MXPA06011360A - Secuencias de citoquinina oxidasa y metodos de uso de las mismas. - Google Patents

Secuencias de citoquinina oxidasa y metodos de uso de las mismas.

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Abstract

Metodos y composiciones para la modulacion del desarrollo vegetal. Se proveen secuencias de polinucleotidos y secuencias de aminoacidos que codifican polipeptidos de citoquinina oxidasa. Las secuencias se pueden usar en diversos metodos incluyendo la modulacion del desarrollo radicular, la modulacion del desarrollo floral, la modulacion del desarrollo de hojas y/o brotes, la modulacion del tamano y/o del peso de las semillas, la modulacion de la tolerancia bajo estres abiotico y la modulacion de la resistencia a patogenos. Tambien se proveen polinucleotidos que comprenden promotores CKX. Los promotores se pueden usar para regular la expresion de una secuencia de interes. Se proveen tambien plantas, celulas vegetales, tejidos y semillas transformadas.

Description

SECUENCIAS DE CITOQUININA OXIDASA Y MÉTODOS DE USO DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el campo de la manipulación genética de plantas, en particular con la modulación de la actividad genética y el desarrollo en plantas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las citoquininas constituyen una clase de hormonas vegetales derivadas de purinas sustituidas en N6 que regulan la división celular, así como un gran número de eventos del desarrollo, tal como el desarrollo de brotes, la ramificación de las raíces, el control de la dominancia apical en los brotes, el desarrollo de hojas, el desarrollo de cloroplastos y la senescencia de las hojas (Mo ef al. (1994) Cytokinins. Chemistry, Action and Function. CRC Press, Boca Ratón, FLA, págs. 155-166). La enzima catabólica, citoquinina oxidasa (CKX), cumple una importante función en el control de los niveles de citoquinina en los tejidos vegetales, y se ha encontrado actividad CKX en muchos de los tejidos de las plantas. La enzima CKX es una oxidorreductasa que contiene FAD y que cataliza la degradación de citoquininas que contienen cadenas laterales de isoprenoides insaturados. Las enzimas CKX inactivan de forma irreversible a la mayoría de las citoquininas por clivaje de la cadena lateral isoprenoide del anillo adenina (Armstrong et al. (1994). Cytokinins. Chemistry, Action and Function. CRC Press, Boca Ratón, FLA, págs. 139-154). En vista del efecto de las citoquininas sobre una gran variedad de procesos del desarrollo vegetal, incluyendo la arquitectura radicular, el desarrollo de brotes y de hojas, y la formación de semillas, la capacidad para manipular los niveles de citoquinina en las células de plantas superiores, y de esa manera afectar el crecimiento y la productividad de las plantas, es de un gran valor comercial.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Las composiciones de la invención incluyen polipéptidos y polinucleótidos de la citoquinina oxidasa (CKX) que están comprometidos en la modulación del desarrollo, la morfología y la fisiología de plantas. Las composiciones incluyen polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por: (a) la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID N°: 3, 6, 10, 14 ó 53; (b) la secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 60% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 3, 6, , 14 ó 53, donde dicho polipéptido posee actividad citoquinina oxidasa; (c) la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de la SEQ ID N°: 2, 5, 9, 11 , 54 ó 55, donde dichas condiciones severas comprenden una hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,1X a 60-65 °C; y (d) la secuencia de aminoácidos que comprende al menos 20 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N°: 3, 6, 10, 14 ó 53, donde dicho polipéptido retiene la actividad citoquinina oxidasa. Las composiciones incluyen además polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: (a) una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N°: 1 , 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11 , 51 , 52, 54 ó 55; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID N°: 3, 6, 10, 14 ó 53; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 60% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 1 , 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11 , 51 , 52, 54 ó 55, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que posee actividad citoquinina oxidasa; (d) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID N°: 1 , 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11 , 51 , 52, 54 ó 55 o un complemento de la misma; y (e) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de una secuencia de nucleótidos de a), donde dichas condiciones severas comprenden hibridación en formamida 50%, NaC1 1 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,1X a 60-65 °C. Las composiciones también incluyen plantas que comprenden un polipéptido CKX de la invención ligado operativamente a un promotor que dirige la expresión en dichas plantas. Las plantas de la invención pueden presentar un nivel de citoquinina modulado en comparación con una planta control. En algunas plantas, el nivel de citoquinina es modulado en un tejido vegetativo, en un tejido reproductor o en un tejido vegetativo y un tejido reproductor. Las plantas de la invención pueden presentar al menos uno de los siguientes fenotipos: desarrollo floral modulado, tiempo de floración modulado, desarrollo radicular modulado, una relación de brotes a raíces alterada, un tamaño de semilla incrementado y/o un peso de semilla incrementado, un mayor rendimiento y/o vigor de la planta, una tolerancia al estrés incrementada o conservada o una disminución en el crecimiento de los brotes, en comparación con una planta control. Las composiciones incluyen además plantas que han sido modificadas genéticamente en un locus genómico, donde dicho locus genómico codifica un polipéptido CKX de la invención. Se proveen métodos para incrementar el nivel o la actividad de un polipéptido CKX en una planta lo cual puede disminuir el nivel de citoquinina en dicha planta. El método puede comprender la introducción en la planta de un polinucleótido CKX de la invención. En determinados métodos, se aumenta la actividad del polipéptido CKX en un tejido vegetativo, un tejido reproductor o en un tejido vegetativo y un tejido reproductor. En determinadas realizaciones, el incremento en la actividad del polipéptido CKX modula el desarrollo radicular, altera la relación de brotes a raíces y/o modula el desarrollo floral. También se proveen métodos para reducir o eliminar el nivel de un polipéptido CKX en una planta. El método puede comprender la introducción en dicha planta de un polinucleótido CKX de la invención usando técnicas para lograr una subsensibilización. La reducción del nivel o de la actividad del polipéptido CKX puede incrementar el nivel de una citoquinina en la planta. Se reduce o elimina el nivel o la actividad del polipéptido en un tejido vegetativo, en un tejido reproductor o en un tejido vegetativo y un tejido reproductor. En otros métodos, la reducción del nivel y/o de la actividad del polipéptido CKX conserva o mejora la tolerancia al estrés de la planta, incrementa el tamaño de semilla y/o el peso de semilla, incrementa el crecimiento de los brotes de la planta y/o demora la senescencia de las hojas. Se proveen asimismo métodos y composiciones para regular la expresión genética en una planta. Se proveen polinucleótidos que comprenden secuencias promotoras. Las composiciones incluyen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: (a) una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N°: 15, 16, 17 ó 18; (b) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 60% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 15, 16, 17 ó 18, donde dicho polinucleótido retiene la capacidad para regular la transcripción; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID N°: 15, 16, 17 ó 18, donde dicho polinucleótido retiene la capacidad para regular la transcripción; y (d) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de la secuencia de nucleótidos de a), donde dichas condiciones severas comprenden una hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 0,1X a 60-65 °C, donde dicha secuencia retiene la capacidad para regular la transcripción. Las composiciones incluyen además plantas y semillas que contienen una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de interés ligada operativamente a un promotor CKX de la invención. En realizaciones específicas, la construcción de ADN se integra de forma estable en el genoma de la planta. También se proveen métodos para regular la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés. El método comprende introducir en una planta una secuencia de nucleótidos de interés ligada operativamente a un promotor CKX de la invención. DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La Figura 1A-C provee una alineación de aminoácidos de ZmCkxl (SEQ ID N°: 33), ZmCkx2 (SEQ ID N°: 3), ZmCkx3 (SEQ ID N°: 6), ZmCkx4 (SEQ ID N°: 9), ZmCkxd (SEQ ID N°: 12) y ZmCkx6 (SEQ ID N°: 53). También se provee una secuencia consenso (SEQ ID N°: 34). La alineación se generó con AlignX del grupo VNTI usando la matriz blosum62mt2, una penalidad por apertura del hueco (gap) de 10 y una penalidad por extensión del hueco (gap) de 0,05, un rango de penalidad de separación del hueco (gap) de 8 y un % de identidad para un retardo de alineación de 40. La Figura 2A-F provee la alineación de aminoácidos de AtCkxl (SEQ ID N°: 35), AtCkx2 (SEQ ID N°: 36), AtCkx3 (SEQ ID N°: 37), AtCkx4 (SEQ ID N°: 38), AtCkxd (SEQ ID N°: 39), AtCkx6 (SEQ ID N°: 40), AtCkx7 (SEQ ID N°: 41), DsCkxl (SEQ ID N°: 42), HvCkx2 (SEQ ID N°: 43), HvCkx3 (SEQ ID N°: 44), OsCkxl (SEQ ID N°: 45), OsCkx2 (SEQ ID N°: 46), OsCkx3 (SEQ ID N°: 47), OsCkx4 (SEQ ID N°: 48), OsCkxd (SEQ ID N°: 49), ZmCkxl (SEQ ID N°: 33), ZmCkx2 (SEQ ID N°: 3), ZmCkx3 (SEQ ID N°: 6), ZmCkx4 (SEQ ID N°: 10) y ZmCkxd (SEQ ID N°: 14). Se provee una secuencia consenso en la SEQ ID N°: 50. La alineación se efectuó usando Clustal W. La Figura 3 provee un resumen del perfil de expresión para ZmCkx2 en diferentes tejidos de maíz usando la base de datos Lynx de Pioneer. Los mayores niveles de expresión de ZmCkx2 se encontraron en hojas, tallos, verticilos, raíces y plántulas. La Figura 4 provee un análisis de la base de datos comercial Lynx para la expresión de ZmCkx3, ZmCkx4 y ZmCkxd. Los datos demuestran que ZmCkx4 presenta una expresión constitutiva baja en la mayoría de los órganos, observándose mayores niveles en espiga, estilo y haces vasculares, así como niveles intermedios en hojas y pedicelos. Se observó expresión de ZmCkx3 en raíces. La expresión de ZmCkxd era mayor en raíces y en los haces vasculares.
La Figura d provee un esquema de diversas inserciones Mu en ZmCkx2 y ZmCkx4. La Figura 6 provee datos sobre el número de brotes formados en callos de maíz transgénico Ubi:ZmCkx2 y control durante el proceso de regeneración. La Figura 7 provee datos sobre las características fenotípicas de plantas de maíz transgénicas Ubi:ZmCkx2 y control. La Figura 8A muestra el nivel de la actividad citoquinina oxidasa en raíces producida por callos que expresan Ubi-ZmCkx2 en comparación con raíces producidas por callos control. La Figura 8B muestra el nivel de la actividad citoquinina oxidasa en hojas de plantas transgénicas que expresan Ubi-ZmCkx2 en comparación con controles transgénicos. La Figura 9 provee una alineación PFAM para ZmCkx2 (aminoácidos 63 a 220 de la SEQ ID N°: 3), ZmCkx3 (aminoácidos 68 a 229 de la SEQ ID N°: 6), ZmCkx4 (aminoácidos 44 a 213 de la SEQ ID N°: 10) y ZmCkxd (aminoácidos d9 a 224 de la SEQ ID N°: 14). La secuencia consenso PFAM se muestra en la SEQ ID N°: 56. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se describirá más detalladamente de ahora en adelante con referencia a las figuras adjuntas, en las cuales se muestran algunas, pero no todas, las realizaciones de la invención. Aún más, la invención se puede realizar en muchas formas diferentes y no se limita a las realizaciones descritas en la presente; antes bien, estas realizaciones se proveen para que esta descripción satisfaga los requerimientos legales correspondientes. Los números iguales se refieren a los mismos elementos en todas las figuras. El especialista en el arte al cual pertenecen estas invenciones notará la posibilidad de efectuar muchas modificaciones y la existencia de otras realizaciones de la invención descrita en la presente, con el beneficio de las descripciones presentadas precedentemente y las figuras asociadas. Por ello, se considera que la invención no se limita a las realizaciones específicas descritas y que las modificaciones y realizaciones adicionales están incluidas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque aquí se emplean términos específicos, se utilizan solamente en un sentido genérico y descriptivo y no en un sentido limitativo. COMPOSICIONES Las composiciones de la invención incluyen polipéptidos y polinucleótidos de la citoquinina oxidasa (CKX) que están comprometidos en la modulación del desarrollo, la morfología y la fisiología de plantas. Las composiciones de la invención incluyen además promotores CKX capaces de regular la transcripción. En particular, la presente invención provee polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12 ó 53. Se proveen además polipéptidos que poseen una secuencia de aminoácidos codificada por uno de los polinucleótidos descritos en la presente, por ejemplo los que se muestran en la SEQ ID N°: 1 , 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11 , 51 ó 52. Otras composiciones incluyen las secuencias promotoras CKX que se muestran en las SEQ ID N°: 13, 14, 15 y 16. Los polipéptidos citoquinina oxidasa de la invención comparten identidad de secuencia con los miembros de la familia de proteínas de la citoquinina oxidasa. Los cambios en la actividad citoquinina oxidasa alteran la concentración de citoquinina en los tejidos, y por consiguiente las enzimas citoquinina oxidasa son importantes para controlar los procesos locales dependientes de citoquinina. La enzima citoquinina oxidasa es una oxidorreductasa que contiene FAD y cataliza la degradación de las citoquininas que contienen cadenas laterales de isoprenoides insaturados. Las bases libres, isopentenil-adenina (iP) y zeatina (Z), y sus respectivos ribósidos, constituyen ejemplos de sustratos de la misma.
Los polipéptidos CKX de la invención contienen un dominio de unión a FAD predicho (PFAM, N° Acceso PF01565). Esta familia de enzimas comprende varios polipéptidos que emplean FAD como co-factor. Los dominios de unión a FAD están ubicados entre los aminoácidos 63 y 220 de ZmCkx2, entre los aminoácidos 68 y 229 de ZmCkx3, entre los aminoácidos 44 y 213 de ZmCkx4 y entre los aminoácidos 59 y 224 de ZmCkxd. Las alineaciones y la secuencia consenso de PFAM se proveen en la Figura 9. Los polipéptidos CKX de la invención también comparten homología con varios polipéptidos de la familia CKX. En la Tabla 1 , que se muestra más adelante en el Ejemplo 1 , se provee un resumen de la relación de identidad de secuencia de ZmCkx2, 3, 4 y d con diversos miembros de la familia CKX. La invención abarca composiciones de polinucleótidos o proteínas aislados o sustancialmente purificados. Un polinucleótido o proteína "aislado" o "purificado", o una porción biológicamente activa del mismo, está sustancialmente o esencialmente libre de los componentes que habitualmente acompañan o interactúan con el polinucleótido o la proteína tal como se hallan en su entorno natural. Por consiguiente, un polinucleótido o proteína aislado o purificado está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando es producido mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando es sintetizado químicamente. Preferentemente, un polinucleótido "aislado" está libre de las secuencias (preferentemente las secuencias que codifican proteínas) que habitualmente flanquean los polinucleótidos (es decir, secuencias ubicadas en los extremos d' y 3' del polinucleótido) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, el polinucleótido aislado puede contener menos que d kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,d kb o 0,1 kb aproximadamente de las secuencias de nucleótidos que habitualmente flanquean de las secuencias de nucleótidos que habitualmente flanquean el polinucleótido en el ADN genómico de la célula de la cual deriva el polinucleótido. La proteína que está substancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas que poseen menos que un 30%, 20%, 10%, d% o 1% (en peso seco) de proteínas contaminantes. Cuando la proteína de la invención o una porción biológicamente activa de la misma es producida de forma recombinante, el medio de cultivo representa preferentemente menos que un 30%, 20%, 10%, 5% o 1% (en peso seco) aproximadamente de precursores químicos o de sustancias químicas que no son las proteínas de interés. Los fragmentos y las variantes de los polinucleótidos y las proteínas descritas codificadas por los mismos también están comprendidos en la presente invención. El término "fragmento" significa una porción de la secuencia del polinucleótido o una porción de la secuencia de aminoácidos y por ende de la proteína codificada por el mismo. Los fragmentos de un polinucleótido pueden codificar fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína nativa y por ende pueden exhibir actividad citoquinina oxidasa. Como alternativa, los fragmentos de polinucleótido que son de utilidad como sondas de hibridación generalmente no codifican fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica. Por consiguiente, los fragmentos de la secuencia de nucleótidos pueden variar en un rango entre al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos y hasta un polinucleótido de longitud completa que codifica una proteína de la invención. Un fragmento de un polinucleótido CKX que codifica una porción biológicamente activa de una proteína CKX de la invención codificará al menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 3d0, 400, 4d0, dOO, d2d o d37 aminoácidos contiguos o hasta la cantidad total de aminoácidos presentes en una proteína CKX de longitud completa de la invención (por ejemplo, 619 aminoácidos, d38 aminoácidos, d21 aminoácidos y d42 aminoácidos para las SEQ ID N°: 3, 6, 9 y 12, respectivamente). En general no es necesario que los fragmentos de un polinucleótido CKX que son de utilidad como sondas de hibridación o cebadores para PCR codifiquen una porción biológicamente activa de una proteína CKX. Por consiguiente, un fragmento de un polinucleótido CKX puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína CKX o puede ser un fragmento que se pueda utilizar como una sonda de hibridación o un cebador para PCR usando los métodos que se describirán más adelante. Una porción biológicamente activa de una proteína CKX se puede preparar aislando una porción de uno de los polinucleótidos CKX de la invención, expresando la porción codificada de la proteína CKX (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la porción codificada de la proteína CKX. Los polinucleótidos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de CKX comprenden al menos 16, 20, dO, 7d, 100, 1d0, 200, 2d0, 300, 3d0, 400, 4d0, 500, ddO, 600, 6d0, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600 ó 1629 nucleótidos, o hasta la cantidad de nucleótidos presentes en un polinucleótido CKX de longitud completa descrito en la presente (por ejemplo, 3200 nucleótidos, 1560 nucleótidos, 3258 nucleótidos, 263d nucleótidos, 1617 nucleótidos, 6177 nucleótidos, 1816 nucleótidos, 1d66 nucleótidos, d108 nucleótidos o 1629 nucleótidos para la SEQ ID N°: 1 , 2, 4, d, 64, 7, 8, 65, 10 ú 1 1 , respectivamente).
El término "variantes" significa secuencias sustancialmente similares. Para los polinucleótidos, una variante comprende la supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios dentro del polinucleótido nativo y/o la sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en dicho polinucleótido nativo. Tal como se utiliza en la presente, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos natural, respectivamente. Para los polinucleótidos, las variantes conservadoras incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos citoquinina oxidasa de la invención. Las variantes alélicas naturales como las recién mencionadas pueden ser identificadas utilizando técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de hibridación que se describirán más adelante. Las variantes de polinucleótidos también incluyen secuencias de polinucleótidos derivadas sintéticamente, tal como las que se generan, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida al sitio pero que todavía codifican una proteína CKX de la invención. En general, las variantes de un polinucleótido particular de la invención tendrán por lo menos un 40%, 46%, 50%, 56%, 60%, 66%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más identidad de secuencia con dicho polinucleótido particular determinada mediante los programas de alineación de secuencia que se describen en este documento utilizando los parámetros predeterminados. Las variantes de un polinucleótido particular de la invención (es decir, el polinucleótido de referencia) también puede evaluarse por comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por una variante de polinucleótido y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Por consiguiente, se describen, por ejemplo, los polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido con un porcentaje de identidad de secuencia dado con el polipéptido de la SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12 ó 53. El porcentaje de identidad de secuencia entre cualesquiera dos polipéptidos se puede calcular usando los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos en otra parte en este documento. Cuando se evalúa cualquier par de polinucleótidos dado de la invención por comparación del porcentaje de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos codificados por el mismo, dicho porcentaje de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es de al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 86%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia.
El término "variante" de proteína significa una proteína derivada de la proteína nativa por supresión o adición de uno o varios aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa y/o la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Las variantes de las proteínas comprendidas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, aún retienen la actividad biológica deseada de la proteína nativa, en este caso, la actividad citoquinina oxidasa descrita en la presente. Dichas variantes pueden ser el resultado de, por ejemplo, polimorfismos genéticos o de la intervención humana. Las variantes biológicamente activas de la proteína CKX nativa de la invención tendrán al menos un 40%, 46%, 50%, 56%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa determinada con los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos en otra parte en la presente. Una variante biológicamente activa de una proteína de la invención puede diferir de dicha proteína por tan poco como 1-15 residuos de aminoácidos, tan poco como 1-10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o aún 1 residuo de aminoácido. Las proteínas de la invención se pueden alterar de varias maneras, incluyendo substituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para dichas manipulaciones son conocidos en general en el arte. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos y los fragmentos de las proteínas CKX se pueden preparar mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para llevar a cabo la mutagénesis y las alteraciones de los polinucleótidos son bien conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 164: 367-382; Patente de EE.UU. N°: 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citadas en las mismas. Los lineamientos para efectuar las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se pueden consultar en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporada en este documento a modo de referencia. Las sustituciones conservadoras, tal como el intercambio de un aminoácido por otro de propiedades similares, son óptimas. Por consiguiente, los genes y polinucleótidos de la invención incluyen tanto las secuencias naturales como las formas mutantes. De la misma manera, las proteínas de la invención abarcan tanto las proteínas naturales como las variaciones y formas modificadas de las mismas. Dichas variantes continúan reteniendo la actividad citoquinina oxidasa deseada. Obviamente, las mutaciones que se efectuarán en el ADN que codifica las variantes no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y, con preferencia, no van a crear regiones complementarias que podrían producir una estructura de ARNm secundaria. Véase, la Publicación de la Solicitud de Patente EP N°: 75.444. No se espera que las supresiones, inserciones y sustituciones de las secuencias de proteínas comprendidas en la presente produzcan cambios radicales en las características de las proteínas. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, supresión o inserción antes de producirla, el especialista en el arte comprenderá que el efecto será evaluado por medio de ensayos de monitoreo de rutina. Es decir, la actividad se puede evaluar mediante ensayos de la actividad citoquinina oxidasa. La actividad citoquinina oxidasa se puede evaluar de varias maneras. Por ejemplo, se pueden emplear diversos derivados de citoquinina como sustratos para medir la actividad citoquinina oxidasa. Por ejemplo, el polipéptido que posee actividad CKX se puede mezclar con una citoquinina, por ejemplo, zeatina, y se puede medir el cambio neto de absorbancia a 590 nm. Véase, la Patente de EE.UU. N°: 6.229.066. Como alternativa, se puede medir la actividad citoquinina oxidasa evaluando la conversión de [2-3H]iP en adenina. Véase, por ejemplo, Faiss et al. (1997) Plant J. 12: 401-415, incorporada en este documento a modo de referencia. Para consultar ensayos adicionales, véase Morris et al. (1999) Biochem Biophys Res Comm 255:328-333, Bilyeu et al. (2001) Plant Physiol 125: 378-386, Jones et al. (1990) Proceedings of the Plant Growth Regulation Society of America: (17a), págs. 183-196, Dietrich et al. (1995) Plant Physiol. Bioch. 268: 327-336 y Frebort ef al. (2002) Annu Biochem 306: 1-7, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Además, se usó un método fotoespectrométrico para la velocidad inicial que dio como resultado la formación de un colorante formazán para evaluar la actividad citoquinina oxidasa. Véase, por ejemplo, Frebort ef al. (2002) Annu Biochem 306: 1-7. Además, se puede medir la actividad citoquinina oxidasa evaluando una disminución en los niveles de citoquinina in vivo. Dicha disminución en los niveles de citoquinina puede producir uno o más síntomas de un síndrome de deficiencia de citoquinina. Los diversos fenotipos asociados con el síndrome de deficiencia de citoquinina son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Schmulling ef al. (2003) J. Plant Res 116: 241-252, cuyo contenido se incorpora en este documento a modo de referencia. Las variantes de polinucleótidos y proteínas también abarcan secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como recombinación de ADN. Con dicho procedimiento, es posible manipular una o más secuencias de secuencias de CKX diferentes con el fin de crear un nuevo polipéptido CKX que posea las propiedades deseadas. De esta manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de secuencias de polinucleótidos relacionadas que comprenden regiones de " secuencia con una identidad de secuencia sustancial y que pueden ser recombinadas de forma homologa in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando este enfoque, se pueden recombinar motivos de secuencia que codifican el dominio de interés entre los genes CKX de la invención y otros genes CKX conocidos con el fin de obtener un gen nuevo que codifique una proteína con mejoras en la propiedad de interés, tal como una mayor Km en el caso de una enzima. Las estrategias para dichas recombinaciones de ADN son conocidas en el arte. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 91 : 10747- 10751 ; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri ef al. (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU 94: 4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391 : 288-291 ; y las Patentes de EE.UU. N°: 5.605.793 y 5.837.458. Las composiciones de la invención también incluyen polinucleótidos aislados que comprenden las secuencias de nucleótidos del promotor CKX que se muestran en las SEQ ID N°: 13, 14, 15 y 16. El término "promotor" se refiere a una región de ADN reguladora que habitualmente comprende una caja TATA capaz de dirigir la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripción apropiado para una secuencia de polinucleótidos particular. El promotor puede comprender además otras secuencias de reconocimiento generalmente ubicadas 5' con respecto a la caja TATA, denominadas elementos promotores 5', que afectan la velocidad de inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras de la presente invención regulan (es decir, reprimen o activan) la transcripción a partir de la región promotora. Se considera que es posible agregar dominios adicionales a las secuencias promotoras de la invención y de esa manera modular el nivel de expresión, el momento en el desarrollo de la expresión o el tipo de tejido donde tiene lugar la expresión. Véase en particular, la Patente de Australia N° AU-A-77751/94 y las Patentes de EE.UU. N°: 5.466.786 y 5.635.618. Los fragmentos y las variantes de los polinucleótidos descritos del promotor CKX también están incluidos en la presente invención. Los fragmentos de un polinucleótido promotor pueden retener la actividad biológica y por ende retener la actividad reguladora de la transcripción. Como alternativa, los fragmentos de polinucleótido que son de utilidad como sondas de hibridación generalmente no retienen la actividad biológica. Por consiguiente, los fragmentos de la secuencia de nucleótidos del promotor pueden variar en un rango entre al menos 20 nucleótidos aproximadamente, 50 nucleótidos aproximadamente, 100 nucleótidos aproximadamente y hasta el polinucleótido de longitud completa de la invención.
Por consiguiente, un fragmento de un polinucleótido del promotor CKX puede codificar una porción biológicamente activa de un promotor CKX o puede ser un fragmento que se podría utilizar como sonda de hibridación o cebador para PCR usando los métodos que se describirán más adelante. Se puede preparar una porción biológicamente activa de un polinucleótido del promotor CKX aislando una porción de uno de los polinucleótidos del promotor CKX de la invención y evaluando la actividad de dicha porción del promotor CKX. Los polinucleótidos que son fragmentos de un polinucleótido del promotor CKX comprenden al menos 16, 20, 50, 75, 100, 160, 200, 260, 300, 360, 400, 450, 500, 550, 600, 660, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900 ó 2000 nucleótidos o hasta la cantidad de nucleótidos presentes en un polinucleótido de longitud completa del promotor CKX descrito en la presente (por ejemplo, 3003, 2001 , 2448 ó 2346 nucleótidos para las SEQ ID N°: 13, 14, 15 ó 16, respectivamente). En el caso de un polinucleótido promotor, una variante comprende la supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios dentro del polinucleótido nativo y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. En general, las variantes de un polinucleótido promotor particular de la invención tendrá al menos un 40%, 45%, 50%, 56%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%>, 99% aproximadamente o más de identidad de secuencia con dicho polinucleótido particular, determinada con los programas y parámetros de alineación de secuencia descritos en otra parte en la presente. Las variantes los polinucleótidos del promotor también abarcan secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como recombinación de ADN. Con dicho procedimiento, es posible manipular una o varias secuencias promotoras diferentes con el fin de crear un nuevo promotor CKX que posea las propiedades deseadas. Las estrategias para dichas recombinaciones de ADN se describen en otra parte en la presente.
En el arte existen métodos para determinar si una secuencia promotora retiene la capacidad para regular la transcripción. Dicha actividad se puede medir con un análisis de transferencia Northern. Véase, por ejemplo, Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York), incorporada en este documento a modo de referencia. Como alternativa, la actividad biológica del promotor se puede medir usando ensayos diseñados específicamente para medir la actividad y/o el nivel del polipéptido que está siendo expresado a partir de dicho promotor. Dichos ensayos son conocidos en el arte. Los polinucleótidos de la invención (es decir, las secuencias CKX y las secuencias promotoras CKX) se pueden utilizar para aislar las correspondientes secuencias a partir de otros organismos, en particular de otras plantas y más particularmente de otras monocotiledóneas. De esta manera, se pueden utilizar métodos tales como PCR, hibridación y semejantes para identificar dichas secuencias sobre la base de su homología de secuencia con las secuencias que se describen en la presente. Las secuencias aisladas sobre la base de su identidad de secuencia con las secuencias CKX completas o las secuencias promotoras CKX descritas en la presente, o con variantes y fragmentos de las mismas, están comprendidas en la presente invención. Dichas secuencias incluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias descriptas. El término "ortólogos" se refiere a genes derivados de un gen ancestral común que se encuentra en diferentes especies como resultado de la especiación. Los genes presentes en diferentes especies son considerados ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o las secuencias de proteínas codificadas por las mismas comparte al menos un 60%, 70%, 76%, 80%, 8d%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia. Las funciones de los ortólogos a menudo están muy conservadas entre las especies. Por consiguiente, los polinucleótidos aislados que codifican una proteína CKX y que se hibridizan bajo condiciones severas con las secuencias CKX descritas en la presente, o con variantes o fragmentos de las mismas, están comprendidas en la presente invención. En un enfoque con PCR, se pueden diseñar cebadores de oligonucleótidos para su uso en reacciones de PCR para amplificar las correspondientes secuencias de ADN a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores para PCR y clonación por PCR son conocidos en general en el arte y se describen en Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Véase también Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, a modo de ejemplo, los métodos que emplean cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores individuales específicos, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vectores, cebadores parcialmente no coincidentes y semejantes. En las técnicas de hibridación, se utiliza toda o parte de un polinucleótido conocido como una sonda que se hibridice selectivamente con otros polinucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado o fragmentos de ADNc (es decir, bibliotecas de ADN genómico o ADNc) de un organismo elegido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos y se pueden marcar con un grupo detectable, tal como 32P o cualquier otro marcador detectable. Por consiguiente, se pueden elaborar, por ejemplo, sondas para la hibridación mediante marcación de oligonucleótidos sintéticos basados en los polinucleótidos CKX o las secuencias promotoras CKX de la invención. Los métodos de preparación de sondas para la hibridación y para la construcción de bibliotecas de ADNc y genómicas son conocidos en general en el arte y se describen en Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Por ejemplo, se pueden usar las secuencias de polinucleótidos CKX completas o las secuencias promotoras CKX completas descritas en la presente, o una o más porciones de las mismas, como sondas capaces de hibridizarse específicamente con lOs correspondientes polinucleótidos CKX y ARN mensajeros. Para obtener una hibridación específica bajo diversas condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias de polinucleótidos CKX y preferentemente son de al menos 10 nucleótidos aproximadamente de longitud, y más preferentemente de al menos 20 nucleótidos aproximadamente de longitud. Dichas sondas se pueden usar para amplificar los correspondientes Polinucleótidos CKX de la planta elegida por PCR. Esta técnica se puede usar para aislar secuencias de codificación adicionales de la planta deseada o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en una planta. Las técnicas de hibridación incluyen búsqueda con hibridación de bibliotecas de ADN plaqueadas (ya sean placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). La hibridación de dichas secuencias se puede llevar a cabo bajo condiciones severas. Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" hacen referencia a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridizará con su secuencia blanco, hasta un grado detectable mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces con respecto al nivel basal). Las condiciones severas dependen de la secuencia y serán diferentes bajo distintas circunstancias. El control de la severidad de las condiciones de hibridación y/o de lavado, permite identificar secuencias blanco que son un 100% complementarias de la sonda (sonda homologas). Como alternativa, es posible ajustar las condiciones de severidad para permitir alguna falta de coincidencia en las secuencias de modo que se detectan grados más bajos de similitud (sondas heterólogas). En general, una sonda tiene menos que aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, a menudo menos que 500 nucleótidos de longitud. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sales es menor que aproximadamente 1 ,5 M del ion de Na, típicamente entre 0,01 y 1 ,0 M aproximadamente de concentración del ion de Na (u otras sales) a pH entre 7,0 y 8,3 y la temperatura es de al menos 30 °C aproximadamente para sondas cortas (por ejemplo, entre 10 y 50 nucleótidos) y al menos 60 °C aproximadamente para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes, tal como formamida. Los ejemplos de condiciones de baja severidad incluyen hibridación con una solución amortiguadora de formamida al 30 a 35%, NaCI 1 M, SDS 1% (dodecilsulfato de sodio) a 37 °C y un lavado en SSC 1X a 2X (SSC 20X = NaCI 3,0 M / citrato trisódico 0,3 M) a 50-55 °C. Los ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen hibridación en formamida 40 a 45%, NaCI 1 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,5X a 1X a 55-60 °C. Los ejemplos de condiciones de severidad alta incluyen hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,1X a 60-65 °C. Optativamente, las soluciones amortiguadoras de lavado pueden comprender SDS entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 1%. La duración de la hibridación es en general menor que 24 horas aproximadamente, habitualmente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será de un tiempo suficiente como para alcanzar el equilibrio. La especificidad depende típicamente de los lavados de post-hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución final de lavado. Para los híbridos ADN-ADN, la Tm se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284 (1984): Tm = 81 ,6 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/I; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanosina y nucleótidos de citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual un 50% de una secuencia blanco complementaria se hibridiza con una sonda perfectamente coincidente. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de falta de coincidencia; por lo tanto, es posible ajustar la Tm, las condiciones de hibridación y/o de lavado para hibridizar las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm se puede disminuir en 10 °C. En general, las condiciones severas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones muy severas pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 1 , 2, 3 ó 4 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja severidad pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 20 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado y la Tm deseada, los especialistas comprenderán que se describen inherentemente variaciones en la severidad de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de falta de coincidencia deseado da como resultado una Tm menor que 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida) se prefiere incrementar la concentración de SSC para que se pueda usar una temperatura más alta. Se puede consultar una guía muy extensa para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acids Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, (Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York (1995). Véase Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York).
Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Tal como se utiliza en este documento, una "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se utiliza como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, un segmento de una secuencia genética o de ADNc de longitud completa o la secuencia completa del gen o del ADNc. (b) Tal como se utiliza en este documento, una "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia o huecos) al compararla con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para una alineación óptima de los dos polinucleótidos. En general, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos de longitud y, optativamente, puede ser de 30, 40, 50, 100 o más de longitud. Los especialistas en el arte comprenderán que a fin de evitar una gran similitud con la secuencia de referencia debido a la inclusión de faltas de coincidencia en la secuencia de polinucleótidos, se introduce típicamente una penalización por falta de coincidencia y se resta de la cantidad de coincidencias. Los métodos de alineación de secuencias para una comparación son bien conocidos en el arte. Por consiguiente, la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias cualesquiera se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitativos de dichos algoritmos matemáticos son: el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 11-17; el algoritmo de homología local de Smith ef al. (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol.
Biol. 48: 443-453; el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85: 2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5873-6877. Se pueden utilizar las implementaciones computarizadas de estos algoritmos matemáticos para la comparación de secuencias con el fin de determinar la identidad de secuencia. Dichas implementaciones incluyen, a modo de ejemplo: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, EE.UU.). Las alineaciones que emplean estos programas se pueden efectuar utilizando los parámetros predeterminados. El programa CLUSTAL está muy bien descripto por Higgins et al., (1988) Gene 73: 237-244; Higgins et al., (1989) CABIOS 5: 151-153; Corpet et al., (1988) Nucleic Acids Research 16: 10881-90; Huang, et al., (1992) CABIOS 8: 155-65; y Pearson et al., (1994) Meth. Mol. Biol. 24: 307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Se puede usar una tabla de peso de residuos PAM120, una restricción para la falta de coincidencia de 12 y una restricción por falta de coincidencia de 4 con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul ef al (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden efectuar con el programa BLASTN, calificación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener las secuencias de nucleótidos homologas de una secuencia de nucleótidos codificadora de una proteína de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden efectuar con el programa BLASTX, calificación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener las secuencias de aminoácidos homologas de una proteína o polipéptido de la invención. Con el fin de obtener alineaciones con faltas de coincidencia para efectuar una comparación, se puede emplear Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389. Como alternativa, se puede utilizar PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para efectuar una búsqueda iterada que permite detectar relaciones distantes entre las moléculas. Véase, Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. La alineación también se puede efectuar por inspección manual. A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia provistos en este documento se refieren a los valores obtenidos utilizando GAP Versión 10 con los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando un Peso de 50 y un Peso de Longitud de 3; y la matriz de calificación de nwsgapdna.cmp; % de identidad y % similitud para una secuencia de aminoácidos usando un Peso GAP de 8 y un Peso de Longitud de 2, y la matriz de calificación BLOSUM62; o cualquier programa equivalente de los mismos. El término "programa equivalente" significa cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genera una alineación que presenta coincidencias de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos y una identidad de secuencia porcentual idéntica cuando se compara con la alineación correspondiente generada por el programa GAP Versión 10. GAP emplea el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, para hallar la alineación de dos secuencias completas que maximice la cantidad de coincidencias y minimice la cantidad de faltas de coincidencias. GAP tiene en cuenta todas las alineaciones y posiciones posibles de las coincidencias y crea una alineación con la mayor cantidad de bases coincidentes y la menor cantidad de faltas de coincidencias. Permite la provisión de un límite de penalidad por creación de faltas de coincidencias y una penalidad por la extensión de las faltas de coincidencias, expresados en unidades de bases coincidentes. GAP debe obtener una ganancia con la penalidad por creación de faltas de coincidencias en cantidades de coincidencias por cada falta de coincidencia que inserta. Si se elige una penalidad por la extensión de las faltas de coincidencias mayor que cero, GAP debe, además, proveer una ganancia por cada falta de coincidencia insertada, cuya longitud es la cantidad de faltas de coincidencia, con respecto a la penalidad por extensión de las faltas de coincidencias. Los valores predeterminados para la penalidad por creación de faltas de coincidencias y para la penalidad por la extensión de las faltas de coincidencias en las secuencias de proteínas en la Versión 10 del paquete de software de Wisconsin Genetics GCG son de 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos la penalidad por creación de falta de coincidencia predeterminado es de 50, en tanto la penalidad por falta de coincidencia predeterminado es de 3. La penalidad por creación de faltas de coincidencia y de extensión de las faltas de coincidencia se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros de 0 a 200. Así, por ejemplo, los valores de las penalidades por creación de faltas de coincidencia y de extensión de las faltas de coincidencia pueden ser de 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mayor.
GAP representa un miembro de la familia de mejores alineaciones. Esta familia puede tener muchos miembros, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP muestra cuatro valores de calificación para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada para alinear las secuencias. La Relación es la calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. La Identidad porcentual es el porcentaje de los símbolos que coinciden realmente. La Similitud porcentual es el porcentaje de los símbolos que son similares. No se tienen en cuenta los símbolos que son cruzados con respecto a las faltas de coincidencia. Se califica una similitud cuando el valor de la matriz de calificación para un par de símbolos es mayor o igual que 0,50, como el umbral de similitud. La matriz de calificación usada en la Versión 10 del paquete de software de Wisconsin Genetics GCG es BLOSUM62 (véase, Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915). (c) Tal como se utiliza en este documento, la "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean por correspondencia máxima en la ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencias se utiliza con referencia a proteínas se comprenderá que las posiciones de los residuos que no son idénticos a menudo difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos, donde los residuos aminoacídicos son sustituidos por otros residuos aminoacídicos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por ello no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba con el fin de corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por dichas sustituciones conservadoras poseen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para efectuar este ajuste son bien conocidos por los especialistas en el arte. Típicamente, comprende la calificación de una sustitución conservadora como una falta de coincidencia parcial en lugar de completa, con lo cual aumenta el porcentaje de identidad de secuencias. Así, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico recibe una calificación de 1 y una sustitución no conservadora recibe una calificación de cero, la sustitución conservadora recibe una calificación entre cero y 1. La calificación de sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View. California). (d) Tal como se utiliza en este documento, el "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado por comparación de dos secuencias alineadas de forma óptima en una ventana de comparación, donde la porción de una secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia) en comparación con una secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando la cantidad de posiciones en las cuales aparece la base de ácido o residuo aminoacídico en ambas secuencias para obtener la cantidad de posiciones coincidentes, dividiendo la cantidad de posiciones coincidentes por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. La invención provee además plantas que poseen niveles y/o actividades alterados de los polipéptidos CKX de la invención. En algunas realizaciones, las plantas de la invención han incorporado de forma estable en sus genomas las secuencias CKX de la invención. En determinadas realizaciones, se proveen plantas que fueron modificadas genéticamente en un locus genómico que codifica un polipéptido CKX de la invención. El término " locus genómico nativo" se refiere a una secuencia genómica natural. En algunas realizaciones, el locus genómico es el que se muestran en la SEQ ID N°: 1 , 4, 7, 10 ó 51. En aún otras realizaciones, el locus genómico fue modificado para reducir o eliminar la actividad del polipéptido CKX. El término "modificado genéticamente", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una planta o a una parte de planta cuya información genética fue modificada por introducción de uno o más polinucleótidos extraños y en la cual la inserción del polinucleótido extraño conduce a un cambio fenotípico en la planta. Un "cambio fenotípico" se refiere a un cambio medible en una o más funciones celulares. Por ejemplo, las plantas que contienen una modificación genética en el locus genómico que codifica el polipéptido CKX pueden mostrar una reducción o eliminación en la expresión o actividad del polipéptido CKX. En otra parte en este documento, se describen diversos métodos para generar dicho locus genómico modificado genéticamente así como la variedad de fenotipos que se pueden obtener como resultado de la modulación del nivel y/o de la actividad de las secuencias CKX de la invención.
Tal como se utiliza en la presente, el término planta incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos tisulares de células vegetales a partir de los cuales es posible regenerar una planta, callos vegetales, masas vegetales y células vegetales que están intactas en las plantas o en partes de las plantas tal como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, marlos, chalas, tallos, raíces, puntas de raíces, anteras y semejantes. Tal como se utiliza en la presente, el término "grano" se refiere a la semilla madura producida por los criadores comerciales con un propósito distinto de cultivar o reproducir la especie. La progenie, las variantes y los mutantes de las plantas regeneradas también están incluidos dentro del alcance de la invención, siempre que estas partes comprendan las secuencias de ácido nucleico introducidas. Una "planta sujeto" o "célula vegetal sujeto" es uno en que se ha efectuado una alteración genética, tal como una transformación, como en un gen de interés, o es una planta o célula vegetal que desciende de una planta o célula vegetal alterada de esa forma y que comprende dicha alteración. Un "control" o una "planta control" o una "célula vegetal control" provee un punto de referencia para medir los cambios en dicha planta o célula vegetal sujeto. Una planta control o una célula vegetal control puede comprender, por ejemplo: (a) una planta o célula vegetal de tipo salvaje, es decir, del mismo genotipo que el material inicial para la alteración genética que dio como resultado la planta sujeto o célula vegetal sujeto; (b) una planta o célula vegetal del mismo genotipo que el material inicial pero que ha sido transformado con una construcción nula (es decir, con una construcción que no tiene efecto sobre la característica de interés, tal como una construcción que comprende un gen marcador); (c) una planta o célula vegetal que es un segregante no transformado entre la progenie de dicha planta sujeto o célula vegetal sujeto; (d) una planta o célula vegetal idéntica genéticamente a la planta sujeto o célula vegetal sujeto pero que no fue expuesto a las condiciones o estímulos que inducirían la expresión del gen de interés; o (e) la propia planta sujeto o célula vegetal sujeto, bajo condiciones en las cuales el gen de interés no se expresa. En este caso, por ejemplo, en diversas realizaciones, se podrían medir los cambios en la actividad citoquinina oxidasa, los niveles de citoquinina oxidasa, la actividad citoquinina, los niveles de citoquinina, las proporciones de citoquinina, la distribución de citoquinina y/o cambios en una o más características tales como tiempo de floración, formación de semillas, ramificación, senescencia, tolerancia al estrés o masa radicular, por comparación de la planta sujeto o célula vegetal sujeto con la planta control o célula vegetal control. MÉTODOS /. Provisión de secuencias Las secuencias de la presente invención se pueden introducir/expresar en una célula huésped tal como bacteria, levadura, insecto, mamífero o, preferentemente, células vegetales. Se considera que los especialistas en el tienen conocimiento de los numerosos sistemas disponibles para la introducción de un polipéptido o de una secuencia de nucleótidos de la presente invención en una célula huésped. No se describirá con detalle aquí los distintos métodos conocidos para proveer proteínas en procariotas o eucariotas. El término "célula huésped" significa una célula que contiene una secuencia de ácido nucleico heteróloga de la invención. Las células huésped pueden ser células procariotas, tal como E. coli, o células eucariotas, tales como células de levadura, insectos, plantas, anfibios o mamíferos. Las células huésped también pueden ser células vegetales monocotiledóneas o dicotiledóneas. En una realización, la célula huésped monocotiledónea es una célula huésped de maíz. El uso del término "polinucleótido" no pretende limitar la presente invención a los polinucleótidos que comprenden ADN. Los especialistas en el arte comprenderán que los polinucleótidos puede comprender ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Dichos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas naturales como análogos sintéticos. Los polinucleótidos de la invención también abarcan todas las formas de secuencias incluyendo, a modo de ejemplo, formas de cadena simple, formas de cadena doble, horquillas, estructuras de tallo-y-bucle y semejantes. Las secuencias de polinucleótidos CKX o promotoras CKX de la invención se pueden proveer en casetes de expresión para su expresión en el organismo de interés. El cásete puede incluir secuencias reguladoras 5' y 3' ligadas operativamente a un polinucleótido CKX de la invención. El término "ligado operativamente" se refiere a un ligamiento funcional entre dos o más elementos. Por ejemplo, un ligamiento operativo entre un polinucleótido de interés y una secuencia reguladora (es decir, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. Los elementos ligados operativamente pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se usan con referencia a la unión de dos regiones de codificación de proteínas, el término ligado operativamente significa que las regiones de codificación están en el mismo marco de lectura. El cásete puede contener además al menos un gen adicional que será cotransformado en el organismo. Como alternativa, se puede proveer cualquier gen adicional en múltiples casetes de expresión. Dicho cásete de expresión se provee con a pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para que la inserción del polinucleótido CKX se encuentre bajo la regulación de la transcripción de las regiones reguladoras. El cásete de expresión puede contener además genes marcadores seleccionables. El cásete de expresión puede incluir en la dirección de transcripción 5'-3', una región de inicio de la transcripción y de la traducción (es decir, un promotor), un polinucleótido CKX de la invención y una región de terminación de la transcripción y de la traducción (es decir, una región de terminación) funcional en la célula huésped (es decir, la planta). Las regiones reguladoras (es decir, promotores, regiones reguladoras de la transcripción y regiones de terminación de la traducción) y/o el polinucleótido CKX de la invención pueden ser nativas/análogas para la célula huésped o entre sí. Como alternativa, las regiones reguladoras y/o el polinucleótido CKX de la invención pueden ser heterólogas de la célula huésped o entre sí. Tal como se utiliza en la presente, el término "heterólogas" con referencia a una secuencia es una secuencia originaria de una especie extraña o, si es de la misma especie, está modificada sustancialmente con respecto a su forma nativa en cuanto a composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor ligado operativamente a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la cual deriva el polinucleótido o, si es de la misma especie o una especie análoga, uno o ambos están sustancialmente modificadas con respecto a su forma y/o locus genómico original, o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleótido ligado operativamente. Tal como se utiliza en la presente, un gen quimérico comprende una secuencia de codificación ligada operativamente a una región de inicio de la transcripción que es heteróloga con respecto a la secuencia de codificación. En tanto las secuencias se pueden expresar usando promotores heterólogos, se puede no obstante emplear las secuencias promotoras nativas (es decir, SEQ ID N°: 13, 14, 15 ó 16). Dichas construcciones cambiarán los niveles de expresión de CKX en la planta o célula vegetal. Por consiguiente, se altera el fenotipo de la planta o célula vegetal. Como alternativa, en otros métodos, se puede emplear cualquiera de las secuencias promotoras CKX de la invención para expresar las secuencias CKX. Además, se pueden utilizar otros promotores CKX; véase, por ejemplo, WO 02/0708438 y la publicación de Patente de EE.UU. N°: 01525000; y las Solicitudes de Patente de EE.UU. N°: 10/109.488 y 11/074.144 (SEQ ID N°: 17 y 18 en la presente). La región de terminación puede ser nativa con respecto a la región inicio de la transcripción, puede ser nativa con respecto al polinucleótido CKX ligado operativamente de interés o con las secuencias promotoras CKX, puede ser nativa con respecto a la planta huésped o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga) al promotor, el polinucleótido CKX de interés, la planta huésped o cualquier combinación de los mismos. Las regiones de terminación convenientes se encuentran disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de la octopina sintetasa y nopalina sintetasa. Véase también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen ef al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 9627-9639. Cuando corresponda, los polinucleótidos pueden ser optimizados para una mayor expresión en la planta transformada. Es decir, los polinucleótidos se pueden sintetizar utilizando los codones vegetales preferidos para una mejor expresión. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowrl (1990) Plant Physiol. 92: 1-11 por una descripción de la utilización de codones preferida para el huésped. Existen métodos disponibles en el arte para sintetizar los genes con preferencia por plantas. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: 5.380.831 y 5.436.391 , y Murray ef al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498, incorporada en este documento a modo de referencia. Se conocen otras modificaciones de secuencia que mejoran la expresión del gen en una célula huésped. Dichas modificaciones incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espúreas, señales de sitios de procesamiento de exón-intrón, repeticiones tipo transposón y otras secuencias del tipo bien caracterizadas que pueden resultar nocivas para la expresión del gen. El contenido de G-C de la secuencia puede ser ajustado en niveles promedio para una célula huésped dada, calculado con referencia a genes conocidos que se expresan en dicha célula huésped. Cuando fuera posible, la secuencia será modificada a fin de evitar las estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas. Los casetes de expresión pueden, además, contener secuencias directrices 51. Dichas secuencias directrices pueden mejorar la traducción. Las directrices de traducción son conocidas en el arte e incluyen: las directrices de picornavirus, por ejemplo, directriz EMCV (región no codificadora 5' de encefalomiocarditis) (Elroy- Stein et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., (16: 6126-6130); directrices potivirus, por ejemplo, directriz TEV (virus del etch de tabaco) (Gallie ef al. (1995) Gene 165(2):233-238), directriz MDMV (virus en mosaico enano de maíz) (Johnson et al. (1986) Virology, 154: 9-20) y proteína de unión de cadena pesada de la inmunoglobulina humana (BiP). (Macejak et al. (1991) Nature, 353: 90-94: directriz no traducida del ARNm de la proteína de la cubierta del virus en mosaico de alfalfa (AMV ARN 4). (Jobling et al., (1987) Nature, 325: 622-625); directriz del virus en mosaico de tabaco (TMV), (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nueva York), págs. 237-256); y directriz del virus moteado clorótico de maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology, 81: 382-385). Véase también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology, 84: 965-968. También se pueden utilizar otros métodos conocidos para mejorar la traducción, por ejemplo, intrones y semejantes. Cuando se prepara el cásete de expresión, se pueden manipular los diversos fragmentos de ADN con el fin de proveer las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, según corresponda, en el marco de lectura adecuado. Con este fin se pueden emplear adaptadores o ligadores para unir los fragmentos de ADN o se pueden utilizar otras manipulaciones para proveer sitios de restricción convenientes, eliminar ADN superfluo, eliminar sitios de restricción o semejantes. Con este propósito, se puede utilizar mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, digestiones de restricción, alineamiento, resubstituciones, por ejemplo transiciones y transversiones. En general, el cásete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionable para seleccionar las células transformadas. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos, tal como aquellos que codifican la neomicina fosfotransferasa II (NEO) y la higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tal como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Otros marcadores de selección incluyen marcadores fenotípicos, tal como ß-galactosidasa y proteínas fluorescentes tal como la proteína fluorescente verde (GFP) (Su ef al. (2004) Biotechnol Bioeng 85: 610-9 y Fetter ef al. (2004) Plant Cell 16: 215-28), proteína ciano fluorescente (CYP) (Bolte ef al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 y Kato ef al. (2002) Plant Physiol 129: 913-42) y la proteína fluorescente amarilla (PhiYFP™ de Evrogen, véase, Bolte ef al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54). Por otros marcadores de selección adicionales, véase en general, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511 ; Christopherson et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89: 6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71 : 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419-2422; Barkley ef al. (1980) en The Operon, págs. 177-220; Hu ef al. (1987) Cell 48: 555-566; Brown et al. (1987) Cell 49: 603-612; Figge et al. (1988) Cell 52: 713-722; Deuschle ef al. (1989) Proc. Nati. Acad. Aci. EE.UU 86: 5400-5404; Fuerst ef al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sel. EE.UU. 86: 2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248: 480-483; Gossen (1993) Tesis de Doctorado, Universidad de Heidelberg; Reines ef al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU 90: 1917-1921 ; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 89: 3952-3956; Baim ef al. (1991) Proc. ?/af/. y cací. Sci. EE.UU 88: 5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Top/'cs Mol. Struc. Biol. 10: 143-162; Degenkolb ef a/. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidt ef a/. (1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) Tesis de Doctorado, Universidad de Heidelberg; Gossen ef al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU 89: 5547-5551; Oliva ef a/. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913-919; Hlavka ef a/. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); Gilí ef a/. (1988) Nature 334: 721-724. El contenido de dichas citas se incorpora en este documento a modo de referencia. La lista anterior de genes marcadores seleccionables no se ofreció en un sentido limitativo. Se puede utilizar cualquier gen marcador seleccionable en la presente invención. Se puede emplear una cantidad de promotores en la práctica de la invención, incluyendo el promotor nativo de la secuencia de polinucleótidos de interés. Los promotores se pueden seleccionar sobre la base del resultado deseado. Es decir, los ácidos nucleicos se pueden combinar con promotores constitutivos, con preferencia por tejidos u otros promotores para su expresión en plantas. Dichos promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor nuclear de Rsyn7 y otros promotores constitutivos como se describe en WO 99/43838 y en la Patente de EE.UU. N°: 6.072.050; el promotor nuclear CaMV 35S (Odell ef al. (1985) Nature 313: 810-812); el promotor de actina de arroz (McEIroy ef al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); el promotor de ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 y Christensen ef al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); el promotor pEMU (Last ef al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); el promotor el promotor ALS (Patente de EE.UU. N°: 5.659.026) y semejantes. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las que se describen en las Patentes de EE.UU. N°: 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121 ; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; y 5.608.142 y 6.177.611. Se pueden utilizar promotores con preferencia por tejidos para obtener una mayor expresión de CKX dentro de un tejido vegetal particular. Los promotores con preferencia por tejidos incluyen los que se describen en Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata ef al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792-803; Hansen ef al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3): 337-343; Russell ef al. (1997) Transgenics Res. 6(2): 157-168; Rinehart ef al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341 ; Van Camp ef al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181- 196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Nati. Acad. Sci. EE.UU. 90(20): 9586-9590; y Guevara-Garcia ef al. (1993) Plant J. 4(3): 495-505. Dichos promotores se pueden modificar, si fuera necesario, para obtener una expresión débil. Véase, también, la Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 2003/0074698, incorporada en este documento a modo de referencia. Los promotores activos en los tejidos vegetales maternos, tal como flores femeninas, ovarios, aleurona, pedicelo y región formadora del pedicelo, ya sea antes o durante la polinización, pueden ser de particular interés. Los promotores con preferencia por hojas son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Yamamoto ef al. (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kwon ef al. (1994) Plant Physiol. 105: 357-67; Yamamoto ef al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773-778; Gotor ef al. (1993) Plant J. 3: 509-18; Orozco ef al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; Baszczynski et al. (1988) Nucí. Acid Res. 16: 4732; Mitra et al. (1994) Plant Molecular Biology 26: 35-93; Kayaya ef al. (1995) Molecular and General Genetics 248: 668-674; y Matsuoka ef al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 90(20): 9586-9590. Los promotores regulados por la senescencia también son de utilidad, tal como SAM22 (Crowell ef al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 459-466). Los promotores específicos de raíz son conocidos y se pueden seleccionar entre todos los que se encuentran disponibles de la literatura o se pueden aislar de novo a partir de diversas especies compatibles. Véase, por ejemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol Biol. 20(2): 207-218 (gen de la glutamina sintetasa específico de raíz de soja), Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10): 1051-1061 (elemento de control específico de raíz en el gen GRP 1.8 de habichuela verde), Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 433-443; (promotor específico de raíz del gen de la manopina sintetasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); y Miao el al. (1991) Plant Cell 3(1): 11-22 (clon de ADNc de longitud completa que codifica glutamina sintetasa citosólica (GS), que se expresa en raíces y nodulos de raíz de soja). Véase también, Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7): 633-641, donde se describen dos promotores específicos de raíz aislados de genes de hemoglobina de Parasponia andersonii fijadora de nitrógeno no en legumbres y de la especie relacionada Trema tormentosa no fijadora de nitrógeno no en legumbres. Los promotores de estos genes se ligaron a un gen informante ß-glucuronidasa y se introdujeron en la especie no leguminosa Nicotiana tabacum y en la especie leguminosa Lotus corniculatus y en ambos casos se conservó la actividad promotora específica de raíz. Leach y Aoyagi (1991) describen su análisis de los promotores de los genes inductores de raíz de gran expresión rolC y rolD de Agrobacterium rhizogenes (véase Plant Science (Limerick) 79(1): 69-76). Ellos concluyeron que los determinantes de ADN potenciadores y de preferencia por tejidos están disociados en dichos promotores. Teeri et al. (1989) utilizaron fusión de genes con lacZ para demostrar que el gen de ADN-T de Agrobacterium codificador de una octopina sintetasa es especialmente activa en la epidermis de la punta de la raíz y que el gen TR2' es específico de raíces en la planta intacta y estimulada por lesiones en el tejido foliar, una combinación de características especialmente deseable para su uso con un gen insecticida o larvicida (véase EMBO J 8(2): 343-350). El gen TR1 ', fusionado a nptll (neomicina fosfotransferasa II) presentó características similares. Otros promotores con preferencia por raíces incluyen al promotor del gen VfENOD-GRP3 (Kuster et al (1995) Plant Mol. Biol. 29(4): 759-772)' y el promotor rolB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4): y el promotor con preferencia por raíces CRWAQ81 con el primer intrón de ADH (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/961.629, presentada el 8 de octubre, 2004, incorporada en este documento a modo de referencia). Véase también las Patentes de EE.UU. N°: 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732; y 5.023.179. Los promotores asociados con el gen Ckx1 de maíz también puede ser de utilidad para modificar la actividad CKX en raíces; véase las Solicitudes de Patente de EE.UU. N°: 10/109.488 y 11/074.144 (SEQ ID N°: 17 y 18 en la presente).
Los promotores "con preferencia por semillas" incluyen aquellos promotores que son activos durante el desarrollo de las semillas, tal como los que se expresan preferencialmente en los tejidos reproductores femeninos y los que regulan las proteínas de almacenamiento en semillas, así como los promotores que son activos durante la germinación de semillas. Véase Thompson ef al. (1989) BioEssays 10: 108, incorporada en este documento a modo de referencia. Dichos promotores con preferencia por semillas incluyen, a modo de ejemplo, el promotor de zag2.1 de maíz, (GenBank X80206); el promotor de Zap de maíz, también conocido como ZmMADS (publicación de Patente de EE.UU. N°: 2004/0025206); el promotor de eepl de maíz (Publicación de Patente de EE.UU. N°: 2004/0237147); el promotor de led de maíz (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 09/718.754); el promotor de F3.7 de maíz (Baszczynski et al., Maydica (1997) 42: 189-201 (1997); el promotor de tb1 de maíz (Hubbarda et al., Genetics (2002) 162: 1927-1935); el promotor de Zm40 de maíz (Patente de EE.UU. N°: 6.403.862 y WO 01/21783); el promotor de mLIP15 de maíz, Patente de EE.UU. N°: 6.479.734; el promotor de ESR de maíz, Publicación de Patente de EE.UU. N°: 2004/0210960; el promotor de PCNA 2 de maíz (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/388.359 y WO 03/078591); los promotores de Cim1 (mensaje inducido por citoquinina); cZ19B1 (de zeína de 19 kDa de maíz); milps (mio-inositol-1 -fosfato sintetasa) (véase WO 00/11177 y Patente de EE.UU. N°: 6.225.529; incorporada en este documento a modo de referencia). La gamma-zeína es un promotor específico del endosperma. La globulina-1 (Glob-1) es un promotor específico de embriones representativo. Para dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, a modo de ejemplo, ß-faseolina de haba, napina, ß-conglicinina, lectina de soja, cruciferina y semejantes. Para monocotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, a modo de ejemplo, la zeína de 15 kDa, la zeína de 22 kDa, la zeína de 27 kDa, gamma-zeína, waxy, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1 , etc., de maíz. Véase también WO 00/12733 y la Patente de EE.UU. N°: 6.528.704, donde se describen promotores con preferencia por semillas de los genes endl y end2; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Otros promotores específicos de embriones se describen en Sato ef al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. 93: 8117-8122; Nakase et al. (1997) Plant J 12: 235-46; y Postma-Haarsma et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39: 257-71. Otros promotores específicos del endosperma se pueden consultar en Albani et al. (1984) EMBO 3: 1405-15; Albani ef al. (1999) Theor. Appl. Gen. 98: 1253-62; Albani ef al. (1993) Plant J. 4: 343-55; Mena ef al. (1998) The Plant Journal 116: 53-62, y Wu ef a/. (1998) P/anf Ce// Physiology 39: 885-889. Los promotores con preferencia por brotes incluyen los promotores con preferencia por brotes meristemáticos, tal como los promotores descritos en Weigal ef al. (1992) Cell 69: 843-859; N° Acceso AJ 131822; N° Acceso Z7 981 ; N° Acceso AF049870 y los promotores con preferencia por brotes descritos en McAvoy ef al. (2003) Acta Hort. (ISHS) 625: 379-385. Los promotores con preferencia por tejidos meristemáticos o células en división se describen en Ito ef al. (1994) Plant Mol. Biol. 24: 863-878; Reyad ef al. (1995) Mo. Gen. Genet. 248: 703-711 ; Shaul ef al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. 93: 4868-4872; Ito ef al. (1997) Plant J. 11 : 983-992; y Trehin ef a/. (1997) Plant Mol. Biol. 35: 667-672. Los promotores con preferencia por inflorescencias incluyen el promotor de la chalcona sintetasa (Van der Meer ef al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 95-109), LAT52 (Twell ef al. (1989) Mol. Gen. Genet. 217: 240-245), de genes específicos del polen (Albani ef al (1990) Plant Mol Biol. 15: 605, Zm13 (Buerrero ef al. (1993) Mol. Gen. Genet. 224: 161-168), de genes específicos de polen de maíz (Hamilton ef al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 21 1-218), gen que se expresa en polen de girasol (Baltz ef al. (1992) The Plant Journal 2: 713-721), genes específicos del polen de B. napus (Amoldo et al. (1992) J. Cell. Biochem, N° Resumen Y101204). Los promotores inducibles por estrés incluyen los promotores inducibles por estrés por sales/agua, tal como P5CS (Zang ef al. (1997) Plant Sciences 129: 81-89); promotores inducibles por frío, tal como cor15a (Hajela ef al. (1990) Plant Physiol. 93: 1246-1252), cor15b (Wlihelm ef al. (1993) Plant Mol Biol 23: 1073-1077), wsc120 (Ouellet ef al. (1998) FEBS Lett. 423-324-328), c¡7 (Kirch ef al. (1997) Plant Mol Biol. 33: 897-909), ci21A (Schneider ef al. (1997) Plant Physiol. 113: 335-45); promotores inducibles por sequía, tal como, Trg-31 (Chaudhary et al (1996) Plant Mol. Biol. 30: 1247-57), rd29 (Kasuga ef al. (1999) Nature Biotechnology 18: 287-291); promotores inducibles osmóticos, tal como Rabí 7 (Vilardell ef al. (1991) Plant Mol. Biol. 17: 985-93) y osmotina (Raghothama ef al. (1993) Plant Mol Biol 23: 1117-28); y promotores inducibles por calor, tal como las proteínas de shock de calor (Barros ef al. (1992) Plant Mol. 19: 665-75; Marrs ef al. (1993) Dev. Genet. 14: 27-41) y smHSP (Waters ef al. (1996) J. Experimental Botany 47: 325-338). Otros promotores inducibles por estrés incluyen rip2 (Patente de EE.UU. N°: 5.332.808 y la Publicación de Patente de EE.UU. N°: 2003/0217393) y rd29a (Yamaguchi-Shinozaki ef al. (1993) Mol. Gen. Genetics 236: 331-334). Los métodos de la invención comprenden la introducción de un polipéptido o polinucleótido en una célula huésped (es decir, una planta). El término "Introducir" significa presentar a la planta el polinucleótido o polipéptido de tal manera que la secuencia logra acceder al interior de la célula. Los métodos de la invención no dependen de un método particular para introducir la secuencia en la célula huésped, solamente que el polinucleótido o polipéptido pueda acceder al interior de al menos una célula del huésped. Los métodos para introducir polinucleótidos o polipéptidos en células huésped (es decir, plantas) son conocidos en el arte y incluyen, a modo de ejemplo, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitorios y métodos mediados por virus. Una "transformación estable" significa que la construcción de nucleótidos introducida en un huésped (es decir, una planta) se integra en el genoma de la planta y que puede ser heredada por la progenie de la misma. Una "transformación transitoria" significa que un polinucleótido es introducido en el huésped (es decir, una planta) y que se expresa temporalmente o un polipéptido es introducido en un huésped (es decir, una planta). Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias de polipéptidos o polinucleótidos en plantas, pueden variar según el tipo de planta o célula vegetal, es decir monocotiledóneas o dicotiledóneas, pretendido para la transformación. Los métodos para introducir polipéptidos o polinucleótidos en células vegetales adecuados incluyen microinyección Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334; electroporación, Riggs et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 83: 5602-5606; transformación mediada por Agrobacterium, véase por ejemplo, Townsend ef al. Patente de EE.UU. N°: 5.563.055; Zhao ef al., Patente de EE.UU. N°: 5.981 ,840); transferencia directa de genes, Paszkowski et al., (1984) EMBO. J. 3: 2717-2722) y aceleración balística de partículas, véase por ejemplo, Sanford ef al. Patente de EE.UU. N°: 4.945.050; Tomes ef al., Patente de EE.UU. N°: 5.879.918; Tomes ef al., Patente de EE.UU. N°: 5.886.244; Bidney ef al., Patente de EE.UU. N°: 5.932.782; Tomes ef al. (1995) "Direct ADN Transfer ¡nto Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y McCabe ef al. (1988) Biotechnology 6: 923-926; y transformación de Led (WO 00/28058). También véase Weissinger ef al. (1988) Ann Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford ef al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (cebolla); Christou ef al. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (soja); McCabe ef al. (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (soja); Finer y McMullen (1991) In vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh ef al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (soja); Datta ef al. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (arroz); Klein ef al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 85: 4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6: 559-563 (maíz); Tomes, Patente de EE.UU. N°: 5.240.855; Buising ef al., Patentes de EE.UU. N°: 5.322.783 y 5.324.646; Tomes ef al. (1995) 'Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlín) (maíz); Klein ef al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (maíz); Fromm ef al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311: 763-764; Bowen ef al., Patente de EE.UU. N°: 5.736.369 (cereales); Bytebier ef al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 84: 5345-5349 (L/7/aceae); De Wet ef al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman ef al. (Longman, Nueva York), págs. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418; y Kaeppler ef al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (transformación mediada por fibras); D.Halluin ef al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993; Plant Cell Reports 12: 250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda eí al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (maíz mediante Agrobacterium tumefaciens); cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. En realizaciones específicas, las secuencias CKX de la invención se pueden proveer en una planta usando una variedad de métodos de transformación transitorios. Dichos métodos de transformación transitorios incluyen, a modo de ejemplo, la introducción de la proteína CKX, o variantes o fragmentos de la misma, directamente en la planta o la introducción de un transcripto de CKX en la planta. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, microinyección o bombardeo de partículas. Véase, por ejemplo, Crossway ef al. (1986) Mol Gen. Genet. 202: 179-185; Nomura ef al. (1986) Plant Sci. 44: 53-58; Hepler ef al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. 91: 2176-2180 y Hush ef al. (1994) The Journal of Cell Science 107: 775-784, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Como alternativa, el polinucleótido CKX puede ser transformado transitoriamente en la planta usando técnicas conocidas en el arte. Dichas técnicas incluyen un sistema de vectores virales y la precipitación del polinucleótido de una manera que impida la posterior liberación del ADN. Por consiguiente, la transcripción del ADN unido a las partículas puede tener lugar, pero la frecuencia que la que es liberado para integrarse en el genoma es muy reducida. Dichos métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilimina (PEÍ; Sigma N° P3143). En determinadas realizaciones, el polinucleótido de la invención puede ser introducido en plantas por contacto de dichas plantas con un virus o con ácidos nucleicos virales. En general, dichos métodos comprenden la incorporación de una construcción de nucleótidos de la invención en una molécula de ADN o ARN viral. Se considera que la secuencia CKX de la invención puede ser sintetizada inicialmente como parte de una poliproteína viral, que luego puede ser procesada por proteolisis in vivo o in vitro para producir la proteína recombinante deseada. Además, se considera que los promotores de la invención también abarcan los promotores utilizados para la transcripción por las ARN polimerasas virales. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas y expresar una proteína codificada en las mismas, que comprende moléculas de ADN o ARN virales, son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: 5.889.191 , 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 y Porta ef al. (1996) Molecular Biotechnology 5: 209-221; incorporada en este documento a modo de referencia.
Son conocidos en el arte los métodos para una inserción dirigida de un polinucleótido en una ubicación específica en el genoma de la planta. En una realización, la inserción del polinucleótido en una ubicación genómica deseada se logra usando un sistema de recombinación específico del sitio. Véase, por ejemplo, WO99/25821 , WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 y WO99/25853; también las Patentes de EE.UU. N°: 6.552.248, 6.624.297, 6.573.425, 6.455.315 y 6.458.594, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Brevemente, el polinucleótido de la invención puede estar contenido en un cásete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos. El cásete de transferencia es introducido en una planta que ha incorporado de forma estable en su genoma su sitio blanco que está flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que se corresponden con los sitios del cásete de transferencia. Se provee una recombinasa apropiada y el cásete de transferencia es integrado en el sitio blanco. El polinucleótido de interés es integrado así en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta.
Las células, que fueron transformadas, se pueden cultivar hasta obtener plantas según las maneras convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports, 5: 81-84. Luego se pueden cultivar estas plantas y se pueden polinizar con la misma cepa transformada o con cepas diferentes y después se puede identificar la progenie resultante que expresa apropiadamente la característica fenotípica deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica de interés se mantenga de forma estable y que sea heredable y después se puede cosechar las semillas para asegurar que se haya logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención provee semillas transformadas (también denominadas "semillas transgénicas") que contienen un polinucleótido de la invención, por ejemplo, un cásete de expresión de la invención, incorporado de forma estable en su genoma. La cría de pedigrí comienza con el cruzamiento de dos genotipos, tal como una línea de élite de interés y alguna otra línea que posea una o más características deseables (por ejemplo, que han incorporado de forma estable un polinucleótido de la invención, que presentan una actividad y/o nivel modulado del polipéptido de la invención, etc.) que complementa la línea de élite de interés. Si los dos progenitores originales no proveen todas las características deseadas, se pueden incluir otras fuentes en la población de cría. En el método del pedigrí, se autocruzan plantas superiores y se seleccionan en sucesivas generaciones filiales. En las subsiguientes generaciones filiales la condición heterocigota da lugar a líneas homogéneas como resultado de auto-polinización y selección. Típicamente, en el método de cría de pedigrí, se practica autocruzamiento y selección en cinco o más generaciones filiales sucesivas: F1 - F2; F2-» F3; F3 -» F4; F4 ? F5, etc. Después de una endogamia suficiente, las sucesivas generaciones filiales servirán para incrementar las semillas del endogámico desarrollado. Preferentemente, la línea endogámica comprende alelos homocigotas en un 95% aproximadamente o más de sus loci. Se puede emplear retrocruza para transferir una o más características específicamente deseables de una línea, el progenitor donante, a un endogámico denominado progenitor recurrente, que presenta características agronómicas generales buenas aunque no posee la o las características deseables. La retrocruza se puede usar en combinación con la cría de pedigrí para modificar una línea de élite de interés, y se obtiene un híbrido usando la línea de élite modificada. Sin embargo, se puede emplear el mismo procedimiento para mover la progenie hacia el genotipo del progenitor recurrente y retener al mismo tiempo muchos componentes del progenitor no recurrente, deteniendo la retrocruza en una etapa temprana y avanzando con la autocruza y selección. Por ejemplo, se crea una F1, tal como un híbrido comercial. Este híbrido comercial se puede retrocruzar con una de sus líneas progenitoras para crear una BC1 o BC2. La progenie se autocruza y selecciona de modo tal que el endogámico recién desarrollado posea muchos de los atributos del progenitor recurrente y además varios de los atributos deseados del progenitor no recurrente. Este enfoque permiten relevar el valor y la fuerza del progenitor recurrente para su uso en nuevos híbridos y cría. Por ello, una realización de esta invención es un método para elaborar mediante conversión por retrocruza una línea endogámica de maíz de interés, que comprende los pasos de cruzar una planta de la línea endogámica de maíz de interés con una planta donante que comprende un gen o transgen mutante que confiere la característica deseada, seleccionar una planta de progenie F1 que comprende a dicho gen o transgen mutante que confiere la característica deseada y retrocruzar la planta de progenie F1 seleccionada con una planta de la línea endogámica de maíz de interés. Este método puede comprender además el paso de obtener un perfil marcador molecular de la línea endogámica de maíz de interés y usar dicho perfil marcador molecular para seleccionar una planta de progenie con la característica deseada y el perfil marcador molecular de la línea endogámica de interés. De la misma manera, este método se puede usar para producir semillas híbridas F1 por adición de un paso final de cruzar la línea endogámica de maíz de interés convertida a la característica deseada con una planta de maíz diferente para obtener una semilla híbrida F1 de maíz que comprende un gen o transgen mutante que confiere la característica deseada. La selección recurrente es un método utilizado en un programa de cría de plantas para mejorar una población de plantas. El método comprende la polinización cruzada entre plantas individuales entre sí para formar la progenie. Se cultiva la progenie y se selecciona una progenie superior utilizando numerosos métodos de selección, que incluyen plantas individuales, progenie de medio hermanas, progenie de hermanas completas, progenie autocruzada y cruzamiento superior. La progenie seleccionada es sometida a polinización cruzada entre sí para formar la progenie de otra población. Esta población se planta y nuevamente se seleccionan plantas superiores para volver a someterlas a una polinización cruzada entre sí. La selección recurrente es un proceso cíclico y por ello se puede repetir cuantas veces se desee. El objetivo de la selección recurrente es el de mejorar las características de una población. La población mejorada se puede usar luego como fuente de material de cría para obtener líneas endogámicas que se usarán híbridos o como progenitores para un cultivar sintético. Un cultivar sintético es la progenie resultante formada por el entrecruzamiento de varios endogámicos seleccionados. La selección en masa es una técnica útil especialmente cuando se usa junto con selección mejorada por marcadores moleculares. En la selección en masa, las semillas individuales se seleccionan sobre la base del fenotipo y/o genotipo. Estas semillas seleccionadas se agrupan luego y se usan para obtener la siguiente generación. La selección en masa requiere del cultivo de una población de plantas en una parcela de cultivo, la autopolinización de las plantas, la cosecha de las semillas en masa y el posterior uso de una muestra de las semillas cosechadas en masa para plantar la generación siguiente. En lugar de autopolinización, se podría usar una polinización dirigida como parte del programa de cría. La cría por mutación es uno de los numerosos métodos que se podría usar para introducir características nuevas en una línea de élite. Las mutaciones que tienen lugar espontáneamente o que son inducidas artificialmente pueden ser fuentes útiles de variabilidad para un criador de plantas. La meta de la mutagénesis artificial es la de incrementar el índice de mutación para la característica deseada. Los índices de mutación se pueden incrementar con muchos medios diferentes incluyendo temperatura, almacenamiento de semillas a largo plazo, condiciones del cultivo tisular, radiación (tal como rayos X, rayos Gamma (por ejemplo, cobalto 60 o cesio 137), neutrones, (producto de la fisión nuclear del uranio 235 en un reactor atómico), radiación Beta (emitida de radioisótopos tales como fósforo 32 o carbono 14) o radiación ultravioleta (preferentemente entre 2500 y 2900 nm)) o mutágenos químicos (tal como análogos de las bases (5-bromo-uracilo), compuestos relacionados (8-etoxi-cafeína), antibióticos (estreptonigrina), agentes alquilantes (mostazas de azufre, mostazas de nitrógeno, epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso o acridinas. Una vez observada la característica deseada a través de mutagénesis, se puede incorporar dicha característica en un germoplasma existente mediante técnicas de cría tradicionales, tal como retrocruza. Los detalles sobre la cría por mutación se pueden consultar en la publicación de Fehr "Principies of Cultivar Development," 1993, Macmillan Publishing Company, cuyo contenido se incorpora en este documento a modo de referencia. Además, se pueden usar las mutaciones creadas en otras líneas para producir una conversión por retrocruza de una línea de élite que comprende dichas mutaciones. La presente invención se puede utilizar para la transformación de cualquier especie vegetal, incluyendo, pero sin limitaciones, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de especies vegetales de interés incluyen, a modo de ejemplo, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), en particular aquellas especies de Brassica que son de utilidad como fuentes de aceite de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perlado (Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria itálica), mijo dedo (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), alazor (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucífera), ananá (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp), palta (Pernea americana), higo (Ficus casica), guayava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea), papaya (Carica papaya), cajú (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, verduras, ornamentales, pastos y coniferas. Las verduras incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), habas verdes (Phaseolus vulgaris), frijol de media luna (Phaseolus limensis), arvejas (Lathyrus spp.) y miembros del género Curcumis tal como pepino (C. sativus), melón cantalupa (C. cantalupensis) y melón amarillo (C. meló). Las plantas ornamentales incluyen azaleas (Rhododendron spp.), hidrangea (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus), pastora (Euphorbia pulcherrima) y crisantemos. En realizaciones específicas, las plantas de la presente invención son plantas de cultivos (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, alazor, maní, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.). En determinadas realizaciones, se prefieren las plantas de maíz y soja y en otras realizaciones las plantas preferidas son de maíz.
Otras plantas de interés incluyen plantas con granos que proveen semillas de interés, plantas de semillas oleaginosas y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de granos, tal como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas de semillas oleaginosas incluyen algodón, soja, alazor, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palmera, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen habas y arvejas. Las habas incluyen guar, semilla de algarroba, fenogreco, soja, habas de jardín, caupí, habichuela, poroto pallar, haba común, lentejas, garbanzos, etc. Típicamente, una célula huésped intermediaria se usará en la práctica de esta invención para incrementar la cantidad de copias del vector de clonación. Con una mayor cantidad de copias, es posible aislar el vector que contiene al ácido nucleico de interés en cantidades significativas para su introducción en las células de la planta deseada. En una realización, es emplean promotores vegetales que no causan la expresión del polipéptido en bacterias. Los procariotas están representados con mayor frecuencia por diversas cepas de E. coli; sin embargo, también se pueden emplear otras cepas microbianas. Las secuencias de control procariotas comúnmente utilizadas, que en este documento se definen por incluir promotores para el inicio de la transcripción, optativamente con un operador, junto con secuencias del sitio de unión a ribosomas, incluyen los promotores comúnmente utilizados tales como los sistemas promotores de la beta lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang ef al. (1977) Nature 198: 1056), el sistema promotor del triptofano (trp) (Goeddel ef al. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057) y el promotor P L derivado de lambda y sitio de unión a ribosomas del gen N (Shimatake ef al. (1981) Nature 292: 128). La inclusión de marcadores de selección en los vectores de ADN transfectados en E coli. también resulta de utilidad. Los ejemplos de dichos marcadores incluyen genes con resistencia específica a ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol.
El vector se selecciona de manera tal que permita la introducción en la célula huésped apropiada. Los vectores bacterianos son típicamente de origen plasmídico o fago. Las células bacterianas apropiadas son infectadas con partículas del vector fago o transfectadas con el ADN del vector fago desnudo. Si se utiliza un vector plasmídico, las células bacterianas son transfectadas con el ADN del vector plasmídico. Los sistemas de expresión que permiten expresar una proteína de la presente invención se encuentran disponibles utilizando Bacillus sp. y Salmonella (Palva ef al. (1983) Gene 22: 229-235 y Mosbach ef al. (1983) Nature 302: 543-545). Los especialistas en el arte conocen diversos sistemas de expresión en eucariotas, tales como células de levadura, líneas celulares de insectos, células vegetales y de mamíferos. Como se explicará brevemente más adelante, es posible expresar un polinucleótido de la presente invención en estos sistemas eucariotas. En algunas realizaciones, se emplean células vegetales transformadas/transfectadas, como se discutirá infra, como sistemas de expresión para la producción de las proteínas de la presente invención. La síntesis de polinucleótidos heterólogos en levaduras es bien conocida (Sherman, F., et al., (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory). Dos levaduras ampliamente utilizadas para la producción de proteínas eucariontes son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Los vectores, las cepas y los protocolos para la expresión en Saccharomyces y Pichia son conocidos en el arte y se encuentran disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Invitrogen). Los vectores adecuados poseen habitualmente secuencias de control de la expresión, tales como promotores, incluyendo la 3-fosfoglicerato quinasa o alcohol oxidasa, y un origen de replicación, secuencias de terminación y semejantes, según convenga. Una vez expresada la proteína de la presente invención, puede ser aislada de la levadura mediante lisis de las células y la aplicación de técnicas de aislamiento de proteínas estándar a los usados. El seguimiento del proceso de purificación se puede llevar a cabo con técnicas de transferencia Western o radioinmunoensayos o con otras técnicas de inmunoensayos estándar. Las secuencias que codifican las proteínas de la presente invención también se pueden ligar a varios vectores de expresión para su uso en la transfección de cultivos de células de, por ejemplo, mamíferos, insectos o de origen vegetal. Las células de mamífero constituyen cultivos celulares de utilidad para la producción de los péptidos. En el arte se ha desarrollado una cantidad de líneas de células huésped adecuadas, capaces de expresar proteínas intactas e incluyen las líneas celulares HEK293, BHK21 y CHO. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias para el control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor (por ejemplo, el promotor CMV, el promotor HSV tk o el promotor pgk (promotor de la fosfoglicerato quinasa)), un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49 (1986)) y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de procesamiento del ARN, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición poli A Ag T grande SV40) y secuencias terminadoras de la transcripción. Otras células animales que son de utilidad para la producción de las proteínas de la presente invención se encuentran disponibles, por ejemplo, de American Type Culture Collection. Los vectores apropiados para la expresión de las proteínas de la presente invención en células de insecto derivan habitualmente del baculovirus SF9. Las líneas celulares de insecto adecuadas incluyen líneas de larvas de mosquito, gusano de seda, oruga militar, polilla y Drosophila, tal como la línea celular Schneider (Véase Schneider, (1987) J. Embryol. Exp. Morphol. 27: 353-365. Al igual que con levadura, cuando se emplean células huésped de animales o plantas superiores, típicamente se incorporan secuencias terminadoras de la transcripción o de poliadenilación en el vector. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento bovino. También se pueden incluir secuencias para un procesamiento preciso del transcripto. Un ejemplo de una secuencia de procesamiento es el intrón VP1 del SV40 (Sprague, et al., (1983) J. Virol, 45: 773-781). Además, se pueden incorporar secuencias génicas en el vector para controlar la replicación en la célula huésped, tales como los que se hallan en los vectores del tipo del virus del papiloma bovino. (Saveria-Campo (1985) DMA Cloning Vol. II a Practical Approach, D.M. Glover, Ed., IRL Press, Arlington, Virginia, págs. 213-238). Las células huésped de animales y de eucariontes inferiores (por ejemplo, levadura) son competentes o se pueden volver competentes para la transfección utilizando diversos medios. Existen varios métodos bien conocidos para introducir ADN en células animales. Estos métodos incluyen: precipitación por fosfato de calcio, fusión de células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen ADN, tratamiento de células receptoras con liposomas que contienen el ADN, dextrano DEAE, electroporación, biolística y micro-inyección de ADN directamente en las células. Las células transfectadas se cultivan por medios bien conocidos en el arte. (Kuchler, R.J., (1977) Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson y Ross, Inc.. En determinadas realizaciones, los polinucleótidos de la presente invención se pueden apilar con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés adicionales con el fin de crear una planta con el fenotipo deseado con respecto a una o más características. Las combinaciones generadas pueden incluir múltiples copias de cualquiera entre uno o más de los polinucleótidos de interés. Estas combinaciones apiladas pueden ser creadas mediante cualquier método, incluyendo por ejemplo, cruzamiento de plantas con cualquier metodología convencional o TopCross o transformación genética. Si las características se apilaron por transformación genética de las plantas, se pueden combinar las secuencias de polinucleótidos de interés en cualquier momento y en cualquier orden. Por ejemplo, se puede usar una planta transgénica que comprende una o más de las características deseadas como blanco para introducir otras características mediante una posterior transformación. Las características se pueden introducir simultáneamente en un protocolo de cotransformación con los polinucleótidos de interés provistos por cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si se introducirán dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes transformación separadas (trans) o pueden estar contenidas en el mismo cásete de transformación (cis). La expresión de las secuencias de interés puede ser dirigida por el mismo promotor o por promotores diferentes. En determinados casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión de un polinucleótido de interés. Esto se puede acompañar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de características en la planta. //. Modulación de la concentración y/o actividad de un polipéptido CKX Se provee un método para modular la concentración y/o actividad del polipéptido de la presente invención en una planta. En general, la concentración y/o actividad es incrementada o disminuida en al menos un 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% con relación a la planta, parte de planta o célula control nativa que no contiene la secuencia de la invención introducida. La modulación en la presente invención puede tener lugar durante y/o después del crecimiento de la planta hasta la etapa deseada del desarrollo. En realizaciones específicas, los polipéptidos de la presente invención son modulados en monocotiledóneas, en particular en maíz. Se puede emplear una variedad de métodos para evaluar la modulación de la concentración y/o actividad de un polipéptido CKX. Por ejemplo, se puede medir directamente el nivel de expresión del polipéptido CKX, por ejemplo, evaluando el nivel del polipéptido CKX en la planta (es decir, transferencia Western o Northern), o indirectamente, por ejemplo, evaluando la actividad citoquinina oxidasa del polipéptido CKX en la planta. Los métodos para medir la actividad citoquinina oxidasa están descritos en otra parte en la presente. En realizaciones específicas, la modulación de la concentración y/o actividad del polipéptido CKX comprende la modulación (es decir, un incremento o una disminución) en el nivel de citoquinina en la planta. Los métodos para medir el nivel y/o la actividad de citoquinina son conocidos en el arte y se describen en otra parte en la presente. En aún otras realizaciones, el nivel y/o la actividad del polipéptido CKX es modulado en el tejido vegetativo, en el tejido reproductor o en ambos tejidos vegetativo y reproductor. En una realización, la actividad y/o concentración del polipéptido CKX es modulada mediante la introducción del polipéptido o del polinucleótido de la invención en la planta. Posteriormente, se selecciona la planta que contiene la secuencia introducida de la invención usando métodos conocidos por los especialistas en el arte tal como, a modo de ejemplo, análisis de transferencia Southern, secuenciación de ADN, análisis con PCR o análisis fenotípico. La planta o parte de planta alterada o modificada según las realizaciones precedentes se cultiva bajo condiciones formadoras de plantas por el tiempo suficiente como para modular la concentración y/o actividad del polipéptido CKX en la planta. Las condiciones formadoras de plantas son bien conocidas en el arte y se describen brevemente en otra parte de la presente. Se considera también que el nivel y/o actividad del polipéptido puede ser modulado empleando un polinucleótido que no sea capaz de dirigir, en una planta transformada, la expresión de una proteína o un ARN. Por ejemplo, los polinucleótidos de la invención se pueden usar para diseñar construcciones de polinucleótidos que puedan emplearse en los métodos para alterar o mutar una secuencia de nucleótidos genómica en un organismo. Dichas construcciones de polinucleótidos incluyen, a modo de ejemplo, vectores de ARN:ADN, vectores de ARN:ADN de mutación, vectores de reparación de ARN:ADN, oligonucleótidos dobles mixtos, oligonucleótidos de ARN:ADN auto-complementarios y oligonucleobases recombinogénicos. Dichas construcciones de nucleótidos y los métodos de uso de las mismas son conocidos en el arte. Véase, las Patentes de EE.UU. N°: 5.565.350; 5.731.181 ; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972; y 5.871.984; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Véase también, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821 y Beetham ef al. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 96: 8774-8778; incorporadas en este documento a modo de referencia. Por ello se considera que los métodos de la presente invención no dependen de la incorporación de todo el polinucleótido en el genoma, sólo que la planta o una célula de la misma sea alterada como resultado de la introducción del polinucleótido en una célula. En una realización de la invención, es posible alterar el genoma después de la introducción del polinucleótido en una célula. Por ejemplo, se puede incorporar el polinucleótido, o cualquier parte del mismo, en el genoma de la planta. Las alteraciones al genoma de la presente invención incluyen, a modo de ejemplo, adiciones, supresiones y sustituciones de nucleótidos en el genoma. En tanto los métodos de la presente invención no dependen de adiciones, supresiones y sustituciones de ninguna cantidad particular de nucleótidos, se considera que dichas adiciones, supresiones o sustituciones comprenden al menos un nucleótido. Las construcciones genéticas que proveen una expresión reducida de los genes de citoquinina oxidasa se pueden usar en combinación con construcciones que provee una modulación adicional de los niveles eficaces de citoquinina en una planta, incluyendo una mayor biosíntesis de citoquininas, como se describe en la Solicitud co-pendiente de Patente de EE.UU. N°: 09/545.334 presentada el 16 de abril, 1999, y la Publicación de Patente de EE.UU. N°: 2004/0237147, publicada el 24 de noviembre, 2004, incorporadas en este documento a modo de referencia. A Incremento de la actividad y/o el nivel de un polipéptido CKX Se proveen métodos para incrementar la actividad y/o el nivel de un polipéptido CKX de la invención en una planta. Dicho incremento en el nivel y/o la actividad de un polipéptido CKX de la invención se puede lograr proporcionándole a la planta un polipéptido CKX. Dicho polipéptido CKX se puede proveer introduciendo la secuencia de aminoácidos que codifica al polipéptido CKX en la planta, introduciendo en la planta una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido CKX o modificando el locus genómico que codifica al polipéptido CKX de la invención. Como se describe en otra parte de la presente, hay muchos métodos que son conocidos en el arte por proveer un polipéptido a una planta incluyendo, a modo de ejemplo, la introducción directa del polipéptido en la planta, y la introducción en la planta (de forma transitoria o estable) una construcción de un polinucleótido que codifica un polipéptido que posee actividad citoquinina oxidasa. Se considera también que los métodos de la invención pueden emplear un polinucleótido que no es capaz de dirigir, en la planta transformada, la expresión de una proteína o un ARN. Por consiguiente, se puede incrementar el nivel y/o la actividad de un polipéptido CKX alterando el gen que codifica al polipéptido CKX o alterando o afectando su promotor. Véase, por ejemplo, Kmiec, Patente de EE.UU. N°: 5.565.350; Zarling ef al., PCT/US93/03868. Por ello se proveen plantas mutagenizadas que contienen mutaciones en los genes CKX, donde dichas mutaciones incrementan la expresión del gen CKX o incrementan la actividad citoquinina oxidasa del polipéptido CKX codificado. B. Reducción de la actividad y/o el nivel de un polipéptido CKX Se proveen métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido CKX de la invención por transformación de una célula vegetal con un cásete de expresión que expresa un polinucleótido que inhibe la expresión del polipéptido CKX. El polinucleótido puede inhibir la expresión del polipéptido CKX directamente, impidiendo la traducción del ARN mensajero de CKX, o indirectamente, codificando un polipéptido que inhibe la transcripción o traducción de un gen CKX que codifica un polipéptido CKX. Los métodos para inhibir o eliminar la expresión de un gen en una planta son bien conocidos en el arte y se puede usar cualquiera de dichos métodos en la presente invención para inhibir la expresión de un polipéptido CKX. De acuerdo con la presente invención, la expresión de un polipéptido CKX es inhibida si el nivel proteico del polipéptido CKX es menor que el nivel proteico del mismo polipéptido CKX en una planta o parte de planta que no ha sido modificado genéticamente o mutagenizada para inhibir la expresión de dicho polipéptido CKX. En realizaciones particulares de la invención, el nivel proteico del polipéptido CKX en una planta o parte de planta modificada de acuerdo con la invención es menor que 70%, menor que 60%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20%), menor que 10%, menor que 5%, o menor que 2% con respecto al nivel proteico del mismo polipéptido CKX en una planta o parte de planta que no es un mutante o que no ha sido modificado genéticamente para inhibir la expresión de dicho polipéptido CKX. El nivel de expresión del polipéptido CKX se puede medir directamente, por ejemplo, evaluando el nivel de polipéptido CKX expresado en la célula vegetal o planta, o indirectamente, por ejemplo, midiendo la actividad citoquinina oxidasa del polipéptido CKX en la célula vegetal o planta o midiendo el nivel de citoquinina o actividad en la planta o célula vegetal. Los métodos para efectuar dichos ensayos están descritos en otra parte en la presente. En determinadas realizaciones de la invención, la actividad de los polipéptidos CKX es reducida o eliminada por transformación de una célula vegetal con un cásete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que inhibe la actividad de un polipéptido CKX. La actividad citoquinina oxidasa de un polipéptido CKX está inhibida de acuerdo con la presente invención si la actividad citoquinina oxidasa del polipéptido CKX es menor que la actividad citoquinina oxidasa del mismo polipéptido CKX en una planta que no ha sido modificada para inhibir la actividad citoquinina oxidasa de dicho polipéptido CKX. En realizaciones particulares de la invención, la actividad citoquinina oxidasa del polipéptido CKX en una planta modificada de acuerdo con la invención es menor que un 70%, menor que un 60%, menor que un 50%, menor que un 40%), menor que un 30%, menor que un 20%, menor que un 10% o menor que un 5% de la actividad citoquinina oxidasa del mismo polipéptido CKX en una planta que no ha sido modificada para inhibir la expresión de dicho polipéptido CKX. La actividad citoquinina oxidasa de un polipéptido CKX es "eliminada" de acuerdo con la invención cuando no es detectable con los métodos de ensayo descritos en otra parte en la presente. Los métodos para determinar la actividad citoquinina oxidasa de un polipéptido CKX están descritos en otra parte en la presente. En otras realizaciones, la actividad de un polipéptido CKX puede ser reducida o eliminada por ruptura del gen que codifica al polipéptido CKX. La invención abarca plantas mutagenizadas que contienen mutaciones en los genes CKX, donde dichas mutaciones reducen la expresión del gen CKX o inhiben la actividad citoquinina oxidasa del polipéptido CKX codificado. Por consiguiente, se pueden usar muchos métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido CKX. Además, se puede usar más de un método para reducir la actividad de un solo polipéptido CKX. Los ejemplos no limitativos de métodos para reducir o eliminar la expresión de un polipéptido CKX se ofrecen a continuación. 1. Métodos basados en polín ucleótldos: En algunas realizaciones de la presente invención, se transforma una planta con un cásete de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de un polipéptido CKX de la invención. El término "expresión" tal como se utiliza en la presente se refiere a la biosíntesis de un producto genético, incluyendo la transcripción y/o traducción de dicho producto genético. Por ejemplo, a los efectos de la presente invención, un cásete de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de al menos un polipéptido CKX es un cásete de expresión capaz de producir una molécula de ARN que inhibe la transcripción y/o traducción de al menos un polipéptido CKX de la invención. La "expresión" o "producción" de una proteína o polipéptido a partir de una molécula de ADN se refiere a la transcripción y traducción de la secuencia de codificación para producir la proteína o el polipéptido, en tanto la "expresión" o "producción" de una proteína o polipéptido a partir de una molécula de ARN se refiere a la traducción de la secuencia de codificación del ARN para producir la proteína o el polipéptido. Los ejemplos de polinucleótidos que inhiben la expresión de un polipéptido CKX se ofrecen a continuación. /. Supresión/cosupresión en el sentido del marco de lectura En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión de un polipéptido CKX se puede obtener mediante supresión o cosupresión en el sentido del marco de lectura. Para la cosupresión, se diseña un cásete de expresión para expresar una molécula de ARN correspondiente a todo o parte de un ARN mensajero que codifica un polipéptido CKX orientado "en el sentido del marco de lectura". La sobreexpresión de esta molécula de ARN puede dar como resultado una expresión reducida del gen nativo. Por consiguiente, se examinan múltiples líneas de plantas transformadas con el cásete de expresión de cosupresión para identificar a las que muestran la mayor inhibición de la expresión del polipéptido CKX. El polinucleótido usado para la cosupresión puede corresponder a toda o una parte de la secuencia que codifica al polipéptido CKX, todo o parte de la región no traducida 5' y/o 3' de un transcripto del polipéptido CKX, o todo o parte de la secuencia de codificación y las regiones no traducidas de un transcripto que codifica un polipéptido CKX. En algunas realizaciones donde el polinucleótido comprende todo o parte de la región de codificación del polipéptido CKX, el cásete de expresión se diseña para eliminar el codón de inicio del polinucleótido de modo que no se traducirá ningún producto proteico. La cosupresión se puede usar para inhibir la expresión de genes vegetales para producir plantas que poseen niveles de no detectables para las proteínas codificadas por estos genes. Véase, por ejemplo, Broin ef al. (2002) Plant Cell 14: 1417-1432. La cosupresión también se puede usar para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°: 5.942.657. Los métodos para usar cosupresión para inhibir la expresión de genes endógenos en plantas se describen en Flavell ef al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 91 : 3490-3496; Jorgensen et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31 : 957- 973; Johansen y Carrington (2001) Plant Physiol. 126: 930-938; Broin et al. (2002) Plant Cell 14: 1417-1432; Stoutjesdijk ef al. (2002) Plant Physiol. 129: 1723-1731 ; Yu et al. (2003) Phytochemistry 63: 753-763; y Patentes de EE.UU. N°: 5.034.323, 5.283.184 y 5.942.657; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Se puede incrementar la eficacia de la cosupresión incluyendo una región poli-dT en el cásete de expresión en una posición 3' con respecto a la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura y 5' con respecto a la señal de poliadenilación. Véase, la Publicación de Patente de EE.UU. N°: 20020048814, incorporada en este documento a modo de referencia. Típicamente, tal secuencia de nucleótidos presenta una identidad de secuencia sustancial con la secuencia del transcripto del gen endógeno, preferentemente más que un 65% aproximadamente de identidad de secuencia, más preferentemente más que aproximadamente un 85% de identidad de secuencia, con mayor preferencia más que un 95% aproximadamente de identidad de secuencia. Véase, las Patentes de EE.UU. N°: 5.283.184 y 5.034.323; incorporada en este documento a modo de referencia. //'. Supresión antisentido En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión del polipéptido CKX se puede lograr mediante supresión antisentido. Para la supresión antisentido, el cásete de expresión se diseña para que exprese una molécula de ARN complementaria de todo o parte del ARN mensajero que codifica al polipéptido CKX. La sobreexpresión de la molécula de ARN antisentido puede dar como resultado una expresión reducida del gen nativo. Por consiguiente, se examinan múltiples líneas de plantas transformadas con el cásete de expresión para supresión antisentido con el fin de identificar las que muestran la mayor inhibición de la expresión del polipéptido CKX. El polinucleótido de uso en la supresión antisentido puede corresponder a todo o parte del complemento de la secuencia que codifica al polipéptido CKX, todo o parte del complemento de la región no traducida 5' y/o 3' del transcripto CKX o todo o parte del complemento de la secuencia de codificación y la regiones no traducidas de un transcripto que codifica al polipéptido CKX. Además, el polinucleótido antisentido puede ser completamente complementario (es decir, 100% idéntico al complemento de la secuencia de interés) o parcialmente complementario (es decir, menos que un 100% idéntico al complemento de la secuencia de interés) de la secuencia de interés. La supresión antisentido se puede usar para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°: 5.942.657. Aún más, se pueden usar porciones de los nucleótidos antisentido para interrumpir la expresión del gen de interés. En general, se pueden usar secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 300, 400, 450, 500, 550 o más nucleótidos. Los métodos para usar supresión antisentido en la inhibición de la expresión de genes endógenos en plantas se describen, por ejemplo, en Liu ef al. (2002) Plant Physiol. 129: 1732-1743 y en las Patentes de EE.UU. N°: 5.759.829 y 5.942.657, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Es posible incrementar la eficacia de la supresión antisentido incluyendo una región poli-dT en el cásete de expresión en una posición 3' con respecto a la secuencia antisentido y 5' con respecto a la señal de poliadenilación. Véase, la publicación de Patente de EE.UU. N°: 20020048814, incorporada en este documento a modo de referencia. ///. Interferencia con ARN de cadena doble En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión de un polipéptido CKX se puede lograr por interferencia con ARN de cadena doble (ARNcd). Para la interferencia con ARNcd, se expresa una molécula de ARN orientada en el sentido del marco de lectura como la que se describió precedentemente para la cosupresión y una molécula de ARN antisentido que es completa o parcialmente complementaria de la molécula de ARN orientada en el sentido del marco de lectura en la misma célula, dando como resultado la inhibición de la expresión del correspondiente ARN mensajero endógeno. La expresión de las moléculas orientadas en el sentido del marco de lectura y antisentido se puede lograr diseñando el cásete de expresión para que contenga una secuencia orientada secuencia orientada en el sentido del marco de lectura y una secuencia antisentido. Como alternativa, se pueden usar casetes de expresión separados para las secuencias orientadas en el sentido del marco de lectura y las secuencias antisentido. Se pueden examinar múltiples líneas de plantas transformadas con el o los casetes de expresión para interferencia con ARNcd con el fin de identificar las líneas de plantas que muestran la mayor inhibición de la expresión del polipéptido CKX. Los métodos para usar interferencia con ARNcd en la inhibición de la expresión de genes endógenos vegetales se describen en Waterhouse ef al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 95: 13959-13964, Liu et al. (2002) Plant Physiol. 129: 1732-1743, y WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631 y WO 00/49035; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. iv. Interferencia con ARN en horquilla e interferencia con ARN en horquilla que contiene intrones En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión de uno o más polipéptidos CKX se puede obtener mediante la interferencia con ARN en horquilla (ARNh) o la interferencia con ARN en horquilla que contiene intrones (ARNhi). Estos métodos son altamente eficaces para inhibir la expresión de genes endógenos. Véase, Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4: 29-38 y las referencias citadas en las mismas.
Para la interferencia con ARNh, se diseña un cásete de expresión para que exprese una molécula de ARN que se hibridiza consigo misma para formar una estructura en horquilla que comprende una región de bucle de cadena simple y un tallo con apareamiento de bases. La región del tallo con apareamiento de bases comprende una secuencia orientada en el sentido del marco de lectura correspondiente a todo o parte del ARN mensajero endógeno que codifica al gen cuya expresión se desea inhibir y una secuencia antisentido que es completa o parcialmente complementaria de la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura. Por consiguiente, la región del tallo con apareamiento de bases de la molécula generalmente determina la especificidad de la interferencia con ARN. Como alternativa, la región del tallo con apareamiento de bases puede comprender secuencias complementarias correspondientes a una región promotora seleccionada, dando como resultado el silenciamiento de la secuencia de codificación ligada operativamente a dicho promotor seleccionado. Véase, por ejemplo, Mette ef al. (2000) EMBO J 19(19): 5194-5201. Las moléculas de ARNh son altamente eficaces en la inhibición de la expresión de genes endógenos y la interferencia con ARN que inducen es heredada por las generaciones subsiguientes de las plantas. Véase, por ejemplo, Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU 97: 4985-4990; Stoutjesdijk ef al. (2002) Plant Physiol. 129: 1723-1731; y Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4: 29-38. Los métodos para usar la interferencia con ARNh para inhibir o silenciar la expresión de genes se describen, por ejemplo, en Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 97: 4985-4990; Stoutjesdijk ef al. (2002) Plant Physiol. 129: 1723-1731 ; Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4: 29-38; Pandolfini ef al. BMC Biotechnology 3: 7, y la publicación de Patente de EE.UU. N°: 20030175965; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Panstruga ef al. (2003) Mol. Biol. Rep. 30: 135-140, incorporada en este documento a modo de referencia, han descrito un ensayo transitorio para determinar la eficacia de las construcciones de ARNh en el silenciamiento de la expresión genética in vivo. Para el ARNhi, las moléculas que interfieren tienen la misma estructura general que para el ARNh, pero la molécula de ARN comprende además un intrón capaz de procesarse en la célula en la cual se expresa el ARNhi. El uso de un intrón minimiza el tamaño del bucle en la molécula de ARN en horquilla después del procesamiento, y esto incrementa la eficacia de la interferencia. Véase, por ejemplo, Smith et al. (2000) Nature 407: 319-320. De hecho, Smith et al. muestran un 100%) de supresión de la expresión genética endógena usando interferencia mediada por ARNhi. Los métodos para usar la interferencia con ARNhi para inhibir la expresión de genes endógenos vegetales se describen, por ejemplo, en Smith et al. (2000) Nature 407: 319-320; Wesley et al. (2001) Plant J. 27: 581-590; Wang y Waterhouse (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5: 146-150; Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4: 29-38; Helliwell y Waterhouse (2003) Methods 30: 289-295, y en la publicación de Patente de EE.UU. N°: 20030180945, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. El cásete de expresión para la interferencia con ARNh también se puede diseñar de modo tal que la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura y la secuencia antisentido no corresponden al ARN endógeno. En esta realización, la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura y la secuencia antisentido flanquean una secuencia en bucle que comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a todo o parte del ARN mensajero endógeno del gen de interés. Por consiguiente, es la región del bucle que determina la especificidad de la interferencia con ARN. Véase, por ejemplo, WO 02/00904, incorporada en este documento a modo de referencia. v. Interferencia mediada por amplicones Los casetes de expresión de amplicones comprenden una secuencia derivada de un virus de plantas que contiene todo o parte del gen de interés pero en general no todos los genes del virus nativo. Las secuencias virales presentes en el producto de transcripción del cásete de expresión permiten que el producto de la transcripción dirija su propia replicación. Los transcriptos producidos por el amplicón pueden estar orientados en el sentido del marco de lectura o antisentido con relación a la secuencia de interés (es decir, el ARN mensajero del polipéptido CKX). Los métodos para usar amplicones en la inhibición de la expresión de genes endógenos vegetales se describen, por ejemplo, en Angelí y Baulcombe (1997) EMBO J. 16: 3675-3684, Angelí y Baulcombe (1999) Plant J. 20: 357-362, y en la Patente de EE.UU. N°: 6.646.805, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. vi. Ribozimas En algunas realizaciones, el polinucleótido expresado por el cásete de expresión de la invención es ARN catalítico o posee una actividad ribozima específica del ARN mensajero del polipéptido CKX. Por consiguiente, el polinucleótido causa la degradación del ARN mensajero endógeno, dando como resultando una menor expresión del polipéptido CKX. Este método se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N°: 4.987.071 , incorporada en este documento a modo de referencia. vii ARN pequeño de interferencia o micro ARN En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión de un polipéptido CKX se puede lograr mediante interferencia con ARN por expresión de un gen que codifica un micro ARN (ARNmi). Los ARNmi son agentes reguladores que consisten de 22 ribonucleótidos aproximadamente. Los ARNmi son altamente eficaces en la inhibición de la expresión de genes endógenos. Véase, por ejemplo Javier ef al. (2003) Nature 425: 257-263, incorporada en este documento a modo de referencia. Para la interferencia con ARNmi, el cásete de expresión es diseñado para que exprese una molécula de ARN que es modelado sobre un gen de ARNmi endógeno. El gen del ARNmi codifica un ARN que forma una estructura en horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria de otro gen endógeno (secuencia blanco). Para la supresión de la expresión de CKX, la secuencia de 22 nucleótidos se selecciona de una secuencia del transcripto de CKX y contiene 22 nucleótidos de dicha secuencia de CKX orientados en el sentido del marco de lectura y 21 nucleótidos de una correspondiente secuencia antisentido que es complementaria de la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura. Las moléculas de ARNmi son altamente eficaces en la inhibición de la expresión de genes endógenos y la interferencia con ARN que inducen es heredada por las posteriores generaciones de plantas. 2. Inhibición de la expresión genética basada en polipéptidos En una realización, el polinucleótido codifica una proteína en dedo de zinc que se une a un gen que codifica un polipéptido CKX, dando como resultado una menor expresión del gen. En realizaciones particulares, la proteína en dedo de zinc se une a una región reguladora de un gen CKX. En otras realizaciones, la proteína en dedo de zinc se une a un ARN mensajero que codifica un polipéptido CKX e impide su traducción. Los métodos para seleccionar sitios para el direccionamiento por proteínas en dedo de zinc se describieron, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N°: 6.453.242, y los métodos para usar proteínas en dedo de zinc para inhibir la expresión de genes en plantas se describen, por ejemplo, en la publicación de Patente de EE.UU. N°: 20030037355; cuyo contenido se incorpora en este documento a modo de referencia. 3. Inhibición de la actividad proteica basada en polipéptidos En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido codifica un anticuerpo que se une a por lo menos un polipéptido CKX, y reduce la actividad citoquinina oxidasa del polipéptido CKX. En otra realización, la unión del anticuerpo da como resultado un mayor recambio del complejo de anticuerpo-CKX por los mecanismos de control de calidad celulares. La expresión de anticuerpos en células vegetales y la inhibición de las vías moleculares por expresión y unión de anticuerpos a proteínas en células vegetales son bien conocidas en el arte. Véase, por ejemplo, Conrad y Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21 : 35-36, incorporada en este documento a modo de referencia. 4. Ruptura de genes En algunas realizaciones de la presente invención, se reduce o elimina la actividad de un polipéptido CKX interrumpiendo al gen que codifica el polipéptido CKX. El gen que codifica al polipéptido CKX puede ser interrumpido utilizando cualquier método conocido en el arte. Por ejemplo, en una realización, el gen se interrumpe mediante marcación con transposones. En otra realización, el gen es interrumpido por mutaciones en las plantas usando mutagénesis aleatoria o dirigida, y seleccionando las plantas que presentan una menor actividad citoquinina oxidasa. /. Marcación con transposones En una realización de la invención, se usa marcación con transposones para reducir o eliminar la actividad CKX de uno o más polipéptidos CKX. La marcación con transposones comprende la inserción de un transposón dentro de un gen CKX endógeno para reducir o eliminar la expresión del polipéptido CKX. El término "gen CKX" se refiere al gen que codifica un polipéptido CKX acorde con la invención. En esta realización, se reduce o elimina la expresión de uno o más polipéptidos CKX insertando un transposón dentro de una región reguladora o región de codificación del gen que codifica al polipéptido CKX. Un transposón que se encuentra dentro de un exón, intrón, secuencia no traducida 5' o 3', un promotor o cualquier otra secuencia reguladora del gen CKX se puede usar para reducir o eliminar la expresión y/o la actividad del polipéptido CKX codificado. Los métodos de marcación con transposones de genes específicos en plantas son bien conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Maes ef al. (1999) Trends Plant Sci. 4: 90-96; Dharmapuri y Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179: 53-59; Meissner ef al. (2000) Plant J. 22: 265-274; Phogat ef al. (2000) J. Biosci. 25: 57-63; Walbot (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2: 103-107; Gai ef al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 94-96; Fitzmaurice ef al. (1999) Genetics 153: 1919-1928). Además, en Bensen ef al. (1995) Plant Cell 7: 75-84; Mena ef a/. (1996) Science 274: 1537-1540; y en la Patente de EE.UU. N°: 5.962.764; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia, se describe el proceso TUSC para seleccionar inserciones Mu en genes selectos. //. Plantas mutantes con actividad reducida Hay otros métodos para disminuir o eliminar la expresión de genes endógenos en plantas que también son conocidos en el arte y que se pueden aplicar de manera similar a la presente invención. Estos métodos incluyen otras formas de mutagénesis, tal como mutagénesis inducida por metansulfonato de etilo, mutagénesis por supresión y mutagénesis por supresión con irradiación rápida de neutrones usada en una genética inversa orientada en el sentido del marco de lectura (con PCR) para identificar líneas de plantas en las cuales se ha suprimido el gen endógeno. Por ejemplos sobre estos métodos véase Ohshima ef al. (1998) Virology 243: 472-481 ; Okubara ef al. (1994) Genetics 137: 867-874; y Quesada et al. (2000) Genetics 154: 421-436; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Además, un método rápido y automatizable para rastrear mutaciones inducidas químicamente, el método TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes), que emplea HPLC desnaturalizante o digestión selectiva de endonucleasas de productos seleccionados de una PCR también es aplicable en la presente invención. Véase McCallum ef al. (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455-457, incorporada en este documento a modo de referencia. Las mutaciones que afectan la expresión genética o que interfieren con la función (actividad citoquinina oxidasa) de la proteína codificada son bien conocidas en el arte. Las mutaciones por inserción en los exones de los genes habitualmente dan como resultado mutantes nulos. Las mutaciones en los residuos conservados son particularmente eficaces para inhibir la actividad citoquinina oxidasa de la proteína codificada. Se han descrito residuos conservados de los polipéptidos CKX vegetales adecuados para una mutagénesis con la finalidad de eliminar la actividad citoquinina oxidasa. Véase, por ejemplo, las Figuras 1 y 9 y los ejemplos 1 y 7. Dichos mutantes pueden ser aislados de acuerdo con procedimientos bien conocidos, y es posible apilar las mutaciones en diferentes loci de CKX por cruzamiento genético. Véase, por ejemplo, Gruis ef al. (2002) Plant Cell 14: 2863-2882. En otra realización de esta invención, se pueden usar los mutantes dominantes para provocar un silenciamiento del ARN debido a la inversión de genes y la recombinación de un locus genético duplicado. Véase, por ejemplo, Kusaba ef al. (2003) Plant Cell 15: 1455-1467. La invención abarca métodos adicionales para reducir o eliminar la actividad de uno o más polipéptidos CKX. Los ejemplos de otros métodos para alterar o mutar una secuencia de nucleótidos genómica en una planta son conocidos en el arte e incluyen, a modo de ejemplo, el uso de vectores de ARN:ADN, vectores , de ARN:ADN de mutación, vectores de reparación de ARN:ADN, oligonucleótidos dobles mixtos, oligonucleótidos de ARN:ADN auto-complementarios y oligonucleobases recombinogénicos. Dichos vectores y métodos de uso son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: 5.565.350; 5.731.181 ; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972; y 5.871.984; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Véase también, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821 y Beetham ef al. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 96: 8774-8778; incorporadas en este documento a modo de referencia. ///. Modulación del nivel/actividad de la citoquinina Tal como se utiliza en la presente, una "citoquinina" se refiere a una clase de hormonas específicas de plantas que cumplen una función central durante el ciclo celular y afectan numerosos programas del desarrollo. Las citoquininas comprenden derivados de purinas sustituidos en N6. Las citoquininas representativas incluyen ¡sopenteniladenina (N6-(?2-isopenteniI)adenina (de aquí en adelante, iP), zeatina (6-(4-hidroxi-3-metilbut-trans-2-enilamino)purina) (de aquí en adelante, Z) y dihidrozeatina (DZ). Se cree que las bases libres y sus ribósidos (iPR, ZR y DZR) son los compuestos activos. Se conocen otras citoquininas. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°: 5.211.738. La "modulación del nivel y/o de la actividad de citoquininas" incluye cualquier disminución o incremento en el nivel y/o la actividad de las citoquininas en plantas. Por ejemplo, la modulación del nivel y/o la actividad puede comprender ya sea un incremento o una disminución en el contenido general de citoquinina de aproximadamente 0,1 %, 0,5%, 1%, 3% 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más en comparación con una planta o parte de planta control. Como alternativa, el nivel y/o la actividad modulado de la citoquinina puede incluir un incremento o una disminución de aproximadamente 0,5 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 8 veces, 16 veces o 32 veces en el nivel/actividad de citoquinina en la planta o en una parte de planta en comparación con una planta o parte de planta control. Se considera además que la modulación del nivel/actividad de citoquinina no necesariamente sea un incremento/disminución global en el nivel y/o la actividad de la citoquinina, sino que también incluye un cambio en la distribución en tejidos de la citoquinina. Por ejemplo, los polipéptidos CKX pueden afectar la cantidad de citoquinina importada en tejidos específicos o exportada de un tejido productor de citoquinina. Por ejemplo, la importación de citoquinina en los tejidos de reserva puede comprender un paso de transporte apoplástico, donde los polipéptidos CKX controlan el nivel de las citoquininas fisiológicamente activas. Véase, por ejemplo, Jones ef al. (1997) Plant Growth Regul 23: 123-134, Turner ef al. (1985) Plant Physiol 79: 321-322, y Mok ef al. (2001) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52: 89-118, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Más aún, la modulación del nivel/actividad de citoquininas no comprende necesariamente un incremento/disminución global en las citoquininas, sino que también incluye un cambio en la relación de los distintos derivados de citoquininas. Por ejemplo, se puede alterar la relación de los diversos derivados de citoquinina tal como de tipo isopenteniladenina, de tipo zeatina o de tipo dihidrozeatina citoquininas, y semejantes, y de esa manera se puede modular el nivel/actividad de la citoquinina de la planta o parte de planta en comparación con una planta control. Los métodos para evaluar la modulación en el nivel y/o la actividad de la citoquinina son conocidos en el arte. Por ejemplo, los métodos representativos para la extracción, inmunopurificación, separación por HPLC y cuantificación con métodos de ELISA de citoquininas se pueden consultar en Faiss ef al. (1997) Plant J. 12: 401-415. Véase también Werner ef al. (2001) PNAS 98: 10487-10492) y Dewitte et al. (1999) Plant Physiol. 119: 111-121. Cada una de estas referencias se incorpora en este documento a modo de referencia. En métodos específicos, se disminuye el nivel y/o actividad de una citoquinina en una planta incrementando el nivel o la actividad del polipéptido CKX en dicha planta. Los métodos para incrementar el nivel y/o la actividad de polipéptidos CKX en una planta se describen en otra parte de la presente. Brevemente, dichos métodos comprenden la provisión de un polipéptido CKX de la invención en una planta y de esa manera se incrementa el nivel y/o actividad del polipéptido CKX. En otras realizaciones, se puede proveer una secuencia de nucleótidos CKX que codifica un polipéptido CKX por introducción en la planta de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos CKX de la invención, expresión de la secuencia CKX, que incrementa la actividad del polipéptido CKX, y de esa manera disminuye el nivel y/o la actividad de una citoquinina en la planta o parte de planta. En determinadas realizaciones, la construcción de nucleótidos CKX introducida en la planta es incorporada de forma estable en el genoma de la planta. En otros métodos, se incrementa el nivel y/o actividad de una citoquinina en una planta disminuyendo el nivel y/o la actividad del polipéptido CKX en dicha planta. Dichos métodos se describen con detalle en otra parte de la presente. En uno de dichos métodos, se introduce una secuencia de nucleótidos CKX en la planta y la expresión de dicha secuencia de nucleótidos CKX disminuye la actividad del polipéptido CKX y de esa manera incrementa el nivel y/o la actividad de la citoquinina en la planta o parte de planta. En determinadas realizaciones, la construcción de nucleótidos CKX introducida en la planta es incorporada de forma estable en el genoma de la planta. Como se describió precedentemente, el especialistas podrá reconocer el promotor apropiado para su uso para modular el nivel/actividad de una citoquinina en una planta. Los ejemplos de promotores para esta realización se describieron en otra parte de la presente. Por consiguiente, la presente invención provee además plantas que poseen un nivel/actividad modulado de una citoquinina en comparación con el nivel/actividad de citoquinina de una planta control. En una realización, la planta de la invención presenta un mayor nivel/actividad del polipéptido CKX de la invención y por consiguiente presenta un menor nivel/actividad de citoquinina. En otras realizaciones, la planta de la invención presenta un nivel reducido o eliminado del polipéptido CKX de la invención y por consiguiente presenta un mayor nivel/actividad de la citoquinina. En determinadas realizaciones, dichas plantas han incorporado de forma estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos CKX de la invención ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. IV. Modulación del desarrollo radicular Se proveen métodos de modulación del desarrollo radicular en una planta. El término "modulación del desarrollo radicular" se refiere a cualquier alteración en el desarrollo de la raíz de la planta en comparación con una planta control. Dichas alteraciones en el desarrollo radicular incluyen, a modo de ejemplo, alteraciones en el índice de crecimiento de la raíz primaria, el peso fresco de la raíz, el grado de formación de raíces laterales y adventicias, el sistema vascular, desarrollo del meristema o expansión radial. Se proveen métodos para modular el desarrollo radicular en una planta. Los métodos comprenden la modulación del nivel y/o de la actividad del polipéptido CKX en la planta. En un método, se provee una secuencia CKX de la invención en la planta. En otro método, la secuencia de nucleótidos CKX se provee introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos CKX de la invención, expresando la secuencia CKX, y modificando así el desarrollo radicular. En aún otros métodos, la construcción de nucleótidos CKX introducida en la planta es incorporada de forma estable en el genoma de la planta. En otros métodos, el desarrollo radicular se modula incrementando el nivel o la actividad del polipéptido CKX en la planta. Un incremento en la actividad CKX puede dar como resultado una o más alteraciones en el desarrollo radicular, incluyendo, a modo de ejemplo, meristemas radiculares más grandes, mayor crecimiento de las raíces, mayor expansión radial, un sistema de vasculatura mejorado, una mayor ramificación de las raíces, más raíces adventicias y/o un incremento en peso fresco de la raíz en comparación con una planta control. Tal como se utiliza en la presente, el término "crecimiento radicular" abarca todos los aspectos de crecimiento de las diferentes partes que conforman el sistema radicular en diferentes etapas de su desarrollo en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se debe tener en cuenta que dicho mayor crecimiento radicular puede ser el resultado de un mayor crecimiento de una o más de sus partes incluyendo la raíz primaria, las raíces laterales, raíces adventicias, etc. Los métodos para medir dichas alteraciones del desarrollo en el sistema radicular son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 2003/0074698 y Werner et al. (2001) PNAS 18: 10487-10492, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia.
Como se describió precedentemente, el especialista podrá reconocer al promotor apropiado para su uso en la modulación del desarrollo radicular en la planta. Los ejemplos de promotores para esta realización incluyen promotores constitutivos y promotores con preferencia por raíces. Los ejemplos de promotores con preferencia por raíces se describieron en otra parte de la presente. La estimulación del crecimiento radicular y el incremento en la masa radicular mediante un aumento en la actividad y/o nivel del polipéptido CKX también son de utilidad en el mejoramiento de la capacidad de permanecer en pie de una planta. El término "resistencia al vuelco" o "capacidad de permanecer en pie" se refiere a la capacidad de una planta de fijarse a sí misma en el suelo. Para las plantas con un hábito de crecimiento erecto o semi-erecto, este término también se refiere a la capacidad para mantener una posición erguida bajo condiciones adversas, tal como ambientes adversos. Esta característica se relaciona con el tamaño, la profundidad y la morfología del sistema radicular.
Además, la estimulación del crecimiento radicular y el incremento de la masa radicular mediante un aumento en el nivel y/o la actividad del polipéptido CKX también son de utilidad en la promoción de la propagación de explantes in vitro. Además, una mayor producción de biomasa radicular debida a un incremento en el nivel y/o la actividad de CKX tiene un efecto directo sobre el rendimiento y un efecto indirecto . sobre la producción de los compuestos producidos por las células de la raíz o las células transgénicas de la raíz o los cultivos celulares de dichas células transgénicas de la raíz. Un ejemplo de un compuesto interesante producido en cultivos de raíces es la shikonina, cuyo rendimiento puede mejorarse ventajosamente con dichos métodos. Por consiguiente, la presente invención provee además plantas que presentan un desarrollo radicular modulado en comparación con el desarrollo radicular de una planta control. En algunas realizaciones, la planta de la invención presenta un mayor nivel/actividad del polipéptido CKX de la invención y mejoras en el crecimiento radicular y/o la biomasa de la raíz. En determinadas realizaciones, dichas plantas han incorporado de forma estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos CKX de la invención ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. V. Modulación del desarrollo de brotes y de hojas También se proveen métodos para modular el desarrollo de brotes y de hojas en una planta. El término "modulación del desarrollo de brotes y/o de hojas" se refiere a cualquier alteración en el desarrollo de brotes y/o de hojas de la planta. Dichas alteraciones en el desarrollo de brotes y/o de hojas incluyen, a modo de ejemplo, alteraciones en el desarrollo de brotes del meristema, en la cantidad de hojas, el tamaño de hojas, en la vasculatura de hojas y tallo, longitud de internodos y senescencia de las hojas. Tal como se utiliza en la presente, los términos "desarrollo de hojas" y "desarrollo de brotes" abarca todos los aspectos del crecimiento de las diferentes partes que conforman el sistema foliar y el sistema de brotes, respectivamente, en las diferentes etapas de su desarrollo, tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Los métodos para medir dichas alteraciones del desarrollo en el sistema de brotes y el sistema foliar son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Werner et al. (2001) PNAS 98: 10487-10492 y la Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 2003/0074698, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. El método para modular el desarrollo de brotes y/o de hojas en una planta comprende la modulación de la actividad y/o del nivel de un polipéptido CKX de la invención. En una realización, se provee una secuencia CKX de la invención. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos CKX se puede proveer introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos CKX de la invención, expresando la secuencia CKX y modificando así el desarrollo de brotes y/o de hojas. En determinadas realizaciones, la construcción de nucleótidos CKX introducida en la planta es incorporada de forma estable en el genoma de la planta. En realizaciones específicas, se modula el desarrollo de brotes o de hojas incrementando el nivel y/o la actividad del polipéptido CKX en la planta. Un incremento en la actividad CKX puede dar como resultado una o más alteraciones en el desarrollo de brotes y/o de hojas, incluyendo, a modo de ejemplo, menores meristemas apicales, cantidad reducida de hojas, superficie foliar reducida, vasculatura reducida, intemodos más cortos y crecimiento achaparrado, y senescencia demorada de las hojas, en comparación con una planta control. Por consiguiente, los métodos de la invención pueden ser de utilidad en la producción de plantas enanas. En determinadas realizaciones, se disminuye el nivel y/o la actividad del polipéptido CKX en la planta para obtener como resultado niveles más altos de citoquinina. Como se describe en otra parte de la presente, una reducción dirigida en el nivel y/o la actividad de un polipéptido CKX puede dar como resultado una o más de las siguientes características: desarrollo floral modulado, tiempo de floración modulado, incremento en el tamaño de semillas y/o en el peso de semillas, mayor rendimiento de la planta y/o vigor de la planta, incremento o conservación de la tolerancia al estrés, relación de raíces/brotes alterada o un incremento en el crecimiento de los brotes, en comparación con una planta control. Como se describió precedentemente, el especialista podrá reconocer al promotor apropiado para su uso en la modulación del desarrollo de brotes y de hojas de la planta. Los ejemplos de promotores para esta realización incluyen promotores constitutivos, promotores con preferencia por brotes, promotores con preferencia por brotes del meristema y promotores con preferencia por hojas. Los ejemplos de promotores se describieron en otra parte de la presente. Por consiguiente, la presente invención provee además plantas que presentan un desarrollo modulado de brotes y/o de hojas en comparación con una planta control. En algunas realizaciones, la planta de la invención presenta un mayor nivel/actividad del poíipéptido CKX de la invención. En otras realizaciones, la planta de la invención presenta un menor nivel/actividad del polipéptido CKX de la invención. VI. Modulación del desarrollo del tejido reproductor Se proveen métodos para modular de desarrollo del tejido reproductor. En una realización, se proveen métodos para modular el desarrollo floral en una planta. El término "modulación del desarrollo floral" se refiere a cualquier alteración en la estructura del tejido reproductor de una planta en comparación con una planta control en la cual no está modulada la actividad o el nivel del polipéptido CKX. El término "modulación del desarrollo floral" incluye además cualquier alteración en la sincronización del desarrollo del tejido reproductor de una planta (es decir, una sincronización demorada o acelerada del desarrollo floral) en comparación con una planta control en la cual no se ha modulado la actividad o el nivel del polipéptido CKX. Las alteraciones macroscópicas pueden incluir cambios en el tamaño, la forma, la cantidad o la ubicación de los órganos reproductores, el período de tiempo del desarrollo durante el cual se forman estas estructuras y/o la capacidad para permanecer o avanzar a través del proceso de floración en épocas de estrés ambiental. Las alteraciones microscópicas pueden incluir cambios en los tipos o las formas de las células que conforman los órganos reproductores. El método para modular el desarrollo floral en una planta comprende la modulación de la actividad CKX en una planta. En un método, se provee una secuencia CKX de la invención. La secuencia de nucleótidos CKX se puede proveer introduciendo en la planta un polinucleótido que comprenda una secuencia de nucleótidos CKX de la invención, expresando la secuencia CKX, y de esa manera modificando el desarrollo floral. En determinadas realizaciones, la construcción de nucleótidos CKX introducida en la planta es incorporada de forma estable en el genoma de la planta.
En métodos específicos, se modula el desarrollo floral incrementando el nivel o la actividad del polipéptido CKX en la planta. Un incremento en la actividad CKX puede dar como resultado una o más alteraciones en el desarrollo floral, incluyendo, a modo de ejemplo, una floración demorada, una cantidad reducida de flores, esterilidad masculina parcial y formación de semillas reducida, en comparación con una planta control. Se puede usar inducción de la floración demorada o inhibición de la floración para mejorar el rendimiento en los cultivos forrajeros tal como alfalfa. Los métodos para medir dichas alteraciones del desarrollo en el desarrollo floral son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Mouradov ef al. (2002) The Plant Cell S111-S130, incorporada en este documento a modo de referencia. Como se describió precedentemente, el especialista podrá reconocer al promotor apropiado para su uso en la modulación del desarrollo floral de la planta. Los ejemplos de promotores para esta realización incluyen promotores constitutivos, promotores ¡nducibles, promotores con preferencia por brotes y promotores con preferencia por inflorescencias. En otros métodos, se modula el desarrollo floral disminuyendo el nivel y/o la actividad de la secuencia CKX de la invención. Dichos métodos pueden comprender la introducción de una secuencia de nucleótidos CKX en la planta y la disminución de la actividad del polipéptido CKX. En otros métodos, la construcción de nucleótidos CKX introducida en la planta es incorporada de forma estable en el genoma de la planta. Una disminución en la expresión de la secuencia CKX de la invención puede modular el desarrollo floral durante períodos de estrés. Dichos métodos se describen en otra parte en la presente. Por consiguiente, la presente invención provee además plantas que presentan un desarrollo floral modulado en comparación con el desarrollo floral de la planta control. Las composiciones incluyen plantas que presentan un mayor nivel/actividad del polipéptido CKX de la invención y que presentan un desarrollo floral alterado. Las composiciones también incluyen plantas que presentan un menor nivel/actividad del polipéptido CKX de la invención donde dichas plantas permanecen o avanzan a través del proceso de floración en épocas de estrés. También se proveen métodos para usar las secuencias CKX de la invención en el aumento del tamaño y/o peso de las semillas. El método comprende disminuir la actividad de las secuencias CKX en una planta, o parte de planta, tal como la semilla, mediante las técnicas de subsensibilización descritas en otra parte en la presente. Un incremento en el tamaño y/o el peso de las semillas comprende un mayor tamaño o peso de las semillas y/o un incremento en el tamaño o peso de una o más partes de la semilla incluyendo, por ejemplo, el embrión, el endosperma, el recubrimiento de las semillas, la aleurona o cotiledones. Como se describió precedentemente, el especialista podrá reconocer al promotor apropiado para incrementar el tamaño de las semillas y/o el peso de las semillas. Los ejemplos de promotores de esta realización incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores con preferencia por semillas, promotores con preferencia por embriones, promotores con preferencia por endosperma y promotores activos en los tejidos reproductores femeninos inmediatamente antes y después de la polinización. Se considera además que el aumento en el tamaño y/o el peso de las semillas también puede estar acompañado de un incremento en la velocidad de crecimiento de las plántulas o de un incremento en el vigor temprano. Tal como se utiliza en la presente, el término "vigor temprano" se refiere a la capacidad de una planta de crecer rápidamente durante el desarrollo temprano y se relaciona con el establecimiento exitoso, después de la germinación, de un sistema radicular bien desarrollado y un aparato de fotosíntesis bien desarrollado. Además, un incremento en el tamaño y/o el peso de las semillas puede dar como resultado un aumento en el rendimiento de la planta en comparación con un control. Por consiguiente, la presente invención provee además plantas que presentan un mayor peso de semillas y/o tamaño de semillas en comparación con una planta control. En otras realizaciones, también se proveen plantas que presentan un mayor vigor y rendimiento de la planta. En algunas realizaciones, la planta de la invención presenta un menor nivel/actividad del polipéptido CKX de la invención y posee un mayor peso de semillas y/o tamaño de semillas. En determinadas realizaciones, dichas plantas han incorporado de forma estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos CKX de la invención ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. Vil. Modulación de la tolerancia al estrés de una planta Se proveen métodos para usar las secuencias CKX de la invención para modificar la tolerancia de una planta al estrés abiótico. El incremento en el crecimiento de plántulas o del vigor temprano a menudo está asociado con un aumento en la tolerancia al estrés. Por ejemplo, un desarrollo más rápido de plántulas, incluyendo el sistema radicular de dichas plántulas con la germinación, resulta crítico para la supervivencia, en particular bajo condiciones adversas tal como una sequía. Los promotores que se pueden usar en este método se describen en otra parte en la presente. Brevemente, en este método se podrían utilizar promotores constitutivos o con preferencia por raíces o promotores inducidos por estrés. Por consiguiente, en un método de la invención, se incrementa o conserva la tolerancia al estrés de una planta en comparación con una planta control disminuyendo el nivel de la actividad CKX en la planta. En otros métodos, se provee una secuencia de nucleótidos CKX introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos CKX de la invención, expresando la secuencia CKX e incrementando de esa manera la tolerancia al estrés de la planta. En determinadas realizaciones, la construcción de nucleótidos CKX introducida en la planta es incorporada de forma estable en el genoma de la planta. También se proveen métodos para incrementar o conservar la formación de semillas durante los episodios de estrés abiótico. Durante los períodos de estrés (es decir, sequía, salinidad, metales pesados, temperatura, etc.) a menudo aborta el desarrollo de los embriones. En maíz, un desarrollo detenido de embriones da como resultado en granos abortados en la espiga. La prevención de esta pérdida de granos conservará el rendimiento. Por consiguiente, se proveen métodos para incrementar la resistencia al estrés en una planta (es decir, un embrión en desarrollo temprano). La disminución de la expresión de la secuencia CKX de la invención también puede modular el desarrollo floral durante los períodos de estrés y por consiguiente se proveen métodos para conservar o mejorar el proceso de floración en plantas bajo estrés. El método comprende disminuir el nivel y/o la actividad de la secuencia CKX de la invención por medio de las técnicas de subsensibilización descritas en otra parte en la presente. Se puede producir una inestabilidad significativa en el rendimiento como resultado de un medio ambiente desfavorables, en especial durante la fase de retardo del desarrollo de las semillas. Durante este período, las semillas sufren cambios dramáticos en la ultraestructura, bioquímica y sensibilidad a las perturbaciones ambientales, aunque demuestran pocos cambios en la acumulación de masa seca. Los dos eventos importantes que tienen lugar durante la fase de retardo son el inicio y la división de células del endosperma y de amiloplastos (que son los sitios para la deposición de almidón). Se ha demostrado que durante la fase de retardo (en maíz, desde la polinización hasta aproximadamente 10 a 12 días después déla polinización (DAP)), un incremento dramático en la concentración de citoquinina precede inmediatamente a los índices máximos de división celular en endosperma y la formación de amiloplastos, lo cual indica que esta hormona cumple una función central en estos procesos y en lo que se denomina el 'poder de reserva' de la semilla en desarrollo. Se ha demostrado que las citoquininas cumplen un rol importante en el establecimiento del tamaño de las semillas, en la disminución de abortos de granos en la punta y en el incremento de la formación de semillas durante las condiciones ambientales desfavorables.
Por ello se proveen métodos para disminuir la actividad y/o el nivel de los polipéptidos CKX en la inflorescencia femenina en desarrollo, elevando de esa manera los niveles de citoquinina y dejando que la semilla en desarrollo alcance su potencial genético completo en cuanto a tamaño, minimización de abortos de los granos de la punta y regulación de la formación de semillas durante la exposición a ambientes desfavorables. Los métodos permiten además que la planta conserve y/o mejore el proceso de floración durante la exposición a ambientes desfavorables. En esta realización, se podrían usar diversos promotores para dirigir la expresión de una secuencia capaz de disminuir el nivel y/o la actividad del polipéptido CKX. En un método, se usa un promotor con preferencia por granos en desarrollo/en fase de retardo/insensibles al estrés. El término "insensible al estrés" significa que el nivel de expresión de una secuencia ligada operativamente al promotor no es alterado o solamente es alterado mínimamente bajo las condiciones de estrés. Dichos promotores son conocidos en el arte e incluyen el promotor Zag2, 1 (Schmidt ef al. (1993) Plant Cell 5: 729-737, Genbank N° Acceso X80206), el promotor ZmCkxl -2 (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/109.488 y 11/074.144), el promotor ZmCkx2 (SEQ ID N°: 13), el promotor ZmCkx3 (SEQ ID N°: 14), el promotor ZmCkx4 (SEQ ID N°: 15), el promotor ZmCkxd (SEQ ID N°: 16), el promotor ZmCkx? (véase la SEQ ID N°: 51), cualquier otro promotor de CKX y el promotor mzE40 (Zm40) (Patente de EE.UU. N°: 6.403.862 y WO01/2178). Como alternativa, se puede usar un promotor que responda al estrés, tal como rd29a (Yamaguchi-Shinozaki ef al. (1993) Mol. Gen. Genetics 236: 331-334). Los métodos para evaluar un incremento en la formación de semillas durante el estrés abiótico son conocidos en el arte. Por ejemplo, las plantas que presentan una actividad CKX reducida pueden ser monitoreadas bajo diversos condiciones de estrés y comparadas luego con plantas control. Por ejemplo, la planta que presenta la actividad reducida de CKX puede ser sometida a diversos grados de estrés durante la floración y la formación de semillas. Bajo condiciones idénticas, la planta modificada genéticamente que presenta la actividad CKX reducida tendrá un mayor número de granos en desarrollo que una planta de tipo salvaje (no transformada). Por consiguiente, la presente invención provee además plantas que presentan un mayor rendimiento o que han conservado el rendimiento y/o un proceso de floración incrementado o conservado durante períodos de estrés abiótico (por ejemplo, sequía, salinidad, metales pesados, temperatura, etc). En algunas realizaciones, las plantas con un rendimiento mayor o conservado durante el estrés abiótico presentan un menor nivel/actividad del polipéptido CKX de la invención. En otras realizaciones, la planta comprende una secuencia de nucleótidos CKX de la invención ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. En determinadas realizaciones, dichas plantas han incorporado de forma estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos CKX de la invención ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. VIII Modulación de la resistencia a patógenos Se proveen métodos para modular la resistencia a patógenos en una planta. Los patógenos vegetales pueden producir citoquininas (Mills et al. (1978) Physiol Plant Pathol 13: 73-80 y Angra ef al. (1990) Mycopathologia 109: 177-182). Por consiguiente, el incremento de la actividad CKX en una planta o parte de planta puede incrementar la resistencia de la planta al patógeno. Véase, por ejemplo, Bilyeu ef al. (2001) Plant Physiol. 125: 378-386. Por consiguiente, se proveen composiciones y métodos para inducir resistencia en una planta a las plagas de plantas. En realizaciones específicas, se provee el polipéptido CKX a la semilla en desarrollo y de esa manera se incrementa la resistencia a patógenos de la semilla. Por consiguiente, las composiciones y los métodos también son de utilidad para proteger a las plantas contra patógenos fúngicos, virus, nematodes, insectos y semejantes.
El término "resistencia a enfermedades" significa que las plantas evitan los síntomas de enfermedad que son el resultado de las interacciones planta- patógeno. Es decir, se impide que los patógenos causen enfermedades en las plantas y los síntomas asociados con la enfermedad o, como alternativa, se minimizan o disminuyen los síntomas de la enfermedad causada por el patógeno. El término "composiciones antipatogénicas" significa que las composiciones de la invención presentan actividad antipatogénica y por consiguiente que son capaces de suprimir, controlar y/o matar al organismo patogénico invasor. Una composición antipatogénica de la invención reducirá los síntomas de enfermedad debidos a la exposición a un patógeno entre al menos 2% aproximadamente y al menos 6% aproximadamente, entre al menos 5% aproximadamente y 50% aproximadamente, entre al menos 10% aproximadamente y 60% aproximadamente, entre al menos 30% aproximadamente y 70% aproximadamente, entre al menos 40% aproximadamente y 80% aproximadamente o entre al menos 50% aproximadamente y 90%) aproximadamente o más. Por ende, los métodos de la invención se pueden utilizar para proteger a las plantas contra enfermedades, en particular aquellas enfermedades que son causadas por patógenos de plantas. El método para incrementar la resistencia a patógenos en una planta comprende aumentar el nivel o actividad de los polipéptidos CKX de la invención. En métodos específicos, se provee una secuencia CKX de la invención. Dicha secuencia de nucleótidos CKX se puede proveer introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos CKX de la invención, expresando la secuencia CKX y de esa manera se incrementa la resistencia a patógenos en la planta. En determinadas realizaciones, la construcción de nucleótidos CKX introducida en la planta es incorporada de forma estable en el genoma de la planta. Como se describió precedentemente, el especialista podrá reconocer al promotor apropiado para incrementar la resistencia a patógenos en la planta. Los ejemplos de promotores para esta realización incluyen promotores constitutivos, promotores con preferencia por tejidos, promotores inducibles por patógenos y promotores con preferencia por semillas. Los ensayos que miden la actividad antipatogénica son conocidos comúnmente en el arte, así como los métodos para cuantificar la resistencia a enfermedades en plantas después de una infección por patógenos. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°: 5.614.395, incorporada en este documento a modo de referencia. Dichas técnicas incluyen la medición en el tiempo del diámetro promedio de la lesión, la biomasa del patógeno y el porcentaje general de tejidos vegetales decaídos. Por ejemplo, una planta que ya sea expresa un polipéptido antipatogénico o a la cual se le ha aplicado una composición antipatogénica a su superficie muestra una disminución en la necrosis tisular (es decir, el diámetro de la lesión) o una disminución en la muerte de las plantas después de la exposición al patógeno en comparación con una planta control que no estuvo expuesta a la composición antipatogénica. Como alternativa, la actividad antipatogénica se puede medir por una disminución en la biomasa del patógeno. Por ejemplo, una planta que expresa un polipéptido antipatogénico o que ha estado expuesta a una composición antipatogénica es sometida a pruebas con el patógeno de interés. Se obtienen muestras de los tejidos inoculados con el patógeno en el tiempo y se extrae el ARN. El porcentaje de un transcripto de ARN patógeno específico con relación al nivel en el transcripto de una planta específica permite determinar el nivel de biomasa del patógeno. Véase, por ejemplo, Thomma ef al. (1998) Plant Biology 95: 15107-15111 , incorporada en este documento a modo de referencia. Además, los ensayos antipatogénicos in vitro incluyen, por ejemplo, la aplicación de concentraciones variables de la composición antipatogénica a discos de papel y la colocación de dichos discos sobre agar que contiene una suspensión del patógeno de interés. Después de una incubación, se desarrollan zonas claras de inhibición alrededor de los discos que contienen una concentración eficaz del polipéptido antipatogénico (Liu et al. (1994) Plant Biology 91 : 1888-1892, incorporada en este documento a modo de referencia). Además, se puede usar un análisis microespectrof otométrico para medir las propiedades antipatogénicas in vitro de la composición (Hu ef al. (1997) Plant Mol. Biol. 34: 949-959 y Cammue ef al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 2228-2233, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia). Los patógenos de la invención incluyen, a modo de ejemplo, virus o viroides, bacterias, insectos, nematodes, hongos y semejantes. Los virus incluyen cualquier virus de plantas, por ejemplo, el virus en mosaico del tabaco o del pepino, el virus de manchas anilladas, el virus de necrosis o el virus en mosaico enano de maíz. IX. Método de uso de los polinucleótidos del promotor CKX Los polinucleótidos que comprenden los promotores CKX descritos en la presente invención, así como variantes y fragmentos de los mismos, son de utilidad en la manipulación genética de cualquier célula huésped, preferentemente una célula vegetal, cuando se ensamblan con una construcción de ADN de modo tal que la secuencia promotora está ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos que comprende un polinucleótido de interés. De esta manera, los polinucleótidos de los promotores CKX de la invención se proveen en casetes de expresión junto con una secuencia de polinucleótidos de interés para su expresión en la célula huésped de interés. Tal como se describirá más adelante en el Ejemplo 2, las secuencias promotoras CKX de la invención se expresan en diversos tejidos y por consiguiente las secuencias promotoras pueden ser de utilidad en la regulación de la expresión temporal y/o espacial de los polinucleótidos de interés. Las regiones promotoras híbridas sintéticas son conocidas en el arte. Dichas regiones comprenden elementos promotores 5' de un polinucleótido ligados operativamente al elemento promotor de otro polinucleótido. En una realización de la invención, la expresión de la secuencia heteróloga es controlada por un promotor híbrido sintético que comprende las secuencias promotoras CKX de la invención, o una variante o fragmento del mismo, ligado operativamente a uno o más elementos promotores 5' de un promotor heterólogo. Se han identificado los elementos promotores 5' que están comprometidos en el sistema defensa de la planta y se pueden usar para generar un promotor sintético. Véase, por ejemplo, Rushton ef al. (1998) Curr. Opin. Plant Biol. 1: 311-315. Como alternativa, la secuencia del promotor sintético CKX puede comprender duplicaciones de los elementos promotores 5' presentes dentro de las secuencias promotoras CKX. Se considera que la secuencia promotora de la invención se puede usar con sus secuencias de codificación CKX nativas. La construcción de ADN que comprende al promotor CKX ligado operativamente con su gen CKX nativo se puede usar para transformar cualquier planta de interés con el fin de obtener aproximadamente el cambio fenotípico deseado, tal como la modulación de los niveles de citoquinina, la modulación del desarrollo de raíces, brotes, hojas, floral y de embriones, de la tolerancia al estrés y cualquier otro fenotipo descrito en otra parte en la presente. Las secuencias de nucleótidos promotoras y los métodos descritos en la presente son de utilidad para regular la expresión de cualquier secuencia de nucleótidos en una planta huésped con el fin de variar el fenotipo de una planta. Los diversos cambios en el fenotipo son de interés, incluyendo la composición de ácidos grasos en una planta, la alteración del contenido de aminoácidos de una planta, la alteración del mecanismo de defensa de una planta y semejantes. Estos resultados se puede lograr con la expresión de los productos heterólogos o con una mayor expresión de los productos endógenos en las plantas. Como alternativa, dichos resultados se pueden obtener suministrando una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, en particular enzimas o cofactores en la planta. Estos cambios dan como resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada.
Los genes de interés reflejan los mercados comerciales y los intereses de aquellos que están comprometidos en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y mercados de interés cambian y, a medida que las naciones en desarrollo se abren a los mercados mundiales, también emergerán nuevos cultivos y tecnologías. Además, según nuestra visión de las características agronómicas y de características tales como incrementa en rendimiento y heterosis, la elección de los genes para la transformación cambiarán en consecuencia. Las categorías generales de los genes de interés incluyen, por ejemplo, los genes comprometidos en la información, tal como dedos de zinc, los genes comprometidos en la comunicación, tal como quinasas, y los genes comprometidos en el mantenimiento, tal como las proteínas de shock de calor. Las categorías más específicas de transgenes incluyen, por ejemplo, genes que codifican características importantes para la agronomía, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, resistencia a herbicida, esterilidad, características de los granos y productos comerciales. Los genes de interés incluyen, en general, los que están comprometidos en el metabolismo de aceites, almidón, carbohidratos o nutrientes, así como los que afectan el tamaño de los granos, la carga de sacarosa y semejantes. En una realización, las secuencias de interés mejoran el crecimiento de las plantas y/o los rendimientos del cultivo. En más realizaciones específicas, la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés mejora la respuesta de la planta al estrés inducido bajo condiciones de crecimiento de gran densidad. Por ejemplo, las secuencias de interés incluyen genes agronómicamente importantes que dan como resultado mejores sistemas radiculares primarios o laterales. Dichos genes incluyen, a modo de ejemplo, transportadores de nutrientes/agua e inductores del crecimiento. Los ejemplos de dichos genes incluyen, sin limitaciones, H+-ATPasa de la membrana plasmática de maíz (MHA2) (Frías ef al. (1996) Plant Cell 8: 1533-44); AKT1 , un componente del aparato de captación de potasio en Arabidopsis, (Spalding ef al. (1999) J Gen Physiol 113: 909-18); los genes RML que activan el ciclo celular de división en las células apicales de raíces (Cheng ef al. (1995) Plant Physiol 108: 881); los genes de la glutamina sintetasa de maíz (Sukanya ef al. (1994) Plant Mol Biol 26: 1935-46) y de hemoglobina (Duff ef al. (1997) J. Biol. Chem 27: 16749-16752, Arredondo-Peter ef al. (1997) Plant Physiol. 115: 1259-1266; Arredondo-Peter ef al. (1997) Plant Physiol 114: 493-500 y las referencias citadas en las mismas); y los genes de la isopentenilo transferasa, o ipt (Strabala et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 388-394, (Agrobacterium); Solicitudes de Patente de EE.UU. N°: 60/610.656 presentada el 17 de septiembre, 2004, y 60/637.230 presentada el 17 de diciembre, 2004 (maíz); Takei et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 26405-26410 (Arabidopsis); Zubko et al. (2002) Plant J. 29(6): 797-808 (petunia); Sakano et al. (2004) Phytochem. 65: 2439-2446 (lúpulo); y GenBank N° Acceso XM_477138 (arroz, 2004)). La secuencia de interés también puede ser de utilidad en la expresión de secuencias de nucleótidos antisentido de los genes que afectan negativamente el desarrollo radicular. Otras características agronómicamente importantes tal como contenido de aceite, almidón y proteínas, pueden ser alteradas genéticamente además de usar los métodos de cría tradicionales. Las modificaciones incluyen el incremento del contenido de ácido oleico, aceites saturados e insaturados, el incremento de los niveles de lisina y azufre, la provisión de aminoácidos esenciales y también la modificación del almidón. Las modificaciones de la proteína hordotionina se describen en las Patentes de EE.UU. N°: 5.703.049, 5.885.801, 5.885.802 y 5.990.389, incorporadas en este documento a modo de referencia. Otro ejemplo es la proteína de las semillas rica en lisina y/o azufre codificada por el gen de albúmina 2S de soja descrito en la Patente de EE.UU. N°: 5.850.016, y el inhibidor de Quimiotripsina de cebada, descrito en Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165: 99-106, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia.
Se pueden elaborar derivados de los siguientes genes por mutagénesis dirigida al sitio para incrementar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido rico en lisina de cebada (BHL) deriva del inhibidor de quimiotripsina de cebada, Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 08/740.682, presentada el 1 de noviembre, 1996, WO 9820133, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Otras proteínas incluyen proteínas vegetales ricas en metionina, tal como de semillas de girasol (Lilley ef al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite, H.; (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), 497-.502; incorporada en este documento a modo de referencia)); de maíz (Pedersen et al. (1986), J Biol. Chem. 261 : 6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71 : 359; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia); y de arroz (Musumura ef al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123, incorporada en este documento a modo de referencia. Otros genes agronómicamente importantes codifican látex, Floury 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento en semillas y factores de transcripción. Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a plagas que presentan un gran pérdida en el rendimiento, tal como gusanos de la raíz, gusanos cortadores, barrenador del maíz europeo y semejantes. Dichos genes incluyen, por ejemplo genes de las proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes de EE.UU. N°: 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881 ; y Geiser ef al. (1986) Gene 48: 109; y semejantes. Los genes que codifican características de resistencia a enfermedades pueden incluir: genes de desintoxicación, tal como contra fumonisina (Patente de EE.UU. N°: 5.792.931); genes de avirulencia (avr) y genes de resistencia a enfermedades (R) (Jones et al., (1994), Science 266: 789; Martin et al., (1993) Science 262: 1432; Mindrinos et al., (1994), Cell 78: 1089); y semejantes.
Las características de resistencia a herbicidas pueden incluir genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintetasa (ALS), en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de la acetolactato sintetasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a dicha resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la glutamina sintetasa, tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), genes que codifican proteínas que degradan el glifosato u otros genes parecidos conocidos en el arte. El gen bar codifica resistencia al herbicida basta, el gen nptll codifica resistencia al antibiótico kanamicina y geneticina y los mutantes del gen ALS que codifican resistencia al herbicida clorsulfurón. Los genes para esterilidad también pueden estar codificados en un cásete de expresión y proveen una alternativa a la emasculación física. Los ejemplos de genes usados de tal manera incluyen los genes con preferencia por tejido masculino y los genes con fenotipos de esterilidad masculina tal como QM, descritos en la Patente de EE.UU. N°: 5.583.210. Otros genes incluyen las quinasas y los que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo gametofítico ya sea masculino o femenino. La calidad del grano se refleja en características tales como los niveles y tipos de aceites, saturados e insaturados, calidad y cantidad de aminoácidos esenciales y los niveles de celulosa. En maíz, las proteínas modificadas de la hordotionina se describen en las Patentes de EE.UU. N°: 5.703.049, 5.885.801 , 5.885.802 y 5.990.389. Las características comerciales también pueden estar codificadas por uno o más genes que podrían incrementar, por ejemplo, el almidón para la producción de etanol, o proveer expresión de proteínas. Otras plantas transformadas importantes de uso comercial son para la producción de polímeros y bioplásticos como se describe en la Patente de EE.UU. N°: 5.602.321. Los genes tales como ß-cetotiolasa, PHBasa (polihidroxibutirato sintetasa) y acetoacetil-CoA reductasa (véase Schubert ef al. (1988) J. Bacteriol. 170: 5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA). Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales, así como los de otras fuentes incluyendo procariotas y otros eucariotas. Dichos productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y semejantes. Se puede incrementar el nivel de proteínas, en particular de proteínas modificadas con una mejor distribución de aminoácidos para mejorar el valor nutritivo de la planta. Esto se logra con la expresión de aquellas proteínas que presentan un mayor contenido de aminoácidos. Todas las publicaciones y patentes a las cuales se hace referencia en la presente se incorporan en este documento a modo de referencia hasta el mismo grado como si cada una se incorporara individualmente en el mismo. Los siguientes ejemplos se ofrecen a efectos ilustrativos y no limitativos de la invención. EXPERIMENTOS Ejemplo 1. Análisis de secuencia de la secuencia CKX Los polipéptidos CKX de la invención comparten similitud de secuencia con numerosos polipéptidos CKX. En la Tabla 1 se resumen las relaciones de secuencia de ZmCkx2, 3, 4 y 5 entre sí y también con enzimas CKX conocidas o putativas. Tabla 1 Basado en alineaciones con GAP usando la matriz de sustitución de aminoácidos BLOSUM62. Referencia: Henikoff, S. y Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrixes from protein blocks. Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915-10919 La alineación de aminoácidos de ZmCkxl (SEQ ID N°: 33), ZmCkx2 (SEQ ID N°: 3), ZmCkx3 (SEQ ID N°: 6), ZmCkx4 (SEQ ID N°: 9), ZmCkxd (SEQ ID N°: 12) y ZmCkxd (SEQ ID N°: 53), junto con la secuencia consenso (SEQ ID N°: 34) se muestra en las Figuras 1A y B. La alineación de aminoácidos de los polipéptidos CKX de la invención con otros polipéptidos CKX conocidos se muestra en la Figura 2A-F. Específicamente, la alineación provee la relación de secuencias de AtCkxl (SEQ ID N°: 35), AtCkx2 (SEQ ID N°: 36), AtCkx3 (SEQ ID N°: 37), AtCkx4 (SEQ ID N°: 38), AtCkxd (SEQ ID N°: 39), AtCkxd (SEQ ID N°: 40), AtCkx7 (SEQ ID N°: 41), DsCkxl (SEQ ID N°: 42), HvCkx2 (SEQ ID N°: 43), HvCkx3 (SEQ ID N°: 44), OsCkxl (SEQ ID N°: 45), OsCkx2 (SEQ ID N°: 46), OsCkx3 (SEQ ID N°: 47), OsCkx4 (SEQ ID N°: 48), OsCkxd (SEQ ID N°: 49), ZmCkxl (SEQ ID N°: 33), ZmCkx2 (SEQ ID N°: 3), ZmCkx3 (SEQ ID N°: 6), ZmCkx4 (SEQ ID N°: 10) y ZmCkxd (SEQ ID N°: 14). Se provee una secuencia consenso en la SEQ ID N°: 60. Los polipéptidos CKX de la invención contienen un dominio de unión a FAD predicho (PFAM N° Acceso PF01666). Tal como se muestra en la Figura 9, el dominio de unión a FAD se encuentra entre los aminoácidos 63 a 220 de ZmCkx2, entre los aminoácidos 68 a 229 de ZmCkx3, entre los aminoácidos 44 a 213 de ZmCkx4 y entre los aminoácidos 59 a 224 de ZmCkxd. También se efectuó un análisis de la ubicación subcelular de los polipéptidos CKX de la invención. Los resultados de estos análisis se muestran a continuación.
A. Análisis de ZmCkx2: Se corrió una predicción de señales usando ProtComp adaptado a plantas. A continuación se muestran los resultados para ZmCkx2 y predicen que el polipéptido ZmCkx2 es de localización extracelular. ProtComp Versión 5. Identificación de la ubicación subcelular (Plantas) Nombre de la secuencia: ZmCkx2 619 Similitud significativa en Ubicación DB - Ubicación: Extracelular (Secretada) Secuencia de la base de datos: AC=Q9T0N8 Ubicación: Extracelular (Secretada) DE Citoquinina oxidasa 1 precursor (EC Puntaje=11145, Longitud de secuencia=534, Longitud de alineación=392 Predicho por Neural Nets - Membrana plasmática con puntaje de 0,9 ******** Se encontraron segmentos transmembrana: -325 : 337+. Predicción integral de la ubicación de la proteína: Extracelular unida a membrana (Secretada) con un puntaje de 4,3 Pesos de la ubicación: LocDB / PotLocDB / Neural Nets / Integral Nuclear 0,0 / 0,0 / 0,74 / 0,74 Membrana plasmática 0,0 / 0,0 / 0,92 / 0,92 Extracelular 11145,0 / 9230,0 / 0,81 / 4,31 Citoplasmática 0,0 / 0,0 / 0,64 / 0,64 Mitocondrial 0,0 / 0,0 / 0,76 / 0,76 Cloroplastos 0,0 / 0,0 / 0,73 / 0,73 Retículo endoplasmático 0,0 / 0,0 / 0,77 / 0,77 Peroxisómico 0,0 / 0,0 / 0,76 / 0,76 SPScan en SeqWeb 1. 1 mkppslvhcfkllvllalarltmh'vp 26 Puntaje: 7,7 Probabilidad: 7,225E-01 Longitud SP: 24 Barrido McGeoch exitoso: Estadística de la región cargada: Longitud: 11 Carga: 2 Estadística de la región hidrofóbica: Longitud: 8 Offset: 12 Hidropatía total: 62,3 Hidropatía máxima de 8 residuos: 62,3, comenzando en 13 B. Análisis de ZmCkx3: Se corrió una predicción de señales usando ProtComp adaptado a plantas.
A continuación se muestran los resultados para ZmCkx3 y predicen que el polipéptido ZmCkx3 es de localización extracelular. ProtComp Versión 5. Identificación de la ubicación subcelular (Plantas) Nombre de la secuencia: ZmCkx3 638 Similitud significativa en Ubicación DB - Ubicación: Extracelular (Secretada) Secuencia de la base de datos: AC=Q9T0N8 Ubicación: Extracelular (Secretada) DE Citoquinina oxidasa Puntaje = 13520, Longitud de secuencia=534, Longitud de alineación = 600 Predicho por Neural Nets - Membrana plasmática con puntaje 1 ,3 Predicción integral de ubicación de la proteína: Extracelular (Secretada) con puntaje 6,3 Pesos de la ubicación: LocDB / PotLocDB / Neural Nets / Integral Nuclear 0,0 / 0,0 / 1 ,18 / 1 ,18 Membrana plasmática 0,0 / 0,0 / 1 ,32 / 1,32 Extracelular 13520,0 / 11200,0 / 1 ,07 / 5,32 Citoplasmática 0,0 / 0,0 / 0,72 / 0,72 Mitocondrial 0,0 / 0,0 / 0,98 / 0,98 Cloroplastos 0,0 / 0,0 / 0,71 / 0,71 Retículo endoplasmático 0,0 / 0,0 / 0,56 / 0,56 Peroxisómico 0,0 / 0,0 / 0,42 / 0,42 C. Análisis de ZmCkx4: Se corrió una predicción de señales usando ProtComp adaptado a plantas. A continuación se muestran los resultados para ZmCkx4 y predicen que el polipéptido ZmCkx4 es de localización extracelular. ProtComp Versión 5. Identificación de la ubicación subcelular (Plantas) Nombre de la secuencia: ZmCkx4 521 Similitud significativa en Ubicación DB - Ubicación: Extracelular (Secretada) Secuencia de la base de datos: AC = Q9LTS3 Ubicación: Extracelular (Secretada) DE Citoquinina oxidasa Puntaje = 10155, Longitud de secuencia = 523, Longitud de alineación = 360 Predicho por Neural Nets - Membrana plasmática con puntaje 1 ,3 Predicción integral de ubicación de la proteína: Extracelular (Secretada) con puntaje 4,4 Pesos de la ubicación: LocDB / PotLocDB / Neural Nets / Integral Nuclear 0,0 / 0,0 / 1 ,18 / 1 ,18 Membrana plasmática 0,0 / 0,0 / 1 ,32 / 1 ,32 Extracelular 10155,0 / 9925,0 / 1 ,07 / 4,43 Citoplasmática 0,0 / 0,0 / 0,72 / 0,72 Mitocondrial 0,0 / 0,0 / 0,95 / 0,95 Cloroplastos 0,0 / 0,0 / 0,71 / 0,71 Retículo endoplasmático 0,0 / 0,0 / 0,56 / 0,56 Peroxisómico 0,0 / 0,0 / 0,42 / 0,42 D. Análisis de ZmCkx5: Se corrió una predicción de señales usando ProtComp adaptado a plantas. A continuación se muestran los resultados para ZmCkxd y predicen que el polipéptido ZmCkxd es de localización extracelular. ProtComp Versión d. Identificación de la ubicación subcelular (Plantas) Nombre de la secuencia: ZmCkxd 642 Similitud significativa en Ubicación DB - Ubicación: Extracelular (Secretada) Secuencia de la base de datos: AC = Q9LTS3 Ubicación: Extracelular (Secretada) DE Citoquinina oxidasa Puntaje = 9405, Longitud de secuencia = 523, Longitud de alineación = 390 Predicho por Neural Nets - Membrana plasmática con puntaje 1 ,3 Predicción integral de ubicación de la proteína: Extracelular (Secretada) con puntaje 4,3 Pesos de la ubicación: LocDB / PotLocDB / Nets / Integral Nuclear 0,0 / 0,0 / 1 ,18 / 1 ,18 Membrana plasmática 0,0 / 0,0 / 1 ,32 / 1 ,32 Extracelular 9405,0 / 10020,0 / 1,08 / 4,28 Citoplasmática 0,0 / 0,0 / 0,72 / 0,72 Mitocondrial 0,0 / 0,0 / 0,98 / 0,98 Cloroplastos 0,0 / 0,0 / 0,71 / 0,71 Retículo endoplasmático 0,0 / 0,0 / 0,56 / 0,56 Peroxisómico 0,0 / 0,0 / 0,42 / 0,42 Ejemplo 2. Perfiles de expresión de los genes de citoquinina oxidasa. Se identificaron diversos EST de citoquinina oxidasa y se aislaron las secuencias genómicas de los correspondientes clones BAC. Los genes correspondientes se denominaron ZmCkx2, ZmCkx3, ZmCkx4, ZmCkxd y ZmCkxd. Se estudiaron los perfiles de expresión de las secuencias CKX usando transferencias Northern y RT-PCR, y usando una base de datos propiedad de Lynx (Lynx Therapeutics, Hayward CA, EE.UU.; véase, por ejemplo, Brenner et al., Nature Biotechnology (2000) 18: 630-634). A Análisis de ZmCkx2 Se efectuó un análisis Northern de ZmCkx2 usando solución de hibridación ExpressHyb™ de BD Biosciences Clontech (Palo Alto, California) con un lavado final en SSC 0,1X, SDS 0,1 % a 66 °C durante 20 minutos. Existe una estrecha relación entre los datos de Lynx y Northern para ZmCkx2. Esto provee confianza cuando la base de datos Lynx era minada por la expresión de ZmCkx2 en varias partes de las plantas. Por ejemplo, ambos análisis Northern y Lynx mostraron que ZmCkx2 presentaba un incremento de 2 veces en la expresión en discos de hoja incubados con benciladenina (una citoquinina sintética) 10 µM. Los datos de Lynx en la Figura 3 muestran que la expresión es mayor en hojas, tallos, verticilo, raíces y plántulas. De manera similar, los datos de Northern mostraron las señales más fuertes en los tejidos foliares y nervadura de espiga; niveles intermedios en panoja, hojas de chala, hojas jóvenes, tallo y pulvini; y niveles menores en marlo y tejido de ovario. Se detectó poca o ninguna actividad de ZmCkx2 con el análisis Northern en raíces o estilos. Además, los análisis de los datos con Lynx revelaron que la expresión de ZmCkx2 aumenta con el envejecimiento de la raíz y es inducida en 4 veces en plántulas sometidas a estrés por congelamiento. En el tallo, la expresión es 3 veces más alta en la médula que en la corteza. Se efectuó una RT-PCR para determinar el perfil de expresión de ZmCkx2 en diversos tejidos de maíz. Dicha RT-PCR se efectuó con tejido de plántulas y maduro de maíz empleando los siguientes parámetros de PCR: 94 °C durante 45 seg, 60 °C durante 1 min, 72 °C durante 3 min, para 30 ciclos. La expresión de ZmCkx2 era más fuerte en el tejido de tallos maduros y en las hojas y mesocótilo de plántulas. Se observó una expresión más débil en nervaduras y hojas jóvenes y maduras de plantas maduras, así como en raíces de plántulas. También se efectuaron estudios similares con RT-PCR en diversas etapas del desarrollo de los granos de maíz, incluyendo 0, 5, 10, 16, 20, 25 y 30 días después de la polinización. Se detectó un pico de expresión a los 5 DAP. Se analizó también una base de datos propiedad de Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, California) para identificar la tendencia de la expresión de ZmCkx2. Los tejidos que mostraron las diferencias más dramáticas en la expresión de ZmCkx2 provienen del tallo. Estas muestras se recolectaron de la zona internodal del 3er o 4t0 ¡nternodo debajo de la espiga antes y después de la floración. Se encontró que la expresión de ZmCkx2 aumenta más de 10 veces en el tallo después de la floración (Tabla 2). Tabla 2.
En la Tabla 2 se muestran la magnitud de los cambios identificados en muestras de tallo recolectadas de la zona internodal del 3er o 4t0 intemodo debajo de la espiga, antes y después de la floración. Este incremento en la expresión de ZmCkx2 se podía asociar con el proceso de floración. Un incremento en el flujo de citoquinina desde las raíces hasta los brotes a menudo se considera como una señal de floración y es coherente con los hallazgos previos que los niveles incrementados de citoquinina inducen la expresión de ZmCkxl y ZmCkx2. También se encontró que la expresión de ZmCkx2 incrementaba un promedio de 10 veces durante el desarrollo de la espiga. Por consiguiente, la manipulación de la expresión de ZmCkx2 puede ser de utilidad para modular el tiempo de floración. B. Análisis de ZmCkx3 No se pudo detectar expresión de ZmCkx3 usando transferencias Northern. El minado de las bases de datos Agilent y Lynx confirmó que el gen es expresa a niveles extremadamente bajas. El EST para ZmCkx3 se obtuvo de una biblioteca de panoja y se cree que este gen podría expresarse estrictamente en un tipo celular particular en una etapa particular del desarrollo de las panojas. Aún es posible que ZmCkx3 se exprese durante el desarrollo de las anteras a niveles muy bajos. Las únicas marcas de Lynx provienen de raíces a un promedio de 4-d ppm (Véase la Figura 4). C. Análisis de ZmCkx4 El análisis de la base de datos Lynx para ZmCkx4 mostró una expresión constitutiva baja del gen en la mayoría de los órganos, observándose niveles más altos en espiga, estilo y haces vasculares, así como niveles intermedios en hojas y pedicelos (Figura 4). Cabe destacar que, en espigas de 15-20 mm, ZmCkx4 se expresa a niveles más altos en la base de la espiga que en la punta de la espiga. Esta etapa de crecimiento de la espiga coincide con la aparición de la estructura del estilo sobre la espiga, lo cual, considerado junto con la expresión fuerte en el estilo, sugiere que existe un rol para este gen en el desarrollo de los estilos. D. Análisis de ZmCkxd El análisis de la base de datos Lynx para ZmCkxd mostró que los niveles más altos de expresión eran en la raíz y los haces vasculares. (Véase la Figura 4) Ejemplo 3. Identificación de los eventos TUSC para ZmCkx2 y ZmCkx4 Con el fin de definir mejor la función de ZmCkx2 y ZmCkx4 en el desarrollo de las plantas, se obtuvieron mutantes noqueados para estos dos genes. Después de cada secuencia se muestra un resumen de TUSC. A Resumen de TUSC para ZmCkx2 Se obtuvieron dos secuencias genómicas de ortólogos de la citoquinina oxidasa para el examen de noqueo. ZmCkx2 es una secuencia genómica de ~3200 bp con cinco exones y cuatro intrones. Con el uso de esta anotación, se diseñaron seis cebadores para PCR para varios intervalos del gen ZmCkx2 y luego se evaluaron en reacciones control contra ADNg de maíz de tipo salvaje (B73). Los cebadores se identificaron como 71936 (SEQ ID N°: 19), 71937 (SEQ ID N°: 20), 71938 (SEQ ID N°: 21), 71939 (SEQ ID N°: 22), 71940 (SEQ ID N°: 23), 71941 (SEQ ID N°: 24) y 9242 MuTIR (SEQ ID N°: 26). Se verificaron y obtuvieron resultados claros para 71936 + 71937, 71940 + 71937, 71940 + 71941 , 71940 + 71939, 71938 + 71941 y 71938 + 71939. No se observaron resultados de amplificación para 71936 + 71941 y 71936 + 71939. Los productos de amplificación 71936 + 71937 y 71938 + 71939 se recortaron del gel de agarosa, se purificaron y se usaron como sondas para la hibridación. Estos dos intervalos dividen efectivamente al gen ZmCKX2 en mitades 5' y 3' para el examen de inserción. Las secuencias de los cebadores se muestran a continuación junto con los tamaños esperado y observado del amplicón para cada combinación de cebadores. Tabla 3.
La población TUSC agrupada se examinó con los cebadores genéticos 71936, 71937, 71938 y 71939, cada uno combinado con el cebador Mutator TIR 9242. Los resultados de las hibridaciones para la agrupación fueron regulares, detectándose con la hibridación algunas agrupaciones positivas por PCR. En términos generales, se logró una confirmación cruzada de las señales de hibridación entre los cebadores. Se seleccionaron las agrupaciones para el análisis de la determinación del tamaño de los fragmentos basado en la intensidad y reproducibilidad de las señales de hibridación de las transferencias puntuales de la agrupación. En esta fase del examen, se determinaron los tamaños de los productos de la PCR de blanco: : Mu PCR por reamplificación, electroforesis y análisis Southern. Se examinaron catorce agrupaciones positivas para el cebador 71936, cincuenta y un agrupaciones positivas para el cebador 71937, cuarenta y cuatro agrupaciones positivas para el cebador 71939 y treinta y siete agrupaciones positivas para 71938 por determinación del tamaño de los fragmentos. Se identificó una cantidad de agrupaciones que presentaban fuertes bandas EtBr y Southern. Se seleccionaron ocho agrupaciones para el análisis individual basado en la ubicación putativa de la inserción Mutator dentro de ZmCKX2, determinado a partir de los datos de tamaño y la calidad general de las señales de hibridación en todo el proceso de examen. Las agrupaciones se muestran en la siguiente tabla, junto con sus datos respectivos de tamaño. Cada placa enumerada consiste de los individuos de dos agrupaciones: los que fueron evaluados en el análisis de determinación del tamaño (con caracteres resaltados), así como los individuos de las agrupaciones compañeras correspondientes. Los individuos en las agrupaciones compañeras a menudo están relacionados, pero no necesariamente, con los de las agrupaciones buscadas. Tabla 4 71937 Se dispusieron los ADN individuales y se efectuó una prueba de transferencia puntual con 71936 y 71937. Obsérvese que estas selecciones se centraron en los mejores candidatos de la mitad d' del gen, buscando primariamente el primer exón grande. En las pruebas individuales, se identificaron los individuos positivos por PCR para todas las agrupaciones buscadas. Con el fin de asegurar la transmisión germinal de los alelos blanco: : Mu, se efectuó una prueba de transmisión F2 con treinta familias individuales que contenían a los alelos putativos ZmCKX2: : Mu. Se aisló el ADN genómico de la F2 de granos secos (d K/individuo) y se amplificó con los cebadores apropiados. También se obtuvieron templados controles de estas preparaciones usando el par específico del gen, 71936 + 71937. En la Figura d se provee un esquema de diversas inserciones Mu en ZmCkx2 y ZmCkx4. Los resultados indican la transmisión genética de cinco alelos ZmCkx2: : Mu. 1) Inserción A: Esta inserción es heredada únicamente por esta familia F2 en la Agrupación 139. Se obtuvo una confirmación cruzada de esta inserción desde ambos flancos de la inserción, produciéndose fuertes señales EtBr y de hibridación en las pruebas F2. El alelo permitió amplificar un fragmento de -625 bp con 71936+9242, que se confirmó con un fragmento de -375 bp usando 71937+9242. Esto provee evidencia de un alelo noqueado en el primer exón de ZmCkx2, cerca del nt 800 de la secuencia genómica de referencia. 2) Inserción B: Varias familias relacionadas por hermanas heredan el mismo alelo de inserción, lo cual sugiere un origen pre-meiótico para este alelo; una inserción progenitora habría sido evidente en muchas más familias positivas. Cinco individuos positivos fuertes fueron sometidos a las pruebas F2; todos eran positivos para el alelo de inserción. Se obtuvo una confirmación cruzada de inserción por amplificación a partir de ambos flancos. La combinación 71936+9242 produce un producto pequeño de -160 bp y el par de cebadores del flanco 3' de 71937+9242 produce un fragmento de -800 bp. Se predijo entonces que el sitio de la inserción se encontraba cerca del comienzo del Exón I y se puede encontrar en la región no traducida. Un fenotipo suprimible Mu puede ser el resultado de una inserción en esta posición. 3) Inserción C: Es una inserción Mu heredada únicamente en el extremo 51 de ZmCkx2. El alelo es de un pedigrí distinto del correspondiente al Alelo 2, aún así produce tamaños de producto por PCR muy similares a los enumerados previamente para los flancos 6' y 3'. 4) Inserción D: Esta es otra inserción heredada únicamente y confirmada para el extremo 5' del gen ZmCKX2. Esta inserción produce fragmentos de -776 bp y -225 bp con las combinaciones de cebadores d' (71936) y 3' (71937), respectivamente. Sobre la base de la anotación genómica, esta inserción tiene lugar en el Intrón I del gen y por consiguiente probablemente no proporcione un alelo noqueado fuerte. Será necesario efectuar una confirmación de la secuencia de ADN a fin de sustanciar las expectativas para este alelo. d) Inserción E: Esta es una inserción heredada únicamente, nuevamente confirmada por amplificación a partir de ambos flancos del sitio de la inserción. El alelo produce fuertes fragmentos EtBr y de hibridación de -625 bp con la combinación 71936+9242 y de -475 bp con la combinación 71937+9242. Esta posición de la inserción parece interrumpir verdaderamente al Exón I del gen, y tal vez sea el mejor candidato como nulo bueno en el gen ZmCKX2. B. Resumen de TUSC para ZmCKX4 Al igual que para ZmCkx2, se obtuvo la secuencia genómica completa para ZmCkx4 con el fin de facilitar la prueba de noqueo. Se usaron las alineaciones de los dos genes y se identificaron secuencias de intrón conocidas para diseñar los cebadores específicos de las inserciones en el gen ZmCkx4. Después de estos análisis, se diseñaron seis cebadores para PCR para varios intervalos de ZmCkx4 y se evaluaron en pares de control contra el ADNg de maíz de tipo salvaje (B73). Los cebadores fueron identificados como 71942 (SEQ ID N°: 26), 71943 (SEQ ID N°: 27), 71944 (SEQ ID N°: 28), 71945 (SEQ ID N°: 29), 71946 (SEQ ID N°: 30), 71947 (SEQ ID N°: 31) y 9249 MuTIR (SEQ ID N°: 32). Solamente se obtuvo verificación y resultados claros para la combinación de cebadores 71944 + 71947. Otros exámenes estaban dirigidos al Exón IV. Para las pruebas con el Exón IV, el producto de la amplificación de 71944 + 71947 se recortó del gel de agarosa, se purificó y se usó como sonda para la hibridación. Las secuencias de los cebadores se muestran a continuación junto con los tamaños esperados y observados del amplicón para cada combinación de cebadores. Tabla 5 La población TUSC agrupada se examinó con los cebadores 71944 y 71947, cada uno en combinación con el cebador Mutator TIR 9242. Los resultados de las hibridaciones de la agrupación eran buenos con detección de algunas agrupaciones positivas por PCR por hibridación: algunas señales eran reproducibles y se confirmaron entre los cebadores. Las agrupaciones fueron seleccionadas para el análisis de determinación del tamaño de los fragmentos basado en la intensidad y reproducibilidad de las señales de hibridación de las transferencias puntuales de la agrupación. En esta fase del examen, se determinaron los tamaños de los productos de la PCR de blanco: : Mu por reamplificación, electroforesis y análisis Southern. Se examinaron cuarenta y cinco agrupaciones positivas para el cebador 71944 y siete agrupaciones positivas para el cebador 71947 por determinación del tamaño de los fragmentos. Se identificó una cantidad de agrupaciones que presentaban fuertes bandas EtBr y Southern. Se seleccionaron seis agrupaciones para el análisis individual basado en la ubicación putativa de la inserción Mutator dentro de ZmCKX2, determinado a partir de los datos de tamaño y la calidad general de las señales de hibridación en todo el proceso de examen. Las agrupaciones se muestran en la siguiente tabla, junto con sus datos respectivos de tamaño. Las inserciones detectadas fuera de los límites del intervalo de cebadores son de utilidad para expandir la búsqueda de inserciones más allá del exón IV. Cada placa enumerada consiste de los individuos de dos agrupaciones: los que fueron evaluados en el análisis de determinación del tamaño (con caracteres resaltados), así como los individuos de las agrupaciones compañeras correspondientes. Los individuos en las agrupaciones compañeras a menudo están relacionados, pero no necesariamente, con los de las agrupaciones buscadas. Tabla 6 71944 71947 Se dispusieron los ADN individuales y se efectuó una prueba de transferencia puntual con 71944 y 71947. Se identificaron los individuos positivos por PCR para todas las agrupaciones buscadas. Con el fin de asegurar la transmisión germinal de los alelos blanco: : Mu, se efectuó una prueba de transmisión F2 con treinta familias individuales que contenían a los alelos putativos ZmCkx4: : Mu. Se aisló el ADN genómico de la F2 de granos secos (5 K/individuo) y se amplificó con los cebadores apropiados. También se obtuvieron templados controles de estas preparaciones usando el par específico del gen, 71944 + 71947. En la Figura d se provee un esquema de diversas inserciones Mu en ZmCkx4. Los resultados indican la transmisión genética de tres alelos ZmCKX4: : Mu. 1) Inserción A: Este alelo de inserción único solamente se detecta con el cebador 71947+9242, y produce un fragmento grande de >1600 bp. Esta es una señal positiva y probablemente represente una inserción en el Exón I del gen ZmCkx4. La caracterización adicional de este alelo incluirá secuenciación de ADN y el diseño y prueba de los cebadores 5' alternativos. 2) Inserción B: Es una inserción heredada únicamente, con confirmación cruzada por amplificación con ambos cebadores F y R del Exón IV. Como tal, representa un candidato excelente para el noqueo. El alelo produce un producto fuerte de -200 bp con 71944+9242; confirmado por el producto de -400 bp con 71947+9242. Estos cebadores pueden ser de utilidad para los ensayos de determinación del genotipo durante la propagación. 3) Inserción C: Esta es otra inserción heredada únicamente en el Exón IV.
Esta inserción es próxima a la del Alelo 2. La inserción produce un pequeño producto de -176 bp con la combinación 71944+9242 y se confirmó con un producto de -425 bp con la combinación para el flanco derecho, 71947+9242. Los tres alelos son excelentes candidatos para los noqueos de ZmCkx4. Ejemplo 4. La expresión de ZmCkx2 modula el desarrollo de la planta La construcción de ADN que comprende al gen ZmCkx2 ligado operativamente al promotor de ubiquitina se introdujo en plantas de maíz como se describe en Zhao ef al. (1998) Maize Genetics Corporation Newsletter 72: 34-37, incorporada en este documento a modo de referencia. Se obtuvieron plantas de maíz que comprenden un plásmido que contiene la secuencia de ZmCkx2 ligada operativamente a un promotor de ubiquitina. Como control, también se introdujo una construcción no relacionada con citoquinina en las plantas de maíz usando el método de transformación descrito precedentemente. El análisis Northern indicó la presencia de niveles elevados de expresión de ZmCkx2 en los eventos transgénicos. Se estudiaron además los fenotipos de estas plantas de maíz transgénicas que presentan un nivel elevado del polipéptido ZmCkx2. Los cultivos de callos del tejido de maíz transgénico produjo significativamente más raíces y solamente un sexto de los brotes presentes en las plantas control durante el proceso de regeneración. (Véase la Figura 6) Además, las raíces transgénicas cultivadas in vitro y hojas de plantas TO en invernadero mostraron un incremento del doble en la actividad citoquinina oxidasa. (Véase la Figura 8) Las plantas cultivadas en invernadero y que expresan la secuencia ZmCkx2 a niveles altos mostraron un fenotipo típico de las plantas con niveles más bajos de citoquinina, incluyendo problemas del desarrollo tal como plantas más cortas con hojas más delgadas y un color verde/gris. Estas diferencias eran evidentes durante todo el período de crecimiento vegetativo. De las 23 plantas que expresan la secuencia Ubi: ZmCkx2, 6 plantas transgénicas eran del tamaño normal, 8 plantas transgénicas presentaron un tamaño medio, 6 plantas transgénicas eran pequeñas pero viables y 3 plantas transgénicas eran muy pequeñas. En la Figura 7 se muestran los datos de altura de la planta, longitud de la hoja y ancho de la hoja de las plantas transgénicas en comparación con los controles. Las panojas de algunas plantas Ubi: ZmCkx2 carecían de espiguillas pero generaron estilos capaces de formar semillas. Ejemplo 5. Evaluación de la actividad citoquinina oxidasa Se midió el nivel de actividad citoquinina oxidasa en la planta de maíz generada en el Ejemplo 4. El ensayo para determinar el nivel de actividad citoquinina oxidasa se llevó a cabo como se describe en Brugiére ef al. (2003) Plant Physiol. 132: 1228-1240, incorporada en este documento a modo de referencia. Tal como se muestra en la Figura 8A, la actividad citoquinina oxidasa en las raíces de las plantas transgénicas es significativamente mayor que la actividad citoquinina oxidasa en las raíces de las plantas control. Además, como se muestra en la Figura 8B, la actividad citoquinina oxidasa en hojas es mayor en las plantas que expresan ZmCkx2 que en las plantas control.
Ejemplo 6. Conservación o incremento en la formación de semillas durante el estrés. Se bombardearon embriones inmaduros de maíz de plantas donantes de invernadero con un plásmido diseñado para lograr el silenciamiento de genes después de la transcripción (PTGS) con un apropiado promotor. Por ejemplo, el plásmido puede comprender al promotor de ZmCkx2 (SEQ ID N°: 13) ligado operativamente a la secuencia que codifica una estructura en horquilla correspondiente a la CDS del polinucleótido ZmCkx2 (SEQ ID N°: 2). El plásmido también puede contener el gen marcador de selección PAT (Wohlleben ef al. (1988) Gene 70: 25-37), que confiere resistencia al herbicida Bialaphos. La transformación se efectúa de la siguiente manera. Los contenidos de los medios se describen más adelante. Las espigas son despinochadas y se esterilizaron las superficies con blanqueador Clorox 30% además de detergente Micro 0,5% durante 20 minutos y se lavaron dos veces con agua estéril. Se recortaron los embriones inmaduros y se colocaron con el eje embrionario hacia abajo (el escutelo hacia arriba), a razón de 26 embriones por placa, sobre medio 560Y durante 4 horas y luego se alinearon dentro de la zona blanco de 2,6 cm como preparación para el bombardeo. Se elaboró un vector plásmido que comprendía la secuencia promotora ZmCkx2 ligada operativamente a una secuencia que codifica una estructura en horquilla correspondiente a la CDS del polinucleótido ZmCkx2. Este ADN plásmido y el ADN plásmido que contenía el marcador seleccionable PAT se hicieron precipitar sobre partículas de tungsteno de 1 ,1 µm (diámetro promedio) utilizando el siguiente procedimiento de precipitación por CaCI2: 100 µl de un preparado de partículas de tungsteno en agua; 10 µl (1 µg) de ADN en buffer Tris EDTA (1 µg total de ADN); 100 µl de CaCI2 2,5 M; y 10 µl de espermidina 0,1 M. Cada reactivo se agregó sucesivamente a la suspensión de partículas de tungsteno, manteniendo el vortexeo sobre un agitador para múltiples tubos. La mezcla final se sónico brevemente y se dejó en incubación bajo agitación constante durante 10 minutos. Después del período de precipitación, los tubos se centrifugaron brevemente, se retiró el líquido y el pelet se lavó con 500 ml de etanol 100% y se centrifugó durante 30 segundos. Nuevamente se retiró el líquido y se agregaron 105 µl de etanol 100% al pelet final de partículas de tungsteno. Para el bombardeo con la pistola de partículas, las partículas de tungsteno/ADN se sonicaron brevemente y se sembraron 10 µl en forma de manchas sobre el centro de cada macrotransportador y se dejó secar durante aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Las placas de muestras se bombardearon en el nivel N° 4 de la pistola de partículas N° HE34-1 o N° HE34-2. Todas las muestras recibieron un solo disparo a 650 psi, con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas/ADN preparado. Después del bombardeo, los embriones se mantuvieron sobre medio 560Y durante 2 días, luego se transfirieron a medio de selección 560R que contenía Bialaphos 3 mg/litro y se subcultivaron cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de los callos resistentes a la selección fueron transferidos a medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración de los embriones somáticos (2-4 semanas), dichos embriones somáticos bien desarrollados se transfirieron a un medio para su germinación y luego se llevaron a la habitación de cultivo con luz. Aproximadamente 7-10 días después, se transfirieron las plántulas en desarrollo al medio 272V libre de hormonas en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas estaban bien establecidas. Las plantas se transfirieron luego a insertos en cajas (equivalentes a macetas de 2,5") que contenían tierra para macetas y se cultivaron durante 1 semana en cámara de crecimiento, después de cultivaron otras 1-2 semanas en invernadero, luego se transfirieron a las macetas clásicas 600 (1 ,6 galones) y se cultivaron hasta la madurez. Las plantas se monitorearon y calificaron bajo diversas condiciones de estrés y se compararon con plantas control. Se monitoreó la conservación o el incremento en la formación de semillas durante un episodio de estrés abiótico. El medio de bombardeo (560Y) comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C-1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1 ,0 ml/l (1000X SIGMA-1611), tiamina HCl 0,5 mg/l, sacarosa 120,0 g/l, 2,4-D 1 ,0 mg/l y L-prolina 2,88 g/l (llevado a volumen con H2O D-l después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); Gelrite 2,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con H2O D-l); y nitrato de plata 8,6 mg/l (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de selección (560R) comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C- 1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1 ,0 ml/l (1000X SIGMA-1611), tiamina HCl 0,5 mg/l, sacarosa 30,0 g/l y 2,4-D 2,0 mg/l (llevado a volumen con H2O D-l después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); Gelrite 3,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con D-l H20); y nitrato de plata 0,85 mg/l y Bialaphos 3,0 mg/l (ambos se agregaron después de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente). El medio de regeneración (288J) comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 11117-074), solución madre de vitaminas MS 5,0 ml/l (0,100 g de ácido nicotínico, tiamina HCl 0,02 g/l, piridoxina HCl 0,10 g/l y glicina 0,40 g/l llevado a volumen con H2O D-l pulida) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473), mio-inositol 100 mg/l, zeatina 0,6 mg/l, sacarosa 60 g/l y ácido abscísico 1 ,0 ml/l de 0,1 mM (llevado a volumen con H2O D-l pulida después de ajustar el pH en 5,6); 3,0 g/l Gelrite (se agregó después de llevar a volumen con H2O D-l); y ácido indolacético 1 ,0 mg/l y Bialaphos 3,0 mg/l (se agregó después de esterilizar el medio y enfriar a 60 °C). El medio libre de hormonas (272V) comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 11117-074), solución madre de vitaminas MS 5,0 ml/l (ácido nicotínico 0,100 g/l, tiamina HCl 0,02 g/l, piridoxina HCl 0,10 g/l y glicina 0,40 g/l llevado a volumen con H2O D-l pulida), mio-inositol 0,1 g/l y sacarosa 40,0 g/l (llevado a volumen con H2O D-l pulida después de ajustar el pH en d,6); y Bactoagar 6 g/l (se agregó después de llevar a volumen con H2O D-l pulida), esterilizado y enfriado a 60 °C. Ejemplo 7: Modulación del desarrollo radicular Para la transformación mediada por Agrobacterium de maíz con la secuencia ZmCkx4 ligada operativamente al promotor con preferencia por raíces CRWAQ81: : ADH intrón, se empleó el método de Zhao (Patente de EE.UU. N°: 5.981.840, y publicación de patente PCT WO98/32326; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia). Brevemente, se aislan embriones inmaduros de maíz y los embriones toman contacto con una suspensión de Agrobacterium, donde las bacterias tienen la capacidad de transferir el zmCkx4 a por lo menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (paso 1 : el paso de infección). En este paso los embriones inmaduros se sumergen preferentemente en una suspensión de Agrobacterium para iniciar la inoculación. Los embriones se cocultivan por un tiempo con Agrobacterium (paso 2: el paso de cocultivo). Preferentemente, los embriones inmaduros se cultivan sobre un medio sólido después del paso de infección. Después de este período de cocultivo se contempla un paso opcional de "reposo". En este paso de reposo, los embriones se incuban en presencia de al menos un antibiótico conocido por inhibir el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para los transformantes vegetales (paso 3: paso de reposo). Los embriones inmaduros se cultivan sobre medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para eliminar el Agrobacterium y para la fase de reposo de las células infectadas. A continuación, los embriones inoculados se cultivan sobre medio que contiene un agente de selección y se recuperan los callos transformados en crecimiento (paso 4: el paso de selección). Los embriones inmaduros se cultivan sobre medio sólido con un agente selectivo dando como resultado el crecimiento selectivo de las células transformadas. Los callos se regeneran luego en plantas (paso 5: el paso de regeneración) y los callos que crecen sobre el medio selectivo se cultivan sobre medio sólido para regenerar las plantas.
Se efectúa un seguimiento de las plantas y son calificadas por la modulación del desarrollo radicular. Esta modulación del desarrollo radicular incluye el monitoreo del crecimiento radicular mejorado de una o más partes de la raíz incluyendo la raíz primaria, las raíces laterales, las raíces adventicias, etc. Los métodos para medir dichas alteraciones del desarrollo en el sistema radicular son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 2003/0074698 y Werner ef al. (2001) PNAS 18: 10487-10492, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Ejemplo 8. Transformación de embriones de soja Se bombardean embriones de soja con un plásmido que comprende a la secuencia ZmCkx3 ligada operativamente a un promotor con preferencia por raíces. Con el fin de inducir la formación de embriones somáticos, se pueden cultivar cotiledones de 3-d mm de longitud disecados de semillas inmaduras, de superficie esterilizada del cultivar de soja A2872, con luz u oscuridad, a 26 °C sobre un medio de agar apropiado durante 6-10 semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios se recortan y colocan en un medio líquido adecuado. Después de una selección repetida de las agrupaciones de embriones somáticos que se multiplicaron como embriones en etapa globular temprana, las suspensiones se mantienen como se describe más adelante. Los cultivos en suspensión de soja embriogénica se pueden mantener en ml de medio líquido sobre un agitador rotatorio, 150 rpm, a 26 °C con luz fluorescente, con un programa de 16:8 horas de día/noche. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas por inoculación de aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de medio líquido. Luego se pueden transformar los cultivos en suspensión de soja embriogénica por el método de bombardeo con pistola de partículas (Klein et al. (1987) Nature (Londres) 327: 70-73, Patente de EE.UU. N°: 4.946.060). Se puede emplear el equipo DuPont Biolistic PDS1000/HE (retroalimentación con helio) para estas transformaciones.
Un gen marcador de selección que se puede utilizar para facilitar la transformación en soja es un transgen compuesto por el promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812), el gen de la higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25: 179-188) y la región 3' del gen de la nopalina sintetasa del ADN-T del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. El cásete de expresión de interés, que comprende la secuencia ZmCkx2 ligada operativamente al promotor con preferencia por raíces, se puede aislar como un fragmento de restricción. Este fragmento se puede insertar entonces en un único sitio de restricción en el vector que lleva el gen marcador. A 50 µl de una suspensión 60 mg/ml de partículas de oro de 1 µm se agrega (en el orden dado): 5 µl de ADN (1 µg/µl), 20 µl de espermidina (0,1 M) y 60 µl de CaCI2 (2,6 M). La preparación de partículas se agita durante tres minutos, se pasa por una microcentrífuga durante 10 segundos y se retira el sobrenadante. Las partículas recubiertas con ADN se lavan luego una vez en 400 µl de etanol 70% y se vuelven a suspender en 40 µl de etanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas se puede sonicar tres veces durante un segundo por vez. Luego se cargan cinco µl de las partículas de oro recubiertas con ADN sobre cada disco macrotransportador. Se colocan aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas en una caja de Petri vacía de 60 x 15 mm y el líquido residual se retira del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, se bombardean aproximadamente 5-10 placas de tejido. La presión de ruptura de membrana se define en 1 100 psi y la cámara se evacúa hasta un vacío de 28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente a 3,5 pulgadas de distancia de la pantalla de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido se puede dividir por la mitad, colocarse nuevamente en el líquido y cultivarse como se describió anteriormente.
Cinco a siete días después del bombardeo, se puede cambiar el medio líquido por medio fresco y once a doce días después del bombardeo por medio fresco que contiene higromicina 50 mg/ml. Este medio selectivo se puede cambiar semanalmente. Siete a ocho semanas después del bombardeo, se puede observar tejido transformado verde creciendo desde las agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. Se retira el tejido verde aislado y se lo inocula en frascos individuales con el fin de generar nuevos cultivos embriogénicos transformados en suspensión, propagados por clonación. Cada línea nueva se puede tratar como un suceso de transformación independiente. Estas suspensiones se pueden subcultivar y mantener como agrupaciones de embriones inmaduros o se pueden regenerar en plantas completas por maduración y germinación de los embriones somáticos individuales. Ejemplo 9. Variantes de las secuencias CKX A Variantes de las secuencias de nucleótidos de CKX (SEQ ID N°: 2, 5, 8, 11, 52, 54 ó 55) que no alteran la secuencia de aminoácidos codificada Las secuencias de nucleótidos CKX que se muestran en las SEQ ID N°: 2, 5, 8, 11 , 62, 54 y 56 se usan para generar variantes de secuencias de nucleótidos que poseen la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto con un 70%, 75%, 80%), 85%, 90% y 96% aproximadamente de identidad de secuencia de nucleótidos en comparación con la secuencia de nucleótidos ORF inicial no alterada de las correspondientes SEQ ID. Estas variantes funcionales se generan usando una tabla de codones estándar. En tanto la secuencia de nucleótidos de las variantes está alterada, la secuencia de aminoácidos codificada por el marco de lectura abierto no cambia. B. Variantes de aminoácidos de las secuencias de polipéptidos CKX Se generaron variantes de aminoácidos de las secuencias de los polipéptidos CKX. En este ejemplo, se altera un aminoácido. Específicamente, se revisaron los marcos de lectura abiertos que se muestran en las SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12 ó 53 para determinar la alteración de aminoácido apropiada. La selección del aminoácido a cambiar se efectúa consultando la alineación de la proteína (con los otros ortólogos y otros miembros de la familia de genes de distintas especies). Véase las Figuras 1 y 2. Se selecciona un aminoácido que no se considera bajo una gran presión de selección (no está altamente conservado) y que se puede sustituir con relativa facilidad por un aminoácido de características químicas similares (es decir, cadenas laterales funcionales similares). Se puede cambiar el aminoácido apropiado usando la alineación proteica que se muestra en las Figuras 1 y/o 2. Una vez identificado el aminoácido buscado, se emplea el procedimiento descrito en el Ejemplo 9A. Se generan variantes que presentan un 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95% aproximadamente de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12 ó 53 usando este método. C. Variantes adicionales de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos CKX En este ejemplo, se crean secuencias proteicas artificiales que presentan un 80%), 85%>, 90%) y 95% de identidad con relación a la secuencia proteica de referencia. Este último esfuerzo requiere de la identificación de regiones conservadas y variables de la alineación que se muestra en las Figuras 1 y 9 y luego la aplicación prudente de una tabla de sustituciones de aminoácidos. Estas partes se describirán con mayor detalle más adelante. Mayormente, la determinación de cuáles de las secuencias de aminoácidos están alteradas se realiza sobre la base de las regiones conservadas entre la proteína CKX o entre los demás polipéptidos CKX. Véase las Figuras 1 , 2 y 9. Basado en la alineación de secuencia, las distintas regiones del polipéptido CKX con probabilidad de ser alteradas están representadas con letras minúsculas, en tanto las regiones conservadas están representadas con letras mayúsculas. Se considera que se pueden efectuar sustituciones conservadoras en las regiones conservadas abajo sin alterar la función. Además, el especialista comprenderá que las variantes funcionales de la secuencia CKX de la invención pueden contener alteraciones menores de aminoácidos no conservados en el dominio conservado. Después se crean secuencias proteicas artificiales que son diferentes de la original en los intervalos de 80-85%, 85-90%, 90-95%, y 95-100% de identidad. Se buscan los puntos medios de estos intervalos, con una desviación de más o menos el 1%, por ejemplo. Las sustituciones de aminoácidos serán efectuadas por el script comercial Perl. A continuación se provee la tabla de sustituciones en la Tabla 8. Tabla 8. Tabla de sustituciones Primero, se identifica todo aminoácido conservado en la proteína que no debe cambiarse y se "marca" para aislarlo de la sustitución. La metionina inicial se agregará por supuesto a esta lista de forma automática. A continuación se efectúan los cambios. H, C y P no se cambian bajo ninguna circunstancia. Los cambios tendrán lugar con isoleucina primero, pasando de N-terminal a C-terminal. Después la leucina, y así sucesivamente avanzando por la lista hasta obtener el blanco deseado. Se pueden efectuar sustituciones interinas como para no causar una inversión de los cambios. La lista está ordenada de 1-17, de modo que se puede comenzar por tantos cambios de ¡soleucina como sea necesario antes de la leucina y así sucesivamente hasta llegar a la metionina. Resulta claro que de esta manera no será necesario cambiar muchos aminoácidos. L, I y V comprenderán una sustitución de 50: 50 de las dos sustituciones óptimas alternativas. Las variantes de las secuencias de aminoácidos se obtienen por escrito. Se emplea Perl script para calcular las identidades porcentuales. Este procedimiento permite generar variantes de los polipéptidos CKX que poseen aproximadamente un 80%, 85%), 90% y 95% de identidad de aminoácidos con la secuencia de nucleótidos de la ORF inicial no alterada de la SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12 ó 53. Ejemplo 10. Subsensibilización del catabolismo de la citoquinina Los promotores de la presente invención se pueden utilizar en construcciones diseñadas para subsensibilizar la actividad citoquinina oxidasa. Por ejemplo, determinadas realizaciones comprenden una construcción que comprende un segmento de un promotor endógeno de la citoquinina oxidasa de modo tal que, con la expresión, la auto-hibridación del ARN dará como resultado la formación de ARN en horquilla (ARNh), lo cual a su vez se traduce en un silenciamiento genético de transcripción del gen nativo de la citoquinina oxidasa. Por consiguiente, la realización comprende una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa en una célula, forma una molécula de ARN en horquilla (ARNh), que suprime (es decir, reduce o elimina) la expresión del gen endógeno de la citoquinina oxidasa a partir de su promotor endógeno. La capacidad de los ARNh para suprimir la expresión de un gen está descrita en la literatura (véase, por ejemplo, Matzke et al. (2001) Curr. Opin. Genet. Devel. 11 : 221-227; Scheid et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci., EE.UU. 99: 13659-13662; Waterhouse y Helliwell (2003) Nature Reviews Genetics 4: 29-38; Aufsaftz et al (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 99(4): 16499-16506; Sijen et al., Curr. Biol. (2001) 11 : 436-440). El promotor que está ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el ARNh puede ser cualquier promotor que sea activo en células vegetales, en particular un promotor que sea activo (o que pueda ser activado) en los tejidos reproductores de una planta. Como tal, el promotor puede ser, por ejemplo, un promotor constitutivamente activo, un promotor inducible, un promotor específico de tejidos, un promotor con preferencia por tejidos, un promotor específico de la etapa del desarrollo o un promotor con preferencia por una etapa del desarrollo. La horquilla puede estar dirigida a un solo promotor o bien a dos o más promotores por medio de un solo ARN transcrito. La región que codifica la horquilla puede estar ubicada en cualquier posición apropiada dentro de la construcción, tal como dentro de un intrón de un gen codificado o dentro de las regiones no codificadoras 5' o 3' o puede ser el único elemento expresado de la construcción. Los métodos para preparar dichas construcciones y transformar plantas pueden ser los que ya están descritos (por ejemplo, véase Cigan et al., Sex Plant Reprod. 14: 135-142, 2001). Dicha construcción para subsensibilizar la expresión de la citoquinina oxidasa se puede usar junto con otras construcciones o métodos, tal como los que dan como resultado un incremento en la actividad de biosíntesis de la citoquinina. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los especialistas en el arte a los cuales está dirigida esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en este documento a modo de referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual se incorporara específicamente e individualmente en este documento a modo de referencia. Aunque la invención precedente se ha descrito con cierto detalle a modo ilustrativo y de ejemplo a efectos de ofrecer una mayor claridad para su comprensión, resulta evidente que es posible efectuar determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (39)

  1. REIVINDICACIONES: 1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por: (a) una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID N°: 6, 9, 12 ó 53; (b) una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 6, 9, 12 ó 53, donde dicho polipéptido posee actividad citoquinina oxidasa; (c) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de la
  2. SEQ ID N°: 5, 8, 11 ó 52, donde dichas condiciones severas comprenden hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,1X a 60-65 °C; y (d) una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 17 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N°: 6, 9, 12 ó 53, donde dicho polipéptido retiene la actividad citoquinina oxidasa. 2. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: (a) una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N°: 4, 5, 7, 8, 10, 11 , 51 0 52; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID N°: 6, 9, 12 ó 53; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 85%) de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 4, 5, 7, 8, 10, 11 , 51 ó 52, o con la secuencia de codificación de la misma, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que posee actividad citoquinina oxidasa; (d) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 50 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID N°: 4, 5, 7, 8, 10, 11 , 51 ó 52, o un complemento de la misma; y (e) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de la secuencia de nucleótidos de a), donde dichas condiciones severas comprenden hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,1X a 60-65 °C.
  3. 3. Un cásete de expresión que comprende el polinucleótido de la cláusula 2 ligado operativamente a un promotor que dirige la expresión en una planta.
  4. 4. Una planta que comprende el cásete de expresión de la cláusula 3.
  5. 5. La planta de la cláusula 4, donde dicha planta presenta un nivel de citoquinina modulado en comparación con una planta control.
  6. 6. La planta de la cláusula 5, donde dicho nivel de citoquinina está aumentado en comparación con una planta control.
  7. 7. La planta de la cláusula 5, donde dicho nivel de citoquinina está disminuido en comparación con una planta control.
  8. 8. El cásete de expresión de la cláusula 3, donde dicho promotor es un promotor específico de tejidos, un promotor constitutivo o un promotor inducible.
  9. 9. La planta de la cláusula 4, donde dicha planta presenta un desarrollo floral modulado en comparación con una planta control.
  10. 10. La planta de la cláusula 4, donde dicha planta presenta un desarrollo radicular modulado en comparación con una planta control.
  11. 11. La planta de la cláusula 4, donde la planta presenta una relación alterada de brotes a raíces en comparación con una planta control.
  12. 12. La planta de la cláusula 4, donde dicha planta presenta un tamaño de semilla incrementado o un peso de semilla incrementado, o ambos, en comparación con una planta control.
  13. 13. La planta de la cláusula 4, donde el rendimiento o el vigor de dicha planta está aumentado en comparación con una planta control.
  14. 14. La planta de la cláusula 4, donde la tolerancia al estrés de dicha planta está conservada o mejorada en comparación con una planta control.
  15. 15. La planta de la cláusula 14, donde dicha planta es Zea mays y están reducidos los abortos de granos de la punta.
  16. 16. La planta de la cláusula 14, donde la formación de semillas de dicha planta bajo estrés está aumentada o conservada en comparación con una planta control.
  17. 17. La planta de la cláusula 4, donde dicha planta presenta una disminución en el crecimiento de los brotes en comparación con una planta control.
  18. 18. Una semilla transformada de la planta de la cláusula 4.
  19. 19. Una planta modificada genéticamente en un locus genómico nativo, donde dicho locus genómico codifica un polipéptido seleccionado del grupo formado por: (a) una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12 ó 53; y (b) una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12 ó 53, donde dicho polipéptido presenta actividad citoquinina oxidasa; donde dicha planta fue modificada genéticamente para reducir o eliminar la actividad de dicho polipéptido.
  20. 20. La planta de la cláusula 19, en la cual se ha reducido o eliminado la actividad de dicho polipéptido por medio de una inserción Mu en el locus genómico.
  21. 21. La planta de la cláusula 19, en la cual se ha reducido o eliminado la actividad de dicho polipéptido por medio de una construcción en horquilla específica para el locus genómico.
  22. 22. Un método para incrementar el nivel o la actividad de un polipéptido de citoquinina oxidasa en una planta, que comprende introducir en dicha planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: (a) una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N°: 2, 5, 8, 11, 52, 54 ó 55; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12 ó 53; (c) una secuencia de nucleótidos que presenta al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 2, 5, 8, 11 , 52, 54 ó 55, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que presenta actividad citoquinina oxidasa; (d) una secuencia de nucleótidos que se híbridiza bajo condiciones severas con el complemento del polinucleótido de a), donde dichas condiciones severas comprenden hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,1X a 60-65 °C, y donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que presenta actividad citoquinina oxidasa; y (e) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 50 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID N°: 2, 5, 8, 11 , 52, 54 ó 55, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que presenta actividad citoquinina oxidasa.
  23. 23. El método de la cláusula 22, donde la provisión de dicho polipéptido disminuye el nivel o la actividad de citoquinina en dicha planta.
  24. 24. El método de la cláusula 22, donde dicho polinucleótido está ligado operativamente a un promotor específico de tejidos, un promotor constitutivo o un promotor inducible.
  25. 25. El método de la cláusula 22, donde el incremento en la actividad de dicho polipéptido modula el desarrollo radicular de la planta en comparación con una planta control.
  26. 26. El método de la cláusula 22, donde el incremento en la actividad del polipéptido modula el desarrollo floral.
  27. 27. Un método para reducir o eliminar el nivel de un polipéptido en una planta que comprende modificar el locus genómico nativo que codifica dicho polipéptido, donde dicho locus genómico nativo comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: (a) la SEQ ID N°: 1 , 2, 4, 5, 7, 8, 10, 1 1 , 51 , 52, 54 0 55; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID N°: 3, 6, 9, 12 ó 53; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 2, 5, 8, 11 , 52, 54 ó 55, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que presenta actividad citoquinina oxidasa; (d) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 50 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID N°: 1 , 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11 , 51 , 52, 54 ó 55, o un complemento de la misma; y (e) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de la secuencia de nucleótidos de a), donde dichas condiciones severas comprenden hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,1X a 60-65 °C.
  28. 28. El método de la cláusula 27, donde dicho método incrementa el nivel de citoquinina en la planta.
  29. 29. El método de la cláusula 27, donde la reducción del nivel de dicho polipéptido incrementa el tamaño de las semillas o el peso de las semillas de la planta en comparación con una planta control.
  30. 30. El método de la cláusula 27, donde dicha planta es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno.
  31. 31. El método de la cláusula 27, donde la tolerancia al estrés de dicha planta se conserva o se mejora en comparación con una planta control.
  32. 32. El método de la cláusula 31, donde la planta es Zea mays y se minimizan los abortos de granos de la punta.
  33. 33. El método de la cláusula 27, donde dicho locus genómico nativo fue modificado por medio de una inserción Mu.
  34. 34. El método de la cláusula 27, donde dicho locus genómico nativo fue modificado por medio de una construcción en horquilla.
  35. 35. Un primer polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N°: 13, 14, 15 ó 16, o los nucleótidos 1-3390 de la SEQ ID N°: 51 , donde dicho polinucleótido dirige la expresión de un segundo polinucleótido, ligado operativamente al mismo.
  36. 36. Una construcción de ADN que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, donde dicho promotor comprende al polinucleótido de la cláusula 35 o un fragmento funcional del mismo.
  37. 37. Un método para regular la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés, donde dicho método comprende la incorporación de forma estable en el genoma de una célula vegetal de una secuencia de nucleótidos de interés ligada operativamente a un promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de la cláusula 36.
  38. 38. Una construcción que comprende una primera secuencia de nucleótidos que comparte suficiente identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 13, 14, 15, 16 ó 51 que, cuando se expresa, forma una molécula de ARN en horquilla que suprime la expresión de una segunda secuencia de nucleótidos ligada operativamente al promotor ZmCkx2, al promotor ZmCkx3, al promotor ZmCkx4, al promotor ZmCkxd o al promotor ZmCkx?, respectivamente.
  39. 39. Un método para suprimir la actividad citoquinina oxidasa en una planta, que comprende la transformación de una célula vegetal huésped con la construcción genética de la cláusula 38 y la regeneración a partir de dicha célula transformada de una planta transgénica, en la cual se ha reducido o eliminado la expresión de uno o más genes endógenos de citoquinina oxidasa. TEXTO DE LAS FIGURAS
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