100kg/cm2(9.8MPa)下填充的柱子。
通过与上述类似的操作，将对比实施例1的色谱分离剂填充到类似柱子中。要指出的是，前几分钟，将填充压力设定在400kg/cm2，然后设定在100kg/cm2。
通过淤浆法将对比实施例1的色谱分离剂填充到具有25cm的长度和0.46cm的内径的不锈钢柱子以及具有25cm的长度和0.2cm的内径的不锈钢柱子中。
通过使用由上述操作获得的分别填充了实施例1-3和对比实施例1的色谱分离剂的柱子，对由以下结构式1-10表示的10种外消旋体进行旋光离析试验。
Figure GSB00000540216900131
使用己烷/2-丙醇(9/1)作为洗脱剂。在实施例1-3中，流速是0.2ml/min，以及在对比实施例1中，对于具有0.46cm的内径的柱子，流速是0.5ml/min，而对于具有0.2cm的内径的柱子，流速是0.1ml/min。通过联合使用UV检测器和旋光计来进行检测。由苯的峰确定理论塔板数N，以及由1，3，5-三叔丁基苯的洗脱时间确定洗脱剂通过柱子的时间t0。在填充之前和之后的珠粒的SEM观测证实了珠粒没有因为在填充过程中的压力而变形。表2示出了结果。
Figure GSB00000540216900151
在表2中，k1’表示容量系数和α表示分离系数。在括号内的符号表示首先洗脱的对映体的旋光能力。表2揭示，实施例1-3各自的容量系数k1’是对比实施例1的容量系数k1’的2.5-3倍，可能是因为实施例1-3各自的色谱分离剂不使用载体。因此，实施例1-3的各色谱分离剂估计可以一次光学离析更大量的化合物。
表3示出了理论塔板数的测量结果。
表3
  理论塔板数
  实施例1(填充压力50kg/cm2)   1200
  实施例1(填充压力100kg/cm2)   760
  实施例2   700
  实施例3   680
  对比实施例1   900
表3揭示，在50kg/cm的填充压力下用实施例1的色谱分离剂填充的柱子的理论塔板数大于对比实施例1的理论塔板数。
(光学离析试验2)
通过使用在50kg/cm2的填充压力下分别填充了实施例1的色谱分离剂和对比实施例1的色谱分离剂的具有25cm的长度和0.2cm的内径的不锈钢柱子测定一次通过能够分离为旋光异构体的化合物的最大量。
也就是说，将2，2，2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇的外消旋体溶于组成与洗脱剂相同的溶剂中，从而制备了具有10mg/l，40mg/l和50mg/l的浓度的溶液。通过使用这些溶液来进行光学离析，以及在所得图中提供了两种对映体的重叠峰的外消旋体的量被认为是能够用柱子分离的化合物的最大量。图1示出了结果。
图1揭示，具有0.2cm的内径的对比实施例1的柱子仅能分离6mg的外消旋体，但实施例1的柱子几乎完全分离8mg外消旋体。
(用扫描电子显微镜观察)
对于实施例1和3以及对比实施例1，用扫描电子显微镜照相。结果，如图2-7所示，实施例1-3的色谱分离剂各自为珠粒的形状，与对比实施例1相同。
(实施例4)
(a)在第6位具有羟基的纤维素3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯的合成
作为珠粒的原料，合成具有在第6位上保留的羟基的纤维素OD(6-OH)的3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯衍生物，该羟基后来通过使用二异氰酸酯彼此交联。
Figure GSB00000540216900171
将15g的氯化锂和150ml的脱水N，N’-二甲基乙酰胺加入到10g(62mmol)的干燥纤维素中，将该混合物在氮气氛围下在80℃溶胀27小时。然后，将32(114mmol)的三苯基甲基氯和150ml的吡啶加入到其中，在80℃下反应24小时。将吡啶可溶部分滴入到甲醇中，作为不溶部分收集。然后所得物在真空下干燥。
所得衍生物在葡萄糖环的第6位上具有不完全三苯甲基化羟基。因此，再次，将15g的氯化锂和150ml的脱水N，N’-二甲基乙酰胺加入到该衍生物中，以及将该混合物在氮气氛围下在80℃溶胀24小时。然后，将17g(62mmol)的三苯甲基氯和150ml的吡啶加入到其中，在80下反应24℃小时。将吡啶可溶部分滴入到甲醇中，并收集不溶部分。然后，所得物在真空下干燥，从而获得了其中葡萄糖环的第6位的羟基被完全三苯甲基化的纤维素衍生物。
接下来，将21g的所得衍生物溶于190ml的吡啶，再在氮气氛围下将22g(150mmol)的3，5-二甲基苯基异氰酸酯加入到该混合物中，在80℃下反应30小时。取反应溶液的样品进行红外吸收光谱测定，证实了未反应的异氰酸酯在该溶液中的存在。然后，将反应溶液滴入到甲醇中，用于收集不溶物质，从而获得纤维素2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酰基)-6-O-三苯甲基纤维素。
然后，将该衍生物在1,500ml的1％HCl/甲醇中搅拌24小时用于去保护，从而使第6位的三苯甲基复原为羟基。然后，所得物用甲醇洗涤，在真空下干燥，从而获得24g的目标纤维素2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。
OD(6-OH)-25的合成
接下来，将10g(22mmol)的所得衍生物溶于65ml的吡啶，再在氮气氛围下将2.5g(1.7mmol)的异氰酸3，5-二甲基苯基酯加入到该混合物中，在80℃下反应18小时。将反应溶液滴入到甲醇中，用于收集不溶物质，以及将所得物在真空下干燥。从反应前的衍生物与异氰酸3，5-二甲基苯基酯比率可以测定，大约25％的葡萄糖环的第6位的羟基被保留。下文，该衍生物被称为OD(6-OH)-25。
(b)OD(6-OH)-25珠粒的制备
将0.25g的OD(6-OH)-25溶于30ml的四氢呋喃/庚醇(2/1，v/v)的混合溶剂中。将OD(6-OH)-25的溶液滴入到500ml的月桂基硫酸钠的0.2％水溶液中，同时该水溶液用分散器在1,100rpm的轴转速下搅拌，以及将包含含有水溶液的容器的水浴的温度升高到75℃。在滴加完后，使水浴的温度保持在75℃，从而蒸馏出四氢呋喃。所形成的珠粒通过吸滤来收集，并用水和乙醇洗涤。在洗涤之后，所得物在真空下干燥，从而以大约87％的收率获得了OD(6-OH)-25珠粒。这些珠粒进行反复操作，通过20μm过滤器分类，从而收集了具有大约3到10μm的粒度的珠粒。
该分散器采用6叶片型轴，以及使用1L烧杯作为容器。所得珠粒用扫描电子显微镜(SEM)观察。
(c)OD(6-OH)-25用二异氰酸酯交联
为了将强度提供给所得OD(6-OH)-25珠粒，让第6位的羟基和4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯反应，用于在珠粒中交联。
Figure GSB00000540216900191
交联前的珠粒在THF中可溶    交联后的珠粒在THF中不溶
交联珠粒的制备(用于柱子A)
在氮气氛围下将20ml的甲苯加入到1.83g的干燥OD(6-OH)-25珠粒中，再将该混合物在80℃下加热4小时，从而溶胀这些珠粒。然后，将0.3g(1.2mmol，过量)的4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯加入到其中，在80℃下反应24小时。通过上层液的液体IR测量证实了未反应的异氰酸酯的存在，再取少量珠粒样品，用于证实这些珠粒在四氢呋喃中变得不溶。然后，通过吸滤收集这些珠粒，并且在吸滤的同时用温甲醇洗涤，从而从过量异氰酸酯中除去所形成的脲。通过珠粒的固体IR测量证实不存在脲，然后在真空下干燥这些珠粒，从而获得1.83g的珠粒(下文，称为珠粒A)，其中25％的第6位的羟基彼此交联。
交联珠粒的制备(用于柱子B)
在氮气氛围下将11ml的甲苯加入到1.0g的干燥OD(6-OH)-25珠粒中，再将该混合物在80℃下加热4.5小时，从而溶胀这些珠粒。然后，将0.14g(0.56mmol，过量)的4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯加入到其中，在80℃下反应15小时。通过上层液的液体IR测量证实了未反应的异氰酸酯的存在，再取少量珠粒样品，用于证实这些珠粒在四氢呋喃中变得不溶。然后，为了改性剩余的异氰酸酯，添加10ml(过量)的叔丁醇，反应3小时。
通过上层液的液体IR测量证实了异氰酸酯的不存在。然后，通过吸滤收集这些珠粒，并且在吸滤的同时用温甲醇洗涤，从而从异氰酸酯和叔丁醇中除去所形成的脲。通过珠粒的固体IR测量证实不存在脲，然后在真空下干燥这些珠粒，从而获得1.0g的珠粒(下文，称为珠粒B)，其中25％的第6位的羟基彼此交联。
在珠粒B的制备中，不像珠粒A的制备，没有与衍生物反应的4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯的两个异氰酸酯基的一个异氰酸酯基用叔丁醇处理，用于用庞大的醇(bulky alcohol)改性。这样，在光学离析中涉及的在珠粒B和外消旋体之间的相互作用没有被其它相互作用所干扰，预期是更有效的。
OD(6-OH)-25珠粒的观察
在反应之前和之后的珠粒A和B的SEM观测揭示，反应之前和之后的珠粒的尺寸或表面状态没有改变。图8和9分别示出了交联之后的珠粒A和B的SEM图像。
(d)将珠粒填充到柱子
将所得两类珠粒A和B按粒度分类，再分散于30ml的己烷/液体链烷烃(2/1)。通过淤浆法，使用己烷/2-丙醇(9/1)作为洗脱剂，在3-30kg/cm2的压力下，用HPLC泵将珠粒A和B各自填充到具有25cm的长度和0.2cm的内径的不锈钢柱子中。所得柱子分别被称为柱子A和B。
填充到柱子中的珠粒的观测
表4显示了填充到各柱子中的珠粒的质量、表面积、理论塔板数(N)和填充时间。在填充之前和之后的珠粒的观测揭示珠粒没有因为在填充过程中的压力而变形。
表4
Figure GSB00000540216900201
(e)光学离析能力的评价
通过采用用由上述操作获得的两类珠粒填充的柱子，对用上述结构式1-10表示的10种外消旋体进行光学离析。使用己烷/2-丙醇(9/1)作为洗脱剂，流速是0.1ml/min。检测峰，通过使用UV检测器和旋光计来鉴定。注意，理论塔板数N由苯的峰测定，以及当洗脱剂通过柱子时的时间t0由1，3，5-三叔丁基苯的洗脱时间测定。
光学离析能力的评价结果
表5示出了上述外消旋体通过使用柱子A和B光学离析的结果。为了对比，表5还示出了这些外消旋体通过使用包含担载于硅胶的3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯衍生物的填充剂(对比实施例1)光学离析的结果。表5中的值表示了容量系数k1’和分离系数α。括号内的符号代表了首先洗脱的对映体的旋光能力。
Figure GSB00000540216900221
柱子A和B的结果的对比表明，柱子B具有通常小的容量系数k1’和通常大的分离系数α，虽然柱子用大量的衍生物填充。可推测的原因是柱子B用叔丁醇处理，以消除干扰外消旋体的分离的相互作用。
此外，所有珠粒柱子的外消旋体的洗脱顺序与普通担载型柱子的洗脱顺序相同。这些珠粒柱子各自的容量系数kl’比包括担载于硅胶的衍生物的柱子的那些大2.5-4倍。该结果假定是因为由于没有使用硅胶，大量的纤维素衍生物被引入到柱子中而获得的。预期一次可以光学离析更大量的外消旋体。
(f)2，2，2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇的大规模分离
用珠粒填充的柱子比相同尺寸的现有硅胶担载类柱子含有更大量的多糖类衍生物，并且预期与硅胶担载型柱子相比一次可以分离更大量的外消旋体。可以一次分离的外消旋体2，2，2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇(9)的量通过使用柱子A和硅胶担载型柱子来研究。
在该情况下，将该外消旋体溶于组成与洗脱剂相同的溶剂，以制备120mg/ml的溶液，以及用该溶液进行光学离析。使用具有25cm的长度和0.2cm的内径的柱子，以及使用己烷/2-丙醇(9/1)作为洗脱剂。硅胶担载型柱子的洗脱剂的流速是0.20ml/mim，以及柱子A的洗脱剂流速是0.15ml/min。在所得图中提供了两种对映体的重叠峰的外消旋体的量被称为可以用该柱子分离的化合物的最大量。
2，2，2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇的大规模分离的结果
图10示出了外消旋体2，2，2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇的大规模分离的结果。测量波长是271nm。结果，在担载型柱子注入6mg的外消旋体和柱子A注入20mg的外消旋体的情况下，两个峰重叠。
(实施例5-7)
具有孔的纤维素衍生物珠粒的制备
为了制备纤维素衍生物珠粒，将作为生孔剂的聚合物加入到纤维素的THF/1-庚醇混合溶液中。在搅拌下，将该混合物滴入到月桂基硫酸钠的水溶液中，并加热整个体系，以蒸馏掉THF。所得珠粒用能够溶解用作生孔剂的聚合物的溶剂洗涤，以洗掉生孔剂，再观测珠粒中的孔。孔的数目或尺寸根据所用生孔剂的类型或浓度而改变。
将25mg的在一部分第6位上具有羟基的纤维素3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯溶于3ml的四氢呋喃/庚醇(2/1，v/v)的混合溶剂中，再以相对于纤维素衍生物的量的大约20质量％的比率将用作生孔剂的聚合物溶于其中。将OD(6-OH)-25的溶液滴入到100ml的月桂基硫酸钠的0.2％水溶液中，同时该水溶液用分散器在1,100rpm的轴转速下搅拌，再将包括含有水溶液的容器的水浴的温度提高到75℃。
在滴加完后，将水浴的温度保持在75℃，以蒸馏掉四氢呋喃。所形成的珠粒通过吸滤来收集，再用水、乙醇和仅能溶解生孔剂的溶剂洗涤。在洗涤之后，在真空下干燥所得物，从而获得具有孔和大约3-12μm的粒度的纤维素衍生物珠粒。
分散器轴采用6叶片型轴，以及使用200ml烧杯作为容器。使用聚苯乙烯(PSt，分子量：17,000，Mw/Mn：1.03)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，分子量：42,000，Mw/Mn：1.40)，和聚-N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM，分子量：28,000，Mw/Mn：1.85)作为生孔剂。
所得珠粒用扫描电子显微镜(SEM)观测。图11-13示出了所得珠粒的SEM图像。
工业应用性
本发明的色谱分离剂包括用交联分子交联的多糖类衍生物。因此，耐溶剂性和机械强度显著改进。因此，与现有色谱分离剂相比，可以使用具有较强洗脱能力的溶剂。此外，即使在高压条件下比如HPLC的条件下，也能够充分使用本发明的色谱分离剂。
此外，本发明的色谱分离剂不使用载体。因此，可以增加填充到柱子中的多糖类衍生物的量，以及可以增加一次光学离析的化合物的量，例如，可以进一步改进工业生产光学异构体的生产率。

Claims (4)

1.生产色谱分离剂的方法，该色谱分离剂包含未担载在载体上的多糖类衍生物，该方法包括下列步骤：
将保护基引入到存在于多糖类中的一部分羟基上的步骤；
用改性分子改性在引入了保护基的多糖类中保留的各羟基的步骤；
脱去所引入的保护基，复原羟基的步骤；
在溶剂中溶解通过在脱去步骤中复原羟基所获得的复原多糖类衍生物的步骤；
在所得复原的多糖类衍生物的溶液中分散生孔剂的步骤；
将分散有生孔剂的复原多糖类衍生物的溶液保持在所需形状和除去溶剂，形成所需形状的复原多糖类衍生物的步骤；以及
用能够溶解生孔剂的洗涤溶剂洗涤所形成的复原多糖类衍生物的步骤；以及
通过交联分子使复原的羟基彼此交联的步骤。
2.生产色谱分离剂的方法，该色谱分离剂包含未担载在载体上的多糖类衍生物，该方法包括下列步骤：
将保护基引入到存在于多糖类中的一部分羟基上的步骤；
用改性分子改性在引入了保护基的多糖类中保留的备羟基的步骤；
脱去所引入的保护基，复原羟基的步骤；
通过交联分子使复原的羟基彼此交联的步骤，
其中交联步骤包括下列步骤：
通过在溶剂中溶解由在脱去步骤中复原羟基所获得的复原多糖类衍生物，形成复原多糖类衍生物的溶液，将该复原多糖类衍生物的溶液滴入到表面活性剂的溶液中，以及搅拌该整个体系，从而形成珠粒形状的复原多糖类衍生物的步骤；以及
通过交联分子交联珠粒形状的复原多糖类衍生物，形成珠粒形状的色谱分离剂的步骤。
3.根据权利要求2的生产色谱分离剂的方法，进一步包括下列步骤：
在珠粒形成步骤中将生孔剂分散在复原多糖类衍生物的溶液中的步骤；和
用能够溶解生孔剂的洗涤溶剂洗涤所形成的珠粒形状的复原多糖类衍生物的步骤。
4.根据权利要求1～3中任一项的生产色谱分离剂的方法，其中引入保护基团的步骤中将保护基团引入到存在于多糖类中的吡喃糖环或呋喃糖环和另一吡喃糖环或呋喃糖环的第6位羟基。
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