PL222498B1 - Kaseta DNA, wektor binarny, szczep A. tumefaciens oraz sposób otrzymywania rośliny zbożowej o zwiększonej produktywności - Google Patents
Kaseta DNA, wektor binarny, szczep A. tumefaciens oraz sposób otrzymywania rośliny zbożowej o zwiększonej produktywnościInfo
- Publication number
- PL222498B1 PL222498B1 PL388118A PL38811809A PL222498B1 PL 222498 B1 PL222498 B1 PL 222498B1 PL 388118 A PL388118 A PL 388118A PL 38811809 A PL38811809 A PL 38811809A PL 222498 B1 PL222498 B1 PL 222498B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- vector
- gene
- ckx
- expression
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 222498 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 388118 (22) Data zgłoszenia: 27.05.2009 (51) Int.Cl.
C12N 15/82 (2006.01) C12N 15/29 (2006.01) C12N 9/06 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01)
Kaseta DNA, wektor binarny, szczep A. tumefaciens oraz sposób otrzymywania rośliny zbożowej o zwiększonej produktywności (73) Uprawniony z patentu:
INSTYTUT HODOWLI I AKLIMATYZACJI ROŚLIN-PAŃSTWOWY INSTYTUT BADAWCZY, Błonie, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:
06.12.2010 BUP 25/10 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.08.2016 WUP 08/16 (72) Twórca(y) wynalazku:
ANNA NADOLSKA-ORCZYK, Radzików, PL PETR GALUSZKA, Olomouc, CZ WOJCIECH ZALEWSKI, Białystok, PL WACŁAW ORCZYK, Radzików, PL (74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Rafał Witek
PL 222 498 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kaseta DNA, wektor binarny, szczep A. tumefaciens oraz sposób otrzymywania rośliny zbożowej o zwiększonej produktywności.
W rozwiązaniu ujawnionym w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO2005EP06670 (Schmulling T., Werner T.) autorzy uzyskali zwiększenie produktywności nasion roślin poprzez ekspresję oksydazy cytokininy w warstwie aleuronowej i/lub zarodku nasiona oraz przedstawili wektory ekspresyjne, zawierające kwasy nukleinowe kodujące oksydazę cytokininy Arabidopsis thaliana, znajdujące się pod kontrolą tkankowo-specyficznego promotora warunkującego ekspresję w warstwie aleuronowej i/lub zarodku nasiona. W rozwiązaniach opisanych w publikacjach zgłoszeń patentowych WO 03/050287 i US 2005/0044594 ci sami autorzy przedstawiają metodę do stymulacji wzrostu i/lub zwiększenia formowania bocznych lub przybyszowych korzeni poprzez ekspresję oksydazy cytokininy lub innego białka redukującego poziom aktywnych cytokinin w roślinach lub ich częściach. Ponadto dostarczają metody do powiększenia rozmiarów nasiona i/lub wagi, rozmiarów zarodka i/lub wagi poprzez ekspresję oksydazy cytokininy lub innego białka redukującego poziom aktywnych cytokinin w roślinach lub ich częściach.
Celem wynalazku jest zaproponowanie sposobu i narzędzi do jego realizacji, które pozwalałyby uzyskać zwiększenie produktywności roślin zbożowych poprzez zwiększenie liczby i masy nasion i/lub zwiększenie masy korzenia.
Nieoczekiwanie, określony powyżej cel udało się uzyskać dzięki rozwiązaniu według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest kaseta DNA do zwiększania produktywności roślin zbożowych i/lub masy korzenia składająca się z następujących elementów: promotora ekspresji, fragmentu DNA pochodzącego z części kodującej lub niekodującej genu zbożowej oksydazy cytokininy CKX w orientacji sens, intronu, fragmentu DNA pochodzącego z części kodującej lub niekodującej genu zbożowej oksydazy cytokininy CKX w orientacji antysens oraz terminatora transkrypcji 3', przy czym roślina zbożowa została wybrana z grupy obejmującej: pszenicę, jęczmień, żyto, owies lub kukurydzę, przy czym gen zbożowej oksydazy cytokininy jest wybrany spośród genów ulegających ekspresji w rozwijającym się kłosie i/lub korzeniu, korzystnie z grupy obejmującej geny: HvCKX lub TaCKX, przy czym ekspresja rzeczonej kasety prowadzi do powstania hpRNA, a następnie siRNA ukierunkowanego na wyciszenie ekspresji co najmniej jednego spośród genów CKX.
Jako „promotor ekspresji” zgodnie z wynalazkiem może byt wykorzystywany dowolny aktywny w komórkach zbożowych promotor. W szczególności może to być promotor konstytutywny lub indukowany, albo promotor tkankowo lub rozwojowo specyficzny.
Zgodnie z wynalazkiem jako „fragment genu zbożowej oksydazy cytokininy CKX’ może być stosowana sekwencja co najmniej 21 nukleotydów będąca fragmentem sekwencji kodującej i/lub niekodującej wybranego genu cytokininy CKX, której ekspresja występuje w rozwijających się kłosach i/lub korzeniach. W szczególności dotyczy to przykładowego genu HvCKX1, którego ekspresja występuje w młodych korzeniach, kwiatostanach i rozwijających się kłosach/ziarnach (Fig. 8) i TaCKX1, którego ekspresję stwierdzono w ziarnach oraz poddanych stresowi suszy siewkach (Galuszka i in. 2004). Ponadto dotyczy to genów XvCKX6 o ekspresji umiejscowionej w wierzchołku wzrostu siewek, TaCKX6a i TaCKX6b, których ekspresja występuje w rozwijających się nasionach, TaCKX2, TaCKX3 o ekspresji w ziarnach i siewkach, TaCKX7b i TaCKX8 wykazujących ekspresję w kłoskach na wczesnym etapie kwitnienia oraz TaCKX7a o ekspresji w młodych korzeniach (Galuszka i in. 2004). Dotyczy to również homologów i homeologów genów z rodziny CKX u kukurydzy, Zea Mays L., czyli ZmCKX, żyta, Secale Cereal L., czyli ScCKX oraz u owsa, Avena sativa L., czyli AsCKX, których ekspresja występuje w rozwijających się kłosach i/lub korzeniach.
W szczególności sygnałem wyciszającym może być również 3'UTR wyżej wymienionych genów CKX. Korzystnie kaseta według wynalazku zawiera fragment genu oksydazy cytokoniny CKX posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja 1 albo sekwencja 3 albo sekwencja 4 albo sekwencja 5 lub jej fragment w orientacji sens i antysens. Ponadto mogą to być sekwencje kod ujące lub fragmenty genów zbożowych CKX dostępne w bazach NCBI pod numerami CA031729, CA705202, BQ903062, BQ235927, BQ238832, CA603337, BJ316444, BJ322935.
Korzystnie kaseta wyciszająca według wynalazku posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja 6 lub sekwencja 8. Może to być również kaseta wyciszająca zawierająca fragment innego, zbożowego genu CKX, którego ekspresja występuje w rozwijających się kłosach i/lub korzeniach, w orientacji sens i antysens jak przedstawiono na fig. 1.
PL 222 498 B1
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor binarny zawierający kasetę DNA określoną powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczep A. tumefaciens zawierający wektor określony powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania rośliny zbożowej o zwiększonej produktywności charakteryzujący się tym, że:
a) otrzymuje się kasetę DNA obniżającą ekspresję genów CKX według wynalazku określoną powyżej, przy czym umieszcza się ją pod kontrolą promotora aktywnego w mod yfikowanej komórce,
b) wprowadza się otrzymaną kasetę DNA do genomu komórki rośliny zbożowej,
c) z otrzymanej komórki uzyskuje się roślinę zbożową o zwiększonej produktywności (zwiększonej liczbie i/lub zwiększonej masie nasion),
d) z otrzymanej komórki uzyskuje się roślinę zbożową o zwiększonej masie korzenia, przy czym roślina zbożowa została wybrana z grupy obejmującej: pszenicę, jęczmień, żyto, owies lub kukurydzę.
Korzystnie w etapie b) transformację komórki rośliny zbożowej prowadzi się za pomocą szczepu A. tumefaciens zawierającego wektor binarny według wynalazku jak określono powyżej.
Nieoczekiwanie okazało się, że istotne zwiększenie produktywności oraz masy korzenia roślin zbożowych wyniknęło z obniżenia ekspresji genu XvCKX1 i obniżenia aktywności enzymu CKX w tych roślinach, które mogą być uzyskane dzięki wprowadzeniu do ich genomu kasety ekspresyjnej kodującej hpRNAi, służącego do wyciszania genu kodującego enzym CKX zbóż.
Wbrew sugestiom wynikającym z cytowanego na wstępie stanu techniki, zgodnie z niniejszym wynalazkiem zwiększenie produktywności roślin zbóż oraz masy korzenia uzyskano nieoczekiwanie poprzez zupełnie przeciwstawny zabieg tj. wyciszanie ekspresji określonych genów z rodziny CKX u jęczmienia i pszenicy. Zwiększenie produktywności (masy oraz liczby ziarniaków = nasion) jest pozytywnie skorelowane z masą korzeni. Efekt taki uzyskano dzięki użyciu promotora konstytutywnego warunkującego ekspresję kasety wyciszającej w całej roślinie. Ekspresja ujawnionej kasety/kaset spowodowała wyciszenie ekspresji określonego genu/genów CKX zbóż i przez to redukcję enzymu oksydazy cytokininy prowadzący do zwiększenia (a nie redukcji) poziomu aktywnych cytokinin w rośl inach zbóż lub ich częściach.
Opis figur.
Niniejszy opis został uzupełniony o dołączone figury.
Fig. 1. Schemat kasety wyciszającej zawierającej fragmenty wybranego, zbożowego genu CKX w orientacji sens i antysens.
Fig. 2A. Klonowanie wektora pMCG161 - HvCKX1. Miejsca restrykcyjne Apal w klonowanym wektorze pMCG161 zawierającym pierwszy insert fragmentu genu HvCKX1.
Fig. 2B. Klonowanie wektora pMCG161 - HvCKX1. Analiza restrykcyjna wektora pMCG161 zawierającego drugi insert fragmentu genu HvCKX1 enzymem Apal.
Fig. 3A. Klonowanie wektora pMCG161 - HvCKX2-1. Analiza restrykcyjna wektora pMCG161 zawierającego pierwszy insert fragmentu genu HvCKX2 enzymem Ehel.
Fig. 3B. Mapa wektora pMCG161 - HvCKX2. Analiza restrykcyjna wektora pMCG161 zawierającego obydwa inserty fragmentu genu HvCKX2 enzymem Ehel.
Fig. 4A. Klonowanie wektora pMCG161 - TaCKX1. Analiza restrykcyjna wektora pMCG161 zawierającego pierwszy insert fragmentu genu TaCKX1 enzymem Sacl.
Fig. 4B. Klonowanie wektora pMCG161 - TaCKX1. Analiza restrykcyjna wektora pMCG161 zawierającego obydwa inserty fragmentu genu TaCKX1 enzymem Sacl.
Fig. 5. Struktura wektora pMCG/HvCKX1.
Fig. 6. Struktura wektora pMCG/HvCKX2.
Fig. 7. Struktura wektora pMCG/TaCKX1.
Fig. 8. Względna aktywność enzymu oksydazy/dehydrogenazy cytokininowej (CKX) w korzeniach siewek T1.
Fig. 9A, B, C. Wynik półilościowej analizy ekspresji genu HvCKX1 w różnych tkankach odmiany Scarlett (A) i Golden Promise (B) oraz HvCKX2 u Golden Promise (C). Część górna żelu przedstawia amplifikację cDNA genu referencyjnego aktyny (qAct) a część dolna genu HvCKX (qCKX1, qCKX2). Kolejne ścieżki obrazują amplifikacyjną cDNA z: 1) dwudniowych siewek ok. 1 cm długości, 2) korzen i z cztero-, pięciodniowych siewek, 3) merystemu z cztero-, pięciodniowej siewki, 4) liścia z cztero-,
PL 222 498 B1 pięciodniowej siewki, 5) rozwijającego się liścia 2-3 tygodniowej rośliny, 6) rozwiniętego liścia 2-3 tygodniowej rośliny, 7) łodygi (wraz z kolankiem) z 6 tygodniowej rośliny, 8) kwiatostanu w początkowym stadium rozwoju (3-4 cm długości) z 6 tygodniowej rośliny, 9) kwiatostanu starszego o długości 6-8 cm z rośliny 7 tygodniowej, 10) kłosa w trakcie pylenia, 11) kłosa tydzień po zapyleniu, 12) kłosa 2 tygodnie po zapyleniu.
P r z y k ł a d 1. Uzyskiwanie wektorów typu hpRNAi służących do wyciszania genów: HvCKX1, HvCKX2 i TaCKX1 w roślinach zbożowych
Do konstrukcji wektorów typu hpRNAi użyto wektora pMCG161 (http://www.chromdb.org/- /mcg161 .html) zawierającego kasetę wyciszającą z miejscami do klonowania fragmentu wyciszanego genu w orientacji sens i antysens. Kasety wyciszające przygotowano w oparciu o sekwencje genów: HvCKX1 (NCBI accession AF362472) i HvCKX2 (NBCI accession AF540382) jęczmienia oraz TaCKX1 (NCBI accession AF362471) pszenicy (Galuszka et al., Eur. J. Biochem., 271: 3990-4002). Opracowane kasety składały się z następujących fragmentów funkcjonalnych: promotora CaMV 35S (można również zastosować inne, zwłaszcza tkankowo-specyficzne), fragmentu wyciszanego genu w orientacji sens, intronu AdhI, fragmentu wyciszanego genu w orientacji antysens oraz terminatora transkrypcji OCS3’. Sekwencja kasety wyciszającej zawierająca fragment genu HvCKX1 przedstawiona została jako sekwencja 1. Sekwencja kasety wyciszającej zawierająca fragment genu HvCKX2 przedstawiona została jako sekwencja 2. Sekwencja kasety wyciszającej zawierająca fragment genu TaCKX1 przedstawiona została jako sekwencja 3. Po transformacji genetycznej wektorami zawierającymi te kasety następuje ich integracja z genomem rośliny, a powstające w wyniku ich ekspresji siRNA regulują ekspresję tzn. wyciszają ekspresję określonych powyżej genów. Po klonowaniu wektory były elektroporowane do E. coli (szczep DH5a), izolowane i analizowane za pomocą analizy restrykcyjnej, przy użyciu kilku enzymów. Wektory, zawierające klonowane konstrukcje były następnie elektroporowane do A. tumefaciens, szczep AGL1 i ponowne sprawdzane za pomocą analizy restrykcyjnej.
Szczegółowy opis klonowania wektorów wraz z analizą restrykcyjną przedstawiono poniżej.
Klonowanie
Przygotowanie wektora pMCG161 - HvCKX1
Kolejne etapy przygotowania wektora obejmowały:
- Amplifikację fragmentu HvCKX1 (443 pz) przy użyciu starterów z sekwencją miejsc restrykcyjnych Sacl, Spel oraz Rsrll, AvrIl. Amplifikacja na wektorze pCRT7/NT-TOPO - HvCKX1.
- Analizę restrykcyjną enzymem Apal.
- Oczyszczanie amplifikowanego fragmentu przy użyciu zestawu Gene Clean KitlI.
- Trawienie wektora pMCG161 i oczyszczonego fragmentu HvCKX1 enzymem restrykcyjnym Spel (Bcul).
- Oczyszczenie wektora i fragmentu HvCKX1 zestawem Gene Clean Kit II.
- Trawienie oczyszczonego wektora i fragmentu genu enzymem restrykcyjnym Sacl.
- Oczyszczenie strawionego wektora i fragmentu HvCKX1 zestawem Gene Clean KitlI.
- Ligacja wektora pMCG161 z fragmentem HvCKX1 (stosunek molowy wektor : insert wynosi 1:2).
- Oczyszczenie mieszaniny ligacyjnej zestawem Gene Clean KitlI.
- Elektroporacja do E. coli (DH5a).
- Posiew bakterii na płytki z antybiotykiem (chloramfenikol - 35 mg/ml).
- Posiew redukcyjny wybranych kolonii.
- Wybrane kolonie sprawdzono na obecność insertu HvCKX1, za pomocą cięcia enzymem restrykcyjnym Apal. Schemat wektora z pierwszym wklonowanym fragmentem genu HvCKX1 i miejscami restrykcyjnymi Apal przedstawiono na fig. 2A).
- Po potwierdzeniu integralności insertu z wektorem pMCG161, wyizolowano plazmid wraz z insertem z wybranej, pozytywnej kolonii.
- Trawienie wektora (z insertem) oraz fragmentu HvCKX1 enzymami restrykcyjnymi AvrIl i Rsrll.
- Oczyszczenie strawionych fragmentów.
- Ligacja wektora z drugim fragmentem HvCKX1 - stosunek molowy wektor : insert, 1:2.
- Oczyszczenie mieszaniny ligacyjnej.
- Elektroporacja oczyszczonego wektora do E. coli (DH5a).
- Posiew bakterii na pożywkę selekcyjną (chloramfenikol 35 mg/ml).
- Posiew redukcyjny wybranych kolonii.
PL 222 498 B1
- Sprawdzenie obecności integralności drugiego insertu z wektorem na wybranych koloniach, przy użyciu analizy restrykcyjnym enzymem Apal. Analizę restrykcyjną przedstawiono na fig. 2B.
- Z wybranych pozytywnych kolonii wyizolowano wektor z dwoma insertami.
- Elektroporacja wektora pMCG161 - HvCKX1 do Agrobacterium tumefaciens (szczep AGL1).
- Posiew bakterii na pożywkę MG/L z antybiotykiem rifampicyną (50 mg/l) i chloramfenikolem 100 mg/l; posiew redukcyjny wybranych kolonii oraz izolacja plazmidu z wyselekcjonowanych kolonii.
- Analiza restrykcyjna wyizolowanego wektora z Agrobacterium enzym Apal.
Przygotowanie wektora pMCG161 - HvCKX2
- Amplifikacja fragmentu HvCKX2 (289 pz) przy użyciu starterów z sekwencją miejsc restrykcyjnych Sacl, Spel oraz Rsrll, AvrIl. Amplifikacja na wektorze pDRIVE - HvCKX2.
- Sprawdzenie amplifikowanego fragmentu enzymem restrykcyjnym Ehel.
- Oczyszczanie amplifikowanego fragmentu przy użyciu zestawu Gene Clean KitlI.
- Trawienie wektora pMCG161 i oczyszczonego fragmentu HvCKX2 enzymami restrykcyjnymi Spel (Bcul) i Sacl.
- Oczyszczenie trawionego wektora i fragmentu HvCKX2 zestawem Gene Clean KitlI.
- Ligacja wektora pMCG161 z fragmentem HvCKX2 (stosunek molowy wektor : insert wynosi 1:2)
- Oczyszczenie mieszaniny ligacyjnej zestawem Gene Clean KitlI.
- Elektroporacja do E. coli (DH5a).
- Posiew bakterii na płytki z antybiotykiem (chloramfenikol - 35 mg/ml).
- Posiew redukcyjny wybranych kolonii.
- Wybrane kolonie sprawdzono na obecność insertu HvCKX2, za pomocą cięcia enzymem restrykcyjnym Ehel (Fig. 3A).
- Po potwierdzeniu integralności insertu z wektorem pMCG161, wyizolowano plazmid wraz z insertem z wybranej, pozytywnej kolonii.
- Trawienie wektora (z insertem) oraz fragmentu HvCKX2 enzymami restrykcyjnymi AvrIl i Rsrll.
- Oczyszczenie strawionych fragmentów.
- Ligacja wektora z drugim fragmentem HvCKX2 - stosunek molowy wektor : insert wynosi 1:2.
- Oczyszczenie mieszaniny ligacyjnej.
- Elektroporacja oczyszczonego wektora do E. coli (DH5a).
- Posiew bakterii na pożywkę selekcyjną (chloramfenikol 35 mg/ml); posiew redukcyjny wybranych kolonii.
- Sprawdzenie integralności drugiego insertu z wektorem na wybranych koloniach, przy użyciu analizy restrykcyjnym enzymem Ehel (Fig. 3B).
- Z wybranych pozytywnych kolonii wyizolowano wektor z dwoma insertami.
- Elektroporacja wektora pMCG161 - HvCKX2 do A. tumefaciens (szczep AGL1).
- Posiew bakterii na pożywkę MG/L z antybiotykiem rifampicyna (50 mg/l) i chloramfenikol (100 mg/l).
- Posiew redukcyjny wybranych kolonii oraz izolacja plazmidu z wyselekcjonowanych kolonii.
- Analiza restrykcyjna wyizolowanego wektora z Agrobacterium enzymem Ehel.
- Przygotowanie wektora pMCG161 - TaCKX1.
- Amplifikacja fragmentu TaCKX1 (770 pz) przy użyciu starterów z sekwencją miejsc restrykcyjnych Spel i Xmal oraz Rsrll i AvrIl. Amplifikacja na wektorze pDRIVE - TaCKX1.
- Sprawdzenie amplifikowanego fragmentu enzymem restrykcyjnym Sacl.
- Oczyszczanie amplifikowanego fragmentu przy użyciu zestawu Gene Clean KitlI.
- Trawienie wektora pMCG161 i oczyszczonego fragmentu TaCKX1 enzymami restrykcyjnymi Spel (Bcul) i Xmal.
- Oczyszczenie trawionego wektora i fragmentu TaCKX1 zestawem Gene Clean KitlI.
- Ligacja wektora pMCG161 z fragmentem TaCKX1 (stosunek molowy wektor : insert wynosi 1:2).
- Oczyszczenie mieszaniny ligacyjnej zestawem Gene Clean KitlI.
- Elektroporacja do E. coli (DH5a).
- Posiew bakterii na płytki z antybiotykiem (chloramfenikol - 35 mg/ml).
- Posiew redukcyjny wybranych kolonii.
- Wybrane kolonie sprawdzono na obecność insertu TaCKX1, za pomocą cięcia enzymem restrykcyjnym Sacl (Fig. 4A).
- Po potwierdzeniu integralności insertu z wektorem pMCG161, wyizolowano plazmid wraz z insertem z wybranej, pozytywnej kolonii.
PL 222 498 B1
- Trawienie wektora (z insertem) oraz fragmentu TaCKX1 enzymami restrykcyjnymi AvrIl i Rsrll.
- Oczyszczenie strawionych fragmentów.
- Ligacja wektora z drugim fragmentem TaCKI - stosunek molowy wektor : insert, 1:2.
- Oczyszczenie mieszaniny ligacyjnej.
- Elektroporacja oczyszczonego wektora do E. coli (DH5a).
- Posiew bakterii na pożywkę selekcyjną (chloramfenikol 35 mg/ml); posiew redukcyjny wybranych kolonii.
- Sprawdzenie integralności drugiego insertu z wektorem na wybranych koloniach, przy użyciu analizy restrykcyjnym enzymem Sacl (Fig. 4B).
- Z wybranych pozytywnych kolonii wyizolowano wektor z dwoma insertami.
- Elektroporacja wektora pMCG161 - TaCKX1 do A. tumefaciens (szczep AGL1).
- Posiew bakterii na pożywkę MG/L z antybiotykiem rifampicyna (50 mg/l) i chloramfenikol 100 mg/l; posiew redukcyjny wybranych kolonii oraz izolacja plazmidu z wyselekcjonowanych kolonii.
- Analiza restrykcyjna wyizolowanego wektora z Agrobacterium enzymem Sacl.
Tak przygotowane kombinacje szczepu A. tumefaciens z właściwym wektorem binarnym były użyte do transformacji genetycznej zbóż.
Wektor binarny pMCG/HvCKX1 zawierający następujące elementy funkcjonalne: T-DNA z kasetą selekcyjną oraz kasetą wyciszającą został zaprezentowany na figurze 5, sekwencja nukleotydowa obszaru T-DNA tego wektora przedstawiona jako sekwencja 9 a sekwencja wbudowanego fragmentu genu HvCKX1 w orientacji sens jako sekwencja 10. Wektor binarny pMCG/HvCKX2 zawierający n astępujące elementy funkcjonalne: T-DNA z kasetą selekcyjną oraz kasetą wyciszającą został zaprezentowany na figurze 6, sekwencja nukleotydowa T-DNA tego wektora przedstawiona jako sekwencja 11 a sekwencja wbudowanego fragmentu genu HvCKX2 w orientacji sens jako sekwencja 12. Wektor binarny pMCG/TaCKX1 zawierający następujące elementy funkcjonalne: T-DNA z kasetą selekcyjną oraz kasetą wyciszającą został zaprezentowany na figurze 7, sekwencja nukleotydowa T-DNA tego wektora przedstawiona jako sekwencja 13 a sekwencja wbudowanego fragmentu genu TaCKX1 w orientacji sens jako sekwencja 14.
Do klonowania fragmentów genów w kasetach wyciszających wykorzystano startery przedstawione w tabeli 1.
T a b e l a 1. Sekwencje starterów zaprojektowane i użyte do klonowania fragmentów wyciszanych genów w orientacji sens i antysens kaset wyciszających w wektorze pMCG161.
| Starter | Sekwencja | Zastosowanie |
| CKX2s CKX2a | TTCGGACCGACTAGT GAGGCGAACTCTGGATAAATG TTCCTAGGGAGCTC AAACTGACCCAGACCACCAAGA | klonowanie kasety wyciszającej genu HvCKX2 |
| HCV-F HCV-R | TTCGGACCGACTAGT ATCCCTGGCTCAACGTGCTCGT TTCCTAGGGAGCTC AGTTGAAGATGTCTTGGCCCGGG | klonowanie kasety wyciszającej genu HvCKX1 |
| TAC-F TAC-R | TTCGGACCGACTAGT TGAGGAACTCGGGCGGGTTCTT TTCCTAGGCCCGGG ACTTGTCCTTCATCTCCACGAAG | klonowanie kasety wyciszającej genu TaCKX1 |
P r z y k ł a d 2. Uzyskiwanie transformowanych roślin zbożowych
Wykonano transformację dwóch odmian jęczmienia Golden Promise i Scarlett oraz pszenicy (polskie odmiany Torka i Kontesa) wektorami RNAi (z użyciem metod genetycznej modyfikacji: za pomocą Agrobacterium tumefaciens oraz metodą biolistyczną).
Metoda kultury in vitro i transformacji za pomocą A. tumefaciens
Wykładanie zarodków jęczmienia i pszenicy - kłosy w stadium 12-14 dni po pyleniu (pszenica) lub 8-18 dni po pyleniu (jęczmień) są zbierane i następnie łuska się z nich ziarna i sterylizuje.
Sterylizacja ziarniaków: płukanie w 70% Etanolu przez około minutę; zlać alkohol, dodać dwietrzy krople Tweenu 20; zalać ziarniaki 0,1% roztworem HgCI; płukać w roztworze sterylizacyjnym 3-4 minuty; płukać ziarniaki sterylną wodą, trzykrotnie odpowiednio przez 5, 10 i 15 minut; zlać wodę; przystąpić do izolacji i wykładania zarodków.
Wykładać po 20 zarodków na płytkę ze zmodyfikowaną pożywką MSB3 w przypadku zarodków jęczmienia lub na MSB6, w przypadku zarodków pszenicy.
PL 222 498 B1
Skład pożywki MSB3 (zmodyfikowana wg Wan i Lemaux, 1994; Trifonova i in. 2001, Przetakiewicz i in. 2003): makro- i mikroelementy wg Murashige i Skoog, (1962); 30 g/l maltozy, 500 mg/l hydrolizatu kazeiny, 1,234 mg/l CuSO4, 2,5 mg/l DICAMBA, 3,0 g/l GeIRite, 0,02 g/l tiaminy, 5 g/l myoinositol, 13,8 g/l proliny. pH 5,6-5,8
Skład pożywki MSB6 (zmodyfikowana wg Przetakiewicz i in. 2003): pożywka podstawowa MSB zawiera makro- i mikroelementy wg Murashige i Skoog, (1962) i witaminy wg Gamborg i in. (1968). Pożywka MSB6 zawiera składniki MSB oraz dodatkowo: 30 g/l sacharozy, 2 mg/l picrolam, 1 mg/l 2,4-D, 3,0 g/l GeIRite; pH 5,6-5,8.
Kulturę prowadzić w pokoju kultur w temperaturze 22-24°C, w fotoperiodzie 16/8 (dzień/noc), oświetleniu 50 pEm- s- pod przykryciem z bibuły filtracyjnej przez dwa - trzy dni.
Przygotowanie szczepu A. tumefaciens Agl1 do transformacji - odpowiednio wcześniej (1-2 dni), zakładamy kulturę bakteryjną. Kulturę prowadzimy w pożywce MG/L z właściwymi antybiotykami (rifampicyna 50 mg/l, chloramfenikol - 70 mg/l). Gdy kultura osiągnie odpowiedni rozwój (OD600 = 0,61,2), należy przelać zawartość kolby do probówek wirówkowych. Wirować 10 minut przy 6000 rpm, 4°C. Po wirowaniu, zaznaczyć poziom supernatantu a następnie go zlać. Wlewamy świeżą, płynną pożywkę MSB3 do zaznaczonego poziomu. Dodać acetosyringon. Probówki ustawić na wytrząsarce w celu rozpuszczenia osadu bakterii w pożywce.
Transformacja/inokulacja niedojrzałych zarodków A. tumefaciens - Przygotowaną zawiesinę bakterii z acetosyringonem nakraplamy na każdy zarodek. Pozostawiamy 2 płytki z niezakroplonymi zarodkami (kontrola). Kulturę prowadzimy w pokoju kultur w standardowych warunkach (jak wyżej), w świetle pod przykryciem z bibuły.
Zarodki jęczmienia transformowano szczepem A. tumefaciens Agl1 zawierającym wektory: pMCG/HvCKX1 i pMCG/HvCKX2. Do transformacji pszenicy używano A. tumefaciens Agl1 z wektorami: pMCG161/TaCKX1, pMCG/HvCKX1 oraz pMCG161/HvCKX2.
Pasażowanie - Po trzech dniach od inokulacji bakteryjnej przekładamy zarodki, po 6 sztuk, na pożywkę selekcyjną z odpowiednimi antybiotykami (fosfinotrycyna - 2 mg/l, timentin - 150 mg/l). Jednocześnie prowadzono kontrolę pozytywną regeneracji - zarodki nietransformowane na pożywce bez antybiotyku oraz kontrolę negatywną selekcji i regeneracji - zarodki nietransformowane na pożywce z antybiotykami. Po czterech tygodniach przekładamy, po cztery zarodki/linie kalusowe na pożywkę R2-MSB (Przetakiewicz i in. 2003) zawierającą 1 mg/l BA i 0,2 mg/l IAA z antybiotykami, jak wyżej. Po następnych 2-4 tygodniach, regenerujące roślinki przekładamy na pożywkę R2-MSB z antybiotykami, w celu dalszego wzrostu. Rosnące roślinki (ponad 1 cm) przekładamy do słoików o poj. ok. 0,5 I na pożywkę MS (połowa mikro- i makroelementów wg Murashige i Skoog, 1962) z antybiotykami. Dobrze rosnące i ukorzeniające się rośliny, sadzone są do doniczek z ziemią świeżo wysadzone rośliny poz ostawiamy na kilka dni pod przykryciem w celu adaptacji do nowych warunków.
Z rosnących roślin pobierać materiał do analiz.
Uzyskano 108 potencjalnie transgenicznych roślin pochodzących z 75 linii kalusowych. Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 2.
T a b e l a 2. Liczby transformowanych eksplantatów (niedojrzałych zarodków), wyselekcjonowanych roślin oraz linii i wydajność transformacji w poszczególnych doświadczeniach z użyciem wektorów wyciszających, kontrolnego (pMCG161) i ekspresyjnego metodą Agrobacterium i biolistyczną.
| Transformacja metodą A. tumefaciens | |||||
| odmiana | nr dośw./wektor wyciszający i kontr. | liczba ekspl. | liczba roślin wyselekcjonowanych po transformacji | liczba linii | wydajność transformacji (%) |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Golden Promise | 1. pMCG/CKX1 | 825 | 52 | 32 | 6,3 |
| 4. pMCG/CKX2 | 421 | 36 | 28 | 8,6 | |
| 4. pMCG161 | 100 | 4 | 3 | 4,0 |
PL 222 498 B1 cd. tabeli 2
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 5. pMCG/CKX2 | 75 | 5 | 4 | 6,7 | |
| 6. pMCG/CKX2 | 440 | 1 | 1 | 0,2 | |
| 6. pMCG161 | 75 | 0 | 0 | 0 | |
| 7. pMCG/CKX2 | 231 | 0 | 0 | 0 | |
| suma | 2167 | 98 | 68 | 4,52 | |
| Scarlett | 1. pMCG/CKX1 | 633 | 1 | 1 | 0,16 |
| 4. pMCG/CKX2 | 507 | 1 | 1 | 0,20 | |
| 6. pMCG/CKX2 | 237 | 0 | 0 | 0 | |
| 6. pMCG161 | 125 | 0 | 0 | 0 | |
| 7. pMCG/CKX2 | 335 | 0 | 0 | 0 | |
| suma | 1837 | 2 | 2 | 0,11 | |
| Kontesa | 4. pMCG/CKX2 | 715 | 0 | 0 | 0 |
| 4. pMCG161 | 100 | 0 | 0 | 0 | |
| 5. pMCG/TaCKX1 | 76 | 0 | 0 | 0 | |
| 6. pMCG/TaCKX1 | 322 | 0 | 0 | 0 | |
| 7. pMCG/TaCKX1 | 71 | 0 | 0 | 0 | |
| suma | 1284 | 0 | 0 | 0 | |
| Torka | 4. pMCG/CKX2 | 550 | 0 | 0 | 0 |
| 4. pMCG161 | 100 | 0 | 0 | 0 | |
| 5. pMCG/TaCKX1 | 260 | 0 | 0 | 0 | |
| 6. pMCG/TaCKX1 | 344 | 0 | 0 | 0 | |
| suma | 1254 | 0 | 0 | 0 | |
| Wanad | 4. pMCG/CKX2 | 1000 | 0 | 0 | 0 |
| 4. pMCG161 | 125 | 0 | 0 | 0 | |
| 5. pMCG/TaCKX1 | 350 | 0 | 0 | 0 | |
| suma | 1475 | 0 | 0 | 0 | |
| Transformacja metodą biolistyczną | |||||
| Golden Promise | 2. HvCKX2 liniowy | 251 | 5 | 4 | 1,99 |
| Scarlett | 2. HvCKX2 liniowy | 620 | 3 | 1 | 0,48 |
PL 222 498 B1
Analiza fenotypowa roślin T0 (genetycznie modyfikowane rośliny zregenerowane w kulturze in vitro), uzyskanie i analiza linii potomnych T1 (z każdej rośliny T0 można wyprowadzić linię w której uzyskane cechy są dziedziczone).
Nasiona uzyskano ze wszystkich zregenerowanych i wyselekcjonowanych na pożywkach selekcyjnych roślin. Zostały one policzone i zważone oraz obliczono masę tysiąca ziaren. Liczba ziaren z roślin T0 wyniosła od 36 do 332 sztuk a masa tysiąca ziaren (MTZ) od 12 do 41,28 gramów.
Analiza genotypowa
Za pomocą analiz molekularnych (głównie PCR) potwierdzono, że uzyskane rośliny T 0 są transgeniczne. W tym celu zaprojektowaliśmy i użyliśmy 7 par specyficznych starterów. Sekwencje starterów oraz ich zastosowanie przedstawiono w tabeli 3.
T a b e l a 3. Specyficzne startery zaprojektowane do analizy wyselekcjonowanych po transformacji, potencjalnie transgenicznych roślin.
| Starter | Sekwencja | Zastosowanie |
| qOCS1 | CGAGCGGCGAACTAATAACG | qPCR (PCR ilościowy) |
| qOCS2 | AATTCTCGGGGCAGCAACTC | dla kasety wyciszającej |
| qOCS3 qOCS4 | CGAGCGGCGAACTAATAACG AATTCTCGGGGCAGCAACTC | qPCR dla kasety wyciszającej |
| qOCS5 qOCS6 | GCCGTCCGCTCTACCGAAAGTTAC CAAAATTCGCCCTGGACCCG | qPCR dla kasety wyciszającej |
| pM1 pM2 | TCATTCATCTGATCTGCTCAAAGCT TCTCGCATATCTCATTAAAGCAGGA | PCR dla kasety wyciszającej |
| pM3 pM4 | ATGTCCATTCGAATTTTACCGTGT GATCAGCCTAACCAAACATAACGAA | PCR dla kasety wyciszającej |
| pM5 pM6 | CTCAAAGCTCTGTGCATCTCCG TTATTAGTTCGCCGCTCGGTG | PCR dla kasety wyciszającej |
P r z y k ł a d 3. Wyciszanie genu HvCKX1 za pomocą hpRNA/siRNA prowadzi do uzyskania zwiększonej produktywności i masy korzenia roślin zbożowych.
Przeanalizowano efekt wyciszania genu HvCKX1 oraz cechy fenotypowe w 52 genetycznie modyfikowanych liniach Golden Promise i 2 liniach Scarlett.
Pierwszym etapem analizy roślin T1 był pomiar aktywności enzymu oksydazy/dehydrogenazy cytokininy (CKX) w korzeniach roślin uzyskanych w wyniku transformacji wektorem wyciszającym genu HvCKX1. W tym celu kiełkowano po pięć roślin potomnych z każdej rośliny T0, odcinano korzeń u nasady, ważono indywidualnie i zbierano pulę korzeni z pięciu roślin do pomiaru. Doświadczenie wykonano trzykrotnie (dla 3x5 roślin T1 z linii). Wyniki pomiarów względnej aktywności oksydazy/dehydrogenazy cytokininy (CKX) wraz z odchyleniem standardowym w 52 analizowanych liniach T1 pokazano na figurze 8.
Wartości względne tych pomiarów, przyjmując pomiar w kontroli jako 1,00 (linia zre generowana w kulturze in vitro, nietransformowana) wahały się w granicach od 0,38 do 1,23. Istotnie niższą niż w kontroli aktywność oksydazy/dehydrogenazy cytokininy odnotowano w 40 liniach. W celu porównania aktywności enzymu z produktywnością linii oraz ich masą korzeni, podzielono je na trzy grupy: 1) o względnej aktywności enzymu CKX poniżej 0,59, 2) o względnej aktywności od 0,6 do 0,79 i 3) powyżej 0,8. Dwie pierwsze grupy obejmujące 40 linii wykazywały istotnie niższą aktywność enzymu w stosunku do grupy trzeciej o aktywności zbliżonej do linii kontrolnej. Zestawienie wyników obejmujące liczbę ziaren i masę tysiąca ziaren w roślinach T0 oraz średnią masę korzenia (dla 15 roślin potomnych, T1) i względną aktywność enzymu CKX w korzeniach tych roślin przedstawiono w tabeli 4.
PL 222 498 B1
T a b e l a 4. Trzy grupy linii: o aktywności enzymu CKX poniżej 0,59; od 0,6 do 0,79 i powyżej 0,8 i odpowiadające im wartości produktywności i masy korzeni.
aktywność enz. < 0,59
| nr linii | roślina T0 | liczba ziaren | masa ziaren [mg] | masa tysiąca ziaren [g] | śr. masa korzenia w T1 [mg] | względna aktywność CKX |
| 25 | 2G/4 | 210 | 8522 | 40,58 | 40,21 | 0,44 ± 0,05 |
| 30 | 5G/2B | 63 | 2053 | 32,59 | 26,50 | 0,53 ± 0,02 |
| 34 | 5G/4 | 214 | 7567 | 35,36 | 27,95 | 0,54 ± 0,03 |
| 36 | 5G/5B | 185 | 6223 | 33,64 | 33,85 | 0,58 ± 0,11 |
| 38 | 5G/7A | 203 | 6382 | 31,44 | 31,92 | 0,54 ± 0,19 |
| 39 | 5G/7B | 197 | 6467 | 32,83 | 30,92 | 0,41 ± 0,06 |
| 40 | 5G/8 | 217 | 6564 | 30,25 | 29,29 | 0,54 ± 0,1 |
| 41 | 5G/9 | 99 | 3221 | 32,54 | 31,33 | 0,49 ± 0,1 |
| 42 | 5G/10A | 184 | 4711 | 25,60 | 29,63 | 0,45 ± 0,14 |
| 43 | 5G/10B | 239 | 7850 | 32,85 | 33,90 | 0,42 ± 0,08 |
| 44 | 5G/11 | 157 | 5031 | 32,04 | 37,80 | 0,48 ± 0,15 |
| 49 | 5G/14A | 233 | 8470 | 36,35 | 33,00 | 0,43 ± 0,12 |
| 50 | 5G/14B | 217 | 6725 | 30,99 | 32,92 | 0,43 ± 0,12 |
| 51 | 5G/15A | 55 | 1381 | 25,11 | 34,13 | 0,59 ± 0,11 |
| 53 | 5G/16B | 120 | 4091 | 34,09 | 29,13 | 0,48 ± 0,19 |
| 54 | 5G/17 | 142 | 3875 | 27,29 | 21,45 | 0,41 ± 0,11 |
| 57 | 5G/19/C | 71 | 2305 | 32,46 | 31,88 | 0,59 ± 0,12 |
| 58 | 5G/20A | 126 | 4061 | 32,23 | 37,40 | 0,58 ± 0,20 |
| 59 | 5G/20B | 217 | 6685 | 30,81 | 23,58 | 0,38 ± 0,06 |
| 60 | 5G/20C | 174 | 5743 | 33,01 | 27,79 | 0,46 ± 0,04 |
| 61 | 5G/20D | 177 | 6230 | 35,20 | 28,10 | 0,57 ± 0,05 |
| 65 | 5G/23B | 170 | 7018 | 41,28 | 27,83 | 0,53 ± 0,07 |
| 66 | 5G/24 | 142 | 4796 | 33,77 | 30,90 | 0,58 ± 0,11 |
| 67 | 5G/25 | 185 | 6080 | 32,86 | 30,25 | 0,53 ± 0,09 |
| 69 | 6G/1A | 143 | 3721 | 26,02 | 37,00 | 0,52 ± 0,23 |
| 70 | 6G/1B | 235 | 7939 | 33,78 | 33,25 | 0,59 ± 0,20 |
| średnia | 26 | 168,27 | 5527,35 | 32,50 | 31,23 | 0,50 ± 0,11 |
PL 222 498 B1
| aktywność enz. 0,6-0,79 | ||||||
| 24 | 2G/3C | 90 | 2175 | 24,17 | 16,13 | 0,69 ± 0,06 |
| 27 | 5G/1B | 94 | 2542 | 27,04 | 18,50 | 0,63 ± 0,25 |
| 32 | 5G/3A | 86 | 3330 | 38,72 | 29,38 | 0,67 ± 0,09 |
| 33 | 5G/3B | 265 | 8678 | 32,75 | 30,13 | 0,65 ± 0,14 |
| 35 | 5G/5A | 260 | 6993 | 26,90 | 25,33 | 0,63 ± 0,17 |
| 37 | 5G/6 | 195 | 7477 | 38,34 | 30,88 | 0,64 ± 0,29 |
| 45 | 5G/12A | 49 | 1476 | 30,12 | 32,20 | 0,62 ± 0,15 |
| 46 | 5G/12A-1 | 166 | 5509 | 33,19 | 44,50 | 0,77 ± 0,23 |
| 48 | 5G/13 | 134 | 3847 | 28,71 | 30,25 | 0,68 ± 0,27 |
| 55 | 5G/18 | 202 | 7016 | 34,73 | 34,83 | 0,69 ± 0,22 |
| 56 | 5G/19A | 177 | 6181 | 34,92 | 38,08 | 0,68 ± 0,31 |
| 62 | 5G/21 | 206 | 7532 | 36,56 | 25,13 | 0,76 ± 0,28 |
| 63 | 5G/22 | 89 | 2608 | 29,30 | 24,05 | 0,68 ± 0,08 |
| 64 | 5G/23A | 148 | 5030 | 33,99 | 18,50 | 0,67 ± 0,19 |
| średnia | 14 | 154,36 | 5028,14 | 32,10 | 28,42 | 0,68 ± 0,20 |
aktywność enz. >0,8
| 19 | KOP 4G/1 | 50 | 489 | 9,78 | brak danych | 1,00 ± 0,00 |
| 20 | 2G/1 | 36 | 432 | 12,00 | 9,83 | 0,80 ± 0,21 |
| 21 | 2G/2 | 66 | 1430 | 21,67 | 16,53 | 1,07 ± 0,37 |
| 22 | 2G/3A | 77 | 1786 | 23,19 | 27,00 | 0,85 ± 0,47 |
| 23 | 2G/3B | 80 | 2056 | 25,70 | 25,42 | 0,87 ± 0,27 |
| 28 | 5G/1C | 145 | 3584 | 24,72 | 26,54 | 1,03 ± 0,37 |
| 29 | 5G/1D | 143 | 3116 | 21,79 | 18,00 | 0,85 ± 0,15 |
| 31 | 5G/2B | 214 | 6530 | 30,51 | 24,04 | 0,88 ± 0,35 |
| 47 | 5G/12B | 100 | 3082 | 30,82 | 27,88 | 0,96 ± 0,40 |
| 52 | 5G/16A | 177 | 5978 | 33,77 | 27,60 | 0,93 ± 0,38 |
| 68 | 5G/28 | 148 | 4850 | 32,77 | 19,45 | 0,93 ± 0,58 |
| 71 | 6G/2 | 110 | 3976 | 36,15 | 31,42 | 0,85 ± 0,40 |
| średnia | 12 | 117,82 | 3347,27 | 26,64 | 23,06 | 0,92 ± 0,33 |
Porównanie średnich danych trzech grup wskazuje wyraźnie na korelację pozytywną produktywności i masy korzeni badanych linii z obniżoną aktywnością enzymu CKX. W grupie pierwszej obejmującej linie o względnej aktywności enzymu poniżej 0,59 (średnia = 0,50 ± 0,11) średnia liczba ziaren z rośliny T0 wyniosła 168,27; masa tysiąca ziaren 32,5 grama a średnia waga korzenia w siewkach T1 31,23 miligrama. W drugiej grupie linii o względnej aktywności enzymu wynoszącej od 0,6 do 0,79 (średnia = 0,68 ± 0,20) kolejne wartości wynosiły odpowiednio: 154,36; 32,10 g; 28,42 mg. W trzeciej grupie obejmującej linie o aktywności zbliżonej do kontroli (średnia = 0,92 ± 0,33) uzyskano średnio 117,82 ziaren o masie 26,64 g i średniej masie korzenia w siewkach T1 wynoszącej 23,06 mg. Wyniki obniżonej aktywności enzymu w 40 transgenicznych liniach odmiany Golden Promise jęczmienia świadczą pośrednio o znacznym obniżeniu ekspresji wyciszanego genu HvCKX1. Nie można wykluczyć wyciszania przez użytą konstrukcję innych genów z tej rodziny, których ekspresja zachodzi w korzeniu i mają one sekwencje homologiczne do zastosowanej konstrukcji wyciszającej. Konsekwencją redukcji aktywności enzymu oksydazy/dehydrogenazy cytokininy jest zwiększenie masy korzenia a w częściach generatywnych zwiększenie produktywności linii (tabela 4). Im niższa aktywność enzymu CKX tym wyższe liczby uzyskanych ziaren oraz wyższe wartości masy tysiąca ziaren w roślinach T0 oraz średnia masa korzenia w roślinach T 1.
PL 222 498 B1
Względny, ilościowy pomiar ekspresji genu HvCKX1 w transgenicznych roślinach pokolenia T1 odmiany Golden Promise, transformowanych konstrukcją wyciszającą dla tego genu.
W drugim etapie analizy roślin T1 przeprowadzono pomiary ekspresji genu HvCKX1 w korzeniach czterodniowych siewek. Z każdej linii T0 kiełkowano po 6 ziarniaków, indywidualnie odcinano korzenie u nasady i ważono. Z części korzenia izolowano RNA, przepisane następnie na cDNA.
Do ilościowej analizy ekspresji genu HvCKX2 zaprojektowano i użyto następujących starterów:
| Starter | Sekwencja | Zastosowanie |
| qCKX11 qCKX12 | TCGTCGTCTACCCACTCAACAAATC TTGGGGTCGTACTTGTCCTTCATC | RT-PCR i qRT-PCR genu HvCKX1 |
Wyniki tego pomiaru u wybranych roślin T1 (pokolenie segregujące) przedstawiono w tabeli 5.
T a b e l a 5. Względny, ilościowy pomiar ekspresji genu HvCKX1 w transgenicznych roślinach pokolenia T1 odmiany Golden Promise transformowanych konstrukcją wyciszającą dla tego genu.
| oznaczenie rośliny | roślina | masa korzenia [mg] | utarty materiał (korzenie) [mg] | stężenie RNA [ng/pl] | wydajność izolacji korzeń [ng/mg] | wzgl. ekspr. korzeń CKX1 AACt | |
| 1 | GP/6 | Golden Prom. | 64 | 31 | 264,39 | 255,86 | 1.00a,d’e’f |
| 2 | GP/7 | Golden Prom. | 56 | 32 | 402,31 | 377,17 | 1.00b |
| 4 | GP in vitro 1/6 | Il FG KP/1A | 81 | 43 | 414,2 | 288,98 | 1.11a |
| 5 | GP in vitro 1/7 | Il FG KP/1A | 81 | 45 | 465,45 | 310,30 | 1.09b |
| 6 | GP in vitro 1/8 | Il FG KP/1A | 56 | 27 | 470,43 | 522,70 | 1.00c |
| 7 | 28/6 | 5G/1C | 44 | 23 | 240,3 | 313,43 | 1.89a |
| 8 | 28/7 | 5G/1C | 42 | 23 | 453,37 | 591,35 | 1.22b |
| 10 | 28/9 | 5G/1C | 43 | 30 | 570,5 | 570,50 | 1.16d |
| 12 | 28/11 | 5G/1C | 64 | 44 | 670,5 | 457,16 | 0.80f |
| 14 | 30/7 | 5G/2B | 71 | 45 | 748,77 | 499,18 | 0.97b |
| 16 | 30/9 | 5G/2B | 46 | 24 | 507,5 | 634,38 | 0.81d |
| 19 | 38/6 | 5G/7A | 55 | 35 | 424,41 | 363,78 | 1.93a |
| 20 | 38/7 | 5G/7A | 52 | 40 | 609,55 | 457,16 | 1.23b |
| 25 | 43/6 | 5G/10B | 34 | 18 | 187,17 | 311,95 | 2.51a |
| 26 | 43/7 | 5G/10B | 69 | 42 | 460,64 | 329,03 | 1.89b |
| 27 | 43/8 | 5G/10B | 73 | 52 | 722,60 | 416,88 | 0.82c |
| 31 | 52/6 | 5G/16A | 69 | 39 | 347,51 | 267,32 | 1.02a |
| 32 | 52/7 | 5G/16A | 66 | 26 | 346,9 | 400,27 | 2.72b |
| 35 | 52/10 | 5G/16A | 60 | 40 | 583,8 | 437,85 | 0.86e |
| 36 | 52/11 | 5G/16A | 60 | 32 | 567,2 | 531,75 | 1.06f |
| 37 | 59/6 | 5G/20B | 71 | 40 | 460,35 | 345,26 | 1.14a |
| 38 | 59/7 | 5G/20B | 56 | 32 | 448,15 | 420,14 | 1.09b |
| 42 | 59/11 | 5G/20B | 58 | 37 | 438,1 | 355,22 | 1.11f |
| 43 | 70/6 | 6G/1B | 49 | 27 | 348,3 | 387,00 | 1.46a |
| 44 | 70/7 | 6G/1B | 62 | 39 | 609,28 | 468,68 | 1.23b |
| 45 | 70/8 | 6G/1B | 47 | 23 | 463,91 | 605,10 | 0.89c |
średnia masa dla ekspresji > 0,80 58,81
PL 222 498 B1
| 9 | 28/8 | 5G/1C | 44 | 27 | 492,92 | 547,69 | 0.60c |
| 18 | 30/11 | 5G/2B | 102 | 77 | 1009,9 | 393,47 | 0.61f |
| 39 | 59/8 | 5G/20B | 45 | 21 | 638,86 | 912,66 | 0.64c |
| 41 | 59/10 | 5G/20B | 37 | 17 | 525,5 | 927,35 | 0.69e |
| 28 | 43/9 | 5G/10B | 51 | 19 | 437,3 | 690,47 | 0.72d |
| 30 | 43/11 | 5G/10B | 72 | 42 | 577,5 | 412,50 | 0.71f |
| 34 | 52/9 | 5G/16A | 53 | 21 | 443 | 632,86 | 0.73d |
| 48 | 70/11 | 6G/1B | 70 | 36 | 457,9 | 381,58 | 0.73f |
| 17 | 30/10 | 5G/2B | 66 | 44 | 655,1 | 446,66 | 0.76e |
| 24 | 38/11 | 5G/7A | 80 | 54 | 737,1 | 409,50 | 0.79f |
| śr. masa dla ekspresji = | 0,60 - 0,79 | 62,00 | |||||
| 46 | 70/9 | 6G/1B | 44 | 15 | 312,7 | 625,40 | 0.10d |
| 11 | 28/10 | 5G/1C | 82 | 58 | 714,8 | 369,72 | 0.31e |
| 22 | 38/9 | 5G/7A | 85 | 59 | 786,2 | 399,76 | 0.41d |
| 47 | 70/10 | 6G/1B | 71 | 52 | 737,6 | 425,54 | 0.45e |
| 15 | 30/8 | 5G/2B | 57 | 34 | 699,95 | 617,60 | 0.51c |
| 40 | 59/9 | 5G/20B | 42 | 19 | 420,6 | 664,11 | 0.54d |
| 29 | 43/10 | 5G/10B | 80 | 52 | 604,2 | 348,58 | 0.54e |
| 23 | 38/10 | 5G/7A | 68 | 41 | 783,3 | 573,15 | 0.57e |
| 13 | 30/6 | 5G/2B | 99 | 57 | 517,77 | 272,51 | 0.58a |
| 33 | 52/8 | 5G/16A | 42 | 18 | 390,08 | 650,13 | 0.59c |
| 21 | 38/8 | 5G/7A | 58 | 40 | 719,82 | 539,87 | 0.59c |
śr. masa dla ekspresji < 0,59 66,18
Testowane w tabeli 6 rośliny T1 zaliczono do trzech grup w zależności od intensywności wyciszania ekspresji badanego genu. W grupie roślin T1 wykazujących względną ekspresję genu HvCKX1 powyżej 0,80 średnia masa korzenia w czterodniowej siewce wynosiła 58,81 mg; w grupie roślin o względnej ekspresji od 0,60 do 0,79 średnia masa korzenia wynosiła 62,00 mg; w grupie o najniższej względnej ekspresji genu HvCKX1 (poniżej 0,59) średnia masa korzenia wynosiła 66,18 mg.
Wnioski: Wykazano korelację pozytywną produktywności i masy korzeni badanych linii z obniżoną ekspresją genu HvCKX1 oraz aktywnością enzymu CKX. W grupie pierwszej obejmującej linie o względnej aktywności enzymu poniżej 0,59 (średnia = 0,50 ± 0,11) średnia liczba ziaren z roślin y T0 wyniosła 168,27; masa tysiąca ziaren 32,5 grama a średnia waga korzenia w siewkach T1 31,23 miligrama. W drugiej grupie linii o względnej aktywności enzymu wynoszącej od 0,6 do 0,79 (średnia = 0,68 ± 0,20) kolejne wartości wynosiły odpowiednio: 154,36; 32,10 g; 28,42 mg. W trzeciej grupie obejmującej linie o aktywności zbliżonej do kontroli (średnia = 0,92 ± 0,33) uzyskano średnio 117,82 ziaren o masie 26,64 g i średniej masie korzenia w siewkach T1 wynoszącej 23,06 mg. Wyniki obniżonej aktywności enzymu w 40 transgenicznych liniach odmiany Golden Promise jęczmienia pokrywają się z wynikami obniżonej ekspresji wyciszanego genu HvCKX1 w badanych liniach. Nie można wykluczyć wyciszania przez użytą konstrukcję innych genów z tej rodziny, których ekspresja zachodzi w korzeniu i mają one sekwencje homologiczne do zastosowanej konstrukcji wyciszającej. Konsekwencją obniżenia ekspresji genu HvCKX1 jest redukcja aktywności enzymu oksydazy/dehydrogenazy cytokininy co prowadzi do zwiększenia masy korzenia a w częściach generatywnych zwiększenia produktywności linii. Im niższa ekspresja badanego genu i aktywność enzymu CKX tym wyższe liczby uzyskanych ziaren oraz wyższe wartości masy tysiąca ziaren w roślinach T0 oraz średniej masy korzenia w roślinach T1.
PL 222 498 B1
Wartość produktywności:
U roślin wykazujących obniżoną do 0,5 (± 0,11) względną aktywność enzymu CKX średnia liczba ziaren z rośliny T0 wzrosła do 142,8%; masa tysiąca ziaren do 122% a średnia masa korzenia do 135,4%. U roślin wykazujących obniżoną do 0,69 (± 0,20) względną aktywność enzymu CKX średnia liczba ziaren z rośliny T0 wzrosła do 131%; masa tysiąca ziaren do 120,5% a średnia masa korzenia do 123,2%. Na podstawie tych danych można założyć uzyskanie wartości produktywności w waru nkach polowych na poziomie 106-120% wzorca.
P r z y k ł a d 4. Wyciszanie genu HvCKX2 za pomocą hpRNA/siRNA prowadzi do zmniejszonej produktywności i masy korzenia roślin zbożowych.
Przykład ten pokazuje, że wyciszanie ekspresji genów zbożowych CKX, których ekspresja występuje głównie w tkankach somatycznych (liściach) zbóż prowadzi do efektu przeciwnego niż zastrzegany.
W wyniku transformacji biolistycznej wektorem wyciszającym gen HvCKX2 uzyskano jedynie pięć potencjalnie transgenicznych roślin Golden Promise i trzy rośliny Scarlett. Wartości względnej aktywności enzymu CKX w korzeniach siewek T1 siedmiu linii po trzykrotnej analizie (3x5 siewek) wahały się w zakresie od 0,88 do 1,21 i mieściły się w granicach błędu dla roślin kontrolnych. Jedna linia uzyskana z odmiany Scarlett wykazywała istotnie wyższą aktywność wynoszącą 2,37 ± 0,02. Dane produktywności tych linii obejmujące liczbę ziaren i masę tysiąca ziaren oraz średnią masę k orzenia w siewkach T1 i względną aktywność enzymu CKX podano w tabeli 6. Produktywność linii kontrolnych in vitro oraz masa korzenia u obydwu odmian Scarlett i Golden Promise była wyższa niż w liniach transformowanych konstrukcją wyciszającą ekspresję genu HvCKX2.
T a b e l a 6. Liczba ziaren i masa tysiąca ziaren (MTZ) w roślinach T0 oraz średnia masa korzenia i względna aktywność enzymu CKX w siewkach T1 linii transformowanych wektorem wyciszającym genu HvCKX2.
| liczba ziaren | MTZ (g) | śr. masa korzenia | aktywność CKX | odch st. | ||
| 1953 | 39,06 | 36,38 | ||||
| Golden Promise | Il FG KP/1A | 275 | 32,86 | 41,60 | ||
| 1 | Il FG KP/1B | 248 | 31,42 | 46,28 | ||
| 2 | Il FG KP/1C | 198 | 32,16 | 46,00 | 1,00 | 0,00 |
| 3 | średnia | 240,33 | 32,15 | 44,63 | ||
| Il FG/1A | 292 | 32,22 | 30,92 | 0,93 | 0,29 | |
| 4 | Il FG/1B | 292 | 30,58 | 30,08 | 0,94 | 0,20 |
| 5 | Il FG/2 | 190 | 29,02 | 54,88 | 0,88 | 0,12 |
| 6 | Il FG/3 | 116 | 33,04 | 48,08 | 1,08 | 0,19 |
| 7 | Il CG/1 | 55 | 9,68 | 22,00 | 1,21 | 0,00 |
| 8 | średnia | 189 | 26,91 | 37,19 | 1,01 | 0,16 |
| 2066 | 41,32 | 41,50 | ||||
| Scarlett | Il BS KP/1 | 151 | 38,52 | 41,67 | ||
| 9 | Il BS K P/2A | 145 | 34,2 | 32,92 | ||
| 10 | Il BS K P/2B | 155 | 34,62 | 31,07 | 1,00 | 0,00 |
| 11 | Il BS KP/2C | 229 | 28,78 | 28,75 |
PL 222 498 B1
| 12 | Il FS KP/1 | 215 | 29,82 | 36,25 | ||
| 13 | Il FS KP/2 | 251 | 31,56 | 41,67 | ||
| 14 | średnia | 191 | 32,917 | 35,39 | ||
| Il FS 1A | 117 | 22,92 | 28,08 | 1,19 | 0,29 | |
| 15 | Il FS/1B | 307 | 26,2 | 25,00 | 1,02 | 0,34 |
| 16 | Il FS/1C | 93 | 32,1 | 36,33 | 2,37 | 0,02 |
| średnia | 172,33 | 27,07 | 29,81 | 1,52 | 0,22 |
Do ilościowej analizy ekspresji genu HvCKX2 użyto starterów:
| Starter | Sekwencja | Zastosowanie |
| qCKX21 qCKX22 | GGCGAACTCTGGATAAATGTCTTG AGTTCTGTTCTGGTGAGCAAGTGAC | RT-PCR i qRT-PCR genu HvCKX2 |
P r z y k ł a d 5. Analiza ekspresji genów natywnych HvCKX1 i HvCKX2 w różnych tkankach jęczmienia odmiany Golden Promise i Scarlett.
Dodatkowo w ramach doświadczeń wykonano analizę ekspresji badanego w projekcie genu HvCKX1 i HvCKX2 w różnych tkankach jęczmienia kontrolnego Golden Promise i Scarlett (Fig. 9A, B, C). Dane literaturowe na ten temat są bardzo ubogie i niewystarczające do wybrania odpowiednich tkanek do analizy i interpretacji wyników wyciszania. Jak wynika z Fig. 9A i B, wysoka ekspresja genu HvCKX1 w tkankach roślin kontrolnych występuje w korzeniach z siewek oraz w kwiatostanach i kłosach w trzech badanych stadiach, przy czym najwyższa w kłosie siedem dni po zapylaniu (7 DAP). Ekspresja genu HvCKX2 jest widoczna we wszystkich 12 badanych tkankach (Fig. 9C) przy czym najsilniejszą amplifikację uzyskano w rozwijającym się i rozwiniętym liściu 2-3 tygodniowej rośliny.
Podsumowanie:
Uzyskano 108 potencjalnie transgenicznych linii dwóch odmian jęczmienia Golden Promise i Scarlett zawierających kasety wyciszające genów HvCKX1 i HvCKX2 (oraz T-DNA bez kaset wyciszających jako kontrole).
Potwierdzono za pomocą pomiarów aktywności enzymu CKX w korzeniach bardzo silny spadek aktywności enzymu u prawie 80% linii (40 z 52 testowanych linii) odmiany Go lden Promise.
Potwierdzono za pomocą pomiarów ilościowych ekspresji genu HvCKX1 efekt wyciszania ekspresji w transgenicznych liniach; był on skorelowany pozytywnie z produktywnością roślin i masą korzenia.
Wykazano, że istnieje silna korelacja pomiędzy obniżeniem aktywności enzymu CKX a produktywnością (liczbą i masą tysiąca ziaren) i masą korzenia w wyciszanych liniach.
W badaniach potwierdzono, że zastosowana metoda modyfikacji genetycznej z zastosowaniem wektora typu hpRNAi, wprowadzonego za pomocą stałej transformacji do zbóż umożliwia:
wyciszenie aktywności określonych genów z rodziny CKX, analizę ich funkcji, uzyskanie materiału hodowlanego o nowych, korzystnych cechach związanych z produktywnością rośliny dotyczącą liczby i masy ziarniaków oraz budową systemu korzeniowego.
PL 222 498 B1
Cytowana literatura:
Galuszka P, Frebortova J, Werner T, Hamada M, Strnad M, Schmulling T, Frebort I. 2004. Cytokinin oxidase/dehydrogenase genes in barley and wheat. Cloning and heterologous expression. Eur. J. Biochem. 271: 3990-4002.
Gamborg OL, Miller RA, Ojima K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50:. 151-158.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.
Przetakiewicz A, Karas A, Orczyk W, Nadolska-Orczyk A. 2004. Agrobacterium-mediated transformation of polyploid cereals. The efficiency of selection and transgene expression in wheat. Cell. Mol. Biol. Lett. 9: 903-917.
Przetakiewicz A, Orczyk W, Nadolska-Orczyk A. 2003. The effect of auxin on plant regeneration of wheat, barley and triticale. Plant Cell, Tissue Org. Cult. 73: 245-256.
Wan Y, Lemaux PG. 1994. Generation of large numbers of independently transformed fertile barley plants. Plant Physiol. 104: 37-48.
Trifonova A, Madsen S, Olesen A. 2001. Agrobacterium - mediated transgene delivery and integration into barley under a range of in vitro culture conditions. Plant Sci. 161: 871-880.
PL 222 498 B1
Lista sekwencji <110> Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin Nadolska-Orczyk, Anna Galuszka, Petr Zalewski, Wojciech Orczyk, Wacław <120> Kaseta DNA, wektor binarny, szczep A.
otrzymywania rośliny zbożowej o zwięk masie korzenia <130> PK/0776/RW <160> 36 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 420 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> CKX fragment <400> 1 cctcatccct ggctcaacgt gctcgtgccc cgctccggca gtcttcaggg gcatcctcca gggcaccgac atcgccgggc aacaaatcca agtgggacga cggcatgtcg gcggtgacgc gcggtgtcga tgctcttctc gtcggtggcc aacgacctga cagaagatac tgcggttctg cgacctcgcc gggatagggt tacacggccc acggcgactg ggtccggcac ttcggcggca atgaaggaca agtacgaccc caagaagctg ctctccccgg tumefaciens oraz sposób szonej produktywności i/lub tcgccgactt ccctcgtcgt cggcggagga ggcggctgga acaaggagta agtggaagca gccaagacat cgaccgcgcc ctacccactc ggtgttctac ggcgcagaac cctggcgcac cttcgtggag cttcaactaa
120
180
240
300
360
420 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
1828
DNA artificial
CKX fragment 2 agtgaaccac taccctgcta ttatttattc ttgacctaca gttcctgttg ctaggccttg tgcatccctg gggacgctcc tgcaatggac ttcggcaacc agtggctgac attgccacaa cacagtggca gctcgtgggc gattgtcatc agaatggaat accctatgtg gatgcctcag gtatggtttg gcgccgaagt gtcaaatgcg ggcgtcagcg cgaattggag attgtgactg tgatctcttc cgtgctgctc gatcgcactt gagcctgctc catgagcttc accgaggatc tgaaggtttc gttatcataa tccacaggac ccagagcggg cgagatgaca aagaacttca actactatct caacttagat tgagttcttg gatagggtgc agtcccacac ccatggctta gcaggtcttt gggaaaatcc gaagaagtcc agatgggaca cctggtggga ttcctatcct gaacaaccag ataatagagt aaactacacc acagaacccg acagaggaaa aacacctatg aaagaaacca gcatcactac gtggagcaat atgtctatgt gcagcgtgaa ggacactgta tttagcactg agatcaatga seąuence cacgcctttc gaagagccat gcgcagtcac cccttgacgg tctctagctt ccgtgaggca atggacactc cccttcggag gaggcgaact catggacaga ggcagacatt gaagaggtga ttggtggtct cacaaatggt aggagatgct acagaacagg ctagccggtt accctgaaga acacaccagc actcctctga atctcatcat tcgaagataa accgaacgtc cggcgatagg tctctaacaa agtggaaggc accccctggc ccttgtcctc tagtatggaa cagagtagtg agatcagc atctttctcc gaggcaatta tgctgagcat gcatttcagc cccgccagtc tgtgttcttg gctatatggg tgtcaaaatg ctggataaat ctacctccac ccggcatggt tattgtcact gggtcagttt gaggtggata tatttcagca catcctaaac cgaaacagac agctgacatc ctccttattc gatgaagctg accaagaagc caacaatggt agtggtcata cccccacagc agcaagtatt ccactatggg aatcctagct gttacagtac ctatagtcgc actattagta tgaaaacctc ctcctgcaat gtgcttaaac ttccacgact gctgtgcttc atgggtgagc cagtcccagg caggtgcatc gtcttgaata cttacggttg ccacagatca tgctcaccag ggcatcatta agagttctct gagaagacct aactggaggt agaaaagtgc atggaacagg cacacggacg agagctaagg actatccata cccatattgc ccagatgagg atcgaacata ggggtgaagc gctaggtggg ccaggacaga ctactgtaaa tttgcaaaag gtggtgatgc accactaaac acctgaagct atgatgtgct tgtctgcagc acccaggttc actccgcgct ctgctggagg ctggtgcatc agacgttgaa ggggcacgtt gcaatgtgaa aacagaactc ctcgggccag acttagattt tcgactacat catcgttcaa tcttctgcct aggtccatgc tcacttacat gcttgtggga catttgcaga tctacccagt aagttttcta cattgaacct aatatcttcc acgcatttca aaatatttca aaatatatat ataacgaact tcaaaatact
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1828
PL 222 498 B1
ttcaccgacg gtgtacgtca gagctcagct gcgtcgtacc gggctgtggc gacttcgacc gtcgtctacc gcgatcctgc tgggacgacg cccttctcgt cggttctgcg ggcgactggg tacgacccca
| ccgacgtcgc | caggatcgtg | 60 |
| tcgagacgac | gctcaactac | 120 |
| cggtgctggc | gacgctgagg | 180 |
| tggagttcct | ggaccgggtg | 240 |
| gtgtcccgca | cccttggctc | 300 |
| gcggcgtctt | caagggcatc | 360 |
| cgctcaacaa | atccaagtac | 420 |
| atggtatgta | tcacgcactt | 480 |
| gcatgtcggc | ggtgacgcca | 540 |
| cggtggccaa | cgacctgaag | 600 |
| acctcgccgg | ggtagggtac | 660 |
| tccggcactt | cggcggcaag | 720 |
| agaggctgct | ctccccaggc | 780 789 |
<210> 4 <211> 585 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> TaCKX4 fragment <4QQ> 4 gctgtctcgg gttcctggac tccacaccca ggtcttcggc cagateaaag ggtggggttc gagcctgaac cctagcgccc atttgagcgg atttccaaag ctgagataca agggtgcact tggctcaacc aagatcctga tgggacaaca ctgtcgtcgg gacaagatcg tacaccaccc aggaaacaca gcatcactgc tacagtcaac cctccgagct tcctcatccc aagacagcaa ggacgtcagt eaccgtccgc tagacttctg agcagcagtg tgtatgatcc ccatgtcctc cctcttccac caagctcagg gagaagcacc caatggcccc ggtgataccg ctcaggccac cgacaaggcg gaaagcccac cctagcaatc ttgacaaaca
| accgacgtca | cgtacctcga | 60 |
| gcccagggcc | tctgggaggt | 120 |
| atccaccggt | tcgcgcggga | 180 |
| atactcctct | acccagtaaa | 240 |
| gaagaagaaa | tcttctacct | 300 |
| ggcagcgtcg | agcatgcggt | 360 |
| ggcgtcggga | tgaagcagta | 420 |
| ttcggggcga | ggtgggagac | 480 |
| ctagccccag | gacagagaat | 540 |
| gcatc | 585 |
<210> 5 <211> 538 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> TaCKX7 fragment <400> 5 cgtgcaggac ccgcgccgcc ccgcgtcctc cggccccatg gtcagcggtg ggtgtccgag cgaggaggca ggagaagaag tgaccccaag gtgtcgtacg ggcctctggg gacttcgcgg ggccccgtcc ttcccagagg ggtgaccttg gggataccgt cactttggtc gcgatcctat cggggttcct acgtgccgca ccggcgtctt tcgtctaccc aggaggaggt ggcgtctgga gcgtgcagta cagccaagtg cccgtggtca tgaccgggtg cccctggctc ccacggcatc catgaaccgg gttctacacg ggagcagaac cctgccgtac ggccaggttc gagaattttc
| cgcgacggcg | agctcaagct | 60 |
| aacctcttcc | tcccgcgctc | 120 |
| ctccgccgcg | acggcggcac | 180 |
| gacaggtggg | acggcaacac | 240 |
| gttgggatcc | ttcggtcggc | 300 |
| gaggagatct | tacgcttctg | 360 |
| tacgccgacc | aggccgggtg | 420 |
| gtggagcgga | agagggagta | 480 |
| acctccccgc | tggcttga | 538 |
<210> 6 <211> 4697 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> kaseta wyciszająca genu HvCKXl <400> 6 aatcccacca aaacctgaac ctagcagttc agttgctcct tcaacaccct cataccaact actacgtcgt gtataacgga tgactggggt tgtacaaagg cagcaacaaa cggtgttccc
| ctcagagacg | aatcgggtat | 60 |
| cctcatgccg | gtatatacga | 120 |
| ggagttgcgc | ataagaagtt | 180 |
PL 222 498 B1 tgccactatt taggttgaac cctaacaagc agtgatccag tatctttacg gataatgaga gaggcctacg aaataccttc aacacagaga ggcttgcttc actgaatcta cgtgaagact cttcgtcaac ctcagaagac cggattccat ctcctacaaa gacagtggtc ccaaccacgt gcacaatccc gagaggacac ccttgtttct ttggggaaag gatcttgtat tgaaaagact tggtccatcc ttccctgttc tgcaaggagg acgtaaggcc gaaaagtttg gctgcggcca cgtgctcgtg ccagggcacc cgacggcatg ctcgtcggtg ctgcgacctc ctgggtccgg ccccaagaag catatatgtt ttgctcgttt gaaattaatt cttcgttcgt ccaggggttt cactccttat agagtctaga atcaggaggg atcagaatcc ttattgtttt aagatgaaaa tgttgatttg aatagattct tccgggtgca cccaagaaac agttttagcg ctgtcttttt aataaacttc tcttttaggc cccgggaggt gtccttcatc ggccgtgtag tatcttctgg cgacaccgcg ggatttgttg cctgaagacg gggatgagga cgcatgatat tcagatcctt tttttatgaa acagaggcaa ttcatcccca ccaccaaagc ccccaaaaga atctaggaag aggttagcct cagcaggtct ccaagaaggt aagacatatt ataaaccaag aggccatgca ggcgaacagt atggtggagc caaagggcta tgcccagcta tgccatcatt ccaaagatgg cttcaaagca actatccttc gctcgagccc cctctgtctc ctagcttcgt gctatcctgc agctagtaat gacagtctgg tttaatgaaa cgtttctttc tttgctgctc catcttgatg tgggagggcg ccccgctccg gacatcgccg tcggcggtga gccaacgacc gccgggatag cacttcggcg ctgctctccc tataattctt ttccttacaa aattaattaa tatgtttggt tccaactagc aattatttta tcttgtgttc tttattttgg aaccaatttt ggcaaaaaaa taagtagcag gcacaattaa cttcaaaaca acggccagga tgctccttaa acaatttttt ttttcgaatt aattctccta tcaccaaacc tagttgaaga tccacgaagt tgcgccaggt ttctgcgcct tagaacacct agtgggtaga gcgcggtcga ctagtgggtc ttgctttcaa accgccggtt taatattctc gagcagcagc aaggagaagc aaaaagccca gatctccttt gaagttcgaa cttcaatttc catcaagacg taaagatgca tctcaagatc gcaagtaata tggagtctaa fccatacagag acgacactct ttgagacttt tctgtcactt gcgataaagg acccccaccc agtggattga gcaagaccct ccatttaaat ttgatctgac ccacagtttt aatcgtggtg ctttctcgat ctgaacacat gacgtcattt tttgaattta cacacatgtc atttagcttg cgccagagat gcatcgccga ggcccctcgt cgccggcgga tgaggcggct ggtacaagga gcaagtggaa cgggccaaga tgtttcccct gtagtctcat ttgacttgcc taggctgatc tccacaagat tattagatca aactctcgtt gtataggtca agtagccgag aatctgaata aaaattaaaa attcagtgtc atttaatcat tatttattgt gtccttataa taaaaacttt ttaaatgtag attaacatct ttaaacaatt tgtcttggcc gcttccactt actccttgta ccagccgcct cctccgccgg cgacgagggg agtcggcgat tagagtcctg ttctgttgtg tcggttcatt cgttcaattt tgacgcgtat tcaactcaag ctgctcacgc gccccggaga ggtgaaggtg agaaagaatg atctacccga gtcaaaagat agaagtacta gagattggag gattcaaatc tcttttacga ggtctactcc tcaacaaagg catcgaaagg aaaggctatc acgaggagca tgtgacatct tcctctatat cccccctcga taatcttggt tttttcgatg aacttatgtc gtaacatcgt catacgatat tcatcagtat actaactcgt cattcgaatt actatgcgat atcagacgga cttcgaccgc cgtctaccca ggaggtgttc ggaggcgcag gtacctggcg gcacttcgtg catcttcaac cttattcaga acatgctaat aagatccata aatgttattc ggtgggctag ttttctaata aaatcatgtc aagctaagat ttggtcaaag tgcaaaatac aatggattat aaggttttgt tcatctgatc gcagtaaaaa gcacatatgg tggtcctttt cttcaaattc taattcattt caattcagtg cggggagagc gccgccgaag ccctatcccg caggtcgttg cgtcaccgcc cccggcgatg gccggagcgg ctttaatgag cacgttgtaa ctaatgaata actgattgta acaacaagtc cccaagagct taggaaccaa ttacaatgga acgacactat ctgacccaca gtaacaatct tcaggactaa ttccagtatg tctctaaaaa gaggatctaa ctcaatgaca aaaaatgtca ataatttcgg acagtagaaa attcaagatc tcgtggaaaa ccactgacgt aaggaagttc ggatcaagtg ttatgattcg aacagtgccg ttttatatcc ccagcactgc tgagcaaaga gatctaagaa tgagtggccc ttaccgtgtt tgctttcctg ccgcctcatc gccgtcttca ctcaacaaat tacgcggtgt aaccagaaga cactacacgg gagatgaagg taaagaccta tcgatcacat ttctgtaagg tatatgtcct tagagtctag ctgacctaga ttcgtgtctt tctcgccact tgaaattcac gaaaatgtat ttgtatatct atttcctggg gcaagaattc tgctcaaagc aatgtcatat cattgtaata Łatgaacgtt taatccccaa atttgaaaac gagctcagag agcttcttgg tgccggaccc gcgaggtcgc gccaccgacg gacatgccgt tcggtgccct ggcacgagca atatgcgaga aaaacctgag tatcacccgt ccctactact agcaaacaga ttgcgaaggc aaggcccagc cgatttcctc gttcaccact gatggttaga ccaggagatc ttgcatcaag gacgattcaa ggtagttcct cagaactcgc agaagaaaat aagatacagt gaaacctcct aggaaggtgg tgcctctgcc agaagacgtt aagggatgac atttcatttg caaaggtccg ttgagtaatt cagtggcgct ttcactacca tattaccgtg tcgatctatc tgttgcaact tgtttctcgg tagcaagggc gacccgtgca cctggctcaa ggggcatcct ccaagtggga cgatgctctt tactgcggtt cccacggcga acaagtacga ggaaggtata gcatctttca tgttgggctg gatattaaat agaaacacac tttgaagtct tttttattct ggagaaacag aaatagtaaa atagctagat ttgtattaag ctaaaagaat agtgtgaagg tctgtgcatc cccctagcca tatatgtttg ttaagtttca tccaaattgt cagttcaaat cgatcgcaga ggtcgtactt agtcgccgtg agaaccgcag agaagagcat cgtcccactt ggaggatgcc cgttgagcca cgcctatgat catgtgtagc tactatcgta tatatgtaca
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760
2820
2880
2940
3000
3060
3120
3180
3240
3300
3360
3420
3480
3540
3600
3660
3720
3780
3840
3900
3960
4020
4080
4140
4200
PL 222 498 B1 atattaaaat cgccacaata gaaccggtca aggggctagt cggttccccg taccgaaagt ctgccccgag csaaccttga gtcgaggctc gaaaacaata acaaacaatt aacctaaaag atctacgaca ccggcgcgca tacgggcacc aattatgcag cagtgacgac agcagga tattgtgctg gcgttttatt actgattaca caccgagcgg tgggtgagat attcaacccg catttttttg aaatcgttgg aataggttta attacaaatc taaatcttat cgaactaata tccttgaagt gtccagcacg gtgtatgtgg gcgggtccag tagcgacatc caattttaaa tcaaatttca acgctcactg tgagtattgg gcggccgggt gccccaaatg ggcgaatttt tatgatagag aaaagcggca aaagtgcccc aagggaactc ccgtccgctc aaccgacttg aagtgcaggt gcgacaacat
4260
4320
4380
4440
4500
4560
4620
4680
4697
4467
DNA artificial seguence kaseta wyciszająca genu HvCKX2 7 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
aatcccacca aaacctgaac ctagcagttc agttgctcct ctcagagacg aatcgggtat tcaacaccct cataccaact actacgtcgt gtataacgga cctcatgccg gtatatacga tgactggggt tgtacaaagg cagcaacaaa cggtgttccc ggagttgcgc ataagaagtt tgccactatt acagaggcaa gagcagcagc tgacgcgtat acaacaagtc agcaaacaga taggttgaac ttcatcccca aaggagaagc tcaactcaag cccaagagct ttgcgaaggc cctaacaagc ccaccaaagc aaaaagccca ctgctcacgc taggaaceaa aaggcccagc agtgatccag ccccaaaaga gatctccttt gccccggaga ttacaatgga cgatttcctc tatctttacg atctaggaag gaagttcgaa ggtgaaggtg acgacactat gttcaccact gataatgaga aggttagcct cttcaatttc agaaagaatg ctgacccaca gatggttaga gaggcctacg cagcaggtct catcaagacg atctacccga gtaacaatct ccaggagatc aaataccttc ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ttgcatcaag aacacagaga aagacatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc ataaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttcct actgaatcta aggccatgca tggagtctaa gattcaaatc gaggatctaa cagaactcgc cgtgaagact ggcgaacagt tcatacagag tcttttacga ctcaatgaca agaagaaaat cttcgtcaac atggtggagc acgacactct ggtctactcc aaaaatgtca aagatacagt ctcagaagac caaagggcta ttgagacttt tcaacaaagg ataatttcgg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt catcgaaagg acagtagaaa aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc attcaagatc tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgacatct ccactgacgt aagggatgac gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc atttcatttg gagaggacac gctcgagccc ccatttaaat cccccctcga ggatcaagtg caaaggtccg ccttgtttct cctctgtctc ttgatctgac taatcttggt ttatgattcg ttgagtaatt ttggggaaag ctagcttcgt ccacagtttt tttttcgatg aacagtgccg cagtggcgct gatcttgtat gctatcctgc aatcgtggtg aacttatgtc ttttatatcc ttcactacca tgaaaagact agctagtaat ctttctcgat gtaacatcgt ccagcactgc tattaccgtg tggtccatcc gacagtctgg ctgaacacat catacgatat tgagcaaaga tcgatctatc ttccctgttc tttaatgaaa gacgtcattt tcatcagtat gatctaagaa tgttgcaact tgcaaggagg cgtttctttc tttgaattta actaactcgt tgagtggccc tgtttctcgg acgtaaggcc tttgctgctc cacacatgtc cattcgaatt ttaccgtgtt tagcaagggc gaaaagtttg catcttgatg atttagcttg actatgcgat tgctttcctg gacccgtgca gctgcggcca tgggagggcg cgccagagat atcagacgga ccgactagtg aggcgaactc tggataaatg tcttgaataa gacgttgaag tatggtttgg cgccgaagtc atggacagac tacctccacc ttacggttgg gggcacgttg tcaaatgcgg gcgtcagcgg gcagacattc cggcatggtc cacagatcag caatgtgaac gaattggaga ttgtgactgg aagaggtgat attgtcactt gctcaccaga acagaactct gatctcttcc gtgctgctct tggtggtctg ggtcagtttg agctccctag gaaggtatac atatatgttt ataattcttt gtttcccctc ttattcagat cgatcacatg catctttcat tgctcgtttt tccttacaag tagtctcata catgctaatt tctgtaaggt gttgggctgg aaattaatta attaattaat tgacttgcca agatccatat atatgtcctg atattaaatc ttcgttcgtt atgtttggtt aggctgatca atgttattct agagtctaga gaaacacacc caggggtttt ccaactagct ccacaagatg gtgggctagc tgacctagat ttgaagtctc actccttata attattttat attagatcat tttctaatat tcgtgtcttt ttttattcta gagtctagat cttgtgttca actctcgtta aatcatgtet ctcgccactg gagaaacaga tcaggagggt ttattttggg tataggtcaa agctaagatt gaaattcaca aatagtaaaa tcagaatcca accaatttta gtagccgagt tggtcaaagg aaaatgtata tagctagatt tattgttttg gcaaaaaaaa atctgaatat gcaaaatact tgtatatctt tgtattaaga agatgaaaat aagtagcaga aaattaaaaa atggattata tttcctgggc taaaagaatt gttgatttgg cacaattaaa ttcagtgtca aggttttgtg caagaattca gtgtgaagga atagattctc ttcaaaacaa tttaatcatt
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760
2320
2880
2940
3000
PL 222 498 B1 catctgatct gctcaaagct ctgtgcatct ccgggtgcaa cggccaggat atttattgtg 3060 cagtaaaaaa atgtcatatc ccctagccac ccaagaaact gctccttaag tccttataag 3120 cacatatggc attgtaatat atatgtttga gttttagcga caattttttt aaaaactttt 3180 ggtccttttt atgaacgttt taagtttcac tgtctttttt tttcgaattt taaatgtagc 3240 ttcaaattct aatccccaat ccaaattgta ataaacttca attctcctaa ttaacatctt 3300 aattcattta tttgaaaacc agttcaaatt cttttaggct caccaaacct taaacaattc 3360 aattcagtgg agctcaaact gacccagacc accaagagca gcacggaaga gatcagagtt 3420 ctgttctggt gagcaagtga caatatcacc tcttccagtc acaatctcca attcgttcac 3480 attgctgatc tgtggaccat gceggaatgt ctgcccgctg acgcccgcat ttgacaacgt 3540 gcccccaacc gtaaggtgga ggtagtctgt ccatgacttc ggcgccaaac catacttcaa 3600 cgtcttattc aagacattta tccagagttc gcctcactag tgggtctaga gtcctgcltt 3660 aatgagatat gcgagacgcc tatgatcgca tgatatttgc tttcaattct gttgtgcacg 3720 ttgtaaaaaa cctgagcatg tgtagctcag atccttaccg ccggtttcgg ttcattctaa 3780 tgaatatatc acccgttact atcgtatttt tatgaataat attctccgtt caatttactg 3840 attgtaccct actacttata tgtacaatat taaaatgaaa acaatatatt gtgctgaata 3900 ggtttatagc gacatctatg atagagcgcc acaataacaa acaattgcgt tttattatta 3960 caaatccaat tttaaaaaaa gcggcagaac cggtcaaacc taaaagactg attacataaa 4020 tcttattcaa atttcaaaag tgccccaggg gctagtatct acgacacacc gagcggcgaa 4080 ctaataacgc tcactgaagg gaactccggt tccccgccgg cgcgcatggg tgagattcct 4140 tgaagttgag tattggccgt ccgctctacc gaaagttacg ggcaccattc aacccggtcc 4200 agcacggcgg ccgggtaaec gacttgctgc cccgagaatt atgcagcatt tttttggtgt 4260 atgtgggccc caaatgaagt gcaggtcaaa ccttgacagt gacgacaaat cgttgggcgg 4320 gtccagggcg aattttgcga caacatgtcg aggctcagca ggacctgcag gcatgcaagc 4380 ttggcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt 4440 aatcgccttg cagcacatcc ccctttc 4467 <210> 8 <211> 5431 <212> DNA <213> artificial seguence <220>
<223> kaseta wyciszająca genu TaCKXl <400> 8 aatcccacca aaacctgaac ctagcagttc agttgctcct ctcagagacg aatcgggtat 60 tcaacaccet cataccaact actacgtcgt gtataacgga cctcatgccg gtatatacga 120 tgactggggt tgtacaaagg cagcaacaaa cggtgttccc ggagttgcgc ataagaagtt 180 tgccactatt acagaggcaa gagcagcagc tgacgcgtat acaacaagtc agcaaacaga 240 taggttgaac ttcatcccca aaggagaagc tcaactcaag cccaagagct ttgcgaaggc 300 cctaacaagc ccaccaaagc aaaaagccca ctgctcacgc taggaaccaa aaggcccagc 360 agtgatccag ccccaaaaga gatctccttt gccccggaga ttacaatgga cgatttcctc 420 tatctttacg atctaggaag gaagttcgaa ggtgaaggtg acgacactat gttcaccact 480 gataatgaga aggttagcct cttcaatttc agaaagaatg ctgacccaca gatggttaga 540 gaggcctacg cagcaggtct catcaagacg atctacccga gtaacaatct ccaggagatc 600 aaataccttc ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ttgcatcaag 660 aacacagaga aagacatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa 720 ggcttgcttc ataaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttcct 780 actgaatcta aggccatgca tggagtctaa gattcaaatc gaggatctaa cagaactcgc 840 cgtgaagact ggcgaacagt tcatacagag tcttttacga ctcaatgaca agaagaaaat 900 cttcgtcaac atggtggagc acgacactct ggtctactcc aaaaatgtca aagatacagt 960 ctcagaagac caaagggcta ttgagacttt tcaacaaagg ataatttcgg gaaacctcct 1020 cggattccat tgcccagcta tctgtcactt catcgaaagg acagtagaaa aggaaggtgg 1080 ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc attcaagatc tgcctctgcc 1140 gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt 1200 ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgacatct ccactgacgt aagggatgac 1260 gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc atttcatttg 1320 gagaggacac gctcgagccc ccatttaaat cccccctcga ggatcaagtg caaaggtccg 1380 ccttgtttct cctctgtctc ttgatctgac taatcttggt ttatgattcg ttgagtaatt 1440 ttggggaaag ctagcttcgt ccacagtttt tttttcgatg aacagtgccg cagtggcgct 1500 gatcttgtat gctatcctgc aatcgtggtg aacttatgtc ttttatatcc ttcactacca 1560 tgaaaagact agctagtaat ctttctcgat gtaacatcgt ccagcactgc tattaccgtg 1620 tggtccatcc gacagtctgg ctgaacacat catacgatat tgagcaaaga tcgatctatc 1680 ttccctgttc tttaatgaaa gacgtcattt tcatcagtat gatctaagaa tgttgcaact 1740 tgcaaggagg cgtttctttc tttgaattta actaactcgt tgagtggccc tgtttctcgg 1800 acgtaaggcc tttgctgctc cacacatgtc cattcgaatt ttaccgtgtt tagcaagggc 1860 gaaaagtttg catcttgatg atttagcttg actatgcgat tgctttcctg gacccgtgca 1920 gctgcggcca tgggagggcg cgccagagat atcagacgga ccgggccgcc gggtgaggaa 1980 ctcgggcggg ttcttcaccg acgccgacgt cgccaggatc gtggccgtcg ccgcggcgag 2040
PL 222 498 B1 gaacgctacc gtccgtggac gttcgtgcgg gctggacaag ctcccgcatc cgccgggcct tgcatgcatg tcgtggtttc cgcggtgtcg ccagaagata ctacacggcc gatgaaggac ggtatacata ctttcattgc gggctggaaa ttaaatcttc acacacccag aagtctcact tattctagag aaaeagatca agtaaaatca ctagatttat attaagaaga aagaattgtt tgaaggaata tgcatctccg tagccaccca tgtttgagtt gtttcactgt aattgtaata tcaaattctt cgcagacccg catctccacg gtagtgcgcc ctggttctgc cgcgtagaac acgaccgagc tgcacgatgg ggcgatgtcg ggagcggggc cagcgccccc gaacgcgtgc ggacgcggcc gttcctcgcc cgagttcctc gacgcctatg agcatgtgta gttactatcg cttatatgta tctatgatag aaaaaagcgg caaaagtgcc tgaagggaac ggccgtccgc gtaaccgact tgaagtgcag ttgcgacaac accgtgtacg caggagctca gacgcgtcgt atcgggctgt gccgacttcg ctcgtcgtct catgcgatcc aggtgggacg ctgcccttct ctgcggttct cacggcgact aagtacgacc tatgtttata tcgtttttcc ttaattaatt gttcgttatg gggttttcca ccttataatt tctagatctt ggagggttta gaatccaacc tgttttggca tgaaaataag gatttggcac gattctcttc ggtgcaacgg agaaactgct ttagcgacaa cttttttttt aacttcaatt ttaggctcac gggatgtcct aagcgctgcc aggtactcct gcctccagcc acctcctccg cagtgtcagt acgcgtagtg gtgccctgga acgagcacga tcctcgccgt ccctcctcgt gtggcgctgt gcggcgacgg acccggcggc atcgcatgat gctcagatcc tatttttatg caatattaaa agcgccacaa cagaaccggt ccaggggcta tccggttccc tctaccgaaa tgctgccccg gtcaaacctt atgtcgaggc tcatcgagac gctcggtgct acctggagtt ggcgtgtccc accgcggcgt acccgctcaa tgcatggtat acggcatgtc cgtcggtggc gcgacctcgc gggtccggca ccaagaggct attctttgtt ttacaagtag aattaattga tttggttagg actagctcca attttatatt gtgttcaact ttttgggtat aattttagta aaaaaaaatc tagcagaaaa aattaaattc aaaacaattt ccaggatatt ccttaagtcc tttttttaaa cgaattttaa ctcctaatta caaaccttaa ggcctgggga acttgccgcc tgtaccctac gcttcaggtc ctggcgtcac taagtgcgtg cgtacttgga ggatgccctt tgagccaagg gcacccggtc gcctcagcgt cgtagttgag ccacgatcct cactagtggg atttgctttc ttaccgccgg aataatattc atgaaaacaa taacaaacaa caaacctaaa gtatctacga cgccggcgcg gttacgggca agaattatgc gacagtgacg tcagcaggac gacgctcaac ggcgacgctg cctggaccgg gcacccttgg cttcaagggc caaatccaag gtatcacgca ggcggtgacg caacgacctg cggggtaggg cttcggcggc gctctcccca tcccctctta tctcatacat cttgccaaga ctgatcaatg caagatggtg agatcatttt ctcgttaaat aggtcaaagc gccgagttgg tgaatatgca ttaaaaaatg agtgtcaagg aatcattcat tattgtgcag ttataagcac aacttttggt atgtagcttc acatcttaat acaattcaat gagcagcctc gaagtgccgg cccggcgagg gttggccacc cgccgacatg atacatacca tttgttgagc gaagacgccg gtgcgggaca caggaactcc cgccagcacc cgtcgtctcg ggcgacgtcg tctagagtcc aattctgttg tttcggttca tccgttcaat tatattgtgc ttgcgtttta agactgatta cacaccgagc catgggtgag ccattcaacc agcatttttt acaaatcgtt c tacgacagcg aggcacgagg gtgcacggcg ctcatcgtgc at cctccagg tacgcactac cttaactgac ccagcggagg aagcggctgg tacaaggagt aagtggcagc ggccaggaca ttcagatcga gctaatttct tccatatata ttattctaga ggctagctga ctaatattcg catgtctctc taagattgaa tcaaaggaaa aaatacttgt gattatattt ttttgtgcaa ctgatctgct taaaaaaatg atatggcatt cctttttatg aaattctaat tcatttattt tcagtggagc ttggggtcgt acccagtcgc tcgcagaacc gacgagaagg ccgtcgtccc tgcaggatcg gggtagacga cggtcgaagt cgccacagcc aggtacgacg gagctgagct atgacgtaca gcgtcggtga tgctttaatg tgcacgttgt ttctaatgaa ttactgattg tgaataggtt ttattacaaa cataaatctt ggcgaactaa attccttgaa cggtccagca tggtgtatgt gggcgggtcc ccacggccgc aggggcacgc aggagggggc tcgtgccccg gcaccgacat gcgtccatcg actggctcgg aggtgttcta aggcgcagaa acctggcgca gcttcgtgga tccctaggaa tcacatgcat gtaaggtgtt tgtcctgata gtctagagaa cctagatttg tgtctttttt gccactggag attcacaaat atgtatatag atatctttgt cctgggctaa gaattcagtg caaagctctg tcatatcccc gtaatatata aacgttttaa ccccaatcca gaaaaccagt tcagagcgat acttgtcctt cgtgggccgt gcagtatctt gcagcgacac acctgaaacc catgcatgca cgagaggccc cggcgatgcg cgatcttgtc cgtcccgcac cctggtccac cggtggtagc agaacccgcc agatatgcga aaaaaacctg tat atcaccc taccctacta tatagcgaca tccaatttta attcaaattt taacgctcac gttgagtatt cggcggccgg gggccccaaa agggcgaatt
2100
2160
2220
2230
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760
2820
2880
2940
3000
3060
3120
3180
3240
3300
3360
3420
3480
3540
3600
3660
3720
3780
3840
3900
3960
4020
4080
4140
4200
4260
4320
4380
4440
4500
4560
4620
4680
4740
4800
4860
4920
4980
5040
5100
5160
5220
5280
5340
5400
5431 <210> 9 <21!> 8172 <212> DNA <213> artificial seguence <220>
<223> obszar T-DNA wektora pMCG/HvCKXl <400> 9 aattctatgt ttgacagctt atcatcggat ctagtaacat atttatccta gtttgcgcgc tatattttgt tttctatcgc agatgacacc gtattaaatg gcgcgcgata tataattgcg
120
PL 222 498 B1 ggactctaat catgcttaac tcaatcttaa tcggtgacgg cccacgtcat tatccgagcg acgctcttga agtcccgtcc gcgttgcgtg gcgacgagcc tcctgcggct cagaccgccg ctcatggtta tgagcatcga aaaatccaca ataaaacata gctgcatatg tagatcgata cagttccaaa acgaatgaac ctgtatatgc atccatcatc taataaatcc ccagaccaca gtgcacggca aaaaaatcat agagaaacac cgaacgctag agaactaccg gggggggagg atctggttgt gggtgtctat cccccgtagc tgccgctccg aaetetegag ccgacgcgac aggctggcat agggtatttg ataaaaaaac agatgtacta taataaaatg tgeacactaa accatgteta agattatatt tcaaacaagt cattatctct tgttcgagta tttactgtgt gagttaatga cttatttgtt aaaaatgtgt tagttgtacc gcaaatgtta tatgtaattt tcatggattt attgacaaca caccaaaacc accctcatac ggggttgtac ctattacaga tgaacttcat caagcccacc tccagcccca ttacgatcta tgagaaggtt ctacgcagca ccttcccaag cataaaaacc gtaattcaac gaaactttat gcaggaccgg gccagttccc cctcgtgcat agccctgtgc gctggtggcg ccttccaggg agggatagcg eggtacggaa gcatgtccgc cttcctaatc caaaagaaac tatagctgct cttgtttatt ccatcatgta tttccatcca attaataaat gaccgcccaa atcagtaaaa ttcaattcgt accaggtagt tcatcacaac tatattgaaa gaaategatc tggcaagtta cagcacggat ggccctaacc acgagcggcg gtgtgtgtgc ttattacggc tgccgtgccg ccacgcaatt aggggtccag gctgctggtt tatctactcg tttaattttt taaaatagag aaaaaattag gatgaagtat aaagataaaa actgttcatt attcgtagag gtgacaaaaa agagaggggc ttatggcatt tttttattcg atgatatggt gtgtgttgaa caaatcgtgg attatgetta ctgaatacaa tccagaatcc gtagttgagt tgcatcaatc tgaacctagc caactactac aaaggcagca ggcaagagca ccccaaagga aaagcaaaaa aaagagatct ggaaggaagt agcctcttca ggtctcatca aaggttaaag catctcataa agaaattata tgccaaatgt acggggcggt gtgcttgaag gcgcacgctc ctccagggac gggggagacg gcccgcgtag ctcccgcaga gttgaecgtg ctcggtggca gatggatcct agtaccaagc gcatatgeea ataatagata tatgeateag tcttaaactc aeaccaggta ccacaccaca cccgcatcaa aactatgaat ttgaaacaga caagacaaaa taaaggaaaa ccgtctgcgg gcaatcagaa ctaacacaaa atggaccgga taccttgaag gctccgaaca gggcgaggaa tgagaggagg tctggatgcc aggcagcgac cgctggttgg aaacaagaaa agtcacttta ttttagtttt tctataaaaa tatataggtg ctgtagagtc tatatgatte taaagtttaa aaatatgtgg acgaccgggt gggaaaactg gttttcgcta ccttttgttc tttgaaatta cctctaatga tteactaggc gtatgtcctc ttgtcagatt atgaaaatat tagggcatgc agttcagttg gtcgtgtata acaaacggtg gcagctgacg gaagctcaac gcccactgct cctttgcccc tcgaaggtga atttcagaaa agaegateta atgcagtcaa ataacgtcat tgataatcat tgaacgatct accggcaggc ccggccgccc gggtcgttgg ttcagcaggt tacacggtcg gcgatgccgg cggacgaggt cttgtetega cggcggatgt etagtgeaga aaataaatag tcatccaagt ggtactcaag taaaacccac gtaactatga gtttgaaaca tcatcacaac catgtatacc atgtatggca attctactcc aaaagcatga gggcaaacca aacggctaga cgtgtctgac cacggatcta acgccgatct cggaggtgcc acacgaggtt gggaaagcga aggaggccgc gacagcggag agagatgeeg tgtccgttag aatgtttcct ttttattcta cttaatttag ccattaaccc aagctatttg ctgttgtcaa tctaaaaeae atatatgtat taatttttta cacgctgcac tttttcttgt tcgaactgtg attctcaaat taagagatat ccgaagttaa aacaaatata ttgtgtttta ctaatcattg tttttaatgc gggggttaat ctcctctcag acggacctca ttcccggagt cgtatacaac tcaagcccaa cacgctagga ggagattaca aggtgacgac gaatgctgac cccgagtaac aagattcagg gcattacatg cgcaagaccg gcaggtcgac tgaagtccag gcagcatgcc gcagcccgat gggtgtagag actcggccgt cgacctcgcc cgtccgtcca tgtagtggtt cggccgggcg agtaacacca cgtatgaagg atatcaagat gttagageat atcaacatgt agatgtatga gtattctact caagcgaaca tatcctagat cacacataca gatctagaac aaagatgacc aaccctatgc gccatcccag gtacaggtcg acacaaacat agagaaggta gacgggtgga ggggaaagag aggagcggtg ctgcegtgcc caagtccaac tgccgtctgc actcgtcgac tagttttttt ttttatatct aggctaaaat taaaccctaa caaaaaaaaa aatactcaat tgatattatt aaagatagat taacttagac tgcactagag accatttgtt aaatggaaat taatattatt gcaaacattt tatgaggagt ttttcagacc gacatttatg ctttataatt attttatgac taacccccga agacgaatcg tgccggtata tgcgcataag aagtcagcaa gagctttgcg aecaaaaggc atggacgatt actatgttca ccacagatgg aatctccagg actaattgca ttaattatta gcaacaggat ggateagate ctgccagaaa gcggggggca gacagcgacc cgtggagccc ccagtcgtag gtccacctcg ctcctgcggt gaegatggtg tcgttctggg aacaacaggg cagggctaaa caaaataatt atgaatagat atacctatcc cacacacata cegatctaga aaaagcatct cgatatttcc gatccaaaat gaccgcccaa cgacaaacaa aacgaaacaa gattccccaa catccgtgta gaacagaagt gagagggggg tttgggggag ggtgtggagg ggaaaggaat ggctcacgtc ggtggagcgg ttcgcttggc ggcgtttaac aatttcttaa aaattattaa agaataaaat atggatgtac ggagaacaca tgtcctttag gtagtactat aaactgcact atgcaatgct tcgaccctag gtgcttgtaa ggatggagaa tgttttttct tgttttgagt aaaacacttg tagaaaagct aactttcctt atagttatac ttgccaattg attccaatcc ggtattcaac tacgatgact aagtttgcca acagataggt aaggccctaa ccagcagtga tcctctatct ccactgataa ttagagaggc agatcaaata tcaagaacac
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 22 80 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3340 3900 3960 4020 4080 4140
PL 222 498 B1 agagaaagac gcttcataaa atctaaggcc agactggcga tcaacatggt aagaccaaag tccattgccc acaaatgcca tggtcccaaa cacgtcttca atcccactat gacacgctcg tttctcctct gaaagctagc tgtatgctat agactagcta catccgacag tgttctttaa ggaggcgttt aggcctttgc gtttgcatct ggccatggga tcgtgccccg gcaccgacat gcatgtcggc cggtggccaa acctcgccgg tccggcactt agaagctgct atgtttataa cgtttttcct taattaatta ttcgttatgt ggttttccaa cttataatta ctagatcttg gagggtttat aatccaacca gttttggcaa gaaaataagt atttggcaca attctcttca gtgcaacggc gaaactgctc tagcgacaat tttttttttc acttcaattc taggctcacc gaggttagtt tcatctccac tgtagtgcgc tctggttctg ccgcgtagaa tgttgagtgg agacggcgcg gaggactagt gatatttgct tccttaccgc atgaataata aaaatgaaaa caataacaaa ggtcaaacct ctagtatcta ccccgccggc aaagttacgg ccgagaatta cttgacagtg atatttctca ccaaggcaag atgcatggag acagttcata ggagcacgac ggctattgag agctatctgt tcattgcgat gatggacccc aagcaagtgg ccttcgcaag agcccccatt gtctcttgat ttcgtccaca cctgcaatcg gtaatctttc tctggctgaa tgaaagacgt ctttctttga tgctccacac tgatgattta gggcgcgcca ctccggcatc cgccgggccc ggtgacgccg cgacctgagg gatagggtac cggcggcaag ctccccgggc ttctttgttt tacaagtagt attaattgac ttggttaggc ctagctccac ttttatatta tgttcaactc tttgggtata attttagtag aaaaaaatct agcagaaaat attaaattca aaacaattta caggatattt cttaagtcct ttttttaaaa gaattttaaa tcctaattaa aaaccttaaa gaagatgtct gaagtgcttc caggtactcc cgcctccagc cacctcctcc gtagacgacg gtcgaagtcg gggtctagag ttcaattctg cggtttcggt ttctccgttc caatatattg caattgcgtt aaaagactga cgacacaccg gcgcatgggt gcaccattca tgcagcattt acgacaaatc agatcagaag taatagagat tctaagattc cagagtcttt actctggtct acttttcaac cacttcatcg aaaggaaagg cacccacgag attgatgtga acccttcctc taaatccccc ctgactaatc gttttttttt tggtgaactt tcgatgtaac cacatcatac cattttcatc atttaactaa atgtccattc gcttgactat gagatatcag gccgacttcg ctcgtcgtct gcggaggagg cggctggagg aaggagtacc tggaagcact caagacatct cccctcttat ctcatacatg ttgccaagat tgatcaatgt aagatggtgg gatcattttc tcgttaaatc ggtcaaagct ccgagttggt gaatatgcaa taaaaaatgg gtgtcaaggt atcattcatc attgtgcagt tataagcaca acttttggtc tgtagcttca catcttaatt caattcaatt tggcccgggg cacttgccgc ttgtacccta cgcctcaggt gccggcgtca aggggcccgg gcgatgccgg tcctgcttta ttgtgcacgt tcattctaat aatttactga tgctgaatag ttattattac ttacataaat agcggcgaac gagattcctt acccggtcca ttttggtgta gttgggcggg tactattcca tggagtctct aaatcgagga tacgactcaa actccaaaaa aaaggataat aaaggacagt ctatcattca gagcatcgtg catctccact tatataagga ctcgaggatc ttggtttatg cgatgaacag atgtctttta atcgtccagc gatattgagc agtatgatct ctcgttgagt gaattttacc gcgattgctt acggaccgcc accgcgccgt aeceactcaa tgttctacgc cgcagaacca tggcgcacta tcgtggagat tcaactaaag tcagatcgat ctaatttctg ccatatatat tattctagag gctagctgac taatattcgt atgtctctcg aagattgaaa caaaggaaaa aatacttgta attatatttc tttgtgcaag tgatctgctc aaaaaaatgt tatggcattg ctttttatga aattctaatc catttatttg cagtggagct agagcagctt cgaagtgccg tcccggcgag cgttggccac ccgccgacat cgatgtcggt agcggggcac atgagatatg tgtaaaaaac gaatatatca ttgtacccta gtttatagcg aaatccaatt cttattcaaa taataacgct gaagttgagt gcacggcggc tgtgggcccc tccagggcga gtatggacga aaaaaggtag tctaacagaa tgacaagaag tgtcaaagat ttcgggaaac agaaaaggaa agatctgcct gaaaaagaag gacgtaaggg agttcatttc aagtgcaaag attcgttgag tgccgcagtg tatccttcac actgctatta aaagatcgat aagaatgttg ggccctgttt gtgtttagca tcctggaccc tcatccctgg cttcaggggc caaatccaag ggtgtcgatg gaagatactg cacggcccac gaaggacaag acctaggaag cacatgcatc taaggtgttg gtcctgatat tctagagaaa ctagatttga gtcttttttt ccactggaga ttcacaaata tgtatatagc tatetttgta ctgggctaaa aattcagtgt aaagctctgt catatcccct taatatatat acgttttaag cccaatccaa aaaaccagtt cagagcgatc cttggggtcg gacccagtcg gtcgcagaac cgacgagaag gccgtcgtcc gccctggagg gagcacgttg cgagacgcct ctgagcatgt cccgttacta ctacttatat acatctatga ttaaaaaaag tttcaaaagt cactgaaggg attggccgtc cgggtaaccg aaatgaagtg attttgcgac ttcaaggctt ttcctactga ctcgccgtga aaaatcttcg acagtctcag ctcctcggat ggtggctcct ctgccgacag acgttccaac atgacgcaca atttggagag gtccgccttg taattttggg gcgctgatct taccatgaaa ccgtgtggtc ctatcttccc caacttgcaa ctcggacgta agggcgaaaa gtgcagctgc ctcaacgtgc atcctccagg tgggacgacg ctcttctcgt cggttctgcg ggcgactggg tacgacccca gtatacatat tttcattgct ggctggaaat taaatcttcg cacacccagg agtctcactc attctagagt aacagatcag gtaaaatcag tagatttatt ttaagaagat agaattgttg gaaggaatag gcatctccgg agccacccaa gtttgagttt tttcactgtc attgtaataa caaattcttt gcagacccgg tacttgtcct ccgtgggccg cgcagtatct agcatcgaca cacttggatt atgcccctga agccagggat atgatcgcat gtagctcaga tcgtattttt gtacaatatt tagagcgcca cggcagaacc gccccagggg aactccggtt cgctctaccg acttgctgcc caggtcaaac aacatgtega
4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 46 80 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 56 40 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7080 7140 72 00 7260 7320 7380 7440 7500 7560 7620 76 80 7740 7800 7860 7920 7980 8040 8100 8160
PL 222 498 B1 ggctcagcag ga
8172 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
atccctggct tcaggggcat
414
DNA artif icial seąuence sekwencja wbudowanego fragmentu genu 10 caacgtgctc gtgccccgct ccggcatcgc cctccagggc accgacatcg ccgggcccct
HvCKXl w orientacji sens aatccaagtg ggacgacggc atgtcggcgg tgacgccggc tgtcgatgct cttctcgtcg gtggccaacg acctgaggcg agatactgcg gttctgcgac ctcgccggga tagggtacaa cggcccacgg cgactgggtc cggcacttcg gcggcaagtg aggacaagta cgaccccaag aagetgetct ccccgggcca cgacttcgac cgtcgtctac ggaggaggtg gctggaggcg ggagtacctg gaagcacttc agacatcttc cgcgccgtct ccactcaaca ttctacgcgg cagaaccaga gcgcactaca gtggagatga aact
120
180
240
300
360
414 <210> 11 <211> 7942 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> obszar T-DNA wektora pMCG/HvCKX2 <400> 11 aattctatgt ttgacagctt atcatcggat ctagtaacat agatgacacc gcgcgcgata 60 atttatccta gtttgcgcgc tatattttgt tttctatcgc gtattaaatg tataattgcg 120 ggactctaat cataaaaacc catctcataa ataacgtcat gcattacatg ttaattatta 180 catgcttaac gtaattcaac agaaattata tgataatcat cgcaagaccg gcaacaggat 240 tcaatcttaa gaaactttat tgccaaatgt tgaacgatct gcaggtcgac ggatcagatc 300 tcggtgacgg gcaggaccgg acggggcggt accggcaggc tgaagtccag ctgccagaaa 360 cceacgtcat gccagttccc gtgcttgaag ceggcegccc gcagcatgcc gcggggggca 420 tatccgagcg cctcgtgcat gcgcacgctc gggtcgttgg gcagcccgat gacagcgacc 480 acgctcttga agccctgtgc ctccagggac ttcagcaggt gggtgtagag cgtggagccc 540 agtcccgtcc gctggtggcg gggggagacg tacacggtcg actcggccgt ccagtcgtag 600 gcgttgcgtg ccttccaggg gcccgcgtag gcgatgccgg cgacctcgcc gtccacctcg 660 gcgacgagcc agggatagcg ctcccgcaga cggacgaggt cgtccgtcca ctcctgcggt 720 tcctgcggct cggtacggaa gttgaccgtg cttgtctcga tgtagtggtt gacgatggtg 780 cagaccgccg gcatgtccgc ctcggtggca cggcggatgt cggccgggcg tcgttctggg 840 ctcatggtta cttcctaatc gatggatcct ctagtgcaga agtaacacca aacaacaggg 900 tgagcatcga caaaagaaac agtaccaagc aaataaatag cgtatgaagg cagggctaaa 960 aaaatccaca tatagctgct gcatatgcca tcatccaagt atatcaagat caaaataatt 1020 ataaaacata cttgtttatt ataatagata ggtactcaag gttagagcat atgaatagat 1080 gctgcatatg ccatcatgta tatgcatcag taaaacccac atcaacatgt atacctatcc 1140 tagatcgata tttccatcca tcttaaactc gtaactatga agatgtatga cacacacata 1200 cagttccaaa attaataaat acaccaggta gtttgaaaca gtattctact ccgatctaga 1260 acgaatgaac gaccgcccaa ccacaccaca tcatcacaac caagcgaaca aaaagcatct 1320 ctgtatatgc atcagtaaaa cccgcatcaa catgtatacc tatcctagat cgatatttcc 1380 atccatcatc ttcaattcgt aactatgaat atgtatggca cacacataca gatccaaaat 1440 taataaatcc accaggtagt ttgaaacaga attctactcc gatctagaac gaccgcccaa 1500 ccagaccaca tcatcacaac caagacaaaa aaaagcatga aaagatgacc cgacaaacaa 1560 gtgcacggca tatattgaaa taaaggaaaa gggcaaacca aaccctatgc aacgaaacaa 1620 aaaaaatcat gaaatcgatc ccgtctgcgg aacggctaga gccatcccag gattccccaa 1680 agagaaacac tggcaagtta gcaatcagaa cgtgtctgac gtacaggtcg catccgtgta 1740 cgaacgctag cagcacggat ctaacacaaa cacggatcta acacaaacat gaacagaagt 1800 agaactaccg ggccctaacc atggaccgga acgccgatct agagaaggta gagagggggg 1860 gggggggagg acgagcggcg taccttgaag cggaggtgcc gacgggtgga tttgggggag 1920 atctggttgt gtgtgtgtgc gctccgaaca acacgaggtt ggggaaagag ggtgtggagg 1980 gggtgtctat ttattacggc gggcgaggaa gggaaagcga aggagcggtg ggaaaggaat 2040 cccccgtagc tgccgtgccg tgagaggagg aggaggccgc ctgccgtgcc ggctcacgtc 2100 tgccgctccg ccacgcaatt tctggatgcc gacagcggag caagtccaac ggtggagcgg 2160 aactctcgag aggggtccag aggcagcgac agagatgccg tgccgtctgc ttcgcttggc 2220 ccgacgcgac gctgctggtt cgctggttgg tgtccgttag actcgtcgac ggcgtttaac 2280 aggctggcat tatctactcg aaacaagaaa aatgtttcct tagttttttt aatttcttaa 2340 agggtatttg tttaattttt agtcacttta ttttattcta ttttatatct aaattattaa 2400 ataaaaaaac taaaatagag ttttagtttt cttaatttag aggctaaaat agaataaaat 2460 agatgtacta aaaaaattag tctataaaaa ccattaaccc taaaccctaa atggatgtac 2520 taataaaatg gatgaagtat tatataggtg aagctatttg caaaaaaaaa ggagaacaca 2580
PL 222 498 B1 tgcacactaa accatgtcta agattatatt tcaaacaagt cattatctct tgttcgagta tttactgtgt gagttaatga cttatttgtt aaaaatgtgt tagttgtacc gcaaatgtta tatgtaattt tcatggattt attgacaaca caccaaaacc accctcatac ggggttgtac ctattacaga tgaacttcat caagcccacc tccagcccca ttacgatcta tgagaaggtt ctacgcagca ccttcccaag agagaaagac gcttcataaa atctaaggcc agactggcga tcaacatggt aagaccaaag tccattgccc acaaatgcca tggtcccaaa cacgtcttca atcccactat gacacgctcg tttctcctct gaaagctagc tgtatgctat agactagcta catccgacag tgttctttaa ggaggcgttt aggcctttgc gtttgcatct ggccatggga aaatgtcttg ccaccttacg tggtccacag cacttgctca gtttgagctc cagatcgatc taatttctgt catatatatg attctagagt ctagctgacc aatattcgtg tgtctctcgc agattgaaat aaaggaaaat atacttgtat ttatatttcc ttgtgcaaga gatctgct.ca aaaaaatgtc aaagataaaa actgttcatt attcgtagag gtgacaaaaa agagaggggc ttatggcatt tttttattcg atgatatggt gtgtgttgaa caaatcgtgg attatgctta ctgaatacaa tccagaatcc gtagttgagt tgcatcaatc tgaacctagc caactactac aaaggcagca ggcaagagca ccccaaagga aaagcaaaaa aaagagatct ggaaggaagt agcctcttca ggtctcatca aaggttaaag atatttctca ccaaggcaag atgcatggag acagttcata ggagcacgac ggctattgag agctatctgt tcattgcgat gatggacccc aagcaagtgg ccttcgcaag agcccccatt gtctcttgat ttcgtccaca cctgcaatcg gtaatctttc tctggctgaa tgaaagacgt ctttctttga tgctccacac tgatgattta gggcgcgcca aataagacgt gttgggggca atcagcaatg ccagaacaga cctaggaagg acatgcatct aaggtgttgg tcctgatatt ctagagaaac tagatttgaa tcttttttta cactggagaa tcacaaatag gtatatagct atctttgtat tgggctaaaa attcagtgtg aagctctgtg atatccccta ctgtagagtc tatatgattc taaagtttaa aaatatgtgg acgaccgggt gggaaaactg gttttcgcta ccttttgttc tttgaaatta cctctaatga ttcactaggc gtatgtcctc ttgtcagatt atgaaaatat tagggcatgc agttcagttg gtcgtgtata acaaacggtg gcagctgacg gaagctcaac gcccactgct cctttgcccc tcgaaggtga atttcagaaa agacgatcta atgcagtcaa agatcagaag taatagagat tctaagattc cagagtcttt actctggtct acttttcaac cacttcatcg aaaggaaagg cacccacgag attgatgtga acccttcctc taaatccccc ctgactaatc gttttttttt tggtgaactt tcgatgtaac cacatcatac cattttcatc atttaactaa atgtccattc gcttgactat gagatatcag tgaagtatgg cgttgtcaaa tgaacgaatt actctgatct tatacatata ttcattgctc gctggaaatt aaatcttcgt acacccaggg gtctcactcc ttctagagtc acagatcagg taaaatcaga agatttattg taagaagatg gaattgttga aaggaataga catctccggg gccacccaag ctgttgtcaa tctaaaacac atatatgtat taatttttta cacgctgcac tttttcttgt tcgaactgtg attctcaaat taagagatat ccgaagttaa aacaaatata ttgtgtttta ctaatcattg tttttaatgc gggggttaat ctcctctcag acggacctca ttcccggagt cgtatacaac tcaagcccaa cacgctagga ggagattaca aggtgacgac gaatgctgac cccgagtaac aagattcagg tactattcca tggagtctct aaatcgagga tacgactcaa actccaaaaa aaaggataat aaaggacagt ctatcattca gagcatcgtg catctccact tatataagga ctcgaggatc ttggtttatg cgatgaacag atgtctttta atcgtccagc gatattgagc agtatgatct ctcgttgagt gaattttacc gcgattgctt acggaccgac tttggcgceg tgcgggcgtc ggagattgtg cttccgtgct tgtttataat gtttttcctt aattaattaa tcgttatgtt gttttccaac ttataattat tagatcttgt agggtttatt atccaaccaa ttttggcaaa aaaataagta tttggcacaa ttctcttcaa tgcaacggcc aaactgctcc aatactcaat tgatattatt aaagatagat taacttagac tgcactagag accatttgtt aaatggaaat taatattatt gcaaacattt tatgaggagt ttttcagacc gacatttatg ctttataatt attttatgac taacccccga agacgaatcg tgccggtata tgcgcataag aagtcagcaa gagctttgcg accaaaaggc atggacgatt actatgttca ccacagatgg aatctccagg actaattgca gtatggacga aaaaaggtag tctaacagaa tgacaagaag tgtcaaagat ttcgggaaac agaaaaggaa agatctgcct gaaaaagaag gacgtaaggg agttcatttc aagtgcaaag attcgttgag tgccgcagtg tatccttcac actgctatta aaagatcgat aagaatgttg ggccctgttt gtgtttagca tcctggaccc tagtgaggcg aagtcatgga agcgggcaga actggaagag gctcttggtg tctttgtttc acaagtagtc ttaattgact tggttaggct tagctccaca tttatattag gttcaactct ttgggtatag ttttagtagc aaaaaatctg gcagaaaatt ttaaattcag aacaatttaa aggatattta ttaagtcctt tgtcctttag gtagtactat aaactgcact atgcaatgct tcgaccctag gtgcttgtaa ggatggagaa tgtt.ttt.tct tgttttgagt aaaacacttg tagaaaagct aactttcctt atagttatac ttgccaattg attccaatcc ggtattcaac tacgatgact aagtttgcca acagataggt aaggccctaa ccagcagtga tcctctatct ccactgataa ttagagaggc agatcaaata tcaagaacac ttcaaggctt ttcctactga ctcgccgtga aaaatcttcg acagtctcag ctcctcggat ggtggctcct ctgccgacag acgttccaac atgacgcaca atttggagag gtccgccttg taattttggg gcgctgatct taccatgaaa ccgtgtggtc ctatcttccc caacttgcaa ctcggacgta agggcgaaaa gtgcagctgc aactctggat cagactacct cattccggca gtgatattgt gtctgggtca ccctcttatt tcatacatgc tgccaagatc gatcaatgtt agatggtggg atcattttct cgttaaatca gtcaaagcta cgagttggtc aatatgcaaa aaaaaatgga tgtcaaggtt tcattcatct ttgtgcagta ataagcacat
2640
2700
2760
2820
2880
2940
3000
3060
3120
3180
3240
3300
3360
3420
3480
3540
3600
3660
3720
3780
3840
3900
3960
4020
4080
4140
4200
4260
4320
4380
4440
4500
4560
4620
4680
4740
4800
4860
4920
4980
5040
5100
5160
5220
5280
5340
5400
5460
5520
5580
5640
5700
5760
5320
5880
5940
6000
6060
6120
6180
6240
6300
6360
6420
6480
6540
6600
PL 222 498 B1 atggcattgt tttttatgaa attctaatcc atttatttga agtggagctc ctggtgagca tgatctgtgg caaccgtaag tattcaagac gatatgcgag aaaaacctga atatcacccg accctactac atagcgacat ccaattttaa ttcaaatttc aacgctcact ttgagtattg ggcggccggg ggccccaaat gggcgaattt actggecgtc ccttgcagca aatatatatg cgttttaagt ccaatccaaa aaaccagttc aaactgaccc agtgacaata accatgccgg gtggaggtag atttatccag acgcctatga gcatgtgtag ttactatcgt ttatatgtac ctatgataga aaaaagcggc aaaagtgccc gaagggaact gccgtccgct taaccgactt gaagtgcagg tgcgacaaca gttttacaac catccccctt tttgagtttt ttcactgtct ttgtaataaa aaattctttt agaccaccaa tcacctcttc aatgtctgcc tctgtccatg agttcgcctc tcgcatgata ctcagatcct atttttatga aatattaaaa gcgccacaat agaaccggtc caggggctag ccggttcccc ctaccgaaag gctgccccga tcaaaccttg tgtcgaggct gtcgtgactg tc agcgacaatt ttttttttcg cttcaattct aggctcacca gagcagcacg cagtcacaat cgctgacgcc acttcggcgc actagtgggt tttgctttca taccgccggt ataatattct tgaaaacaat aacaaacaat aaacctaaaa tatctacgac gccggcgcgc ttacgggcac gaattatgca acagtgaega cagcaggacc ggaaaaccct tttttaaaaa aattttaaat cctaattaac aaccttaaac gaagagatca ctccaattcg cgcatttgac caaaccatac ctagagtcct attctgttgt ttcggttcat ccgttcaatt atattgtgct tgcgttttat gactgattac acaccgagcg atgggtgaga cattcaaccc gcattttttt caaatcgttg tgcaggcatg ggcgttaccc cttttggtcc gtagcttcaa atcttaattc aattcaattc gagttctgtt ttcacattgc aacgtgcccc ttcaacgtct gctttaatga gcacgttgta tctaatgaat tactgattgt gaataggttt tattacaaat ataaatctta gcgaactaat ttccttgaag ggtccagcac ggtgtatgtg ggcgggtcca caagcttggc aacttaatcg
6660 6720 6780 6840 69 00 6960 7020 7080 7140 7200 7260 7320 7380 7440 7500 7560 7620 7680 7740 7800 7860 7920 7942 <210> 12 <211> 260 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> sekwencja wbudowanego fragmentu genu <400> 12 gaggcgaact ctggataaat gtcttgaata agacgttgaa catggacaga ctacctccac cttacggttg ggggcacgtt ggcagacatt ccggcatggt ccacagatca gcaatgtgaa gaagaggtga tattgtcact tgctcaccag aacagaactc ttggtggtct gggtcagttt
HvCKX2 w orientacji sens gtatggtttg gtcaaatgcg cgaattggag tgatctcttc gcgccgaagt ggcgtcagcg attgtgactg cgtgctgctc
120
180
240
260 <210> 13 <211> 8906 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> obszar T-DNA wektora pMCG/TaCKXl <400> 13 aattctatgt ttgacagctt atcatcggat ctagtaacat atttatccta gtttgcgcgc tatattttgt tttctatcgc ggactctaat cataaaaacc catctcataa ataacgtcat catgcttaac gtaattcaac agaaattata tgataatcat tcaatcttaa gaaactttat tgccaaatgt tgaacgatct tcggtgacgg gcaggaccgg acggggcggt accggcaggc cccacgtcat tatccgagcg acgctcttga agtcccgtcc gcgttgcgtg gcgacgagcc tcctgcggct cagaccgccg ctcatggtta tgagcatcga aaaatccaca ataaaacata gctgcatatg tagatcgata cagttccaaa acgaatgaac ctgtatatgc gccagttccc cctcgtgcat agccctgtgc gctggtggcg ccttccaggg agggatagcg cggtacggaa gcatgtccgc cttcctaatc caaaagaaac tatagctgct cttgtttatt ccatcatgta tttccatcca attaataaat gaccgcccaa atcagtaaaa gtgcttgaag gcgcacgctc ctccagggac gggggagacg gcccgcgtag ctcccgcaga gttgaccgtg ctcggtggca gatggatcct agtaccaagc gcatatgcca ataatagata tatgcatcag tcttaaactc acaccaggta ccacaccaca cccgcatcaa ccggccgccc gggtcgttgg ttcagcaggt tacacggtcg gcgatgccgg cggacgaggt cttgtctcga cggcggatgt ctagtgcaga aaataaatag tcatccaagt ggtactcaag taaaacccac gtaactatga gtttgaaaca tcatcacaac catgtatacc agatgacacc gtattaaatg gcattacatg cgcaagaccg gcaggtcgac tgaagtccag gcagcatgcc gcagcccgat gggtgtagag actcggccgt cgacctcgcc cgtccgtcca tgtagtggtt cggccgggcg agtaacacca cgtatgaagg atatcaagat gttagagcat atcaacatgt agatgtatga gtattctact caagcgaaca tatcctagat gcgcgcgata tataattgcg ttaattatta gcaacaggat ggatcagatc ctgccagaaa gcggggggca gacagcgacc cgtggagccc ccagtcgtag gtccacctcg ctcctgcggt gacgatggtg tcgttctggg aacaacaggg cagggctaaa caaaataatt atgaatagat atacctatcc cacacacata ccgatctaga aaaagcatct cgatatttcc
120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 13 80
PL 222 498 B1 atccatcatc taataaatcc ccagaccaca gtgcacggca aaaaaatcat agagaaacac cgaacgctag agaactaccg gggggggagg atctggttgt gggtgtctat cccccgtagc tgccgctccg aactctcgag ccgacgcgac aggctggcat agggtatttg ataaaaaaac agatgtacta taataaaatg tgcacactaa accatgtcta agattatatt tcaaacaagt cattatctct tgttcgagta tttactgtgt gagttaatga cttatttgtt aaaaatgtgt tagttgtacc gcaaatgtta tatgtaattt tcatggattt attgacaaca caccaaaacc accctcatac ggggttgtac ctattacaga tgaacttcat caagcccacc tccagcccca ttacgatcta tgagaaggtt ctacgcagca ccttcccaag agagaaagac gcttcataaa atctaaggcc agactggcga tcaacatggt aagaccaaag tccattgccc acaaatgcca tggtcccaaa cacgtcttca atcccactat gacacgctcg tttctcctct gaaagctagc tgtatgctat agactagcta catccgacag tgttctttaa ggaggcgttt aggcctttgc gtttgcatct ttcaattcgt accaggtagt tcatcacaac tatattgaaa gaaatcgatc tggcaagtta cagcacggat ggccctaacc acgagcggcg gtgtgtgtgc ttattacggc tgccgtgccg ccacgcaatt aggggtccag gctgctggtt tatctactcg tttaattttt taaaatagag aaaaaattag gatgaagtat aaagataaaa actgttcatt attcgtagag gtgacaaaaa agagaggggc ttatggcatt tttttattcg atgatatggt gtgtgttgaa caaatcgtgg attatgctta ctgaatacaa tccagaatcc gtagttgagt tgcatcaatc tgaacctagc caactactac aaaggcagca ggcaagagca ccccaaagga aaagcaaaaa aaagagatct ggaaggaagt agcctcttca ggtctcatca aaggttaaag atatttctca ccaaggcaag atgcatggag acagttcata ggagcacgac ggctattgag agctatctgt tcattgcgat gatggacccc aagcaagtgg ccttcgcaag agcccccatt gtctcttgat ttcgtccaca cctgcaatcg gtaatctttc tctggctgaa tgaaagacgt ctttctttga tgctccacac tgatgattta aactatgaat ttgaaacaga caagacaaaa taaaggaaaa ccgtctgcgg gcaatcagaa ctaacacaaa atggaccgga taccttgaag gctccgaaca gggcgaggaa tgagaggagg tctggatgcc aggcagcgac cgctggttgg aaacaagaaa agtcacttta ttttagtttt tctataaaaa tatataggtg ctgtagagtc tatatgattc taaagtttaa aaatatgtgg acgaccgggt gggaaaactg gttttcgcta ccttttgttc tttgaaatta cctctaatga ttcactaggc gtatgtcctc ttgtcagatt atgaaaatat tagggcatgc agttcagttg gtcgtgtata acaaacggtg gcagctgacg gaagctcaac gcccactgct cctttgcccc tcgaaggtga atttcagaaa agacgatcta atgcagtcaa agatcagaag taatagagat tctaagattc cagagtcttt actctggtct acttttcaac cacttcatcg aaaggaaagg cacccacgag attgatgtga acccttcctc taaatccccc ctgactaatc gttttttttt tggtgaactt tcgatgtaac cacatcatac cattttcatc atttaactaa atgtccattc gcttgactat atgtatggca attctactcc aaaagcatga gggcaaacca aacggctaga cgtgtctgac cacggatcta acgccgatct cggaggtgcc acacgaggtt gggaaagcga aggaggccgc gacagcggag agagatgccg tgtccgttag aatgtttcct ttttattcta cttaatttag ccattaaccc aagctatttg ctgttgtcaa tctaaaacac atatatgtat taatttttta cacgctgcac tttttcttgt tcgaactgtg attctcaaat taagagatat ccgaagttaa aacaaatata ttgtgtttta ctaatcattg tttttaatgc gggggttaat ctcctctcag acggacctca ttcccggagt cgtatacaac tcaagcccaa cacgctagga ggagattaca aggtgacgac gaatgctgac cccgagtaac aagattcagg tactattcca tggagtctct aaatcgagga tacgactcaa actccaaaaa aaaggataat aaaggacagt ctatcattca gagcatcgtg catctccact tatataagga ctcgaggatc ttggtttatg cgatgaacag atgtctttta atcgtccagc gatattgagc agtatgatct ctcgttgagt gaattttacc gcgattgctt cacacataca gatctagaac aaagatgacc aaccctatgc gccatcccag gtacaggtcg acacaaacat agagaaggta gacgggtgga ggggaaagag aggagcggtg ctgccgtgcc caagtccaac tgccgtctgc actcgtcgac tagttttttt ttttatatct aggctaaaat taaaccctaa caaaaaaaaa aatactcaat tgatattatt aaagatagat taacttagac tgcactagag accatttgtt aaatggaaat taatattatt gcaaacattt tatgaggagt ttttcagacc gacatttatg ctttataatt attttatgac taacccccga agacgaatcg tgccggtata tgcgcataag aagtcagcaa gagctttgcg accaaaaggc atggacgatt actatgttca ccacagatgg aatctccagg actaattgca gtatggacga aaaaaggtag tctaacagaa tgacaagaag tgtcaaagat ttcgggaaac agaaaaggaa agatctgcct gaaaaagaag gacgtaaggg agttcatttc aagtgcaaag attcgttgag tgccgcagtg tatccttcac actgctatta aaagatcgat aagaatgttg ggccctgttt gtgtttagca tcctggaccc gatccaaaat gaccgcccaa cgacaaacaa aacgaaacaa gattccccaa catccgtgta gaacagaagt gagagggggg tttgggggag ggtgtggagg ggaaaggaat ggctcacgtc ggtggagcgg ttcgcttggc ggcgtttaac aatttcttaa aaattattaa agaataaaat atggatgtac ggagaacaca tgtcctttag gtagtactat aaactgcact atgcaatgct tcgaccctag gtgcttgtaa ggatggagaa tgttttttct tgttttgagt aaaacacttg tagaaaagct aactttcctt atagttatac ttgccaattg attccaatcc ggtattcaac tacgatgact aagtttgcca acagataggt aaggccctaa ccagcagtga tcctctatct ccactgataa ttagagaggc agatcaaata tcaagaacac ttcaaggctt ttcctactga ctcgccgtga aaaatcttcg acagtctcag ctcctcggat ggtggctcct ctgccgacag acgttccaac atgacgcaca atttggagag gtccgccttg taattttggg gcgctgatct taccatgaaa ccgtgtggtc ctatcttccc caacttgcaa ctcggacgta agggcgaaaa gtgcagctgc
1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5 2 80 53 40 5400
PL 222 498 B1 ggccatggga gcgggttctt ctaccaccgt tggaccagga tgcgggacgc acaagatcgg gcatcgccga ggcctctcgt gcatgcatgc gtttcaggtg tgtcgctgcc agatactgcg cggcccacgg aggacaagta acatatatgt attgctcgtt ggaaattaat tcttcgttcg cccaggggtt tcactcctta tagagtctag gatcaggagg aatcagaatc tttattgttt gaagatgaaa ttgttgattt gaatagattc ctccgggtgc acccaagaaa gagttttagc actgtctttt taataaactt ttcttttagg acccggggat ccacgaagcg gcgccaggta tctgcgcctc agaacacctc cgagccagtg gatggacgcg tgtcggtgcc ggggcacgag ccccctcctc cgtgcccctc cggccgtggc tcgccgcggc tcctcacccg ctatgatcgc gtgtagctca tatcgtattt atgtacaata gatagagcgc agcggcagaa gtgccccagg ggaactccgg tccgctctac cgacttgctg tgcaggtcaa acaacatgtc gggcgcgcca caccgacgcc gtacgtcatc gctcagctcg gtcgtacctg gctgtggcgt cttcgaccgc cgtctacccg gatcctgcat ggacgacggc cttctcgtcg gttctgcgac cgactgggtc cgaccccaag ttataattct tttccttaca taattaatta ttatgtttgg ttccaactag taattatttt atcttgtgtt gtttattttg caaccaattt tggcaaaaaa ataagtagca ggcacaatta tcttcaaaac aacggccagg ctgctcctta gacaattttt tttttcgaat caattctcct ctcaccaaac gtcctggcct ctgccacttg ctccttgtac cagccgcttc ctccgctggc tcagttaagt tagtgcgtac ctggaggatg cacgatgagc gccgtgcacc ctcgtgcctc gctgtcgtag gacggccacg gcggccacta atgatatttg gatccttacc ttatgaataa ttaaaatgaa cacaataaca ccggtcaaac ggctagtatc ttccccgccg cgaaagttac ccccgagaat accttgacag gaggctcagc gagatatcag gacgtcgcca gagacgacgc gtgctggcga gagttcctgg gtcccgcacc ggcgtcttca ctcaacaaat ggtatgtatc atgtcggcgg gtggccaacg ctcgccgggg cggcacttcg aggctgctct ttgtttcccc agtagtctca attgacttgc ttaggctgat ctccacaaga atattagatc caactctcgt ggtataggtc tagtagccga aaatctgaat gaaaattaaa aattcagtgt aatttaatca atatttattg agtccttata ttaaaaactt tttaaatgta aattaacatc cttaaacaat ggggagagca ccgccgaagt cctaccccgg aggtcgttgg gtcaccgccg gcgtgataca ttggatttgt cccttgaaga caagggtgcg cggtccagga agcgtcgcca ttgagcgtcg atcctggcga gtgggtctag ctttcaattc gccggtttcg tattctccgt aacaatatat aacaattgcg ctaaaagact tacgacacac gcgcgcatgg gggcaccatt tatgcagcat tgacgacaaa aggacc acggaccggg ggatcgtggc tcaactacga cgctgaggca accgggtgca cttggctcat agggcatcct ccaagtacgc acgcacttaa tgacgccagc acctgaagcg tagggtacaa gcggcaagtg ccccaggcca tcttattcag tacatgctaa caagatccat caatgttatt tggtgggcta attttctaat taaatcatgt aaagctaaga gttggtcaaa atgcaaaata aaatggatta caaggttttg ttcatctgat tgcagtaaaa agcacatatg ttggtccttt gcttcaaatt ttaattcatt tcaattcagt gcctcttggg gccggaccca cgaggtcgca ccaccgacga acatgccgtc taccatgcag tgagcgggta cgccgcggtc ggacacgcca actccaggta gcaccgagct tctcgatgac cgtcggcgtc agtcctgctt tgttgtgcac gttcattcta tcaatttact tgtgctgaat ttttattatt gattacataa cgagcggcga gtgagattcc caacccggtc ttttttggtg tcgttgggcg ccgccgggtg cgtcgccgcg cagcgccacg cgaggagggg cggcgaggag cgtgctcgtg ccagggcacc actacgcgtc ctgacactgg ggaggaggtg gctggaggcg ggagtacctg gcagcgcttc ggacatccct atcgatcaca tttctgtaag atatatgtcc ctagagtcta gctgacctag attcgtgtct ctctcgccac ttgaaattca ggaaaatgta cttgtatatc tatttcctgg tgcaagaatt ctgctcaaag aaatgtcata gcattgtaat ttatgaacgt ctaatcccca tatttgaaaa ggagctcaga gtcgtacttg gtcgccgtgg gaaccgcagt gaagggcagc gtcccacctg gatcgcatgc gacgacgaga gaagtcggcg cagcccgatc cgacgcgtcc gagctcctgg gtacacggtg ggtgaagaac taatgagata gttgtaaaaa atgaatatat gattgtaccc aggtttatag acaaatccaa atcttattca actaataacg ttgaagttga cagcacggcg tatgtgggcc ggtccagggc aggaactcgg gcgaggaacg gccgcgtccg cacgcgttcg ggggcgctgg ccccgctccc gacatcgccg catcgtgcat ctcggtcgtg ttctacgcgg cagaaccaga gcgcactaca gtggagatga aggaaggtat tgcatctttc gtgttgggct tgatattaaa gagaaacaca atttgaagtc ttttttattc tggagaaaca caaatagtaa tatagctaga tttgtattaa gctaaaagaa cagtgtgaag ctctgtgcat tcccctagcc atatatgttt tttaagtttc atccaaattg ccagttcaaa gcgatcgcag tccttcatct gccgtgtagt atcttctggt gacaccgcgt aaaccacgac atgcatgcac ggcccggcga atgcgggagc ttgtccagcg cgcacgaacg tccacggacg gtagcgttcc ccgcccgagt tgcgagacgc acctgagcat cacccgttac tactacttat cgacatctat ttttaaaaaa aatttcaaaa ctcactgaag gtattggccg gccgggtaac ccaaatgaag gaattttgcg
5460
5520
5580
5640
5700
5760
5820
5880
5940
6000
6060
6120
6180
6240
6300
6360
6420
6480
6540
6600
6660
6720
6780
6840
6900
6960
7020
7080
7140
7200
7260
7320
7380
7440
7500
7560
7620
7680
7740
7800
7860
7920
7980
8040
8100
8160
8220
8280
8340
8400
8460
8520
8580
8640
8700
8760
8820
8880
8906 <210> 14 <211> 741 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> sekwencja wbudowanego fragmentu genu <400> 14
TaCKXl w orientacji sens
PL 222 498 B1 tgaggaactc cggcgaggaa cggccgcgtc ggcacgcgtt agggggcgct tgccccgctc ccgacatcgc tccatcgtgc ggctcggtcg tgttctacgc cgcagaacca tggcgcacta tcgtggagat gggcgggttc cgctaccace cgtggaccag cgtgcgggac ggacaagatc ccgcatcgcc cgggcctctc atgcatgcat tggtttcagg ggtgtcgctg gaagatactg cacggcccac gaaggacaag ttcaccgacg gtgtacgtca gagctcagct gcgtcgtacc gggctgtggc gacttcgacc gtcgtctacc gcgatcctgc tgggacgacg cccttctcgt cggttctgcg ggcgactggg t
ccgacgtcgc tcgagacgac cggtgctggc tggagttcct gtgtcccgca gcggcgtctt cgctcaacaa atggtatgta gcatgtcggc cggtggccaa acctcgccgg tccggcactt caggatcgtg gctcaactac gacgctgagg ggaccgggtg cccttggctc caagggcatc atccaagtac tcacgcactt ggtgacgcca cgacctgaag ggtagggtac cggcggcaag gccgtcgccg gacagcgcca cacgaggagg cacggcgagg atcgtgctcg ctccagggca gcactacgcg aactgacact gcggaggagg cggctggagg aaggagtacc tggcagcgct
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
741 <210>
<211>
<212>
DNA <213> artificial sequence <220>
<223> primer CKX2s <400> 15 ttcggaccga ctagtgaggc gaactctgga taaatg <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
DNA artificial sequence
CKX2a ttcctaggga gctcaaactg acccagacca ccaaga <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
DNA artificial primer HCV-F 17 seguence ttcggaccga ctagtatccc tggctcaacg tgctcgt <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
DNA artificial sequence primer HCV-R 18 ttcctaggga gctcagttga agatgtcttg gcccggg <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
ttcggaccga ctagttgagg aactcgggcg ggttctt
DNA artificial sequence primer TAC-F <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
DNA artificial sequence primer TAC-R 20 ttcctaggcc cgggacttgt ccttcatctc cacgaag
PL 222 498 B1
PL 222 498 B1
PL 222 498 B1
Claims (7)
- Zastrzeżenia patentowe1. Kaseta DNA do zwiększania produktywności roślin zbożowych i/lub masy korzenia roślin zbożowych poprzez obniżanie ekspresji genów CKX, składająca się z następujących elementów:a. promotora ekspresji,b. fragmentu DNA pochodzącego z części kodującej lub niekodującej genu zbożowej oksydazy cyt koniny CKX w orientacji sens,c. intronu,d. fragmentu DNA pochodzącego z części kodującej lub niekodującej genu zbożowej oksydazy cytokininy CKX w orientacji antysens oraze. terminatora transkrypcji 3', przy czym roślina zbożowa została wybrana z grupy obejmującej: pszenicę, jęczmień, żyto, owies lub kukurydzę, przy czym gen zbożowej oksydazy cytokininy jest wybrany spośród genów ulegających ekspresji w rozwijającym się kłosie i/lub korzeniu, korzystnie z grupy obejmującej geny: XvCKX lub TaCKX, przy czym ekspresja rzeczonej kasety prowadzi do powstania hpRNA, a następnie siRNA ukierunk owanego na wyciszenie ekspresji co najmniej jednego spośród genów CKX.
- 2. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera fragment genu oksydazy cytokininy CKX posiadający sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej: sekwencję 1, sekwencję 3, sekwencję 4, sekwencję 5 lub ich fragment.
- 3. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja 6 albo sekwencja 8.
- 4. Wektor binarny zawierający kasetę DNA określoną w zastrz. od 1 do 3.
- 5. Szczep A. tumefaciens zawierający wektor binarny jak określono w zastrz. 4.
- 6. Sposób otrzymywania rośliny zbożowej o zwiększonej produktywności, znamienny tym, że:a) otrzymuje się kasetę DNA obniżającą ekspresję genów CKX określoną w zastrz. od 1 do 3, przy czym umieszcza się ją pod kontrolą promotora aktywnego w modyfikowanej komórce,b) wprowadza się otrzymaną kasetę DNA do genomu komórki rośliny zbożowej,c) z otrzymanej komórki uzyskuje się roślinę zbożową o zwiększonej produktywności i/lubd) z otrzymanej komórki uzyskuje się roślinę zbożową o zwiększonej masie korzenia, przy czym roślina zbożowa została wybrana z grupy obejmującej: pszenicę, jęczmień, żyto, owies lub kukurydzę.
- 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w etapie b) transformację komórki rośliny zbożowej prowadzi się za pomocą szczepu A. tumefaciens zawierającego wektor binarny jak określono w zastrz. 4.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL388118A PL222498B1 (pl) | 2009-05-27 | 2009-05-27 | Kaseta DNA, wektor binarny, szczep A. tumefaciens oraz sposób otrzymywania rośliny zbożowej o zwiększonej produktywności |
| US13/322,299 US20120102600A1 (en) | 2009-05-27 | 2010-05-27 | DNA Cassette, Binary Vector, and Strain of A. Tumefaciens and a Method of Producing Cereal Plant of Increased Productivity and/or Root Mass |
| PCT/PL2010/050019 WO2010138011A1 (en) | 2009-05-27 | 2010-05-27 | A dna cassette, binary vector, and strain of a. tumefaciens and a method of producing cereal plant of increased productivity and/or root mass |
| AU2010253552A AU2010253552B2 (en) | 2009-05-27 | 2010-05-27 | A DNA cassette, binary vector, and strain of A. tumefaciens and a method of producing cereal plant of increased productivity and/or root mass |
| CA2762556A CA2762556C (en) | 2009-05-27 | 2010-05-27 | A dna cassette, binary vector, and strain of a. tumefaciens and a method of producing cereal plant of increased productivity and/or root mass |
| EP10734580.3A EP2435574B1 (en) | 2009-05-27 | 2010-05-27 | A dna cassette, binary vector, and strain of a. tumefaciens and a method of producing cereal plant of increased productivity and/or root mass |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL388118A PL222498B1 (pl) | 2009-05-27 | 2009-05-27 | Kaseta DNA, wektor binarny, szczep A. tumefaciens oraz sposób otrzymywania rośliny zbożowej o zwiększonej produktywności |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL388118A1 PL388118A1 (pl) | 2010-12-06 |
| PL222498B1 true PL222498B1 (pl) | 2016-08-31 |
Family
ID=42668640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL388118A PL222498B1 (pl) | 2009-05-27 | 2009-05-27 | Kaseta DNA, wektor binarny, szczep A. tumefaciens oraz sposób otrzymywania rośliny zbożowej o zwiększonej produktywności |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20120102600A1 (pl) |
| EP (1) | EP2435574B1 (pl) |
| AU (1) | AU2010253552B2 (pl) |
| CA (1) | CA2762556C (pl) |
| PL (1) | PL222498B1 (pl) |
| WO (1) | WO2010138011A1 (pl) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10883113B2 (en) | 2015-08-28 | 2021-01-05 | The Curators Of The University Of Missouri | Increasing plant oil content by altering a negative regulator of acetyl-coa carboxylase |
| WO2018009626A2 (en) * | 2016-07-07 | 2018-01-11 | The Curators Of The University Of Missouri | Increasing plant oil content by improving activity of acetyl-coa carboxylase |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7468475B2 (en) * | 2000-06-16 | 2008-12-23 | Schmuelling Thomas | Method for modifying plant morphology, biochemistry and physiology |
| AU2002361037B2 (en) | 2001-12-10 | 2008-05-08 | Thomas Schmulling | Method for modifying plant morphology, biochemistry and physiology comprising expression of plant cytokinin oxidase |
| JP4448031B2 (ja) * | 2002-11-13 | 2010-04-07 | 本田技研工業株式会社 | 穀物の収量を増加させる遺伝子、並びにその利用 |
| MXPA06011360A (es) * | 2004-04-02 | 2007-03-29 | Pioneer Hi Bred Int | Secuencias de citoquinina oxidasa y metodos de uso de las mismas. |
| US7820882B2 (en) * | 2005-05-12 | 2010-10-26 | The Regents Of The University Of California | NAC from wheat for increasing grain protein content |
-
2009
- 2009-05-27 PL PL388118A patent/PL222498B1/pl unknown
-
2010
- 2010-05-27 EP EP10734580.3A patent/EP2435574B1/en not_active Not-in-force
- 2010-05-27 AU AU2010253552A patent/AU2010253552B2/en not_active Ceased
- 2010-05-27 US US13/322,299 patent/US20120102600A1/en not_active Abandoned
- 2010-05-27 CA CA2762556A patent/CA2762556C/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-05-27 WO PCT/PL2010/050019 patent/WO2010138011A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2010253552A1 (en) | 2011-12-08 |
| CA2762556C (en) | 2017-04-11 |
| US20120102600A1 (en) | 2012-04-26 |
| EP2435574B1 (en) | 2015-07-15 |
| PL388118A1 (pl) | 2010-12-06 |
| AU2010253552B2 (en) | 2016-01-28 |
| EP2435574A1 (en) | 2012-04-04 |
| CA2762556A1 (en) | 2010-12-02 |
| WO2010138011A1 (en) | 2010-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lelivelt et al. | Stable plastid transformation in lettuce (Lactuca sativa L.) | |
| ES2262514T3 (es) | Plantas resistentes a herbicidas. | |
| US8653325B2 (en) | Increased seed size and seed number through transgenic over expression of revoluta protein during early embryo development | |
| Anuradha et al. | Genetic transformation of peanut (Arachis hypogaea L.) using cotyledonary node as explant and a promoterless gus:: npt II fusion gene based vector | |
| KR20120107476A (ko) | 우량 이벤트 ｅｅ－ｇｍ３, 그리고 생물학적 시료에서 이러한 이벤트를 동정하기 위한 방법 및 키트 | |
| EP2687085B1 (en) | Acetyl-coa carboxylase herbicide resistant sorghum | |
| Kuluev et al. | Morphological and physiological characteristics of transgenic tobacco plants expressing expansin genes: AtEXP10 from Arabidopsis and PnEXPA1 from poplar | |
| CN113874388A (zh) | 孤雌生殖基因 | |
| Reddy et al. | Analysis of chloroplast transformed tobacco plants with cry 1Ia5 under rice psbA transcriptional elements reveal high level expression of Bt toxin without imposing yield penalty and stable inheritance of transplastome | |
| CN110643589B (zh) | 一种提高植物抗旱性的蛋白及其应用 | |
| WO2019129145A1 (en) | Flowering time-regulating gene cmp1 and related constructs and applications thereof | |
| WO2010138328A2 (en) | Light-regulated promoters | |
| CN101874116A (zh) | 具有增强的产量相关性状的植物及其生产方法 | |
| WO2021003592A1 (en) | Sterile genes and related constructs and applications thereof | |
| PL222498B1 (pl) | Kaseta DNA, wektor binarny, szczep A. tumefaciens oraz sposób otrzymywania rośliny zbożowej o zwiększonej produktywności | |
| CN112430684B (zh) | 一种用于检测水稻植物h23的核酸序列及其检测方法 | |
| JP4814686B2 (ja) | 雌雄配偶子形成不全植物の作成方法 | |
| CN110959043A (zh) | 利用bcs1l基因和向导rna/cas核酸内切酶系统改良植物农艺性状的方法 | |
| CN113416747B (zh) | 一种创建温度敏感型雄性不育植物的方法 | |
| RU2235778C2 (ru) | Выделенный полинуклеотид, способный придавать растению устойчивость или толерантность к глифосатному гербициду, вектор, способ получения растений, толерантных или устойчивых к глифосатному гербициду, способ регенерации трансформированного растения и способ селективной борьбы с сорняками | |
| AU2012244097A1 (en) | Increased seed size and seed number through transgenic over expression of a growth and/or development related gene during early embryo development | |
| CN103890182A (zh) | 具有增强的产量相关性状的植物和其生产方法 | |
| KR20110090349A (ko) | 식물성장 촉진용 유전자 및 그 유전자를 포함하는 형질전환 식물 | |
| JP2003199582A (ja) | 植物由来のプロモーター | |
| JPH11164688A (ja) | 植物形態の制御方法、該方法により得られた植物、果実及び種子 |