WO2004044200A1

WO2004044200A1 - 穀物の収量を増加させる遺伝子、並びにその利用

Info

Publication number: WO2004044200A1
Application number: PCT/JP2003/014434
Authority: WO
Inventors: Motoyuki Ashikari; Makoto Matsuoka; Shaoyang Lin; Toshio Yamamoto; Asuka Nishimura; Tomonori Takashi
Original assignee: Honda Motor Co., Ltd.
Priority date: 2002-11-13
Filing date: 2003-11-13
Publication date: 2004-05-27
Also published as: US7417180B2; EP1580270B1; EP1580270A1; US20060123507A1; JP4448031B2; JPWO2004044200A1; JP2007049994A; DE60327254D1; JP4462566B2; AU2003301997A1; CN1742085A; EP1580270A4

Description

明細書穀物の収量を増加させる遺伝子、並びにその利用技術分野

本発明は、植物の着粒数（穎花 ·果実 ·種子を含む）の増減に関する遺伝子の単離 ·同定、並びに該遺伝子を利用した植物の着粒数（穎花 ·果実 ·種子を含む）を増加させる育種手法に関する。背景技術世界人口が爆発的に増え続ける一方、環境汚染や地球温暖ィヒ ·砂漠化による急激な耕地減少が起こっており、発展途上国を中心に慢性的な食糧不足が続いている。また現在、世界の年間人口増加率 1.4%に対し、穀物生産増加率は 1.0%と人口増加率に比べ低く、世界人口が 80億を突破する 2025年には、穀物需要は 50%上昇すると予想され食糧不足は一層加速している。この深刻な状況を打破する為には、政治，経済的な政策はもちろん、穀物生産量を上昇させる科学的な穀物育種戦略が不可欠である。交配と選抜を主体とする従来育種ではもはやこの深刻な状況を回避する事はできず、収量増加を目指した穀物の草型研究と具体的かつ効率的な穀物育種が必須である。 1960年代世界の食糧危機が懸念された際、国際イネ研究所（フィリピン）においてミラクルライスと呼ばれる短椁多収イネが、国際厶ギ · トウモロコシ研究所 (メキシコ）において短桿多収コムギが育成され、これら両品種の速やかな普及により世界の食糧危機が回避された。いわゆる「緑の革命」である。両品種は従来品種の 2倍の収量を示したが、この多収性は半矮性と呼ばれる短椁性の草型によつてもたらされた。すなわち多収を目指す場合、窒素肥料の投与が不可欠であるが、これは同時に草丈の伸長も誘導し、伸長した穀物は風雨により倒伏し収量を激減させる。一方、短桿品種は、施肥した場合でも、草丈の徒長なしに収量を増加させる事が可能となる。つまり「緑の革命」に貢献した両短桿品種は耐倒伏性を獲得する事によって、劇的に収量の増加をもたらした。現在においても、穀物の半矮性化は増収に多大に貢献しているが、既に多くの穀物品種は半矮性遺伝子を利用しているため、この技術を用いたさらなる増収は期待できず、新たな技術を利用した穀物生産技術の開発が必須である。コメは世界の人類の 50%の人々が食糧として利用し、特にアジアに住む人々にとって、コメの栽培特性がモンスーンという多湿の気候条件に合い、長いあいだ主食としてエネルギーの供給源になっていたばかりでなく、深く生活 ·文化に根付き、これまでに様々な地域で育種が進められ、人類が利用しやすい性質に改善されてきた。また最近イネのゲノム塩基配列が決定されるなど、分子遺伝学的ッールが整いつつあり、ゲノム遺伝学を用いた新たな育種技術が期待されるところである。

これまで、穀類（植物）の収量増加のため、様々な試みが行われたが、直接的に収量増加を担う、花 '種子（穎花）数の増減に関与する遺伝子について単離 · 同定が行われたという報告はなされていない。従来の穀物の半矮性化に加えて、花 ·種子（穎花）数の増減を制御する技術が開発されれば、さらなる穀物の収量の増加が期待される。発明の開示

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物の着粒数（穎花 ·果実 ·種子を含む）の増減に関する遺伝子の単離 ·同定、並びに該遺伝子を利用した植物の着粒数（穎花 ·果実 '種子を含む）を増加させる育種方法を提供することにある。

発明者らは、穀類（植物）の収量増加を試みるため、単子葉植物のモデルであるイネを用いて直接的に収量増加を担う遺伝子、すなわち花'種子（穎花）数の増減に関する遺伝子の探索を試みた。花 ·種子（穎花）数は複数の遺伝子の相互作用による量的形質 (QTL)として支配されている。そこでまず、 QTL解析を行う雑種集団の育成に先駆け、雑種集団の親となる品種の選定を試み、着粒数に明瞭な差が見られた日本型イネの「コシヒカリ」とインド型イネ「ハパタキ」 2つの品種を選抜した（図 1 ) 。これら二つの品種を交雑した F1個体に、コシヒカリを反復親とした戻し交雑と自殖を行い、 74系統の BC2F1, BC2F2および BC3F2 の集団を育成後、名古屋大学付属農場に展開した。 BC2F2 74個体を用いて、着粒数に関する QTL解析を行った結果、着粒数を増加させる複数の QTLを検出した (図 2)。特に第 1染色体短腕約 28cM近傍にハバタキの locusがコシヒカリに対して着粒数を増加させる効果の大きい QTL(YQ1; Yielding QTL 1)を見いだすことに成功した（図 2 ) 。 YQ1の存在を検証するために、返し戻し交雑と MASを用いて、 YQ1準同質遺伝子系統を作製し、 Nil-YQl及びコシヒカリ（コントロール）の最大着粒数を調査した。その結果、 QTL(YQ1)の存在を確認し、第 1染色体短腕、約 28cM近傍が八バタキに置換した系統は平均で 50粒着粒数を増加させることがわかった。

次に 74個体の BC2F1からそれぞれ CTAB法を用いて DNAを抽出すると共全染色体を網羅的に包含する 93個の分子マーカ一を用いて各個体の遺伝子型を決定した。その自殖後代 BC2F2を 1系統に各 10個体展開し、その中から、ランダムに 1系統に 1個体を選定し、選定した個体についてそれぞれ 6穂をサンプリング後、各穂の着粒数を調査した。各系統 6穂の内、最も着粒数の多かった穂を選出し、最大着粒数とした後、 Qgene ソフトを用いて QTL解析を行った。

次に BC3F2集団を用いて、分子マ一カーによる遺伝子型と表現型（F2及ぴ F3) を調査し、再度連鎖解析を行った。その結果分子マーカー（6Aと 8A) に挟まれる領域に YQ1が座乗することが明らかになった（図 3 ) 。 YQ1座乗領域と詳細に特定するために、 YQの分離集団（12500個体）を用いて高精度連鎖解析を行った結果、 YQ1は分子マーカー（4A9と 20) に挟まれる約 8Kbを特定する事ができた（図 4 ) 。この領域において遺伝子予測を行ったところ、 1個の遺伝子が予測され、相同性検索の結果、 CK (サイトカイニン酸化酵素)と高い相同性を有する遺伝子を見いだした（図 4 ) 。この CKX遺伝子について、ハバタキとコシヒカリの塩基配列を決定したところ、塩基の違いがみいだされ、ハバタキの CKXは機能を欠失していると思われた（図 5 ) 。

さらに、イネゲノム配列を検索し、イネにおける CKX遺伝子を解析したところ、イネゲノム中に 11ケの CKX遺伝子が存在する事が判明した。シロイヌナズナにおける CKX遺伝子と共に、これらについて遺伝的系統樹を作成した結果、シロイヌナズナの AtCKX2， 3及び 4と 5つのイネ CKX遺伝子 (Chr.1 25cM P695A4に座乗する CKX, Chr.127 P419B01に座乗する CKX (本遺伝子）、 Chr.6 79cM OsJ0006A22-GSに座乗する CKX遺伝子、 Chr.2 32cMに座乗する 2つの CKX遺伝子）が非常に近縁である事が判明した（図 6 ) 。これらの遺伝子の相同性を調べたところアミノ酸レベルで高い相同性を有する事が判明した（図 7〜9 ) 。また、イネにおけるすべての CKX遺伝子について座乗位置を確認したところ、いくつかの YQ領域に座乗することが明らかになった（図 1 0 ) 。

即ち、本発明者らは、植物の着粒数の増減に関与する新たな遺伝子を単離することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。

本発明は、植物の着粒数（穎花 ·果実 ·種子を含む）の増減を調節する遺伝子の単離 ·同定、並びに該遺伝子を利用した植物の着粒数（穎花 ·果実 ·種子を含む）を増加させる育種方法に関し、以下の〔1〕〜〔1 9〕を提供するものである。

〔1〕その機能の欠失により植物の着粒数を増加させる植物由来のタンパク質をコードする、下記（a ) から（d ) のいずれかに記載の DNA。 ( a ) 配列番号： 3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA。 ( b) 配列番号： 1もしくは 2に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。

( c ) 配列番号： 3に記載のアミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および Zまたは揷入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNAo ( d ) 配列番号： 1もしくは 2に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DNA。

〔2〕イネ由来である、〔1〕に記載の DNA。

〔3〕〔1〕または〔2〕に記載の DNAの転写産物と相補的な RNAをコードする DNA。〔4〕〔1〕または〔2〕に記載の DNAの転写産物を特異的に開裂するリポザィム活性を有する RNAをコ一ドする DNA。

〔5〕植物細胞における発現時に、共抑制効果により、〔1〕または〔2〕に記載の DNAの発現を抑制させる RNAをコードする DNA。

〔6〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の DNAを含むベクタ一。〔7〕〔6〕に記載のベクターが導入された宿主細胞。

〔8〕〔6〕に記載のベクタ一が導入された植物細胞。

〔9〕〔8〕に記載の植物細胞を含む形質転換植物体。

〔1 0〕〔9〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクロ一ンである、形質転換植物体。〔1 1〕〔9〕または〔1 0〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。

〔1 2〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の DNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、形質転換植物体の製造方法。

〔1 3〕〔1〕または〔2〕に記載の DNAによりコードされるタンパク質。

〔1 4〕〔7〕に記載の宿主細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、〔1 3〕に記載のタンパク質の製造方法。〔1 5〕〔1 3〕に記載のタンパク質に結合する抗体。

〔1 6〕配列番号： 1もしくは 2に記載の塩基配列またはその相補配列に相補的な少なくとも 15の連続する塩基を含むポリヌクレオチド。

〔1 7〕〔3〕から〔5〕のいずれかに記載の DNAを植物体の細胞内で発現させる工程を含む、植物の着粒数を増加させる方法。〔1 8〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の DNA、もしくは〔6〕に記載のベクタ一を有効成分とする、植物の着粒数を改変する薬剤。

〔1 9〕植物の着粒数を判定する検査方法であって、

( a ) 被検植物体またはその繁殖媒体から DNA試料を調製する工程、

( b) 該 DNA試料から〔1〕に記載の DNA領域を増幅する工程、

( c ) 増幅された DNA領域の塩基配列を決定する工程、

を含み、該塩基配列がその機能の欠失により植物の着粒数を増加させるタンパク質をコードしている場合に、着粒数が少ない品種であると判断し、該タンパク質をコ一ドしていない場合に、着粒数が多い品種であると判断する方法。

本発明は、イネ由来の C KXタンパク質をコードする DNAを提供する。「コシヒカリ」のゲノム DNAの塩基配列を配列番号： 1に、「コシヒカリ」の cDNAの塩基配列を配列番号： 2に、該 DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 3に示す。また、「ハバタキ」のゲノム DNAの塩基配列を配列番号： 4 に、「ハバタキ」の cDNAの塩基配列を配列番号： 5に、該 DNAがコードする夕ンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 6に示す。本発明により単離された C KX遺伝子は「ハパタキ」と「コシヒカリ」の交雑後代を利用して検出された量的形質遺伝子座 (QTL) の一つであり、第 1染色体上に座乗することが明らかとなった。また、この C KX遺伝子について、ハバ夕キとコシヒカリの塩基配列を決定したところ、塩基の違いが見出され、コシヒ力リ等の他の品種に比べ着粒数が多いハパタキの C KXタンパク質は機能を欠失していることがわかった。植物ホルモンの 1つサイトカイニン（力イネチンと同様な生理活性を有する化合物群で、アデニンの 6位に置換基を持つものの総称）は、細胞分裂促進、花芽形成、側芽形成、老化抑制、気孔の開閉、根の伸長促進等に関与している。特に花芽形成、側芽形成の促進は本形質（穎花数の増加）と密接に連鎖していると言える。サイトカイニンはメバロン酸を基質として 4つの触媒反応を通して合成されるが、サイトカイニン酸化酵素によってアデニンの 6位が切断され不活性化される（ゼァチンの場合はアデニンとメチルブテナルに分解）。つまり、 CKX (サィトカイニン酸化酵素）遺伝子の機能欠損は、サイトカイニンを分解する事ができず、結果的にサイトカイニンを蓄積することになる。サイトカイニンの蓄積は花芽形成誘導を行うので、着粒数（穎花数）の増加につながると考えられ CKX遺伝子はその機能と表現型に非常に合致する。以上の結果から、 CKX遺伝子の機能欠失は、イネの着粒数（穎花数）を上昇させ、結果収量を増加させることがわかる。これまで、着粒数（穎花数）の増加につながると考えられる遺伝子については、同定および単離には至っていなかった。本発明者らは、複雑なステップを経て遂にその存在領域を解明し、単一の遺伝子として該遺伝子を単離することに初めて成功した。現在、日本のイネの品種改良においては、着粒数の増加は重要な育種目標である。着粒数の増加は、そのまま穀類の収量を増加させる形質に繋がり、それらの形質は農業的に極めて重要な形質であるため、 CKX遺伝子を用いた育種への応用が期待されている。 CKX遺伝子の機能欠失は、植物の着粒数を上昇させることから、アンチセンス法、リポザィム法等を利用して該 DNAの発現制御を行うことにより、結果的に穀物の収量を増加させることが可能である。例えば、 CKX遺伝子が機能している品種、例えば「コシヒカリ」に、アンチセンス方向に CKX遺伝子を導入することにより、着粒数を増加させることができる。また、分子マ一カーを用いて不活性型 C KX遺伝子を導入し、着粒数を増加させることができる。導入方法は形質転換であっても、交配であってもよい。形質転換に要する期間は交配による遺伝子移入に比較して極めて短期間であり、他の形質の変化を伴わないで着粒数を増加が可能となる。本発明において単離した、着粒数の増減に関る CKX遺伝子を利用することにより、イネの着粒数を容易に変化させることができ、着粒数が増加したイネ品種育成に貢献できると考えられる。また、穀類には、ゲノムシンテニー

(遺伝子の相同性）が極めてよく保存されているため、イネ C KX遺伝子のコムギ、ォォムギ、トウモロコシなどの穀物育種への応用が期待できる。さらに、穀類のみならず、 C KX遺伝子は植物に広く分布することから、 C KX遺伝子の機能欠失は全ての植物で花 ·種子（穎花）数を増加させ、収量の増加を導くと考えられる。本発明の C KXタンパク質をコードする D N Aには、ゲノム D NA、 c D NA、および化学合成 D NAが含まれる。ゲノム D NAおよび c D NAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノム D NAは、例えば、該 C KX遺伝子を有するイネ品種（例えば、「コシヒカリ」）からゲノム D NA を抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、 B A C、 P A Cなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明タンパク質をコードする D NA (例えば、配列番号： 1もしくは 2 ) を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダィゼーションあるいはプラークハイブリダィゼーシヨンを行うことにより調製することが可能である。また、本発明タンパク質をコードする D NA (例えば、配列番号： 1もしくは 2 ) に特異的なプライマーを作成し、これを利用した P C Rをおこなうことによって調製することも可能である。また、 c D NAは、例えば、 C KX遺伝子を有するイネ品種 (例えば、「コシヒカリ」）から抽出した mRNAを基に cDNAを合成し、これを λ ΖΑΡ等のベクターに揷入して cDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーシヨンあるいはプラークハイブリダイゼ —シヨンを行うことにより、また、 PCRを行うことにより調製することが可能である。本発明は、配列番号： 3に記載の C KXタンパク質（「コシヒカリ」）と機能的に同等なタンパク質をコードする DNAを包含する。ここで「C KXタンパク質と同等の機能を有する」とは、対象となるタンパク質の機能を欠失させることにより、着粒数を増加させる機能を有することを指す。このような DNAは、好ましくは単子葉植物由来であり、より好ましくはイネ科植物由来であり、最も好ましくはイネ由来である。このような DNAには、例えば、配列番号： 3に記載のアミノ酸配列において 1 若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードする DNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、 site-dii'ected mutagenesis法（Kramer, W. & Fritz，H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154： 350-367) が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型の C KXタンパク質をコ一ドするアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNAであっても、天然型の C KXタンパク質（配列番号： 3 ) と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明の DNAに含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明の DNAに含まれる。配列番号： 3に記載の C KXタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコ一ドする DNAを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503) やポリメラーゼ連鎖反応（PCR) 技術 (Saiki, R. . et al. (1985) Science, 230, 1350-1354、 Saiki, R. K. et al. (1988) Science, 239, 487-491) を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、 C KX遺伝子の塩基配列（配列番号： 2 ) もしくはその一部をプローブとして、また C KX遺伝子（配列番号： 2 ) に特異的にハイブリダィズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ィネゃ他の植物から C KX遺伝子と高い相同性を有する DNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイプリダイズ技術や PCR技術により単離しうる C KXタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする DNAもまた本発明の DNAに含まれる。このような DNAを単離するためには、好ましくはストリンジエンドな条件下でハイブリダィゼーシヨン反応を行う。本発明においてストリンジェン卜な八イブリダィゼーシヨン条件とは、 6M尿素、 0.4%SDS、 0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジエンシーのハイブリダィゼーシヨン条件を指す。よりストリンジエンシーの高い条件、例えば、 6M尿素、 0.4%SDS、 O.lxSSCの条件を用いることにより、より相同性の高い: DNAの単離を期待することができる。これにより単離された DNAは、アミノ酸レベルにおいて、 C KXタンパク質のアミノ酸配列 (配列番号： 3または 6 ) と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも 50%以上、さらに好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 90%以上（例えば、 95%，96%,97%，98%，99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチユールによるアルゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268， 1990、 Proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993) を用いて決定できる。 BLASTのァルゴリズムに基づいた BLASTNや BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている

(Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990) 。 BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータ一は、例えば

とする。また、 BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメ一タ一は、例えば score=50、 wordlength=3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメ一ターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。ある DNAが植物の着粒数の増減に関るタンパク質をコードするか否かは以下のようにして評価することができる。最も一般的な方法としては、該 DNAの機能を欠失させた上で栽培を行い、着粒数を調べる手法である。すなわち該 D N Aの機能を保った条件と該 DNAの機能を欠失させた条件で栽培し、着粒数を比較する方法である。着粒数が変わらないかほとんど同じ場合は、該 D NAは着粒数の増減に関与しないと判断する。該 DN Aが着粒数の増減に関る場合は、着粒数はより増加し、その差を着粒数の増減の程度とみなすことができる。本発明の DNAは、例えば、組み換えタンパク質の調製や着粒数が改変された形質転換植物体の作出などに利用することが可能である。組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードする DNAを適当な発現べクターに揷入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合夕ンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国 New England BioLabs社発売のベクター pMALシリーズ）、グルタチオン- S-トランスフエラ一ゼ (GST)との融合タンパク質として調製する方法（Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクター pGEXシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Novagen社の pETシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法 (Mandel, M. & Higa, A. (1970) Journal of Molecular Biology, 53, 158-162、 Hanahan, D. (1983) Journal of Molecular Biology, 166, 557-580) を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組み換えタンパク質を上記のマルト一ス結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にァフィ二ティー精製を行うことが可能である。また、後述する手法で、本発明の DNAが導入された形質転換植物体を作成し、該植物体から本発明のタンパク質を調製することも可能である。従って、本発明の形質転換植物体には、後述する、着粒数を改変するために本発明の DNAが導入された植物体のみならず、本発明のタンパク質の調製のために本発明の DNAが導入された植物体も含まれる。得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをゥサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺぃを除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞ひ、イブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。これらの抗体を用いることにより、植物体における着粒数の増減に関与する夕ンパク質の発現部位の判別、もしくは植物種が着粒数の増減に関与するタンパク質を発現するか否かの判別を行うことが出来る。例えば、着粒数が少ない「コシヒカリ」のカルボキシル末端側のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体は、着粒数が多い「ハバタキ」等の品種において発現するタンパク質には結合しないため、植物種内において着粒数の増減に関与するタンパク質が発現するかいなかを判別する際に用いることができる。本発明の DNAを利用して着粒数が増加した形質転換植物体を作製する場合には、本発明の夕ンパク質をコ一ドする DNAの発現を抑制するための DNAを適当なベクタ一に掙入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。ベクターを導入する植物細胞としては、本発明の DNAが正常に発現している植物細胞であることが好ましい。「本発明のタンパク質をコードする DNAの発現を抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、 DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。植物における特定の内在性遺伝子の発現の抑制は、例えば、本発明のタンパク質をコ一ドする DNAの転写産物と相補的な RNAをコードする DNAを利用して行なうことができる。

「本発明のタンパク質をコードする DNAの転写産物と相補的な RNAをコードする DNA」の一つの態様は、本発明のタンパク質をコ一ドする DNAの転写産物と相補的なアンチセンス RNAをコードする DNAである。植物細胞におけるアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンス RNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証した (J.REckerand R.W.Davis, (1986) Proc.Natl.Acad.USA.83:5372)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンス: RNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており（A.R.van der Krol et al. (1988) Nature 333:866)、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイプリッド形成による転写抑制、合成の進みつつある RNAとの八イブリツド形成による転写阻害、イントロンとェキソンとの接合点でのハイブリツド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリツド形成によるスプライシング抑制、 mRNAとのハイブリツド形成による核から細胞質への移行抑制、キヤッビング部位やポリ (A)付加部位とのハイブリツド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイプリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリポソ一ム結合部位とのハイプリッド形成による翻訳抑制、 mRNAの翻訳領域ゃポリゾーム結合部位とのハイブリツド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイプリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する (平島および井上「新生化学実験講座 2核酸 IV遺伝子の複製と発現」，日本生化学会編，東京化学同人 ,pp.319-347,1993)。本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む DNAも、本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。使用されるアンチセンス DNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された DNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンス DNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写された RNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンス DNAの長さは、少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上であり、さらに好ましくは 500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンス DNAの長さは 5kbよりも短く、好ましくは 2.5kbよりも短い。内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リポザィムをコードする DNAを利用して行うことも可能である。リポザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことをいう。リポザィムには種々の活性を有するものがあるが、中でも RNAを切断する酵素としてのリポザィムの研究により、 RNAの部位特異的な切断を目的とするリポザィムの設計が可能となった。リポザィムには、グループ Iイントロン型や、

RNasePに含まれる M1RNAのように 400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマ一ヘッド型やヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメィンを有するものもある (小泉誠および大塚栄子， (1990)蛋白質核酸酵素, 35:2191)。例えば、ハンマーヘッド型リポザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15の C15の 3'側を切断するが、活性には U14が 9位の Aと塩基対を形成することが重要とされ、 15位の塩基は Cの他に Aまたは Uでも切断されることが示されている (M.Koizumi et al. (1988) FEBS Lett.228:225)。リポザィムの基質結合部を標的部位近傍の； RNA配列と相補的になるように設計すれば、標的 RNA中の UC！、 UU または UAという配列を認識する制限酵素的な RNA切断リポザィムを作出することが可能である (M.Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 239:285、小泉誠および大塚栄子， (1990)蛋白質核酸酵素, 35:2191、 M.Koizumi et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7059)。例えば、 C KX遺伝子のコード領域（配列番号： 2) 中には標的となりうる部位が複数存在する。また、ヘアピン型リポザィムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リポザィムは、例えばタバコリングスポットウィルスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出される (J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリポザィムも、標的特異的な RNA切断を起こすように設計できることが示されている (Y.Kikuchi and N.Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751、菊池洋，（1992)化学と生物 30:112)。標的を切断できるよう設計されたリポザィムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラヮ一モザイクウイレスの 35Sプロモーターなどのプロモータ一および転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写された RNAの 5'末端や 3'末端に余分な配列が付加されていると、リポザィムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザィムを含む RNAからリボザィム部分だけを正確に切り出すために、リポザィム部分の 5'側や 3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザィ厶を配置させることも可能である (KTaira et al. (1990) Protein Eng. 3:733、 A.M.Dzianottand J.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、 CA.Grosshansand R.T.Cecli (1991)

Nucleic Acids Res. 19:3875、 K.Taira et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:5125)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる (N. Yuy ama et al.

Biochem.Biopliys.Res.Commun.l86:1271,1992)。このようなリボザィムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。

「本発明のタンパク質をコードする DNAの転写産物と相補的な RNAをコードする DNA」の他の一つの態様は、本発明のタンパク質をコードする DNAの転写産物と相補的な dsRNAをコードする DNAである。 RNAiは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖 RNA (以下 dsRNA) を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約 40〜数百塩基対の dsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサ一 (Dicer)と呼ばれる RNaselll様のヌクレアーゼが ATP存在下で、 dsRNAを 3'末端から約 21〜23塩基対ずつ切り出し、 siRNA (short interference RNA) を生じる。この siRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレア一ゼ複合体（RISC： RNA-induced silencing complex) が形成される。この複合体は siRNAと同じ配列を認識して結合し、 RNaselll様の酵素活性によつて siRNAの中央部で標的遺伝子の mRNAを切断する。また、この経路とは別に siRNAのアンチセンス鎖が mRNAに結合して R A依存性; RNAポリメラーゼ (RsRP)のプライマーとして作用し、 dsHNAが合成される。この dsRNAが再びダイサ一の基質となって、新たな siRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。上記 RNAiは、当初、線虫において発見されたが（Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, (1998)) 、現在では、線虫のみならず、植物、線 8 - 形動物、ショウジヨウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている

(Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)、 Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)、

Hammond, S. M.， Gaudy, A. A. & Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110.1119 (2001)、 Zamore, P. D. RNA interference- listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)) 。これら生物では、実際に外来より dsRNAを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらにはノックァゥト個体を創生する方法としも利用されつつある。 RNAiの登場当初は dsRNAはある程度の長さ (40塩基)以上でなければ効果がないと考えられていたが、米口ックフェラ一大の TuscMらは 21塩基対前後の単鎖 dsRNA(siRNA)を細胞に導入すれば、哺乳動物細胞においても PKRによる抗ウイルス反応を起こさず、 RNAiの効果があることを報告し（Tuschl, Nature, 411， 494-498(2001)) 、 RNAiは分ィ匕したヒトなどの哺乳動物細胞に応用可能な技術として俄然注目を集めることになつた。本発明の DNAは、標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域に対するァンチセンス RNAをコードしたアンチセンスコード DNAと、前記標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域のセンス RNAをコ一ドしたセンスコ一ド DNAを含み、前記ァンチセンスコード DNAおよび前記センスコ一ド DNAより前記アンチセンス RNAおよび前記センス; RNAを発現させることができる。また、これらのアンチセンス RNAおよびセンス RNAより dsRNAを作成することもできる。本発明の dsRNAの発現システムを、ベクタ一等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる場合と、異なるベクタ一からそれぞれァンチセンス RNA、センス RNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクタ一からアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる構 9 一

成としては、アンチセンスコード DNAおよびセンスコード DNAの上流にそれぞれ polIII系のような短い RNAを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンス RNA発現カセット、センス RNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコード DNAとセンスコ一ド DNAと逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンス RNAコード鎖とセンス RNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖 DNA (siRNAコ一ド DNA) が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンス RNA、センス RNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センス RNA、アンチセンス RNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンス RNAコ一ド鎖、センス; NAコ —ド鎖）の 3 '末端にターミネータ一をそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、（アデニン）塩基を 4つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモ一ターの種類を異ならせることが好ましい。また、異なるベクタ一からアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコード DNAおよびセンスコード DNAの上流にそれぞれ polIII系のような短い RNAを発現し得るプロモ一夕を連結させたアンチセンス RNA発現カセット、センス RNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。本発明の; RNAiにおいては、 dsRNAとして siRNAが使用されたものであってもよい。「siRNA」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖 RNAを意味し、 Tuschlら（前掲）により報告された全長 21〜23塩基対に限定されるものではなく、毒性を示さない範囲の長さであれば特に限定はなく、例えば、 15〜49 塩基対と、好適には 15〜35塩基対と、さらに好適には 21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現される siRNAが転写され最終的な二重鎖 RNA部分の長さが、例えば、 15〜49塩基対、好適には 15〜35塩基対、さらに好適には 21〜30塩基対とすることができる。本発明の DNAとしては、標的配列のィンパーテツドリピートの間に適当な配列 (イントロン配列が望ましい）を揷入し、ヘアピン構造を持つダブルストランド RNA(self-complementary ' hairpin， RNA(hpRNA))を作るようなコンストラクト（Smith, N.A. et al. Nature, 407:319， 2000、 Wesley, S.V. et al. Plant J. 27:581, 2001、 Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29:E55， 2001) を用いることもできる。 RNAiに用いる DNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。 dsRNAにおける RNA同士が対合した二重鎖 RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、 dsRNAにおける RNA同士が対合する二重鎖 RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する DNAの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される (Cm'r.Biol.7:R793,1997, Curr.Biol.6:810,1996)₀ 例えば、 C KX遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、 C KX遺伝子若しくはこれと類似した配列を有する DNAを発現できるように作製したべクタ一 DNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から C K X 変異体の形質を有する植物、即ち感光性が低下した植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上（例えば、

95 ,96%,97%,98%,99°/o¾±) の配列の同一性を有する。さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによつても達成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。また、本発明は、上記本発明の DNAや本発明の DNAの発現を抑制する DNAが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、組み換えタンパク質の生産に用いる上記したベクタ一の他、形質転換植物体作製のために植物細胞内で本発明の DNAあるいは本発明の DNAの発現を抑制する DNAを発現させるためのベクタ一も含まれる。このようなベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデ二レーション部位を含むターミネ一ター配列を含んでいれば特に制限されず、例えば、プラスミド「pBI121J、「pBI221」、「pBI101」（いずれも Clontech社製）などが挙げられる。植物細胞の形質転換に用いられるベクタ一としては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザィクウィルスの 35Sプロモーター）を有するべク夕一や外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。本発明のベクターは、本発明のタンパク質を恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウィルスの 35Sプロモ一ター（Odell et al. 1985 Nature 313:810) 、イネのァクチンプロモーター（Zhang et al.1991 Plant Cell 3:1155) 、トウモロコシのュビキチンプロモーター（Cornejo et al. 1993 Plant MoLBiol. 23:567) などが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌'細菌 ·ウィルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモータ一などが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌*細菌 ·ウィルスの感染ゃ侵入によって発現するイネキチナ一ゼ遺伝子のプロモ一夕一（Xu et al. 1996 Plant Mol. Biol. 30： 387) やタバコの PRタンパク質遺伝子のプロモー夕一 (Ohshima et al. 1990 Plant Cell 2：95) 、低温によって誘導されるイネの

「lipl9」遺伝子のプロモータ一（Aguan et al. 1993 MoLGenGenet. 240:1) 、高温によって誘導されるイネの「hsp80」遺伝子と「hsp72」遺伝子のプロモー夕一 (Van Breusegem et al. 1994 Planta 193:57) 、乾燥によつて誘導されるシロイヌナズナの「rabl6」遺伝子のプロモーター（Nundy et al. 1990

Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87-Ί406) 、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモータ一（Schulze-Lefert et al. 1989 EMBO J. 8:651) 、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコ一ルデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Walker et al. 1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6624) などが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモータ一とタバコの PRタンパク質遺伝子のプロモ一夕一はサリチル酸などの特定の化合物によって、「i'abl6」は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。また、本発明は、本発明のベクターが導入された形質転換細胞を提供する。本発明のベクターが導入される細胞には、組み換えタンパク質の生産に用いる上記した細胞の他に、形質転換植物体作製のための植物細胞が含まれる。植物細胞としては特に制限はなく、例えば、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、ジャガィモ、タバコなどの細胞が挙げられる。本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクト口ポーレーシヨン）、ァグロパクテリゥムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki et al. (1995) Plant Physiol. 100:1503-1507参照）。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリェチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74) 、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507) 、パ一ティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.) およびァグロパクテリゥムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei et al. (1994) Plant J. 6： 271-282.) など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。形質転換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えば、イネであれば Fujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)) の方法が挙げられ、トウモロコシであれば Shillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)) の方法や

Gorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)) が挙げられ、ジャガイモであれば Visserら（Theor.Appl.Genet 78:594 (1989)) の方法が挙げられ、タバコであれば Nagataと Takebe (Planta 99:12(1971)) の方法が挙げられ、シロイヌナズナであれば Akamaら（Plant Cell Reportsl2:7_ll (1992)) の方法が挙げられ、ユー力リであれば土肥ら（特開平 8-89113号公報）の方法が挙げられる。一旦、ゲノム内に本発明の DNAあるいは本発明の DNAの発現を抑制する DNA が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロ卜プラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明の DNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が、含まれる。このようにして作出された着粒数が改変された植物体は、野生型植物体と比較して、その着粒数および収量が変化している。例えば、アンチセンス DNAなどの導入により C KXタンパク質をコードする DNAの発現が抑制された植物体は、その着粒数の増加により、収量の増加が期待される。本発明の手法を用いれば、有用農作物であるイネにおいては、その着粒数を増加することができ、収量が増加したイネ品種の育成の上で非常に有益である。また、本発明は、配列番号： 1もしくは 2に記載の塩基配列またはその相補配列に相補的な少なくとも 15の連続する塩基を含むポリヌクレオチドを提供する。ここで「相補配列」とは、 A:T、 G:Cの塩基対からなる 2本鎖 DNAの一方の鎖の配列に対する他方の鎖の配列を指す。また、「相捕的」とは、少なくとも 15個の連続したヌクレオチド頜域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも 70% 、好ましくは少なくとも 80% 、より好ましくは 90% 、さらに好ましくは 95%以上の塩基配列の同一性を有すればよい。このような DNAは、本発明の DNAの検出や単離を行なうためのプロ一ブとして、また、増幅を行なうためのプライマーとして有用である。さらに、本発明は、植物の着粒数の増減を判定する遺伝子診断方法を提供する。植物の着粒数は植物の収穫量に密接に係わり、植物の着粒数を判定することは収穫量の増大を目的としたイネ品種育成において非常に重要なことである。本発明において「植物の着粒数の増減を判定」とは、これまでに栽培されていた品種における着粒数の増減の判定のみならず、交配や遺伝子組換え技術による新しい品種における着粒数の増減の判定も含まれる。本発明の植物の着粒数の増減を評価する方法は、植物が C KXタンパク質をコードする DNAの機能を欠失しているか否かを検出することを特徴とする。植物が C KXタンパク質をコードする DNAの機能を欠失しているか否かは、ゲノム DNAの C K X遺伝子に相当する塩基配列の違いを検出することにより評価することが可能である。本発明の DNAに相当する被検植物体の DNA領域の塩基配列を直接決定し、該塩基配列がその機能の欠失により植物の着粒数を増加させるタンパク質をコードしている場合には、着粒数が少ない品種であると判定し、該タンパク質をコードしていない場合には、着粒数が多い品種であると判定する。例えば、イネの C K Xタンパク質の機能を欠失させる変異が被検植物の DNAの塩基配列に見出されれば、この被検植物は着粒数が多い品種であると診断される。本発明の方法による植物の着粒数の増減の評価は、例えば、植物の交配による品種改良を行なう場合において利点を有する。例えば、着粒数を増加させる形質の導入を望まない場合に、着粒数を増加させる性質を有する品種との交配を避けることができ、逆に、着粒数を増加させる形質の導入を望む場合に、着粒数を増加させる性質を有する品種との交配を行うことができる。また交雑後代個体から望ましい個体を選抜する際にも有効である。植物の着粒数の増減を、その表現型により判断することに比して、遺伝子レベルで判断することは簡便で確実であるため、本発明の着粒数の増減の評価方法は、植物の品種改良において大きく貢献し得る。図面の簡単な説明

図 1は、コシヒカリおよびハバタキの表現型を示す写真である。左側がコシヒカリ、右側がハバタキを示す。

図 2は、 Yielding QTL(YQ)の染色体における位置を示す図である。

図 3は、 Yielding QTL(YQ)の小規模連鎖 MAPを示す図である。

図 4は、 Yielding QTL(YQ)の高精度連鎖 MAPを示す図である。

図 5は、コシヒカリとハパタキの Yielding QTL(YQ)の高精度連鎖 MAPの比較を示す図である。

図 6は、シロイヌナズナとイネの C KX遺伝子の系統樹を示す図である。

図 7は、各 C KX遺伝子の配列を比較した図である。

図 8は、図 7の続きを示す図である。

図 9は、図 8の続きを示す図である。

図 1 0は、イネにおけるすべての C KX遺伝子の座乗位置を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。〔実施例 1〕試験材料の選定および準同質遺伝子系統の作製

QTL解析を行う雑種集団の育成に先駆け、雑種集団の親となる品種の選定を試みた。まず、日本型イネ-数品種、インド型イネ-数品種の平均着粒数を調査し、両品種間で着粒数に明瞭な差が見られた日本型イネの「コシヒカリ」とインド型イネ「八バタキ」 2つの品種を選抜した（図 1 ) 。日本型品種「コシヒカリ」にインド型品種「ハバタキ」を交雑した F1個体に、コシヒカリを反復親とした戻し交雑と自殖を行い、 74系統の BC2F1, BC2F2および BC3F2の集団を育成後、名古屋大学付属農場に展開した。

BC2F2 74個体を用いて、着粒数に関する QTL解析を行った結果、着粒数を増加させる複数の QTLを検出した (図 2)。特に第 1染色体短腕約 28cM近傍にハバタキの locusがコシヒ力リに対して着粒数を増加させる効果の大きい

QTL(YQ1; Yielding QTL 1)を見いだすことに成功した（図 2 ) 。 YQ1の存在を検証するために、返し戻し交雑と MASを用いて、 YQ1準同質遺伝子系統（Nil- YQ1:コシヒ力リの染色体に八バタキの第 1染色体約 28cM近傍が置換した系統）を作製した。 Nil-YQl及びコシヒカリ（コントロール）の最大着粒数を調査し、 QTL(YQ1)の存在を確認した。第 1染色体短腕、約 28cM近傍がハバタキに置換した系統は平均で 50粒着粒数を増加させた。

〔実施例 2〕 QTL解析

74個体の BC2F1からそれぞれ CTAB法を用いて DNAを抽出すると共全染色体を網羅的に包含する 93個の分子マ一力一を用いて各個体の遺伝子型を決定した。その自殖後代 BC2F2を 1系統に各 10個体展開し、その中から、ランダムに 1系統に 1値体を選定し、選定した個体についてそれぞれ 6穂をサンプリング後、各穂の着粒数を調査した。各系統 6穂の内、最も着粒数の多かった穂を選出し、最大着粒数とした。 Qgene ソフトを用いて QTL解析を行った。

〔実施例 3〕 YQの分離集団を用いた高精度連鎖解析

BC3F2集団を用いて、分子マ一力一による遺伝子型と表現型（F2及び F3) を調査し、再度連鎖解析を行った。その結果分子マーカ一（6Aと 8A) に挟まれる領域に YQ1が座乗することが明らかになった（図 3 ) 。 YQ1座乗領域を詳細に特定するために、 YQの分離集団（12500個体）を用いて高精度連鎖解析を行つた結果、 YQ1は分子マーカー（4A9と 20) に挟まれる約 8Kbを特定する事ができた（図 4) 。この領域において遺伝子予測を行ったところ、 1個の遺伝子が予測され、相同性検索の結果、 CKX (サイトカイニン酸化酵素)と高い相同性を有する遺伝子を見いだした（図 4 ) 。この CKX遺伝子について、ハバタキとコシヒカリの塩基配列を決定したところ、塩基の違いがみいだされ、ハバタキの CKX は機能を欠失していると思われた（図 5 ) 。

〔実施例 4〕イネゲノムにおける CK 遺伝子の解析またイネゲノム配列を検索し、イネにおける CKX遺伝子を解析したところ、ィネゲノム中に 11ケの CKX遺伝子が存在する事が判明した。シロイヌナズナにおける CKX遺伝子と共に、これらについて遺伝的系統樹を作成した結果、シロイヌナズナの AtCKX2，3及び 4と 5つのイネ CK 遺伝子（Chr.l 25cM P695A4に座乗する CKX， Chr.l27 P419B01に座乗する CKX (本遺伝子）、 Chr.6 79cM

OsJ0006A22-GSに座乗する CKX遺伝子、 Chr.2 32cMに座乗する 2つの CKX遺伝子）が非常に近縁である事が判明した（図 6 ) 。これらの遺伝子の相同性を調べたところアミノ酸レベルで高い相同性を有する事が判明した（図 7〜9 ) 。また、イネにおけるすべての CKX遺伝子について座乗位置を確認したところ、いくつかの YQ領域に座乗することが明らかになった（図 1 0 ) 。

産業上の利用の可能性

本発明により提供された CKX遺伝子の機能欠失は、植物の着粒数を上昇させることから、アンチセンス法、リボザィム法等を利用して該 DNAの発現制御を行うことにより、結果的に穀物の収量を増加させることが可能である。穀類には、ゲノムシンテニー（遺伝子の相同性）が極めてよく保存されているため、イネ C KX遺伝子のコムギ、ォォムギ、トウモロコシなどの穀物育種への応用が期待できる。さらに、穀類のみならず、 C KX遺伝子は植物に広く分布することから、 C KX遺伝子の機能欠失は全ての植物で花 '種子（顔花）数を増加させ、収量の増加を導くと考えられる。

さらに、本発明は、植物の着粒数の増減を判定する遺伝子診断方法を提供する。植物の着粒数の増減を、その表現型により判断することに比して、遺伝子レベルで判断することは簡便で確実であるため、本発明の着粒数の増減の評価方法は、植物の品種改良において大きく貢献し得る。

Claims

請求の範囲

1. その機能の欠失により植物の着粒数を増加させる植物由来のタンパク質をコードする、下記（a) から（d) のいずれかに記載の DNA。

(a) 配列番号： 3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA。 (b) 配列番号： 1もしくは 2に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。

(c) 配列番号： 3に記載のアミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA。

(d) 配列番号： 1もしくは 2に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA。

2. イネ由来である、請求項 1に記載の DNA。

3. 請求項 1または 2に記載の DNAの転写産物と相補的な RNAをコ一ドする

4. 請求項 1または 2に記載の DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNAをコードする DNA。

5. 植物細胞における発現時に、共抑制効果により、請求項 1または 2に記載の DNAの発現を抑制させる RNAをコードする DNA。

6. 請求項 1力、ら 5のいずれかに記載の DNAを含むベクター。

7. 請求項 6に記載のベクターが導入された宿主細胞。

8. 請求項 6に記載のベクターが導入された植物細胞。

9. 請求項 8に記載の植物細胞を含む形質転換植物体。

1 0 . 請求項 9に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。

1 1 . 請求項 9または 1 0に記載の形質転換植物体の繁殖材料。

1 2 . 請求項 1から 5のいずれかに記載の DNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、形質転換植物体の製造方法。

1 3 . 請求項 1または 2に記載の DNAによりコードされるタンパク質。

1 . 請求項 7に記載の宿主細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、請求項 1 3に記載のタンパク質の製造方法。 1 5 . 請求項 1 3に記載のタンパク質に結合する抗体。

1 6 . 配列番号： 1もしくは 2に記載の塩基配列またはその相補配列に相補的な少なくとも 15の連続する塩基を含むポリヌクレオチド。

1 7 . 請求項 3から 5のいずれかに記載の DNAを植物体の細胞内で発現させる工程を含む、植物の着粒数を増加させる方法。 1 8 . 請求項 1力 ^ら 5のいずれかに記載の DNA、もしくは請求項 6に記載のベクタ一を有効成分とする、植物の着粒数を改変する薬剤。

1 9 . 植物の着粒数を判定する検査方法であって、

( b) 該 DNA試料から請求項 1に記載の DNA領域を増幅する工程、

( c ) 増幅された DNA領域の塩基配列を決定する工程、

を含み、該塩基配列がその機能の欠失により植物の着粒数を増加させるタンパク質をコードしている場合に、着粒数が少ない品種であると判断し、該タンパク質をコードしていない場合に、着粒数が多い品種であると判断する方法。