WO2004083829A1 - Membran-osmometer und verfahren zur selektiven bestimmung spezifischer analyte - Google Patents

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WO2004083829A1
WO2004083829A1 PCT/EP2004/002471 EP2004002471W WO2004083829A1 WO 2004083829 A1 WO2004083829 A1 WO 2004083829A1 EP 2004002471 W EP2004002471 W EP 2004002471W WO 2004083829 A1 WO2004083829 A1 WO 2004083829A1
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membrane
solution
binding
measuring
measuring cell
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PCT/EP2004/002471
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Uwe Beyer
Rudolf Ehwald
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Disetronic Licensing Ag
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N13/00—Investigating surface or boundary effects, e.g. wetting power; Investigating diffusion effects; Analysing materials by determining surface, boundary, or diffusion effects
    • G01N13/04—Investigating osmotic effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N7/00—Analysing materials by measuring the pressure or volume of a gas or vapour
    • G01N7/10—Analysing materials by measuring the pressure or volume of a gas or vapour by allowing diffusion of components through a porous wall and measuring a pressure or volume difference

Definitions

  • the present invention relates to a membrane osmometer and an osmotic measuring method, in particular a biosensor membrane osmometer.
  • Membrane osmometers in which an osmotically induced pressure difference is measured over a semipermeable membrane, are known in various embodiments. They are usually used to measure a concentration of osmotically active analytes by changing the osmotic pressure. Although osmometers provide reproducible and precise measured values, they are rarely used for the analytical recording of individual substances, because they usually do not selectively measure a certain substance, but react with comparable sensitivity to a large class of different molecules that unite on the semipermeable membrane due to their size Volume flow of your solvent, or generate a pressure difference.
  • US Pat. No. 6,475,750 discloses a biosensor in which a hydrogel in a measuring cell is used to measure the concentration of a free molecule.
  • the hydrogel comprises a particular binding molecule that is chemically or physically immobilized on the hydrogel and a bound molecule that is also immobilized on the hydrogel.
  • the hydrogel changes its tendency to swell and its pressure depending on the concentration of a free molecule.
  • the free molecule competes with the bound molecule for binding to the binding molecule. This reduces the number of hydrogel bonds and the hydrogel swells and increases the pressure in the measuring cell.
  • a measuring device measures the pressure or the threshold size of the hydrogel and uses the measurement to determine the concentration of the free molecule.
  • the present invention has for its object to provide a sensory membrane osmometer and an osmotic measuring method which is suitable for the selective determination of analytes, in particular of low molecular weight analytes, can measure the concentration of a specific analyte and has a high stereospecificity and selectivity.
  • a membrane osmometer comprises a semi-permeable membrane.
  • a measuring solution in a measuring cell borders on one side of the semipermeable membrane and an examination solution borders on the other side of the membrane.
  • the membrane osmometer comprises a measuring device for measuring a pressure difference in the measuring cell, or on the semipermeable membrane, or a volume flow through the semipermeable membrane.
  • the measurement solution has ligands with binding sites and receptors with binding counter sites. The ligands and receptors can form ligand complexes by binding the binding sites to the binding opposite sites and can therefore be referred to as binding partners.
  • the ligands and receptors have sufficient affinity for one another so that they are also referred to as affinity ligands and affinity receptors. They are present in the measurement solution as solutes, but can also be bound to insoluble particles or porous solids or be in the form of a gel. A balance between affinity receptors, affinity ligands and ligand complexes is established within the measurement solution without external influence. It is also possible to provide different types of affinity ligands with binding sites that match the binding counterparts of the affinity receptors in the measurement solution. It is also conceivable to provide several binding counterparts for a type of affinity ligand or different types of binding counterparts for different binding sites of different affinity ligands on one affinity receptor.
  • the membrane osmometer is provided for a test solution, the analytes with a binding site for binding has the binding counterparts of the affinity receptors.
  • the analytes and the affinity receptors are therefore also binding partners. It can therefore bind either an affinity ligand or an analyte via their respective binding sites to an opposite binding site of an affinity receptor, with either ligand complexes or analyte complexes being formed.
  • the semipermeable membrane of the membrane osmometer is permeable to the analytes, but impermeable to the affinity receptors and the affinity ligands. The reason why an affinity receptor or an affinity ligand does not penetrate through the semipermeable membrane is preferably that a certain particle size is exceeded.
  • the membrane osmometer according to the invention it is sufficient if one of the non-permeable binding partners is diffusible after the dissolution of a complex in the measurement solution and thus becomes osmotic on the semi-permeable membrane, ie in the measuring cell.
  • the analytes diffuse at least partially from the test solution through the semipermeable membrane into the measuring solution of the measuring cell , This changes the equilibrium within the measuring solution from affinity ligands, affinity receptors and ligand complexes, so that a pressure change within the measuring cell that can be measured by the measuring device or a measurable volume flow through the membrane is generated. Analytes may also already be present in the measurement solution. Then there is a corresponding equilibrium between the ligands, the receptors and the ligand complexes and the analytes.
  • the method is generally based on the principle of a competitive affinity assay.
  • the equilibrium of the measurement solution can, for. B. by dissociation or association of the ligand complexes change as soon as analytes diffuse through the semipermeable membrane into the measuring cell. It is also possible that the balance changes because that instead of the affinity ligands, the analytes bind with their binding sites to the binding sites of the affinity receptors and in this way form analyte complexes.
  • the equilibrium changes, there is also a pressure change in the measuring solution in the measuring cell and a volume flow through the semipermeable membrane. It is therefore necessary for the method according to the invention that the affinity ligands and receptors are present in an osmotically effective concentration which can be detected with the measuring device.
  • the dissociation of the ligand complexes by the analytes changes the hydraulic effect of the measurement solution on the semipermeable membrane.
  • This means that the dissociation or association of the ligand complexes influenced by the analytes is associated with a change in the osmotic partial pressure of the impermeable affinity partners or with an increase in the hydraulic effect in the measurement solution.
  • the change in pressure or change in volume can be measured by the measuring device of the membrane osmometer.
  • the present invention preferably analyzes and quantifies biological substances, so that such a membrane osmometer can be referred to as a biosensor membrane osmometer.
  • the essence of the invention consists in a membrane osmometer with a measuring cell and a semi-permeable membrane, the measuring cell containing impermeable affinity ligands and affinity receptors so that these do not diffuse through the membrane.
  • the affinity ligands have a binding site which is sterically similar to a preferably low molecular weight analyte and compete with the analytes on the affinity receptors with their binding counterparts with regard to the formation of an affinity complex, ie a ligand complex or an analyte complex.
  • Suitable affinity receptors are e.g. B. immunoglobulins, lectins, avidin, or enzymes and polynucleotides, e.g. B. DNA or RNA.
  • the affinity receptor can be a polymer-bound or immobilized biogenic or synthetically produced affinity binding domains, e.g. B. an oligonucleotide, an oligo- or polypeptide, an oligosaccharide, Cibachromglu or another complex organic substance.
  • the affinity receptors and affinity ligands are preferred Polymers and also individually, ie in a non-bonded state due to their size, are not permeable through the membrane and therefore remain enclosed in the measuring cell, while the analyte is permeable and diffuses easily through the semipermeable membrane of the measuring cell.
  • Low molecular weight substances such as. B. sugar, salts, amino acids and the like
  • affinity for the affinity receptor do not contribute or only with a small, temporary effect to the pressure difference at the semipermeable membrane.
  • the diffusion exchange of the analyte with the measuring cell leads to the dissociation or association of the ligand complexes and this can be detected as a change in the coverage with a sufficient concentration of receptors and ligands or ligand complexes.
  • a sufficiently high concentration of binding points in the measuring cell is essential for a measuring method according to the invention with a biosensory membrane osmometer. Since the sensitivity of a measuring device, such as an electronic pressure transducer with a bending plate, is technically limited, the concentration of the binding sites in the measuring cell should preferably exceed 0.2 mM in order to be sufficient according to the Vant-Hoff law (24 mbar / mM) enable high modulation of the pressure difference in the measuring cell by detaching the polymeric affinity ligands.
  • the solubility of the affinity receptor and the ratio between its molecular size and the number of binding counterparts bound are important.
  • a concentration of 1 mM for the binding counterparts at the receptor requires protein mass concentrations of 25 and 50 g / 1 for lectins and immunoglobulins. At these concentrations, only some of the receptor proteins in question form stable aqueous solutions. However, the solubility and the solution stability of receptor proteins can be improved if necessary by modifying or masking aggregation-promoting domains, such as. B. Kim, JJ. and Parker, J. "Glucose Binding Property of Pegylated Concanavalin A", Pharmaceutical Research, 2001, Vol. 18, S 794-799.
  • polysaccharides polyols or polyethylene oxide with a Stokes' see radius of 2 to 4 nm, which are suitable as polymeric ligands, the dependence of the osmotic pressure on the molar concentration remains approximately linear up to a value of 2 mM.
  • Polymer affinity ligands of this size can e.g. B. by conjugation of the analyte or a sterically analogous low molecular weight substance with said neutral hydrocolloids.
  • binding partners bound in solid state can be used if a sufficient volume concentration of binding sites and binding counter sites for the biosensory measuring method can be achieved.
  • the affinity complex with the polymeric affinity ligand is osmotically or hydraulically ineffective.
  • the affinity ligands only contribute to the pressure difference or to the volume flow on the semipermeable membrane after they have been detached from the affinity receptor by exchanging them for an analyte.
  • the measuring cell can also contain a gel-like system or a network liquid of polymeric receptors and ligands, the swelling pressure of which depends on the analyte concentration.
  • a gel-like system or a network liquid of polymeric receptors and ligands the swelling pressure of which depends on the analyte concentration.
  • polyvalent or divalent polymer affinity receptors are mixed with polyvalent or divalent affinity ligands in a suitable concentration ratio, precipitates are formed in which the polymers are cross-linked in high concentration and so z.
  • B. form the gel-like system, but make no contribution to the osmotic pressure of the dispersion.
  • a mono alent low molecular weight analyte which competes with the ligand, swell the precipitates, since the number of cross-linking affinity bonds decreases.
  • This process can be used in the membrane osmometer according to the invention for measuring the concentration of low molecular weight analytes. If, for example, a solution of D-glucose (100 mM), concanavalin A (40 mg / ml) and branched dextran molecules with a molecular weight of 20 kDa (40 mg / ml) is filled into the measuring cell and the latter into a buffer at pH 7.4 transferred, a gel forms in the measuring cell after the glucose has escaped, in which the terminal non-reducing glucose residues are cross-linked with the tetravalent lectin by affinity bonds.
  • D-glucose 100 mM
  • concanavalin A 40 mg / ml
  • branched dextran molecules with a molecular weight of 20 kDa 40 mg / ml
  • the swelling pressure increases in accordance with the concentration because the volume increase in the polymer dispersion which normally occurs when the gel is converted into a sol is prevented by the limitation of the measuring cell. With a satiating glucose concentration, the maximum swelling pressure measured. It is identical to the colloid osmotic pressure of the enclosed network fluid.
  • a concentrated sol with crosslinkable non-permeable polymeric affinity binding partners that have multiple binding sites can be e.g. B. with the help of a solvent that has an unfavorable for the affinity binding ion composition or contains a monovalent low molecular weight affinity ligand.
  • a low molecular weight analyte generally has only one binding site per particle. Therefore, it can generally prevent crosslinking at sufficient concentration by displacing the affinity ligand from binding to the receptor.
  • the sol with the crosslinkable, impermeable binding partners is filled into a measuring cell with a semipermeable membrane and brings this into contact with an examination solution, a network liquid is created in the measuring cell, the pressure of which is effective on the semipermeable membrane. If an analyte is added to the measuring solution in different concentrations, the hydraulic effect on the membrane increases.
  • the membrane osmometer In the measurement method with the membrane osmometer according to the invention, it is advantageous if the ligand exchange with the analyte takes place quickly at the affinity receptor.
  • the affinity of the polymeric affinity ligand on the affinity receptor must not be very high, i.e. the dissociation constant should be more than 10 mM. If the affinity of the affinity receptor for the analyte is also comparatively low, the binding equilibrium between the affinity ligands, the analytes and the affinity receptors is established quickly even after the analyte concentration has been reduced. Therefore, the membrane osmometer can be used for continuous measurement processes with weak affinity bonds. Analyte concentrations of approximately 0.1 mM or more are preferably used.
  • glycosides of polyethylene oxide and insulin as well as polyvalent affinity binding partners such as dextran with an optimal molecular size.
  • An advantage of the membrane osmometer according to the invention over the previously known affinity sensors based on concanavalin A is that a simple signal conversion principle can be used by measuring pressure differences.
  • analyte concentrations can be determined with the biosensory membrane osmometer. In this case, however, the diffusion of the analyte determines the rate of equilibrium. With high accumulation rates in the measuring cell, it requires a longer period of time. Furthermore, with a high affinity for the analyte, its binding to the affinity receptor is not reversible in a short time. In order to accelerate separation of the analyte from the affinity receptor, e.g. B. in the case of immunoglobulins and lectins, the affinity z. B.
  • the measuring cell can be inserted into such a suitable elution medium in order to detach the analytes.
  • a membrane osmometer according to DE 197 14 586, according to which the semipermeable membrane is separated by a segment of a microdialysis Hollow fiber can be formed.
  • This achieves an advantageous embodiment of the measuring cell for the measurement, which has a large surface area and, in comparison, a small volume. It is particularly preferred if the measuring cell is limited to 1 mm in relation to the direction of expansion of the measuring solution in the area of the membrane. As a result, the ratio to the volume of the measuring cell and the membrane surface can be reduced to a value below 200 mM.
  • a Drackmessvortechnisch z. B.
  • the pressure transducer with a bending plate or a deformable membrane, preferably a semiconductor membrane, suitable. If a fluid adjacent to the membrane is at atmospheric pressure, ie a fluid isobaric to the atmosphere, the pressure transducer measures the pressure difference to the atmosphere, for example, and thus detects the pressure difference across the semipermeable membrane.
  • the fluid can be formed from the examination or measurement solution.
  • the membrane osmometer according to the invention has a measuring cell and at least one reference cell with a semipermeable membrane, the semipermeable membranes of the measuring cell and the reference cell being identical in quality and area.
  • the bending plate of the pressure transducer lies between the measuring cell and the reference cell.
  • the reference cell differs from the measuring cell in that it contains a reference solution in which at least one of the polymeric affinity binding partners, i.e. some kind of ligand or receptor is missing.
  • the measuring cell and the reference cell preferably contain the affinity binding partners in equal concentrations.
  • This embodiment has the advantage that the non-specific osmotic effects of the fluid, such as the examination or measurement solution, on the semipermeable membrane of the measurement cell and thus undesirable influences on the pressure change can be compensated for by comparing the measurement and reference cells.
  • the fluid such as the examination or measurement solution
  • the measuring cell and the reference cell can be configured as hollow fiber segments arranged in parallel and closed at the end, which are attached to a carrier.
  • the semiconductor membrane of the drain converter is attached as a kind of partition between the measuring cell and the reference cell, so that the cells communicate with the two surfaces of the drain converter membrane.
  • the measuring cell and reference cell designed in this way can be provided with a filling device for the measuring solution and the reference solution.
  • the parallel arrangement of the two hollow fiber segments offers the advantage that the entire membrane surface can be accommodated on a needle-like probe. The latter can be carried out into a very small volume of liquid or into living tissue. In principle, however, another arrangement of the measuring cell and the reference cell that is suitable for measurement is also conceivable.
  • the membrane osmometer can be provided with a measuring device in which the osmotically induced voltage changes on the deformable bending plate of the pressure transducer are compensated.
  • the counterforces required to maintain a constant tension on the bending plate of the drack converter are measured.
  • This version of the biosensory membrane osmometer has the advantage of a slight time delay in setting the osmotic equilibrium, since the pressure transducer does not require a volume flow for the actual measuring process.
  • FIG. 1 of the drawing shows a schematic longitudinal section through a structure of a membrane osmometer according to the invention.
  • the membrane osmometer shown in FIG. 1 consists of a measuring cell 1, a reference cell 2 and a drain sensor with a bending plate 3 which lies between the two cells 1 and 2.
  • the measuring cell 1 and the reference cell 2 serve as segments of the same length of a dialysis hollow fiber 4 made of regenerated cellulose with high hydraulic conductivity, high volume modulus of elasticity and a sharp cut-off with a Stokes' see radius of 2 to 3 nm.
  • the dialysis hollow fiber simultaneously forms a semipermeable membrane of the measuring cell 1 and the reference cell 2.
  • the segments 4 are glued to a steel support and closed at one end 5. At the other end, they are filled with different solution liquids via valves 6 and filler neck 7.
  • the membrane osmometer forms a needle-like probe which, as mentioned, z. B. can be introduced into a body tissue.
  • Measuring cell 1 contains a measuring solution of Concanavalin A (1 mM, based on the monomer) and one-sided glycosylated polyethylene oxide with a molecular weight of 10 kDa (40 g / 1).
  • reference cell 2 there is a reference solution of concanavalin A (1 mM) and unmodified polyethylene oxide with the same molecular weight and the same concentration as the one-sided glycosylated polyethylene oxide of the solution of measuring cell 1, ie 10 kDa (40 g / 1).
  • a pressure difference of about 60 mbar arises between the measuring cell 1 and the reference cell 2, which results from the binding of the glycosylated polyethylene oxide to the concanavalin A.
  • This pressure difference decreases with an increase in the glucose concentration and disappears completely when a saturating glucose concentration of e.g. B. 50 mM is present.
  • the embodiment provided has the advantage that all osmotic effects on the difference in pressure on the bending plate 3, which are not based on the exchange of the affinity ligands on the concanavalin A, are compensated for.
  • Another advantage of the embodiment shown is that the probe is so small that it can be implanted in the subcutaneous fat.
  • the time required for the deformation of the drain hiking bending plate 3 increases.
  • a compensatory dracling device in which the tension of the deformable bending plate 3 is kept constant, is advantageous.

Abstract

Ein Membran-Osmometer weist eine semipermeable Membran (4) auf, an deren einen Seite eine Messlösung in der Messzelle (1) und an deren anderen Seite eine Untersuchungslösung angrenzt. Eine Messvorrichtung misst eine Druckdifferenz in der Messzelle (1) oder einen Volumenfluss durch die Membran (4). Die Messlösung weist Liganden mit Bindungsstellen und Rezeptoren mit Bindungsgegenstellen auf, wobei die Liganden und Rezeptoren durch eine Bindung der Bindungsstellen an die Bindungsgegenstellen Ligandenkomplexe bilden können. Die Untersuchungslösung weist Analyten mit einer Bindungsstelle zur Bindung an die Bindungsgegenstellen der Rezeptoren auf. Die semipermeable Membran (4) ist für Analyten durchlässig und für Rezeptoren und Liganden undurchlässig. Bei einem Verfahren zur selektiven Bestimmung eines spezifischen Analyten in der Untersuchungslösung diffundieren die Analyten zumindest teilweise aus der Untersuchungslösung durch die semipermeable Membran (4) in die Messzelle. Dadurch verändert sich innerhalb der Messlösung ein Gleichgewicht aus Liganden, Rezeptoren und Ligandenkomplexen, wodurch eine von der Messvorrichtung messbare Druckänderung in der Messzelle (1) erzeugt wird.

Description

Membran-Osmometer und Verfahren zur selektiven Bestimmung spezifischer
Analyte
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Membran-Osmometer und ein osmotisches Messverfahren, insbesondere ein biosensorisches Membran-Osmometer.
Membran-Osmometer, bei denen eine osmotisch bedingte Druckdifferenz über eine semipermeable Membran gemessen wird, sind in verschiedenen Ausführungsformen bekannt. Üblicherweise werden sie eingesetzt, um eine Konzentration osmotisch aktiver Analyte durch eine Veränderung des osmotischen Drucks zu messen. Obwohl Osmometer reproduzierbare und genaue Messwerte liefern, werden sie für eine analytische Erfassung einzelner Stoffe selten eingesetzt, denn sie messen meist nicht selektiv einen bestimmten Stoff, sondern reagieren mit vergleichbarer Empfindlichkeit auf eine große Klasse unterschiedlicher Moleküle, die an der semipermeablen Membran aufgrund ihrer Größe einen Volumenfluss ihres Lösungsmittels, bzw. eine Druckdifferenz generieren.
Aus der US 6,475,750 ist beispielsweise ein Biosensor bekannt, bei dem zur Messung der Konzentration eines freien Moleküls ein Hydrogel in einer Messzelle verwendet wird. Das Hydrogel umfasst ein bestimmtes Bindungsmolekül, das chemisch oder physikalisch an dem Hydrogel immobilisiert ist, und ein gebundenes Molekül, das ebenfalls an dem Hydrogel immobilisiert ist. Das Hydrogel ändert seine Schwell-Neigung und seinen Druck in Abhängigkeit der Konzentration eines freien Moleküls. Das freie Molekül konkurriert mit dem gebundenen Molekül um eine Bindung an dem Bindungsmolekül. Dadurch wird die Anzahl der Hydrogelbindungen reduziert und das Hydrogel schwillt an und erhöht den Druck in der Messzelle. Eine Messvorrichtung misst den Druck oder den Schwellumfang des Hydrogels und ermittelt aufgrund der Messung die Konzentration des freien Moleküls. Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein sensorisches Membran- Osmometer und ein osmotisches Messverfahren bereitzustellen, das zur selektiven Bestimmung von Analyten, insbesondere von niedermolekularen Analyten, geeignet ist, die Konzentration eines spezifischen Analyten messen kann und eine hohe Stereospezifität und Selektivität aufweist.
Die Aufgäbe der Erfindung wird durch die Patentansprüche 1 und 19 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen gehen aus den Unteransprüchen hervor.
Nach der vorliegenden Erfindung umfasst ein Membran-Osmometer eine semipermeable Membran. An eine Seite der semipermeablen Membran grenzt eine Messlösung in einer Messzelle und an die andere Seite der Membran grenzt eine Untersuchungslösung. Ferner umfasst das Membran-Osmometer eine Messvorrichtung zur Messung einer Druckdifferenz in der Messzelle, bzw. an der semipermeablen Membran, oder eines Volumenflusses durch die semipermeable Membran. Erfindungsgemäß weist die Messlösung Liganden mit Bindungsstellen und Rezeptoren mit Bindungsgegenstellen auf. Die Liganden und Rezeptoren können durch eine Bindung der Bindungsstellen an die Bindungsgegenstellen Ligandenkomplexe bilden und können daher als Bindungspartner bezeichnet werden. Die Liganden und Rezeptoren weisen eine ausreichende Affinität zueinander auf, sodass sie auch als Affinitätsliganden und Affinitätsrezeptoren bezeichnet werden. Sie liegen in der Messlösung als gelöste Stoffe vor, können aber auch an unlöslichen Partikeln oder porösen Festkörpern gebunden sein oder in Form eines Gels vorliegen. Innerhalb der Messlösung stellt sich ohne Einwirkung von außen ein Gleichgewicht zwischen Affinitätsrezeptoren, Affinitätsliganden und Ligandenkomplexen ein. Es ist auch möglich, in der Messlösung verschiedene Arten von Affmitätsliganden mit Bindungsstellen, die zu den Bindungsgegenstellen der Affinitätsrezeptoren passen, vorzusehen. Auch ist es denkbar, an einem Affinitätsrezeptor mehrere Bindungsgegenstellen für eine Sorte von Affinitätsliganden oder verschiedenartige Bindungsgegenstellen für verschiedene Bindungsstellen unterschiedlicher Affinitätsliganden vorzusehen. Nach der Erfindung ist das Membran-Osmometer für eine Untersuchungslösung vorgesehen, die Analyten mit einer Bindungsstelle zur Bindung an die Bindungsgegenstellen der Affinitätsrezeptoren aufweist. Auch die Analyten und die Affinitätsrezeptoren sind daher Bindungspartner. Es kann daher entweder ein Aifinitätsligand oder ein Analyt über deren jeweilige Bindungsstellen an eine Bindungsgegenstelle eines Affinitätsrezeptors binden, wobei entweder Ligandenkomplexe oder Analytkomplexe entstehen. Die semipermeable Membran des Membran-Osmometers ist für die Analyten durchlässig, für die Affinitätsrezeptoren und für die Affmitätsliganden jedoch undurchlässig. Die Ursache dafür, dass ein Affinitätsrezeptor oder ein Affmitätsligand nicht durch die semipermeable Membran durchdringen, liegt vorzugsweise darin, dass eine bestimmte Teilchengröße überschritten wird. Es ist jedoch auch möglich den Affinitätsrezeptor und/oder den -liganden an einem Feststoff zu immobilisieren. Für die Funktion des erfindungsgemäßen Membranosmometers ist es ausreichend, wenn einer der nichtpermeablen Bindungspartner nach der Auflösung eines Komplexes in der Messlösung diffusibel ist und damit osmotisch an der semipermeablen Membran, d. h. in der Messzelle wirksam wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur selektiven Bestimmung eines spezifischen Analyten in einer Untersuchungslösung, vorzugsweise auch zur Messung der Konzentration des spezifischen Analyten in der Untersuchungslösung mit einem vorher beschriebenen Membran-Osmometer diffundieren die Analyten zumindest teilweise aus der Untersuchungslösung durch die semipermeable Membran in die Messlösung der Messzelle. Dadurch wird das Gleichgewicht innerhalb der Messlösung aus Affmitätsliganden, Affinitätsrezeptoren und Ligandenkomplexen verändert, sodass eine von der Messvorrichtung messbare Druckänderung innerhalb der Messzelle oder ein messbarer Volumenfluss durch die Membran erzeugt wird. Es können auch in der Messlösung bereits Analyte vorhanden sein. Dann stellt sich zwischen den Liganden, den Rezeptoren und den Ligandenkomplexen sowie den Analyten ein entsprechendes Gleichgewicht ein. Das Verfahren beruht im Allgemeinen auf dem Prinzip eines kompetitiven Affinitätsassays.
Das Gleichgewicht der Messlösung kann sich z. B. durch Dissoziation oder Assoziation der Ligandenkomplexe ändern, sobald Analyten durch die semipermeable Membran in die Messzelle diffundieren. Es ist auch möglich, dass sich das Gleichgewicht dadurch ändert, dass anstelle der Affmitätsliganden die Analyten mit ihren Bindungsstellen an die Bindungsgegenstellen der Affinitätsrezeptoren binden und auf diese Weise Analytkomplexe ausbilden. Bei der Gleichgewichtsänderung erfolgt auch eine Druckänderung in der Messlösung in der Messzelle und ein Volumenstrom durch die semipermeable Membran. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es deshalb notwendig, dass die Affinitätsliganden und -rezeptoren in einer osmotisch wirksamen Konzentration vorliegen, die mit der Messvorrichtung erfasst werden kann. Die Dissoziation der Ligandenkomplexe durch die Analyte verändert die hydraulische Wirkung der Messlösung an der semipermeablen Membran. Das heißt, die durch die Analyte beeinflusste Dissoziation oder Assoziation der Ligandenkomplexe ist mit einer Veränderung des osmotischen.Partialdrucks der unpermeablen Affinitätspartner oder mit einer Vergrößerung des hydraulischen Effekts in der Messlösung verbunden. Die Druckänderung oder Volumenänderung kann durch die Messvorrichtung des Membran-Osmometers gemessen werden.
Mit der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise biologische Stoffe analysiert und quantitativ bestimmt, sodass ein solches Membran-Osmometer als biosensorisches Membran-Osmometer bezeichnet werden kann.
Zusammengefasst besteht das Wesen der Erfindung in einem Membran-Osmometer mit einer Messzelle und einer semipermeablen Membran, wobei die Messzelle unpermeäble Affmitätsliganden und Affinitätsrezeptoren enthält, sodass diese nicht durch die Membran diffundieren. Die Affinitätsliganden weisen eine mit einem vorzugsweise niedermolekularen Analyten sterisch ähnliche Bindungsstelle auf und konkurrieren mit den Analyten an den Affmitätsrezeptoren mit deren Bindungsgegenstellen hinsichtlich der Bildung eines Affinitätskomplexes, d.h. eines Ligandenkomplexes oder eines Analytkomplexes. Geeignete Affinitätsrezeptoren sind z. B. Immunglobuline, Lektine, Avidin, oder Enzyme sowie Polynukleotide, z. B. DNA oder RNA. Außerdem kann der Affinitätsrezeptor eine polymergebundene oder immobilisierte biogene oder synthetisch hergestellte Affinitätsbindungsdomände darstellen, z. B. ein Oligonukleotid, ein Oligo- oder Polypeptid, ein Oligosaccharid, Cibachromglu oder ein anderer komplexer organischer Stoff. Die Affmitätsrezeptoren und Affmitätsliganden sind vorzugsweise Polymere und auch einzeln, d.h. in nicht aneinander gebundenem Zustand aufgrund ihrer Größe nicht permeäbel durch die Membran und bleiben daher in der Messzelle eingeschlossen, während der Analyt permeäbel ist und durch die semipermeable Membran der Messzelle leicht diffundiert.
Niedermolekulare Stoffe, wie z. B. Zucker, Salze, Aminosäuren und Ähnliches, ohne Affinität zum Affinitätsrezeptor tragen zwar nicht oder nur mit einem geringen, vorübergehenden Effekt zur Druckdifferenz an der semipermeablen Membran bei. Der Diffusionsaustausch des Analyten mit der Messzelle führt jedoch zur Dissoziation oder Assoziation der Ligandenkomplexe und dies ist bei ausreichender Konzentration an Rezeptoren und Liganden, bzw. Ligandenkomplexen, als Drackänderung detektierbar. Für niedermolekulare Stoffe mit einer Affinität zum Affinitätsrezeptor, für die jedoch noch kein konkurrierender Affinitätsligand verfügbar ist, ist es möglich, durch Konjugation mit einem Biogen oder künstlichen Polymer den niedermolekularen Stoff zu vergrößern, ohne dabei die Affinität zum Affinitätsrezeptor zu verlieren.
Für ein Messverfahren gemäß der Erfindung mit einem biosensorischen Membran- Osmometer ist eine ausreichend hohe Konzentration an Bindungsstellen in der Messzelle wesentlich. Da die Empfindlichkeit einer Messvorrichtung, wie etwa eines elektronischen Druckwandlers mit einer Biegeplatte, technisch begrenzt ist, sollte die Konzentration der Bindungsstellen in der Messzelle vorzugsweise 0,2 mM überschreiten, um entsprechend dem Vant-Hoffschen-Gesetz (24 mbar/mM) eine ausreichend hohe Modulation der Druckdifferenz in der Messzelle durch eine Ablösung der polymeren Affinitätsliganden zu ermöglichen. Für die Auswahl geeigneter Affmitätsrezeptoren sind daher die Löslichkeit des Affinitätsrezeptors und das Verhältnis zwischen seiner Molekülgröße und der Zahl der gebundenen Bindungsgegenstellen wichtig. Eine Konzentration von 1 mM für die Bindungsgegenstellen am Rezeptor erfordert bei Lektinen und Immunglobulinen Proteinmassekonzentrationen von 25 bzw. 50 g/1. Bei diesen Konzentrationen bildet nur ein Teil der in Frage kommenden Rezeptorproteine stabile wässrige Lösungen. Jedoch kann die Löslichkeit und die Lösungsstabilität von Rezeptorproteinen im Bedarfsfall durch Modifikation oder Maskierung aggregationsfördernder Domänen verbessert werden, wie z. B. bei Kim, JJ. und Parker, J. „Glukose-Binding-Property of Pegylated Concanavalin A", Pharmaceutical Research, 2001, Vol. 18, S 794-799 beschrieben ist.
Es ist auch möglich, als Affinitätsrezeptor oder als Affinitätsliganden einen diffusiblen unpermeablen Polyelektrolyten mit hoher Ladungsdichte zu verwenden, wenn die Ionenstärke in der Untersuchungslösung gering ist. In diesem Fall wirken nicht nur die unpermeablen Polyelektrolyte, sondern auch die an ihnen adsorbierten Gegenionen hydraulisch auf die semipermeable Membran. Dadurch kann die Empfindlichkeit eines erfindungsgemäßen Membranosmometers weiter gesteigert werden, da der Partialdruck der durch den Ligandenaustausch freigesetzten Polyelektrolyte den Wert, der sich aus einer molaren Konzentrationsänderung der Polyelektrolyte ergibt, übersteigt.
Nur wenn die Massekonzentration der in der Messzelle eingeschlossenen Polymere unter ihrer Überlappungskonzentration liegt, wird bekanntlich die osmotische Druckdifferenz an der Dialysemembran annähernd durch das Vant-Hoffsche-Gesetz beschrieben. Bei höheren Polymerkonzentrationen wird der osmotische Druck einer Lösung relativ unabhängig von der Teilchenkonzentration und hängt vor allem von der Massekonzentration ab. Die molare Überlappungskonzentration, bei deren Überschreitung sich die hydratisierten knäuelförmigen Polymermoleküle gegenseitig durchdringen, sinkt mit zunehmender Molekülgröße, bzw. zunehmendem Viskositätsradius. Die polymeren Affinitätsbindungsparten sollten andererseits einen kritischen Stokes' sehen Radius von 1,5 nm überschreiten, um die Permeation durch die handelsüblichen Dialysemembranen zu verhindern. Vorzugsweise wird ein Stokes 'scher Radius zwischen 2 nm und 4 nm gewählt. Dies ist bei den meisten Proteinen der Fall. Bei Polysacchariden, Polyolen oder Polyethylenoxid mit einem Stokes 'sehen Radius von 2 bis 4 nm, die als polymere Liganden geeignet sind, bleibt die Abhängigkeit des osmotischen Drucks von der molaren Konzentration bis zu einem Wert von 2 mM annähernd linear. Polymere Affmitätsliganden dieser Größe lassen sich z. B. durch Konjugation des Analyten oder eines sterisch analogen niedermolekularen Stoffes mit den genannten neutralen Hydrokolloiden herstellen.
Erfindungsgemäß können fein disperse, partikuläre Affmitätsrezeptoren, bzw. -liganden, d.h. z. B. an unlöslichen Partikeln gebundene Bindungspartner, oder an einen porösen Festkörper gebundene Bindungspartner eingesetzt werden, wenn hiermit eine ausreichende Volumenkonzentration von Bindungsstellen und Bindungsgegenstellen für das biosensorische Messverfahren erreicht werden kann. Befinden sich die für den polymeren Affinitätsliganden zugänglichen Bindungsgegenstellen in einer für den Messvorgang ausreichenden Konzentration in einer porösen Feststoffmatrix innerhalb der Messzelle, z. B. in porösem Glas, ist der Affinitätskomplex mit dem polymeren Affinitätsliganden osmotisch bzw. hydraulisch unwirksam. In diesem Fall tragen die Affmitätsliganden erst nach ihrer Ablösung von dem Affinitätsrezeptor durch den Austausch gegen einen Analyten zur Druckdifferenz oder zum Volumenfluss an der semipermeablen Membran bei.
Erfindungsgemäß kann die Messzelle als Messlösung auch ein gelartiges System oder eine Netzwerkflüssigkeit von polymeren Rezeptoren und Liganden enthalten, dessen Quellungsdruck von der Analytkonzentration abhängt. Werden polyvalente oder divalente polymere Affinitätsrezeptoren mit polyvalenten oder divalenten Affinitätsliganden in einem geeigneten Konzentrationsverhältnis versetzt, entstehen Präzipitate, in denen die Polymere in hoher Konzentration quer vernetzt vorliegen und so z. B. das gelartige System bilden, jedoch keinen Beitrag zum osmotischen Druck der Dispersion leisten. Bei Zugang z. B. eines mono alenten niedermolekularen Analyten, der in Konkurrenz zu dem Liganden steht, quellen die Präzipitate, da die Zahl der quer vernetzenden Affinitätsbindungen abnimmt. Dieser Vorgang kann in dem erfindungsgemäßen Membran- Osmometer zur Messung der Konzentration niedermolekularer Analyte genutzt werden. Wird beispielsweise eine Lösung von D-Glucose (100 mM), Concanavalin A (40 mg/ml) und verzweigten Dextranmolekülen mit einem Molekulargewicht von 20 kDa (40 mg/ml) in die Messzelle gefüllt und letztere in einen Puffer bei pH 7,4 überführt, entsteht in der Messzelle nach dem Austritt der Glucose ein Gel, in dem die terminalen nicht reduzierenden Glucosereste mit dem tetravalenten Lektin durch Affinitätsbindungen vernetzt sind. Wird der so gefüllten Messzelle Glucose in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt, steigt der Quellungsdruck entsprechend der Konzentration, weil die normalerweise bei der Umwandlung des Gels in ein Sol stattfindende Volumenzunahme der Polymerdispersion durch die Begrenzung der Messzelle verhindert wird. Bei einer sättigenden Glucosekonzentration wird der maximale Quellungsdruck gemessen. Er ist mit dem kolloidosmotischen Druck der eingeschlossenen Netzwerkflüssigkeit identisch.
Um eine Netzwerkflüssigkeit in der Messzelle zu erhalten, ist es z. B. möglich, den Ligandenaustausch in der Messzelle des Membran-Osmometers auszunützen. Ein konzentriertes Sol mit vernetzungsfähigen nichtpermeäblen polymeren Affinitätsbindungspartnern, die mehrere Bindungsstellen haben, lässt sich z. B. mit Hilfe eines Lösungsmittels herstellen, das eine für die Affinitätsbindung ungünstige Ionenzusammensetzung aufweist oder einen monovalenten niedermolekularen Affmitätsliganden enthält. Ein niedermolekularer Analyt besitzt im Allgemeinen nur eine Bindungsstelle pro Teilchen. Er kann daher im Allgemeinen bei ausreichender Konzentration eine Vernetzung verhindern, indem er den Affinitätsliganden aus einer Bindung mit dem Rezeptor verdrängt. Wird das Sol mit den vernetzungsfähigen unpermeablen Bindungspartnern in eine Messzelle mit einer semipermeablen Membran gefüllt und bringt diese mit einer Untersuchungslösung in Kontakt, entsteht in der Messzelle eine Netzwerkflüssigkeit, deren Druck an der semipermeablen Membran wirksam ist. Wird der Messlösung ein Analyt in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt, steigt der hydraulische Effekt an der Membran.
Bei dem Messverfahren mit dem erfindungsgemäßen Membran-Osmometer ist es vorteilhaft, wenn der Ligandenaustausch mit dem Analyten am Affinitätsrezeptor schnell erfolgt. Hierzu darf bekanntlich die Affinität des polymeren Affinitätsliganden am Affinitätsrezeptor nicht sehr hoch sein, d.h. die Dissoziationskonstante sollte mehr als 10 mM betragen. Ist die Affinität des Affinitätsrezeptors für den Analyten ebenfalls vergleichsweise gering, stellt sich das Bindungsgleichgewicht zwischen den Affmitätsliganden, den Analyten und den Affinitätsrezeptoren auch nach Reduktion der Analytkonzentration schnell ein. Daher ist das Membran-Osmometer bei schwachen Affinitätsbindungen für kontinuierliche Messvorgänge einsetzbar. Vorzugsweise werden Analytkonzentrationen von circa 0,1 mM oder mehr verwendet.
Ein wichtiger Anwendungsfall für ein kompetitives Affinitätsassay mit schnellem Ligandenaustausch an einem erfindungsgemäß stereospezifischen Rezeptor ist die Messung der Glucosekonzentration mit dem pflanzlichen Rezeptorprotein Concanavalin. Diese Anwendung wird in den viskosimetrischen und optischen Affinitätssensoren für Glucose im Blut und in der interstitiellen Flüssigkeit realisiert, wie z. B. in der DE 197 14 087 beschrieben ist. Dieses Rezeptorprotein ist auch für den Einsatz bei dem erfindungsgemäßen Membran-Osmometer zur Glucosebestimmung geeignet, weil z. B. Concanavalin A in wässrigen Pufferlösungen langzeitstabil und in Konzentrationen bis zu 4 mM löslich ist, wie von Kim J J. und Park K. in der bereits zitierten Veröffentlichung beschrieben wird. Außerdem stehen verschiedene monovalente polymere Affinitätsbindungspartner für Concanavalin A, z. B. Glycoside des Polyethylenoxids und Insulin, sowie polyvalente Affinitätsbindungspartner wie Dextran mit einer optimalen Molekülgröße zur Verfügung. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Membran-Osmometers gegenüber den bisher bekannten Affinitätssensoren auf der Basis von Concanavalin A besteht darin, dass mit der Messung von Druckdifferenzen ein einfaches Signalwandlungsprinzip ausgenützt werden kann.
Bei einer hohen Affinität des Affinitätsrezeptors für den Analyten und einer vergleichsweise geringen Affinität für den eingeschlossenen polymeren Affinitätsliganden können sehr geringe Analytkonzentrationen mit dem biosensorischen Membran- Osmometer erfasst werden. In diesem Fall ist jedoch die Diffusion des Analyten geschwindigkeitsbestimmend für die Gleichgewichtseinstellung. Sie erfordert bei hohen Akkumulationsraten in der Messzelle einen längeren Zeitraum. Ferner ist bei einer hohen Affinität für den Analyten dessen Bindung an den Affinitätsrezeptor nicht in kurzer Zeit reversibel. Um eine Trennung des Analyten vom Affinitätsrezeptor zu beschleunigen, kann z. B. im Fall von Immunglobulinen und Lektinen die Affinität z. B. durch Veränderung des pH-Wertes, der Ionenstärke oder durch organische Zusätze im Vergleich zu der Untersuchungslösung reversibel um mehrere Größenordnungen verändert werden. Vor jeder neuen Nutzung kann die Messzelle in ein solches geeignetes Elutionsmedium eingeführt werden, um die Analyten abzulösen.
Günstig für eine schnelle Einstellung des Diffusionsgleichgewichts des Analyten in der Messzelle ist die Verwendung des Aufbaus eines Membran-Osmometers nach der DE 197 14 586, wonach die semipermeable Membran durch ein Segment einer Mikrodialyse- Hohlfaser gebildet werden kann. Dadurch wird eine für die Messung vorteilhafte Ausgestaltung der Messzelle erreicht, die eine große Oberfläche und im Vergleich dazu ein geringes Volumen aufweist. Es wird besonders bevorzugt, wenn die Messzelle in Bezug auf die Ausdehnungsrichtung der Messlösung im Bereich der Membran auf 1 mm begrenzt ist. Hierdurch kann das Verhältnis zu dem Volumen der Messzelle und der Membranoberfläche auf einen Wert unter 200 mM herabgesetzt werden. Als Drackmessvorrichtung sind z. B. Druckwandler mit einer Biegeplatte oder einer deformierbaren Membran, vorzugsweise einer Halbleitermembran, geeignet. Wenn ein an die Membran angrenzendes Fluid unter Atmosphärendruck steht, d.h. ein mit der Atmosphäre isobares Fluid vorliegt, misst der Druckwandler beispielsweise die Druckdifferenz zur Atmosphäre und erfasst damit die Drackdifferenz über der semipermeablen Membran. Bei der Erfindung kann das Fluid von der Untersuchungs- oder Messlösung gebildet werden.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform weist das erfindungsgemäße Membran-Osmometer eine Messzelle und wenigstens eine Referenzzelle mit einer semipermeablen Membran auf, wobei die semipermeablen Membranen der Messzelle und der Referenzzelle in Qualität und Fläche übereinstimmen. Die Biegeplatte des Druckwandlers liegt zwischen der Messzelle und der Referenzzelle. Die Referenzzelle unterscheidet sich von der Messzelle darin, dass sie eine Referenzlösung beinhaltet, in der mindestens einer der polymeren Affinitätsbindungspartner, d.h. eine Art eines Liganden oder eines Rezeptors fehlt. Dabei enthalten vorzugsweise die Messzelle und die Referenzzelle die Affinitätsbindungspartner in gleichen Konzentrationen. Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass die unspezifischen osmotischen Effekte des Fluids, wie der Untersuchungs- oder Messlösung, auf die semipermeable Membran der Messzelle und damit unerwünschte Einflüsse auf die Druckänderung durch Vergleich zwischen Mess- und Referenzzelle kompensiert werden können. Mit dieser Anordnung können z. B. kolloidosmotische Effekte von Proteinen und Polyanionen ausgeglichen werden, welche die Druckdifferenz an einer semipermeablen Membran von der Ionenkonzentration des Mediums abhängig machen.
Die Messzelle und die Referenzzelle können als parallel angeordnete und am Ende verschlossene Hohlfasersegmente ausgebildet werden, die an einem Träger befestigt sind. Die Halbleitermembran des Drackwandlers ist als eine Art Trennwand zwischen der Messzelle und der Referenzzelle angebracht, sodass die Zellen mit den beiden Flächen der Drackwandlermembran kommunizieren. Hierdurch können z. B. mögliche Drackgradienten in der Untersuchungslösung kompensiert werden, die z. B. durch die Schwerkraft oder Strömungen entstehen können. Die so gestaltete Messzelle und Referenzzelle können mit einer Einfüllvorrichtung für die Messlösung und die Referenzlösung versehen werden. Die Parallelanordnung der beiden Hohlfasersegmente bietet den Vorteil, dass die gesamte Membranfläche auf einer nadelähnlichen Sonde untergebracht werden kann. Letztere ist in ein sehr kleines Flüssigkeitsvolumen oder in lebendes Gewebe emführbar. Grundsätzlich ist aber auch eine andere zur Messung geeignete Anordnung der Messzelle und der Referenzzelle denkbar.
Erfindungsgemäß kann das Membran-Osmometer mit einer Messvorrichtung versehen werden, bei der die osmotisch bedingten Spannungsänderangen an der deformierbaren Biegeplatte des Druckwandlers kompensiert werden. In diesem Fall werden die zur Aufrechterhaltung einer konstanten Spannung an der Biegeplatte des Drackwandlers erforderlichen Gegenkräfte gemessen. Diese Ausführung des biosensorischen Membran- Osmometers hat den Vorteil einer geringen zeitlichen Verzögerung bei der Einstellung des osmotischen Gleichgewichts, da der Druckwandler für den eigentlichen Messprozess keinen Volumenfluss erfordert.
Eine Ausführungsform eines erfmdungsgemäßen Membran-Osmometers ist beispielhaft anhand der Zeichnung erklärt. In Figur 1 der Zeichnung ist ein schematischer Längsschnitt durch einen Aufbau eines Membran-Osmometers gemäß der Erfindung gezeigt.
Das in Figur 1 gezeigte Membran-Osmometer besteht aus einer Messzelle 1, einer Referenzzelle 2 und einem Dracksensor mit einer Biegeplatte 3, die zwischen den beiden Zellen 1 und 2 liegt. Als Messzelle 1 und als Referenzzelle 2 dienen gleich lange Segmente einer Dialyse-Hohlfaser 4 aus regenerierter Zellulose mit hoher hydraulischer Leitfähigkeit, hohem Volumen-Elastizitätsmodul und einem scharfen Cut-Off bei einem Stokes' sehen Radius von 2 bis 3 nm. Die Dialyse-Hohlfaser bildet gleichzeitig eine semipermeable Membran der Messzelle 1 und der Referenzzelle 2. Die Segmente 4 sind auf einem Stahlträger aufgeklebt und an einem Ende 5 verschlossen. Sie werden am anderen Ende jeweils über Ventile 6 und Füllstutzen 7 mit verschiedenen Lösungsflüssigkeiten gefüllt. Das Membran-Osmometer bildet in dieser Ausgestaltung eine nadelähnliche Sonde, die wie erwähnt z. B. in ein Körpergewebe eingeführt werden kann. In der Messzelle 1 befindet sich eine Messlösung von Concanavalin A (1 mM, bezogen auf das Monomer) und einseitig glycosiliertem Polyethylenoxid mit einem Molekulargewicht von 10 kDa (40 g/1). In der Referenzzelle 2 befindet sich eine Referenzlösung von Concanavalin A (1 mM) und unmodifiziertem Polyethylenoxid mit dem gleichen Molekulargewicht und der gleichen Konzentration wie das einseitig glycosilierte Polyethylenoxid der Lösung der Messzelle 1, d.h. 10 kDa (40 g/1).
Wird die Sonde mit der Messzelle 1 und der Referenzzelle 2 z. B. in zuckerfreie Lösung gebracht, entsteht zwischen der Messzelle 1 und der Referenzzelle 2 eine Druckdifferenz von circa 60 mbar, die sich aus der Bindung des glycosilierten Polyethylenoxids an das Concanavalin A ergibt. Diese Druckdifferenz verkleinert sich bei der Erhöhung der Glucosekonzentration und verschwindet vollständig, wenn eine sättigende Glucosekonzentration von z. B. 50 mM vorliegt.
Die daxgestellte Ausführungsform hat den Vorteil, dass alle osmotischen Wirkungen auf die Drackdifferenz an der Biegeplatte 3, die nicht auf dem Austausch der Affmitätsliganden am Concanavalin A beruhen, kompensiert werden. Ein weiterer Vorteil der dargestellten Ausführangsform besteht darin, dass die Sonde so klein ist, dass sie in das Unterhautfettgewebe implantiert werden kann. Allerdings erhöht sich mit der Verkleinerung der Membranfläche der Zeitbedarf für die Deformation der Drackwanderbiegeplatte 3. Um diesen Nachteil zu vermeiden, ist eine kompensatorische Draclαnessvorrichtung, bei welcher die Spannung der deformierbaren Biegeplatte 3 konstant gehalten wird, vorteilhaft. Bezugszeichen
Messzelle
Referenzzelle
Biegeplatte
Hohlfaser-Segment
Segmentende
Ventil
Füllstutzen

Claims

Patentansprüche
1. Membran-Osmometer mit einer semipermeablen Membran (4), an deren einen Seite eine Messlösung in einer Messzelle (1) und an deren anderen Seite eine Untersuchungslösung angrenzt, und mit einer Messvorrichtung (3) zur Messung einer Druckdifferenz in der Messzelle (1) oder eines Volumenflusses durch die semipermeable Membran (4), dadurch gekennzeichnet, dass a) die Messlösung Liganden mit Bindungsstellen und Rezeptoren mit Bindungsgegenstellen aufweist, wobei die Liganden und die Rezeptoren durch eine Bindung der Bindungsstellen an die Bindungsgegenstellen Ligandenkomplexe bilden können, b) die Untersuchungslösung Analyte mit einer Bindungsstelle zur Bindung an die Bindungsgegenstellen der Rezeptoren aufweist und c) die semipermeable Membran (4) für die Analyte durchlässig und für die Rezeptoren und die Liganden undurchlässig ist.
2. Membran-Osmometer nach Ansprach 1, bei dem die Bindungsstellen der Liganden und die Bindungsstellen der Analyten sterisch ähnliche Bindungsstellen sind.
3. Membran-Osmometer nach Anspruch 1 oder 2, bei dem niedermolekulare Stoffe die Analyten bilden.
4. Membran-Osmometer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Rezeptoren und/oder die Liganden Polymere sind.
5. Membran-Osmometer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ein Rezeptor ein Protein, insbesondere ein Immunglobulin, ein Lektin oder ein Enzym ist.
6. Membran-Osmometer nach eine der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ein Rezeptor ein Oligo- oder Polynukleotid oder ein Polymer mit konjugierten Oligo- oder Polynukleotiden ist.
7. Membran-Osmometer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Bindungsstellen eines Liganden und/oder die Bindungsstellen eines Rezeptors an unlöslichen Partikeln oder in einem porösen Festkörper gebunden sind.
8. Membran-Osmometer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ein Rezeptor und/oder ein Ligand monovalent ist.
9. Membran-Osmometer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ein Rezeptor und ein Ligand divalent oder polyvalent sind.
10. Membran-Osmometer nach dem vorhergehenden Anspruch, bei dem Liganden und Rezeptoren ein vernetztes Gel bilden.
11. Membran-Osmometer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ein polymerer Ligand einen Stokes'schen Radius zwischen 2 nm und 4 nm besitzt.
12. Membran-Osmometer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Messvorrichtung ein Druckwandler mit wenigstens einer Biegeplatte (3) ist.
13. Membran-Osmometer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Biegeplatte (3) an die Atmosphäre oder ein mit der Atmosphäre isobares Fluid grenzt.
14. Membran-Osmometer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das die Messzelle (1) und eine Referenzzelle (2) umfasst, wobei die Messzelle (1) und eine Referenzzelle (2) jeweils eine semipermeable Membran (4) gleicher Größe und Qualität aufweisen und eine Referenzlösung in der Referenzzelle (2) wenigstens eine Art eines Liganden und/oder Rezeptors weniger aufweist als die Messlösung.
15. Membran-Osmometer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Biegeplatte (3) zwischen der Messzelle (1) und einer Referenzzelle (2) angeordnet ist.
16. Membran-Osmometer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die semipermeable Membran (4) durch ein Segment einer Mikrodialyse-Hohlfaser gebildet wird.
17. Membran-Osmometer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Segmente der Mikrodialyse-Hohlfaser (4) für die Messzelle (1) und die wenigstens eine Referenzzelle (2) parallel an einem in ein Körpergewebe einführbaren Träger befestigt sind.
18. Membran-Osmometer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem eine Vorrichtung zur Kompensation einer osmotisch bedingten Spannungsänderung an der Biegeplatte (3) und eine Vorrichtung zur Messung der zur Kompensation erforderlichen Gegenkräfte vorgesehen sind.
19. Verfahren zur selektiven Bestimmung eines spezifischen Analyten in einer Untersuchungslösung, wobei a) ein Membran-Osmometer nach einem der Ansprüche 1 bis 18 verwendet wird, b) die Analyten zumindest teilweise aus der Untersuchungslösung durch die semipermeable Membran (4) in die Messzelle (1) diffundieren, c) wodurch sich innerhalb der Messlösung ein Gleichgewicht aus Liganden, Rezeptoren und Ligandenkomplexen verändert und d) eine von der Messvorrichtung messbare Drackänderung in der Messzelle (1) oder ein messbarer Volumenfluss durch die Membran (4) erzeugt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem sich das Gleichgewicht in der Messzelle (1) durch Dissoziation oder Assoziation der Ligandenkomplexe ändert.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, bei dem sich das Gleichgewicht in der Messzelle (1) durch Bindung der Bindungsstellen der Analyten an die Bindungsgegenstellen der Rezeptoren zu Analytkomplexen ändert.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, bei dem eine Konzentration eines spezifischen Analyten in der Untersuchungslösung in Abhängigkeit von der Druckänderung gemessen wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, bei dem die Messzelle (1) nach einer Messung und vor einer folgenden Messung zur Trennung von Analytkomplexen in ein Medium eingebracht wird, das im Vergleich zu der Untersuchungslösung einen veränderten pH- Wert, eine veränderte lonenstärke und/oder zusätzlich organische Komponenten aufweist.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, bei dem eine Messlösung durch ein vernetztes Gel gebildet wird, das ab einer kritischen Konzentration des Analyten in ein Sol umgewandelt wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, bei dem eine Druckänderung durch unspezifische osmotische Effekte der Untersuchungs- und/oder Messlösung durch Vergleich mit einer Referenzlösung kompensiert werden.
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