WO2004067514A1 - Medizinisch nützliche 3,3-dimethyl-8-oxoisochinoline, verfahren zu ihrer herstellung sie enthaltende arzneimittel und deren verwendung - Google Patents

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WO2004067514A1 PCT/EP2003/014849 EP0314849W WO2004067514A1 WO 2004067514 A1 WO2004067514 A1 WO 2004067514A1 EP 0314849 W EP0314849 W EP 0314849W WO 2004067514 A1 WO2004067514 A1 WO 2004067514A1
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polysubstituted
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Gerhard Bringmann
Christian Rummey
Stefan Neumann
Reto Brun
August Stich
Verena Hörr
Werner E. G. MÜLLER
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Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Julius-Maximilians-Uni Versität Würzburg
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/02—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with only hydrogen atoms or radicals containing only carbon and hydrogen atoms, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring; Alkylene-bis-isoquinolines
    • C07D217/04—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with only hydrogen atoms or radicals containing only carbon and hydrogen atoms, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring; Alkylene-bis-isoquinolines with hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals attached to the ring nitrogen atom
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to new bioactive compounds from the class of 3,3-dimethyl-8-oxoisoquinolines.
  • the invention further relates to a process for the preparation of these compounds, medicaments containing them and their use in the treatment of diseases.
  • the central isoquinoline part also forms the basis for other antitumor-active substances of marine origin, for example the ingredients of sponges of the Haliclonidae family (MA Rashid, KR Gustafson, MR Boyd, R. Michael, J. Nat. Prod. 2001, 64, 1249- 1250).
  • marine isoquinoline derivatives also have antibacterial potential, for example against Staphylococcus aureus (RA Edrada, P. Proksch, V. Wray, R. Christ, L. Witte, RWM Van Soest, J. Nat. Prod. 1996, 59, 973 -976).
  • the invention thus relates to compounds of general structures 1 and 2, which (apart from the possible presence of chirality centers in R 1 -R 7 ) are deliberately intended to be achiral and therefore easy to synthesize.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 can have the following meanings:
  • R 1 can be -H or an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted alkyl, where the alkyl can be straight, branched or cyclic.
  • R 1 can be an alkenyl, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted aryl or heteroaryl radical, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted benzyl group or an acyl group (for example formyl, acetyl, trichloroacetyl, fumaryl, benzoyl, maleyl, maleyl, maleyl, maleyl branched or heteroatom or aryl substituted acyl groups etc.) as well as residues of inorganic and organic acids (eg sulfate, phosphate, carbonate, sulfonate, phosphonate, etc.) and in the case of polybasic acids their salts or 'external' alkyl or aryl esters his.
  • acyl group for example formyl, acetyl, trichloroacetyl, fumaryl, benzoyl, maleyl, maley
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 can each be one or more identical or different substituents of the following type:
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 can be -H or an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted alkyl, where the alkyl can be straight, branched or cyclic.
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 can be an alkenyl, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted aryl or heteroaryl radical, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted benzyl group or an acyl group (for example formyl, acetyl, trichloroacetyl , Fumaryl, maleyl, succinyl, benzoyl, branched or heteroatom or aryl substituted acyl groups etc.).
  • acyl group for example formyl, acetyl, trichloroacetyl , Fumaryl, maleyl, succinyl, benzoyl, branched or heteroatom or aryl substituted acyl groups etc.
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 can also each be substituted by a hydroxy- (-OH) or alkoxy substituent (for example -OMe, -OEt, -O ⁇ Pr, - / Pr, -OnBu, -O / Bu, -OsecBu, -OtBu etc.) may be represented, the alkyl group of which is branched, unbranched or cyclic.
  • a hydroxy- (-OH) or alkoxy substituent for example -OMe, -OEt, -O ⁇ Pr, - / Pr, -OnBu, -O / Bu, -OsecBu, -OtBu etc.
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 can also contain alkyl (e.g. -SMe, -SEt, etc.) bonded via a sulfur atom or a sulfonyl group (e.g. -SO 3 H, - SO 2 Me, -SO 2 CF 3 , -SO 2 C 6 H 4 CH 3 or SO 2 C 6 H CH 2 Br).
  • alkyl e.g. -SMe, -SEt, etc.
  • a sulfonyl group e.g. -SO 3 H, - SO 2 Me, -SO 2 CF 3 , -SO 2 C 6 H 4 CH 3 or SO 2 C 6 H CH 2 Br.
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 can be a fluorine, chlorine, bromine, iodine, -CN or also a hetero substituent.
  • R 1 - R 4 , 1 and 2 can be centro- or axially chiral compounds.
  • R 7 can be -H or an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted alkyl, where the alkyl can be straight, branched or cyclic. Furthermore, R 7 can be an alkenyl, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted aryl or heteroaryl radical, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted benzyl group, or acyl group (for example formyl, acetyl, trichloroacetyl, fumaryl, maleyl, heteroaryl or heteroaryl or benzyl aryl substituted or benzyl), or benzyl Acyl groups, etc.).
  • Two or more radicals can also be linked to one another in such a way that an iso- or heteroaromatic or saturated ring is thereby obtained.
  • R 2 plus R can also be an aromatic or saturated ring fused to two adjacent carbon atoms of the isoquinoline skeleton.
  • the invention also relates to all possible stereoisomers and their mixtures. Furthermore, the present invention includes the physiologically tolerable salts and solvates of the above. Links.
  • the present invention thus provides a new bioactive and synthetically producible group of substances, 3,3-dimethyl-8-oxodi- and tetrahydroisoquinolines 1 and 2; processes for their production and also for their use are also shown.
  • the compounds 1 and 2 according to the invention can be mixed with the customary solvents, auxiliaries and carriers to give tablets, dragées, capsules, drip solutions, Suppositories, injection and infusion preparations are processed to be used therapeutically for oral, rectal or parenteral application.
  • the present invention further relates to a method for producing the above-mentioned compounds.
  • a still further aspect of the present invention relates to the use of the compounds according to the invention for the treatment of diseases such as e.g. viral diseases, tumor diseases, infectious diseases and / or neurodegenerative diseases.
  • diseases such as e.g. viral diseases, tumor diseases, infectious diseases and / or neurodegenerative diseases.
  • it can be used in the form of a depot substance or as a precursor together with a suitable, pharmaceutically acceptable diluent or carrier substance.
  • the term “precursor” is understood to mean a derivative of one of the compounds according to the invention, which is only converted into its pharmaceutically active form by the metabolic conversion in the body.
  • compositions comprising a compound according to the invention, together with suitable additives or auxiliaries.
  • This pharmaceutical composition can be characterized in that the compound is in the form of a depot substance or as a precursor together with a suitable, pharmaceutically acceptable diluent or carrier substance.
  • suitable, pharmaceutically acceptable diluent or carrier substance The preparation and preparation of such pharmaceutical compositions is well known to the person skilled in the art and can be found in the relevant literature.
  • compositions in which the compound according to the invention is present in an amount of about 20 ⁇ g to 200 mg per unit dose or pharmaceutical compositions in which the compound according to the invention is present in such an amount that a dosage between 0.001 and 15.0 ⁇ g / ml, preferably between 0.01 and 5.0 ⁇ g / ml is present in the treatment in vivo.
  • a pharmaceutical composition according to the present invention which contains further chemotherapeutic agents is preferred. These chemotherapeutic agents can all chemotherapy agents customary for the expert in the Within the scope of cancer therapy, infection therapy and / or therapy of neurodegenerative diseases.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition can be in the form of tablets, dragees, capsules, drip solutions, suppositories, injection or infusion preparations for oral, rectal or parenteral use.
  • dosage forms and their preparation are known to the person skilled in the art.
  • the process products of the general formulas 1 and 2 gain additional value because they can be produced very easily by chemical synthesis.
  • the second aromatic ring can be obtained from the corresponding alcohol 3 in a single step by a Ritter reaction (JJ Ritter, PP Minieri, J. Am. Chem. Soc. 1948, 70, 4045-4048; Review: LI Krimen, DJ Cota, Org.React. 1969, 17, 213-325) with simultaneous ring closure:
  • the reaction does not produce the corresponding formamide first, but, with ring closure, the dihydroisoquinoline 1 directly. This can then be easily converted to the tetrahydroisoquinoline 2 using appropriate reducing agents (eg NaBH 4 ) or by catalytic hydrogenation.
  • appropriate reducing agents eg NaBH 4
  • corresponding alcohols 3 are known from the literature in individual cases (cf. S. Ahmad, WB Whalley, DF Jones, J. Chem. Soc. C 1971, 21, 3590-3593) and can easily be obtained from ketones 4 by single or double Grignard reaction (see G. Bringmann, R. Weirich, H. Reuscher, JR Jansen, L. Kinzinger, T. Ortmann Liebigs Ann. Chem. 1993, 877-888) or from corresponding arylacetic acid esters 5:
  • the test was carried out in 96-well microtiter plates, each with 100 ⁇ l RPMI 1640 medium with 10% fetal calf serum and 2 mM L-glutamine, each with 2000 L6 cells (rat myoblasts) per well. After 24 hours, 5000 trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi (Tulahuen strain C2C4, equipped with the galactosidase gene, Lac Z) and the substance were added in different concentrations. The plates were incubated at 37 ° C and 5% CO 2 content (incubation atmosphere) for 96 h. To determine the IC 50 values, CPRG / Nonidet was then added as a substrate.
  • the color reaction the h within the next 2-4 entwik- celt, was evaluated photometrically at 540 nm and the IC 5 o determined from the inhibition curve sigmoida- len.
  • the cytotoxicity was determined in the same test with uninfected L-6 cells at the same dilution rate. The cells were seeded and exposed to a serial dilution series of the substance for 3 days. The viability was then determined using Alamar Blue (B. Räz, M. Iten, Y. Grether- Buhler, R. Kaminsk, R. Brun, Acta Trop. 1997, 68, 139-147). The cytotoxic activities were expressed as IC 50 values.
  • Peritoneal mouse macrophages were placed in RPMI-1640 medium in 10% fetal calf serum in Lab-tek 16-chamber south. After 24 hours, Leishmania donovani amastogoths (MHOM-ET-67 / L82 strain) were added in a ratio of 3: 1 (amastigotes: macrophages). The medium still containing free amastigotes was replaced after 4 hours with fresh medium. The next day, the medium in the chambers was replaced by fresh one, which contained the corresponding test substance concentration. The chamber slides were then incubated for 96 hours at 37 ° C. under a 5% CO 2 atmosphere. The medium was then removed and the south was fixed with methanol and stained with Giemsa. The ratio of infected to non-infected macrophages was determined microscopically, compared to the control and the ICso calculated by linear regression. Antitumor effects
  • the antitumor activity of the derivatives of 3,3-dimethyl-8-oxoisochinoüne was determined in the tumor cell lines PC-12 (adrenal, phaeochromocytomal tumor [rat]; ATCC CRL 1721), Sarcoma 180 (sarcoma [mouse]; ATCC TIB 66 ) and HeLa S3 (epitheloides carcinoma [cervix; human]; ATCC CCL 2.2).
  • ED 50 concentrations below a concentration of 5 ⁇ g / ml are measured on these in vitro models, which suggest a potent effect in vivo.
  • the viral disease in which the viral disease can be an HIV-1 infection
  • the compound can be used in vivo in a concentration range between 1 and 5.0 ⁇ g / ml (blood level).
  • the person skilled in the art can easily see the amounts to be administered which are required to achieve these concentrations, which include may depend on the particular patient, the disease and the bioavailability of the compound used in each case.
  • Further HIV infections, infections with HCV (hepatitis C virus), herpes and / or RSV virus diseases may be mentioned here as examples of further viral diseases to be treated.
  • HTLV-IIIB HBV-1
  • a specific inhibition of virus production was determined in a concentration range between 1 and 5.0 ⁇ g / ml.
  • the use for neuroprotection is of particular importance for the use of the process products.
  • the present invention now relates to a method for the treatment of neurodegenerative diseases.
  • the basis of these diseases is often an impairment of the neuronal glutamate channels. Will this modulated back to physiological activities by antagonists in // 7- ⁇ ro modes, it can also be concluded that there is an effective / ⁇ -v / Vo effect. Examples of this include the clinical pictures from the group of Alzheimer's diseases (S. Perovic, M. Böhm, E. Meesters, HC Schröder, G. Pergande, WEG Müller, Mech. Aging Develop. 1998, 101, 1- 19) as well as prion diseases (WEG Müller, HC Schröder, H. Ushijima, J.
  • the invention relates to the use of a compound of the general formulas 1 and 2,
  • radicals R 1 to R 7 are as defined above, for the manufacture of a medicament for the treatment of viral, tumor and / or neurodegenerative diseases and / or for the treatment of inflammatory conditions and / or for the treatment of Chagas disease.
  • the use according to the invention preferably takes place in the form of a depot substance or as a precursor together with a suitable, pharmaceutically acceptable dilution solution or carrier substance.
  • Use according to the invention in an amount in a concentration range between 0.1 and 15.0 ⁇ g / ml in the treatment in vivo is preferred, more preferably between 0.3 and 5.0 ⁇ g / ml.
  • the administration can take place in the form of a depot substance or as a precursor together with a suitable, pharmaceutically acceptable dilution solution or carrier substance.
  • IR (film): v 3416 cm “1 (s, br, OH), 2967 (s, CH), 2837 (m, CH), 1595 (s, CO), 1462 (s), 1430 (m), 1340 (s), 1205, 1150, 1064 (s, s, s, CO).
  • reaction mixture was carefully dripped into a separatory funnel with sat. aq. Sodium carbonate solution. It was extracted three times with 100 ml of ethyl acetate. Half-conc. Was added to the combined organic phases. Hydrochloric acid and so pulled the product into the aqueous phase. This was washed twice with 100 ml of ethyl acetate and then carefully made basic with sodium carbonate. The analytically pure product was extracted therefrom by extracting three times with ethyl acetate and removing the solvent i. Vak. obtained as a dark brown oil.
  • IR (film): v 3196 crrf 1 (br, OH), 2969 (m, CH), 1611 (s, ON), 1377, 1307, 1149 (s, s, s, CO).
  • Example 3 Representation of the antiplasmodial tetra hydroisoquinoline 2b
  • the antitrypanosomal activity of the compounds was tested on T. criyz / infected L-6 cells by the method described above.
  • compound 1a has a good - selective - activity against L. donovani, much better than, for example, against T. cruzi (ICso> 50 ⁇ g / ml).
  • the anti-tumor activity of the 3,3-dimethyl-8-oxoisoquinone was tested on a number of tumor-transformed cells, such as the L5178y mouse lymphoma cell system (ATCC CRL 1722). As described (W.E.G. Müller, R.K. Zahn, Cancer Res. 1979, 39, 1102-1107), the cells were cultivated in RPMI medium to which 10% fetal calf serum had been added. 10,000 cells / ml were chosen as the inoculum concentration. At the start, the selected substance was added and the culture was incubated for 72 hours.
  • the number of living cells was then determined using the colorimetric XTT approach and evaluated using an ELISA reader (see: DA Scudiero, RH Shoemaker, KD Pauli, A. Monks, S. Tierney, TH Nofziger, MJ Currens, D Seniff, MR Boyd, Cancer Res. 1988, 48, 4827-4833; T. Daum, J. Engels, M. Mag, J. Muth, S. Lücking, HC Schröder, E. Matthes, WEG Müller, Intervirology 1992, 33, 65-75).
  • the ED 50 concentrations of some selected dimethyl-8-oxo-isoquinoline derivatives for the above-mentioned tumor cells were determined by linear regression after the colorimetric XTT test (L. Sachs, Applied Statistics. Springer, Berlin, 1984 1-168). The respective mean values with the associated standard deviations were determined from 10 independent experiments. The antitumor activities for L5178y mouse lymphoma cells are shown below.
  • the dimethyl-8-oxoisoquinoline derivatives significantly reduce cell proliferation after 72 h at the low required concentrations of up to 0.4 ⁇ g / ml. Particularly inhibiting - and highly selective - is 2g with an activity (ED 50 concentration) of 0.4 ⁇ 0.1 ⁇ g / ml.
  • the other derivatives also have a pronounced effect on the cell proliferation of L5178y cells.
  • the ED ⁇ o concentration of the dimethyl-8-oxoisoquinone derivatives in cell culture batches of PC-12 cells, Sarcoma-180 cells and HeLa-S3 cells is also low.
  • the derivative 2g can also be mentioned, which has an ED 50 concentration of 3.7 ⁇ 0.4 ⁇ g / ml in PC-12 cells. It can therefore be concluded that the antitumor spectrum of the dimethyl-8-oxoisoquinone derivatives is broad.
  • H9 cells and H9 cells infected with HTLV-IIIB were used in a concentration of 0.2 ⁇ 1,000,000 cells / ml of culture medium for inoculating a culture medium. After 4 days of incubation, the density of the H9 cells was 1.4 x 1,000,000 cells / ml, while the density of the H9 cells infected with HTLV-IIIB was only 0.7 x 1,000,000 cells / ml; these two values formed the control values. Then samples of H9-HTLV-IIIB cells (0.2 x 1,000,000 cells / ml) were treated for 4 days with different concentrations of 2a. The following results were obtained:
  • test parameter is based on the inhibition of the production of reverse transcriptase and the expression of the p24 and p15 proteins.
  • Fura-2-acetoxymethyl ester was from Molecular Probes (Leiden, The Netherlands), RPMI 1640 from Biochrom KG (Berlin, Germany) and the antibodies "Mice-anti-neurofilament” (68 kDa) and "Mice- anti-glial-fibrillary-acidic-protein ,, (Anti-GFAP) from Röche Diagnostics (Mannheim, Germany).
  • the cortical cell culture was obtained from the brains of 17-18 day old rat embryos according to RI Freshney (in: Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (ed .: RI Freshney), AR Liss Inc., New York, 1987, Pp. 257-288) hold; the method was slightly modified (S. Perovic, C. Schleger, G. Pergande, S. Iskric, H. Ushijima, P. Rytik, WEG Müller, Eur. J. Pharmacol. 1994, 288, 27-33).
  • the neurons were isolated from the cerebral hemispheres and transferred to "Hank's ballanced salt solution" without Ca 2+ and Mg 2+ (HBSS).
  • the cells were previously dissociated in HBSS using 0.025% (w / v) trypsin (10 min; 37 ° C). The proteolytic reaction was terminated with 10% (v / v) fetal calf serum (FCS). The single cell suspension was centrifuged and the resulting pellet was taken up in medium. The cells were plated in a chamber coated with poly-L-lysine (5 ⁇ g / ml, 300 ⁇ l / cm 2 ) with a cell density of 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 . The DMEM / 10% FCS medium was removed 2 days after isolation and replaced with DM EM / serum-free medium.
  • FCS fetal calf serum
  • immunostaining was carried out with “anti-neurofilament” antibodies (against a 68 kDa protein) as markers for neurons and “anti-GFAP” as markers for glial cells.
  • the cultures contain> 80% neurons; the remaining cells were GFAP positive and mainly represented astrocytes.
  • Loading neurons with Fura-2-AM The intracellular Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ] j) was determined by fluorescence measurements. The ratio of the fluorescence of the Ca 2+ indicator dye fura-2-AM at the wavelengths of 340 and 380 nm was used as parameters (G. Grynkiewicz, M. Poenie, RY Tsien, J. Biol. Chem. 1985, 260, 3440 -3450). The neurons were loaded with 4 ⁇ M fura-2-AM in DMEM / serum-free medium (plus 1% bovine serum albumin) for 45 min at 37 ° C. After the incubation, the cells were washed twice with medium and incubated at 37 ° C. for a further 45 min. This incubation period is sufficient to load the neurons with "inactive [insensitive] fura-2"; the intracellular hydrolysis by esterases can then take place.
  • a calcium calibration curve was determined using the method of Grynkiewicz et al. (See literature above). Fluorescence images were obtained at 340 nm and 380 nm. The quotient from the two fluorescence data (340/380 nm) was calculated and used for the preparation of the Kaübri fürsku ⁇ te. A unit [ratio unit] of 1.0 from this quotient (340/380 nm) corresponds to 228 nM [Ca 2+ ] j.
  • mice were stimulated with 0.25% DMSO (control) for 5 min; after 10 min, 200 ⁇ l L-glutamic acid and 2.4 mM CaCl 2 were added to the cells.
  • the test mixture (with the substances according to the invention), the cells were initially preincubated with the test derivatives (5 min with 1 ⁇ g / ml of the 3,3-dimethyl-8-oxoisoquinoline); 200 ⁇ M L-glutamate and 2.4 mM CaCl 2 were then added to the batches (for 10 min) and the change in the calcium level of the preincubated neurons was determined. The duration of the experiment to measure the [Ca 2+ ] - level was 20-22 min.
  • the cells were cultivated on poly-L-lysine-coated cover glasses in a 4-chamber system (Lab-Tek Chamber Slide System; Nunc, Wiesbaden, Germany).
  • the fluorescence measurements were carried out with an "inverted-stage" Olympus IX70 microscope with apochromatic reflecting light and the fluorescence objective UApo40X / 340.
  • the cells were alternately illuminated with light of the wavelengths 340 and 380 nm using a computer-controlled narrowband interference filter in front of a 100 W xenon lamp.
  • a 0.25 ND filter for 380 nm was used.
  • the fluorescence emissions at 510 nm were recorded with a CCD camera (model C2400-87; Hamamatsu, Herrsching, Germany).
  • the images were computerized, using the Argus 50 imaging system, Hamamatsu, digitized as 256x256 pixels with 8-bit arrays.
  • the fluorescence ratio [ratio] 340nm / 380nm was determined by dividing the image pairs.
  • the neurons were treated with the relevant new substance 2d (5 min) and then with L-glutamate (200 ⁇ M) in the presence of 2.4 mM CaCl 2 .
  • L-glutamate used as an agonist and the neurons without pyrrole alkaloid cubed, an increase in intracellular calcium ([Ca 2+ ] from a ratio unit of 0.8 to a ratio unit of 2.6 was determined (see FIG. 1).
  • FIG. 1 shows the reduction in the increase in intracellular calcium ions caused by the glutamate receptor agonist L-glutamate in neurons by the new substance 2d.
  • the neurons were only treated with L-glutamate ( ⁇ ).

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Abstract

Es werden die Verbindungen (3,3-Dimethyl-8-oxoisochinolin-Derivate) der allgemeinen Formeln (I) und (II) beschrieben sowie Verfahren zu ihrer Herstellung. 3,3-Dimethyl-8-oxoisochinoline haben in Zellkulturmodellen antivirale und Antitumor-Eigenschaften. Weiterhin stellen diese Substanzen Inhibitoren für neurodegenerative Erkrankungen dar und zeigen eine ausgeprägte antiprotozoische Aktivität.

Description

Medizinisch nützliche 3,3-Dimethyl-8-oxoisochinoline, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue bioaktive Verbindungen aus der Klasse der 3,3-Dimethyl-8-oxoisochinoline. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen, diese enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen.
Hintergrund der Erfindung
Die herausragende Rolle von marinen Organismen als Quelle von Wirkstoffen kristallisiert sich in den letzten Jahren immer mehr heraus. Dies gilt sowohl für den antiparasitären Bereich (siehe z.B. O. Kayser, A. F. Kiderlein, S. L. Croft, Studies in Natural Products Chemistry 2002, 779-848), als auch insbesondere für antitumorale Substanzen (z. B. G. Schwartsmann, A. B. da Rocha, R. G. S. Berlinck, J. Jimeno, Lan- cet Oncol. 2001 , 2, 221-225). So fand man beispielsweise für das ungewöhnliche Isochinolin-Alkaloid Imbricatin, isoliert aus dem Seestern Dermasterias imbricata, sehr aussichtsreiche Aktivitäten gegen humane Brustkrebszellinien (siehe J. Stingl, R. Andersen, J. T. Emerman Cancer Chemoth. Pharm. 1992, 30, 401-406; C. Pathi- rana, R. J. Andersen J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 8288-8289).
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Imbricatin Der zentrale Isochinolinteil bildet auch die Basis für andere antitumor-aktive Substanzen marinen Ursprungs, beispielsweise die Inhaltstoffe von Schwämmen der Familie Haliclonidae (M. A. Rashid, K. R. Gustafson, M. R. Boyd, R. Michael, J. Nat. Prod. 2001, 64, 1249-1250). Darüber hinaus zeigen marine Isochinolin-Derivate auch antibakterielles Potenzial, beispielsweise gegen Staphylococcus aureus (R. A. Edrada, P. Proksch, V. Wray, R. Christ, L. Witte, R. W. M. Van Soest, J. Nat. Prod. 1996, 59, 973-976).
Auch die - wenngleich aus terrestrischen Pflanzen stammenden -Naphthylisochino- lin-Alkaloide (siehe u.a. G. Bringmann, D. Feineis, Act. Chim. Therap. 2000, 26, 151- 171 ; G. Bringmann, F. Pokorny in The Alkaloids (Hrsg.: G. Cordeil), Bd. 46, Acade- mic Press, New York, 1995, S. 127-271 ; G. Bringmann, U. Holzgrabe, V. Hoerr, G. Stich, Pharmazie, im Druck) weisen ein überaus interessantes Spektrum von antiinfektiösen Eigenschaften auf; so zeigt z.B. Dioncophyllin C hohe antiplasmodiale Aktivität in vitro und in vivo.
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C )H e Dioncophyllin C
Alle diese Befunde veranlassten die Erfinder, nach alternativen Isόchinolin-Derivaten, die gleichzeitig chemisch leichter zugänglich (weil ohne Chiralität an C-1 und C-3) sein sollten, zu suchen. Pharmazeutisch interessante und möglicherweise medizinisch nützliche Eigenschaften standen dabei im Mittelpunkt.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass 3,3-Dimethyl-8-oxo-3,4-di- und - 1 ,2,3,4-tetrahydroisochinoline der allgemeinen Formeln 1 und 2 ausgeprägte antiin- fektive, wie zum Beispiel antiprotozoische (z.B. antitrypanosomale, antileishmaniale und antiplasmodiale) und antitumorale Eigenschaften besitzen.
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Die Erfindung somit betrifft Verbindungen der allgemeinen Strukturen 1 und 2, wobei diese (abgesehen von der möglichen Präsenz von Chiralitätszentren in R1-R7) be- wusst möglichst achiral und damit leicht synthetisierbar sein sollen.
Die Substituenten R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7 können dabei die folgenden Bedeutungen haben:
R1 kann -H oder ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes Alkyl sein, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann.
Weiterhin kann R1 ein Alkenyl, ein unsubstituierter, monosubstituierter oder polysub- stituierter Aryl- oder Heteroarylrest, eine unsubstituierte, monosubstituierte oder po- lysubstituierte Benzylgruppe oder eine Acylgruppe (z.B. Formyl, Acetyl, Trichlorace- tyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, verzweigte oder heteroatom- oder arylsub- stituierte Acylgruppen usw.) sowie Reste anorganischer und organischer Säuren (z.B. Sulfat, Phosphat, Carbonat, Sulfonat, Phosphonat, etc.) und im Falle mehrbasi- ger Säuren deren Salze oder 'externe' Alkyl- oder Arylester sein.
R2, R3, R4, R5 und R6 können jeweils ein oder mehrere gleiche oder verschiedene Substituenten der folgenden Art sein:
R2, R3, R4, R5 und R6 können -H oder ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes Alkyl sein, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann. Weiterhin können R2, R3, R4, R5 und R6 ein Alkenyl, ein unsubstituierter, monosub- stituierter oder polysubstituierter Aryl- oder Heteroarylrest, eine unsubstituierte, monosubstituierte oder polysubstituierte Benzylgruppe oder eine Acylgruppe sein (z.B. Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, verzweigte oder heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppen usw.).
R2, R3, R4, R5 und R6 können jeweils auch durch einen Hydroxy- (-OH) oder Alkoxy- substituenten (z.B. -OMe, -OEt, -OπPr, -/Pr, -OnBu, -O/Bu, -OsecBu, -OtBu usw.) repräsentiert sein, dessen Alkylgruppe verzweigt, unverzweigt oder cyclisch ist.
R2, R3, R4, R5 und R6 können neben Thiol (-SH) auch über ein Schwefelatom gebundene Alkyl- (z. B. -SMe, -SEt, usw.) oder eine Sulfonylgruppe (z. B. -SO3H, - SO2Me, -SO2CF3, -SO2C6H4CH3 oder SO2C6H CH2Br) sein.
R2, R3, R4, R5 und R6 können ein Stickstoffsubstituent sein [z.B. -NH2, -NHR, -NRR" (R, R' = Alkyl, Aryl usw.), -NC, -N02 usw.].
Des Weiteren können R2, R3, R4, R5 und R6 ein Fluor-, Chlor-, Brom-, lod-, -CN oder auch ein Heterosubstituent sein.
Im Falle von R5 ungleich R6 oder bei sperrigen Arylresten R1 - R4 können 1 und 2 zentro- oder axialchirale Verbindungen sein.
R7 kann -H oder ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes Alkyl sein, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann. Weiterhin kann R7 ein Alkenyl, ein unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Aryl- oder Heteroarylrest, eine unsubstituierte, monosubstituierte oder polysubstituierte Benzylgruppe, oder Acylgruppe (z.B. Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, verzweigte oder heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppen usw.) sein.
Auch können zwei oder mehr Reste (z.B. ein Rest R1 und ein Rest R2 oder ein Rest R4 und ein Rest R6) so untereinander in der Art verknüpft sein, dass dadurch ein iso- oder heteroaromatischer oder -gesättigter Ring erhalten wird. So kann z.B. R2 plus R auch ein an zwei benachbarten Kohlenstoffatomen des Isochinolingerüsts kondensierter aromatischer oder gesättigter Ring sein.
Die Erfindung betrifft ebenfalls alle möglichen Stereoisomere und deren Gemische. Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung die physiologisch verträglichen Salze und Solvate der o. g. Verbindungen.
Ausgenommen sind die folgenden Verbindungen sein, die bereits vorher in R. C. Bemotas, C. E. Thomas, A. A. Carr, T. R. Niedzuak, G. Adams, D. F. Ohlweiler, D. A. Hay, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6, 1105-1110; J. P. Gavin, R. D. Waigh, J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1 1990, 3, 503-508; und G. Schwachhofer, J. Chopin, Bull. Soc. Chim. France 1962, 835-843 beschrieben wurden:
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Eine biologische Wirksamkeit der oben genannten Verbindungen wurde durch die oben genannten Veröffentlichungen jedoch nicht beschrieben. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formeln 1 und 2, die aus den folgenden Strukturformeln ausgewählt sind:
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1d und deren physiologisch verträgliche Salze und
Solvate.
Mit der vorliegenden Erfindung wird somit eine neue bioaktive und synthetisch herstellbare Substanzgruppe, die 3,3-Dimethyl-8-oxodi- und -tetrahydroisochinoline 1 und 2, zur Verfügung gestellt; ferner werden Verfahren zu deren Herstellung und auch zu deren Verwendung dargestellt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen 1 und 2 können mit den üblichen Lösungsmitteln, Hilfs- und Trägerstoffen zu Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions- und Infusionszubereitungen verarbeitet werden, um therapeutisch zur peroralen, rektalen oder parenteralen Applikation Verwendung zu finden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der oben genannten Verbindungen.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen, wie z.B. viralen Erkrankungen, Tumorerkrankungen, Infektionserkrankungen und/oder neurodegene- rativen Erkrankungen. Die Verwendung kann zum Beispiel in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz erfolgen. Dabei wird im Rahmen der Erfindung unter dem Begriff „Vorläufer" ein Derivat einer der erfindungsgemäßen Verbindungen verstanden, das erst durch die metabolische Umsetzung im Körper in ihre pharmazeutisch aktive Form überführt wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung, zusammen mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz vorliegt. Die Herstellung und Zubereitung solcher pharmazeutischen Zusammensetzungen ist dem Fachmann gut bekannt und kann aus der einschlägigen Literatur entnommen werden.
Besonders bevorzugt sind pharmazeutische Zusammensetzungen, in denen die erfindungsgemäße Verbindung in einer Menge von etwa 20 μg bis 200 mg pro Dosiseinheit vorliegt, oder pharmazeutische Zusammensetzungen, in denen die erfindungsgemäße Verbindung in solch einer Menge vorliegt, dass eine Dosierung zwischen 0,001 und 15,0 μg/ml, bevorzugt zwischen 0,01 und 5,0 μg/ml bei der Behandlung in vivo vorliegt. Bevorzugt ist eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, die weitere Chemotherapeutika enthält. Diese Chemotherapeutika können alle für den Fachmann üblichen Chemotherapeutika im Rahmen einer Krebstherapie, Infektionstherapie und/oder Therapie von neurodege- nerativen Erkrankungen umfassen.
Erfindungsgemäß kann die oben genannte pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropf lösungen, Suppositorien, Injektionsoder Infusionszubereitungen zur peroralen, rektalen oder parenteralen Verwendung vorliegen. Solche Darreichungsformen und deren Herstellung sind dem Fachmann bekannt.
Die Verfahrensprodukte der allgemeinen Formeln 1 und 2 gewinnen zusätzlich an Wert dadurch, dass sie sich sehr leicht durch chemische Synthese herstellen lassen. Generell lässt sich der zweite aromatische Ring aus dem entsprechenden Alkohol 3 in einer einzigen Stufe, durch Ritter-Reaktion (J. J. Ritter, P. P. Minieri, J. Am. Chem. Soc. 1948, 70, 4045-4048; Review: L. I. Krimen, D. J. Cota, Org. React. 1969, 17, 213-325) mit gleichzeitigem Ringschluss gewinnen:
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Schema 1. Ein effizienter Zugang zu den erfindungsgemäßen Verbindungen 1 und
Aufgrund des durch die Sauerstofffunktion elektronenreichen Aromaten entsteht bei der Reaktion nämlich nicht erst das entsprechende Formamid, sondern, unter Ringschluss, direkt das Dihydroisochinolin 1. Dieses kann anschließend leicht mit entsprechenden Reduktionsmitteln (z.B. NaBH4) oder durch katalytische Hydrierung zum Tetrahydroisochinolin 2 umgesetzt werden.
Die entsprechenden Alkohole 3 sind in Einzelfällen literaturbekannt (vgl. S. Ahmad, W. B. Whalley, D. F. Jones, J. Chem. Soc. C 1971 , 21, 3590-3593) und können leicht durch einfache oder doppelte Grignard-Reaktion aus Ketonen 4 (vgl. G. Bringmann, R. Weirich, H. Reuscher, J.R. Jansen, L. Kinzinger, T. Ortmann Liebigs Ann. Chem. 1993, 877-888) oder aus entsprechenden Arylessigsäure-Estern 5 hergestellt werden:
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Alle Reaktionen verlaufen in guten bis sehr guten chemischen Ausbeuten. Dies macht die Heterocyclen des Typs 1 und 2 zu einer leicht in großen Mengen und unterschiedlichsten Varianten verfügbaren Substanzklasse. Aber auch andere Syntheseverfahren zum Aufbau der erfindungsgemäßen Substanzen 1 und 2 sind möglich, z.B. durch Bischler-Napieralski- bzw. Pictet-Spengler-Synthese (siehe z.B. W. M. Whaley, T. R. Govindachari, Org. React. 1951 , 6, 74-89; G. Fodor, S. Nagubandi, Heterocycles 1981, 15, 165-178).
Die Verfahrensprodukte der allgemeinen Formeln 1 und 2 besitzen wertvolle phar- makologische Eigenschaften. Diese wurden nach folgenden Verfahren bestimmt:
Antitrypanosomale Wirkungen
Der Test wurde in 96-Loch-Mikrotiterplatten mit je 100 μl RPMI 1640 Medium mit 10% fötalem Kälberserum und 2mM L-Glutamin durchgeführt, jeweils mit 2000 L6- Zellen (Rattenmyoblasten) pro Well. Nach 24 h wurden 5000 trypomastigote Formen von Trypanosoma cruzi (Tulahuen-Stamm C2C4, ausgestattet mit dem Galactosida- se-Gen, Lac Z) und die Substanz in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben. Die Platten wurden bei 37°C und bei 5% CO2-Gehalt (Inkubations-Atmosphäre) 96 h lang inkubiert. Zur Bestimmung der ICso-Werte wurde danach CPRG/Nonidet als Substrat zugegeben. Die Farbreaktion, die sich innerhalb der nächsten 2-4 h entwik- kelte, wurde photometrisch bei 540 nm ausgewertet und der IC5o aus der sigmoida- len Hemmungskurve bestimmt. Die Zytotoxizität wurde im selben Test mit nicht infizierten L-6-Zellen bei gleicher Verdünnungsrate bestimmt. Die Zellen wurden ausgesät und 3 Tage lang einer seriellen Verdünnungsreihe der Substanz ausgesetzt. Dann wurde die Viabilität mittels Alamar Blue bestimmt (B. Räz, M. Iten, Y. Grether- Buhler, R. Kaminsk, R. Brun, Acta Trop. 1997, 68, 139-147). Die zytotoxischen Aktivitäten wurden als IC50-Werte ausgedrückt.
Antiplasmodiale Wirkungen
Für die Bestimmung der antiplasmodialen Aktivitäten wurden Zellkulturen des K1- Stamms (resistent gegen Chloroquin und Pyrimethamin) verwendet. Es wurde eine Modifikation (R. G. Ridley, W. Hofheinz, H. Matile, C. Jacquet, A. Dorn, R. Masciadri, S. Jolidon, W. F. Richter, A. Guenzi, M. A. Girometta, H. Urwyier, W. Huber, S. Thaitong, W. Peters, Antimicrob. Agents Chemother. 1996, 40, 1846-1854) des [3H]- Hypoxanthin-Einbau-Tests (R. E. Desjardins, C. J. Canfield, D. Haynes, J. Chulay, Antimicrob. Agents Chemother. 1979, 16, 710-718) verwendet. Mit Plasmodium falci- parum infizierte menschliche rote Blutkörperchen wurden mit seriellen Wirkstoffverdünnungsreihen in Mikrotiterplatten 48 h lang bei 37°C, unter einer CO2- angereicherten und O2- reduzierten Atmosphäre inkubiert. [3H]-Hypoxanthin wurde zu jedem Well der Mikrotiterplatte hinzugegeben, und nach weiteren 24 h Inkubationszeit wurden die Wells auf Glasfaserfiltern abgeerntet. Die Zahl der lebenden Zellen wurde mit Hilfe eines Szintillationszählers bestimmt. Der ICso-Wert wurde aus sigmoidalen Inhibierungskurven bestimmt. Die Tests wurden zweimal durchgeführt und mindestens einmal wiederholt.
Antileishmaniale Wirkungen
Peritoneale Maus-Macrophagen wurden in RPMI-1640-Medium in 10% foetalem Kälberserum in Lab-tek 16-Kammer Südes eingebracht. Nach 24 h wurden Leishma- nia-donovani-Amast\goten (MHOM-ET-67/L82-Stamm) im Verhältnis 3:1 (Amastigo- ten : Macrophagen) hinzugefügt. Das noch freie Amastigoten enthaltende Medium wurde nach 4 h durch frisches Medium ersetzt. Am nächsten Tag wurde das Medium in den Kammern durch frisches ersetzt, welches die entsprechende Testsubstanz- Konzentration enthielt. Anschließend wurden die Kammer-Slides 96 h lang bei 37 °C unter 5%iger Cθ2-Atmosphäre inkubiert. Danach wurde das Medium entfernt, und die Südes wurden mit Methanol fixiert und mit Giemsa gefärbt. Das Verhältnis von infizierten zu nicht-infizierten Macrophagen wurde mikroskopisch bestimmt, ins Verhältnis zur Kontrolle gesetzt und der ICso- ert durch lineare Regression berechnet. Antitumorale Wirkungen
Die Antitumorwirkung wurde u.a. am L5178y-Mäuselymphomzellsystem nachgewiesen (ATCC CRL 1722). Diese Zellen wurden in Suspensionskultur gehalten, wie bereits früher beschrieben (W. E. G. Müller, R. K. Zahn, Cancer Res. 1979, 39, 1102- 1107). Die ED50-Konzentrationen für einige ausgewählte 3,3-Dimethyl-8- oxoisochinoün-Derivate-Derivate sind im Folgenden aufgeführt.
Die Antitumor-Aktivität der Derivate der 3,3-Dimethyl-8-oxoisochinoüne wurde bei den Tumorzell-Linien PC-12 (adrenaler, phaeochromocytomaler Tumor [Ratte]; ATCC CRL 1721), Sarcoma 180 (Sarkom [Maus]; ATCC TIB 66) sowie HeLa S3 (epitheloides Carcinom [Cervix; Mensch]; ATCC CCL 2.2) gezeigt. An diesen In-vitro- Modellen werden ED50-Konzentrationen unterhalb einer Konzentration von 5 μg/ml gemessen, die auf eine potente Wirkung in vivo schließen lassen.
Antivirale Aktivität
Weiterhin wird ein Verfahren zur Behandlung von Viruserkrankungen, bei dem die Viruserkrankung eine HIV-1 -Infektion sein kann, offenbart. Dabei kann die Verbindung in vivo in einem Konzentrationsbereich zwischen 1 und 5,0 μg/ml (Blutspiegel) angewandt werden. Dem Fachmann sind die für die Erreichung dieser Konzentrationen erforderlichen zu verabreichenden Mengen leicht ersichtlich, die u.a. von dem jeweiligen Patienten, der Erkrankung und der Bioverfügbarkeit der jeweils verwendeten Verbindung abhängen können. Als weitere zu therapierende virale Erkrankungen seien hier beispielhaft weitere HIV-Infektionen, Infektionen mit HCV (Hepatitis-C- Virus), Herpes- und/oder RSV-Virus-Erkrankungen genannt.
Die ausgeprägte antivirale Wirksamkeit der Verfahrensprodukte wurde im HTLV-IIIB (HIV-1) Testsystem nachgewiesen. Eine spezifische Hemmung der Virus-Produktion wurde bei einem Konzentrationsbereich zwischen 1 und 5,0 μg/ml ermittelt.
Neuroprotektive Wirkungen
Von besonderer Bedeutung für die Verwendung der Verfahrensprodukte ist der Einsatz zur Neuroprotektion. Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen. Grundlage dieser Erkrankungen ist häufig eine Beeinträchtigung der neuronalen Glutamat-Kanäle. Werden diese durch Antagonisten in //7-wϊro-Modeüen auf physiologische Aktivitäten zurückmoduliert, kann auch auf eine effektive /π-v/Vo-Wirkung geschlossen werden. Als Beispiele hierfür seien die Krankheitsbilder aus der Gruppe der Alzheimer- Erkrankungen erwähnt (S. Perovic, M. Böhm, E. Meesters, H. C. Schröder, G. Per- gande, W. E. G. Müller, Mech. Ageing Develop. 1998, 101, 1-19) sowie auch Prion- Erkrankungen (W. E. G. Müller, H. C. Schröder, H. Ushijima, J. Dapper and J. Bormann, Europ. J. Pharmacol. 1992, 226, 209-214). Die gefundenen effektiven Dosen, die neuroprotektiv wirken, liegen ebenfalls unterhalb von 5 μg/ml in den verwandten /n-w-ro-Modellen. Dieser Befund lässt wiederum auf einen hohen therapeutischen Nutzen dieser Chemikalien bei neurodegenerativen Erkrankungen schließen.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formeln 1 und 2,
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1
wobei die Reste R1 bis R7 wie oben definiert sind, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von viralen, Tumor- und/oder neurodegenerativen Erkrankungen und/oder zur Behandlung von Entzündungszuständen und/oder zur Behandlung der Chagas-Krankheit.
Die erfindungsgemäße Verwendung findet bevorzugt in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz statt. Bevorzugt ist dabei eine erfindungsgemäße Verwendung in einer Menge in einem Konzentrationsbereich zwischen 0,1 und 15,0 μg/ml bei der Behandlung in vivo, weiter bevorzugt zwischen 0,3 und 5,0 μg/ml. Die Verabreichung kann erfindungsgemäß in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz erfolgen.
Die Erfindung soll im Folgenden anhand von Beispielen näher verdeutlicht werden, ohne jedoch in irgendeiner Weise auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Beispiel 1 : Synthese der antileishmanialen Verbindung 1a Synthese des Alkohols 3a
MeMgBr
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Zu einer Lösung von 6,00 g (30,9 mMol) des Ketons 4a in 100 ml abs. Diethylether tropfte man bei 0 °C langsam 21 ml einer 1 ,5 M-Lösung von Methylmagnesiumbro- mid (31 mMol) in Diethylether. Man erhitzte 1 h zum Rückfluss. Nach Ansäuern mit verd. Salzsäure gewann man das Produkt durch Ausschütteln mit Diethylether.
Diese Arbeitsvorschrift ist günstiger als eine aus der Literatur bekannte (S. Ahmad, W. B. Whalley, D. F. Jones, J. Chem. Soc. C 1971, 21, 3590-3593), bei der 3a nur als Nebenprodukt entsteht, darüber hinaus verzichtet sie im Gegensatz zur bekannten Darstellung von 3a auf den Einsatz giftiger Cadmiumsalze.
Ausbeute: 6,17 g (29,4 mMol, 95 %).
IR (Film): v = 3416 cm"1 (s, br, O-H), 2967 (s, C-H), 2837 (m, C-H), 1595 (s, C-O), 1462 (s), 1430 (m), 1340 (s), 1205, 1150, 1064 (s, s, s, C-O).
1H-NMR (400 MHz, CDCI3): δ = 1 ,25 (s, 6 H, CCH3), 2,71 (s, 2 H, Ar-CH2), 3,79 (s, 6 H, OCH3), 6,34 (s, 3 H, Ar-H). 13C-NMR (100 MHz, CDCI3): δ = 29,68 (CCH3), 50,39 (CCH2), 55,69 (OCH3), 71 ,03 (CCH3), 98,83, 109,0, 140,4, 161 ,0 (Ar-C).
MS (70 eV): m/z (%) = 210 (10) [M+], 195 (14) [M+ - CH3], 192 (21) [M+ - OH2], 177 (28) [M+ - CH30], 152 (100) [M+ - C2H2O2],91(26) [C7H7 +], 77 (20) [C6H5 +], 59 (53) [C2H3O2 +], 51 (11) [C4H3 +], 43 (23) [C2H3O+].
Cι2H18O3 (210,27) Ber. C 68,25 H 8.46 Gef. C 68,55 H 8,62.
Synthese der antileishmanialen Verbindung 1a
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Zu einer Lösung von 3,00 g (14,2 mMol) des Alkohols 3a in 10 ml Eisessig wurden 924 mg (14,2 mMol) Kaüumcyanid gegeben. Durch einen Tropftrichter fügte man unter ständigem Rühren innerhalb von 20 min 10 ml konz. Schwefelsäure hinzu. Die Reaktionstemperatur wurde durch Kühlung von außen auf 10-20 °C eingestellt. Evtl. entstehende Blausäuredämpfe wurden durch Einleiten in eine wässrige Natriumhypochlorit-Lösung vernichtet.
Die Reaktionsmischung tropfte man vorsichtig in einen Scheidetrichter mit ges. wässr. Natriumcarbonatlösung. Es wurde dreimal mit je 100 ml Ethylacetat extrahiert. Zu den vereinigten organischen Phasen gab man halbkonz. Salzsäure und zog das Produkt so in die wässrige Phase. Diese wurde zweimal mit je 100 ml Ethylacetat gewaschen und anschließend vorsichtig mit Natriumcarbonat basisch gestellt. Das analysenreine Produkt wurde hieraus durch dreimaliges Extrahieren mit Ethylacetat und Entfernen des Lösungsmittels i. Vak. als dunkelbraunes Öl gewonnen.
3, 3-Dimethyl-6, 8-dimethoxy-3, 4-dihydroisochinolin (1a) Ausbeute: 2,43 g (11 ,1 mMol; 78%).
IR (Film): v = 2965 cm-1 (m, C-H), 1604 (s, C=N), 1574 (m, m, C=C), 1464 (m), 1340 (s), 1301 , 1205 1150 (m, s, s, C-O), 1100 (m).
1H-NMR (400 MHz, CDCI3): δ = 1 ,27 (s, 6 H, CCH3), 2,66 (s, 2 H, Ar-CH2), 3,85 und 3,86 (s, s, je 3 H, OCH3), 6,26 und 6,35 (d, d, 4J = 2,3 Hz, je 1 H, Ar-H), 8,54 (s, 1 H, N=CH).
13C-NMR (100 MHz, CDCI3): δ = 27,56 (CCH3), 30,77 (N=CH), 38,87 (Ar-CH2), 53,69 (CCH3), 55,36 und 55,43 (OCH3), 96,22, 105,1 , 139,3, 152,6, 201 ,9, 206,7 (Ar-C).
MS (70 eV): m/z (%) = 219 (85) [M+], 204 (100) [M+ - CH3], 189 (23) [M+- C2H6], 163 (35) [M+- C2H6- CN], 77 (13) [C6H5 +], 51 (8) [C4H3 +].
Cι3H17NO2 Ber. 219,2828 Gef. 219,1254
Beispiel 2: Darstellung des antitrypanosomalen Tetrahydro- isochinolins 1b
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In einem Schlenkrohr löste man 3,00 g (13,7 mMol) 1a in 10 ml abs. DMF. Hierzu gab man 27,4 ml (54,7 mMol) einer 2 M Lösung von Natriumisopropylthiolat, die man durch langsames Eintropfen von Isopropylthiol in eine Suspension von Natriumhydrid in abs. DMF bei -15 °C und ca. zweistündiges Rühren bei Raumtemperatur dargestellt hatte. Nach ca. fünfstündigen Erhitzen auf 80 °C und vollständigem Umsatz entfernte man das Lösungsmittel i. Vak., entfernte anorganische Salze durch Waschen mit ges. Natriumcarbonatlösung und trennte 1b vom ebenfalls entstandenen Regioisomeren durch Säulenchromatographie an basischem deakt. (7,5 % NH3) Alox.
3, 3-Dimethyl-6-methoxy-8-hydroxy-3, 4-dihydroisochinolin (1b)
Ausbeute: 0,91 g (4,46 mMol; 33 %).
Smp.: 208 °C (MeOH).
IR (Film): v = 3196 crrf1 (br, O-H), 2969 (m, C-H), 1611 (s, ON), 1377, 1307, 1149 (s, s, s, C-O).
1H-NMR (400 MHz, MeOD): δ = 1,33 (s, 6 H, CCH3). 2,73 (s, 2 H, Ar-CH2), 3,76 (s 3 H, OCH3), 5,88 und 5,91 (br s, je 1 H, Ar-H), 8,25 (s, 1 H, N=CH).
13C-NMR (100 MHz, CDCI3): δ = 26,43 (CCH3), 40,86 (Ar-CH2), 54,25 (CCH3), 55,79 (OCH3), 102,3, 107,6, 109,7, 139,5, 154,9, 171 ,4 (Ar-C).
MS (70 eV): m/z (%) = 206(11) [M++H], 205 (43) [M+], 190 (51) [M+ - O], 150 (17) [M+ - C2H3 - CN], 149 (20) [M+ - C2H4 - CN], 91 (17) [C7H7 +], 77 (12) [C6H5 +], 51 (9)
Cι2H15N02 Ber. 205,2560 Gef. 205,1101
Beispiel 3: Darstellung des antiplasmodialen Tetra hydro- isochinolins 2b
Hydrierung des Dihydroisochinolins 2a
Figure imgf000019_0001
Zu einer Lösung von 2 g (9,13 mMol) 1a in 20 ml Methanol wurden bei 0 °C portionsweise 346 mg (9,13 mMol) Natriumborhydrid gegeben, dann ließ man auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 1 h entfernte man das Lösungsmittel i. Vak. und gewann das Produkt durch Lösen in Dichlormethan, Abfiltrieren über Celite und Abdampfen des Lösungsmittels als weißen Feststoff.
3, 3-Dimethyl-6, 8-dimethoxy- 1, 2, 3, 4-tetrahydroisochinolin (2a)
Ausbeute; 1 ,85 g (8,34 mMol, 92%).
Smp.: 81 °C (Et2O).
IR (Film): v = 3418 cm-1 (s, br, NH), 2963 (m, CH), 1609 (s, C-N), 1492 (m, OC), 1203, 1147 (s, s, C-O).
1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ = 1 ,18 (s, 6 H, CCH3), 2,58 (s, 2 H, Ar-CH2-C), 3,78 und 3,79 (s, s, je 3 H,OCH3), 3,90 (s, 2 H, Ar-CH2-N), 6,19 und 6,28 (d, d, 4J = 2,3 Hz, Arid).
13C-NMR (100 MHz, CDCI3) δ = 27,51 (CCH3), 39,57 (N-CH2), 41 ,89 (Ar-CH2), 48,23 (CCH3), 55,06 und 55,16 (OCH3), 95,76, 104,7, 115,8, 136,3, 155,8, 157,7 (Ar-C).
MS (70 eV): m/z (%) = 221 (29) [M+], 220 (17) [M+-H], 206 (47) [M+ - CH3], 164 (100) [M++H - C2H6- CN] 91 (10) [C7H7 +].
C13Hι9NO2 (219,38)Ber. C 70,55 H 8,65 N 6,36
Gef. C 69,99 H 8,38 N 5,99. -V-Benzylierung des Tetrahvdroisochinolins 2a
Figure imgf000020_0001
Zu einer Lösung von 2 g (9,05 mMol) 2a in 20 ml Aceton gab man 3,1 g (9,50 mMol) Cäsiumcarbonat und 2,25 ml (19 mMol) Benzylbromid. Nach 18 h reingte man das Rohprodukt nach Abfiltrieren über Celite säulenchromatographisch auf deakt. (7.5% NH3) Kieselgel. Entfernen des Lösungsmittels ergab 2b als weißen Feststoff.
N-Benzyl-3, 3-dimethyl-6, 8-dimethoxy- 1, 2, 3, 4-tetrahydroisochinolin (2b)
Ausbeute: 2,53 g (8,15 mMol, 90%).
Smp.: 109 °C (Et2O).
IR (Film): v = IR (Film): v = 3432 cm"1 (s, br, NH (H-Brücke), 2963 (m, CH), 2835 (m, CH2-N), 1604 (s, C-N), 1496, 1453 (m, m, OC), 1208, 1149 (s, s, C-O), 1109, 1055 (m, m).
1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ = 1 ,21 (s, 6 H, CCH3), 2,74 (s, 2 H, Ar-CH2-C), 3,51 (s, 2 H, Ar-CH2-N), 3,70 und 3,79 (s, s, je 3 H, OCH3), 3,74 (s, 2 H, Ar-CH2-N), 6,23 und 6,25 (d, d, 4J = 2,3 Hz, Ar-H), 7,24 (br m, 1 h, Ar-H), 7,32 (t, 3J = 7,5 Hz, 2 h, Ar-H), 7,42 (br m, 2 H, Ar-H).
13C-NMR (100 MHz, CDCI3) δ = 24,03 (CCH3), 44,09 (C-CH2), 46,37 (N-CH2), (54,23 (N-CH2), 55,46 und 55,68 (OCH3), 96,11 , 104,4, 127,0, 128,6, 129,0, 136,5, 157,3, 159,2 (Ar-C). MS (70 eV): tτ?/z (%) = 311 (21) [M+], 310 (15) [M+-H], 297 (20) [M++H-CH3], 296 (100) [M+-CH3], 204 (24) [M++H-CH3-C7H7], 164 (76) [M++H - C9H13 - CN], 91 (74) [C7H7].
C2oH25NO2 (311 ,52) Ber. C 77,11 H 8.10 N 4,52
Gef. C 76,65 H 8,06 N 4,40
Beispiel 4: Biologische Eigenschaften der Verbindungen
a) Antitrypanosomale Aktivität
Die antitrypanosomale Aktivität der Verbindungen wurde an T.-criyz/-infizierten L-6- Zellen nach dem oben beschrieben Verfahren getestet.
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Ergebnis: Wie die Substanz 1d beispielhaft zeigt, besitzen 3,3-Dimethyl~8- oxoisochinoün-Derivate eine ausgeprägte Wirkung gegen T. cruzi, den Erreger der Chagas-Krankheit (F. Koberle, Adv. Parasitol. 1968, 6, 63-69). Im //?-ι /ϊro-Modell wies Verbindung 1d sehr selektiv einen ICso-Wert von 2,18 auf, zeigte aber keine Anzeichen von Zytotoxizität gegen Säugerzellen (IC50 >90 μg/ml). Bemerkenswert ist auch, dass gerade diese Verbindung (1d) keine antiplasmodiale Aktivität zeigt (>3000 ng/ml).
b) Antiplasmodiale Aktivität
Die antiplasmodiale Aktivität von 3,3-Dimethyl-8-oxoisochinolinen wurde an einer Reihe von Beispielen nach dem oben beschriebenen Verfahren untersucht.
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
Ergebnis: Es wird deutlich, dass besonders Verbindung 2e eine ausgeprägte Aktivität gegen den K1 -Stamm von P. falciparum zeigt, bei im Testrahmen nicht nachweisbarer Zytotoxizität.
c) Antileishmaniale Aktivität
Die Aktivität des 3,3-Dimethyl-8-oxoisochinolins 1a gegen Leishmania donovani wurde nach dem bereits beschriebenen Verfahren untersucht. Die Tabelle zeigt beispielhaft die Aktivität von 1a.
Figure imgf000023_0002
In diesem Testsystem besitzt Verbindung 1a eine gute - selektive - Aktivität gegen L. donovani, viel besser als z.B. gegen T. cruzi (ICso > 50 μg/ml).
d) Antitumorale Aktivität
Die antitumorale Aktivität der 3,3-Dimethyl-8-oxoisochinoüne wurde an einer Reihe von Tumor-transformierten Zellen, wie dem L5178y-Mäuselymphomzellsystem (ATCC CRL 1722), getestet. Wie beschrieben (W. E. G. Müller, R. K. Zahn, Cancer Res. 1979, 39, 1102-1107) wurden die Zellen in RPMI-Medium, dem 10% fötales Kälberserum zugesetzt worden war, kultiviert. Als Inokulumskonzentration wurden 10.000 Zellen/ml gewählt. Zum Startzeitpunkt wurde die ausgewählte Substanz zugegeben und die Kultur 72 h inkubiert. Danach wurde die Anzahl der lebenden Zellen mittels des kolorimetrischen XTT-Ansatzes bestimmt und mit einem ELISA-Reader ausgewertet (siehe: D. A. Scudiero, R. H. Shoemaker, K. D. Pauli, A. Monks, S. Tier- ney, T. H. Nofziger, M. J. Currens, D. Seniff, M. R. Boyd, Cancer Res. 1988, 48, 4827-4833; T. Daum, J. Engels, M. Mag, J. Muth, S. Lücking, H. C. Schröder, E. Matthes, W. E. G. Müller, Intervirology 1992, 33, 65-75).
Die ED50-Konzentrationen einiger ausgewählter Dimethyl-8-oxoisochinolin-Derivate für die genannten Tumorzelünien wurden nach Durchführung des kolorimetrischen XTT-Tests durch lineare Regression bestimmt (L. Sachs, Angewandte Statistik. Springer, Berlin, 1984 1-168). Die jeweiligen Mittelwerte mit den dazugehörigen Standardabweichungen wurden aus 10 unabhängigen Experimenten ermittelt. Nachfolgend sind die Antitumoraktivitäten für L5178y Mäuselymphomzellen angegeben.
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Ergebnis: Es wird deutlich, dass die Dimethyl-8-oxoisochinolin-Derivate bei den niedrigen erforderlichen Konzentrationen von bis zu 0,4 μg/ml die Zeilproliferation nach 72 h entscheidend reduzieren. Besonders stark hemmend - und hochselektiv - ist 2g mit einer Aktivität (ED50-Konzentration) von 0,4±0,1 μg/ml. Auch die übrigen Derivate besitzen eine ausgeprägte Wirkung auf die Zeilproliferation von L5178y-Zellen. Die EDβo-Konzentration der Dimethyl-8-oxoisochinoün-Derivate in Zellkulturansätzen von PC-12-Zellen, Sarcoma-180-Zellen als auch von HeLa-S3-Zellen liegt ebenso niedrig. Beispielhaft kann auch das Derivat 2g erwähnt werden, das bei PC-12-Zellen eine ED50-Konzentration von 3,7±0,4 μg/ml aufweist. Deshalb kann geschlossen werden, dass das Antitumorspektrum der Dimethyl-8-oxoisochinoün-Derivate breit ist.
e) Antivirale Aktivität
Eine ausführliche Angabe der Referenzen und der Durchführung der Methoden sind in früheren Arbeiten zusammengefasst (P. S. Sarin, D. Sun, A. Thornton, W.E.G. Müller J. Natl. Cancer. Inst, 1987, 78, 663-666; H. C. Schröder, P. S. Sarin, M. Rottmann, R. Wenger, A. Maidhof, K. Renneisen, W. E. G. Müller, Biochem Pharma- co/ 1988, 37, 3947-3952).
Untersuchungsparameter: Zellwachstum
H9-Zellen sowie mit HTLV-IIIB (HIV-1) infizierte H9-Zellen wurden in einer Konzentration von 0,2 x 1 000 000 Zellen/ml Kulturmedium zum Beimpfen eines Kulturmediums verwendet. Nach 4-tägiger Inkubation betrug die Dichte der H9-Zellen 1 ,4 x 1 000 000 Zellen/ml, während die Dichte der mit HTLV-IIIB infizierten H9-Zellen lediglich 0,7 x 1 000 000 Zellen/ml war; diese beiden Werte bildeten die Kontrollwerte. Dann wurden Proben von H9-HTLV-IIIB-Zellen (0,2 x 1 000 000 Zellen/ml) 4 Tage mit unterschiedlichen Konzentrationen von 2a behandelt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Figure imgf000027_0001
Ergebnis: Es ist ersichtlich, dass 2a in den Konzentrationen zwischen 1 und 5 μg/ml die Wachstumsrate von H9-HTLV-lllB-Zellen auf Werte steigert, die im Bereich der Kontrolle, also H9-Zellen ohne HTLV-IIIB, liegen.
Die gleiche Anti-HIV-Aktivität der Chemikalien wurde auch in den etablierten Testsystemen, bei denen der Untersuchungsparameter auf der Hemmung der Produktion von Reverser Transkriptase sowie der Expression der p24- und p15-Proteine beruht, gefunden.
f) Neuroprotektive Aktivität
Materialien: Es wurden die gleichen Materialien wie früher beschrieben verwendet (S. Perovic, A. Wicheis, C. Schutt, G. Gerdts, S. Pahler, R. Steffen, W.E.G. Müller, Environm. Toxicol. Pharmacol. 1998, 6, 125-133). Fura-2-acetoxymethylester (Fura- 2-AM) wurde von Molecular Probes (Leiden, Niederlande), RPMI 1640 von Biochrom KG (Berlin, Deutschland) und die Antikörper "Mäuse-anti-neurofilament" (68 kDa) und „Mäuse-anti-glial-fibrillary-acidic-Protein,, (Anti-GFAP) von Röche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) bezogen.
Zellen: Die kortikale Zellkultur wurde aus den Gehirnen von 17-18 Tage alten Rattenembryonen nach R. I. Freshney (in: Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (Hrsg.: R. I. Freshney), A. R. Liss Inc., New York, 1987, S. 257-288) er- halten; die Methode wurde leicht modifiziert (S. Perovic, C. Schleger, G. Pergande, S. Iskric, H. Ushijima, P. Rytik, W. E. G. Müller, Eur. J. Pharmacol. 1994, 288, 27-33). Zusammenfassend wurden die Neuronen aus den Cerebral-Hemisphären isoliert und diese in "Hank's ballanced salt solution" ohne Ca2+ and Mg2+ (HBSS) überführt. Vorher wurden die Zellen in HBSS mit Hilfe von 0,025% (w/v) Trypsin (10 min; 37°C) dissoziiert. Die proteolytische Reaktion wurde mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum (FKS) beendet. Die Einzelzell-Suspension wurde zentrifugiert und das resultierende Pellet mit Medium aufgenommen. Die Zellen wurden in eine mit Poly-L-Lysin (5 μg/ml, 300 μl/cm2) beschichtete Kammer mit einer Zelldichte von 2,0 x 105 Zellen/cm2 ausplattiert. Das DMEM/10% FKS-Medium wurde 2 Tage nach der Isolierung entfernt und durch DM EM/Serum-freies Medium ersetzt. 7 Tage nach der Isolierung erfolgte eine Immunfärbung mit „Anti-Neurofilament„-Antikörper (gegen ein 68-kDa-Protein) als Marker für Neuronen und „Anti-GFAP,, als Marker für Gliazellen. Die Kulturen enthalten >80% Neuronen; die restlichen Zellen waren GFAP-positiv und stellten hauptsächlich Astrozyten dar.
Beladen von Neuronen mit Fura-2-AM: Die intrazelluläre Ca2+-Konzentration ([Ca2+]j) wurde durch Fluoreszenzmessungen bestimmt. Als Parameter wurde das Verhältnis der Fluoreszenz des Ca2+-lndikatorfarbstoffes Fura-2-AM bei den Wellenlängen von 340 und 380 nm herangezogen (G. Grynkiewicz, M. Poenie, R.Y. Tsien, J. Biol. Chem. 1985, 260, 3440-3450). Die Neuronen wurden mit 4 μM Fura-2-AM in DMEM/Serum-freiem Medium (plus 1% bovines Serumalbumin) 45 min lang bei 37°C beladen. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit Medium gewaschen und weitere 45 min bei 37°C inkubiert. Diese Inkubationszeit ist ausreichend, um die Neuronen mit „inaktivem [insensitivem]-Fura-2„ zu beladen; anschließend kann dann die intrazelluläre Hydrolyse durch Esterasen erfolgen.
Eine Calcium-Kalibrierungskurve wurde nach der Methode von Grynkiewicz et al. (Literatur siehe oben) erstellt. Fluoreszenzbilder wurden bei 340 nm und 380 nm erhalten. Der Quotient aus den beiden Fluoreszenzdaten (340/380 nm) wurde berechnet und für die Erstellung der Kaübrierungskuπte eingesetzt. Eine Einheit [Ratio- Einheit] von 1 ,0 aus diesem Quotient (340/380 nm) entspricht 228 nM [Ca2+]j. Versuchsansatz - Änderungen des Calciumspiegels in Neuronen: In dieser Versuchsreihe wurden die Zellen zuerst mit Fura-2-AM beladen und anschließend mit den verschiedenen Testsubstanzen (in Locke's Lösung; 154 mM NaCI, 5,6 mM KCI, 3,6 mM NaHCOß, 5,6 mM Glucose und 10 mM Hepes; pH 7,4; ohne CaCl2) behandelt. Die Testsubstanzen wurden in 100% Dimethylsulfoxid (DMSO) (Konzentration: 20 mg/ml) gelöst und bei -20°C gelagert. Neuronen wurden im ersten Ansatz (Kontrollen) 5 min mit 0,25% DMSO (Kontrolle) stimuliert; nach 10 min wurde 200 μl L- Glutaminsäure und 2,4 mM CaCI2 zu den Zellen gegeben. Im Testansatz (mit den erfindungsmäßigen Substanzen) wurden die Zellen mit den Test-Derivaten zunächst vorinkubiert (5 min mit 1 μg/ml der 3,3-Dimethyl-8-oxoisochinoline); anschließend wurden 200 μM L- Glutamat und 2,4 mM CaCI2 zu den Ansätzen zugegeben (für 10 min), und es wurde die Änderung des Calciumspiegels der vorinkubierten Neuronen bestimmt. Die Versuchsdauer zur Messung des [Ca2+],-Spiegels betrug 20-22 min.
Zur Durchführung wurden die Zellen auf poly-L-Lysin-beschichteten Deckgläsern im 4 Kammersystem (Lab-Tek Chamber Slide System; Nunc, Wiesbaden, Deutschland) kultiviert. Mit einem "inverted-stage"-Mikroskop Olympus IX70 mit apoch romatisch reflektierendem Licht und dem Fluoreszenzobjektiv UApo40X/340 wurden die Fluoreszenzmessungen durchgeführt. Die Zellen wurden alternierend mit Licht der Wellenlängen 340 und 380 nm mit Hilfe eines computergesteuerten Schmalband- Interferenzfilters vor einer 100-W-Xenon Lampe beleuchtet. Zusätzlich wurde ein 0,25-ND-Filter für 380 nm benutzt. Die Fluoreszenzemissionen bei 510 nm wurden mit einer CCD-Kamera (Modell C2400-87; Hamamatsu, Herrsching, Deutschland) aufgezeichnet. Die Bilder wurden computergestützt, mit dem Imaging-System Argus 50, Hamamatsu, digitalisiert als 256x256 pixels mit 8-bit-Arrays. Das Fluoreszenzverhältnis [Ratio] 340nm / 380nm wurde durch Division der Bilderpaare ermittelt.
Statistik: Die Ergebnisse wurden mittels eines gepaarten Student's t-test (L. Sachs, Angewandte Statistik (Springer, Berlin) (1984) Seite 1-552) ausgewertet.
Ergebnis
Die Neuronen wurden mit der betreffenden neuen Substanz 2d (5 min) und anschließend mit L-Glutamat (200 μM) in Anwesenheit von 2,4 mM CaCI2 behandelt. Wurde L-Glutamat als Agonist eingesetzt und ohne Pyrrol-Alkaloid die Neuronen in- kubiert, wurde ein Anstieg von intrazellulärem Calcium ([Ca2+] von einer Ratio- Einheit von 0,8 auf eine Ratio-Einheit von 2,6 ermittelt (siehe Figur 1).
Figur 1 zeigt die Reduktion des durch den Glutamatrezeptor-Agonisten L-Glutamat in Neuronen hervorgerufenen Anstiegs der intrazellulären Calcium-Ionen durch die neue Substanz 2d. In der Kontrollserie wurden die Neuronen nur mit L-Glutamat behandelt (♦). In den Testserien wurden die Neurone mit beispielsweise 0,5 μg/ml an 2d (D) 10 min lang vorinkubiert. Anschließend wurde in die Ansätze L-Glutamat hinzugegeben. Die Änderungskinetik wurde kontinuierlich gemessen. Mittelwert (n = 50) und Standardabweichung (± SE) wurden ermittelt.
Schlussfolgerung: Aus den in der vorangegangen Grafik (Figur 1) zusammenge- fassten Daten geht hervor, dass die neue Substanz 2d bereits in der niedrigen Konzentrationen von 0,5 μg/ml den Anstieg an intrazellulären Calcium-Ionen signifikant reduziert. Bei höheren Konzentrationen ist dieser protektive Effekt noch stärker. Hieraus kann geschlossen werden, dass diese wie die verwandten Substanzen auch in vivo eine neuroprotektive Wirkung entfaltet.

Claims

Patentansprüche
Verbindung der allgemeinen Formeln 1 und 2, worin
Figure imgf000031_0001
R1 -H oder ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes Alkyl sein kann, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch, ein Alkenyl, ein unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Aryl- oder Heteroarylrest, eine unsubstituierte, monosubstituierte oder polysubstituierte Benzylgruppe oder eine Acylgruppe, wie zum Beispiel Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, verzweigte oder heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppen, sowie Reste anorganischer und organischer Säuren, wie zum Beispiel Sulfat, Phosphat, Carbonat, Sulfonat, Phosphonat und im Falle mehrbasiger Säuren deren Salze oder, externe, Alkyl- oder Arylester sein kann,
R2, R3, R4, R5 und R6 unabhängig voneinander Substituenten ausgewählt aus -H oder einem unsubstituierten, monosubstituierten oder polysubstitu- ierten Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, ein Alkenyl, ein unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Aryl- oder Heteroarylrest, eine unsubstituierte, monosubstituierte oder polysubstituierte Benzylgruppe oder eine Acylgruppe, wie zum Beispiel Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, verzweigte oder heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppen oder ein Hydroxy- (-OH) oder Al- koxysubstituent, wie zum Beispiel -OMe, -OEt, -Ot?Pr, -/'Pr, -OπBu, -O/'Bu, - OsecBu, -O-ßu, dessen Alkylgruppe verzweigt, unverzweigt oder cyclisch ist sein können, oder neben Thiol (-SH) auch eine über ein Schwefelatom gebundene Alkyl-, wie zum Beispiel -SMe, -SEt, usw. oder eine Sulfonylgruppe (z. B. -SO3H, -SO2Me, -S02CF3, -SO2C6H4CH3 oder Sθ2C6H4CH2Br) sein können, oder ein Stickstoffsubstituent, wie zum Beispiel -NH2, -NHR, -NRR' (R, R' = Alkyl, Aryl usw.), -NC, -NO2 usw., oder ein Fluor-, Chlor-, Brom-, lod-, -CN oder auch ein Heterosubstituent sein können,
R7 kann -H oder ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes Alkyl sein, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, ein Alkenyl, ein unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Aryl- oder Heteroarylrest, eine unsubstituierte, monosubstituierte oder polysubstituierte Benzylgruppe, oder Acylgruppe, wie zum Beispiel Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, verzweigte oder heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppen, oder zwei oder mehr Reste R1 bis R7, zum Beispiel ein Rest R1 und ein Rest R2 oder ein Rest R4 und ein Rest R6 können so untereinander in der Art verknüpft sein, dass dadurch ein iso- oder heteroaromatischer oder -gesättigter Ring erhalten wird, R2 plus R3 kann auch ein an zwei benachbarten Kohlenstoffatomen des Isochinolingerüsts kondensierter aromatischer oder gesättigter Ring sein, sowie alle möglichen Stereoisomere und deren Gemische, und deren physiologisch verträglichen Salze und Solvate, unter der Voraussetzung, dass die Formel 1 und 2 nicht den folgenden Strukturen entsprechen:
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
2. Verbindung der allgemeinem Formeln 1 und 2 nach Anspruch 1 , ausgewählt aus den folgenden Strukturformeln:
Figure imgf000033_0002
Figure imgf000034_0001
°" 1d und deren physiologisch verträgliche Salze und
Solvate.
3. Verfahren zur Synthese einer Verbindung der allgemeinen Formel 1 oder 2 nach Anspruch 1 oder 2, umfassend eine Ritter-Reaktion mit gleichzeitigem Ringschluss.
4. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, zusammen mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz vorliegt.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung in einer Menge von etwa 20 μg bis 200 mg pro Dosiseinheit vorliegt.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie weitere Chemotherapeutika enthält.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 8 in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropf lösungen, Suppositorien, Injekti- ons- oder Infusionszubereitungen zur peroralen, rektalen oder parenteralen Verwendung.
10. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formeln 1 und 2,
Figure imgf000035_0001
wobei die Reste R1 bis R7 wie in Anspruch 1 definiert sind, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von viralen, Tumor- und/oder neurodegenerativen Erkrankungen und/oder zur Behandlung von Entzündungszuständen und/oder zur Behandlung der Chagas-Krankheit.
11. Verwendung nach Anspruch 10 in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 oder 11 , in einer Menge in einem Konzentrationsbereich zwischen 0,001 und 15,0 μg/ml, bevorzugt zwischen 0,01 und 5,0 μg/ml bei der Behandlung in vivo.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8741901B2 (en) 2004-07-15 2014-06-03 Albany Molecular Research, Inc. Aryl- and heteroaryl-substituted tetrahydroisoquinolines and use thereof to block reuptake of norepinephrine, dopamine, and serotonin
US8802696B2 (en) 2009-05-12 2014-08-12 Albany Molecular Research, Inc. 7-([1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl)-4-(3,4-dichlorophenyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoqu inoli and use thereof
US8815894B2 (en) 2009-05-12 2014-08-26 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of (S)-7-([1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl)-4-(3,4-dichlorophenyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline and use thereof
US9034899B2 (en) 2009-05-12 2015-05-19 Albany Molecular Research, Inc. Aryl, heteroaryl, and heterocycle substituted tetrahydroisoquinolines and use thereof
US9498476B2 (en) 2008-06-04 2016-11-22 Albany Molecular Research, Inc. Crystalline form of 6-[(4S)-2-methyl-4-(2-naphthyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-7-yl]pyridazin-3-amine

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0532027A1 (de) * 1991-09-12 1993-03-17 Merrell Pharmaceuticals Inc. Cyclische Nitrone, ihre Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie enthalten
US5292746A (en) * 1991-09-12 1994-03-08 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Cyclic nitrones, pharmaceutical compositions thereof and their use in treating shock

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0532027A1 (de) * 1991-09-12 1993-03-17 Merrell Pharmaceuticals Inc. Cyclische Nitrone, ihre Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie enthalten
US5292746A (en) * 1991-09-12 1994-03-08 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Cyclic nitrones, pharmaceutical compositions thereof and their use in treating shock

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAVIN, P. ET AL: "The cyclization of Benzylaminonitriles", J.CHEM.SOC.PERKIN TRANSACTIONS 1, vol. 3, - 1990, pages 503 - 508, XP009029027 *
GLUSHKOV ET AL: "Oxirane in the Ritter reaction", CHEMISTRY OF HETEROCYCLIC COMPOUNDS, vol. 37, no. 4, - 2001, pages 444 - 452, XP009029006 *
R.C. BERNOTAS ET AL: "Synthesis and radical scavenging activity of 3,3-dialkyl-3,4-dihydroisoquinoline compounds", BIOORGANIC & MED. CHEMISTRY LETTERS, vol. 6, no. 10, - 1996, pages 1105 - 1110, XP002276270 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8741901B2 (en) 2004-07-15 2014-06-03 Albany Molecular Research, Inc. Aryl- and heteroaryl-substituted tetrahydroisoquinolines and use thereof to block reuptake of norepinephrine, dopamine, and serotonin
US9085531B2 (en) 2004-07-15 2015-07-21 Albany Molecular Research, Inc. Aryl- and heteroaryl-substituted tetrahydroisoquinolines and use thereof to block reuptake of norepinephrine, dopamine, and serotonin
US9499531B2 (en) 2004-07-15 2016-11-22 Albany Molecular Research, Inc. Aryl- and heteroaryl-substituted tetrahydroisoquinolines and use thereof to block reuptake of norepinephrine, dopamine, and serotonin
US9498476B2 (en) 2008-06-04 2016-11-22 Albany Molecular Research, Inc. Crystalline form of 6-[(4S)-2-methyl-4-(2-naphthyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-7-yl]pyridazin-3-amine
US8802696B2 (en) 2009-05-12 2014-08-12 Albany Molecular Research, Inc. 7-([1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl)-4-(3,4-dichlorophenyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoqu inoli and use thereof
US8815894B2 (en) 2009-05-12 2014-08-26 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of (S)-7-([1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl)-4-(3,4-dichlorophenyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline and use thereof
US9034899B2 (en) 2009-05-12 2015-05-19 Albany Molecular Research, Inc. Aryl, heteroaryl, and heterocycle substituted tetrahydroisoquinolines and use thereof
US9173879B2 (en) 2009-05-12 2015-11-03 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of (S)-7-([1,2,4]triazolo[1,5-a ]pyridin-6-yl)-4-(3,4-dichlorophenyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline and use thereof
US9604960B2 (en) 2009-05-12 2017-03-28 Albany Molecular Research, Inc. Aryl, heteroaryl, and heterocycle substituted tetrahydroisoquinolines and use thereof

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