ES2333102T3 - Metodo para modificar la morfologia, bioquimica y fisiologia de las plantas. - Google Patents

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Abstract

Uso de un ácido nucléico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta para estimular el crecimiento radicular para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular.

Description

Método para modificar la morfología, bioquímica y fisiología de las plantas.
Campo de la invención
La presente especificación se relaciona en general con un método para modificar las propiedades o características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas de las plantas, tales como uno o más de sus procesos de desarrollo y/o sus procesos de adaptación al ambiente, incluyendo pero no limitándose a la modificación de la iniciación o estimulación o mejora del crecimiento de la raíz, y/o a la formación de raíces adventicias, y/o a la formación de raíces laterales, y/o al geotropismo de las raíces, y/o al crecimiento de brotes, y/o al dominio apical, y/o a la ramificación, y/o al periodo de senescencia, y/o al periodo de floración, y/o al periodo de formación de flores, y/o al desarrollo de semillas, y/o al rendimiento en semillas, comprendiendo dicho método a la expresión de una proteína de control de la degradación de la citoquinina, en particular la citoquinina oxidasa, en la planta, operablemente bajo el control de una secuencia promotora regulable, tal como una secuencia promotora específica para la célula, promotora específica para el tejido, o promotora específica para un órgano. Preferiblemente, las características modificadas por la presente invención son características mediadas por la citoquinina y/o mediadas por la auxina. La presente especificación se extiende a las construcciones genéticas que son útiles para llevar a cabo el método de la invención y a las plantas transgénicas producidas con el mismo que tienen propiedades morfológicas y/o bioquímicas y/o fisiológicas alteradas comparadas con sus contrapartes isogénicas.
Antecedentes de la invención
Las raíces son un órgano importante de las plantas superiores. Sus principales funciones son anclar la planta en el suelo y tomar el agua y los nutrientes (nutrición N, minerales, etc.). Así, el crecimiento de la raíz tiene una influencia directa o indirecta en el crecimiento y rendimiento de los órganos aéreos, particularmente bajo condiciones de limitación de nutrientes. Las raíces también son relevantes para la producción de productos vegetales secundarios, tales compuestos de defensa y hormonas vegetales.
Las raíces también son órganos de almacenamiento en un buen número de cultivos importantes. La remolacha de azúcar es la planta más importante para la producción de azúcar en Europa (260 millones de toneladas/año, 38% de la producción mundial). La mandioca (casaba), los ñames y las patatas dulces (batatas) son también productores de almidón importantes (aproximadamente 150 millones de toneladas/año cada una). Su contenido en almidón puede ser dos veces tan alto como el de la patata. Las raíces también son el órgano relevante para el consumo en un importante número de vegetales (por ejemplo, zanahorias, rábanos), hierbas (por ejemplo, jengibre, cúrcuma), y plantas medicinales (por ejemplo, ginseng). Además, algunos de los productos vegetales secundarios encontrados en las raíces son de importancia económica para la industria química y farmacéutica. Un ejemplo son los ñames que contienen moléculas básicas para la síntesis de hormonas esteroides. Otro ejemplo es la chiconina, que es producida por las raíces de la Lithospermum erithrorhizon en cultivos de raíces vellosas. La Shikonina es usada por sus propiedades antiinflamatorias, antitumorales y para curación de heridas.
Además, el crecimiento de la raíces de las plantas de cultivo mejoradas también mejora la competitividad frente a la maleza y mejora el crecimiento en áreas áridas, incrementando la accesibilidad y el consumo de agua.
El crecimiento mejorado de las raíces también es relevante para propósitos ecológicos, tales como la biorremediación y la prevención/detención de la erosión del suelo.
La arquitectura de las raíces es un área que ha permanecido durante mucho tiempo inexplorada a través de los cultivos clásicos, debido a las dificultades cuando se trata de tener acceso a este reto en el campo. Así, la biotecnología podría tener un impacto significativo en la mejora de este aspecto, puesto que no se basa en selecciones a gran escala en el campo. En cambio, las modalidades biotecnológicas requieren de un entendimiento básico de los componentes moleculares que determinan una característica específica de la planta. Hoy, este conocimiento es solamente fragmentario, y como consecuencia, la biotecnología hasta ahora ha sido incapaz de alcanzar una profunda penetración en esta área.
Un regulador bien establecido del crecimiento de las raíces es la auxina. La aplicación de ácido indol-3-acético (IAA) a las plantas en crecimiento estimula el desarrollo de las raíces laterales y la elongación de las raíces laterales (Torrey, Am J Bot 37: 257-264, 1950; Blakely et al., BotGaz 143: 341-352, 1982; Muday and Haworth, Plant Physiol Biochem 32: 193-203, 1994). Las raíces expuestas a un rango de concentraciones de IAA iniciaron números crecientes de raíces laterales (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000). Además, cuando las raíces que habían producido laterales en respuesta a una concentración particular de auxina exógena fueron expuestas subsecuentemente a concentraciones más altas de IAA, se formaron numerosas raíces laterales supernumerarias espaciadas entre las existentes (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000).
Por el contrario, el crecimiento de las raíces en agar que contenía inhibidores del transporte de la auxina, incluyendo el NPA, disminuyera el número de raíces laterales (Muday and Haworth, Plant Physiol Biochem 32: 193-203,
1994).
Se han aislado mutantes de arabidopsis que contienen niveles incrementados de IAA endogeno (Boerjan et al., Plant Cell 7: 1405-141, 1995; Celenza et al., Gene Dev 9: 2131-2142, 1995; King et al., Plant Cell 7: 2023-2037, 1995; Lehman et al., Cell 85: 183-194, 1996). Son conocidas por ser alelos de un locus localizado en el cromosoma 2. Estas cepas tienen raíces adventicias y laterales en exceso, lo que está de acuerdo con los efectos antes descritos de la aplicación externa de la auxina.
El efecto estimulador de las auxinas en la formación de raíces adventicias y laterales sugiere que la sobre producción de auxinas en las plantas transgénicas es una estrategia valida para incrementar el crecimiento de las raíces. Además, también es cuestionable si esto produciría un producto comercial con características mejoradas. A parte de su efecto estimulatorio sobre la formación de las raíces adventicias y laterales, la sobreproducción de auxina dispara otros efectos, tales como la reducción en el número de hojas, la morfología anormal de hojas (hojas estrechas, entorchadas), inflorescencias abortadas, dominio apical incrementado, formación de raíces adventicias en el tallo, la mayoría de las cuales son indeseables desde la perspectiva agronómica (Klee et al., Genes Devel 1: 86-96, 1987; Kares et al., Plant Mol Biol 15: 225-236, 1990). Por lo tanto, el principal problema con modalidades que se basan en la síntesis incrementada de la auxina es un problema de las limitaciones, a saber para confinar los efectos de la auxina sobre la raíz. Este problema no es superado probablemente por el uso de promotores específicos del tejido: las auxinas son transportadas en la planta y su acción consecuentemente no está confinada al sitio de la síntesis. Otro aspecto es si las auxinas siempre mejoraran la biomasa total de las raíces. Para plantas cultivadas sobre agar, se ha notado que las concentraciones crecientes estimulaban progresivamente la formación de raíces laterales pero inhibían concurrentemente el crecimiento de estas raíces (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000).
Los problemas anteriormente mencionados en cuanto a la limitación de los efectos de la auxina y el mantenimiento del crecimiento de las raíces se resuelven mediante las realizaciones de las reivindicaciones de la patente.
Resumen de la invención
La presente invención se relaciona con una materia objeto tal como la que se define en las reivindicaciones anexas 1 a 56.
La presente especificación describe una construcción genética que comprende un codificador genético que es una proteína con actividad de citoquinina oxidasa de la Arabidopsis thaliana. Este gen se expresa bajo el control de un promotor regulado. Este promotor puede ser regulado por factores específicos del tejido endógeno o específicos del ambiente, o alternativamente puede ser inducido por la aplicación de productos químicos específicos.
La presente especificación también describe una célula o planta que contiene la construcción genética.
La presente especificación también describe un método para modificar la arquitectura y biomasa de las raíces mediante la expresión de un gen de la oxidasa citoquinina bajo control de un promotor que es específico para la raíz o para ciertos tejidos o tipos de células de la raíz.
Descripción detallada de la invención
Para obviar los problemas antes mencionados asociados con el incremento de la biosíntesis de la auxina, se decidió seguir una modalidad alternativa. Nuestro razonamiento es que una regulación hacia abajo de los antagonistas biológicos de las auxinas podría evocar efectos similares o incluso superiores sobre el crecimiento de las raíces en comparación con los niveles de auxina en incremento. Las acciones e interacciones hormonales son extremadamente complejas, pero nuestra hipótesis es que las citoquininas podrían funcionar como antagonistas de la auxina con respecto al crecimiento de las raíces. Los estudios hormonales sobre los cultivos de tejidos vegetales han mostrado que la relación de la auxina versus la citoquinina es más importante para la organogénesis que los niveles absolutos de cada una de estas hormonas, lo cual en efecto indica que estas funciones hormonales son antagonistas - por lo menos en ciertos procesos biológicos. Además, la formación de raíces laterales es inhibida por la aplicación exógena de citoquininas. De manera interesante, también la elongación es afectada negativamente por el tratamiento con citoquinina, lo cual sugiere que las citoquininas controlan tanto la ramificación de raíces como el crecimiento de las raíces.
Juntos, los datos de la literatura actual indican que niveles incrementados de citoquinina afectan negativamente el crecimiento de las raíces, pero los mecanismos que subyacen bajo este proceso no son entendidos. Los sitios para la síntesis de la citoquinina en la planta son las puntas de las raíces y los tejidos jóvenes del brote. Las concentraciones endógenas de citoquininas están en el rango de los nM. Sin embargo, puesto que su cuantificación es difícil, es necesario extraer grandes cantidades de tejido y las concentraciones reales no son conocidas. También, la compartimentación subcelular de las citoquininas no es conocida. Se cree en general que las bases libres y las ribosidas están localizadas en el citoplasma y en el núcleo, mientras que los glucósidos están localizados en la vacuola. También existen diferentes citoquininas con estructuras químicas ligeramente diferentes. Como consecuencia, no se sabe si los efectos de las citoquininas exógenas deberían ser adscritos a un aumento en la concentración total de citoquinina o más bien a la competencia de otras formas de citoquininas generadas en la planta (las cuales difieren bien en estructura, localización celular o subcelular) para receptores, translocalizadores, transportadores, enzimas de modificación...
Con el fin de probar la hipótesis de que los niveles de citoquinina en la raíz efectivamente exceden el nivel óptimo para el crecimiento de la raíz, se clonaron nuevos genes que codifican la citoquinina oxidasas (las cuales son enzimas metabolizantes de la citoquinina) a partir de Arabidopsis thaliana (designada ATCKX) y fueron expresados subsecuentemente bajo un promotor fuerte constitutivo en tabaco transgénico y Arabidopsis. Los transformantes que mostraron la expresión del ATCKX ARNm e incrementaron la actividad de la oxidasa citoquinina y manifestaron una formación mejorada y crecimiento de las raíces.
También se observaron efectos negativos sobre el crecimiento de brotes. Éste ultimo está de acuerdo con la expresión constitutiva del gen de la citoquinina oxidasa en estas plantas, que ilustra la importancia de la expresión confinada del gen de la citoquinina oxidasa para las propiedades generales de crecimiento de las plantas. La limitación de la actividad de la citoquinina oxidasa puede alcanzarse utilizando promotores específicos para células, tejidos u órganos, puesto que la degradación de la citoquinina es un proceso limitado a los tejidos o células que expresan la proteína CKX, esto en contraste con las modalidades que se basan en la síntesis hormonal, como se explicó anteriormente.
Los efectos negativos observados de la expresión de la citoquinina oxidasa sobre el crecimiento de los brotes demuestran que las citoquininas oxidasas son objetivos interesantes para el diseño o para la selección de productos químicos promotores del crecimiento. Tales productos químicos deberían inhibir la actividad de la citoquinina oxidasa, deberían preferiblemente no ser transportados a la raíz y deberían ser degradados rápidamente en el suelo, de manera que la aplicación de estos productos químicos no inhiba el crecimiento de la raíz. Las citoquininas también retardan la senescencia de las hojas, lo que significa que los efectos positivos incluirán también el crecimiento y mantenimiento de los tejidos fotosintéticos. Además, la observación de que las citoquininas retrasan la senescencia, mejoran el verdor (el contenido de clorofila) de las hojas y reducen el dominio apical de las raíces lo que muestra que las estrategias basadas en la supresión de la actividad CKX (tales como tecnología antisentido, riosomal y de cosupresión) en las partes aéreas de las plantas se traducirían en una senescencia retrasada, mejorando el verdor de las hojas e incrementando la ramificación.
De la misma forma, los efectos positivos observados de la expresión de la citoquinina oxidasa en el crecimiento de las raíces demuestra que las citoquininas oxidasas son objetivos interesantes para el diseño o selección de herbicidas. Tales herbicidas deberían inhibir la actividad de la citoquinina oxidasa, preferiblemente no deberían ser transportados hacia los brotes, y deberían ser solubles y relativamente estables en un solvente que pueda ser administrado a la raíz a través del suelo. Estos efectos de la sobre expresión de la citoquinina oxidasa sobre el desarrollo y la arquitectura de la planta eran hasta el momento desconocidos, y como consecuencia, la presente invención y sus realizaciones no podrían ser previstas.
Los efectos negativos observados sobre el crecimiento de los brotes demuestra que la manipulación de la citoquinina oxidasa también pude ser usada para obtener fenotipos enanos. Los fenotipos enanos son útiles particularmente en cultivos comerciales tales como cereales y árboles frutales por ejemplo.
Realizaciones preferibles de esta especificación se relaciona con el efecto positivo de la expresión de la citoquinina oxidasa en el crecimiento y arquitectura de la planta, y en particular en el crecimiento y arquitectura de la raíz. La familia de genes de la citoquinina oxidasa contiene por lo menos seis miembros en la Arabidopsis (véanse ejemplos más abajo) y los presentes inventores han mostrado que hay diferencias cuantitativas en los efectos alcanzados con algunos de estos genes en plantas transgénicas. Se anticipa que los homólogos funcionales de la citoquinina oxidasa de Arabidopsis descritas pueden ser aislados de otros organismos, dada en la evidencia para la presencia de actividades citoquinina oxidasa en muchas plantas verdes (Hare and van Staden, Physiol Plant 91: 128-138, 1994; Jones and Schreiber, Plant Growth Reg 23:123-134, 1997), así como en otros órganismos (Armstrong, in Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. Eds Mok and Mok, CRC Press, pp139-154, 1994). Por lo tanto, la secuencia de la citoquinina oxidasa funcional en la descripción de esta especificación, no necesita ser idéntica a la descrita aquí. Esta divulgación es particularmente útil para cultivos de cereales y cultivos de monocotiledonias en general, y los genes de la citoquinina oxidasa por ejemplo de trigo o maíz pueden ser usados también (Morris et al., 1999; Rinaldi and Comandini, 1999). Se prevé que otros genes con actividades citoquinina oxidasa o con cualquier otra actividad metabolizante de citoquinina (véase Zazimalová et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones, Hooykaas, Hall and Libbenga (Eds.), Elsevier Science, pp141-160, 1997) también pueden ser para el propósito de esta divulgación. De la misma forma, los genes que codifican proteínas incrementarían la actividad metabolizante de la citoquinina endógena pueden ser usados también para el propósito de esta divulgación. En principio, también podrían obtenerse fenotipos similares que interfieren con genes que funcionan corriente abajo de la citoquinina tales como los receptores o proteínas involucrados en los caminos de transducción de la señal de la citoquinina.
Para el propósito de esta invención, debe entenderse que el término "crecimiento de raíces" abarca todos los aspectos de crecimiento de las diferentes partes que constituyen el sistema radicular en diferentes etapas de su desarrollo, tanto en plantas monocotiledonias como dicotiledonias. Debe entenderse que el crecimiento mejorado de la raíz puede resultar a partir del crecimiento mejorado de una o más de sus partes incluyendo las raíces primarias, raíces laterales, raíces adventicias, etc., todas las cuales caen dentro del alcance de esta invención.
De acuerdo con una presente realización, la presente especificación se refiere a un método para estimular el crecimiento de las raíces y/o potenciar la formación de raíces laterales y/o adventicias y/o alterar el geotropismo de la raíz comprendiendo la expresión de una citoquinina oxidasa de una planta o comprendiendo la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas u otras partes de las plantas.
La invención se relaciona específicamente a tales métodos como se define en la reivindicación anexa 55.
Como se define en la reivindicación anexa 1, la invención se relaciona particularmente con el uso de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta para estimular el crecimiento de la raíz o para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular.
En el contexto de la presente invención debería entenderse que los términos "expresión" y/o "sobre expresión" se usan de manera intercambiable y se relacionan los dos con "una expresión potenciada y/o ectópica" de una citoquinina oxidasa de una planta o cualquier otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en las plantas. Debe quedar claro que aquí una expresión potenciada de la citoquinina oxidasa de una planta, así como la expresión "de novo" de las citoquinina oxidasas o de dichas otras proteínas es importante. Alternativamente, dichas otras proteínas potencian la actividad metabolizante de la citoquinina de una citoquinina oxidasa de una planta.
Debe entenderse adicionalmente que en el contexto de la presente invención la expresión "raíces laterales y/o adventicias" puede significar raíces laterales y adventicias pero también "radiculación lateral o adventicias". La potenciación puede existir en la forma de raíces laterales o en la formación de raíces adventicias así como en la formación de ambos tipos de raíces no primarias, pero no necesariamente.
De acuerdo con una realización adicional, la presente especificación se relaciona con un método para estimular el crecimiento de las raíces y/o potenciar la formación de raíces laterales o adventicias y/o alterar el geotropismo radicular y/o incrementar el rendimiento y/o potenciar el vigor temprano y/o modificar la relación raíces/brotes y/o mejorar la resistencia a la invasión y/o incrementar la tolerancia a la sequía y/o promover la propagación in vitro de esquejes, comprendiendo la expresión de una citoquinina oxidasa de una planta o comprendiendo la expresión de otra proteína que reduzca el nivel de las citoquininas activas en las plantas o en partes de las plantas.
De acuerdo con una realización preferida, la presente especificación se relaciona con un método para estimular el crecimiento de las raíces que resultan en un incremento de la masa radicular por sobreexpresión de una citoquinina oxidasa, preferiblemente una citoquinina oxidasa de acuerdo con la invención, u otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en plantas u otras plantas, preferiblemente en raíces.
La producción de biomasa radicular más alta debida a la sobreexpresión de las secuencias promotoras del crecimiento tiene un efecto directo en el rendimiento y un efecto indirecto en la producción de compuestos producidos por las células radiculares o células radiculares transgénicas o cultivos de células de dichas células radiculares transgénicas. Un ejemplo de un compuesto interesante producido en cultivos de raíces es la Shikonina, cuyo rendimiento puede ser potenciado ventajosamente por dichos métodos.
De acuerdo con una realización más especifica, la presente especificación se refiere a métodos para estimular el crecimiento radicular o para potenciar la formación de raíces laterales y adventicias o para alterar el geotropismo radicular que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta seleccionado del grupo consistente de:
(a)
ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ADN tal como es dada por cualquiera de SEQ ID NOs 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 28, 28 a 31, 33 o 34, o el complemento de los mismos,
(b)
ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de SEQ ID NOs 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 o 34, o los complementos de los mismos,
(c)
ácidos nucleicos que hibridizan específicamente a cualquiera de SEQ ID NOs 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 o 34, o a los complementos de los mismos,
(d)
ácidos nucleicos que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como es dada en cualquiera de SEQ ID NOs 2, 4, 8, 8, 10, 12, 32 o 35, o los complementos de los mismos,
(e)
ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (d), caracterizados por que dicho ácido nucleico es ADN, ADN genómico, ADNc, ADN o ARN sintéticos donde T es remplazado por U,
(f)
ácidos nucleicos que son degenerados a ácidos nucleicos como los dados en cualquiera de SEQ ID NOs 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 o 34, o los cuales son degenerados a un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (e)como resultado del código genético,
(g)
ácidos nucleicos que son divergentes de un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en cualquiera de SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8,10,12 o 35 o los cuales son divergentes de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (e), debido a las diferencias en la utilización de codones entre los organismos,
(h)
ácidos nucleicos que codifican una proteína como se da en SEQ ID NOs 2, 4, 8, 8, 10,12 o 35 o ácidos nucleicos como se define en (a) a (e) los cuales son divergentes debido a las diferencias entre alelos,
(i)
ácidos nucleicos que codifican una proteína como es dada en cualquiera de SEQ ID NOs 2, 4, 8, 8, 10, 12 o 35,
(j)
fragmentos funcionales de ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (i) que tienen la actividad biológica de una citoquinina oxidasa, y
(k)
ácidos nucleicos que codifican una citoquinina oxidasa de una planta,
o que comprenden la expresión, preferiblemente en raíces, de un ácido nucleico que codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas.
La invención se relaciona específicamente con el método como se define en la reivindicación anexa 2.
En la presente especificación los ácidos nucleicos que codifican las citoquinina oxidasas novedosas de la Arabidopsis thaliana han sido aisladas y por primera vez, los presentes inventores pueden demostrar sorprendentemente que la expresión de la citoquinina oxidasas en las plantas transgénicas o en partes de plantas transgénicas se tradujeron en las características relacionadas con las raíces antes mencionadas. Preferiblemente, la expresión de la citoquinina oxidasa debería tomar lugar en las raíces, más preferiblemente bajo el control de un promotor especifico de las raíces. Un ejemplo de tal promotor específico de las raíces está dado en la SEQ ID No 36.
Debe quedar claro que, aunque la especificación describe en la sección de ejemplos varios nuevos genes ATCKX y proteínas, la especificación también se relaciona con el uso de otras citoquinina oxidasas aisladas y expresadas en otras plantas, preferiblemente en la raíces de dichas otras plantas con el fin de obtener efectos similares en las plantas como se describe en la sección de ejemplos.
Por lo tanto, la presente especificación se relaciona de manera más general con el uso de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta o codifica una proteína que reduce el nivel de las citoquininas activas en plantas o partes de plantas para estimular el crecimiento de las raíces o para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular. Las citoquininas oxidasas preferidas para ser usadas son codificadas por ácidos nucleicos que codifican la citoquininas oxidasas como se definió anteriormente y son codificadas por los nuevos ácidos nucleicos que se definen más adelante. La especificación divulga un ácido nucleico aislado que codifica una nueva proteína de una planta que tiene actividades citoquinina oxidasa seleccionado del grupo consistente de:
(a)
un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN tal como es dada en cualquiera de SEQ ID Nos 29, 3, 5, 9, 28, 27, 31, 33 o 34, o el complemento de los mismos,
(b)
un ácido nucleico que comprende las secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 28, 27, 31, 33 o 34 o los complementos de los mismos,
(c)
un ácido nucleico que hibridiza específicamente hacia un ácido nucleico como el dado en cualquiera de SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 28, 27, 31, 33 o 34 o los complementos de los mismos,
(d)
un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido como se da en SEQ ID No 32 y el cual es por lo menos similar en un 70%, preferiblemente por lo menos 75%, 80% u 85%, más preferiblemente al menos 90% o 95%, o más preferiblemente al menos 99% similar a la secuencia de aminoácidos como se da en SEQ ID No 4,
(e)
un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 35% similar, preferiblemente 37%, 40%, 45%, 47% o 50%, similar, más preferiblemente 55%, 60%, 65%, 70%, 75% u 80% similar, más preferiblemente 85%, 90% o 95% similar a la secuencia de aminoácidos como se da en SEQ ID No 6,
(f)
un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 35% similar, preferiblemente 37%, 40%, 45%, 47% o 50% similar, más preferiblemente 55%, 60%, 65%, 70%, 75% u 80% similar, lo más preferiblemente 85%, 90% o 95% similar a la secuencia de aminoácidos como se da en la SEQ ID No 10 o 35,
(g)
un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se da en cualquiera de SEQ ID NOs 4, 6, 10, 32, 35,
(h)
un ácido nucleico que es degenerado hacia un ácido nucleico como se da en cualquiera de SEQ ID NOs 29, 3, 9, 26, 27, 33 o 34 o el cual es degenerado hacia un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (g) como resultado del código genético,
(i)
un ácido nucleico que es divergente de un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 4, 6, 10 o 35 o el cual es divergente de un ácido nucleico que está definido en cualquiera de (a) a (g) debido a las diferencias en el uso de codón entre los organismos,
(j)
un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en SEQ ID NOs 4, 6, 10 o 35 o un ácido nucleico como se define en (a) hasta (g) el cual es divergente debido a las diferencias entre alelos.
(k)
un ácido nucleico que codifica un fragmento immunológicamente activo de una citoquinina oxidasa codificado por un ácido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 28, 27, 31, 33 o 34, o un fragmento immunológicamente activo de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (j),
(l)
un ácido nucleico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificado por un ácido nucleico como se da en cualquiera de SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34 o un fragmento funcional de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (j), donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa, y
(m)
un ácido nucleico que codifica una proteína como se define en SEQ ID No 4, 6, 10 o 35,
dado que dicho ácido nucleico no es el ácido nucleico como está depositado bajo ninguno de los siguientes números de accesos Genbank: AC005917, AB024035 y AC023754.
La invención se relaciona específicamente con ácidos nucleicos como se define en la reivindicación anexa 3.
La invención también se relaciona con un ácido nucleico aislado de la invención el cual es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético, o ARN donde T es remplazada por U.
La invención también se relaciona con una molécula de ácido nucleico de por lo menos 15 núcleos en longitud que hibridiza específicamente con o específicamente amplifica un ácido nucleico de la invención.
De acuerdo con otra realización, la invención también se relaciona con un vector que comprende un ácido nucleico de la invención. En una realización preferida, dicho vector es un vector de expresión donde el ácido nucleico está enlazado de manera operativa con una o más secuencias de control que permite la expresión de dicha secuencia en células huésped procarióticas y/o eucarióticas.
Debería entenderse que para la expresión de los genes de citoquinina oxidasa de la invención en monocotiledonias, debería usarse una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia del ADNc para evitar una unión equivocada de intrones en las monocotiledonias. Las secuencias preferidas ADNc para ser expresadas en las monocotiledonias tienen una secuencia de ácido nucleico como la que se representa en cualquiera de SEQ ID NOs 25 a 30 y 34.
La invención también se relaciona con una célula huésped que contiene cualquiera de las moléculas de ácido nucleico o vectores de la invención. Dicha célula huésped es escogida del grupo que comprende células bacterianas, de insectos, fúngicas, vegetales o animales.
Otra realización de la especificación se relaciona con un polipéptido aislado codificable por un ácido nucleico de la especificación, o un homólogo o derivado del mismo, o un fragmento immunológicamente activo o funcional del mismo. Los polipéptidos preferidos de la especificación comprenden las secuencias de aminoácidos tal como están representadas en cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 32 y 35, o un homólogo derivado de las mismas, o un fragmento immunológicamente activo y/o funcional de las mismas. En una realización aún más preferida, la invención se relaciona con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se da en SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 35, o un homólogo o derivado de los mismos, o un fragmento inmunológicamente activo y/o funcional de los mismos. Los fragmentos funcionales preferidos de los mismos son aquellos fragmentos que están desprovistos de su péptido de señal.
La invención específicamente se relaciona con polipéptidos como se define en las reivindicaciones anexas 11
o 12.
De acuerdo con aún otra realización, la invención se relaciona con un método para producir un polipéptido de la invención que comprende cultivar una célula huésped de la invención bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido y recuperar el polipéptido producido a partir del cultivo.
La invención también se relaciona con un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido de la invención o un epítope especifico del mismo.
La invención se relaciona adicionalmente con un método para la producción de plantas transgénicas, plantas vegetales o tejidos de plantas que comprenden la introducción de una molécula de ácido nucleico de la invención en un formato expresable o un vector de la invención en dicha planta, célula vegetal o tejido de planta.
La invención también se relaciona con un método para la producción de plantas, células de plantas o tejidos de plantas alterados, que comprende la introducción de un polipéptido de la invención directamente en una célula, un tejido o un órgano de dicha planta.
De acuerdo con otra realización, la invención se relaciona con un método para efectuar la expresión de un polipéptido de la invención que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico de la invención unidad de manera operativa con una o más secuencias de control o un vector de la invención de manera estable en el genoma de una célula de la planta. La invención se relaciona adicionalmente con el método tal como se describió anteriormente que comprende de manera adicional la regeneración de una planta a partir de dicha célula de planta.
La invención también se relaciona con una célula de planta transgénica que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención la cual es enlazada de manera operativa a elementos reguladores que permiten la transcripción y/o expresión de dicho ácido nucleico en las células de plantas o que son obtenibles por un método como se explicaron anteriormente.
De acuerdo con otra realización preferida, la invención se relaciona con una célula de planta transgénica como se describe aquí más arriba donde el ácido nucleico de la invención es integrado de manera estable en el genoma de dicha célula de planta.
La invención se relaciona además con una planta transgénica o un tejido de planta que comprende células de la planta como se describen aquí también a una parte recolectable de dicha planta transgénica, seleccionada preferiblemente del grupo consistente de semillas, hojas, frutos, cultivos de tallo, raíces, tubérculos, rizomas y bulbos. La invención también se relaciona con la progenia derivada de cualquiera de dichas plantas o partes de planta transgénicas.
De acuerdo con otra realización, la especificación se relaciona con un método para estimular el crecimiento radicular que comprende la expresión de un ácido nucleico de la especificación o que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas.
La invención se relaciona particularmente con tal método como se define en la reivindicación 25.
Una célula de planta o un cultivo de tejidos es un cultivo de células de plantas o de tejidos de plantas producido artificialmente que se hace crecer en un medio especial, bien sea líquido o sólido, el cual proporciona a estas células o tejidos de plantas todos los requerimientos necesarios para el crecimiento y/o producción de ciertos compuestos. Los cultivos de células y/o tejidos de plantas pueden ser utilizados para la propagación rápida de las plantas y para la producción de plantas transgénicas para nombrar unos pocos ejemplos.
La formación de raíces puede ser difícil para algunos esquejes o bajo algunas condiciones en dichos cultivos y la expresión de un gen de citoquinina oxidasa en dichas células o tejidos de plantas cultivadas puede ser utilizada para potenciar la formación de raíces. El cultivo de células y/o tejidos de plantas también puede ser utilizado para la producción industrial de compuestos valiosos. Compuestos de producción posibles son productos farmacéuticos, pesticidas, pigmentos, cosméticos, perfumes, aditivos para alimentos, etc. Un ejemplo de tal producto es la Shikonina, la cual es producida por las raíces de la planta Lithospermum erythrorhizon. Un ejemplo de un cultivo de tejido de planta es el cultivo de una raíz vellosa, el cual es una masa artificialmente producida de raíces vellosas. Las raíces de L arythrorhizon son difíciles de recolectar en grandes cantidades y mediante la preparación de cultivos de raíces vellosas, el producto final Shikonina podría ser preparado industrialmente a una rata más rápida que ocurriría normalmente. Como se describe aquí, la expresión de la citoquinina oxidasa potencia el crecimiento y desarrollo de las raíces y puede por lo tanto ser usado con ventaja en dichos procedimientos de cultivo de células y tejidos de plantas. Por lo tanto, de acuerdo con otra realización de esta especificación, se proporciona un método para estimular el crecimiento y desarrollo de las raíces que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta, preferiblemente una citoquinina oxidasa de la invención, en un cultivo de célula o tejido de una planta transgénica que comprende dichas células de planta transgénica.
La especificación se relaciona adicionalmente con un método para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias que comprende la expresión de un ácido nucleico de la especificación o que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas.
La invención se relaciona específicamente con tal método como se define en la reivindicación 26.
La especificación también se relaciona con un método para alterar el geotropismo radicular que comprende alterar la expresión de un ácido nucleico de la especificación que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas.
La invención se relaciona específicamente con tal método como se define en la reivindicación 27.
La especificación también se relaciona con métodos para potenciar el vigor temprano y/o para modificar la relación raíz/brote y/o para mejorar la resistencia a las plagas y/o para incrementar la tolerancia a la sequía y/o para promover la propagación in vitro de esquejes que comprenden la expresión de un ácido nucleico de la especificación que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas.
La especificación se relaciona adicionalmente con métodos para incrementar el tamaño de las raíces o el tamaño del meristema de las raíces que comprende la expresión de un ácido nucleico de la especificación o comprende la expresión de otra proteína que reduce 
\hbox{el nivel de citoquininas activas en
plantas o en partes de plantas,  preferiblemente en
raíces.}
De acuerdo con aún otra realización, la especificación se relaciona con un método para incrementar el tamaño de un meristema de brote que comprende la regulación en disminución de la expresión de un ácido nucleico de la especificación, preferiblemente en brotes.
De acuerdo con una realización preferida la especificación se relaciona con un método para retardar la senescencia de las hojas que comprende la regulación en disminución de la expresión de cualquiera de la citoquinina oxidasas de la especificación en hojas, preferiblemente en hojas senescentes. También la especificación se relaciona con un método para alterar la senescencia de las hojas que comprende la expresión de una de las citoquinina oxidasas de las hojas senescentes.
La especificación también se relaciona con métodos para incrementar el grosor de las hojas que comprende la expresión de un ácido nucleico de la especificación o comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas, preferiblemente en hojas.
La especificación también se relaciona con un método para reducir el tamaño de los vasos que comprende la expresión de un ácido nucleico de la especificación o comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas, preferiblemente en los vasos.
La especificación se relaciona adicionalmente con un método para incrementar el tamaño de los vasos que comprende la regulación en disminución de la expresión de un ácido nucleico de la especificación en plantas o en partes de plantas.
De acuerdo con otra realización, la especificación se relaciona con un método para mejorar adicionalmente, la invención se relaciona con cualquiera de los métodos anteriormente descritos, llevando dichos métodos a un incremento en el rendimiento.
La invención se relaciona adicionalmente con cualquiera de los métodos de la invención donde dicha expresión de dichos ácidos nucleicos ocurre bajo el control de un promotor constitutivo fuerte. En una realización preferida, la invención se relaciona con cualquiera de los métodos de la invención donde dicha expresión de dicho ácido nucleico ocurre bajo el control de un promotor que es expresado preferiblemente en raíces. En la tabla 5, se incluye una lista no exhaustiva de los promotores de raíces específicos. Un promotor es preferido para ser usado en los métodos de la invención es el promotor homólogo de la raíz de clavata que tiene una secuencia como la que se da en SEQ ID No 38.
De acuerdo con aún otra realización, la especificación se relaciona con un método para modificar el comportamiento de las células y/o el desarrollo de las plantas modificadas y/o modifica la morfología de las plantas y/o modifica la bioquímica de las plantas y/o modifica la fisiología de las plantas y/o modifica la velocidad de progresión del ciclo celular que comprende la modificación de la expresión en células tejidos u órganos particulares de una planta, de un ácido nucleico de la especificación.
La especificación también se relaciona con un método para obtener un crecimiento potenciado, y/o un rendimiento incrementado y/o una senescencia alterada de una célula, tejido y/o órgano de una planta y/o una frecuencia incrementada de la formación de órganos laterales en una planta, que comprende la expresión ectópica de un ácido nucleico de la especificación.
La especificación también se relaciona con un método para promover y extender la actividad de división celular en células en condiciones de crecimiento adversas y/o en estrés, comprendiendo la expresión ectópica de una secuencia de ácido nucleico de la especificación.
De acuerdo con aún otra realización, la especificación se relaciona con un método para identificar y obtener proteínas que interactúan con un polipéptido de la especificación que comprende una prueba de selección donde se usa un polipéptido de la especificación.
En una realización más preferida, la especificación se relaciona con un método para identificar y obtener proteínas que interactúan con un polipéptido de la especificación que comprende una prueba de selección de dos híbridos donde el polipéptido de la especificación actúa como contraparte y se utiliza una biblioteca de ADNc como presa.
La especificación se relaciona adicionalmente con un método para modular la interacción entre un polipéptido de la especificación y proteínas asociadas que interactúan que son obtenibles por un método como se describió anteriormente.
En una realización adicional, la especificación se relaciona con un método para identificar y obtener compuestos que interactúan con un polipéptido de la especificación que comprende las etapas de:
a)
Proveer un sistema de dos híbridos donde un polipéptido de la especificación y una proteína que interactúa asociada es obtenible por un método como el que se describió anteriormente,
b)
hacer interactuar dicho compuesto con el complejo formado por los polipéptidos expresados como se define en a), y,
c)
llevar a cabo (en tiempo real) la medición de la interacción de dicho compuesto con dicho polipéptido o el complejo formado por los polipéptidos expresados como se define en a).
La especificación se relaciona adicionalmente con un método para identificar compuestos o mezclas de compuestos que específicamente se enlazan a un polipéptido de la especificación, que comprende:
a)
Combinar un polipéptido de la especificación con dicho compuesto o mezclas de compuestos bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de complejos, y,
b)
detectar la formación de complejos, donde la presencia de un complejo identifica un compuesto o mezcla que específicamente se enlaza con dicho polipéptido.
La invención se relaciona específicamente con tales métodos como se define en las reivindicaciones anexas 31 a 34.
La especificación también se relaciona con un método como se describe más arriba donde dicho compuesto o mezcla inhibe la actividad de dicho polipéptido y pueden ser utilizados para el diseño racional de productos químicos.
De acuerdo con otra realización, la especificación se relaciona con el uso de un compuesto o mezcla identificados por medio de un método como se describe más arriba tal como un regulador del crecimiento de una planta o
herbicida.
La especificación también se relaciona como un método para la producción de un regulador de crecimiento de una planta o composición de herbicida que comprende las etapas de métodos de selección del compuesto descrito anteriormente y formular los compuestos obtenidos a partir de dichas etapas en una forma adecuada para la aplicación en agricultura o en cultivo de células o tejidos de plantas.
La especificación también se relaciona con un método para incrementar la ramificación que comprende la expresión de un ácido nucleico de la especificación en plantas o partes de plantas, preferiblemente en tallos o ramas axilares.
La invención se relaciona con un método tal como el que se define en la reivindicación 50.
La especificación también se relaciona con un método para mejorar la resistencia a la invasión que comprende la expresión de un ácido nucleico de la especificación en plantas o partes de plantas, preferiblemente en tallos o ramas axilares.
La invención se relaciona con método tal como se define en la reivindicación 51.
La especificación también se relaciona con un método para el diseño de o selección de productos químicos promotores del crecimiento o herbicidas que comprenden el uso de un ácido nucleico en la especificación o en un vector de la especificación.
La invención se relaciona con un método tal como el definido en la reivindicación 34.
De acuerdo con otra realización, la especificación se relaciona con el uso de una molécula de ácido nucleico, un vector o un polipéptido de la especificación para un rendimiento incrementado.
La especificación también se relaciona con el uso de una molécula de ácido nucleico, un vector o un polipéptido de la especificación para estimular el crecimiento de las raíces.
La especificación también se relaciona con el uso de una molécula de ácido nucleico, un vector o un polipéptido de la especificación para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias.
La especificación también se relaciona con el uso de una molécula de ácido nucleico, un vector o un polipéptido de la especificación para alterar el geotropismo de las raíces.
La invención se relaciona específicamente con usos tales como los definidos en las reivindicaciones anexas 35 a 38.
La especificación se relaciona adicionalmente con el uso de una molécula de ácido nucleico, un vector o un polipéptido de la especificación para potenciar el vigor temprano y/o para modificar la relación raíz/brote y/o para mejorar la resistencia a la invasión y/o para incrementar la tolerancia a la sequía y/o para promover la propagación in vitro de esquejes.
La especificación también se relaciona con el uso de una molécula de ácido nucleico, un vector recombinante o un polipéptido de la especificación para modificar el desarrollo de las plantas y/o para modificar la morfología de las plantas y/o para modificar la bioquímica de las plantas y/o para modificar la fisiología de las plantas.
De acuerdo con aún otra realización, la especificación se relaciona con una composición de diagnostico que comprende por lo menos una molécula de ácido nucleico, un vector, un polipéptido o un anticuerpo de la especificación.
La invención se relaciona específicamente con tales composiciones de diagnostico como se define en la reivindicación anexa 39.
Otra realización de la presente especificación se relaciona con el uso de una reserva de raíces transgénicas que tiene un crecimiento radicular potenciado y un desarrollo también potenciado debido a la expresión de una citoquinina oxidasa en procedimientos de injerto con un sción para producir una planta o árbol con características agrícolas u hortícolas mejoradas. El scion puede ser transgénico o no transgénico. Las características especificas previstas por esta realización son las conferidas por los sistemas radiculares e incluyen un anclaje mejorado de la planta/árbol en el suelo y/o un consumo mejorado del agua resultante por ejemplo en la tolerancia mejorada a la sequedad, y/o un consumo mejorado de los nutrientes del suelo y/o un transporte mejorado de las sustancias orgánicas a través de la planta y/o una secreción mejorada de sustancias hacia el suelo tales como por ejemplo los fitosideróforos, y/o una respiración mejorada y/o una resistencia mejorada a las enfermedades y/o un rendimiento mejorado. Una ventaja de utilizar reservas de raíz transformadas AtCKX para el injerto, además de su sistema radicular potenciado, es la senescencia retardada de las hojas en el injerto, como se describe aquí (véase figura 12 A). Las plantas o árboles preferidos para esta realización particular incluyen plantas o árboles que no crecen bien sobre sus propias raíces y que son injertadas en disposiciones cultivadas tales como las variedades comercialmente explotables de vides, cítricos, albaricoques, almendras, ciruelas, melocotones, manzana, peras, cerezas, nueces, higos, avellano y níspero del
japón.
Como se mencionó supra, las auxinas y citoquininas actúan como antagonistas en ciertos procesos biológicos. Por ejemplo, la relación citoquinina/auxina regula la producción de raíces y brotes con una alta concentración de auxina lo que se traduce en la producción de brotes. Como se describe en esta invención, la expresión de las citoquinina oxidasas en el tabaco y en Arabidopsis resulta en un desarrollo potenciado de las raíces consistente con los efectos potenciados de la auxina. Las auxinas también están involucradas en el desarrollo de los frutos. El tratamiento de las partes femeninas de las flores con auxina se traduce en el desarrollo de frutas partenocárpicas en algunas especies vegetales. El desarrollo de las frutas partenocárpicas ha sido desarrollado por ingeniería genética en diversas plantas de cultivo hortícola a través de biosíntesis incrementada de auxinas en los órganos reproductores femeninos (WO 0105985).
Por lo tanto, de acuerdo con otra realización, esta especificación se relaciona con un método para introducir el tratamiento partenocárpico en plantas, consistiendo dicho método en disminución de la expresión de una o más citoquinina oxidasas o de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas, preferiblemente en los órganos reproductores femeninos tales como la placenta, óvulos y tejidos derivados de la misma. La región promotora de DefH9 de la Antirrhinum majus o uno de sus homólogos, la cual confiere alta especificidad en la expresión en placenta y óvulos, puede ser utilizada para este propósito.
Definiciones y elaboraciones de las realizaciones
Los expertos en la técnica estarán al tanto de que la invención descrita aquí esta sujeta a variaciones y modificaciones diferentes a las descritas específicamente. Debe entenderse que la invención descrita aquí incluye todas tales variaciones y modificaciones.
La presente invención es aplicable a cualquier planta en particular a plantas monocotiledonias y dicotiledonias incluyendo legumbres de alimentación o forraje, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles, o malezas seleccionadas de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astalia fragrans, Astragalus cicer, Balklaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp.,Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp; Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenome/e s spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermun mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumls spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodlum spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochioa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeumvulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo Incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Laudetia simplex,. Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medlcago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp. Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárrago, brócoli, repollitas de Bruselas, repollo, canola, zanahoria, coliflor, apio, variedades de col, greens, linaza, berza común, lentejas, uvas, ocra, cebolla, patata, arroz, soja, paja de cereales, remolacha de azúcar, caña de azúcar, girasol, tomates, calabacín, y té, entre otros, o las semillas de cualquier planta específicamente nombrada antes, o un cultivo de tejido, célula u órgano de cualquiera de las especies anteriores.
A lo largo de esta especificación, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprenden" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" será entendida para implicar la inclusión de un entero establecido o etapas o grupos de enteros pero no exclusión de ningún otro entero o etapa o grupo de enteros o etapas.
Según se usa aquí, el término "derivado de" será tomado para indicar que un entero o grupo de enteros en particular ha sido originado de las especies especificadas, pero no necesariamente ha sido obtenido directamente de la fuente especificada.
Los términos "proteína (s)", "péptido (s)" u "oligopéptido (s)", cuando se usan aquí se refieren a aminoácidos en una forma polimérica de cualquier longitud. Tales términos incluyen también modificaciones conocidas de aminoácidos tales como formación de puentes disulfuro, cisteinilación, oxidación, glutationilación, metilación, acetilación, famesilación, biotinalación, estearoilación, formilación, adición de ácido lipoico, fosforilación, sulfación, ubiquitinación, miristoilación, palmitoilación, geranilación, siclización (por ejemplo formación de ácido piroglutámico) oxidación, desamidación, deshidratación, glicocilación (por ejemplo pentosas, hexosaminas, N-acetil hexosaminas, dexoihexosas, hexosas, ácido siálico, etc.) y acilacion así como residuos de aminoácidos de origen no natural, residuos de L-aminoácidos y residuos de D-aminoácidos.
"Homólogos" de una proteína de la invención son aquellos péptidos, oligopéptidos como polipéptidos, proteínas y enzimas que contienen sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de aminoácidos con respecto a dicha proteína con respecto a la cual son homólogos, sin alterar una o más de sus propiedades funcionales, en particular sin reducir la actividad del resultante. Por ejemplo, un homólogo de dicha proteína consistirá de una variante de secuencia de aminoácidos bioactivos de dicha proteína. Para producir tales homólogos, los aminoácidos presentes en la dicha proteína pueden ser remplazados por otros aminoácidos que tienen propiedades similares, por ejemplo hidrofobicidad, hidrofilicidad, momento hidrofóbico, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras \alpha helicoidales o de \beta-deflexión, y así sucesivamente. Una revisión de las propiedades físicas y químicas de los aminoácidos se da en la Tabla 1.
Las variaciones sustitucionales de una proteína de la invención son aquellas en las cuales por lo menos un residuo de dicha secuencia de aminoácidos de la proteína ha sido eliminado y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero también pueden ser aglomerados dependiendo de las restricciones funcionales colocadas sobre el polipéptido; las inserciones serán usualmente del orden de aproximadamente 1-10 residuos de aminoácidos, las eliminaciones variarán desde aproximadamente 1-20 residuos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos comprenderán sustituciones de aminoácidos conservativos, tales como los descritos supra.
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TABLA 1 Propiedades de aminoácidos de origen natural
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Las variantes de secuencias de aminoácidos insertables de una proteína de la invención son aquellas en las cuales uno o más residuos de aminoácidos son introducidos en sitios predeterminados en dicha proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones aminoterminales y/o fusiones carboxi terminales así como inserciones intrasecuencia de aminoácidos individuales o múltiples. En general, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán menores que las fusiones de terminales amono o carboxilo, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas o péptidos de fusión de terminal amino o carboxi incluyen el dominio de enlace o el dominio de activación de un activador transcripcional como el que se usa en un sistema de dos híbridos, proteínas para recubrimiento de fagos, (histidina)_{6}- tag, glutationa S-transferasa, proteína A, proteína enlazante de la maltosa, dihidrofolato reductasa, Tage*100 epítope (EETARFQPGYRS), epítope c-myc (EQKLISEEDL), epítopo FLAG® (DYKDDDK) LacZ, CMP (péptido enlazante de la calmodulina), epítopo HA (YPY-DVPDYA), epítope de la proteína C (EDQVDPRLIDGK) y epítopo VSV (YTDIMNRLGK).
Las variaciones de eliminación de una proteína de la invención están caracterizadas por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de dicha proteína.
Las variantes de aminoácido de la proteína de la invención pueden hacerse fácilmente utilizando técnicas de síntesis de péptidos bien conocidas en el arte, tales como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por manipulaciones de ADN recombinante. La manipulación de las secuencias de ADN para producir proteínas variantes se manifestarán como variantes sustitucionales insercionales o de eliminación bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en secuencias conocidas que tienen ADN son bien conocidas para los expertos en la técnica, tales como la mutagénesis por M13, la mutagénesis por T7- gen in vitro como un sistema (USB, Cleveland, OH), el juego de mutagénesis, QuickChange Site Directed (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida a un sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigidas a un
sitio.
En la presente invención los porcentajes de "identidad" y/o "similitud" entre secuencias de ADN y/o proteínas se calculan utilizando programas de ordenador conocidos en la técnica tales como los programas DNAstar/MegAlign en combinación con el método Clustal.
"Los Derivados" de una proteína de la invención son aquellos péptidos, oligopétidos, polipétidos, proteínas y enzimas que comprenden por lo menos cinco residuos de aminoácidos contiguos de dicho polipétido pero que retienen la actividad biológica de dicha proteína. Un "derivado" puede comprender adicionalmente residuos de aminoácidos de origen natural, alterados por glicosilación, acilación o que no son de origen natural en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma presente en la naturaleza de dicho polipéptido. Alternativamente o adicionalmente, un derivado puede comprender uno o más sustituyentes ajenos a aminoácidos comparados con la secuencia de aminoácidos de una forma natural de dicho polipétido, por ejemplo una molécula mensajera u otro ligando, enlazada covalente o no covalentemente a la secuencia de aminoácidos tal como por ejemplo una molécula mensajera que está enlazada al mismo para facilitar su detección.
Con "inmunológicamente activo" se da a entender que una molécula o un fragmento específico de la misma tal como un epítope específico o un hapteno específico son reconocidos, por ejemplo, por enlazarse a los anticuerpos. Epítopes específicos pueden determinarse utilizando, por ejemplo, técnicas de barrido de péptidos como se describe en Geysen et al. (1996) (Geysen, H.M., Rodda, S.J. and Mason, T.J. (1986). A priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant. Mol. Immunol. 23, 709-715).
El término "fragmento de una secuencia" o "parte de una secuencia" significa una secuencia truncada de la secuencia original referida. La secuencia truncada (ácido nucleico o secuencia de proteínas) puede variar ampliamente en longitud. El tamaño mínimo de una secuencia para que tenga suficiente tamaño como para proveer una secuencia con por lo menos una función y/o actividad comparable a la secuencia original referida (por ejemplo "fragmento funcional"), mientras que el tamaño máximo no es crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo usualmente no es sustancialmente mayor que el requerido para proporcionar la actividad y/o función deseada de la secuencia
original.
Típicamente, la secuencia de aminoácido truncada variará desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60 aminoácidos de longitud. Más típicamente, sin embargo, la secuencia tendrá un máximo de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, preferiblemente un máximo de aproximadamente 60 aminoácidos. En general es deseable seleccionar secuencias de por lo menos 10, 12 o 15 aminoácidos hasta un máximo de aproximadamente 20 o 25 aminoácidos.
Los fragmentos funcionales también pueden incluir los que comprenden un epítope que es específico para las proteínas de acuerdo a la invención. Los fragmentos funcionales preferidos tienen una longitud de por lo menos, por ejemplo, 5, 10, 25, 100, 150 0 200 aminoácidos.
Debe entenderse por lo tanto que los fragmentos funcionales pueden ser fragmentos inmunológicamente activos o no.
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En el contexto de la presente especificación se incorporan homólogos derivados y/o fragmentos inmunológicamente y/o funcionalmente activos de las citoquinina oxidasas como se definió supra. Homólogos, derivados y/o fragmentos inmunológicamente y/o funcionalmente activos particularmente preferidos de las citoquinina oxidasas que se contemplan para su uso en la presente especificación son derivados de plantas, más específicamente de Arabidopsis thaliana, aún más específicamente dichas citoquinina oxidasas son la Arabidopsis thaliana (At)CKX, o son capaces de ser expresados en las mismas. La presente especificación contempla claramente el uso de homólogos o derivados funcionales y/o de fragmentos inmunológicamente activos de las proteínas AtCKX y no se limita en aplicación al uso de la secuencia de nucleótidos que codifica una de dichas proteínas AtCKX.
Cualquiera de dichas proteínas, polipéptidos, péptidos y fragmentos de las mismas pueden ser producidos en un sistema biológico, por ejemplo un cultivo celular. Alternativamente, cualquiera de dichas proteínas, polipéptidos, péptidos y fragmentos de los mismos pueden ser manufacturados químicamente, por ejemplo, por síntesis de péptidos en fase sólida. Dichas proteínas o fragmentos de las mismas pueden ser parte de una proteína de fusión como es en el caso de por ejemplo, una prueba de dos híbridos que permite, por ejemplo, la identificación de proteínas que interactúan con una citoquinina oxidasa de acuerdo con la invención.
Las proteínas o fragmentos de las mismas son útiles adicionalmente por ejemplo, para modular la interacción entre una citoquinina oxidasa de acuerdo con la invención y asociados proteínicos que interactúan mediante un método de la invención. Los péptidos sintetizados químicamente son particularmente útiles, por ejemplo, como fuente de antígenos para la producción de antisueros y/o anticuerpos.
"Anticuerpos" incluyen anticuerpos monoclonales, policlonales, sintéticos o de cadena pesada así como fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fv o scFv. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados por las técnicas que se describen por ejemplo, en Liddle y Cryer (1991) que comprende la fusión de células de mieloma de ratón en células de bazo derivadas de animales inmunizados. Adicionalmente los anticuerpos o fragmentos de los mismos para una molécula o fragmentos de los mismos pueden ser útiles obtenidos utilizando métodos como los descritos en por ejemplo Harlow and Lane (1988). En el caso de anticuerpos dirigidos contra péptidos pequeños tales como fragmentos de una proteína de la invención, tales péptidos están generalmente acoplados a una proteína portadora antes de la inmunización de los animales. Tales proteínas portadoras incluyen hemocianina de cerradura magnética (KLH), albúmina de suero bovino, (BSA), ovoalbúmina y toxoides de tétano. La proteína portadora potencia la respuesta inmune en el animal y proporciona epítopes para los sitios de enlace del receptor de las células T. El término "anticuerpos" incluye adicionalmente derivados de los mismos tales como anticuerpos marcados. Marcadores de anticuerpos incluyen fosfatasa alcalina, PKH2, PKH26, PKH67, fluoresceína (FITC), Hoechst 33258, R-fiocoeritrina (PE), rodamina (TRITC), Rojo Quantum, Rojo Texas, Cy3, biotina, agarosa, peroxidasa y esferas de oro. Las herramientas en la biología molecular que se basan en anticuerpos contra una proteína incluyen análisis por gel, selección de la expresión por bibliotecas que permiten la identificación de genes, métodos cuantitativos para proteínas incluyendo ELISA y RIA, purificación de proteínas por inmunoafinidad, inmunoprecipitación de proteínas (véase por ejemplo el ejemplo 6) e inmunolocalización.
Otros usos de anticuerpos y especialmente de anticuerpos peptídicos incluyen el estudio del procesamiento proteolítico (Loffler et al. 1994, Woulfe et al. 1994), la determinación de sitios activos en las proteínas (Lerner 1982), el estudio de posicionamiento translacional y precursores (Baron and Baltimore 1982, Lerner et al. 1981), identificación de dominios de proteínas involucrados en la interacción proteína-proteína (Murakami et al. 1992) y el estudio del uso de exon en la expresión genética (Tamura et al. 1991).
Incorporados en la siguiente especificación están los anticuerpos que específicamente reconocen una citoquinina oxidasa o un homólogo, derivados o fragmentos de los mismos como se definió supra. Dicha citoquinina oxidasa preferiblemente es una citoquinina oxidasa de una planta, más específicamente una de la citoquinina oxidasas de la Arabidopsis thaliana (ATCKX).
Los términos "gene o (s)", "polinucleótidos (s)", "ácido nucleico (s)", "secuencia de ácido nucleico (s)", "secuencia de nucleótido (s)" o "molécula de ácido nucleico (s)", cuando se usan aquí se refieren a nucleótidos, bien sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o combinaciones de ambos, en una forma polimérica de cualquier longitud. Dichos términos incluyen adicionalmente ADN y ARN de cadena doble y cadena sencilla. Dichos términos también incluyen modificaciones a nucleótidos conocidas tales como metilación, ciclización y "tapones", y sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo tal como inosina. Las modificaciones de nucleótidos incluyen la adición de acridina, amina, biotina, azul cascada, colesterol, CY3®, CY5®, CY5.5®, Dabicil, digoxigenina, dinitrofenilo, Edans, 6-FAM, fluoreceina, 3'-glicerilo, HEX, IRD-700, IRD-800, JOE, fosfato psoraleno, rodamina, ROX, tiol (SH), espaciadores, tamra, TET, AMCA-S®, SE, BODIPY®, Marina Blue®, Pacific Blue®, Oregon Green®, Rhodamine Green®, Rhodamine Red®, Rhodol Green® y Texas Red®. Las modificaciones en el esqueleto de los polinucleótidos incluyen metilfosfonato, 2'-OMe-metilfosfonato ARN, fosforotiorata, ARN, 2'-OMeARN. Las modificaciones de base incluyen 2-amino-dA, 2-aminopurina, 3'-(ddA), 3'dA-(cordicepina), 7-deaza-dA, 8-Br-dA, 8-oxo-dA, n^{8}-Me-dA, un sitio abásico (despaciador) biotina dT, 2'-OMe-5Me-C, 2'-OMe-propinil-C, 3'-(5-Me-dC), 3'-(ddC), 5-Br-dC, 5-1dC, 5-Me-dC, 5-F-dC, carboxi-dT, dA convertible, dC convertible, dG convertible, dT convertible, dU convertible, 7-deaza-dG, 8-Br-dG, 8-oxo-dG, O^{6}-Me-Dg, S6-DNP-dG, 4-metil-indol, 5-nitroindol, 2'-OMe-inocina, 2'-dL, 0^{6}-fenil-dL, 4-metil-indol, 2'-desoxinebularina, 5-nitroiridol, 2-aminopurina, dP(análogo de la purina), dK(análogo de la pirimidina), 3-nitropirrol, 2-tio-dT, 4-tio-dT, biotina-dT, carboxi-dT,O^{4}-Me-dT, O^{4}-triasol dT, 2'-OMe-propinil-U, 5-Br-dU, 2'-dU, 5'-F-dU, 5-I-dU, O^{4}-triasol-dU. Dichos términos también abarcan ácidos nucleicos péptídicos (PNA), un análogo de ADN en el cual el esqueleto es un seudopéptido que consiste de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina en vez de un azúcar. Los PNA imitan el comportamiento del ADN y se enlazan de manera complementaria a las cadenas de ácidos nucleicos. El esqueleto neutro de los PNA resulta en un enlazamiento más fuerte y en una especificidad mayor que la alcanzada normalmente. Además, las propiedades químicas, físicas y biológicas únicas de los PNA han sido explotadas para producir herramientas biomoleculares poderosas, agentes antisentido y antígenos, sondas moleculares y biosensores.
La presente invención también provee ventajosamente secuencias de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de un ácido nucleico de acuerdo con la invención y preferiblemente de 15 a 50 nucleótidos. Estas secuencias pueden, de manera ventajosa, ser usadas como sondas para hídridizar específicamente en secuencias de la invención como se define más arriba o en iniciadores para iniciar la amplificación o replicación especifica de secuencias de la invención como se define más arriba, o similares. Tales secuencias de ácidos nucleicos pueden ser producidas de acuerdo con técnicas bien conocidas en el arte, tales como por medio recombinantes o sintéticos. También pueden ser usadas en conjuntos de diagnóstico o similares para detectar la presencia de un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Estas pruebas en general comprenden poner en contacto la sonda con la muestra bajo condiciones de híbridización y detectar la presencia de cualquier formación de duplex o triplex entre la sonda y cualquier ácido nucleico en la muestra.
De manera ventajosa, las secuencias de ácido nucleico, de acuerdo con la invención, pueden ser producidas utilizando medios tales como recombinación o síntesis, tales como por ejemplo utilizando mecanismos de clonación por PCR los cuales generalmente involucran realizar un par de cebadores, los cuales pueden ser aproximadamente de 15 a 50 nucleótidos en una región del gen que se desea clonar, poniendo los cebadores en contacto con el ARNm, ADNc o ADN genómico de una célula, llevando a cabo una reacción en cadena de polimeras bajo condiciones que producen la amplificación de la región deseada, aislando la región amplificada o su fragmento y recuperando el ADN amplificado. En general, tales técnicas tal como se definen aquí son bien conocidas en el arte, tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989).
Una "secuencia de codificación" o "marco de lectura abierto" u "ORF" se define como una secuencia de nucleótidos que puede ser transcrita en ARNm y/o traducida en un polipéptido cuando se coloca bajo control de secuencias de control apropiadas o secuencias reguladoras, esto es, cuando dicha secuencia de codificación u ORF está presente en un formato que se puede expresar. Dicha secuencia de codificación de ORF está enlazada por un codón de inicio de traducción 5' y un codón de detención de traducción 3'. Una secuencia de codificación u ORF puede incluir, pero no se limita a ARN, ARNm, ADNc, secuencias de nucleótidos recombinantes, secuencias de nucleótidos manufacturada sintéticamente o ADN genómico. Dicha secuencia de codificación u ORF puede ser interrumpida mediante la intervención de secuencias de ácidos nucleicos.
Los genes y secuencias de codificación que codifican esencialmente la misma proteína pero se aíslan de diferentes fuentes pueden consistir de secuencias de ácidos nucleicos divergentes sustancialmente. De manera recíproca, las secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente divergentes pueden ser diseñadas para efectuar la expresión de esencialmente la misma proteína. Dichas secuencias de ácidos nucleicos son el resultado de, por ejemplo, la existencia de diferentes alelos de un gen dado, de la degeneración del código genético o de diferencias en el uso de codones. Así, como se indica en la Tabla 2, los aminoácidos tales como la metionina y el triptófano son codificados por un codón individual mientras que otros aminoácidos tales como la arginina, leucina y serina pueden ser traducidos a partir de 6 codones diferentes. Las diferencias entre el uso de codón preferido se ilustran en la Tabla 3 para Agrobacterium tumefaciens (una bacteria), A. thaliana, M. sativa (2 plantas dicotiledoneas) y Oryza sativa (una planta monocotiledonia). Para extraer un ejemplo, el codón GGC (para la glicina) es el codón más frecuentemente usado en A. tumefaciens (36.2 por 1000), es el segundo más frecuentemente utilizado en O. sativa pero se usa con frecuencia muchísimo menor en A. thaliana y M. sativa (9\textperthousand y 8.4\textperthousand respectivamente). De los 4 codones posibles que codifican la glicina (véase Tabla 2), dicho codón GGC se usa más preferiblemente en A. tumefaciens y O. sativa. Sin embargo, A. thaliana este es el codón GGA (y GGU) mientras que en M. sativa este es el codón GGU
(y GGA).
La secuencias de ADN como se define en la presente invención pueden ser interrumpidas por secuencias de intervención. Con "secuencias de intervención" se entiende cualquier secuencia de ácidos nucleicos que interrumpa una secuencia de codificación comprendiendo dicha secuencia de ADN de la invención o que interrumpe el formato que se puede expresar de una secuencia de ADN que comprende dicha secuencia de ADN de la invención. La eliminación de la secuencia de intervención restaura dicha secuencia de codificación o dicho formato que se puede expresar. Ejemplos de secuencias de intervención incluyen intrones y secuencias de ADN movilizables tales como transposones. Con "secuencia de ADN movilizable" se entiende cualquier secuencia de ADN que pueda ser movilizada como resultado de un evento de recombinación.
TABLA 2 Degeneración del código genético
2
TABLA 3 Uso de codones indicados en los diferentes organismos dados como frecuencia por cada 1000 codones (http://www.kazusa.or.ip/codon)
3
5 
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"Hibridización" es el proceso donde secuencias de nucleótidos complementariamente homólogas de manera sustancial se fusionan una con otra. El proceso de hibridización ocurre completamente en solución, esto es los ácidos nucleicos complementarios están en solución. Las herramientas en la biología molecular que se basan en tal proceso incluyen PCR, hibridización sustractiva y determinación de la secuencia de ADN. El proceso de hibridización puede ocurrir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en una matriz tal como perlas magnéticas, perlas de Shepharose o cualquier otra resina. Las herramientas en biología molecular que se basan en tal proceso incluyen el aislamiento de ARNm poli (A+). El proceso de hibridización puede ocurrir además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido tal como nitrocelulosa o membrana de naylon o inmovilizado por ejemplo mediante fotolitografía en un soporte por ejemplo vidrio silíceo (conocido este último como disposiciones o microdisposiciones de ácidos nucleicos o como chips de ácidos nucleicos). Las herramientas en biología molecular que se basan en tal proceso incluyen el análisis de separación por gel de ARN y ADN, hibridización por colonia, hibridización en placa e hibridización por microdisposición. Con el fin de permitir que ocurra la hibridización, las moléculas de ácido nucleico son desnaturalizadas en general de manera térmica o química (por ejemplo mediante NaOH) para fusionar una doble cadena en dos cadenas individuales y/o para remover cortes u otras estructuras secundarias a partir de ácidos nucleicos de cadena individual. La restricción de la hibridización es influenciada por condiciones tales como la temperatura, concentración de sal y composición reguladora de hibridización. Condiciones de alta restricción para la hibridización incluyen alta temperatura y/o bajas concentraciones de sal (las sales incluyen NaCl y Na3-citrato) y/o la inclusión de formamida en el regulador de hibridización y/o la disminución de la concentración de compuestos tales como SDS (detergentes) en el regulador de hibridización y/o la exclusión de compuestos tales como sulfato de dextrano o polietilen glicol (que promueven la aglomeración molecular) del regulador de hibridización. Las condiciones convencionales de hibridización se describen en por ejemplo, Sambrook et al. (1989) pero la persona experimentada en la técnica entenderá que pueden diseñarse numerosas condiciones diferentes de hibridización en función de la homología conocida o esperada y/o de la longitud de la secuencia del ácido nucleico. De manera suficiente las condiciones de hibridización de baja restricción son particularmente preferidas para aislar ácidos nucleicos heterólogos a las secuencias de ADN de la invención definida supra. Los elementos que contribuyen a dicha heterología incluyen alelismo, degeneración del código genético y diferencias en el uso de codón preferido como se discutió más arriba.
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Claramente, la presente especificación incorpora el uso de secuencias de ADN que codifican una citoquinina oxidasa, homóloga, derivada de fragmentos inmunológicamente activos y/o funcionales de la misma como se define más arriba en cualquier método de hibridización. La presente especificación adicionalmente se relaciona con secuencias de ADN que hibridizan a dichas secuencias de ADN. Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa de plantas, más específicamente la Arabidopsis thaliana (At) CKX.
Para efectuar la expresión de una proteína en una célula, tejido u órgano, preferiblemente de origen vegetal, la proteína puede ser introducida directamente en dicha célula, por ejemplo por microinyección o por medios balísticos o alternativamente, una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína puede ser introducida en dicha célula, tejido u órgano en un formato que se pueda expresar.
Preferiblemente, la secuencia de ADN comprende una secuencia codificante o un marco de lectura abierto (ORF) que codifica una proteína de citoquinina oxidasa o un homólogo derivado de la misma o fragmentos inmunológica y/o funcionalmente activos de la misma como se definió supra.
La proteína preferida de la especificación comprende la secuencia de aminoácidos de dicha citoquinina oxidasa. Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa de planta y más específicamente una Arbabidopsis thaliana (At)CKX.
Con "vector" o "secuencia vectora" se refiere a una secuencia de ADN que puede ser introducida en un organismo por transformación y que puede ser mantenida de manera estable en dicho organismo. El mantenimiento de un vector es posible por ejemplo en cultivos de Escherichia coli, A. tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe. Otros vectores tales como fagémidos y vectores cósmidos pueden ser mantenidos y multiplicados en bacterias y/o virus. Las secuencias de vectores generalmente comprenden un conjunto de sitios únicos reconocidos por enzimas de restricción, en sitios de clonación múltiple (MCS) donde una o más secuencias no vectoras pueden ser
insertadas.
Con "secuencia no vectora" concordantemente se hace referencia a una secuencia de ADN que está integrada en uno o más de los sitios del MCS comprendido dentro de un vector.
"Vectores de expresión" forman un subconjunto de vectores los cuales, en virtud de comprender las secuencias reguladoras o de control apropiadas habilitan la creación de un formato que se puede expresar para la inserción de secuencias no vectoras permitiendo así la expresión de la proteína codificada por dichas secuencias no vectoras. Los vectores de expresión son conocidos en la técnica porque habilitan la expresión de las proteínas en organismos que incluyen bacterias (por ejemplo E. coli), hongos (por ejemplo S. cerevislae, S. pombe, Pichia pastoris), células de insectos (por ejemplo vectores de expresión báculoviral), células animales (por ejemplo células COS o CHO) y células vegetales (por ejemplo vectores de expresión basados en el virus X de la patata).
La presente especificación incluye claramente cualquier citoquinina oxidasa, homólogo, derivado y/o fragmento inmunológicamente activo y/o funcional de la misma como se definió supra. Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa de planta más, más específicamente una Arabidopsis thaliana (At)CKX.
Como una alternativa a la producción de proteínas mediada por el vector de expresión en sistemas biológicos, la síntesis química de proteínas puede aplicarse también. Los péptidos sintéticos pueden ser manufacturados en fase de solución o en fase sólida. La síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield 1963) es sin embargo la manera más común e involucra la adición secuencial de aminoácidos para crear una cadena de péptidos lineal. La síntesis de péptidos en fase sólida incluye ciclos consistentes de tres etapas: (i) inmovilización del aminoácido carboxi terminal de la cadena creciente de péptidos a un soporte o resina sólidos; (ii) ensamblaje de la cadena, un proceso que consiste de activación, acoplamiento y desprotección del aminoácido que se va a añadir a la cadena de péptido en crecimiento; y (iii) ruptura involucrando la remoción de la cadena peptídica completa a partir de la resina y remoción de los grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos. Las modalidades comunes en la síntesis de péptidos en fase sólida incluyen Fmoc/tBu (9-fluorenilmetiloxicarbonil/t-butil) y Boc (t-butiloxicarbonilo) como los grupos protectores de las aminoácidos terminales de la cadena lateral de aminoácidos con grupos que incluyen metilo (Me), Formilo (CHO), etilo (Et), acetilo (Ac), t-butilo (t-Bu), anisilo, bencilo (Bzl), trifluoroacetilo (Tfa), N-hidoxisuccinimida (ONSu, Osu), benzoilo (Bz), 4- metilbencilo (Meb), tioanicilo, tiopercilo, bencil oximetilo (Bom), 4-nitrofenilo (ONp), benciloxicarbonilo (Z), 2-nitrobenciloxi (NBz), 2-nitrofenilsulfenilo (Nps), 4-toluenosulfonilo (Tosilo, Tos), pentafluorofenilo (Pfp), difenilmetilo (Dpm), 2-chlorobenciloxicarbonilo (Cl-Z), 2,4,5-triclorofenilo, 2-bromobenciloxicarbonilo (Br-Z), trifenilmetilo (Tritilo, Trt), y 2,5,7,8-pentametil-croman-6-sulfonilo (Pmc). Durante el ensamblaje de la cadena, el Fmoc o el Boc son eliminados resultando en un extremo amino activado del residuo de aminoácidos enlazado a la cadena en crecimiento. El extremo carboxi del aminoácido entrante es activado por conversión en un éster altamente reactivo, como por ejemplo, mediante HBTU. Con tecnologías normales, (por ejemplo el sintetizador PerSeptive Biosystems 9050, Applied Biosystems Modelo 431A Sintetizador de Péptidos), puede manufacturarse péptidos lineales de hasta 50 residuos. Está disponible un cierto numero de guías para producir péptidos que son adecuados para su uso en sistemas biológicos incluyendo (i) limitar el uso de aminoácidos difíciles tales como cys, met, trp (fácilmente oxidados y/o degradados durante la síntesis de péptidos) o arg; (ii) minimizar los aminoácidos hidrófobos (pueden impedir la solubilidad de los péptidos); y (iii) evitar un ácido glutámico terminal en amino (puede ciclizarse a
piroglutamato).
Por "formato que se puede expresar" se entiende que la molécula de ácido nucleico aislada está en una forma adecuada para ser transcrita en ARNm y/o traducida para producir una proteína, bien de manera constitutiva o siguiendo inducción mediante una señal intracelular o extracelular, tal como un estímulo ambiental o de estrés (mitógenos, anoxia, hipoxia, temperatura, sal, luz, deshidratación, etc.) o un compuesto químico tal como IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido) tal como un antibiótico (tetraciclina, ampicilina, rifampicina, kanamicina) una hormona (por ejemplo giberelina, auxina, citoquinina, glucocorticoides, brasinosteroide, etileno, ácido abscísico, etc.), un análogo de una hormona (ácido indolacético (IAA) 2,4-D, etc.), un metal (zinc, cobre, hierro, etc.) o dexametasona, entre otros. Como será evidente para aquellos expertos en la técnica, la expresión de una proteína funcional puede también requerir una o más modificaciones post-translacionales, tales como glicosilación, fosforilación, desfosforilación, o una o más interacciones proteína-proteína, entre otras. Todos estos procesos están incluidos dentro del alcance del término "formato que se puede expresar".
Preferiblemente, la expresión de una proteína en una célula, tejido u órgano específico, preferiblemente de origen vegetal se efectúa introduciendo y expresando una molécula de ácido nucleico aislada que codifica dicha proteína, tal como una molécula de ADNc, un gen genómico, una molécula de oligonucleótido sintética, una molécula de ARNm o un marco de lectura abierto, a dicha célula, tejido u órgano, donde dicha molécula de ácido nucleico se coloca de manera operativa en conexión con secuencias reguladoras o de control adecuadas que incluyen un promotor, preferiblemente un promotor que se puede expresar en una planta y una secuencia de terminación.
Las referencias aquí a un "promotor" deben tomarse en su contexto más amplio e incluyen las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariótico clásico, incluyendo la caja TATA la cual se requiere para una iniciación de la transcripción exacta, con o sin una secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores o de control adicionales (esto es, secuencias activadoras corriente arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión genética en respuesta a estímulos de desarrollo y/o externos, o en una forma específica para un
tejido.
El término "promotor" también incluye las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen procariótico clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10.
El término "promotor" también se utiliza para describir una molécula sintética o de fusión, o derivados que confieren, activan o potencian la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.
Los promotores pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos, para potenciar adicionalmente la expresión y/o para alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de una molécula de ácido nucleico a la cual se conecta de manera operativa. Tales elementos reguladores pueden ser colocados adyacentes a una secuencia promotora heteróloga para conducir la expresión de la molécula de ácido nucleico en respuesta a, por ejemplo, cobre, glucocorticoides, dexametasona, tetraciclina, giberelina, AMPc, ácido abscísico, auxina, heridas, etileno, jasmonato o ácido salicílico o para conferir la expresión de una molécula de ácido nucleico a células, tejidos y órganos específicos tales como meristemas, hojas, raíces, embriones, flores, semillas o
frutos.
En el contexto de la presente invención, el promotor preferiblemente es una secuencia promotora que se puede expresar en una planta. Los promotores que también funcionan o funcionan unicamente en células que no provienen de plantas tales como bacterias, células de levadura, células de insectos y células animales no están excluidas de la invención. Por "que se puede expresar en una planta", se entiende que la secuencia promotora, incluyendo cualquier elemento regulador adicional añadido a la misma o contenido en la misma, es por lo mismo capaz de inducir, conferir, activar o potenciar la expresión en una célula, tejido u órgano de una planta, preferiblemente una célula, tejido u órgano de una planta monocotiledonea o dicotiledonea.
Los términos "operable en planta" y "operable en una planta", cuando se usan aquí, con respecto a una secuencia promotora, deben tomarse como equivalentes a una secuencia promotora que se puede expresar en una planta.
Los promotores regulables como parte de un sistema de expresión viral binario en una planta también son conocidos para las personas expertas (Yadav 1999 - W09922003; Yadav 2000 - WO0017365).
En el contexto presente, una "secuencia promotora regulable" es un promotor que puede ser capaz de conferir expresión sobre un gen estructural en una célula, tejido u órgano en particular o grupos de células, tejidos u órganos de una planta, opcionalmente bajo condiciones específicas, aunque generalmente no confieren expresión a través de la planta bajo todas las condiciones. De acuerdo con ello, una secuencia promotora regulable puede ser una secuencia promotora que confiere expresión sobre un gen al cual está conectada de manera operable en una localización particular dentro de la planta o alternativamente, a través de la planta bajo un conjunto específico de condiciones, tales como la inducción siguiente de la expresión del gen mediante un compuesto químico u otro elicitor.
De manera preferible, el promotor regulable utilizado en el desarrollo de la presente invención confiere expresión en una localización específica dentro de la planta, bien constitutivamente o siguiendo la inducción, sin embargo no en la planta completa bajo ninguna circunstancia.
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Incluidos dentro del alcance de tales promotores están las secuencias promotoras específicas para células, secuencias promotoras específicas para tejidos, secuencias promotoras específicas para órganos, secuencias promotoras de genes específicas para el ciclo celular, secuencias promotoras inducibles y otras secuencias promotoras constitutivas que pueden haber sido modificadas para conferir expresión en una parte particular de la planta en cualquier momento dado, tal como mediante la integración de dicho promotor constitutivo dentro de un elemento genético trasponible (Ac, Ds, Spm, En, o sus transposones).
De la misma forma, el término "específico para tejido" debe tomarse para indicar que la expresión está predominantemente en un tejido o tipo de tejido particular, preferiblemente de origen vegetal, aunque no necesariamente exclusivo en dicho tejido o tipo de tejido.
De la misma forma, el término "específico para órganos" debe tomarse para indicar que la expresión está particularmente en un órgano, preferiblemente de origen vegetal, aunque no de manera necesaria exclusivamente en dicho órgano.
De la misma forma, el término "específico de ciclo celular", debe tomarse para indicar que la expresión es predominantemente cíclica y ocurre en una o más fases, no necesariamente consecutivas del ciclo celular si bien no necesariamente de forma exclusiva en células cíclicas, preferiblemente de origen vegetal.
Los expertos en la técnica estarán atentos a que "un promotor inducible" es un promotor de la actividad transcripcional de la cual es incrementado o inducido en respuesta a un estímulo de desarrollo, químico, ambiental o físico. De la misma forma, la persona experta en la técnica entenderá que un "promotor constitutivo" es un promotor que es transcripcionalmente activo a lo largo de la mayoría de, pero necesariamente no de todas las partes de un organismo, preferiblemente una planta, durante la mayor parte de, pero no necesariamente todas las fases de su crecimiento y desarrollo.
Las personas expertas en la técnica serán fácilmente capaces de seleccionar secuencias promotoras apropiadas para su uso en la expresión apropiada reguladora de la proteína de citoquinina oxidasa a partir de fuentes públicamente disponibles o fácilmente disponibles, sin una experimentación indebida.
Colocar una molécula de ácido nucleico bajo el control regulador de una secuencia promotora o en una conexión operativa con una secuencia promotora significa posicionar dicha molécula de ácido nucleico de manera tal que la expresión es controlada por la secuencia promotora. Un promotor es usualmente, pero no necesariamente, posicionado corriente arriba o en el extremo 5', y dentro de 2 kb del sitio de inicio de la transcripción, de la molécula de ácido nucleico que regula. La construcción de combinaciones promotor/gen estructural heterólogas se prefiere generalmente posicionar el promotor a una distancia del sitio de inicio de la transcripción del gen que es aproximadamente la misma que la distancia entre el promotor y el gen que controla en su disposición natural (esto es, el gen desde el cual se deriva el promotor). Como se conoce en la técnica, puede acomodarse alguna variación en la distancia sin pérdida de la función promotora. De la misma forma, el posicionamiento preferido de un elemento de secuencia regulador con respecto a un gen heterólogo que puede ser colocado bajo su control está definido por el posicionamiento del elemento en su localización natural (esto es, el gen desde el cual es derivado). De nuevo, como se conoce en la técnica, puede también presentarse alguna variación en la distancia.
Ejemplos de promotores adecuados para su uso en constructos de genes de la presente invención incluyen los que aparecen en lista en la Tabla 4, entre otros. Los promotores en lista en la Tabla 4 se proveen para los propósitos de ejemplificación solamente y la presente invención no está limitada por la lista provista aquí. Los expertos en la técnica estarán fácilmente en posición de proveer promotores adicionales que son útiles en llevar a cabo la presente
invención.
En el caso de promotores constitutivos o promotores que inducen la expresión a lo largo de la planta completa, se prefiere que tales secuencias sean modificadas mediante la adición de secuencias de nucleótidos derivadas de uno o más de los promotores específicos de tejido que se listan en la Tabla 4, o alternativamente, secuencias de nucleótido derivadas de uno o más de los anteriores promotores inducibles específicos de tejido mencionados, para conferir especificidad al tejido sobre las mismas. Por ejemplo, el promotor CaMV 35S puede ser modificado mediante la adición de la secuencia promotora Adh1 del maíz, para conferir una expresión específica de raíz regulada de manera anaerobia, como se describió previamente (Ellis et al., 1987). Otro ejemplo describe el conferir una expresión genética abundante para raíz o específica de raíz fusionando el promotor CaMV35S con elementos de la proteína de maíz rica en glicina del gen GRP3 (Feix and Wulff 2000 - WO0015662). Tales modificaciones pueden ser alcanzadas mediante experimentación de rutina por las personas expertas en la técnica. El término "terminador" se refiere a una secuencia de ADN al final de una unidad transcripcional que señala la terminación de la transcripción. Los terminadores son secuencias de ADN 3' no traducidas que contienen una señal de poliademilación, la cual facilita la adición de secuencias de poliademilato al extremo 3' de un transcripto primario. Los terminadores activos en las células derivadas de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas son conocidos y descritos en la literatura. Pueden ser aislados a partir de bacterias, hongos, virus, animales y/o
plantas.
TABLA 4 Ejemplos de promotores que se pueden expresar en plantas para su uso en la ejecución de la presente invención
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Ejemplos de terminadores particularmente adecuados para uso en constructos genéticos de la presente invención incluyen la nopalina sintasa de la Agrobacterium tumefaciens (NOS) como terminador de gen, la secuencia terminadora de gen de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (OCS), la secuencia terminadora de gen de (CaMV) 35S del virus mosaico de la coliflor, la secuencia terminadora de la ADP-glucosa pirofosforilaza de Oryza sativa (t3'Bt2), la secuencia terminadora de gen de la zeina de la Zea mays, el terminador de gen de rbcs-1A, y las secuencias terminadoras de gen rbcs-3A, entre otros.
Secuencias promotoras preferidas de la invención incluyen promotores específicos de raíz tales como pero no limitados a los que aparecen enlistados en la Tabla 5 y que se bosquejan en los ejemplos.
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TABLA 5 Ejemplos de promotores específicos de raíz para uso en la ejecución de la presente invención
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Los expertos en la técnica estarán atentos a secuencias promotoras y secuencias terminadoras adicionales que pueden ser adecuadas para ejecutar la invención. Tales secuencias pueden ser utilizadas fácilmente sin ninguna experimentación indebida. En el contexto de la presente invención, "expresión ectópica" o "sobreexpresión ectópica" de un gen o una proteína se refieren a patrones de expresión y/o niveles de expresión de dicho gen o proteína que normalmente no se presentan bajo condiciones naturales, más específicamente significan expresión incrementada y/o niveles de expresión incrementada. La expresión ectópica puede alcanzarse de diversas maneras incluyendo el enlace operativo de dicha proteína que codifica la secuencia de codificación con un promotor homólogo o heterólogo aislado con el fin de crear un gen quimérico y/o enlazando de manera operativa dicha secuencia codificadora a su propio promotor aislado (esto es, el promotor no aislado que conduce de manera natural la expresión de dicha proteína) con el fin de crear una duplicación de gen recombinante o un efecto de multiplicación de gen. Con "coexpresión ectópica" se indica la expresión ectópica o la sobreexpresión ectópica de dos o más genes o proteínas. Los mismos, o más preferiblemente, promotores diferentes se utilizan para conferir expresión ectópica de dichos genes o
proteínas.
Preferiblemente, la secuencia promotora utilizada en el contexto de la presente invención está enlazada de manera operativa a una secuencia codificadora o a un marco de lectura abierto (ORF) que codifica una proteína citoquinina oxidasa o un homólogo derivado o un fragmento inmunológicamente activo y/o funcional de la misma como se definió supra.
"La regulación en disminución de la expresión" como se usa aquí significa disminuir los niveles de la expresión genética y/o niveles de producto del gen activo y/o niveles de la actividad del producto del gen.
Los descensos en la expresión pueden ser alcanzados por ejemplo mediante la adición de secuencias codificadoras o partes de las mismas en una orientación en sentido (si resulta en una cosupresión) o en una orientación antisentido con respecto a la secuencia del promotor y adicionalmente por ejemplo mediante la inserción de mutagénesis (por ejemplo, inserción de T-ADN o inserción de transposones) o por estrategias de silenciamiento de genes como se describen por ejemplo Angell y Baulcombe (1998 - WO9836083), Lowe et al. (1989 - WO9853083), Lederer et al. (1999- WO9915682) or Wang et al. (1999 - WO9953050). Los constructos genéticos buscados con la expresión de silenciamiento de gen pueden tener la secuencia del nucleótido y dicho gen (o una o más partes del mismo contenidas en una orientación sentido y/o antisentido con respecto a la secuencia del promotor. Otro método para regular hacia el descenso la expresión del gen comprende el uso de ribozimas.
La modulación, incluyendo la disminución, del nivel de los productos del gen activo o la actividad del producto del gen pueden ser alcanzados si administrando o exponiendo las células, tejidos órganos u organismos a dicho producto del gen o a un homólogo, derivado y/o fragmento inmunológicamente activo del mismo. La inmunomodulación es otro ejemplo de una técnica capaz de niveles de regulación hacia el descenso de un producto activo del gen y/o de la actividad del producto del gen y comprende la administración de, o la exposición a los anticuerpos que expresan dicho producto de gen hacia o en células, tejidos, órganos u organismos donde los niveles de dicho producto de gen y/o actividad de producto de gen deben ser modulados. Tales anticuerpos comprenden "planticuerpos", anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos IgG y anticuerpos de cadena pesada así como fragmentos de los mismos.
La modulación, incluyendo la disminución, del nivel de productos activos de gen o de la actividad del producto de gen pueden adicionalmente ser alcanzados administrando o exponiendo las células, tejidos, órganos u organismos a un agonista de dicho producto de gen o de la actividad del mismo. Tales agonistas incluyen proteínas (que comprenden por ejemplo, quinasas y proteinasas) y compuestos químicos identificados de acuerdo con la invención presente como se describió más arriba.
En el contexto de la presente especificación se prevé la regulación hacia el descenso de la expresión de un gen de citoquinina oxidasa como se definió más arriba. Preferiblemente dicho gen de citoquinina oxidasa es un gen de citoquinina oxidasa de una planta, más específicamente un AtCKX. La especificación comprende adicionalmente la regulación en descenso de niveles de una proteína de citoquinina oxidasa o de una actividad de citoquinina oxidasa mediante la cual dicha proteína de citoquinina oxidasa ha sido definida más arriba. Preferiblemente dicha proteína citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa de una planta más específicamente una AtCKX.
Por el término "modificando el destino de la planta y/o el desarrollo y/o la morfología y/o la bioquímica y/o la fisiología de la planta" se da a entender que una o más características de desarrollo y/o morfológicas y/o bioquímicas y/o fisiológicas de una planta se alteran mediante la ejecución de una o más etapas que incumben a la invención descrita aquí.
"Destino de las células" se refiere al tipo de célula o características celulares de una célula particular que son producidas durante el desarrollo de la planta o de un proceso celular para la misma en particular durante el ciclo celular o como consecuencia de un proceso de ciclo celular.
"Desarrollo de planta" o el término "característica de desarrollo de planta" o un término similar, cuando se use aquí se tomará el significado de cualquier proceso celular de una planta que está involucrado en la determinación del destino de desarrollo de una célula de una planta, en particular el tipo de tejido u órgano específico en el cual se desarrollará una célula progenitora. Los procesos celulares relevantes para el desarrollo de las plantas serán conocidos por aquellos experimentados en la técnica. Tales procesos incluyen, por ejemplo, morfogénesis, fotomorfogénesis, desarrollo de brotes, desarrollo de raíces, desarrollo vegetativo, desarrollo reproductivo, elongación del tallo, floración, y mecanismos reguladores involucrados en determinar el destino de la célula, en particular un proceso o un proceso regulador que involucra el ciclo celular.
"Morfología de planta" o el término "característica de la morfología de la planta" o término similar, cuando se use aquí será entendido por aquellos expertos en la técnica como referencia a la apariencia externa de una planta, incluyendo uno cualquiera o más rasgos estructurales o combinación de rasgos estructurales de la misma. Tales rasgos estructurales incluyen la forma, tamaño, número, posición, color, textura, disposición, y patrones de cualquier célula, tejido u órgano o grupos de células, tejidos u órganos de una planta, incluyendo la raíz, tallo, hoja, brote, pecíolo, tricomo, flor, pétalo, estigma, estilo, estamen, polen, óvulo, semilla, embrión, endoesperma, recubrimiento de semilla, aleurona, fibra, fruto, cambium, madera, maderamen, parénquima, arénquima, elemento de tamiz, floema, o tejido vascular, entre otros.
"Bioquímica de la planta" o el término "característica bioquímica de la planta" o un término similar cuando se use aquí, será entendido por aquellos expertos en la técnica como referencia a los procesos metabólicos y catalíticos de una planta, incluyendo el metabolismo primario y secundario y el proceso de los mismos, incluyendo cualquier molécula pequeña, macromoléculas o compuestos químicos, tales como pero no limitándose a almidones, azúcares, proteínas, péptidos, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, moléculas de ácidos nucleicos, celulosas, hemicelulosas, callosas, lectinas, fibras, pigmentos tales como antocianinas, vitaminas, minerales, micronutrinetes o macronutrientes, que son producidos por las plantas.
"Fisiología de la planta" o el término "característica fisiológica de una planta" o términos similares, cuando se usen se entenderán como referencia a los procesos funcionales de una planta, incluyendo procesos de desarrollo tales como crecimiento, expansión y diferenciación, desarrollo sexual, reproducción sexual, producción de semillas, desarrollo de semillas, llenado de granos, reproducción asexual, división celular, latencia, germinación, adaptación a la luz, fotosíntesis, expansión de las hojas, producción de fibras, crecimiento secundario o producción de madera, entre otros; respuestas de una planta a factores aplicados externamente tales como metales, productos químicos, hormonas, factores de crecimiento, ambiente factores de estrés ambiental (por ejemplo anoxia, hipoxia, alta temperatura, baja temperatura, deshidratación, luz, duración del día, inundación, sal, metales pesados, entre otros), incluyendo respuestas adaptativas de las plantas a dichos factores aplicados externamente.
Los medios para introducir ADN recombinante en los tejidos o células de una planta incluyen, pero no se limitan, a la transformación utilizando CACL2 y variaciones de la misma, en particular el método descrito por Hanahan (1983), consumo directo de ADN en los protoplastos (Krens et al, 1982 Paszkowski et al, 1984), consumo de protoplastos mediados por PEG (Armstrong et al, 1990), bombardeo con micropartículas, electroporación (Fromm et al, 1985), microinyección de ADN (Crossway et al, 1986), bombardeo con micropartículas de esquejes o células de tejido (Christou et al, 1998; Sanford, 1988), infiltración al vacío de tejidos con ácidos nucleicos, o en el caso de las plantas, transferencia mediada por T-ADN desde Agrobacterium al tejido de la planta como se describe esencialmente por An et al. (1985), Dodds et al., (1985), Herrera-Estrella et al. (1983a, 1983b, 1985). Los métodos para la transformación de plantas monocotiledoneas son bien conocidos en la técnica e incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (Cheng et al., 1997 - WO9748814; Hansen 1998 - WO9854961; Hiei et al., 1994 - WO9400977; Hiei et al., 1998 - WO9817813; Rikiishi et al., 1999 - WO9904618; Saito et al., 1995 - WO9506722), bombardeo con microproyectiles (Adams et al., 1999 - US5969213; Bowen et al., 1998 - US5736369; Chang et al:, 1994 - WO9413822; Lundquist et al., 1999 - US5874265/US5990390; Vasil and Vasil, 1995 - US5405765. Walker et al., 1999 - US5955362), DNA uptake (Eyal et al., 1993 - WO9318168), microinyección de células de agrobacterium (von Holt, 1994-De 4309203), y sonicación (Finer et al, 1997- US5693512).
Para el bombardeo con micropartículas de células, una micropartícula es impulsada hacia una célula para producir una célula transformada. Cualquier metodología y aparato para transformación celular por balística adecuados pueden ser utilizados para ejecutar la presente invención. Aparatos y procedimientos de ejemplos están descritos por Stomp et al. (U.S. Patent No. 5,122,466) y Sanford y Wolf (U.S. Patent No. 4,945,050). Cuando se utilizan procedimientos de transformación balística, el constructo del gen puede incorporar un plásmido capaz de replicar en la célula que va ser transformada. Ejemplos de micropartículas adecuadas para su uso en tales sistemas incluyen esferas de oro de 1 a 5 \mum. El costructo de ADN puede ser depositado sobre la micropartícula por cualquier técnica adecuada, tal como precipitación.
Una planta completa puede ser regenerada a partir de la célula transformada o transfectada; de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. El tejido de planta capaz de una propagación clonal subsecuente, bien por organogénesis o embriogénesis, puede ser transformado con un constructo de gen de la presente invención y regenerarse una planta completa a partir del mismo. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonales disponibles, para, y mejor adecuados a, las especies particulares que están siendo transformadas. Ejemplos de dianas de tejido incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido de callus, tejido meristemático existente (por ejemplo meristema apical, brotes axilares y meristemas de raíz), y tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledon y meristema de hipocotilo.
El término "organogénesis" tal como se usa aquí significa un proceso mediante el cual brotes y raíces se desarrollan secuencialmente a partir de centros meristemáticos.
El término "embriogénesis", tal como se usa aquí, significa un proceso mediante el cual brotes y raíces se desarrollan juntos de una forma concertada (no secuencialmente), bien a partir de células somáticas o gametos.
Preferiblemente, la planta producida de acuerdo con el método de la invención es transfectada o transformada con una secuencia genética, o es suscepetible de la introducción de una proteína, por medios reconocidos en la técnica, tales como el bombardeo con microproyectiles, microinyección, transformación mediada por Agrobacterium (incluyendo la transformación in planta), fusión de protoplastos o electroporación, entre otros. Más preferiblemente dicha planta es producida por transformación mediada por Agrobacterium.
La transformación mediada por Agrobacterium o la transformación agrolística de las plantas, levaduras, mohos u hongos filamentosos se basa en la transferencia de parte de las secuencias vectoras de la transformación, llamadas el ADN-T, al núcleo y por integración de dicho ADN-T en el genoma de dicha eucariota.
Con "Agrobacterium" se indica un miembro de la Agrobacteriaceae con más preferiblemente Agrobacterium o Rhizobacterium y más preferiblemente Agrobacterium tumefaciens.
Con "ADN-T" o ADN transferido, se indica que parte del vector de transformación flanqueado por las fronteras del ADN-T el cual es, después la activación del género Agrobacterium vir, unido a las fronteras de ADN-T y es transferido como un ADN de cadena sencilla al núcleo de una célula eucariota.
Cuando se usa aquí, con "fronteras de ADN-T", "región de frontera de ADN-T", o "región de frontera", se indica bien la frontera de ADN-T (BR) de la derecha, o la frontera de ADN-T (Lb) de la izquierda. Tal frontera comprende una secuencia núcleo flanqueada por una región interna de frontera como parte del ADN-T que flanquea la frontera y/o una región de frontera externa como parte del esqueleto vector que flanquea la frontera. La secuencia núcleo comprende 22 bp en caso de los vectores tipo octopina y 25 bp en caso de los vectores tipo nopalina. Las secuencias de núcleo en la región de frontera derecha y en la región de frontera izquierda forman repeticiones imperfectas. Las secuencias de núcleo en la frontera son indispensables para el reconocimiento y procesamiento del complejo de unión con Agrobacterium que consiste de por lo menos VirD1 y VirD2. Las secuencias núcleo que flanquean un ADN-T son suficientes para promover la transferencia de dicho ADN-T. Sin embargo, la eficiencia de la transformación utilizando vectores de transformación que portan dicho ADN-T únicamente flanqueado por dicha secuencias núcleo es baja. Las regiones de frontera interna y frontera externa son conocidas por modular la eficiencia de la transferencia de ADN-T (Wang et al, 1987). Un elemento que potencia la transferencia de ADN-T ha sido caracterizado y reside en la región de la frontera externa derecha y se denomina sobreconductora (Peralta et al. 1986, van Haaren et al. 1987).
Con "vector de transformación de ADN-T" o "vector ADN-T" se indica cualquier vector que abarque una secuencia ADN-T flanqueada por una frontera de ADN-T derecha e izquierda consistente de por lo menos las secuencias de núcleo de frontera derecha e izquierda, respectivamente, y se utiliza para la transformación de cualquier célula eucariótica.
Con "secuencia de esqueleto de vector de ADN-T" o "secuencias de esqueleto de vector de ADN-T" se indica todo el ADN de un vector que contiene ADN-T que cae por fuera de las fronteras del ADN-T y, más específicamente, por fuera de los sitios de unión de las repeticiones imperfectas del núcleo de frontera.
La presente invención incluye vectores de ADN-T optimizados de tal manera que la integración del esqueleto del vector en el genoma de una célula eucariótica es minimizada o ausente. Con "vector de ADN-T optimizado" se indica un vector de ADN-T diseñado bien para disminuir o abolir la transferencia de secuencias del esqueleto del vector al genoma de una célula eucariótica. Tales vectores de ADN-T son conocidos para los que están familiarizados con la técnica e incluyen los descritos por Hanson et al. (1999) and by Stuiver et al. (1999 - WO9901563).
La presente especificación considera claramente la inclusión de una secuencia de ADN que codifica una citoquinina oxidasa, homólogo, derivado o fragmento immunológicamente activo y/o funcional de la misma como se define más arriba, en cualquier vector de ADN-T que comprende vectores de transformación binaria, vectores de transformación superbinaria, vectores de transformación cointegrada, vectores de transformación derivados de Ri así como en vectores de transporte de ADN-T usados en la transformación agrolística. Preferiblemente, dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa de una planta, más específicamente una Arabidopsis thaliana (At) CKX.
Con "vector de transformación binaria" se indica un vector de transformación de ADN-T que comprende:
(a)
una región de ADN-T que comprende por lo menos un gen de interés y/o por lo menos un marcador activo seleccionable en la célula eucariótica que va ser transformada; y
(b)
una región de esqueleto de vector que comprende por lo menos los orígenes de replicación activa en E. coli y Agrobacterium y marcadores para la selección en E. coli y Agrobacterium.
Las fronteras de ADN-T del vector de transformación binaria pueden ser derivadas a partir de plásmidos tipo octopina o tipo nopalina Ti o de ambos. El ADN-T de un vector binario solamente es transferido a una célula eucariótica en conjunción con un plásmido de ayuda.
Con "plásmido de ayuda" se indica un plásmido que se mantiene de manera estable en el Agrobacterium y que por lo menos porta un conjunto de genes vir necesarios para permitir la transferencia del ADN-T. Dicho conjunto de genes vir puede ser derivado bien de los plásmidos tipo octopina o tipo nopalina Ti o de ambos.
Con "vector de transformación superbinaria" se indica un vector de transformación binaria que porta adicionalmente en la región del esqueleto del vector una región vir del plásmido Ti pTiBo542 de la sepa supervirulenta A. tumefaciens A281 (EP0604662, EP0687730). Los vectores de transformación binaria son utilizados en conjunción con un plásmido de ayuda.
Con "vector de transformación cointegrado" se indica un vector ADN-T que comprende por lo menos:
(a)
una región ADN-T que comprende por lo menos un gen de interés y/o por lo menos un marcador seleccionable activo en plantas; y
(b)
una región de esqueleto de vector que comprende por lo menos orígenes de replicación activos en Escherichia coli y Agrobacterium, y marcadores para selección en E. coli y Agrobacterium, y un conjunto de genes vir necesarios para habilitar la transferencia del ADN-T.
Las fronteras de ADN-T y dicho conjunto de genes vir de dicho vector ADN-T pueden derivarse a partir de los plásmidos tipo octopina o tipo nopolina Ti o de ambos.
Con "vectores de transformación de planta derivado de Ri" se indica un vector de transformación binario en el cual las fronteras de ADN-T son derivadas de un plásmido Ti y dicho vector de transformación binario se usa en conjunción con un plasmido Ri "de ayuda" que porta el conjunto necesario de genes vir.
Según se usa aquí, el término "gen marcador seleccionable" o "marcador seleccionable" o "marcador para selección" incluye cualquier gen que confiera un fenotipo sobre una célula en la cual se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que son transfectadas o transformadas con un constructo de gen de la invención o un derivado de la misma. Genes marcadores seleccionables adecuados contemplados aquí incluyen el de resistencia a ampicilina (AMP^{r}), gen de resistencia a la tetraciclina (TC^{r}), gen de resistencia bacteriana a la canamicina (KAN^{r}), gen de resistencia a la fosfinotricina, gen de fosfotransferasa neomicina (NPTIL), gen de resistencia a la higromicina, gen de \beta-glucuronidasa (GUS), gen de la cloramfenicol acetil transferasa (CAT), gen de la proteína de fluorescencia verde (gfp) (Haseloff et al, 1997), y gen luciferasa, entre otros.
Con "agrolísticos", "transformación agrolística" o "transferencia agrolística" se indica aquí un método de transformación que combina características de la transformación mediada por Agrobacterium y de la administración de ADN biolístico. Como tal, un ADN-T que contiene el plásmido objetivo es coadministrado con ADN/ARN habilitando la producción in planta de VirD1 y VirD2 con o sin VirE2 (Hansen y Chilton 1996; Hansen et al. 1997; Hansen and Chilton 1997 - WO9712046). Con "ADN foráneo" se indica cualquier secuencia de ADN que es introducida en el genoma del huésped por técnicas de recombinación. Tal ADN foráneo incluye por ejemplo una secuencia de ADN-T o una parte de la misma tal como la secuencia de ADN-T que comprende el marcador seleccionable en un formato que se puede expresar. El ADN 
\hbox{foráneo incluye
adicionalmente secuencias interventoras de ADN como  se definió más
arriba.}
Con "evento de recombinación" se indica cualquier evento de recombinación especifico de un sitio o un evento de recombinación efectuado por "salto" de transposones.
Con "recombinasa" se indica cualquier recombinasa específica del sitio o una transposasa.
Con "sitio de recombinación" se indica cualquier sitio de recombinación específica para el sitio o secuencias de frontera del transposón.
Con "evento de recombinación específico del sitio" se indica cualquier evento catalizado por un sistema que consiste generalmente de tres elementos: una pareja de secuencias de ADN (las secuencias o sitios de recombinación específicas del sitio) y una enzima específica (la recombinasa específica del sitio). La recombinasa específica del sitio cataliza una reacción de recombinación solamente entre dos secuencias de recombinación específicas del sitio dependiendo de la orientación de las secuencias de recombinación específicas del sitio. Las secuencias que intervienen entre dos sitios de recombinación específicos del sitio serán invertidas en la presencia de la recombinasa específica del sitio cuando las secuencias de recombinación específicas del sitio sean orientadas en direcciones opuestas con respecto una a otra (esto es, repeticiones invertidas). Si las secuencias de recombinación específicas del sitio están orientadas en la misma dirección una con respecto a la otra (esto es, repeticiones directas), entonces todas las secuencias que intervienen serán eliminadas por interacción con la recombinasa específica del sitio. Así, si las secuencias de recombinación específicas del sitio están presentes como repeticiones directas en ambos extremos de una secuencia de ADN foráneo integrada al genoma eucariótico, tal integración de dichas secuencias puede ser revertida subsecuentemente por interacción de las secuencias 
\hbox{de
recombinación  específicas del sitio con las correspondientes
recombinasas específicas del sitio.}
Puede usarse un gran número de diferentes sistemas de recombinasa específicos incluyendo pero no limitándose al sistema Cre/Iox del bacteriófago P1, el sistema FLP/FRT de la levadura, la recombinasa Gin del fago Mu, la recombinasa Pin de E. coli, la PinB, PinD y PinF de la Shigella, y el sistema R/RS del plásmido pSR1. Las recombinasas en general son integrasas, resolvasas o flipasas. También las recombinasas duales específicas pueden usarse en conjunción con repeticiones directas o indirectas de los dos sitios de recombinación específicos del sitio correspondientes a la recombinasa específica dual (WO99/25840). Los dos sistemas de recombinasa específicos del sitio preferido son los sistemas del bacteriófago P1 Cre/Iox y la levadura FLP/FRT. En estos sistemas una recombinasa (Cre o FLP) interactúa específicamente con su respectiva secuencia de recombinación específica del sitio (Iox o FRT respectivamente) para invertir o escindir las secuencias que intervienen. Las secuencias de recombinación específicas del sitio para cada uno de estos dos sistemas son relativamente cortas (34 bp para Iox y 47 bp para FRT). Algunos de estos sistemas ya han sido usados con alta eficiencia en plantas tales como tabaco (Dale et al. 1990) y Arabidopsis (Osborne et al. 1995). Los sistemas de recombinación específicos del sitio tienen muchas aplicaciones en biología molecular de plantas incluyendo los métodos para controlar la recombinación homóloga (por ejemplo US5527695), para inserción específica, apilación de génes, etc. (WO99/25821) y para la resolución de patrones de integración complejos de ADN-T o para la escisión de un marcador seleccionable (WO99/23202).
Aunque las secuencias de recombinación específica del sitio deben ser unidas a los extremos del ADN que se va a escindir o se va a invertir, el gen que codifica la recombinasa específica del sitio puede estar localizado en cualquier lugar. Por ejemplo, el gen de la recombinasa podría ya estar presente en el ADN de la eucariota o podría ser suministrado por un fragmento de ADN introducido posteriormente bien introducido de manera directa en las células, a través de cruzamiento o a través de polinización cruzada. Alternativamente, una proteína recombinasa purificada podría ser introducida directamente en la célula eucariótica, por ejemplo por microinyección o bombardeo con partículas. Típicamente, la región de codificación de recombinasa específica del sitio será unida de manera operable a las secuencias reguladoras que permiten la expresión de la recombinasa específica del sitio en la célula eucariótica.
Con "evento de recombinación efectuado por salto de transposón" o "recombinación mediada por transposasa" indica un evento de recombinación catalizado por un sistema consistente de tres elementos: un par de secuencias de ADN (las secuencias de frontera del transposón) y una enzima específica (la transposasa). La transposasa cataliza una reacción de recombinación solamente entre dos secuencias de frontera de transposón que están dispuestas como repeticiones invertidas.
Pueden utilizarse diversos sistemas diferentes transpsón/transposasa incluyendo pero no limitándose al sistema Ds/Ac, el sistema Spm y el sistema Mu. Estos sistemas se originan a partir del maíz pero se ha demostrado que por lo menos que el sistema Ds/Ac y el sistema Spm también funcionan en otras plantas (Federoff et al. 1993, Schlappi et al. 1993, Van Sluys et al. 1987). Se prefieren los trasnposones tipo Ds y Spm que son delineados por secuencias de frontera 11 bp y 13 bp respectivamente.
Aunque las secuencias de frontera del transposor deben estar unidas a los extremos del ADN que se va a escindir, el gen que codifica la transposasa puede estar localizado en cualquier lugar. Por ejemplo, el gen de recombinasa podría ya estar presente en el ADN de la eucariótica o podría ser suministrado por un fragmento de ADN introducido posteriormente bien sea introducido directamente en las células, a través de entrecruzamiento o de polinización cruzada. Alternativamente, una proteína de transposasa sustancialmente purificada podría ser introducida directamente en las células, por ejemplo, por microinyección o por bombardeo con partículas.
Como parte de la presente invención, las secuencias de frontera del transposor son incluidas en una secuencia de ADN foráneo de tal manera que caigan fuera de dicha secuencia de ADN y transformen dicho ADN en una entidad similar al transposón que puede moverse por la acción de una transposasa.
Puesto que los transposones se reintegran frecuentemente en otra localización el genoma del huésped, la segregación de la progenie de los huéspedes en los cuales se dejó actuar la transposasa podría ser necesario separar los huéspedes transformados que contienen por ejemplo solamente la huella del transposón y los huéspedes transformados que aún contienen el ADN foráneo.
Para llevar a cabo la presente invención, el elemento genético se induce preferiblemente para movilizarse, tal como, por ejemplo, mediante la expresión de una proteína recombinasa en la célula que entre en contacto con el sitio de integración del elemento genético y facilite un evento de recombinación en el mismo, escindiendo el elemento genético completamente o alternativamente, dejando una "huella" generalmente de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud o mayor, en el sitio de integración original. Estos huéspedes y partes de huéspedes que han sido producidos de acuerdo con el método de la invención pueden ser identificados mediante hibridización de ácidos nucleicos estándar y/o técnicas de amplificación para detectar la presencia del elemento genético movilizable o un constructo genético que comprende el mismo. Alternativamente, en el caso de células huésped, tejidos y huéspedes donde el elemento genético movilizable ha sido escindido, es posible detectar una huella en el genoma del huésped que ha sido dejada después del evento de escisión, utilizando tales técnicas. Tal como se usa aquí, el término "huellas" debe tomarse para hacer referencia a cualquier derivado de un elemento genético movilizable o constructo de gen que comprende el mismo tal como se describió aquí cuando se produce por escisión, eliminación u otro tipo de remoción del elemento genético movilizable del genoma de una célula previamente transformada con dicho constructo de gen. Una huella generalmente comprende por lo menos una copia sencilla de los loci o los transposones utilizados para promover la escisión. Sin embargo, una huella puede comprender secuencias adicionales derivadas del constructo del gen, por ejemplo secuencias de nucleótidos derivadas de la secuencia de frontera izquierda, de la secuencia de frontera derecha, del origen de la replicación, de la codificación de la recombinasa o de la secuencia de recombinación de la transposasa si se usa, u otras secuencias de nucleótidos derivadas de vectores. De acuerdo con ello, una huella es identificable de acuerdo con la secuencia de nucleótido del locus de recombinación o transposón del constructo de gen usado, tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos correspondiente o complementarias a un sitio Iox o un sitio frt.
El término "ciclo celular" significa los eventos bioquímicos y estructurales cíclicos asociados con el crecimiento y con la división de las células y en particular con la regulación de la replicación del ADN y la mitosis. El ciclo celular incluye fases llamadas: G0, Gap1 (G1), síntesis de ADN (S), Gap2 (G2), y mitosis (M). Normalmente estas cuatro fases ocurren de manera secuencial, pero sin embargo el ciclo celular también incluye ciclos modificados donde una o más fases están ausentes lo que se traduce en un ciclo celular modificado tal como endomitósis, acitoquinésis, poliploide, politénia y endorreduplicación.
El término "progresión del ciclo celular" se refiere al proceso de pasar a través de las diferentes fases del ciclo celular. El término "rata de progresión del ciclo celular" de acuerdo con lo anterior se refiere a la velocidad a la cual dichas fases del ciclo celular son atravesadas por el tiempo de barrido requerido para concretar dichas fases de ciclo celular.
Con "prueba de dos híbridos" se indica cualquier prueba que se base en la observación de que muchos factores de transcripción eucarióticos comprenden dos dominios, un dominio de enlace del ADN (DB) y un dominio de activación (AD) los cuales, cuando son separados físicamente (esto es, perturbación de la unión covalente) no efectúan la expresión del gen objetivo. Dos proteínas capaces de interactuar físicamente con una de dichas proteínas fusionadas al DB y la otra de dichas proteínas fusionadas al AD reunirán los dominios DB y AD del factor de transcripción resultando en la expresión del gen objetivo. El gen objetivo en el ensayo de dos híbridos de levadura es usualmente un gen informador como el gen \beta-galactosidasa. La interacción entre las proteínas asociadas en la prueba de dos híbridos de levadura puede ser entonces cuantificada midiendo la actividad del producto gen informador (Bartel y Fields. 1997). De manera alternativa, un sistema de dos híbridos de un mamífero puede ser utilizado el cual incluye una proteína fluorescente verde quimérica por ejemplo, que codifica el gen informador (Shioda et al., 2000).
Adicionalmente, las simulaciones de multiplicación y el rediseño por ordenador de las unidades estructurales de la proteína de la invención pueden ser llevadas a cabo utilizando programas de ordenador apropiados (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 1 (1995), 675-679). La modelación por ordenador de la multiplicación de proteínas puede ser utilizada para los análisis conformacionales y energéticos de modelos de proteínas y péptidos detallados (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45). En particular, pueden usarse los programas apropiados para la identificación de sitios interactivos de citoquinina oxidasas, sus ligandos u otras proteínas interactuantes mediante búsquedas asistidas por ordenador de secuencias de péptidos complementarias (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Sistemas de ordenador apropiados para el diseño de proteínas y péptidos se describen en la técnica anterior, por ejemplo en Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann, N. Y. Acac. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Los resultados obtenidos del análisis por ordenador antes descrito pueden ser utilizados por ejemplo, para la preparación de peptidomiméticos de la proteína de la invención o fragmentos de la misma. Tales análogos pseudopeptídicos de la secuencia de aminoácidos natural de la proteína pueden imitar muy eficientemente la proteína original (Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218-33224). Por ejemplo, la incorporación de residuos \Omega aminoácidos aquirales en una proteína de la invención o un fragmento de la misma resultan la sustitución de enlaces amino por unidades polimetileno de una cadena alifática, proveyendo por lo tanto una estrategia conveniente para construir un péptido mimético (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777). Los análogos peptidomiméticos superactivos de hormonas peptídicas pequeñas en otros sistemas son descritos en la técnica anterior (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327-331). Los peptidomiméticos apropiados de la proteína de la presente invención también pueden ser identificados por la síntesis de las bibliotecas combinatoriales peptidomiméticas a través de aminoalquilación sucesiva y de pruebas de los compuestos resultantes, por ejemplo, en cuanto a sus propiedades de enlace, inhibidoras de la quinasa y/o inmunológicas. Los métodos para la generación y uso de las bibliotecas combinatoriales peptidomiméticas se describen en la técnica anterior, por ejemplo en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715.
Adicionalmente, una estructura tridimensional y/o cristalográfica de la proteína de la invención puede ser utilizada para el diseño de inhibidores peptidomiméticos de la actividad biológica de la proteína de la invención (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Ruterber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).
Los compuestos que van a obtenerse o identificarse en los métodos de la invención pueden ser compuestos que son capaces de enlazar con cualquiera de los ácidos nucleicos, péptidos o proteínas de la invención. Otros compuestos interesantes para ser identificados son los compuestos que modulan la expresión de los génes o las proteínas de la invención de tal manera que bien la expresión de dicho gen o proteína es potenciada o disminuida por la acción de dicho compuesto. Alternativamente el compuesto puede ejercer su acción potenciando o disminuyendo la actividad de cualquiera de las proteínas de la invención. Aquí, las proteínas preferidas son citoquina oxidasas novedosas.
Dicho compuesto o pluralidad de compuestos puede estar comprendida en, por ejemplo, muestras, por ejemplo extractos celulares de, por ejemplo plantas, animales o microorganismos. Adicionalmente, dichos compuestos pueden ser conocidos en la técnica pero hasta ahora no conocidos como capaces de suprimir o activar las proteínas que interactúan con la citoquinina oxidasa. La mezcla de reacción puede ser un extracto libre de células que puede comprender un cultivo celular o de tejidos. Los parámetros adecuados para el método de la invención son conocidos por las personas expertas en la técnica y están, por ejemplo, descritos en general en Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, third edition (1994), en particular Capítulo 17. La pluralidad de compuestos puede ser, por ejemplo, añadida a la mezcla de reacción, al medio de cultivo o inyectada en la célula.
Si una muestra que contiene un compuesto o una pluralidad de compuestos es identificada en el método de la invención, entonces es posible aislar el compuesto de la muestra original identificada por contener el compuesto capaz de actuar como un agonista, o puede adicionalmente subdividirse la muestra original, por ejemplo, si consiste de una pluralidad de diferentes compuestos, de manera que reduzca el número de sustancias diferentes por muestra y repita el método con la subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas anteriormente pueden llevarse a cabo varias veces, preferiblemente hasta que la muestra identificada de acuerdo con el método de la invención comprenda solamente un número limitado de o solamente una sustancia. Preferiblemente dicha muestra comprende sustancias o propiedades químicas y/o físicas similares, y lo más preferiblemente dichas sustancias son idénticas. Preferiblemente, el compuesto identificado de acuerdo con el método antes descrito o su derivado es formulado adicionalmente en una forma adecuada para la aplicación en el cultivo de plantas o en el cultivo de células y tejidos de plantas.
El término "vigor temprano" se refiere a la capacidad de la planta para crecer rápidamente durante su desarrollo temprano, y se relaciona con el establecimiento exitoso, después de la germinación, de un sistema radicular bien desarrollado y un aparato fotosintético bien desarrollado.
El término "resistencia a alojamiento" o "permanencia" se refiere a la capacidad de una planta para fijarse por si misma al suelo. Para plantas con un hábito de crecimiento erecto o semierecto este término se refiere a la capacidad de mantener una posición vertical bajo condiciones adversas (ambientales). Esta virtud se relaciona con el tamaño, profundidad y morfología del sistema radicular.
El término "injerto" como se usa aquí, se refiere a poner juntas las partes de dos plantas diferentes de manera que se unan entre si y la savia pueda fluir, formado así una nueva planta individual que pueda crecer y desarrollarse. Un injerto consiste entonces de dos partes: (i) la parte inferior que es la raíz tal como se cita aquí y esencialmente consiste del sistema radicular y una porción del tallo, y (ii) la parte superior, el scion o injerto, que da lugar a las partes aéreas de la planta.
Tal como se usa aquí tblastn se refiere a una herramienta de alineamiento que es parte del BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básica) de una familia de programas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). BLAST apunta a identificar regiones de alineamiento local óptimo, esto es el alineamiento de alguna porción de las dos secuencias de aminoácidos o proteínas, para detectar relaciones entre las secuencias que comparten solamente regiones aisladas de similitud (Altschul et al., 1990). En la presente invención, tblastn del conjunto de programas BLAST 2.0 se utilizó para comparar la secuencia de proteína de citoquinina oxidasa de maíz contra una base de datos de secuencia de nucleótidos traducido dinámicamente en todos los marcos de lectura (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)).
Los siguientes ejemplos y figuras se dan a manera de ilustración de la presente invención y no son de ninguna manera limitantes.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Representación esquemática de genes de citoquinina oxidasa de plantas.
Se muestran las estructuras de diferentes genes de citoquinina oxidasa aislados de maíz (ZmCKX1, número de acceso AF044603, Biochem. Biophys. Res. Com. 255: 328-333, 1999) y Arabidopsis (AtCKX1 a AtCKX4). Los exones están denominados con "E" y se representan por cajas sombreadas, los intrones son representados por cajas blancas. Se indican adicionalmente los tamaños del gen (en Kb, encima de cada estructura), los números de acceso del gen (bajo los nombres) y una barra de tamaño que representa 0.5 kb.
Figura 2. Alineación de secuencias de aminoácidos de citoquinina oxidasa de plantas.
La secuencia de aminoácidos de citoquinina oxidasas del maíz (ZMCKX1) y Arabidopsis (AtCKX1 a AtCKX4) son alineadas. Residuos de aminoácidos idénticos son marcados mediante una caja negra, y residuos de aminoácidos similares están en una caja gris. Grupos de similitud de aminoácidos: (M,I,L,V), (F,W,Y), (G,A,), (S,T), (R,K,H), (E,D), (N,Q),
Figura 3. Análisis Northern blot de plantas de tabaco y Arabidopsis que expresan AtCKX1
(A)
análisis northern blot de plantas de tabaco que expresan constitutivamente (líneas 1-8) en comparación con tabaco silvestre tipo SNN (línea 9)
(B)
comparación de expresión de gen inducido por tetraciclina en hojas después de 12 horas inducción con un clon constitutivamente expresado. Líneas 2-9 hojas de cuatro diferentes clones AtCKX1-W38TetR (+,-, con o sin tratamiento con tetraciclina), línea 1, clon que expresa constitutivamente 35S::AtCKX1.
(C)
Análisis northern blot de plantas del gen que expresa constitutivamente AtCKX1 de plantas de Arabidopsis. Líneas 2-4, tres clones 35S::AtCKX1 que expresan constitutivamente en comparación con planta tipo Arabidopsis (línea 1).
Figura 4. Características de crecimiento de plantas de Arabidopsis 35S::AtCKX1 transénicas
(A)
Dos tipos de semillas (izquierda) comparados con dos semillas que expresan 35S::AtCKX1 (derecha). Nótese la formación incrementada de raíces adventicias y la ramificación de raíces incrementada en las siembras transgénicas. Las imágenes fueron tomadas 14 días después de la germinación. Las plantas fueron cultivadas in vitro sobre medio MS en cajas de petri en una posición vertical.
(B)
Como A, pero con raíces teñidas con azul de toluidina.
(C)
Vista superior de una caja de petri con siembra hasta de 35S::AtCKX1 transgénico tres semanas después de la germinación.
(D)
Una planta transgénica 35S::AtCKX1 cultivada en cultivo líquido. Las raíces de las siembras tipo salvaje crecieron pobremente bajo estas condiciones (no mostradas).
(E)
Transformantes (TO) que expresan el gen 35S::AtCKX1 (tres plantas a la derecha) una planta tipo silvestre se muestra en la izquierda.
(F)
Fenotipo de plantas T1 cultivadas en suelo. Planta tipo salvaje (izquierda) comparada con dos plantas transgénicas 35S::AtCKX1.
Figura 5: Fenotipo de plantas de Arabidopsis que sobreexpresan AtCKX2
Generación T1 de plantas de Arabidopsis que expresan 35S::AtCKX2 (dos plantas a la derecha) comparadas con tipo silvestre (planta a la izquierda).
Figura 6. Análisis northern blot de plantas de tabaco y arabidopsis que expresan AtCKX2
(A)
Análisis northern blot de plantas de tabaco que expresan constitutivamente (líneas 1-7) en comparación con tabaco tipo silvestre SNN (línea 8).
(B)
Análisis northern blot de plantas de Arabidopsis que expresan constitutivamente el gen AtCKX2.
Figura 2-b, siete diferentes clones que expresan constitutivamente 35S::AtCKX2 en comparación con planta de Arabidopsis tipo silvestre (línea 1).
Figura 7. Fenotipo de brote de plantas de tabaco que expresan AtCKX1 y AtCKX2
(A)
Vista superior de plantas de seis semanas de edad.
(B)
Plantas de tabaco en la etapa de floración.
(C)
Cinética de la elongación de tallos. Las flechas marcan el surgimiento de la floración. Edad de las plantas (días después de la germinación) y el número de hojas en esa etapa se indica encima de las flechas. Las barras indican SD; n = 12.
(D)
Número de hojas (n = 12) formadas entre el día 68 y el día 100 después de la germinación y área superficial final de estas hojas (100% de tipo silvestre es 3646 +/- 144 cm^{2}; n = 3).
(E)
Comparación del tamaño y senescencia de la hoja. Las hojas fueron de nódulos números 4, 9, 12, 16 y 20 de la parte superior (de izquierda a derecha).
Figura 8. Fenotipo de raíz de plantas de tabaco transgénicas que expresan AtCKX
(A)
Siembras 17 días después de la germinación.
(B)
Sistema radicular de plantas crecidas en el suelo en la etapa de floración.
(C)
Longitud de raíces, número de raíces laterales (LR) y raíces adventicias (AR) en el día 10 después de la germinación.
(D)
Curva de respuesta a la dosis de la inhibición del crecimiento de raíces por citoquinina exógena. Las barras indican +/- SD; n = 30.
Figura 9. Crecimiento de meristemas de brote axilar en plantas de tabaco que expresan 35S::AtCKX1 .
Figura 10: Histología de los meristemas de brote, hojas y meristemas de raíz de plantas de tabaco que sobreexpresan AtCKX1 versus tabaco tipo silvestre (WT).
(A)
Sección medina longitudinal a través del meristema apical del brote vegetativo. P, hoja primordia.
(B)
Tejido bascular en venas de segundo orden de hojas. X, xilema, PH, un agrupamiento de floema.
(C)
Secciones transversales de hojas completamente desarrolladas.
(D)
Microscopia de barrido electrónico de la epidermis superior de la hoja.
(E)
Ápices de raíz teñidos con DAPI, RM, meristema de raíz.
(F)
Secciones longitudinales medianas en meristemas de raíz 10 días después de la germinación. RC, punta de raíz; PM, promeristema.
(G)
Secciones transversales de raíces 10 mm del ápice. E, epidermis, C1-C4, capa de célula cortical, X, xilema, PH, floema. Las barras son 100 \mum.
Figura 11. Análisis northern blot de plantas de tabaco que expresan AtCKX3 y AtCKX4 .
(A)
Análisis northern blot de plantas de tabaco que constitutivamente expresan AtCKX3. Las designaciones de las líneas indican números de plantas transgénicas e individuales. WT es tabaco tipo SNN silvestre. La mancha en la parte superior fue ensayada con una sonda especifica AtCKX3, la mancha en la parte inferior con una sonda especifica para el ARNr 25S y sirve como control para la carga de ARN.
(B)
Análisis northern blot de plantas de tabaco que expresan constitutivamente AtCKX4. Las designaciones de líneas indican números de plantas transgenicas individuales, WT es tabaco SNN tipo silvestre. La mancha en la parte superior fue probada con una sonda especifica AtCKX4, la mancha inferior con una sonda especifica para el ARNr 25S y sirve como un control para la carga de ARN.
Figura 12: Injertos recíprocos de plantas de tabaco transgénicas AtCKX2 y plantas tipo silvestre.
(A)
Dos plantas a la izquierda: Control (scion injertado WT sobre una raíz base WT).
\quad
Dos plantas a la derecha: scion WT injertado sobre una raíz de base transgénica AtCKX2-38.
(B)
Izquierda: Control (scion injertado WT sobre una raíz de base WT).
\quad
Derecha: scion de planta AtCKX2-38 injertado sobre raíz de base WT.
(C)
Magnificación del área radicular.
\quad
Izquierda: Control (scion injertado WT sobre una raíz de base WT).
\quad
Derecha: scion WT injertado sobre una raíz de base transgénica AtCKX2-38.
(D)
Formación de raíces adventicias.
\quad
Izquierda: control (scion injertado WT sobre una raíz de base WT).
\quad
Derecha: scion injertado WT sobre una raíz transgénica AtCKX 2-38.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Breve descripción de las secuencias divulgadas en la presente especificación
15
16 
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Los ejemplos 2B, 4, 9 y 11 a 15 se relaciona particularmente con la presente invención.
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Ejemplo 2
Identificación de genes que codifican citoquinina oxidasa candidatos de la Arabidopsis thaliana
Se identificaron seis génes diferentes de Arabidopsis thaliana que portan una similar similitud de secuencia al gen de la citoquinina oxidasa del maíz (Morris et al., Biochem Biophys Res Comm 255:328-333, 1999; Houda-Herin et al. Plant J 17:615-626; WO 99/06571). Estos genes fueron encontrados seleccionando seis traducciones de marco de secuencias de nucleótido de bases de datos genómicas públicas con la secuencia de proteínas del maíz, empleando el programa tblastn. Estas secuencias fueron designadas como genes similares a la citoquinina oxidasa de Arabidopsis thaliana o AtCKX. Fueron numerados arbitrariamente desde AtCKX1 hasta AtCKX6. La lista de más abajo resume la información sobre estos genes. Las fronteras ORF señaladas y las proyecciones de proteínas son indicativas, con el fin de ilustrar por aproximación la divergencia en secuencia de proteínas entre la citoquinina oxidasas de Arabidopsis y de maíz, así como entre las diferentes citoquinina oxidasas de Arabidopsis. Las fronteras ORF y las secuencias de proteínas no deberían ser tomadas como evidencias concluyentes para el modo de acción de estos genes AtCKX. Para comparaciones de ADN y secuencias de proteínas se utilizó el programa MegAlign de DNAstar. Este programa utiliza el método Clustal para las alineaciones. Para alineaciones múltiples de proteínas y secuencias de ADNc la diferencia por espacio vacío y la diferencia en longitud por espacio vacío fueron establecidas en 10 cada una. Para alineamientos pareados de proteína los parámetros fueron como sigue: Ktuple en 1; diferencia de espacio vacío en 3: ventana en 5; diagonales salvadas en 5. Para alineamientos pareados de los ADNc los parámetros fueron como sigue: Ktuple en 2; diferencia de espacio vacío en 5; ventana en 4; las diagonales salvadas en 4. Los grupos de similitud para alineaciones de proteínas fueron: (M,I,L,V), (F,W,Y), (G,A), (S,T), (R,K,H), (E,D), (N,Q). Los valores que están indicados entre el ADNc y secuencias de proteína de Arabidopsis representan los valores más bajos y más altos encontrados con todas la combinaciones.
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A. Nombre de gen: AtCKX1 (proteína similar a la citoquinina oxidasa y Arabidopsis thaliana 1, SEQ ID No1)
Localización en la base de datos (número de acceso, localización en bac): AC002510, cromosoma Arabidopsis thaliana II sección 225 de 255 de la secuencia completa. Secuencia desde los clones T32G6.
ORF predicho en la base de datos:
15517..16183, 16415..16542, 16631..16891, 16995..17257, 17344..17752
La secuencia de ADNc AtCKK1 está listada en SEG ID No 25.
Secuencia de proteína predicha: SEQ ID No 2
Homologías
% de identidad con ADNc de Z. mays:
31.5% (Dnastar/MegAlign-método Clustal)
% de similitud con proteína de Z. mays:
32.2% (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de identidad con otros ADNc de Arabidopsis (rango):
38.2% (AtCKX2) -54.1% (AtCKK6) (Dnastar/MegAlign-método Clustal)
% de similitud con otras proteínas de Arabidopsis (rango):
37.1% (AtCKX2) -58.1% (AtCKX6) (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
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B. Nombre de gen: AtCKX2 (proteína 2, SEG ID No. 3 similar a citoquinina oxidasa de Arabidopsis thliana).
Localización en base de datos (No. de acceso, localización en bac): AC005917, cromosoma 2 de Arabidopsis thaliana sección 113 de 255 de la secuencia completa. Secuencia de los clones F27 F23-F3 P11.
ORF predicho en la base de datos:
Complemento 40721..41012, 41054..41364, 41513..41770, 42535..42662, 43153..4371
Por favor nótese: La secuencia ADNc identificada por el inventor utilizando el programa de predicción de genes NetPlantGene (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) fue diferente que el anotado en la base de datos. Con base en la nueva secuencia de ADNc el ORF predicho en la base de datos fue revisado:
Complemento Y 40721..41012, 41095..41364, 41513..41770, 42535..42662, 43153..43711
La secuencia de proteína codificada por este ADNc se lista en SEG ID No. 4. El ADNc de AtCKX2 fue clonado por RT-PCR a partir de RNA total de tejido de planta transgénica AtCKX2 con el sistema de una etapa RT-PCR (Qiagen, Hilden, Alemania), y se secuenció utilizando un conjunto de reacción de secuenciación cíclica ABI PRISM Big Dye Terminator (Perkin Elmer Applied Biosystems Division). Esto confirmó que la secuencia ADNc identificada y predicha por el inventor era correcta. La nueva secuencia ADNc AtCKX2 está listada en SEQ ID No. 26. Un fragmento 84-bp correspondiente a los nucleótidos 1171 a 1254 del ADNc AtCKX2 está listado en SEQ ID No31. La secuencia de péptidos correspondiente de esta secuencia ADNc 84-bp está listada como SEQ ID No32.
Homologías
% de identidad con ADNc de Z. mays:
38.4% (Dnastar/MegAlign-método Clustal)
% de similitud con proteína de Z. mayz:
37.5% (Dnastar/MegAlign-método Clustal)
% de identidad con otros ADNc de Arabidopsis (rango):
34.9% (AtCKX6)-64.5% (AtCKX4) (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de similitud con otras proteínas de Arabidopsis (rango):
36.5% (AtCKX6)-66.1% (AtCKX4) (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
\vskip1.000000\baselineskip
C. Nombre de gen: AtCKX3 (proteína 3, SEG ID No. 5 similar a citoquinina oxidasa de Arabidopsis thaliana)
Localización en la base de datos (número de acceso, localización en bac): AB024035, ADN genómico de Arabidopsis thaliana, cromosoma 5, clon P1: MHM17, secuencia completa.
No hay predicción del ORF en base de datos.
El gen fue identificado por el inventor utilizando varios programas de predicción de génes incluyendo GRAIL (ftp://arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail), Genscan (http://CCR-081.mit.edu/GEN SCAN.html) and NetPlantGene
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).
Complemento, 43756..44347, 44435..44562, 44700..44966, 45493..45755, 46200..46560. La nueva secuencia
AtCKX3 ADNc identificada por el inventor esta listada como SEQ ID No. 27.
Secuencias de proteínas predicha con base en la predicción propia ORF: SEQ ID No. 6.
Homologías
% de identidad con ADNc de Z. mays:
38.7% (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de similitud con proteína de Z maíz:
39.2% (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de identidad con otros ADNc de Arabidopsis (rango):
38.8% (AtCKX6) -51.0% (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de similitud con otras proteínas de Arabidopsis (rango):
39.9 (AtCKX6)-46.7% (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
\vskip1.000000\baselineskip
D. Nombre de gen: AtCKX4 (proteína 4, SEQ ID No 7 similar a citoquinina oxidasa de Arabidopsis thaliana).
Localización en base de datos (número de acceso, localización en bac): 1) AL079344 cromosoma 4 ADN de Arabidopsis thaliana, clon BAC VÉASE T16L4 (proyecto ESSA).
2) AL161575, cromosoma 4 ADN de Arabidopsis thaliana, contiguo a fragmento No. 71.
\newpage
ORF predicho en la base de datos:
1) 1) 76187..76814, 77189..77316, 77823..78080, 78318..78586, 78677..78968
2) 101002..101629, 102004..102131, 102638..102895, 103133..103401, 103492..103783.
La secuencia de ADNc AtCKX4 aparece listada en SEQ ID No. 28.
Secuencia de proteína predicha: SEG ID No. 8.
Homologías
% de identidad con ADNc de Z. mays:
41.0% (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de similitud con proteína de Z. mays:
41.0% (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de identidad con otros ADNsc de Arabidopsis (rango):
35.2% (AtCKX6) -64.5% (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de similitud con otras proteínas de Arabidopsis (rango):
35.1% (AtCKX6) -66.1% (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign-m'étodo Clustal).
\vskip1.000000\baselineskip
E. Nombre de gen: AtCKX5 (proteína 5, SEQ ID No. 9 similar a citoquinina oxidasa de Arabidopsis thaliana).
Localización en base de datos (número de acceso, localización en bac): AC023754, F1 B16, secuencia completa, cromosoma 1.
No hay predicción del ORF en la base de datos.
El gen fue identificado por los inventores utilizando diversos programas de predicción de genes incluyendo GRAIL (ftp://arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail), Genscan (http://CCR-081.mit.edu/GEN SCAN.html) y NetPlantGene
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).
43756..44347, 44435..44562, 44700..44966, 45493..45755, 46200..46560 La nueva secuencia de ADNc AtCKX5 identificada y predicha por el inventor está listada en SEQ ID No.27. La secuencia de proteína predicha para este ADNc está listada en SEQ ID No. 10. Un segundo codón de inicio potencial ATG está presente 9 nucleótidos corriente arriba en la secuencia genómica. No es claro cual de estos dos codones de inicio codifica el primer aminoácido de la proteína. Por lo tanto, un segundo potencial AtCKX5 ADNc que se inicia en este codón corriente arriba también está listado en esta invención como SEQ ID No. 34. La secuencia genómica correspondiente está listada como SEQ ID No. 33 y la proteína codificada como SEQ ID No. 35.
Homologías
% de identidad con ADNc de Z. mays:
39.1% (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de similitud con proteína de Z. mays:
36.6% (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de identidad con otros ADNc de Arabidopsis (rango):
40.1% (AtCKX2) -44.0% (AtCKX3) y (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de similitud con otras proteínas de Arabidopsis (rango):
41.6% (AtCKX4) -46.4% (AtCKX6) y (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
\newpage
F. Nombre de gen: AtCKX6 (proteína 6, SEQ ID No. 11similar a citoquinina oxidasa de Arabidopsis thaliana).
Localización en base de datos (número de acceso, localización en bac): AL163818, cromosoma 3 de ADN de Arabidopsis thaliana, clon P1MAA21 (proyecto ESSA).
ORF predicho en la base de datos:
46630..47215,47343..47470,47591 ..47806, 47899..48161, 48244..48565 La secuencia de ADNc AtCKX6 está listada como SEQ ID No. 30.
Secuencia de proteína predicha: SEQ ID No. 12.
Homologías
% de identidad con ADNc de Z. mays:
37.3% (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de similitud con proteína de Z. mays:
36.1% (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de identidad con otros ADNc de Arabidopsis (rango):
34.9% (AtCKX2) -54.1% (AtCKX1) (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de similitud con otras proteínas de Arabidopsis (rango):
35.1% (AtCKX4) -58.1% (AtCKX1) (Dnastar/MegAlign-método Clustal).
Los genes AtCKX3 y AtCKX5 no fueron anotados como citoquinina oxidasas putativas en la base de datos y no se dieron ORF para estos genes. Además, el ORF (y consecuentemente las estructuras de las proteínas) predichas para AtCKX2 fueron diferentes de nuestra propia predicción y nuestra predicción fue confirmada por el secuenciamiento del ADNc AtCKX2.
Una comparación de la estructura genética de los genes AtCKX de Arabidopsis 1 a 4 y del gen CKX de maíz se muestra en la Figura 1.
Las proteínas predichas codificadas por los genes AtCKX de Arabidopsis mostraron entre 32% y 41% de similitud en secuencia con la proteína de maíz, mientras que mostraron entre 35% y 65% de similitud de secuencia entre uno y otro. Debido a esta conservación reducida de la secuencia, no es claro a priori si los genes AtCKX de Arabidopsis codifican proteínas con actividad de citoquinina oxidasa. Una alineación de las proteínas predichas AtCKX de Arabidopsis 1 a4 y el gen CKX de maíz se muestra en la Figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Plantas transgénicas que sobreexpresan AtCKX1 mostraron una actividad incrementada de citoquinina oxidasa y una morfología alterada de la planta 1. Descripción del proceso de clonación
Los siguientes cebadores fueron utilizados para amplificar por PCR el gen AtCKX1 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para clonar están en minúscula):
Secuencia de cebador 5':primer: cggtcgacATGGGATTGACCTCATCCTTACG (SEQ ID No:13).
Secuencia del cebador 3':primer gcgtcgacTTATACAGTTCTAGGTTTCGGCAGTAT (SEQ ID No: 14).
Un fragmento de PCR 2235-bp, amplificado por estos cebadores fue insertado en el sitio Sal I de pUC19. El inserto fue secuenciado y se confirmó que el producto de amplificación de PCR no contenía mutaciones. El fragmento Sall/Sall de este vector fue subclonado en el sitio Sall corriente abajo de un promotor 35 SCaMV modificado (que llevaba tres secuencias de operador de tetraciclina) en el vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et al., 1992). El constructor resultante fue introducido en tabaco y Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación estándar.
2. Análisis molecular de las líneas transgénicas
Varias líneas transgénicas fueron identificadas tales que sintetizan el transcripto AtCKX1 a niveles altos (Figura 3). Las líneas transgénicas que expresan el transcripto AtCKX1 también mostraron actividad de citoquinina oxidasa incrementada según se determinó mediante un ensayo estándar de la actividad de la citoquinina oxidasa con base en la conversión de [2-^{3}H]iP a adenina como ha sido descrito (Motyka et al., 1996).
Esto se ejemplifica para dos líneas de tabaco y dos de Arabidopsis en la tabla 6. Este resultado prueba que el gen AtCKX1 codifica una proteína con actividad de citoquinina oxidasa.
TABLA 6 Actividad de la citoquinina oxidasa en tejidos de plantas transgénicas AtCKX1
17
3. Descripción genotípica de las líneas transgénicas. 3.1 En tabaco
Las plantas tenían un fenotipo enano con dominancia apical reducida (Figura 7A, B y C) e incrementaron la producción de raíces (Figura 8).
Cinco categorías de fenotipo
1)
fuerte- 2 clones.
2)
intermedio- 3 clones.
3)
débil- 4 clones.
4)
plantas altas (como WT), con gran inflorescencia- 5 clones
5)
similar a WT, 9 clones.
Altura (véase figura 7B y C)
- WT: entre 100-150 cm
- débil: aproximadamente 75 cm
- intermedio: aproximadamente 40-45 cm (tallo principal aproximadamente 25 cm pero con sobrecrecimiento por ramificaciones laterales).
- fuerte: aproximadamente 10 cm
Los transgénicos AtCKX1-48 y AtCKKI-50 desplegaron un fenotipo fuerte. Abajo están las mediciones de la elongación de los tallos en comparación con las plantas WT:
18
Parte experimental. Las plantas fueron cultivadas en suelo en un invernadero. Los datos fueron recolectados de por lo menos 10 plantas por línea.
Hojas (véase Figura 7 D y E)
La forma de las hojas de los expresores transgénicos AtCKX1 fue lanceolada (larga y estrecha): la proporción anchura a longitud de las hojas maduras fue reducido de 1:2 en plantas tipo silvestre a 1:3 en transgénicos AtCKX1 (Figura 7E). El número de hojas y la superficie de las hojas fue reducida en comparación con WT (véase Figura 7D). También se notó una diferencia prominente para la progresión de la senescencia de las hojas. En tabaco WT, la senescencia de las hojas comienza en las hojas más basales y lleva a una reducción uniforme del pigmento de las hojas (Figura 7E). En contraste, el envejecimiento de las hojas de plantas AtCKX1 con fuerte expresión permaneció en verde a lo largo de las venas de las hojas y se hizo amarillo en las regiones intercostales, indicando una senescencia de hojas alterada. La textura de las hojas más viejas fue más rígida.
Raíces
Plantas cultivadas in vitro que expresaban el gen altamente fueron distinguibles fácilmente de las WT por su capacidad para formar más raíces que eran más gruesas (más fuertes) (Figura 8A), Así como por formar raíces aéreas a lo largo del tallo.
La raíz primaria era más larga y el número de raíces laterales y adventicias era más alto como se ilustra en la Figura 8C para siembras que sobreexpresaban AtCKX1-50 (véase también ejemplo 9).
La curva de respuesta a la dosis de la inhibición del crecimiento de raíces por citoquinina exógena mostró que las raíces de las siembras transgénicas eran más resistentes a la citoquinina que las raíces WT (Figura 8D). La resistencia de los transgénicos AtCKX1 al iPR fue menos marcada que para AtCKX2, lo cual es consistente con los cambios más pequeños en la citoquininas tipo iP en estas ultimas (véase Tabla 10).
Se observó un gran incremento en la biomasa de raíces para plantas adultas cultivadas en suelo (véase Figura 8B para una planta cultivada en suelo durante cuatro a cinco meses) a pesar del hecho de que el crecimiento de las partes aéreas de la planta se vio altamente reducido.
Distancia internodal
\bullet Fenotipo intermedio: el quinto internodo por debajo de la inflorescencia tiene aproximadamente 2.5 cm de longitud y el noveno internodo tenía aproximadamente 0.5 cm de longitud en comparación con 5 cm y 2 cm para la longitud del quinto y noveno internodo respectivamente, en plantas WT.
\bullet Fenotipo fuerte: planta AtCKX1-50. La longitud del vigésimo internodo de la parte inferior medido el día 131 después de la germinación era 1,3 \pm 0.4 mm comparado con 39,2 \pm 3,8 mm para WT.
Dominacia apical y ramificación
Se formaron más ramificaciones laterales que indicaban una dominancia apical reducida en comparación con las plantas WT durante el crecimiento vegetativo (véase Figura 9). Las plantas laterales hicieron sobrecrecer el tallo principal, alcanzando una altura de 40-45 cm para expresores intermedios AtCKX1. Incluso aparecieron ramificaciones secundarias. Sin embargo, las yemas no se liberaron completamente de la dominancia apical, esto es, los brotes laterales no continuaron realmente su desarrollo. La dominación apical reducida podría deberse a la producción reducida de auxina por el meristema apical de los brotes más pequeños (véase ejemplo 10).
Desarrollo reproductivo
La aparición de la floración en los transgénicos AtCKX1 fue retrasada, el número de flores y las semillas producidas por cápsula fue reducido. El tamaño de las flores no fue alterado en las plantas transgénicas y el peso de las semillas individuales fue comparable con el peso de las semillas de las plantas tipo silvestre. Los datos para dos transgénicos representativos AtCKX1 se resumen más abajo:
A. Inicio de la floración
19 
\vskip1.000000\baselineskip
Parte experimental
Datos recolectados para por lo menos diez plantas por línea. La elongación completa de la primera flor fue definida como el inicio de la floración. DAG = días después de la germinación.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Número de capsulas de semillas por planta
20
Parte experimental. El número de cápsulas de semillas fue determinado en por lo menos cinco plantas diferentes. Por favor nótese que estas plantas fueron cultivadas bajo condiciones de invernadero durante el período de invierno. Esto afecta negativamente el número de flores que se forman, en particular en los clones transgénicos. Sin embargo, el cuadro general de que forman un número reducido de flores es correcto, n.d., no determinado.
\vskip1.000000\baselineskip
C. Rendimiento de semillas/cápsula (mg)
21
Parte experimental. El rendimiento de semillas fue determinado para por lo menos doce cápsulas de semillas. El tamaño de las cápsulas de semillas fue muy variable, por lo tanto las desviaciones estándar fueron grandes. n.d., no determinado.
\vskip1.000000\baselineskip
D. Peso de 100 semillas (mg)
22
Parte experimental: La biomasa de semillas fue determinada como el peso de 100 semillas de por lo menos cinco cápsulas de semillas diferentes. n.d., no determinado.
\global\parskip0.930000\baselineskip
3.2 En Arabidopsis
- El inicio de la germinación fue el mismo que para WT.
- El sistema radicular total fue agrandado y el número de raíces laterales y raíces adventicias fue potenciado (véase Figura 4A a D).
- El crecimiento de los órganos aéreos fue reducido resultando en un fenotipo enano (véase Figura 4E y F) y la biomasa de las hojas fue reducida. La formación de hojas y flores se retrasó.
- El ciclo de vida fue más largo comparado con WT y el rendimiento de semillas fue más bajo comparado con WT.
Los siguientes datos morfométricos ilustran estos fenotipos:
\vskip1.000000\baselineskip
Desarrollo de raíces A. Longitud total del sistema radicular
23 
\vskip1.000000\baselineskip
B. Longitud de raíz primaria
24 
\vskip1.000000\baselineskip
C. Longitud de raíces laterales (LR)
25 
\vskip1.000000\baselineskip
D. Longitud de raíces adventicias
26 
\vskip1.000000\baselineskip
E. Número de raíces laterales (LR)
27 
\vskip1.000000\baselineskip
F. Número de raíces adventicias (AR)
28
Parte experimental: Las mediciones se llevaron a cabo en plantas ocho días después de la germinación in Vitro sobre medio MS. Por lo menos se registraron 17 plantas por línea.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Desarrollo de Brotes A. Superficie de hojas
29
Parte experimental: Se midió el área superficial de las hojas de hojas de roseta principales formadas después de 30 días después de la germinación. Se analizaron tres plantas por clon.
Desarrollo reproductivo
Inicio de la floración.
30
Parte experimental. Las plantas se cultivaron bajo condiciones de invernadero. Por lo menos se analizaron 13 plantas por clon. DAG = días después de la germinación.
Conclusión: El análisis de las plantas transgénicas AtCKX1 de Arabidopsis confirmó sobradamente resultados obtenidos del tabaco e indican la naturaleza general de las consecuencias de un contenido de citoquinina reducido. El sistema radicular total fue agrandado (longitud total de raíces se incrementó aproximadamente 110-140% en los transgénicos AtCKX1), los brotes se desarrollaron más lentamente (floración retardada) y la biomasa de hojas fue reducida. El rendimiento de semillas fue más bajo en los transgénicos también (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Plantas transgénicas que sobreexpresan AtCKX2 mostraron actividad de citoquinina oxidasa incrementada y morfología de la planta alterada 1. Descripción del proceso de clonación
Los siguientes cebadores fueron utilizados para amplificar por PCR del gen AtCKX2 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para clonación están en letras mayúsculas):
Secuencia de cebador 5': gcggtaccAGAGAGAGAAACATAAACAAATGGC (SEQ ID NO: 15).
Secuencia de cebador 3': gcggtaccCAATTTTACTTCCACCAAAATGC (SEQ ID NO:16).
Un fragmento de PCR 3104-bp, amplificado por estos cebadores, fue insertado en el sitio Kpnl de pUC19. El inserto fue secuenciado para verificar que no se introdujeron diferencias a la secuencia publicada por el procedimiento de PCR. El fragmento Kpnl/Kpnl de este vector fue subclonado en el sitio Kpnl corriente abajo de un promotor CaMV 35S modificado (que llevaba tres secuencias de operador tetraciclina) en el vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et al., 1992) el constructor resultante fue introducido en tabaco y Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación estándar.
2. Análisis molecular de las líneas transgénicas
Fueron identificadas varias líneas transgénicas que sintetizan el transcripto AtCKX2 a niveles altos (Figura 6). Las líneas transgénicas que expresan el transcripto AtCKX2 también mostraron una actividad incrementada de citoquinina oxidasa. Esto es ejemplificado por dos líneas de tabaco y tres de Arabidopsis en la Tabla 7. Este resultado prueba que el gen AtCKX2 codifica una proteína con actividad de citoquinina oxidasa.
TABLA 7 Actividades de citoquinina oxidasa en tejidos de plantas transgénicas AtCKX2
31
3. Descripción fenotípica de las líneas transgénicas 3.1 En tabaco (véase Figura 7 a 10)
Tres categorías de fenotipo:
1)
Fuerte-15 clones (similar al fenotipo intermedio de AtCKX1).
2)
Débil-6 clones.
3)
Otros-similar a plantas WT, 7 clones.
Partes aéreas de plantas
Las observaciones concernientes a la altura, distancia internodal, ramificación, forma de hojas y amarillamiento de las plantas fueron similares a las de los transgénicos AtCKX1 con algunas diferencias cuantitativas menores en general en que las características de enanismo fueron más severas en transgénicos AtCKX1 que en transgénicos AtCKX2 (compárese plantas AtCKX1 con plantas AtCKX2 en la Figura 7A y B). Esto se ilustra más abajo para las mediciones de elongación del tallo y de la distancia internodal de clones con fuerte fenotipo AtCKX2-38 y AtCKX2-40.
Elongación de tallo
32
Parte experimental: Las plantas fueron cultivadas en el suelo en un invernadero. Los datos fueron recolectados a partir de por lo menos 10 plantas por línea.
Distancia internodo 
\vskip1.000000\baselineskip
33 
\vskip1.000000\baselineskip
Parte experimental: La longitud del vigésimo internodo a partir de la parte inferior fue medida en el día 131 después de la germinación.
Raíces
Las plantas cultivadas in vitro que expresan altamente el gen fueron fácilmente distinguibles de las plantas WT por su capacidad para formar más raíces las cuales son más gruesas (más fuertes) así como por formar raíces aéreas a lo largo del tallo.
La raíz primaria fue más larga y el número de raíces laterales y adventicias fue más alto según se ilustra en la figura 8C para siembras que sobreexpresan AtCKX2-38 (véase también ejemplo 9).
La curva dosis-respuesta de la inhibición del crecimiento de la raíz por citoquinina exogéna mostró que las raíces de las siembras transgénicas fueron más resistentes a la citoquinina que las raíces WT (Figura 8D). La resistencia de los transgénicos AtCKX1-28 a iPR fue menos marcada que para AtCKX2-38, lo cual es consistente con los cambios más pequeños en la citoquininas del tipo jP en la última (véase Tabla 10).
Un incremento en el peso fresco y seco de la biomasa de raíz de las líneas TO de plantas transgénicas AtCKX2 comparadas con WT se observó para plantas cultivadas en el suelo, tal como se ilustra en la siguiente tabla:
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34 
\vskip1.000000\baselineskip
Parte experimental: Seis plantas WT y seis líneas independientes T0 del clon 35S:: AtCKX2 fueron cultivadas en suelo. Después de la floración el sistema radicular fue lavado con agua, el suelo fue eliminado tanto como fue posible y se midió el peso fresco y el peso seco.
Un incremento en peso fresco y peso seco de la biomasa radicular también se observó para la progenie F1 de los transgénicos AtCKX2 cultivados en hidropónico en comparación con WT, como se ilustra en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
35 
\vskip1.000000\baselineskip
Parte experimental: Las plantas cultivadas en suelo fueron transferidas 60 días después de la germinación a un sistema hidropónico (solución de Hoagland) y se cultivaron por 60 días adicionales. La solución hidropónica fue aireada continuamente y remplazada por solución fresca cada tercer día.
En resumen, las plantas transgénicas cultivadas en solución hidropónica formaron aproximadamente 65-150% más biomasa de raíz (peso fresco) que las plantas tipo silvestre. El incremento en peso fresco fue 10-50%. Esta diferencia es posiblemente debida en parte al volumen celular más grande de los transgénicos. Esto reduce la porción relativa de paredes celulares, la cual forma el volumen de materia seca. La biomasa de brotes fue reducida a 20%-70% de los brotes tipo silvestre. La diferencia en peso fresco lleva a una desviación en la proporción brote/raíz, la cual fue aproximadamente 8 en tipo silvestre pero aproximadamente 1 en los clones transgénicos.
Conclusión
Un incremento en el crecimiento de las raíces y la biomasa fue observado para siembras transgénicas AtCKX2 y plantas adultas cultivadas bajo condiciones diferentes en comparación con los controles WT a pesar del hecho de que el crecimiento de las partes aéreas de la planta es reducido. Las diferencias cuantitativas fueron observadas entre plantas transgénicas diferentes: Los incrementos más altos en las biomasas radiculares fueron observados para los clones de expresión más fuerte.
Desarrollo reproductivo
El inicio de la floración en los transgénicos AtCKX2 fue retrasado, y se redujo el número de flores y el rendimiento en semillas por cápsula. Estos efectos fueron muy similares a los observados en las plantas transgénicas AtCKX1 pero fueron menos prominentes en las transgénicas AtCKX2, como se indica en las tablas más abajo. El tamaño de las flores no fue alterado en las plantas transgénicas y el peso de las semillas individuales fue comparable al peso de las semillas de las plantas tipo silvestre.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Inicio de floración
36
Parte experimental: Datos recolectados para por lo menos 10 plantas por línea. La elongación completa de la primera flor fue definida como inicio de la floración. DAG = días después de la germinación.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Número de cápsulas de semilla por planta
37
Parte experimental: El número de cápsulas de semillas fue determinado por lo menos para 5 plantas diferentes. Por favor, nótese que estas plantas fueron cultivadas bajo condiciones de invernadero durante el período de invierno. Esto afecta negativamente el número de flores que se forman, en particular en los clones transgénicos. Sin embargo, el cuadro general que ellas forman un número reducido de flores es correcto. n.d., no determinado.
\vskip1.000000\baselineskip
C. Rendimiento de semillas/cápsula (mg)
38
Parte experimental: El rendimiento en semillas fue determinado para por lo menos 12 cápsulas de semillas. El tamaño de las cápsulas de semillas fue muy variable, por lo tanto las desviaciones estándar fueron grandes. n.d., no determinado.
D. Peso de 100 semillas (mg)
39
Parte experimental: La biomasa de semillas fue determinada como el peso de 100 semillas de por lo menos 5 cápsulas de semillas diferentes. n,d., no determinado.
\vskip1.000000\baselineskip
3.2 En arabidopsis
Los siguientes datos morfométricos fueron obtenidos para transgénicos AtCKX2:
\vskip1.000000\baselineskip
Desarrollo de raíces A. Longitud total del sistema radicular 
\vskip1.000000\baselineskip
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
B. Longitud de raíz primaria 
\vskip1.000000\baselineskip
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
C. Longitud de raíces laterales
42 
\vskip1.000000\baselineskip
D. Longitud de raíces adventicias 
\vskip1.000000\baselineskip
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
E. Número de raíces laterales (LR) 
\vskip1.000000\baselineskip
44 
\newpage
F. Número de raíces adventicias (AR) 
\vskip1.000000\baselineskip
45 
\vskip1.000000\baselineskip
Parte experimental: Las mediciones fueron llevadas a cabo en plantas 8 d.a.g . in vitro sobre medio MS. Por lo menos 17 plantas por línea fueron registradas.
\vskip1.000000\baselineskip
Desarrollo de brotes Superficie de hojas 
\vskip1.000000\baselineskip
46
Parte experimental: Se midió el área superficial de hojas de roseta principales formadas después de 30 días después de la germinación. Se analizaron tres plantas por clon.
\vskip1.000000\baselineskip
Desarrollo reproductivo Inicio de la floración 
\vskip1.000000\baselineskip
48
Parte experimental: Las plantas fueron cultivadas bajo condiciones de invernadero. Por lo menos 13 plantas por clon fueron analizadas. DAG = días después de la germinación.
Conclusión: Los transgénicos de arabidopsis AtCKX2 habían reducido la biomasa de hojas y un fenotipo de enanismo similar a los transgénicos AtCKX1 (compare Figura 5 con Figura 4F). El sistema radicular total también se había agrandado en Arabidopsis transgénico AtCKX2. Longitud de raíz total se incrementa aproximadamente 50% en transgénicos AtCKX2. Los transgénicos AtCKX1 tiene raíces primarias más largas, más raíces laterales y forman más raíces adventicias. Los transgénicos AtCKX2 carecen del crecimiento potenciado de la raíz primaria pero forman más raíces laterales y raíces adventicias que WT.
\vskip1.000000\baselineskip
Resumen
Los fenotipos observados para transgénicos AtCKX2 fueron muy similares pero no idénticos a los transgénicos AtCKX1 los cuales a su vez fueron muy similares pero no idénticos a los resultados obtenidos para los transgénicos de tabaco. Esto confirma la naturaleza general de las consecuencias del contenido reducido de citoquinina en estas dos especies de plantas y por lo tanto, pueden esperarse fenotipos similares en otras especies de plantas también. La principal diferencia entre tabaco y Arabidopsis es la carencia de crecimiento de raíces primarias potenciadas en plantas que sobreexpresan AtCKX2 (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Plantas transgénicas que sobreexpresan AtCKX3 mostraron actividad de citoquinina oxidasa incrementada y alteraron la morfología de la planta 1. Descripción del proceso de clonación
Los siguientes cebadores fueron utilizados para amplificar por PCR el gen AtCKX3 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas utilizadas para clonación están en minúscula):
Secuencia de cebador 5' primer gcggtaccTTCATTGATAAGAATCAAGCTATTCA
(SEQ ID NO: 17).
Secuencia de cebador 3'primer gcggtaccCAAAGTGGTGAGAACGACTAACA
(SEQ ID NO: 18).
Un fragmente DPCR 3397-bp, producido por esta amplificación por PCR, fue insertado en el sitio Kpnl del pBluescript. El inserto fue secuenciado para confirmar que el producto de PNR no tenía cambios de secuencia comparado con el gen. El fragmento Kpnl/Kpnl de este vector fue subclonado en el sitio Kpnl corriente abajo de un promotor CaMV 35S modificado (portador de tres secuencias operadoras de tetraciclina) en el vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et al.,1992). El constructo resultante fue introducido en tabaco y Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación estándar.
2. Análisis molecular de las líneas transgénicas
Varias líneas transgénicas de tabaco fueron identificadas que sintetizaron el transcripto AtCKX3 a niveles altos (figura 11A). Las líneas de tabaco transgénico que expresaban el transcripto AtCKX3 también mostraron una actividad incrementada de citoquinina oxidasa. Esto es ejemplificado para tres plantas en la tabla 8. Esto prueba que el gen AtCKX3 codifica una proteína con actividad de citoquinina oxidasa.
TABLA 8 Actividad de citoquinina oxidasa en tejidos de plantas transgénicas AtCKX4
49
3. Análisis fenotípico de la planta
Los fenotipos generados por sobreexpresión del gen AtCKX3 en tabaco y Arabidopsis fueron similares básicamente a las de las plantas que expresan AtCKX1 y AtCKX2, esto es, una formación de raíz y enanismo potenciados. Sin embargo, las sobreexpresión del gen AtCKX3 en tabaco resultó en un fenotipo más fuerte comparado con AtCKX2. En este sentido la expresión de AtCKX3 fue más similar a la sobreexpresión de AtCKX1.
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Ejemplo 6
Plantas transgénicas que sobreexpresan AtCKX4 mostraron actividad incrementada de citoquinina oxidasa en morfología alterada de la planta 1. Descripción del proceso de clonación
Los siguientes cebadores fueron usados para amplificar por PCR el gen AtCKX4 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para clonación están en minúsculas):
Secuencia del cebador 5': primer: gcggtaccCCCATTAACCTACCCGTITG
(SEQ ID NO:19).
Secuencia del cebador 3': primer: gcggtaccAGACGATGAACGTACTTGTCTGTA
(SEQ ID NO:20).
Un fragmento de PCR 2890-bp, producido por esta amplificación por PCR, fue insertado en el sitio Kpnl del pBluescript. El inserto fue secuenciado para confirmar que el producto de PCR no tenía cambios de secuencia comparado con el gen. El fragmento Kpnl/Kpnl de este vector fue subclonado en el sitio Kpnl corriente abajo de un promotor CaMV 35S modificado (portador de tres secuencias operadoras de tetraciclina) en el vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et al., 1992). El constructo resultante fue introducido en tabaco y Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación estándar.
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2. Análisis molecular de las líneas transgénicas
Varias líneas transgénicas de tabaco sintetizaron el transcripto AtCKX4 a niveles altos (Figura 11 B.). Las líneas transgénicas que expresaban el transcripto AtCKX4 también mostraron actividades citoquinina oxidasa incrementada. Esto es ejemplificado por 3 líneas de Arabidopsis y 3 de tabaco en la Tabla 9. Este resultado muestra que el gen AtCKX4 codifica una proteína con actividades citoquinina oxidasa.
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TABLA 9 Actividades citoquinina oxidasa en tejidos de plantas transgénicas AtCKX4
50 
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Por encima de todo, los datos muestran que los valores aparentes K_{m}, para las cuatro citoquinina oxidasas estuvieron en el rango de 0.2 a 9.5 \muM con iP como sustrato, lo cual demuestra adicionalmente que las proteínas codificadas por AtCKX1 a 4 son en efecto enzimas citoquinina oxidaxas como se describe aquí.
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3. Análisis fenotípico de plantas
Los fenotipos generados por la sobrexpresión del gen AtCKX4 en tabaco y Arabidopsis fueron similares básicamente a los de las plantas que expresan AtCKX1 y AtCKX2, esto es, formación de raíces potenciada, dominación apical reducida, enanismo y amarillamiento de las regiones intercostales en hojas más viejas de tabaco. Un fenotipo adicional en tabaco fue hojas lanceoladas (proporción longitud a anchura alterada).
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Observaciones generales sobre las plantas de tabaco que sobreexpresan AtCKX
En general, el análisis fenotípico demostró que la sobreexpresión del gen AtCKX causó alteraciones de desarrollo drásticas en los brotes y en el sistema radicular de la planta en tabaco, incluyendo el desarrollo potenciado del sistema radicular y el enanismo de la parte aérea de la planta. Otros efectos tales como la senescencia alterada de las hojas, formación de raíces adventicias en tallos, y otros fueron observados también como se divulga aquí. Las alteraciones fueron muy similares pero no idénticas para los diferentes genes. En tabaco, las sobreexpresiones de AtCKX1 y AtCKX3 fueron similares como en AtCKX2 y AtCKX4. En general, los dos primeros mostraron una más alta expresión de los cambios, particularmente en el brote. Por lo tanto, un gen de citoquinina oxidasa en particular puede ser preferido para alcanzar los fenotipos que se describen en las realizaciones de esta invención.
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Ejemplo 7
Clonación del gen AtCKX5
Los siguientes cebadores fueron utilizados para amplificar por PCR el gen AtCKX5 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para la clonación están en minúscula):
Secuencia del cebador 5': ggggtaccTTGATGAATCGTGAAATGAC
(SEQ ID NO: 21)
Secuencia del cebador 3': ggggtaccCTTTCCTCTTGGTTTTGTCCTGT
(SEQ ID NO: 22)
La secuencia del cebador 5' incluye los dos codones de inicio potenciales de la proteína AtCKX5, el codón de inicio máximo 5' está subrayado y un segundo AtG está indicado en itálicas. Un fragmento de PCR 2843-bp, producido por esta amplificación por PCR, fue insertado en un producto cerrado en un extremo en un vector de clonación pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen).
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Ejemplo 8
Clonación del gen AtCKX6
Los siguientes cebadores fueron utilizados para amplificar por PCR el gen AtCKX6 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para la clonación están en minúsculas):
Secuencia de cebador 5' gctctagaTCAGGAAAAGAACCATGCTTATAG
(SEQ ID NO: 23)
Secuencia de cebador 3': gctctagaTCATGAGTATGAGACTGCCTTTTG
(SEQ ID NO: 24)
Un fragmento de PCR 1949-bp, producido por esta amplificación de PCR, fue insertado en un producto de extremo cerrado pCRBlunt II-TOPO como vector de clonación (Invitrogen)
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Ejemplo 9
Prueba de crecimiento de siembras de tabaco que demostraron vigor temprano de transgénicos AtCKX
Semillas de transgénicos que sobreexpresaban AtCKX1-50 y AtCKX2-38 y de tabaco WT fueron cultivadas in vitro sobre medio MS, puestos en un cuarto de cultivo 4 días después del tratamiento por frío y germinaron después de 6 días. Las observaciones sobre el crecimiento de las siembras fueron hechas 10 días después de la germinación (véase también figura 8C) y se resumen más abajo. Por lo menos 20 individuos fueron registrados por clon. Datos similares han sido obtenidos en otros dos experimentos.
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A. Longitud total del sistema radicular
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B. Longitud de raíz primaria
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C. Longitud de raíces laterales
53 
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D. Longitud de raíces adventicias 
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54 
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E. Número de raíces laterales 
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F. Número de raíces adventicias (AR) 
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Plantas AtCKX1 y AtCKX2, observaciones generales
Las siembras de plantas de tabaco que sobreexpresan AtCKX1 y AtCKX2 tenían 60% más de raíces adventicias y 3 veces más de raíces laterales que las plantas de control no transformadas 10 días después de la germinación. La longitud de la raíz primaria se incrementó en aproximadamente en 70%. Esto - con más y más largas raíces laterales y raíces secundarias, resultó en un incremento de 70-100% de la longitud radicular total. Estos resultados mostraron que la sobreexpresión de la citoquinina oxidasa potencia el crecimiento y desarrollo tanto de la raíz principal como de las raíces adventicias, resultando en un vigor temprano.
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Ejemplo 10
Análisis histológico de morfología de plantas alteradas en plantas de tabaco que sobreexpresan AtCKX1
El análisis microscópico de diferentes tejidos reveló que los cambios morfológicos en transgénicos AtCKX son reflejados por cambios distinguibles en número de células y rata de formación de células (véase figura D). El meristema apical del brote (SAM) de transgénicos AtCKX1 fue más pequeño que en el tipo silvestre y más pocas células ocupan el espacio entre la zona central y la zona periférica de la formación del órgano lateral, pero las células fueron del mismo tamaño (figura 10A). El número reducido de células y tamaño de las SAM como consecuencia del contenido reducido de citoquinina indica que las citoquininas juegan un papel en el control de proliferación de SAM. No se presentaron cambios obvios en el patrón de diferenciación, sugiriendo que la organización espacial de las zonas de diferenciación SAM es principalmente independiente del número de células y de la concentración local de citoquinina. El patrón general de tejido de las hojas en sobreexpresión de citoquinina oxidasa no cambió. Sin embargo, el tamaño del floema y el xilema fue significativamente reducido (figura 10B). En contraste, el tamaño promedio de células del parénquima y de las células epidérmicas se incrementó de 4 a 5 veces (figura 10 C, D). Nuevas células de transgénicos AtCKX1 se forman a 3-4% de la rata de las hojas de tipo silvestre y el número final de hojas fue estimado en el rango de 5-6% del tipo silvestre. Esto indica un absoluto requerimiento de citoquinina en hojas para mantener el ciclo de división celular. Ni el tamaño de las células ni la forma de las células de los órganos florales fueron alterados y el rendimiento en semillas por cápsulas fue similar en el tipo silvestre y en plantas transgénicas AtCKX. La población celular de meristemas de raíz de las plantas transgénicas AtCKX1 se agrandó aproximadamente cuatro veces y el número de células tanto en la columnela central como en la lateral fue potenciado (figura 10 E, F), El diámetro final de la raíz se incrementó en un 60% debido a un diámetro incrementado en todos los tipos de raíz de células de la raíz. Los patrones de raíces radiales fueron idénticos en el tipo silvestre y en transgénicos, con excepción, de que frecuentemente se notó una cuarta capa de células de cortex en la raíces transgénicas (figura 10G). El número de células incrementado y la longitud celular ligeramente reducida índica que el crecimiento radicular potenciado es debido a un número incrementado de células de ciclización más que al crecimiento incrementado de las células. En la presencia de un contenido disminuido de citoquinina, las células del meristema de la raíz deben sufrir rondas adicionales de mitosis antes de que salgan del meristema y comiencen a elongarse. La salida del meristema es por lo tanto regulada por un mecanismo que es sensible a las citoquininas. Aparentemente, las citoquininas tienen un papel regulador negativo en el meristema de la raíz y las concentraciones de citoquinina tipo silvestre son inhibidoras para el desarrollo de un sistema radicular máximo. Por lo tanto, al reducir el nivel de citoquininas activas sobreexpresando las citoquininas oxidasas estimula al desarrollo de la raíz, lo que resulta en un incremento en el tamaño de la raíz con más raíces laterales y adventicias en comparación con las plantas WT.
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Ejemplo 11
Las plantas de tabaco que sobreexpresan AtCKX1 y AtCKX2 tenían un contenido de citoquinina reducido
Entre los 16 diferentes metabolitos de citoquinina que fueron medidos, el cambio más grande ocurrió en la citoquininas de tipo iP sobrexpresadores AtCKX2 (tabla 10): El descenso general en el contenido de citoquininas tipo iP es más pronunciado en plantas que expresan AtCKX2 que en transgénicos AtCKX1. Los transgénicos AtCKX1 mostraron un fenotipo más fuerte en el brote. No se sabe qué metabolito de la citoquinina es relevante para los diferentes ensayos que fueron analizados. Puede ser que diferentes formas de citoquinina jueguen papeles diferentes en los diversos procesos de desarrollo. Se notaron alteraciones menores para citoquininas tipo Z, las cuales podrían ser debidas a una diferente accesabilidad del sustrato o a una especificidad del sustrato más baja de la proteína. El contenido total de metabolitos iP y Z en clones transgénicos individuales estuvo entre 31% y 63% del tipo silvestre. La reserva en citoquinina de los O-glucosidos también disminuyó en los transgénicos (tabla 10). La concentración de N-glucosidos y citoquininas tipo DHZ fue muy baja y no fue o no fue marginalmente alterada en siembras transgénicas (datos no mostrados).
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(Tabla pasa a página siguiente)
57
Ejemplo 12
Los experimentos de injerto mostraron que el enanismo y el desarrollo de raíces potenciado debido a la sobreexpresión de AtCKX está confinado a los tejidos transgénicos
Para investigar cuales efectos fenotípicos de la sobreexpresión de citoquinina oxidasa están restringidos a los tejidos que se expresan, esto es, si son ensayos autónomos en células u órganos, se llevaron a cabo experimentos de injerto. Se hicieron injertos recíprocos entre una planta de tabaco transgénica AtCKX2 y una planta de tabaco UVT. La planta transgénica utilizada en este experimento fue AtCKX2.38, la cual desplegó un fuerte fenotipo caracterizado por crecimiento potenciado de raíces y desarrollo reducido de las partes aéreas de la planta. Como se describe en los ejemplos 3 a 6, estos fueron dos importantes fenotipos que resultaron de la sobreexpresión de citoquinina oxidasa en tabaco y Arabidopsis.
Las plantas tenían aproximadamente 15 cm de altura cuando fueron injertadas y la unión del injerto sucedió a aproximadamente 10 cm por encima del suelo. La figura 12 muestra plantas 15 semanas después del injerto. Los principales resultados fueron que:
(i) El fenotipo aéreo de un scion WT injertado sobre una raíz de reserva transgénica fue similar al injerto de control WT (igual al WT scion sobre raíz de reserva WT). De manera importante, esto mostró que la sobreexpresión del transgen AtCKX2 en la reserva de raíz no indujo el enanismo de las partes aéreas no transgénicas de la planta (véase figura 12 A). El crecimiento de raíces mejorado de la reserva de raíces transgénicas fue mantenido, indicando que el crecimiento radicular mejorado de los transgénicos AtCKX es autónomo y no depende del brote transgénico AtCKX (figura 12C). De manera interesante, los sciones WT injertados sobre las reservas de raíz transgénicas lucían más saludables y estaban más desarrollados. De forma notable, la senescencia de las hojas basales se retrasó en estas plantas (véase figura 12 A); (ii) el scion transgénico injertado sobre la reserva de raíz WT se mostró similar a la parte aérea de la planta transgénica de la cual era derivado, esto es, el fenotipo de enanismo del brote también es autónomo y no depende del crecimiento mejorado de la raíz (véase figura 12B).
Además de la mejor apariencia antes mencionada de los brotes WT injertados sobre una raíz de reserva transgénica, la formación de raíces adventicias sobre la parte basal de los brotes WT fue notable (figura 12D, planta de la derecha). La formación de raíces adventicias también se presentó en el tallo de los transgénicos AtCKX pero no sobre los tallos de los injertos de control WT (figura 12D, planta de la izquierda) por lo tanto parece ser un comportamiento no autónomo.
En resumen, se divulga en esta invención que la formación potenciada de raíces y el enanismo del brote en tabaco que sobreexpresa AtCKX son comportamientos autónomos que pueden ser desacoplados por procedimientos de injerto. Sorprendentemente, el injerto de un scion WT sobre una raíz de reserva transgénica AtCKX se traduce en plantas de crecimiento más vigoroso y en un retardo de la senescencia de las hojas.
Como alternativa al injerto, podrían usarse promotores específicos de tejidos para desacoplar los efectos fenotípicos autónomos de la sobreexpresión de citoquinina. Por lo tanto, se divulga en esta invención que la coexpresión de la citoquinina oxidasa en una manera específica para un tejido puede ser utilizada para alterar la morfología de una planta tal como el brote o su sistema radicular.
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Ejemplo 13
La sobreexpresión de un gen AtCKX bajo un promotor específico de raíz en plantas transgénicas lleva a una producción incrementada de raíces
Un gen AtCKK (véase ejemplo 4) es clonado bajo control del promotor homologo de la raíz clavata de Arabidopsis (SEQ IS NO 36), el cual es un promotor que conduce una expresión específica de la raíz. Otros promotores específicos de la raíz también pueden ser utilizados para propósitos de esta invención. Véase la tabla 5 para promotores específicos de raíz a manera de ejemplo.
Las plantas transgénicas que expresan el gen AtCKX específicamente en las raíces muestran una producción de raíces incrementadas sin afectar negativamente el crecimiento y desarrollo de las partes aéreas de la planta. Se observan efectos positivos sobre la senescencia de las hojas y el crecimiento de las partes aéreas de la planta.
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Ejemplo 14
Supresión de un gen AtCKK bajo un promotor inducido de senescencia en plantas transgénicas lleva a una senescencia retardada de las hojas y a un rendimiento de semillas mejorado
Un constructo de gen quimérico derivado de un gen AtCKX y diseñado para suprimir la expresión de genes de citoquinina oxidasa endógenos es clonado bajo el control de un promotor de senescencia inducida. Por ejemplo, los promotores derivados de genes asociados con la senescencia (SAG) tales como el promotor SGA12 pueden ser usados (Quirino et al., 2000). Las plantas transgénicas que suprimen los genes de citoquinina oxidasa endógenos específicamente en las hojas senescentes muestran una senescencia retardada de las hojas y un mayor rendimiento en semillas sin afectar negativamente la morfología y desarrollo de la planta.
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Ejemplo 15
Sobreexpresión de un gen AtCKX en los órganos reproductivos femeninos lleva a un desarrollo partenocárpico del fruto
El marco de lectura abierto de un gen AtCKX es clonado bajo el control de un promotor que confiere sobreexpresión en los órganos reproductivos femeninos tal como por ejemplo el promotor Defy9 de Antirrhinum majus o uno de sus homólogos, el cual tiene una alta especificidad en la placenta y los óvulos. Las plantas transgénicas con actividad potenciada de citoquinina oxidasa en estos tejidos muestra un desarrollo partenocárpico de frutos.
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Referencias
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<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido: sebador o sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggtaccca attttacttc caccaaaatg c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido: sebador o sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggtacctt cattgataag aatcaagcta ttca 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido: sebador o sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggtaccca aagtggtgag aacgactaac a 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido: cebador o sonda
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcggtacccc cattaaccta cccgtttg 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido: cebador o sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggtaccag acgatgaacg tacttgtctg ta 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido: cebador o sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtacctt gatgaatcgt gaaatgac 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido: cebador o sonda
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggtaccct ttcctcttgg ttttgtcctg t 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido: cebador o sonda
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctctagatc aggaaaagaa ccatgcttat ag 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido: cebador o sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctctagatc atgagtatga gactgccttt tg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
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<211> 1728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
85 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1506
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
86 
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
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<211> 1572
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip0,8cm
87 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1575
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip0,8cm
88 
\hskip0,8cm
89 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1611
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
90 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1515
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
91 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
92 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
93 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2814
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
94 
\hskip0,8cm
95 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1620
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
96 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 539
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
97 
\hskip0,8cm
98 
\hskip0,8cm
99 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
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<211> 842
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
100 
\hskip0,8cm
101

Claims (56)

1. Uso de un ácido nucléico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta para estimular el crecimiento radicular para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular.
2. Un método para estimular el crecimiento radicular o para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta seleccionada del grupo consistente de:
(a)
ácidos nucléicos que comprenden una secuencia de ADN tal como está dada por SEQ ID Nos. 3, 26 o 31, o el complemento de los mismos,
(b)
ácidos nucléicos que comprenden la secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de las SEQ ID Nos. 3, 26 o 31, o el complemento de las mismas,
(c)
ácidos nucléicos que hibridizan específicamente a cualquiera de las secuencias de las SEQ ID Nos. 3, 26 o 31 o el complemento de los mismos
(d)
ácidos nucléicos que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las SEQ ID Nos. 4 o 32, o el complemento de las mismas,
(e)
ácidos nucléicos como se define en cualquiera de (a) a (d) caracterizados porque dicho ácido nucléico es ADN, ADN genómico, ADNc, ADN o ARN sintético donde T es reemplazado por U,
(f)
un ácido nucléico que es degenerado a un ácido nucléico como el dado en cualquiera de SEQ ID Nos. 3, 26 o 31, o el cual es degenerado a un ácido nucléicos como se define en cualquiera de (a) a (e) como un resultado del código genético,
(g)
ácidos nucléicos que son divergentes de un ácido nucléico que codifica una proteína como se da en SEQ ID No. 4 o los cuales son divergentes de un ácido nucléico como se define en cualquiera de (a) a (e), debido a las diferencias en el uso de codón entre los organismos,
(h)
ácidos nucléicos que codifican una proteína como se da en SEQ ID No. 4 o ácidos nucléicos como se definen en (a) a (e) los cuales son divergentes debido a las diferencias entre alelos,
(i)
ácidos nucléicos que codifican una proteína como se da en SEQ ID No. 4,
(j)
fragmentos funcionales de ácidos nucléicos como se definen en cualquiera de (a) a (i) que tienen la actividad biológica de una citoquinina oxidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un ácido nucléico aislado que codifica una proteína de planta que tiene actividades citoquinina oxidasa seleccionado del grupo consistente de:
(a)
un ácido nucléico que comprende una secuencia de ADN como se da en SEQ ID No. 3, o los complementos de los mismos,
(b)
un ácido nucléico que comprende las secuencias de ARN correspondientes a SEQ ID No 3, o los complementos de las mismas,
(c)
un ácido nucléico que hibridiza específicamente a un ácido nucléico como se da en SEQ ID No. 3, o el complemento de las mismas,
(d)
un ácido nucléico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se da en SEQ ID No. 4,
(e)
un ácido nucléico que se degenera a un ácido nucléico como se da en SEQ ID No. 3 o el cual es degenerado a un ácido nucléico como se define en cualquiera de (a) a (d) como resultado del código genético,
(f)
un ácido nucléico que es divergente de un ácido nucléico que codifica una proteína como se da en SEQ ID No. 4 o el cual es divergente de un ácido nucléico como se define en cualquiera de (a) a (e) debido a las diferencias en el uso de codón entre los organismos,
(g)
un ácido nucléico que codifica una proteína como se da en SEQ ID No.4, o un ácido nucléico como se define en (a) a (e) el cual es divergente debido a las diferencias entre alelos,
(h)
un ácido nucléico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificada por un ácido nucléico como se da en SEQ ID No. 3, o un fragmento funcional de un ácido nucléico como se define en cualquiera de (a) a (g), donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa,
(i)
un ácido nucléico que codifica una proteína como se define en SEQ ID No. 4,
(j)
un ácido nucléico como se da en SEQ ID No.26,
dado que dicho ácido nucléico no es el ácido nucléico tal como se depositó en el número de acceso Genbank AC005917, y
dado que dicho ácido nucléico no es SEQ ID No. 38443 de EP 1 033 405.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un ácido nucléico aislado de acuerdo con la reivindicación 3 el cual es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético, o ARN donde T está reemplazado por U.
5. Una molécula de ácido nucléico de al menos 15 nucleótidos en longitud que hibridiza específicamente con un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4.
6. Una molécula de ácido nucléico de al menos 15 nucleótidos de longitud que amplifica específicamente un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4.
7. Un vector que comprende un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4.
8. Un vector de acuerdo con la reivindicación 7 el cual es un vector de expresión donde el ácido nucléico se enlaza de manera operativa a una o más secuencias de control que permiten la expresión de dicho ácido nucléico en células huésped procariotas y/o eucariotas.
9. Una célula huésped que contiene un ácido nucléico de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 o un vector de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.
10. La célula huésped de la reivindicación 9, donde la célula huésped es una célula bacteriana, de insecto, fúngica, de planta o animal.
11. Un polipétido aislado codificable por un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4, o un derivado biológicamente activo del mismo donde dicho derivado comprende adicionalmente residuos de aminoácidos de origen natural alterados glicosilados acilados o de origen no natural y/o comprende uno o más sustituyentes no aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma presente en la naturaleza de dichos polipéptidos, o un fragmento funcional de dicho polipéptido, el cual no es SEQ ID No. 38444 de EP 1 033 405.
12. El polipétido de la reivindicación 11 el cual tiene una secuencia de aminoácidos como se da en SEQ ID No. 4, o un derivado biológicamente activo del mismo donde dicho derivado comprende adicionalmente residuos de aminoácidos alterados glicosilados, acilados o de presencia no natural y/o comprende uno o más sustituyentes no aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural de dicho polipéptido, o un fragmento funcional de dicho polipéptido.
13. Un método para producir un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 cultivando una célula huésped de la reivindicación 9 o 10 bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido y recuperar el polipéptido producido a partir del cultivo.
14. Un anticuerpo que específicamente reconoce un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 o un epítope específico del mismo.
15. Un método para la producción de plantas transgénicas, células de plantas o tejidos de plantas que comprenden la introducción de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 en un formato expresable o en un vector de la reivindicación 7 u 8 en dicha planta, célula de planta o tejido de planta.
16. Un método para la producción de plantas, células de plantas o tejidos de plantas alterados que comprende la introducción de un polipétido de la reivindicación 11 o 12 directamente en una célula, un tejido o un órgano de dicha planta.
17. Un método para efectuar la expresión de un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 que comprende la introducción de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 unido de manera operativa a una o más secuencias de control o un vector de la reivindicación 7 u 8 de manera estable en el genoma de una célula de una planta.
\newpage
18. El método de la reivindicación 16 o 17 que comprende adicionalmente regenerar una planta a partir de dicha célula de planta.
19. Una célula de planta transgénica para el ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 obtenible introduciendo a una célula de planta el ácido nucléico aislado de la reivindicación 3 o 4 unido operativamente a elementos reguladores que permiten la transcripción y/o expresión de dicho ácido nucléico en células de planta, o una célula de planta transgénica obtenible por un método de la reivindicación 16 o 17.
20. La célula de planta transgénica de la reivindicación 19 donde dicho ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 está integrado de manera estable en el genoma de dicha célula de planta.
21. Una planta o un tejido de planta transgénico que comprende células de planta de la reivindicación 19 o 20.
22. Una parte recolectable de una planta de la reivindicación 21, donde dicha parte recolectable comprende células de planta de la reivindicación 19 o 20.
23. La parte recolectable de una planta de la reivindicación 22 que es seleccionada del grupo consistente de semillas, hojas, frutos, cultivos de tallo, rizomas, raíces, tubérculos y bulbos.
24. La progenie transgénica derivada de cualquiera de las plantas o partes de plantas de cualquiera de las reivindicaciones 21 o 23 que comprende células de la planta de la reivindicación 19 o 20.
25. Un método para estimular el crecimiento de la raíz que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2.
26. Un método para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2.
27. Un método para alterar el geotropismo radicular que comprende alterar la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2.
28. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, llevando dicho método a un incremento en rendimiento.
29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 donde dicha expresión de dicho ácido nucléico se presenta bajo el control de un promotor constitutivo fuerte.
30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 donde dicha expresión de dicho ácido nucleico se presenta bajo el control de un promotor que es preferencialmente expresado en raíces.
31. Un método para identificar y obtener proteínas que interactuan con un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 que comprenden una prueba de selección donde se usa un polipétido de la reivindicación 11 o 12.
32. El método de la reivindicación 31 que comprende una prueba de selección de dos híbridos donde se usan un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 como cebo y una biblioteca de ADNc como presa.
33. Un método para identificar compuestos o mezclas de compuestos que se enlazan específicamente a un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 que comprende:
(a)
combinar un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 con dicho compuesto o mezclas de compuestos bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de complejos, y
(b)
detectar la formación compleja, donde la presencia de un complejo identifica un compuesto o mezcla que enlaza específicamente dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
34. Un método para el diseño de o la selección para productos químicos promotores del crecimiento o herbicidas que comprenden el uso de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucleico como se define en la reivindicación 2 o un vector de la reivindicación 7 u 8.
35. Uso de una molécula de ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucleico como se define en la reivindicación 2, el vector de la reivindicación 7 u 8, un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 para un rendimiento incrementado.
36. Uso de una molécula de ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2, el vector de la reivindicación 7 u 8, un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 para estimular el crecimiento radicular.
37. El uso de una molécula de ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2, el vector de la reivindicación 7 u 8, un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias.
38. Uso de una molécula de ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se definió en la reivindicación 2, el vector de la reivindicación 7 u 8, un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 para alterar el geotropismo radicular.
39. Composición de diagnóstico que comprende por lo menos una molécula de ácido nucléico de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, el vector de la reivindicación 7 u 8, un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 o un anticuerpo de la reivindicación 14.
40. Un método para incrementar el tamaño del meristema radicular que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en raíces.
41. Un método para incrementar el tamaño de la raíz que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en raíces.
42. Un método para incrementar el tamaño del meristema radicular que comprende la regulación en descenso de la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2, preferiblemente en brotes.
43. Un método para retrasar la senescencia de las hojas que comprende la regulación en descenso de la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en hojas, preferiblemente en hojas senescentes.
44. Un método para alterar la senescencia de las hojas que comprende la expresión de un ácido nucleico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en hojas senescentes.
45. Un método para incrementar el espesor de las hojas que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas.
46. Un método para reducir el tamaño de vaso que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de la planta.
47. Un método para incrementar el tamaño de los vasos que comprende la regulación descendente de la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas.
48. Un método para inducir la partenocarpia que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en la placenta, óvulos y tejidos derivados de los mismos.
49. Un método para mejorar la permanencia de siembras que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en siembras, preferiblemente en las raíces de las siembras.
50. Un método para incrementar la ramificación que comprende la expresión en ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas.
51. Un método para mejorar la resistencia al alojamiento que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en tallos o nódulos axilares.
52. Uso de una raíz de reserva transgénica que comprende un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en procedimientos de injerto con un scion para mejorar las características relacionadas con la raíz de la planta o árbol resultante caracterizado por un crecimiento potenciado de la raíz debido a la expresión de una citoquinina oxidasa de la planta codificada por dicho ácido nucléico en dicha raíz de reserva.
53. Una planta transgénica que comprende una raíz de reserva transgénica que expresa una citoquinina oxidasa de planta de acuerdo con la reivindicación 52 y comprende adicionalmente un sción.
54. Una parte recolectable de una planta de la reivindicación 53, donde dicha parte recolectable comprende el ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2.
55. Un método para estimular el crecimiento y desarrollo radicular que comprende la expresión de un ácido nucléico que codifica una citoquinina oxidasa de planta en una célula o cultivo de tejidos de una planta transgénica.
56. Un método de acuerdo con la reivindicación 55 donde dicho ácido nucléico es por lo menos uno de los ácidos nucléicos de la reivindicación 3 o como se define en la reivindicación 2.
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