WO2004050861A1 - Preparation microbienne et procede de prevention et de traitement du fletrissement bacterien, la plante et son utilisation - Google Patents

Preparation microbienne et procede de prevention et de traitement du fletrissement bacterien, la plante et son utilisation Download PDF

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WO2004050861A1
WO2004050861A1 PCT/CN2003/001025 CN0301025W WO2004050861A1 WO 2004050861 A1 WO2004050861 A1 WO 2004050861A1 CN 0301025 W CN0301025 W CN 0301025W WO 2004050861 A1 WO2004050861 A1 WO 2004050861A1
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WO
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microbial preparation
plant
blight
bacterial wilt
tomato
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Application number
PCT/CN2003/001025
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English (en)
French (fr)
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Yuanguang Li
Wei Wang
Honggang Wei
Guomin Shen
Rongjin Wang
Jialu Deng
Xinzhi Sun
Ming Shen
Original Assignee
Shanghai Zeyuan Marine Biotechnology Ltd.
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom

Definitions

  • the invention relates to the field of microorganisms. Specifically, the present invention relates to a microbial preparation for controlling bacterial wilt, and a method and use thereof. Background technique
  • Ralstonia solanacearum is a worldwide type of soil-borne plant disease caused by R. solanacearum (Ratoo 'a S / aw cearum). It is common in tropical and subtropical regions and is severely harmful. Ralstonia solanacearum has a wide range of hosts, has strong viability in the roots and soil of plants, and can infect more than 300 plants in 44 families.
  • Pesticides such as agricultural streptomycin and copper reagents (such as 77% can be killed), although they show a certain control effect in the field, but because these pesticides are not pesticides to prevent bacterial wilt, the field control effect is poor and unstable And pathogenic bacteria are prone to develop resistance to these pesticides. Therefore, there is no effective agent to control plant bacterial wilt.
  • the pathogenesis of bacterial wilt is as follows:
  • the bacterial wilt pathogen that exists in the soil can infect the plant through the roots of the host crop during the entire growing season and lurk under the appropriate conditions (such as high temperature and humidity).
  • the bacterial wilt pathogens in plants multiply in large quantities, and the vascular bundles that block the plants develop into diseases.
  • bacteriocin-producing strains ABPS
  • Shell cepacia B5 Shell cepacia B5
  • imflceizrM biocontrol strains
  • Bacillus izcz7 / 1 ⁇ 2y spp. B33 and B36
  • VAM vesicular arbuscular mycorrhizal fungi
  • the object of the present invention is to provide a new microbial preparation and method capable of controlling plant bacterial wilt.
  • the live bacteria, fermentation broth or fermentation supernatant of this strain successfully controlled tomato, pepper, eggplant and tobacco green in field experiments. Blight, thus completing the present invention.
  • the strain was deposited on October 31, 2002 at the General Microbial Center (tGMCC) of the China Microbial Species Collection Management Committee under the accession number CGMCC No. 0829.
  • the first aspect of the present invention provides a Bacillus polymyxa C3 ⁇ 4e 'bfl «7to polymyxa) HY96-2, and its deposit number is CGMCC No. 0829.
  • an agricultural microbial preparation which contains live Bacillus polymyxa or a fermented serum obtained by culturing the microorganism.
  • the Bacillus polymyxa is CGMCC No. 0829.
  • the microbial preparation contains a fermentation broth obtained by culturing the bacteria, such as a live bacterium containing Bacillus polymyxa CGMCC No. 0829 and a fermentation broth obtained by culturing the bacteria.
  • the terms "fermentation broth”, “live bacteria”, and “fermentation supernatant” used in the present invention have meanings generally known and recognized by those skilled in the art.
  • the fermentation broth can be grown to a certain degree by cultivating Bacillus polymyxa CGMCC No. 0829 (hereinafter referred to as "biocontrol agent [HY96-2”) under conditions suitable for growth.
  • biocontrol agent [HY96-2” Bacillus polymyxa CGMCC No. 0829
  • the live bacteria refer to viable cells obtained by culturing biocontrol bacteria through biological methods
  • the fermentation supernatant refers to the fermentation liquid obtained by separating and removing the bacteria in the fermentation liquid. .
  • the source of nutrients in the medium used for culturing the strain of the present invention is not particularly limited.
  • the carbon source may be starch, dextrin, glycerol, glucose, sucrose, inositol, mannitol, and the like.
  • Nitrogen sources can be radon, soybean meal, protein meal, meat extract, rice sugar, wheat husk, yeast meal, corn pulp, ammonium salts, and other organic or inorganic nitrogen-containing compounds.
  • inorganic salts such as sodium chloride, phosphates such as dipotassium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate, ammonium sulfate, manganese sulfate, magnesium sulfate, calcium carbonate and other metal salts may be appropriately added to the medium.
  • various known conventional culture media can be used, such as LB agar medium, nutrient agar medium, dextrose yeast agar medium, beef agar medium and the like. The formulation of an optimum medium is given in the examples below. However, those skilled in the art should understand that the present invention is not limited to the specific medium formulations listed herein.
  • Conditions such as temperature, pH, aeration ratio, tank pressure, and rotational speed when culturing the strain of the present invention are not particularly strictly limited, as long as the conditions are suitable for the growth of the bacteria.
  • defoaming agents such as soybean oil and dichloride can be used for defoaming.
  • the pH is preferably controlled between 5.5-7.5.
  • the culture temperature should be between 25-35 ⁇ .
  • the incubation time is usually between 12 and 72 hours.
  • the final bacterial concentration can be as high as IX lOUCFU / ml to 1 X 10 12 CFU / ml.
  • the parameters listed above are only preferred solutions to achieve the objectives of the present invention. Therefore, those skilled in the art can obtain the living cells, fermentation supernatant, and fermentation broth of the present invention by selecting appropriate culture conditions outside the above-mentioned range.
  • the microbial preparation of the present invention can be applied, for example, directly in the form of a fermentation broth, or it can be appropriately diluted (for example, 10-fold dilution, 100-fold dilution, 1000-fold dilution or higher) are applied in the form of a diluent, and the fermentation broth can also be separated and extracted by conventional techniques in the art.
  • the obtained live bacterial cells, the fermentation supernatant, and the extract obtained therefrom can also be directly applied.
  • the microbial preparation may also contain other substances that do not affect the effect of the fermentation broth in controlling bacterial wilt.
  • the fermentation stock solution or its diluent can be mixed with a suitable carrier, and then appropriately dried to prepare a microbial preparation in the form of a carrier.
  • a suitable carrier for example, in order to facilitate long-term storage, the fermentation stock solution or its diluent can be mixed with a suitable carrier, and then appropriately dried to prepare a microbial preparation in the form of a carrier.
  • these carriers have no influence on the effect of controlling the plant bacterial wilt by the live bacterial cells, fermentation supernatants and fermentation broths of the present invention. Therefore, in a preferred embodiment, the microbial preparation further contains a carrier selected from rice hull powder, corn stalk powder, peat soil, light calcium carbonate, talc, attapulgite, and / or diatomaceous earth, and Among the mixtures, preferred carriers are rice hull flour, attapulgite, or corn straw powder. These carriers are all commercially available.
  • the carrier should be processed and ground in advance to a particle size between 10-200 mesh.
  • the carrier is preferably mixed with a bacterial suspension, a fermentation broth or a fermentation broth containing live bacteria in a weight ratio of 1: 0.1 to 1:10, more preferably in a weight ratio of 1: 0.2 to 1: 5.
  • the above-mentioned drying step can adopt conventional techniques in the art, such as, but not limited to, a natural drying method, a vacuum drying method, an air-flow drying method, and an ebullated-bed drying method.
  • the water content of the microbial preparation in the form of an organic carrier should be controlled between 3 and 16% by weight, more preferably 7-
  • the water content of the microbial preparation in the form of an inorganic carrier should be between 16% by weight and 3 to 6% by weight.
  • a method for controlling bacterial bacterial wilt of a plant which method comprises the step of applying the microbial preparation of the present invention to the root of a bacterial wilt-affected plant.
  • the method for applying the microbial preparation to the roots of plants is a conventional technique in the art.
  • the method can be soaking seeds during sowing, immersing the roots of the plants in a fermentation broth or a dilution solution thereof before transplanting, or directly diluting the fermentation broth or the dilution solution.
  • the liquid is poured on the seedbed, and the root can be irrigated during planting, or the root can be irrigated during plant growth.
  • the microbial preparation is stored in a carrier, it can be applied by diluting it with water immediately before use.
  • the optimal dosage of the present invention can be determined without undue experimentation.
  • the preferred application dose is in the range of 1.5 to 4.5 kilograms per mu (667 square meters).
  • the method of the present invention can be used to control bacterial wilt of tomato, pepper, eggplant and tobacco crops.
  • the microbial preparation of the present invention can be used to control bacterial wilt of crops such as tomatoes, peppers, and eggplants, and the field control effect in the late harvest period (some control rates are as high as 97%) can reach 70-85%.
  • the microbial preparation of the present invention can also be used to control plant stand blight, cataplexy disease, tomato blight, eggplant blight, cucumber blight, tobacco blight, and soybean root rot caused by Fusarium Fungal diseases such as diseases.
  • another aspect of the present invention relates to the use of the microbial preparation according to the present invention for controlling plant bacterial wilt disease, cataplexy disease, and tomato wilt, eggplant wilt, cucumber wilt, tobacco blight, soybean root rot the use of.
  • the inventors also found that when the plant does not develop bacterial wilt, the microbial preparation of the present invention has a significant effect of promoting plant growth and increasing yield (for example, increasing tomato yield by 27.5%); and the microbial preparation of the present invention is effective for other crops such as Spinach, amaranth, cowpea, ryegrass, etc. also have obvious growth promotion, increase yield, Increase production by up to 18-25%.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of a microbial preparation for promoting plant growth and increasing plant yield.
  • the microbial preparation of the invention has the advantage of strong biocontrol effect, and has great potential as a biological pesticide.
  • the specific manifestations are as follows: First, it can effectively control bacterial wilt of tomato, pepper, eggplant and tobacco, and delay the onset. Second, in the late stage of plant disease, especially in the late stage of plant harvest, it still has a high control effect, up to more than 85%. This control effect has not been reported in other people's research.
  • the bio-pesticide formulation can also significantly increase crop yields. In addition to significantly promoting the growth of these bacterial wilt disease-prone crops, it can also significantly promote the growth of other plants. Fourthly, the microbial preparation can also prevent fungal diseases such as bacterial wilt, seed blight, tomato blight, eggplant blight, cucumber blight, tobacco blight, and soybean root rot caused by Fusarium.
  • strain HY96-2 of the present invention has been deposited at the General Microbiology Center of the China Microbial Strain Collection Management Committee (CGMCC, Beijing, China) on October 31, 2002, and the accession number is CGMCC No. 0829.
  • CGMCC China Microbial Strain Collection Management Committee
  • Ra & to 'solanacearum ⁇ physiological race Tb and physiological race Tt, Rhizoctonia solani, Nicotiana tabacum, Magnaporthe grisea, Fusarium oxysporum f. Sp. And soybean root rot Fusarium was used as an indicator strain.
  • Root circumference shake the plant vigorously, and the soil under shaking is the root circumference
  • Rhizosphere The soil that adheres firmly to the root surface after shaking, is washed with water, and is the rhizosphere.
  • Root surface The washed roots are cut into small sections, mixed with quartz sand and water, and fully shaken. The washed part is the root surface.
  • the above 3 parts were separated by dilution method, and the culture medium was an improved yeast extract plate (glucose: 1.0%; yeast extract: 0.5%; KH 2 PO 4 : 0.05%; MgSO 4 : 0.05%; agar powder: 1.5 ⁇ : 1.6%; pH: 7.2 ⁇ 7.4; autoclave at 121 ° C for 25 minutes), add an appropriate amount of Ralstonia solanacearum Tb and Tt suspension to each plate, and culture in a 28 ⁇ 30 ⁇ incubator to shape Individual individual bacterial colonies were picked and purified by streaking. Store on slanted medium until use.
  • the antagonistic bacteria were determined by the following method.
  • the first method is: spot the isolate on a modified yeast extract plate, incubate at 30 ° C for 48 hours, kill with chloroform fumigation, and coat the R. solanacearum Tb and Tt suspension (10 8 cfo I ml), continue Cultivate for 12 ⁇ 24 hours, observe the presence or absence of bacteriostatic zone and its size around the colonies, record the size of the bacteriostatic zone, and count the ratio of antagonistic bacteria to the total number of isolated bacteria. All strains exhibiting antagonism were purified and left for further testing.
  • the second method is: Add 1 ml of Ralstonia solanacearum Tb and Tt suspension (10 8 cfo I ml) to a sterilized petri dish, and then add 15 ml of medium at about 50 ° C, and shake well. After cooling, tap the isolated bacterial strains, add 5 isolates to each dish, and set 3 (TC for 12 to 24 hours), observe the presence and absence of inhibitory zones around the colonies, record the size of the inhibitory zone, and count the antibacterial activity. Percentage of total isolates. Purify all strains that exhibit antagonism and leave it to the next test.
  • a total of 40 samples were collected, of which 10 were healthy plants, 10 diseased plants, and 10 diseased plants, respectively, in severely diseased fields (the diseased plant rate was above 50%), and lightly diseased fields (the diseased plant rate was below 20%).
  • 206 strains of antagonistic bacteria were obtained from the initial screening, of which 89, 54 and 35, 28 were from the diseased, diseased, and diseased, respectively; the root circumference, rhizosphere and root surface were 122, 53 and 31 strains. Of these 206 strains, 98 strains having antagonism against bacterial wilt were obtained through the above two kinds of antagonism tests.
  • Staining Gram staining and acid-fast staining are carried out according to methods conventional in the art.
  • Morphological characteristics Cultured on nutrient agar and beef infusion agar for 32 days for 2 days. Smears of the bacterial cells were taken, and the morphology of the bacterial cells was observed with an optical microscope after staining, and the surface characteristics of the cells were observed with an electron microscope.
  • Cell wall chemical classification Amino acid and glycoform analysis of whole cell hydrolysate was performed on the cells by thin plate chromatography.
  • Culture characteristics LB agar, nutrient agar, dextrose yeast agar, and beef agar agar were cultured at 32 ° C for 2-3 days to observe colony formation and color.
  • Physiological and biochemical characteristics Refer to the method of "Bergey, s Manual of Systematic Bacteriology” Vol. ⁇ and “Manual Identification System of Common Bacteria”.
  • 16S rDNA sequence analysis The total DNA of the strain was extracted by conventional methods. ⁇ PCR amplification of 16S rDNA with universal primers. The purified PCR products were directly sequenced with Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit. Electrophoresis and data analysis were performed automatically by Applied Biosystems DNA Sequencer (model 377). The 16S rDNA sequences were compared in GenBank database to determine the taxonomic status of the strain.
  • Glucose yeast extract agar colonies yellowish white with small protrusions, sticky
  • 16S iDNA sequence analysis The results of 16S rDNA sequence analysis indicate that HY96-2 strain belongs to the genus Bacillus sp. (P «e 'ba 7 / M. HY96-2 strain and Bacillus polymyxa (ae' bac // ⁇ polymyxa) sequence homology is 99%.
  • HY96-2 strain belongs to Bacillus genus; HY96-2 strain is Gram-positive and negative, not acid-resistant, cells are rod-shaped, form spores, and have flagella. Only one spore is produced in the sporangia, which belongs to the genus Bacillus (Pae 'bfld // ⁇ ). The culture characteristics and physiological and biochemical characteristics of HY96-2 strain were the same as those of Bacillus polymyxa. Therefore, the HY96-2 strain was identified as Pae 'bad // ⁇ polymyxd. This strain has been deposited on October 31, 2002 in the General Microbial Center of the China Microbial Species Collection Management Committee (CGMCC) under the accession number CGMCC No. 0829.
  • CGMCC General Microbial Center of the China Microbial Species Collection Management Committee
  • HY96-2 seeds are activated, they are cultured.
  • the starch was gelatinized and then added to a medium containing yeast powder, protein powder, glucose, MgSO 4 , KH 2 PO 4 and CaCO 3 and sterilized at 121 ° C for 30 minutes.
  • Fermentation time is 24 ⁇ 48 hours under the conditions of speed of 300 ⁇ 800rpm and 25 ⁇ 35 ° C.
  • the final bacteria concentration was 1.37x10 12 CFU / ml. 2
  • the seeds are activated, they are cultured.
  • the starch is gelatinized and then added to the medium of 1) above. Sterilize at 121 ° C for 30 minutes. Seeds are inoculated into a 50L fully automatic fermentation tank. Under the conditions of aeration ratio of 0.4 ⁇ 2: 1, speed of 300 ⁇ 800rpm, temperature of 25 ⁇ 35 ° C, fermentation time is 24 ⁇ 48 hours.
  • the final bacteria concentration measured by plate counting method was 2.09xlO u CFU / ml.
  • Seed cultivation was performed on a 5L fully automatic fermentation tank, as described in 1) above.
  • the medium is then sterilized. Gelatinize the starch before adding it to glucose, yeast powder, protein powder, M g SO 4 ,
  • the rice husk flour is processed to a particle size between 10 and 100 mesh. Mixing fermentation broth with carrier rice hull flour
  • Attapulgite is processed to a particle size of less than 44 microns.
  • the fermentation broth was centrifuged and filtered to obtain live bacteria and fermentation supernatant.
  • the live bacteria were washed several times, and then suspended in water of approximately the same volume as the initial fermentation broth.
  • the obtained viable bacterial suspension was mixed with attapulgite (1: 3 by weight), and then stirred, and dried by a natural drying method, a vacuum drying method, and an ebullated bed drying method, respectively.
  • the water content of the three preparations was 4.5%, 4.8% and 4.0%, respectively.
  • the corn straw powder is processed so that the particle size is between 20 and 40 mesh.
  • the fermented supernatant liquid obtained in the above 2) was mixed with corn straw powder (3: 1 (weight)), and then stirred, and the natural drying method, vacuum drying method and boiling were used respectively.
  • the bed is dried.
  • the water content of the three preparations was 14.1%, 14.8%, and 13.8%, respectively.
  • the microbial preparation was identified by the following method: Weigh the sample lg, put it in a triangle flask, add 10 ml of sterilized water, and incubate it on a rotary shaker at 150 rpm for 1 hour, and immediately take 1 ml of the suspension and add 9 ml In a test tube of sterilized water, the suspension was dipped into a yeast extract medium plate with an inoculating ring, and the plate was immediately cultured in a 30 ⁇ incubator. The colony morphology was observed within 48 to 72 hours.
  • Bacillus polymyxa Identification based on the culture characteristics of Bacillus polymyxa. Its culture characteristics are as follows: it grows well on the yeast extract medium plate, and the color and texture of the bacterial colonies in the sample should be basically consistent with the colonies of the culture unit in the same period. Its main characteristics are: The colonies are medium in size, semi-transparent and round, bulging upward, the surface is smooth, the edges are neat, shiny, no pigment is produced, and the viscosity is high when picked with a seeding needle. ,
  • the number of viable bacteria in the preparation was then determined.
  • pipette 0.1ml of the dilution on the plate of the yeast extract culture medium at least 5 replicates per dilution.
  • the 5 plates with this dilution were spread evenly on the surface of the agar with a sterile glass spatula.
  • the coated series were placed in a 30 ° C incubator for 20 to 24 hours and counted.
  • the challenge strain used is the plant bacterial wilt pathogen Rato z solanacearum! And races Tb and Tt, and the biocontrol strain is HY96-2.
  • HY96-2 was inoculated in LB liquid culture medium, cultured in a shaker with a rotation speed of 120 rpm for 36 hours, the culture solution was centrifuged at high speed, and the supernatant was used for 0.22 ⁇ m. Filter through a microporous membrane (sterilized) to obtain a sterile filtrate.
  • Rab 'fl solanacearum Tb and Tt were inoculated on LB plates and activated at 30 ° C for 2 days. 0.85% physiological saline was used to make gradient suspensions of different concentrations. The final bacteria were determined by plate counting. The suspension concentration was 10 9 cfo / ml. 30 ⁇ 1 of the bacterial suspension was added to the petri dish, and then 30 ml of 45 ° C LB medium was poured into the petri dish, and the hook was shaken.
  • HY96-2 was cultured in improved beef extract culture for 24 hours, centrifuged, the bacterial cell pellet was mixed with phosphate buffer solution of different pH, and stored at room temperature for 8-96 hours. As a result, it was found that the bacteria were basically in the range of pH 6.2 ⁇ 8.0 Not affected. Bacterial cells were added to the sterilized rice hull powder and light calcium carbonate dry powder to prepare bacteria agents with different water contents. The number of viable bacteria was measured at the beginning and the treatment for 60 days. The highest water content survival rate was 91.2%.
  • Light calcium carbonate dry powder has the highest moisture content survival rate of 4 ⁇ 6%, which is 82.8%.
  • the effects of different carriers on the survival of HY96-2 were studied under the conditions of pH 7.2, organic carrier water content of 7 ⁇ 16%, and inorganic carrier water content of 3 ⁇ 6%. After 12 months, the content of live bacteria was measured, and the results are shown in Table 6 below. Table 6. Effect of vector on survival of HY96-2
  • rice husk flour has the highest survival rate as the carrier HY96-2 and is an ideal carrier. Therefore, rice husk powder is selected as the formulation carrier in the following. Because Bacillus polymyxa is highly resistant to drying, the water content requirement is not very strict. In order to keep Bacillus polymyxa as high as possible in the state of the preparation and have a long storage period, the microorganism The water content of the preparation should preferably be between 7-16%.
  • Example 6 HY96-2 fermentation broth of bacterial wilt applied directly field control plants and increase the yield of administration Test Method: dosage of 2500 ml per acre HY96-2 broth (lxl0 8 CFU / ml)
  • the third application field planting and irrigation
  • Table results show that 80 days (harvest period) after tomato planting in the field, the incidence of bacterial wilt reached 93.7%, and HY96-2 bacterial solution also had a high control effect, with a control effect of more than 83% and an increase of 252.8%.
  • the pepper field control effect reached 82.2% and the yield increased by 86.8%.
  • the eggplant field control effect reached 84.8%, increasing yield by 75.6%.
  • Example 7 Greenhouse potted test of a microbial preparation in the form of a carrier for tomato bacterial wilt control and growth promotion effect
  • the tomato susceptible variety Zhongshu No. 6 was selected, and the test seeds were sown in vermiculite. When the seedlings reached 3-4 true leaves, they were transplanted.
  • the preparation prepared in Example 4 was diluted 200 times with water, thoroughly stirred and soaked for 2 hours, and then the tomato seedlings were dipped into the roots for 20 minutes, and then immediately transplanted into the soil of the planter's inoculated or uninoculated bacteria, and Pour 300 ml of biocontrol preparation into each bowl.
  • the control was diluted with 2 million units of agricultural streptomycin 2000-fold soaking roots, and treated with water.
  • Ralstonia solanacearum strain Tb (physiological race No. 1), purified on a TZC culture plate, cultured at 28-30 ° C on a NA medium plate or slanted surface for about 48 hours, scraped the fungus moss and diluted it with sterile water to A bacterial suspension at a concentration of 3 ⁇ 10 8 CFU / ml was used as an inoculum.
  • the biological preparation made of HY96-2 can delay the occurrence of tomato bacterial wilt by 20 days.
  • the incidence of the control reached 100%, the treatment has only just begun to develop the disease, and the disease occurrence rate is slow and the early prevention effect It is 95.5%, and also has a high control effect in the later stage, which can reach 86.5%.
  • the agricultural streptomycin has a very low control effect on tomato bacterial wilt, and has no effect in the later period.
  • the preparation of the present invention is used to test tobacco, tomato, eggplant and pepper bacterial wilt, and the biological control of plant bacterial wilt is increased and the yield is increased.
  • the third application field planting and irrigation
  • Example 9 Control effect of fermented liquid preparation, live bacteria preparation, and fermented serum preparation in the form of a carrier on tomato bacterial wilt in the field
  • Example 4 As described in 1), 2), and 3) in Example 4, a part of the fermentation broth of the strain HY96-2 cultured in Example 3 was directly formulated into a "fermentation broth preparation". Centrifuge the other part of the fermentation broth, filter to obtain live bacteria, and wash them to form a "live bacteria preparation"; in addition, separate the obtained fermentation broth into a "fermentation serum preparation".
  • the field test method is the same as that in Example 8.
  • the dosage per acre is 2.5 kg.
  • the results are as follows:
  • Example 8 When the method of Example 8 was performed, it was also found that the microbial preparation also had a control effect on fungal diseases.
  • Field tests in Jiangle, Fujian province found that it can prevent and treat fungal diseases such as tobacco brown spot disease, with a control effect of more than 80%.
  • the strain HY96-2 of the present invention has been deposited at the General Microbiology Center of the China Microbial Strain Collection Management Committee (CGMCC, Beijing, China) on October 31, 2002, and the accession number is CGMCC No. 0829.

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Description

防治植物细菌性青枯病的微生物制剂和方法及其用途 技术领域
本发明涉及微生物领域。 具体地说， 本发明涉及一种防治青枯病的微生物制剂 及其方法和用途。 背景技术
青枯病是由青枯劳尔氏菌 (Ratoo 'a S /aw cearum)引起的一类世界性的土传植 物病害， 在热带和亚热带地区发病普遍， 危害严重。 青枯病菌的寄主范围很广， 在 植物的根内和土壤中有很强的存活能力， 可侵染 44个科 300多种植物。
对于植物青枯病的防治， 多年来国内外均予以高度重视。 然而迄今为止， 抗青 枯病的作物品种很少， 抗性低且抗性极易丧失， 这主要是由于青枯病病原菌群的复 杂性和作物品种本身等因素所致。 此外， 抗病品种品质差、 产量低， 难以推广。 其 它方法， 如嫁接虽获得成功， 但由于其技术难度高， 难以大面积推广； 农业措施如 水旱轮作等受地域条件限制，也难以大面积推广。农药如农用链霉素、铜试剂 (如 77% 可杀得)等虽然在田间表现出一定的防效， 但由于这些农药均不是防治青枯病的农 药， 因而田间防效较差， 不稳定， 且病原菌易对这些农药产生抗药性。 因此， 目前 尚无防治植物青枯病的有效药剂。
青枯病的发病机理大致如下： 存在于土壤中的青枯病病原菌在寄主作物的整个 生长期均可通过植物根系侵染植物内部并潜伏，在合适条件 (如高温、高湿)下潜伏在 植物体内的青枯病病原菌便大量繁殖， 堵塞植物的维管束发展成为病害。 针对上述 特点， 可釆用从作物苗期开始防止病原菌从根系侵入和潜伏并阻止潜伏病原菌发展 成为病害的防治策略。
从 80年代初开始，国内外在采用无致病力的青枯假单胞菌菌株防治青枯病的研 究和应用方面开展了许多工作， 发表了大量的文章。 但研究工作几乎都停窜在温室 阶段， 至今大田试验尚未取得成功。 同时， 无致病力的青枯假单胞菌菌株在自然条 件下还可能存在变异， 因此， 其应用潜力不大。
另外， 细菌素产生菌株 (ABPS)、
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颍壳
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cepacia B5) 、
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so/imflceizrM ) 的变种、芽胞杆菌 ( izcz7/½y spp.B33 和 B36) 以及泡囊丛枝菌根真菌 (VAM)等生防菌株也被先后用来防治植物青枯病。然 而，这些菌株也仅仅在温室或田间苗期有效果，而在定植 40天后几乎没有防治效果。
因此， 本领域中迫切需要能够有效防治植物青枯病的新的微生物制剂和方法。 发明内容 本发明的目的是为了提供能够防治植物青枯病的新的微生物制剂和方法。
发明者通过研究从江西南昌郊区土壤中筛选分离获得的一株多粘类芽孢杆菌， 该菌株的活菌、 发酵液或发酵清液在大田试验中成功地防治了番茄、 辣椒、 茄子和 烟草青枯病， 从而完成了本发明。该菌株已经于 2002年 10月 31日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (tGMCC), 保藏号为 CGMCC No. 0829。
因此， 本发明第一方面提供了一种多粘类芽抱杆菌 C¾e 'bfl«7to polymyxa) HY96-2, 其保藏号为 CGMCC No. 0829。
本发明第二方面提供了一种农用微生物制剂， 该微生物制剂含有多粘类芽孢杆 菌活菌或利用该菌培养而得的发酵清液。 在一个具体实施方案中， 该多粘类芽孢杆 菌是 CGMCC No. 0829。
在一个较佳的实施方案中， 所述微生物制剂含有利用该菌培养而得的发酵液， 如含有多粘类芽孢杆菌 CGMCC No. 0829 的活菌以及利用该菌培养而得的发酵清 液。
本发明所用的术语 "发酵液"、 "活菌"、 "发酵清液"具有本领域技术人员通常 熟知且承认的含义。 所述发酵液可通过在适合生长的条件下培养本发明的多粘类芽 孢杆菌 CGMCC No. 0829(即下文所称的 "生防菌 [biocontrol agent]HY96-2" )， 使其 生长至一定的细菌浓度来获得； 所述的活菌是指通过生物法培养生防菌而得到的具 有生活能力的菌体；所述的发酵清液是指将发酵液通过分离去除其中的菌体而得到。
用于培养本发明菌株的培养基中的营养源没有特别的限制。 本领域技术人员可 以根据公知的技术来选择合适的碳源、氮源和其它营养源。例如， 碳源可以是淀粉、 糊精、 甘油、 葡萄糖、 蔗糖、 肌醇、 甘露醇等。 氮源可以是胨、 大豆粉、 蛋白粉、 肉膏、 米糖、 麦皮、酵母粉、 玉米浆、 铵盐以及其它有机或无机含氮化合物。 另外， 培养基中还可适当加入一些无机盐类， 如氯化钠、 磷酸盐如磷酸氢二钾和磷酸二氢 钾、 硫酸铵、 硫酸锰、 硫酸镁、 碳酸钙等金属盐。 通常可采用各种已知的常规培养 基， 如 LB琼脂培养基、 营养琼脂培养基、 葡萄糖酵母膏琼脂培养基和牛肉浸汁琼 脂培养基等。 下文实施例中给出了一个最适培养基的配方。 然而， 本领域技术人员 应当理解， 本发明并不局限于本文中列举的这些具体培养基配方。
培养本发明菌株时的温度、 pH、 通气比、 罐压、 转速等条件没有特别严格的限 制， 只要该条件适合所述菌的生长即可。 在培养时可采用豆油、 泡敌等消泡剂进行 消泡。 在一些较佳的实施方案中， pH宜控制在 5.5-7.5之间。 培养温度宜在 25-35Ό 之间。 培养时间通常在 12 小时至 72 小时之间。 最终的菌浓度通常可高达 I X lOUCFU/ml至 l X 1012CFU/ml。 然而， 上述列举的这些参数只是实现本发明目的的 较佳方案。 因此， 本领域技术人员在上述范围以外选择合适的培养条件也能获得本 发明的活菌体、 发酵清液、 发酵液。
本发明的微生物制剂例如可以直接以发酵液形式施用，也可将其适当稀释 (例如 稀释 10倍、 100倍、 1000倍或更高)以稀释液形式施用， 还可用本领域常规技术对 所述发酵液进行分离提取。 获得的活菌体、 发酵清液以及从中获得的提取物也可直 接施用。 微生物制剂中还可含有不影响发酵液防治青枯病效果的其它物质。 例如， 为了便于长期贮存， 可将发酵原液或其稀释液与合适的载体混合， 然后适当干燥， 制成载体形式的微生物制剂。 这些载体对本发明的活菌体、 发酵清液以及发酵液防 治植物青枯病效果无影响。 因此， 在一个较佳的实施方案中， 所述微生物制剂还含 有选自稻壳粉、 玉米秸粉、 草炭土、 轻质碳酸钙、 滑石粉、 凹凸棒土和 /或硅藻土的 载体及其混合物， 其中较佳的载体是稻壳粉、 凹凸棒土或玉米秸粉。 这些载体均可 市售购得。 载体宜事先加工研磨成粒度在 10-200 目之间。 载体与含活菌的菌悬液、 发酵清液或发酵液宜以 1 : 0.1至 1:10的重量比例， 更佳的为 1 : 0.2至 1 : 5的重量 比例混合。 上述干燥步骤可以采用本领域中的常规技术， 例如但不局限于， 自然干 燥法、 真空干燥法、 气流干燥和沸腾床干燥法等。 为了能使多粘类芽孢杆菌尽可能 保持较高的活性和较长的贮存期， 有机载体形式的微生物制剂的含水量宜控制在 3- 16% (重量)之间， 更佳的为 7-16% (重量)之间， 无机载体形式的微生物制剂的含水量 宜控制在 3-6% (重量)之间。
本发明另一方面提供了一种防治植物细菌性青枯病的方法， 该方法包括将本发 明上述微生物制剂施加到患青枯病植物的根部上的步骤。
上述将微生物制剂施加到植物根部上的方法是本领域中的常规技术， 例如可以 是在播种时浸种， 移栽前将植物根部浸在发酵液或其稀释液中， 或者直接将发酵液 或稀释液泼浇在苗床上， 可定植时进行灌根， 也可在植物生长过程中灌根。 若微生 物制剂是以载体形式保存的， 则可在临用前用水稀释后再进行施加。
本领域技术人员无需经过过多试验即可确定本发明的最适施药剂量。 例如， 当 以稻壳粉作为载体时， 较佳的施药剂量在平均每亩 (667平方米 )1.5~4.5千克范围内。
在一个较佳的实施方案中， 本发明方法可用来防治番茄、 辣椒、 茄子和烟草作 物的青枯病。 如下文试验结果表明， 本发明的微生物制剂可用于防治番茄、 辣椒和 茄子等作物青枯病，收获后期 (有的对照发病率高达 97%)的田间防效可达 70〜85%。
本发明者还发现， 本发明的微生物制剂也可用来防治植物苗期立枯病、 猝倒病 以及番茄枯萎病、 茄子枯萎病、 黄瓜枯萎病， 烟草赤星病和由镰刀菌引起的大豆根 腐病等真菌性病害。
因此， 本发明还有一个方面涉及本发明所述微生物制剂用于防治植物苗期立枯 病、 猝倒病， 以及番茄枯萎病、 茄子枯萎病、 黄瓜枯萎病、 烟草赤星病、 大豆根腐 病的用途。
本发明者还发现， 在植物不发青枯病时， 本发明的微生物制剂具有明显的促进 植物生长、提高产量的作用 (例如提高番茄产量 27.5%);而且发明的微生物制剂对其 它作物， 如菠菜、 苋菜、 豇豆、 黑麦草等等， 也具有明显的促进生长、 提高产量， 增产高达 18〜25 %。
因此， 本发明还有一个方面涉及微生物制剂在促进植物生长、 提高植物产量上 的用途。
本发明的微生物制剂具有生防作用强的优点， 作为生物农药应用的潜力很大。 具体表现在： 第一， 它能有效防治番茄、 辣椒、 茄子和烟草等作物的青枯病， 推迟 发病。 第二， 在植物发病的后期， 特别是植物收获后期仍具有很高的防治效果， 最 高可达 85%以上， 这一防效在其他人的研究中未见报道。 第三， 该生物农药制剂还 能显著提高作物的产量， 除对这些青枯病发病作物生长有明显的促进作用外， 对其 它植物的生长也具有明显的促进作用。 第四， 该微生物制剂还可防治植物苗期立枯 病、 猝倒病， 番茄枯萎病， 茄子枯萎病， 黄瓜枯萎病， 烟草赤星病以及由镰刀菌引 起的大豆根腐病等真菌性病害。
本发明的其它优点和目的可从下文进一步详细描述中清楚地得知。 保藏信息
本发明菌株 HY96-2已经于 2002年 10月 31日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心 (CGMCC, 中国， 北京)， 保藏号为 CGMCC No. 0829。 实施例 1菌株 HY96-2的分离筛选
本实施例以青枯劳尔氏菌株 (Ra&to ' solanacearum)\号生理小种 Tb和 2号生 理小种 Tt、 蔬菜立枯病菌、 烟草赤星病菌、 稻瘟病菌、 黄瓜枯萎镰刀菌以及大豆根 腐镰刀菌作为指示菌株。
在南昌郊区发生程度不同的青枯病田采集番茄健株和病株， 连同根系周围的部 分土壤装入干净的塑料袋内密封， 带回室内尽快分离。 将采集的样本分为以下 3部 分： 根围， 用力抖动植株， 抖下的土壤为根围部分； 根际： 抖动后较牢固地沾附于 根表的土壤， 用水洗下， 为根际部分。 根表： 经洗涤的根剪成小段， 与石英砂和水 混合， 充分振荡， 洗下部分为根表部分。
将上述 3 部分分别进行稀释法分离， 培养基为改进的酵母浸膏平板 (葡萄糖： 1.0%； 酵母浸膏： 0.5%; KH2PO4: 0.05%； MgSO4: 0.05%； 琼脂粉： 1.5〜： 1.6%; pH: 7.2〜7.4； 121 °C高压灭菌 25分钟)，在每个平板上再加入适量的青枯菌 Tb和 Tt 悬液， 置 28~30Ό温箱中培养， 将形态各异的单个细菌菌落挑出， 再划线纯化。 保 存于斜面培养基上待用。
然后用以下方法确定拮抗菌。 第一种方法是： 将分离物点接于改进的酵母浸膏 平板上， 30Ό培养 48小时，以氯仿熏蒸杀死，涂布青枯菌 Tb和 Tt悬液 (108cfo I ml), 继续培养 12〜24小时， 观察菌落周围有无抑菌圈及其大小， 记录抑菌圈大小， 统计 拮抗菌占总分离菌数的比例。 纯化所有表现拮抗作用的菌株， 留待下一步试验。 第二种方法是： 将青枯菌 Tb和 Tt悬液 (108cfo I ml)lml加入灭菌培养皿中， 再加入 50°C左右的 15ml培养基， 摇匀。冷却后， 点接分离到的细菌菌株，每皿接 5 个分离菌， 置 3(TC培养 12〜24小时， 观察菌落周围有无抑菌圈及其大小， 记录抑 菌圈大小， 统计拮抗菌占总分离菌数的比例。 纯化所有表现拮抗作用的菌株， 留待 下一步试验。
然后，测定所获得的拮抗菌转移 10次后的拮抗能力，选取仍具有拮抗能力的菌 株保存。 将上述获得的菌株对其他几种病原菌的拮抗能力进行测定， 采用平板对峙 培养法 (参见《植病研究方法》， 方中达编， 1979， 农业出版社)。
结果与分析
本实施例共采集样本 40个， 其中重病田 (病株率在 50%以上)健株、病株和轻病 田 (病株率在 20%以下)健株、 病株各 10株。 初次筛选得到拮抗细菌 206株， 其中来 自重病田健株、 病株和轻病田健株、 病株的各为 89、 54和 35、 28株； 根围、 根际 和根表各为 122， 53和 31株。在这 206株菌中， 通过上述两种拮抗试验， 获得对青 枯病具有一定拮抗作用的菌株 98株。
98个拮抗菌株于改良的酵母浸膏斜面转移 10次， 每次间隔 6天， 以青枯菌 Tb 和 Tt重新测定拮抗能力， 仅有 49株保持原拮抗能力， 其余菌株全部丧失。 按分离 部位来看， 49个菌株中有 21个来自根表； 根围和根际各有 12个和 16个。 说明根 表菌株的分离频率高于根围和根际。 下表 1中列出部分拮抗作用表现较好的菌株。
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使这些菌株再与蔬菜立枯丝核菌、 烟草赤星病菌、 稻瘟病菌、 枯萎镰刀菌、 大 豆根腐镰刀菌进行对峙培养， 结果如表 2所示。 表 2拮抗菌株对植物真菌病害病原菌的抑菌作用结果
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上述结果表明， 由番茄根际获得的菌株 HY-2、 HY-14, HY-3除对植物青枯病 的两个生理小种均具有明显的拮抗作用外， 对其它几种病原菌也具有很好的拮抗作 用。这表明 HY-2等菌株拮抗作用强、抗菌谱广。将这些菌株命名为 HY96-2、HY96-14 和 HY96-3。 实施例 2 HY96-2菌株的鉴定
下面进一步对上述实施例 1中获得的分离自南昌番茄根际土壤的 HY96-2菌株 进行鉴定。
染色： 按本领域常规方法进行革兰氏染色和抗酸染色。
形态特征： 于营养琼脂、 牛肉浸汁琼脂培养基上 32Ό培养 2天， 取菌体涂片， 染色后用光学显微镜观察菌体形态， 并用电子显微镜观察细胞的表面特征。
细胞壁化学分类:用薄板层析法对菌体进行全细胞水解液的氨基酸及糖型分析。 培养特征： 在 LB琼脂、 营养琼脂、 葡萄糖酵母膏琼脂和牛肉浸汁琼脂四种培 养基 32°C培养 2-3天后观察菌落形成及颜色。
生理生化特征： 参照《Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology》 Vol. Π的方 法和《常见细菌系统鉴定手册》进行。
16S rDNA序列分析： 按常规方法提取菌株总 DNA。 釆用通用引物进行 16S rDNA 的 PCR扩增， PCR产物纯化后直接用 Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit测序， 电泳及数据分析由 Applied Biosystems DNA Sequencer (model 377)自动进行。将所测定的 16S rDNA序列 GenBank数据库中相关种、属序列比较， 以确定该菌株的分类地位。
实验结果：
( 1 ) 革兰氏染色结果表明， HY96-2菌株为革兰氏阳性兼有阴性， 抗酸染色呈 阴性。
(2) 形态特征： 于 32°C培养 2天后， HY96-2菌株的菌体为直或近直的杆状， 在一个略膨大的孢囊内只含有一个椭圆形芽孢， 并具有稀疏的周生鞭毛， 能运动； 好氧生长， 兼性厌氧， 在营养琼脂上无可溶性色素。 (3 ) 细胞壁化学分析： HY96-2菌株含有 meso-DAP (二氨基庚二酸)甘氨酸， 无特征性糖， 细胞壁 II型。
(4) 培养特征： HY96-2培养特征见下表 3。
表 3. HY96-2菌株的培养特征
培养基 菌落颜色及形状
LB琼脂 菌落乳脂色 湿润光滑 营养琼脂 菌落杏仁白色 粘稠状
葡萄糖酵母膏琼脂 菌落淡黄白色 有小突起， 粘性
牛肉汁琼脂 菌落灰白色 湿润光滑
( 5 ) HY96-2菌株的生理生化特征： 见表 4。
表 4. HY96-2菌株的生理生化特征
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( 6) 16S iDNA序列分析： 16S rDNA序列分析结果表明， HY96-2菌株属于类 芽孢杆菌属 (P«e 'ba 7/M 。 HY96-2菌株与多粘类芽孢杆菌 ( ae 'bac //^ polymyxa) 序列同源性为 99%。
根据 16S rDNA的序列分析结果， HY96-2菌株属于类芽抱杆菌属； HY96-2菌 株革兰氏染色阳性兼有阴性， 不抗酸， 细胞呈杆状， 形成芽孢， 并有鞭毛， 在一个 孢子囊中只产生一个孢子，属于类芽孢杆菌属 (Pae 'bfld//^)。 HY96-2菌株的各项培 养特征和生理生化特征均与多粘类芽孢杆菌相同。 所以将 HY96-2菌株鉴定为多粘 类芽孢杆菌 (Pae 'bad//^ polymyxd)。 该菌株已经于 2002年 10月 31日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC),保藏号为 CGMCC No. 0829。 实施例 3 HY96-2的发酵培养
1) 5L全自动发酵罐培养
将 HY96-2种子活化后进行菌种培养。 先将淀粉糊化， 再加到含酵母粉、 蛋白 粉、 葡萄糖、 MgSO4、 KH2PO4和 CaCO3的培养基中， 121 °C灭菌 30分钟。
用无菌水洗下茄子瓶中的菌体，接种到 5L全自动发酵罐中。在通气比为 0.4~2：
1， 转速 300〜800rpm， 25〜35°C的条件下， 发酵时间 24〜48小时。 采用平板计数 法 (参见 《植病研究方法》， 方中达编.， 1979 , 农业出版社)测得其最后菌浓度为 1.37xl012CFU/ml。 2) 50L全自动发酵罐培养
种子活化后进行菌种培养。 先将淀粉糊化， 再加到上述 1)的培养基中。 121 °C 灭菌 30 分钟。 种子接种到 50L全自动发酵罐中。 在通气比为 0.4〜2： 1， 转速 300~800rpm, 温度 25〜35°C的条件下， 发酵时间 24〜48小时。 采用平板计数法测 得其最后菌浓度为 2.09xlOuCFU/ml。
3) 1吨发酵罐培养
在 5L全自动发酵罐上进行种子培养， 方法如上文 1)所述。
然后进行培养基灭菌。先将淀粉糊化，再加到含葡萄糖、酵母粉、蛋白粉、 MgSO4、
KH2PO^n CaCO3的培养基中。 121 °C灭菌 35分钟。 将在 5L全自动发酵罐中培养的 种子接种到 1吨发酵罐中。在通气比为 0.4〜1： 1， 转速 100~350rpm, 25〜35°C的条 件下发酵 24〜48小时。 采用平板计数法测得其最后菌浓度为
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实施例 4 载体形式的微生物制剂的制备
1)以稻壳粉为制剂载体
将稻壳粉进行加工， 使其粒度在 10-100 目之间。 将发酵液与载体稻壳粉混配
(0.2~5:1(重量比))后， 搅拌， 分别采用自然干燥法、真空干燥法和沸腾床干燥法进行 干燥。 获得含水量分别为 14%、 13.2%和 14.3%的三种制剂。
2) 以凹凸棒土为制剂载体：
将凹凸棒土进行加工，使其粒度小于 44微米。对发酵液离心分离，过滤获得活 菌和发酵清液。清洗活菌数次，然后使其悬浮于与最初发酵液体积大致相同的水中。 将所得活菌悬液与凹凸棒土混配 (1:3(重量))后， 搅拌，分别采用自然干燥法、真空干 燥法和沸腾床干燥法进行干燥。 使三种制剂含水量分别为 4.5%、 4.8%和 4.0%。
3) 以玉米秸粉为制剂载体：
将玉米秸粉进行加工， 使其粒度在 20-40目之间。 将上述 2)中分离获得的发酵 清液与玉米秸粉混配 (3:1(重量))后， 搅拌， 分别采用自然干燥法、真空干燥法和沸腾 床千燥法进行干燥。 使三种制剂含水量分别为 14.1%、 14.8%和 13.8%。
用下述方法鉴别微生物制剂： 称取样品 lg， 置于三角瓶中， 加 10ml灭菌水， 于旋转式摇床上以 150rpm充分振荡温育 1小时， 立即取 1ml悬浮液加入一支盛有 9ml灭菌水的试管中， 用接种环蘸取悬浮液在酵母浸膏培养基平板上划线， 立即将 平板置于 30Ό恒温箱中培养， 48小时至 72小时之内观察菌落形态。
根据多粘类芽孢菌的培养性状鉴别。 其培养性状为： 在酵母浸膏培养基平板上 生长良好， 样品中的细菌菌落颜色与质地应与同期培养物单元菌落基本一致。 其主 要特点是： 菌落大小中等， 半透明圆形， 向上隆起， 表面光滑， 边缘整齐， 有光泽， 无色素产生， 用接种针挑取时粘度较大。 ，
然后测定制剂中的活菌数。在干净的环境中称取试样 lO.Og放入装有 90ml无菌 水的灭菌三角瓶中，在旋转式摇床上以 150rpm充分振荡 lh，选择 3-4个连续的适宜 稀释度，分别用 0.5ml的无菌吸管吸取 0.1ml稀释液于已铺好的酵母浸膏培养基平板 平板上， 每个稀释度至少 5个重复。 将此稀释度的 5个平板迅速用无菌玻璃刮刀在 琼脂表面均匀涂开， 将涂布好后的一系列平板放置于 30°C的培养箱中培养 20〜24 小时， 计数。 根据下式统计算出同一稀释度上 5个平皿上的菌落平均数。 糊中多 tt 纖 量 (CFU/g)=
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实施例 5生防菌 ΗΥ96-2对植物青枯病菌的室内毒力测定
在本实施例中， 采用的挑战菌株为植物青枯病病原菌为青枯假单孢菌 (Ra to z solanacearum)!号和 2号小种 Tb和 Tt， 生防菌株为 HY96-2。
抑菌圈测定
用杯碟法测定： 将 HY96-2接菌在 LB液体培养基中， 于转速为 120转 /分钟的 摇床中培养 36小时， 将培养液用离心机高速离心， 取上清液用 0.22μπι微孔滤膜 (已 灭菌)过滤， 得无菌滤液。
将青枯病病原菌 (Ra to 'fl solanacearum)Tb和 Tt分别接菌在 LB平板上 30°C活 化 2天， 用 0.85%生理盐水制成不同浓度梯度菌悬液， 用平板计数法确定终菌悬液 浓度为 109cfo/ml， 在培养皿中加入 30μ1菌悬液， 然后倒入 30ml 45 °C的 LB培养基， 摇勾。 将 3只牛津杯放到平板上， 分别吸取 200μ1各浓度无菌滤液加入到杯中 (或用 纸片沾取上述系列浓度无菌滤液， 放到平板上)以加无菌水的为对照。 每浓度重复 3 次， 8°C冰箱中冷冻 4〜6小时， 放置在 30°C的恒温箱中培养， 18-24小时后观察结 果， 测量抑菌直径。 结果如下表 5所示- 表 5. HY96-2代谢产物对青枯病病原菌的抑菌效果
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本研究利用青枯病病原菌的 1号和 2号生理小种作为指示菌对生防菌株 HY96-2 及其发酵液分别进行拮抗实验， 研究表明当用含菌体的发酵液进行拮抗实验时， 发 现随着时间的延长， 抑菌圈直径会变大。 故分别对菌体和不含菌体的发酵上清液进 行拮抗实验， 发现发酵清液抑菌效果也非常明显， 而活菌体在开始的几天内抑菌圈 直径较小， 放置一个星期左右后出现较明显的抑菌现象， 同时不同浓度的发酵清液 产生的抑菌圈大小不同。 由这些现象可以初步推测： 抑菌现象的产生主要是由于菌 体生长代谢会产生一些对青枯病病原菌有抑制作用的活性物质， 也就是说， 发酵清 液中肯定有某些活性物质在起作用， 并且活菌体的存在会进一步加强和巩固抑菌效 果。 实施例 5载体的筛选
比较不同 pH，不同含水量，不同载体对微生物制剂中 HY96-2菌株存活的影响。 HY96-2在改进的牛肉浸膏培养液中培养 24小时， 离心， 取菌体沉淀与不同的 pH 的磷酸缓冲液混合， 常温存放 8-96小时， 结果发现 pH6.2~8.0范围内细菌基本不受 影响。 在灭菌的稻壳粉和轻质碳酸钙干粉中加入菌体， 调制成不同含水量的菌剂， 分别在起始和处理 60天测定活菌数，结果稻壳粉以 7〜16%的含水量存活率最高，为 91.2%。 轻质碳酸钙干粉以 4~6%得含水量存活率最高， 为 82.8%。 在 pH7.2， 有机 载体含水量为 7~16%， 无机载体含水量 3~6%的条件下， 研究了不同载体对 HY96-2 存活的影响。 12个月后检测活菌含量， 结果如下表 6所示。 表 6.载体对 HY96-2存活的影响
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从表 6中可见， 稻壳粉作为载体 HY96-2存活率最高， 是较理想的载体。 因此， 在下文中选用稻壳粉为制剂载体。 由于多粘类芽孢杆菌对干燥耐性较强， 因此对含 水量要求并不十分严格， 为了使多粘类芽孢杆菌在制剂的状态下尽可能保持较高的 活性以及较长的贮存期， 该微生物制剂的含水量宜在 7-16%之间。 实施例 6 HY96-2发酵液的直接施用田间防治植物青枯病和增加产量试验 施药方法： 每亩用药量为 2500毫升 HY96-2发酵液 (lxl08CFU/ml)
第一次施药： 浸种与泼浇
取 100毫升发酵液，用水稀释 100倍，然后将用纱布包好的种子 (种子量为栽一 亩地所需种子)在 HY96-2稀释液中浸泡 30分钟， 将种子取出阴凉处晾干、 播种于 苗床上 (其面积为栽一亩地所需的苗床， 番茄大田定植数以每亩 2500〜3000株左右 为准)； 最后将浸种后的 HY96-2稀释液均匀泼浇于苗床上。
第二次施药： 营养钵假植
移苗或营养钵假植时，取 200毫升发酵液，加适量清水进行稀释 (约为 500〜600 倍)， 然后将稀释液均匀泼浇于栽一亩地所需的营养钵中。
第三次施药： 大田定植灌根
大田定植当时，每亩取 1200毫升发酵液，适量清水进行稀释 (约为 500〜600倍)， 充然后将稀释液均匀灌根于植株根部。 （折合每棵灌药液量 200〜250ml左右)。
第四次施药： 大田定植后 30天灌根
大田定植后 30天左右 (或始发期)， 每亩取 1000毫升发酵液， 加适量清水进行 稀释 (约为 600〜700 倍)，. 然后将稀释液均匀灌根于植株根部 (折合每棵灌药液量 250〜300ml左右）。
在田间开始发病时调查， 在收获期 (定植后 80天)调查发病率， 计算防治效果和 产量。 结果如表 7所示。
Figure imgf000013_0001
表结果表明，田间番茄定植后 80天 (收获期)，青枯病发病率达到 93.7%, HY96-2 菌液也具有较高的防治效果，防效达 83%以上，增产 252.8%。辣椒田间防效达 82.2%， 增产 86.8%。 茄子田间防效达 84.8%， 增产 75.6%。 实施例 7.载体形式的微生物制剂温室盆栽试验对番茄青枯病的防治作用和促生 长作用
选用番茄感病品种中蔬 6号， 将供试种子播种于蛭石中， 待幼苗达 3-4片真叶 时， 移栽。
将实施例 4制得的制剂用水稀释 200倍， 充分搅拌、 浸泡 2小时， 再将番茄苗 放入浸蘸根部 2 0分钟， 立即移栽于花盆的接菌或未接菌土壤中， 并于每钵浇 300 毫升生防制剂。对照用 200万单位农用链霉素稀释 2000倍浸根，并设清水处理对照。
青枯菌菌株 Tb(l号生理小种)， 在 TZC培养平板上纯化， 于 28-30°C下在 NA 培养基平板或斜面上培养 48 小时左右， 刮取菌苔用灭菌水稀释成浓度为 3xl08CFU/ml的菌悬液， 作为接种体。
细沙壤土 2份与草炭土 1份混合均匀， 高温消毒， 在灭菌土装入盆钵前， 估测 每盆钵用土重量， 称取定量灭菌土， 加入适量青枯菌悬液， 使土中接种体压力达到 106个细菌 /克。将带菌土装入直径 15cm大小花盆中， 同时栽入经生防制剂浸蘸根处 理过的番茄苗每盆 2株， 并随即浇制剂 300ml。
在番茄苗移栽后定期调査青枯病发病株数和发病程度 (病级)， 将番茄植株病情 按 5级划分， 以之为基础， 计算各处理植株病情指数。 在番茄移栽 3周后测定上述 处理植株的高度、 根长、 植株和根系的干重或鲜重。
在番茄苗移栽后每 10天定期调査青枯病发病株数和发病程度结果如下表 8: 表 S温室盆栽生物制剂对番茄青枯病的防治作用结果
Figure imgf000014_0001
由上表可见， 由 HY96-2制成的生物制剂可将番茄青枯病发生推迟 20天， 当对 照发病率达到 100%时， 用药处理才刚刚开始发病， 并且病害发生速度缓慢， 前期防 效为 95.5%,在后期也具有很高的防治效果，可达 86.5%。而农用链霉素对番茄青枯 病的防效很低， 到后期已无效果。
番茄在生物制剂处理移栽后， 植株生长良好， 在前 3周内， 就表现出生长旺盛 的势头， 叶片浓绿， 叶面积增大， 茎杆粗壮， 3 周后株高明显增加， 结果如下表所 示。
表 9生物菌剂对番茄促生长作用结果
Figure imgf000014_0002
结果表明， HY96-2 的生物制剂对番茄具有明显的促进生长作用， 促生长作用 在前期表现较强， 在 5周前， 要比对照高 10厘米以上， 并且茎杆粗壮。 在 6周后， 用生物制剂处理的植株的干重可增加 28%, 促生长作用显著。 实施例 8.载体形式的微生物制剂大田试验对植物青枯病的防治作用
在田间用本发明制剂进行防治烟草、 番茄、 茄子和辣椒青枯病试验， 并全面考 察生物制剂对植物青枯病的防效和增产效果。经过在田间连续进行三年的防治试验， 分别在番茄、 辣椒、 茄子和烟草等作物上取得了一致稳定的防治效果。 下面仅仅列 出一年的结果， 在不同的发病时期对田间发病情况进行调査， 统计最后一次调査 (收 获后期:)的防治效果。
施药方法 (每亩用药量为 3000g):
第一次施药： 浸种与泼浇
取 50克制剂，用水稀释 300倍，充分搅拌 2小时；然后将用纱布包好的种子 (种 子量为栽一亩地所需种子)在稀释液中浸泡 30分钟， 将种子取出阴凉处晾干、 播种 于苗床上 (其面积为栽一亩地所需的苗床)； 最后将浸种后的稀释液均匀泼浇于苗床 上。
第二次施药： 营养钵假植
移苗或营养钵假植时， 取 200克制剂加适量清水进行稀释 (约为 500〜600倍)， 充分搅拌 2小时， 然后将稀释液均勾泼浇于栽一亩地所需的营养钵中。
第三次施药： 大田定植灌根
大田定植当时， 每亩取 1500克制剂加适量清水进行稀释 (约为 500〜600倍)， 充分搅拌 2小时， 然后将稀释液均勾灌根于植株根部 （折合每棵灌药液量 200〜 250ml左右；)。
第四次施药： 大田定植后 30天灌根
大田定植后 30天左右 (或始发期)， 每亩取 1250克制剂加适量清水进行稀释 (约 为 600〜700倍)， 充分搅拌 2小时后， 然后将稀释液均匀灌根于植株根部 (折合每棵 灌药液量 250〜300ml左右)。
小区实验处理： 样品 4个重复， 一共 5X4=20个小区。
结果分别见下表 10-13。
Figure imgf000016_0001
上表结果表明， 生物制剂在番茄田间用量每亩 3.0公斤， 移栽后 60天， 防效达 96.67%, 移栽后 90天 (；收获后期)防效仍为 82.47%， 增产 300.83 %， 此时对照的发病 率高达 97 %。
表 11 生物制剂防治辣椒青枯病大田试验结果
Figure imgf000016_0002
上表结果表明， 生物菌剂在辣椒田间用量每亩 2.0公斤， 防效达 79.23%， 增产 147.9%。 表 12 生物制剂防治茄子青枯病大田试验结果
Figure imgf000017_0002
上表结果表明， 生物制剂在茄子田间用量每亩 3.0公斤， 防效达 85.74%， 增产 166.6%。
表 13 生物制剂防治烟草青枯病大田试验结果
Figure imgf000017_0003
上表结果表明， 在烟草移栽后 110天， 生物制剂田间用量每亩 3.5公斤， 防效 达 67%以上。 实施例 9.载体形式的发酵液制剂、 活菌制剂、 发酵清液制剂对大田番茄青枯病 的防治作用
如实施例 4中 1)、 2)、 3)所述， 将实施例 3培养的菌株 HY96-2发酵液的一部 分直接配成 "发酵液制剂"。 对另一部分发酵液进行离心分离， 过滤获得活菌， 清洗 后配成 "活菌制剂"； 另外将分离获得的发酵清液配成 "发酵清液制剂"。
田间试验方法与实施例 8相同， 每亩用药量为 2.5千克， 结果如下：
Figure imgf000017_0001
可见， 不论是活菌制剂， 还是发酵清液制剂对植物青枯病都具有很好的防治效 果， 并且与发酵液制剂效果相当， 无显著差异。 实施例 10.载体形式的发酵液制剂、活菌制剂、发酵清液制剂对真菌病害的防治 作用
. 在进行实施例 8的方法时， 还发现该微生物制剂对真菌病害也有防治作用。 在安徽省和县的大田试验发现本生物制剂可防治植物苗期立枯病、 猝倒病及黄 瓜枯萎病， 防效达 85%以上。 在江西省南昌的大田试验发现本生物制剂对番茄枯萎 病和茄子枯萎病具有很好的防治作用， 防效达 83%以上。 在福建省将乐的大田试验 发现其可防治烟草赤星病等真菌性病害， 防效达 80%以上。 在黑龙江省大田试验发 现生物制剂可防治由镰刀菌引起的大豆根腐病病害， 防效达 83%以上。 结果如下表 15所示。 表 15 生物制剂防治其它植物真菌病害大田试验调查结果
病害名称 制剂种类 发 病 率(％) 防 效 (％)
发酵液 3.2 91.7
活菌 4.8 87.5
番茄立枯病
清液 4.6 88.1
清水对照 38.5
发酵液 3.8 87.9
活菌 4.2 86.7
番茄猝倒病
清液 4.8 84.8
清水对照 31.5
发酵液 5.15 85.2
活菌 5.45 84.3
番茄枯萎病
清液 5.82 83.3
清水对照 34.8
发酵液 4.62 85.8
活菌 5.0 84.6
¾¾子枯萎病
清液 4.76 85.4
清水对照 32.5
发酵液 2.1 92.7
活菌 2.6 90.9
黄瓜枯萎病
清液 2.4 91.7
清水对照 ' 28.8 病害名称 制剂种类 发 病 率 (％) 防 效 (％)
发酵液 10.5 84.4
活菌 11.2 83.3
烟草赤星病
清液 11.5 82.9
清水对照 67.2
发酵液 5.3 85.5
活菌 5.8 84.2
大豆根腐病
清液 6.1 83.3
清水对照 36.6
可见， 不论是活菌制剂， 还是发酵清液制剂对番茄立枯病、 番茄猝倒病、 番茄 枯萎病、 茄子枯萎病、 黄瓜枯萎病、 烟草赤星病和大豆根腐病都具有很好的防治效 果， 并且与发酵液制剂效果相当， 无显著差异。 实施例 11.载体形式的发酵液制剂、活菌制剂、发酵清液制剂对其他植物的促生 长作用
在进行各种生物制剂防治植物青枯病大田试验过程中， 发现其对番茄、 辣椒、 花生等作物生长具有明显的促进作用。 生物制剂的大田试验表明： 生物制剂不仅对 青枯病病原菌寄主作物 (如番茄)生长具有明显的促进作用，而且对非青枯病病原菌寄 主作物的生长也具有明显的促进作用。 试验表明， 在番茄无青枯病发生情况下使用 本制剂， 可使番茄增产高达 27.5%， 且番茄的增产效果主要表现为使番茄的前期产 量明显增加 (见表 16)。 其它试验结果表明， 应用本生物制剂可使苋菜、 菠菜、 豇豆 和黑麦草分别增产高达 8.3%、 25.0%、 18.7%和 11.9% (见表 17和表 18)。
表 16 生物制剂对番茄不发青枯病的增产作用结果
采果时间和采 量 (Kg)
制剂种 合计 折亩产 增产
10月 26 10月 28 10月 31 11月 3 11月 6 11月 9 11月 12 11月 15 11月 19
(Kg) (Kg) (%) 曰 曰 曰 曰 曰 曰 曰 曰 曰
对照 0.3 2.0 3.3 0.8 0.6 1.2 1.4 2.2 2.0 13.8 2760 发酵液 3.3 4.1 3.9 1.0 0.6 1.5 1.2 2.0 0 17.6 3520 27.5 活菌 3.1 3.6 3.5 1.1 0.7 1.3 1.4 2.0 0.2 16.9 3380 22.5 清液 2.8 4.0 4.0 0.8 0.6 1.4 1.2 2.2 0.4 17.4 3480 26.1 生物制剂对苋菜、 豇豆的增产作用结果
Figure imgf000020_0001
表 18 生物制剂对菠菜的增产作用结果
Figure imgf000020_0002
根据上述表 16-18的结果可以知道， 不论活菌制剂还是发酵清液制剂对番茄、 苋菜、 菠菜、 豇豆都具有明显的促生长作用， 并且与发酵液制剂无显著差异。 尽管上面已经描述了本发明的具体例子， 但是有一点对于本领域技术人员来说 是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。 因此， 所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。 保藏信息
本发明菌株 HY96-2已经于 2002年 10月 31日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心 (CGMCC, 中国， 北京)， 保藏号为 CGMCC No. 0829。

Claims

权利要求
1.
Figure imgf000021_0001
HYQS , 其保藏号为 CGMCC No. 0829
2. —种农用微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂含有多粘类芽孢杆菌活菌 或利用该菌培养而得的发酵清液。
3.根据权利要求 2所述的微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂含有利用该 菌培养而得的含该活菌及其发酵清液的发酵液。
4. 根据权利要求 2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂还含有选 自稻壳粉、 玉米秸粉、 草炭土、 轻质碳酸钙、 滑石粉、 凹凸棒土和 /或硅藻土的载体 及其混合物。
5. 根据权利要求 4所述的微生物制剂， 其特征在于， 所述载体选自稻壳粉、凹 凸棒土或玉米秸粉。
6.根据权利要求 5所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂的含水量 在 3-16% (重量)之间。
7.一种防治植物青枯病的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求 2所述的 微生物制剂施加到患青枯病植物的根部上的步骤。
8. 根据权利要求 7所述的方法， 其特征在于， 所述植物选自番茄、辣椒、茄子 和烟草。
9.权利要求 2所述的微生物制剂在防治植物苗期立枯病、猝倒病、以及番茄枯 萎病、 茄子枯萎病、 黄瓜枯萎病、 烟草赤星病、 大豆根腐病上的用途。
10. 权利要求 2所述的微生物制剂在促进植物生长、 提高植物产量上的用途。
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