ES2333102T3 - Metodo para modificar la morfologia, bioquimica y fisiologia de las plantas. - Google Patents
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Abstract
Uso de un ácido nucléico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta para estimular el crecimiento radicular para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular.
Description
Método para modificar la morfología, bioquímica
y fisiología de las plantas.
La presente especificación se relaciona en
general con un método para modificar las propiedades o
características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas de las
plantas, tales como uno o más de sus procesos de desarrollo y/o sus
procesos de adaptación al ambiente, incluyendo pero no limitándose a
la modificación de la iniciación o estimulación o mejora del
crecimiento de la raíz, y/o a la formación de raíces adventicias,
y/o a la formación de raíces laterales, y/o al geotropismo de las
raíces, y/o al crecimiento de brotes, y/o al dominio apical, y/o a
la ramificación, y/o al periodo de senescencia, y/o al periodo de
floración, y/o al periodo de formación de flores, y/o al desarrollo
de semillas, y/o al rendimiento en semillas, comprendiendo dicho
método a la expresión de una proteína de control de la degradación
de la citoquinina, en particular la citoquinina oxidasa, en la
planta, operablemente bajo el control de una secuencia promotora
regulable, tal como una secuencia promotora específica para la
célula, promotora específica para el tejido, o promotora específica
para un órgano. Preferiblemente, las características modificadas
por la presente invención son características mediadas por la
citoquinina y/o mediadas por la auxina. La presente especificación
se extiende a las construcciones genéticas que son útiles para
llevar a cabo el método de la invención y a las plantas transgénicas
producidas con el mismo que tienen propiedades morfológicas y/o
bioquímicas y/o fisiológicas alteradas comparadas con sus
contrapartes isogénicas.
Las raíces son un órgano importante de las
plantas superiores. Sus principales funciones son anclar la planta
en el suelo y tomar el agua y los nutrientes (nutrición N,
minerales, etc.). Así, el crecimiento de la raíz tiene una
influencia directa o indirecta en el crecimiento y rendimiento de
los órganos aéreos, particularmente bajo condiciones de limitación
de nutrientes. Las raíces también son relevantes para la producción
de productos vegetales secundarios, tales compuestos de defensa y
hormonas vegetales.
Las raíces también son órganos de almacenamiento
en un buen número de cultivos importantes. La remolacha de azúcar
es la planta más importante para la producción de azúcar en Europa
(260 millones de toneladas/año, 38% de la producción mundial). La
mandioca (casaba), los ñames y las patatas dulces (batatas) son
también productores de almidón importantes (aproximadamente 150
millones de toneladas/año cada una). Su contenido en almidón puede
ser dos veces tan alto como el de la patata. Las raíces también son
el órgano relevante para el consumo en un importante número de
vegetales (por ejemplo, zanahorias, rábanos), hierbas (por ejemplo,
jengibre, cúrcuma), y plantas medicinales (por ejemplo, ginseng).
Además, algunos de los productos vegetales secundarios encontrados
en las raíces son de importancia económica para la industria química
y farmacéutica. Un ejemplo son los ñames que contienen moléculas
básicas para la síntesis de hormonas esteroides. Otro ejemplo es la
chiconina, que es producida por las raíces de la Lithospermum
erithrorhizon en cultivos de raíces vellosas. La Shikonina es
usada por sus propiedades antiinflamatorias, antitumorales y para
curación de heridas.
Además, el crecimiento de la raíces de las
plantas de cultivo mejoradas también mejora la competitividad frente
a la maleza y mejora el crecimiento en áreas áridas, incrementando
la accesibilidad y el consumo de agua.
El crecimiento mejorado de las raíces también es
relevante para propósitos ecológicos, tales como la biorremediación
y la prevención/detención de la erosión del suelo.
La arquitectura de las raíces es un área que ha
permanecido durante mucho tiempo inexplorada a través de los
cultivos clásicos, debido a las dificultades cuando se trata de
tener acceso a este reto en el campo. Así, la biotecnología podría
tener un impacto significativo en la mejora de este aspecto, puesto
que no se basa en selecciones a gran escala en el campo. En cambio,
las modalidades biotecnológicas requieren de un entendimiento
básico de los componentes moleculares que determinan una
característica específica de la planta. Hoy, este conocimiento es
solamente fragmentario, y como consecuencia, la biotecnología hasta
ahora ha sido incapaz de alcanzar una profunda penetración en esta
área.
Un regulador bien establecido del crecimiento de
las raíces es la auxina. La aplicación de ácido
indol-3-acético (IAA) a las plantas
en crecimiento estimula el desarrollo de las raíces laterales y la
elongación de las raíces laterales (Torrey, Am J Bot 37:
257-264, 1950; Blakely et al., BotGaz 143:
341-352, 1982; Muday and Haworth, Plant Physiol
Biochem 32: 193-203, 1994). Las raíces expuestas a
un rango de concentraciones de IAA iniciaron números crecientes de
raíces laterales (Kerk et al., Plant Physiol, 122:
925-932, 2000). Además, cuando las raíces que
habían producido laterales en respuesta a una concentración
particular de auxina exógena fueron expuestas subsecuentemente a
concentraciones más altas de IAA, se formaron numerosas raíces
laterales supernumerarias espaciadas entre las existentes (Kerk
et al., Plant Physiol, 122: 925-932,
2000).
Por el contrario, el crecimiento de las raíces
en agar que contenía inhibidores del transporte de la auxina,
incluyendo el NPA, disminuyera el número de raíces laterales (Muday
and Haworth, Plant Physiol Biochem 32:
193-203,
1994).
1994).
Se han aislado mutantes de arabidopsis
que contienen niveles incrementados de IAA endogeno (Boerjan et
al., Plant Cell 7: 1405-141, 1995; Celenza
et al., Gene Dev 9: 2131-2142, 1995; King
et al., Plant Cell 7: 2023-2037, 1995;
Lehman et al., Cell 85: 183-194, 1996). Son
conocidas por ser alelos de un locus localizado en el cromosoma 2.
Estas cepas tienen raíces adventicias y laterales en exceso, lo que
está de acuerdo con los efectos antes descritos de la aplicación
externa de la auxina.
El efecto estimulador de las auxinas en la
formación de raíces adventicias y laterales sugiere que la sobre
producción de auxinas en las plantas transgénicas es una estrategia
valida para incrementar el crecimiento de las raíces. Además,
también es cuestionable si esto produciría un producto comercial con
características mejoradas. A parte de su efecto estimulatorio sobre
la formación de las raíces adventicias y laterales, la
sobreproducción de auxina dispara otros efectos, tales como la
reducción en el número de hojas, la morfología anormal de hojas
(hojas estrechas, entorchadas), inflorescencias abortadas, dominio
apical incrementado, formación de raíces adventicias en el tallo,
la mayoría de las cuales son indeseables desde la perspectiva
agronómica (Klee et al., Genes Devel 1:
86-96, 1987; Kares et al., Plant Mol Biol 15:
225-236, 1990). Por lo tanto, el principal problema
con modalidades que se basan en la síntesis incrementada de la
auxina es un problema de las limitaciones, a saber para confinar
los efectos de la auxina sobre la raíz. Este problema no es superado
probablemente por el uso de promotores específicos del tejido: las
auxinas son transportadas en la planta y su acción consecuentemente
no está confinada al sitio de la síntesis. Otro aspecto es si las
auxinas siempre mejoraran la biomasa total de las raíces. Para
plantas cultivadas sobre agar, se ha notado que las concentraciones
crecientes estimulaban progresivamente la formación de raíces
laterales pero inhibían concurrentemente el crecimiento de estas
raíces (Kerk et al., Plant Physiol, 122:
925-932, 2000).
Los problemas anteriormente mencionados en
cuanto a la limitación de los efectos de la auxina y el
mantenimiento del crecimiento de las raíces se resuelven mediante
las realizaciones de las reivindicaciones de la patente.
La presente invención se relaciona con una
materia objeto tal como la que se define en las reivindicaciones
anexas 1 a 56.
La presente especificación describe una
construcción genética que comprende un codificador genético que es
una proteína con actividad de citoquinina oxidasa de la
Arabidopsis thaliana. Este gen se expresa bajo el control de
un promotor regulado. Este promotor puede ser regulado por factores
específicos del tejido endógeno o específicos del ambiente, o
alternativamente puede ser inducido por la aplicación de productos
químicos específicos.
La presente especificación también describe una
célula o planta que contiene la construcción genética.
La presente especificación también describe un
método para modificar la arquitectura y biomasa de las raíces
mediante la expresión de un gen de la oxidasa citoquinina bajo
control de un promotor que es específico para la raíz o para
ciertos tejidos o tipos de células de la raíz.
Para obviar los problemas antes mencionados
asociados con el incremento de la biosíntesis de la auxina, se
decidió seguir una modalidad alternativa. Nuestro razonamiento es
que una regulación hacia abajo de los antagonistas biológicos de
las auxinas podría evocar efectos similares o incluso superiores
sobre el crecimiento de las raíces en comparación con los niveles
de auxina en incremento. Las acciones e interacciones hormonales son
extremadamente complejas, pero nuestra hipótesis es que las
citoquininas podrían funcionar como antagonistas de la auxina con
respecto al crecimiento de las raíces. Los estudios hormonales sobre
los cultivos de tejidos vegetales han mostrado que la relación de
la auxina versus la citoquinina es más importante para la
organogénesis que los niveles absolutos de cada una de estas
hormonas, lo cual en efecto indica que estas funciones hormonales
son antagonistas - por lo menos en ciertos procesos biológicos.
Además, la formación de raíces laterales es inhibida por la
aplicación exógena de citoquininas. De manera interesante, también
la elongación es afectada negativamente por el tratamiento con
citoquinina, lo cual sugiere que las citoquininas controlan tanto la
ramificación de raíces como el crecimiento de las raíces.
Juntos, los datos de la literatura actual
indican que niveles incrementados de citoquinina afectan
negativamente el crecimiento de las raíces, pero los mecanismos que
subyacen bajo este proceso no son entendidos. Los sitios para la
síntesis de la citoquinina en la planta son las puntas de las raíces
y los tejidos jóvenes del brote. Las concentraciones endógenas de
citoquininas están en el rango de los nM. Sin embargo, puesto que su
cuantificación es difícil, es necesario extraer grandes cantidades
de tejido y las concentraciones reales no son conocidas. También,
la compartimentación subcelular de las citoquininas no es conocida.
Se cree en general que las bases libres y las ribosidas están
localizadas en el citoplasma y en el núcleo, mientras que los
glucósidos están localizados en la vacuola. También existen
diferentes citoquininas con estructuras químicas ligeramente
diferentes. Como consecuencia, no se sabe si los efectos de las
citoquininas exógenas deberían ser adscritos a un aumento en la
concentración total de citoquinina o más bien a la competencia de
otras formas de citoquininas generadas en la planta (las cuales
difieren bien en estructura, localización celular o subcelular) para
receptores, translocalizadores, transportadores, enzimas de
modificación...
Con el fin de probar la hipótesis de que los
niveles de citoquinina en la raíz efectivamente exceden el nivel
óptimo para el crecimiento de la raíz, se clonaron nuevos genes que
codifican la citoquinina oxidasas (las cuales son enzimas
metabolizantes de la citoquinina) a partir de Arabidopsis
thaliana (designada ATCKX) y fueron expresados subsecuentemente
bajo un promotor fuerte constitutivo en tabaco transgénico y
Arabidopsis. Los transformantes que mostraron la expresión
del ATCKX ARNm e incrementaron la actividad de la oxidasa
citoquinina y manifestaron una formación mejorada y crecimiento de
las raíces.
También se observaron efectos negativos sobre el
crecimiento de brotes. Éste ultimo está de acuerdo con la expresión
constitutiva del gen de la citoquinina oxidasa en estas plantas, que
ilustra la importancia de la expresión confinada del gen de la
citoquinina oxidasa para las propiedades generales de crecimiento de
las plantas. La limitación de la actividad de la citoquinina
oxidasa puede alcanzarse utilizando promotores específicos para
células, tejidos u órganos, puesto que la degradación de la
citoquinina es un proceso limitado a los tejidos o células que
expresan la proteína CKX, esto en contraste con las modalidades que
se basan en la síntesis hormonal, como se explicó
anteriormente.
Los efectos negativos observados de la expresión
de la citoquinina oxidasa sobre el crecimiento de los brotes
demuestran que las citoquininas oxidasas son objetivos interesantes
para el diseño o para la selección de productos químicos promotores
del crecimiento. Tales productos químicos deberían inhibir la
actividad de la citoquinina oxidasa, deberían preferiblemente no
ser transportados a la raíz y deberían ser degradados rápidamente
en el suelo, de manera que la aplicación de estos productos químicos
no inhiba el crecimiento de la raíz. Las citoquininas también
retardan la senescencia de las hojas, lo que significa que los
efectos positivos incluirán también el crecimiento y mantenimiento
de los tejidos fotosintéticos. Además, la observación de que las
citoquininas retrasan la senescencia, mejoran el verdor (el
contenido de clorofila) de las hojas y reducen el dominio apical de
las raíces lo que muestra que las estrategias basadas en la
supresión de la actividad CKX (tales como tecnología antisentido,
riosomal y de cosupresión) en las partes aéreas de las plantas se
traducirían en una senescencia retrasada, mejorando el verdor de las
hojas e incrementando la ramificación.
De la misma forma, los efectos positivos
observados de la expresión de la citoquinina oxidasa en el
crecimiento de las raíces demuestra que las citoquininas oxidasas
son objetivos interesantes para el diseño o selección de
herbicidas. Tales herbicidas deberían inhibir la actividad de la
citoquinina oxidasa, preferiblemente no deberían ser transportados
hacia los brotes, y deberían ser solubles y relativamente estables
en un solvente que pueda ser administrado a la raíz a través del
suelo. Estos efectos de la sobre expresión de la citoquinina
oxidasa sobre el desarrollo y la arquitectura de la planta eran
hasta el momento desconocidos, y como consecuencia, la presente
invención y sus realizaciones no podrían ser previstas.
Los efectos negativos observados sobre el
crecimiento de los brotes demuestra que la manipulación de la
citoquinina oxidasa también pude ser usada para obtener fenotipos
enanos. Los fenotipos enanos son útiles particularmente en cultivos
comerciales tales como cereales y árboles frutales por ejemplo.
Realizaciones preferibles de esta especificación
se relaciona con el efecto positivo de la expresión de la
citoquinina oxidasa en el crecimiento y arquitectura de la planta, y
en particular en el crecimiento y arquitectura de la raíz. La
familia de genes de la citoquinina oxidasa contiene por lo menos
seis miembros en la Arabidopsis (véanse ejemplos más abajo)
y los presentes inventores han mostrado que hay diferencias
cuantitativas en los efectos alcanzados con algunos de estos genes
en plantas transgénicas. Se anticipa que los homólogos funcionales
de la citoquinina oxidasa de Arabidopsis descritas pueden ser
aislados de otros organismos, dada en la evidencia para la
presencia de actividades citoquinina oxidasa en muchas plantas
verdes (Hare and van Staden, Physiol Plant 91:
128-138, 1994; Jones and Schreiber, Plant Growth Reg
23:123-134, 1997), así como en otros órganismos
(Armstrong, in Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. Eds Mok
and Mok, CRC Press, pp139-154, 1994). Por lo tanto,
la secuencia de la citoquinina oxidasa funcional en la descripción
de esta especificación, no necesita ser idéntica a la descrita
aquí. Esta divulgación es particularmente útil para cultivos de
cereales y cultivos de monocotiledonias en general, y los genes de
la citoquinina oxidasa por ejemplo de trigo o maíz pueden ser
usados también (Morris et al., 1999; Rinaldi and Comandini,
1999). Se prevé que otros genes con actividades citoquinina oxidasa
o con cualquier otra actividad metabolizante de citoquinina (véase
Zazimalová et al., Biochemistry and Molecular Biology of
Plant Hormones, Hooykaas, Hall and Libbenga (Eds.), Elsevier
Science, pp141-160, 1997) también pueden ser para el
propósito de esta divulgación. De la misma forma, los genes que
codifican proteínas incrementarían la actividad metabolizante de la
citoquinina endógena pueden ser usados también para el propósito de
esta divulgación. En principio, también podrían obtenerse fenotipos
similares que interfieren con genes que funcionan corriente abajo de
la citoquinina tales como los receptores o proteínas involucrados
en los caminos de transducción de la señal de la citoquinina.
Para el propósito de esta invención, debe
entenderse que el término "crecimiento de raíces" abarca todos
los aspectos de crecimiento de las diferentes partes que
constituyen el sistema radicular en diferentes etapas de su
desarrollo, tanto en plantas monocotiledonias como dicotiledonias.
Debe entenderse que el crecimiento mejorado de la raíz puede
resultar a partir del crecimiento mejorado de una o más de sus
partes incluyendo las raíces primarias, raíces laterales, raíces
adventicias, etc., todas las cuales caen dentro del alcance de esta
invención.
De acuerdo con una presente realización, la
presente especificación se refiere a un método para estimular el
crecimiento de las raíces y/o potenciar la formación de raíces
laterales y/o adventicias y/o alterar el geotropismo de la raíz
comprendiendo la expresión de una citoquinina oxidasa de una planta
o comprendiendo la expresión de otra proteína que reduce el nivel
de citoquininas activas en plantas u otras partes de las
plantas.
La invención se relaciona específicamente a
tales métodos como se define en la reivindicación anexa 55.
Como se define en la reivindicación anexa 1, la
invención se relaciona particularmente con el uso de un ácido
nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta para
estimular el crecimiento de la raíz o para potenciar la formación
de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo
radicular.
En el contexto de la presente invención debería
entenderse que los términos "expresión" y/o "sobre
expresión" se usan de manera intercambiable y se relacionan los
dos con "una expresión potenciada y/o ectópica" de una
citoquinina oxidasa de una planta o cualquier otra proteína que
reduzca el nivel de citoquininas activas en las plantas. Debe
quedar claro que aquí una expresión potenciada de la citoquinina
oxidasa de una planta, así como la expresión "de novo" de las
citoquinina oxidasas o de dichas otras proteínas es importante.
Alternativamente, dichas otras proteínas potencian la actividad
metabolizante de la citoquinina de una citoquinina oxidasa de una
planta.
Debe entenderse adicionalmente que en el
contexto de la presente invención la expresión "raíces laterales
y/o adventicias" puede significar raíces laterales y adventicias
pero también "radiculación lateral o adventicias". La
potenciación puede existir en la forma de raíces laterales o en la
formación de raíces adventicias así como en la formación de ambos
tipos de raíces no primarias, pero no necesariamente.
De acuerdo con una realización adicional, la
presente especificación se relaciona con un método para estimular
el crecimiento de las raíces y/o potenciar la formación de raíces
laterales o adventicias y/o alterar el geotropismo radicular y/o
incrementar el rendimiento y/o potenciar el vigor temprano y/o
modificar la relación raíces/brotes y/o mejorar la resistencia a la
invasión y/o incrementar la tolerancia a la sequía y/o promover la
propagación in vitro de esquejes, comprendiendo la expresión
de una citoquinina oxidasa de una planta o comprendiendo la
expresión de otra proteína que reduzca el nivel de las citoquininas
activas en las plantas o en partes de las plantas.
De acuerdo con una realización preferida, la
presente especificación se relaciona con un método para estimular
el crecimiento de las raíces que resultan en un incremento de la
masa radicular por sobreexpresión de una citoquinina oxidasa,
preferiblemente una citoquinina oxidasa de acuerdo con la invención,
u otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en
plantas u otras plantas, preferiblemente en raíces.
La producción de biomasa radicular más alta
debida a la sobreexpresión de las secuencias promotoras del
crecimiento tiene un efecto directo en el rendimiento y un efecto
indirecto en la producción de compuestos producidos por las células
radiculares o células radiculares transgénicas o cultivos de células
de dichas células radiculares transgénicas. Un ejemplo de un
compuesto interesante producido en cultivos de raíces es la
Shikonina, cuyo rendimiento puede ser potenciado ventajosamente por
dichos métodos.
De acuerdo con una realización más especifica,
la presente especificación se refiere a métodos para estimular el
crecimiento radicular o para potenciar la formación de raíces
laterales y adventicias o para alterar el geotropismo radicular que
comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una
citoquinina oxidasa de una planta seleccionado del grupo
consistente de:
- (a)
- ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ADN tal como es dada por cualquiera de SEQ ID NOs 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 28, 28 a 31, 33 o 34, o el complemento de los mismos,
- (b)
- ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de SEQ ID NOs 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 o 34, o los complementos de los mismos,
- (c)
- ácidos nucleicos que hibridizan específicamente a cualquiera de SEQ ID NOs 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 o 34, o a los complementos de los mismos,
- (d)
- ácidos nucleicos que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como es dada en cualquiera de SEQ ID NOs 2, 4, 8, 8, 10, 12, 32 o 35, o los complementos de los mismos,
- (e)
- ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (d), caracterizados por que dicho ácido nucleico es ADN, ADN genómico, ADNc, ADN o ARN sintéticos donde T es remplazado por U,
- (f)
- ácidos nucleicos que son degenerados a ácidos nucleicos como los dados en cualquiera de SEQ ID NOs 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 o 34, o los cuales son degenerados a un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (e)como resultado del código genético,
- (g)
- ácidos nucleicos que son divergentes de un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en cualquiera de SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8,10,12 o 35 o los cuales son divergentes de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (e), debido a las diferencias en la utilización de codones entre los organismos,
- (h)
- ácidos nucleicos que codifican una proteína como se da en SEQ ID NOs 2, 4, 8, 8, 10,12 o 35 o ácidos nucleicos como se define en (a) a (e) los cuales son divergentes debido a las diferencias entre alelos,
- (i)
- ácidos nucleicos que codifican una proteína como es dada en cualquiera de SEQ ID NOs 2, 4, 8, 8, 10, 12 o 35,
- (j)
- fragmentos funcionales de ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (i) que tienen la actividad biológica de una citoquinina oxidasa, y
- (k)
- ácidos nucleicos que codifican una citoquinina oxidasa de una planta,
o que comprenden la expresión,
preferiblemente en raíces, de un ácido nucleico que codifica una
proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o
partes de
plantas.
La invención se relaciona específicamente con el
método como se define en la reivindicación anexa 2.
En la presente especificación los ácidos
nucleicos que codifican las citoquinina oxidasas novedosas de la
Arabidopsis thaliana han sido aisladas y por primera vez, los
presentes inventores pueden demostrar sorprendentemente que la
expresión de la citoquinina oxidasas en las plantas transgénicas o
en partes de plantas transgénicas se tradujeron en las
características relacionadas con las raíces antes mencionadas.
Preferiblemente, la expresión de la citoquinina oxidasa debería
tomar lugar en las raíces, más preferiblemente bajo el control de un
promotor especifico de las raíces. Un ejemplo de tal promotor
específico de las raíces está dado en la SEQ ID No 36.
Debe quedar claro que, aunque la especificación
describe en la sección de ejemplos varios nuevos genes ATCKX y
proteínas, la especificación también se relaciona con el uso de
otras citoquinina oxidasas aisladas y expresadas en otras plantas,
preferiblemente en la raíces de dichas otras plantas con el fin de
obtener efectos similares en las plantas como se describe en la
sección de ejemplos.
Por lo tanto, la presente especificación se
relaciona de manera más general con el uso de un ácido nucleico que
codifica una citoquinina oxidasa de una planta o codifica una
proteína que reduce el nivel de las citoquininas activas en plantas
o partes de plantas para estimular el crecimiento de las raíces o
para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o
para alterar el geotropismo radicular. Las citoquininas oxidasas
preferidas para ser usadas son codificadas por ácidos nucleicos que
codifican la citoquininas oxidasas como se definió anteriormente y
son codificadas por los nuevos ácidos nucleicos que se definen más
adelante. La especificación divulga un ácido nucleico aislado que
codifica una nueva proteína de una planta que tiene actividades
citoquinina oxidasa seleccionado del grupo consistente de:
- (a)
- un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN tal como es dada en cualquiera de SEQ ID Nos 29, 3, 5, 9, 28, 27, 31, 33 o 34, o el complemento de los mismos,
- (b)
- un ácido nucleico que comprende las secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 28, 27, 31, 33 o 34 o los complementos de los mismos,
- (c)
- un ácido nucleico que hibridiza específicamente hacia un ácido nucleico como el dado en cualquiera de SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 28, 27, 31, 33 o 34 o los complementos de los mismos,
- (d)
- un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido como se da en SEQ ID No 32 y el cual es por lo menos similar en un 70%, preferiblemente por lo menos 75%, 80% u 85%, más preferiblemente al menos 90% o 95%, o más preferiblemente al menos 99% similar a la secuencia de aminoácidos como se da en SEQ ID No 4,
- (e)
- un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 35% similar, preferiblemente 37%, 40%, 45%, 47% o 50%, similar, más preferiblemente 55%, 60%, 65%, 70%, 75% u 80% similar, más preferiblemente 85%, 90% o 95% similar a la secuencia de aminoácidos como se da en SEQ ID No 6,
- (f)
- un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 35% similar, preferiblemente 37%, 40%, 45%, 47% o 50% similar, más preferiblemente 55%, 60%, 65%, 70%, 75% u 80% similar, lo más preferiblemente 85%, 90% o 95% similar a la secuencia de aminoácidos como se da en la SEQ ID No 10 o 35,
- (g)
- un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se da en cualquiera de SEQ ID NOs 4, 6, 10, 32, 35,
- (h)
- un ácido nucleico que es degenerado hacia un ácido nucleico como se da en cualquiera de SEQ ID NOs 29, 3, 9, 26, 27, 33 o 34 o el cual es degenerado hacia un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (g) como resultado del código genético,
- (i)
- un ácido nucleico que es divergente de un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 4, 6, 10 o 35 o el cual es divergente de un ácido nucleico que está definido en cualquiera de (a) a (g) debido a las diferencias en el uso de codón entre los organismos,
- (j)
- un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en SEQ ID NOs 4, 6, 10 o 35 o un ácido nucleico como se define en (a) hasta (g) el cual es divergente debido a las diferencias entre alelos.
- (k)
- un ácido nucleico que codifica un fragmento immunológicamente activo de una citoquinina oxidasa codificado por un ácido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 28, 27, 31, 33 o 34, o un fragmento immunológicamente activo de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (j),
- (l)
- un ácido nucleico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificado por un ácido nucleico como se da en cualquiera de SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34 o un fragmento funcional de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (j), donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa, y
- (m)
- un ácido nucleico que codifica una proteína como se define en SEQ ID No 4, 6, 10 o 35,
dado que dicho ácido nucleico no es
el ácido nucleico como está depositado bajo ninguno de los
siguientes números de accesos Genbank: AC005917, AB024035 y
AC023754.
La invención se relaciona específicamente con
ácidos nucleicos como se define en la reivindicación anexa 3.
La invención también se relaciona con un ácido
nucleico aislado de la invención el cual es ADN, ADNc, ADN genómico
o ADN sintético, o ARN donde T es remplazada por U.
La invención también se relaciona con una
molécula de ácido nucleico de por lo menos 15 núcleos en longitud
que hibridiza específicamente con o específicamente amplifica un
ácido nucleico de la invención.
De acuerdo con otra realización, la invención
también se relaciona con un vector que comprende un ácido nucleico
de la invención. En una realización preferida, dicho vector es un
vector de expresión donde el ácido nucleico está enlazado de manera
operativa con una o más secuencias de control que permite la
expresión de dicha secuencia en células huésped procarióticas y/o
eucarióticas.
Debería entenderse que para la expresión de los
genes de citoquinina oxidasa de la invención en monocotiledonias,
debería usarse una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la
secuencia del ADNc para evitar una unión equivocada de intrones en
las monocotiledonias. Las secuencias preferidas ADNc para ser
expresadas en las monocotiledonias tienen una secuencia de ácido
nucleico como la que se representa en cualquiera de SEQ ID NOs 25 a
30 y 34.
La invención también se relaciona con una célula
huésped que contiene cualquiera de las moléculas de ácido nucleico
o vectores de la invención. Dicha célula huésped es escogida del
grupo que comprende células bacterianas, de insectos, fúngicas,
vegetales o animales.
Otra realización de la especificación se
relaciona con un polipéptido aislado codificable por un ácido
nucleico de la especificación, o un homólogo o derivado del mismo,
o un fragmento immunológicamente activo o funcional del mismo. Los
polipéptidos preferidos de la especificación comprenden las
secuencias de aminoácidos tal como están representadas en
cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 32 y 35, o un
homólogo derivado de las mismas, o un fragmento immunológicamente
activo y/o funcional de las mismas. En una realización aún más
preferida, la invención se relaciona con un polipéptido que tiene
una secuencia de aminoácidos como se da en SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8,
10, 12 o 35, o un homólogo o derivado de los mismos, o un fragmento
inmunológicamente activo y/o funcional de los mismos. Los
fragmentos funcionales preferidos de los mismos son aquellos
fragmentos que están desprovistos de su péptido de señal.
La invención específicamente se relaciona con
polipéptidos como se define en las reivindicaciones anexas 11
o 12.
o 12.
De acuerdo con aún otra realización, la
invención se relaciona con un método para producir un polipéptido
de la invención que comprende cultivar una célula huésped de la
invención bajo condiciones que permiten la expresión del
polipéptido y recuperar el polipéptido producido a partir del
cultivo.
La invención también se relaciona con un
anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido de la
invención o un epítope especifico del mismo.
La invención se relaciona adicionalmente con un
método para la producción de plantas transgénicas, plantas
vegetales o tejidos de plantas que comprenden la introducción de
una molécula de ácido nucleico de la invención en un formato
expresable o un vector de la invención en dicha planta, célula
vegetal o tejido de planta.
La invención también se relaciona con un método
para la producción de plantas, células de plantas o tejidos de
plantas alterados, que comprende la introducción de un polipéptido
de la invención directamente en una célula, un tejido o un órgano
de dicha planta.
De acuerdo con otra realización, la invención se
relaciona con un método para efectuar la expresión de un
polipéptido de la invención que comprende la introducción de una
molécula de ácido nucleico de la invención unidad de manera
operativa con una o más secuencias de control o un vector de la
invención de manera estable en el genoma de una célula de la
planta. La invención se relaciona adicionalmente con el método tal
como se describió anteriormente que comprende de manera adicional
la regeneración de una planta a partir de dicha célula de
planta.
La invención también se relaciona con una célula
de planta transgénica que comprende una secuencia de ácido nucleico
de la invención la cual es enlazada de manera operativa a elementos
reguladores que permiten la transcripción y/o expresión de dicho
ácido nucleico en las células de plantas o que son obtenibles por un
método como se explicaron anteriormente.
De acuerdo con otra realización preferida, la
invención se relaciona con una célula de planta transgénica como se
describe aquí más arriba donde el ácido nucleico de la invención es
integrado de manera estable en el genoma de dicha célula de
planta.
La invención se relaciona además con una planta
transgénica o un tejido de planta que comprende células de la
planta como se describen aquí también a una parte recolectable de
dicha planta transgénica, seleccionada preferiblemente del grupo
consistente de semillas, hojas, frutos, cultivos de tallo, raíces,
tubérculos, rizomas y bulbos. La invención también se relaciona con
la progenia derivada de cualquiera de dichas plantas o partes de
planta transgénicas.
De acuerdo con otra realización, la
especificación se relaciona con un método para estimular el
crecimiento radicular que comprende la expresión de un ácido
nucleico de la especificación o que comprende la expresión de otra
proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en
partes de plantas.
La invención se relaciona particularmente con
tal método como se define en la reivindicación 25.
Una célula de planta o un cultivo de tejidos es
un cultivo de células de plantas o de tejidos de plantas producido
artificialmente que se hace crecer en un medio especial, bien sea
líquido o sólido, el cual proporciona a estas células o tejidos de
plantas todos los requerimientos necesarios para el crecimiento y/o
producción de ciertos compuestos. Los cultivos de células y/o
tejidos de plantas pueden ser utilizados para la propagación rápida
de las plantas y para la producción de plantas transgénicas para
nombrar unos pocos ejemplos.
La formación de raíces puede ser difícil para
algunos esquejes o bajo algunas condiciones en dichos cultivos y la
expresión de un gen de citoquinina oxidasa en dichas células o
tejidos de plantas cultivadas puede ser utilizada para potenciar la
formación de raíces. El cultivo de células y/o tejidos de plantas
también puede ser utilizado para la producción industrial de
compuestos valiosos. Compuestos de producción posibles son
productos farmacéuticos, pesticidas, pigmentos, cosméticos,
perfumes, aditivos para alimentos, etc. Un ejemplo de tal producto
es la Shikonina, la cual es producida por las raíces de la planta
Lithospermum erythrorhizon. Un ejemplo de un cultivo de
tejido de planta es el cultivo de una raíz vellosa, el cual es una
masa artificialmente producida de raíces vellosas. Las raíces de
L arythrorhizon son difíciles de recolectar en grandes
cantidades y mediante la preparación de cultivos de raíces
vellosas, el producto final Shikonina podría ser preparado
industrialmente a una rata más rápida que ocurriría normalmente.
Como se describe aquí, la expresión de la citoquinina oxidasa
potencia el crecimiento y desarrollo de las raíces y puede por lo
tanto ser usado con ventaja en dichos procedimientos de cultivo de
células y tejidos de plantas. Por lo tanto, de acuerdo con otra
realización de esta especificación, se proporciona un método para
estimular el crecimiento y desarrollo de las raíces que comprende
la expresión de un ácido nucleico que codifica una citoquinina
oxidasa de una planta, preferiblemente una citoquinina oxidasa de
la invención, en un cultivo de célula o tejido de una planta
transgénica que comprende dichas células de planta transgénica.
La especificación se relaciona adicionalmente
con un método para potenciar la formación de raíces laterales o
adventicias que comprende la expresión de un ácido nucleico de la
especificación o que comprende la expresión de otra proteína que
reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de
plantas.
La invención se relaciona específicamente con
tal método como se define en la reivindicación 26.
La especificación también se relaciona con un
método para alterar el geotropismo radicular que comprende alterar
la expresión de un ácido nucleico de la especificación que comprende
la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas
activas en plantas o en partes de plantas.
La invención se relaciona específicamente con
tal método como se define en la reivindicación 27.
La especificación también se relaciona con
métodos para potenciar el vigor temprano y/o para modificar la
relación raíz/brote y/o para mejorar la resistencia a las plagas y/o
para incrementar la tolerancia a la sequía y/o para promover la
propagación in vitro de esquejes que comprenden la expresión
de un ácido nucleico de la especificación que comprende la
expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas
activas en plantas o en partes de plantas.
La especificación se relaciona adicionalmente
con métodos para incrementar el tamaño de las raíces o el tamaño
del meristema de las raíces que comprende la expresión de un ácido
nucleico de la especificación o comprende la expresión de otra
proteína que reduce
\hbox{el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas, preferiblemente en raíces.}
De acuerdo con aún otra realización, la
especificación se relaciona con un método para incrementar el tamaño
de un meristema de brote que comprende la regulación en disminución
de la expresión de un ácido nucleico de la especificación,
preferiblemente en brotes.
De acuerdo con una realización preferida la
especificación se relaciona con un método para retardar la
senescencia de las hojas que comprende la regulación en disminución
de la expresión de cualquiera de la citoquinina oxidasas de la
especificación en hojas, preferiblemente en hojas senescentes.
También la especificación se relaciona con un método para alterar
la senescencia de las hojas que comprende la expresión de una de las
citoquinina oxidasas de las hojas senescentes.
La especificación también se relaciona con
métodos para incrementar el grosor de las hojas que comprende la
expresión de un ácido nucleico de la especificación o comprende la
expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas
activas en plantas o en partes de plantas, preferiblemente en
hojas.
La especificación también se relaciona con un
método para reducir el tamaño de los vasos que comprende la
expresión de un ácido nucleico de la especificación o comprende la
expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas
activas en plantas o en partes de plantas, preferiblemente en los
vasos.
La especificación se relaciona adicionalmente
con un método para incrementar el tamaño de los vasos que comprende
la regulación en disminución de la expresión de un ácido nucleico de
la especificación en plantas o en partes de plantas.
De acuerdo con otra realización, la
especificación se relaciona con un método para mejorar
adicionalmente, la invención se relaciona con cualquiera de los
métodos anteriormente descritos, llevando dichos métodos a un
incremento en el rendimiento.
La invención se relaciona adicionalmente con
cualquiera de los métodos de la invención donde dicha expresión de
dichos ácidos nucleicos ocurre bajo el control de un promotor
constitutivo fuerte. En una realización preferida, la invención se
relaciona con cualquiera de los métodos de la invención donde dicha
expresión de dicho ácido nucleico ocurre bajo el control de un
promotor que es expresado preferiblemente en raíces. En la tabla 5,
se incluye una lista no exhaustiva de los promotores de raíces
específicos. Un promotor es preferido para ser usado en los métodos
de la invención es el promotor homólogo de la raíz de clavata que
tiene una secuencia como la que se da en SEQ ID No 38.
De acuerdo con aún otra realización, la
especificación se relaciona con un método para modificar el
comportamiento de las células y/o el desarrollo de las plantas
modificadas y/o modifica la morfología de las plantas y/o modifica
la bioquímica de las plantas y/o modifica la fisiología de las
plantas y/o modifica la velocidad de progresión del ciclo celular
que comprende la modificación de la expresión en células tejidos u
órganos particulares de una planta, de un ácido nucleico de la
especificación.
La especificación también se relaciona con un
método para obtener un crecimiento potenciado, y/o un rendimiento
incrementado y/o una senescencia alterada de una célula, tejido y/o
órgano de una planta y/o una frecuencia incrementada de la
formación de órganos laterales en una planta, que comprende la
expresión ectópica de un ácido nucleico de la especificación.
La especificación también se relaciona con un
método para promover y extender la actividad de división celular en
células en condiciones de crecimiento adversas y/o en estrés,
comprendiendo la expresión ectópica de una secuencia de ácido
nucleico de la especificación.
De acuerdo con aún otra realización, la
especificación se relaciona con un método para identificar y obtener
proteínas que interactúan con un polipéptido de la especificación
que comprende una prueba de selección donde se usa un polipéptido
de la especificación.
En una realización más preferida, la
especificación se relaciona con un método para identificar y obtener
proteínas que interactúan con un polipéptido de la especificación
que comprende una prueba de selección de dos híbridos donde el
polipéptido de la especificación actúa como contraparte y se utiliza
una biblioteca de ADNc como presa.
La especificación se relaciona adicionalmente
con un método para modular la interacción entre un polipéptido de
la especificación y proteínas asociadas que interactúan que son
obtenibles por un método como se describió anteriormente.
En una realización adicional, la especificación
se relaciona con un método para identificar y obtener compuestos
que interactúan con un polipéptido de la especificación que
comprende las etapas de:
- a)
- Proveer un sistema de dos híbridos donde un polipéptido de la especificación y una proteína que interactúa asociada es obtenible por un método como el que se describió anteriormente,
- b)
- hacer interactuar dicho compuesto con el complejo formado por los polipéptidos expresados como se define en a), y,
- c)
- llevar a cabo (en tiempo real) la medición de la interacción de dicho compuesto con dicho polipéptido o el complejo formado por los polipéptidos expresados como se define en a).
La especificación se relaciona adicionalmente
con un método para identificar compuestos o mezclas de compuestos
que específicamente se enlazan a un polipéptido de la
especificación, que comprende:
- a)
- Combinar un polipéptido de la especificación con dicho compuesto o mezclas de compuestos bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de complejos, y,
- b)
- detectar la formación de complejos, donde la presencia de un complejo identifica un compuesto o mezcla que específicamente se enlaza con dicho polipéptido.
La invención se relaciona específicamente con
tales métodos como se define en las reivindicaciones anexas 31 a
34.
La especificación también se relaciona con un
método como se describe más arriba donde dicho compuesto o mezcla
inhibe la actividad de dicho polipéptido y pueden ser utilizados
para el diseño racional de productos químicos.
De acuerdo con otra realización, la
especificación se relaciona con el uso de un compuesto o mezcla
identificados por medio de un método como se describe más arriba
tal como un regulador del crecimiento de una planta o
herbicida.
herbicida.
La especificación también se relaciona como un
método para la producción de un regulador de crecimiento de una
planta o composición de herbicida que comprende las etapas de
métodos de selección del compuesto descrito anteriormente y
formular los compuestos obtenidos a partir de dichas etapas en una
forma adecuada para la aplicación en agricultura o en cultivo de
células o tejidos de plantas.
La especificación también se relaciona con un
método para incrementar la ramificación que comprende la expresión
de un ácido nucleico de la especificación en plantas o partes de
plantas, preferiblemente en tallos o ramas axilares.
La invención se relaciona con un método tal como
el que se define en la reivindicación 50.
La especificación también se relaciona con un
método para mejorar la resistencia a la invasión que comprende la
expresión de un ácido nucleico de la especificación en plantas o
partes de plantas, preferiblemente en tallos o ramas axilares.
La invención se relaciona con método tal como se
define en la reivindicación 51.
La especificación también se relaciona con un
método para el diseño de o selección de productos químicos
promotores del crecimiento o herbicidas que comprenden el uso de un
ácido nucleico en la especificación o en un vector de la
especificación.
La invención se relaciona con un método tal como
el definido en la reivindicación 34.
De acuerdo con otra realización, la
especificación se relaciona con el uso de una molécula de ácido
nucleico, un vector o un polipéptido de la especificación para un
rendimiento incrementado.
La especificación también se relaciona con el
uso de una molécula de ácido nucleico, un vector o un polipéptido
de la especificación para estimular el crecimiento de las
raíces.
La especificación también se relaciona con el
uso de una molécula de ácido nucleico, un vector o un polipéptido
de la especificación para potenciar la formación de raíces laterales
o adventicias.
La especificación también se relaciona con el
uso de una molécula de ácido nucleico, un vector o un polipéptido
de la especificación para alterar el geotropismo de las raíces.
La invención se relaciona específicamente con
usos tales como los definidos en las reivindicaciones anexas 35 a
38.
La especificación se relaciona adicionalmente
con el uso de una molécula de ácido nucleico, un vector o un
polipéptido de la especificación para potenciar el vigor temprano
y/o para modificar la relación raíz/brote y/o para mejorar la
resistencia a la invasión y/o para incrementar la tolerancia a la
sequía y/o para promover la propagación in vitro de
esquejes.
La especificación también se relaciona con el
uso de una molécula de ácido nucleico, un vector recombinante o un
polipéptido de la especificación para modificar el desarrollo de las
plantas y/o para modificar la morfología de las plantas y/o para
modificar la bioquímica de las plantas y/o para modificar la
fisiología de las plantas.
De acuerdo con aún otra realización, la
especificación se relaciona con una composición de diagnostico que
comprende por lo menos una molécula de ácido nucleico, un vector,
un polipéptido o un anticuerpo de la especificación.
La invención se relaciona específicamente con
tales composiciones de diagnostico como se define en la
reivindicación anexa 39.
Otra realización de la presente especificación
se relaciona con el uso de una reserva de raíces transgénicas que
tiene un crecimiento radicular potenciado y un desarrollo también
potenciado debido a la expresión de una citoquinina oxidasa en
procedimientos de injerto con un sción para producir una planta o
árbol con características agrícolas u hortícolas mejoradas. El
scion puede ser transgénico o no transgénico. Las características
especificas previstas por esta realización son las conferidas por
los sistemas radiculares e incluyen un anclaje mejorado de la
planta/árbol en el suelo y/o un consumo mejorado del agua resultante
por ejemplo en la tolerancia mejorada a la sequedad, y/o un consumo
mejorado de los nutrientes del suelo y/o un transporte mejorado de
las sustancias orgánicas a través de la planta y/o una secreción
mejorada de sustancias hacia el suelo tales como por ejemplo los
fitosideróforos, y/o una respiración mejorada y/o una resistencia
mejorada a las enfermedades y/o un rendimiento mejorado. Una
ventaja de utilizar reservas de raíz transformadas AtCKX para el
injerto, además de su sistema radicular potenciado, es la
senescencia retardada de las hojas en el injerto, como se describe
aquí (véase figura 12 A). Las plantas o árboles preferidos para
esta realización particular incluyen plantas o árboles que no
crecen bien sobre sus propias raíces y que son injertadas en
disposiciones cultivadas tales como las variedades comercialmente
explotables de vides, cítricos, albaricoques, almendras, ciruelas,
melocotones, manzana, peras, cerezas, nueces, higos, avellano y
níspero del
japón.
japón.
Como se mencionó supra, las auxinas y
citoquininas actúan como antagonistas en ciertos procesos
biológicos. Por ejemplo, la relación citoquinina/auxina regula la
producción de raíces y brotes con una alta concentración de auxina
lo que se traduce en la producción de brotes. Como se describe en
esta invención, la expresión de las citoquinina oxidasas en el
tabaco y en Arabidopsis resulta en un desarrollo potenciado
de las raíces consistente con los efectos potenciados de la auxina.
Las auxinas también están involucradas en el desarrollo de los
frutos. El tratamiento de las partes femeninas de las flores con
auxina se traduce en el desarrollo de frutas partenocárpicas en
algunas especies vegetales. El desarrollo de las frutas
partenocárpicas ha sido desarrollado por ingeniería genética en
diversas plantas de cultivo hortícola a través de biosíntesis
incrementada de auxinas en los órganos reproductores femeninos (WO
0105985).
Por lo tanto, de acuerdo con otra realización,
esta especificación se relaciona con un método para introducir el
tratamiento partenocárpico en plantas, consistiendo dicho método en
disminución de la expresión de una o más citoquinina oxidasas o de
otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en
plantas o en partes de plantas, preferiblemente en los órganos
reproductores femeninos tales como la placenta, óvulos y tejidos
derivados de la misma. La región promotora de DefH9 de la
Antirrhinum majus o uno de sus homólogos, la cual confiere
alta especificidad en la expresión en placenta y óvulos, puede ser
utilizada para este propósito.
Los expertos en la técnica estarán al tanto de
que la invención descrita aquí esta sujeta a variaciones y
modificaciones diferentes a las descritas específicamente. Debe
entenderse que la invención descrita aquí incluye todas tales
variaciones y modificaciones.
La presente invención es aplicable a cualquier
planta en particular a plantas monocotiledonias y dicotiledonias
incluyendo legumbres de alimentación o forraje, plantas
ornamentales, cultivos alimenticios, árboles, o malezas
seleccionadas de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp.,
Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara,
Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu,
Astalia fragrans, Astragalus cicer, Balklaea plurijuga, Betula
spp., Brassica spp.,Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea
frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp; Camellia sinensis, Canna
indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenome/e
s spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermun mopane,
Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumls
spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria
japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga,
Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodlum spp., Dicksonia
squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp.,
Dorycnium rectum, Echinochioa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine
coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea
schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana,
Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium
thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp,
Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma,
Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus,
Hordeumvulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia
dissoluta, Indigo Incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia,
Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Laudetia
simplex,. Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus
spp., Manihot esculenta, Medlcago sativa, Metasequoia
glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis
spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum
spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix
canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus
spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii,
Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria,
Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis,
Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus
natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia,
Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum,
Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron
giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus,
Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium
distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga
heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp. Vitis vinifera, Watsonia
pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto,
alcachofa, espárrago, brócoli, repollitas de Bruselas, repollo,
canola, zanahoria, coliflor, apio, variedades de col, greens,
linaza, berza común, lentejas, uvas, ocra, cebolla, patata, arroz,
soja, paja de cereales, remolacha de azúcar, caña de azúcar,
girasol, tomates, calabacín, y té, entre otros, o las semillas de
cualquier planta específicamente nombrada antes, o un cultivo de
tejido, célula u órgano de cualquiera de las especies
anteriores.
A lo largo de esta especificación, a menos que
el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprenden" y
variaciones tales como "comprende" y "que comprende" será
entendida para implicar la inclusión de un entero establecido o
etapas o grupos de enteros pero no exclusión de ningún otro entero o
etapa o grupo de enteros o etapas.
Según se usa aquí, el término "derivado de"
será tomado para indicar que un entero o grupo de enteros en
particular ha sido originado de las especies especificadas, pero no
necesariamente ha sido obtenido directamente de la fuente
especificada.
Los términos "proteína (s)", "péptido
(s)" u "oligopéptido (s)", cuando se usan aquí se refieren a
aminoácidos en una forma polimérica de cualquier longitud. Tales
términos incluyen también modificaciones conocidas de aminoácidos
tales como formación de puentes disulfuro, cisteinilación,
oxidación, glutationilación, metilación, acetilación, famesilación,
biotinalación, estearoilación, formilación, adición de ácido
lipoico, fosforilación, sulfación, ubiquitinación, miristoilación,
palmitoilación, geranilación, siclización (por ejemplo formación de
ácido piroglutámico) oxidación, desamidación, deshidratación,
glicocilación (por ejemplo pentosas, hexosaminas,
N-acetil hexosaminas, dexoihexosas, hexosas, ácido
siálico, etc.) y acilacion así como residuos de aminoácidos de
origen no natural, residuos de L-aminoácidos y
residuos de D-aminoácidos.
"Homólogos" de una proteína de la invención
son aquellos péptidos, oligopéptidos como polipéptidos, proteínas y
enzimas que contienen sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de
aminoácidos con respecto a dicha proteína con respecto a la cual
son homólogos, sin alterar una o más de sus propiedades funcionales,
en particular sin reducir la actividad del resultante. Por ejemplo,
un homólogo de dicha proteína consistirá de una variante de
secuencia de aminoácidos bioactivos de dicha proteína. Para producir
tales homólogos, los aminoácidos presentes en la dicha proteína
pueden ser remplazados por otros aminoácidos que tienen propiedades
similares, por ejemplo hidrofobicidad, hidrofilicidad, momento
hidrofóbico, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras
\alpha helicoidales o de \beta-deflexión, y así
sucesivamente. Una revisión de las propiedades físicas y químicas
de los aminoácidos se da en la Tabla 1.
Las variaciones sustitucionales de una proteína
de la invención son aquellas en las cuales por lo menos un residuo
de dicha secuencia de aminoácidos de la proteína ha sido eliminado y
se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones
de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero
también pueden ser aglomerados dependiendo de las restricciones
funcionales colocadas sobre el polipéptido; las inserciones serán
usualmente del orden de aproximadamente 1-10
residuos de aminoácidos, las eliminaciones variarán desde
aproximadamente 1-20 residuos. Preferiblemente, las
sustituciones de aminoácidos comprenderán sustituciones de
aminoácidos conservativos, tales como los descritos
supra.
\vskip1.000000\baselineskip
Las variantes de secuencias de aminoácidos
insertables de una proteína de la invención son aquellas en las
cuales uno o más residuos de aminoácidos son introducidos en sitios
predeterminados en dicha proteína. Las inserciones pueden
comprender fusiones aminoterminales y/o fusiones carboxi terminales
así como inserciones intrasecuencia de aminoácidos individuales o
múltiples. En general, las inserciones dentro de la secuencia de
aminoácidos serán menores que las fusiones de terminales amono o
carboxilo, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos
de proteínas o péptidos de fusión de terminal amino o carboxi
incluyen el dominio de enlace o el dominio de activación de un
activador transcripcional como el que se usa en un sistema de dos
híbridos, proteínas para recubrimiento de fagos,
(histidina)_{6}- tag, glutationa
S-transferasa, proteína A, proteína enlazante de la
maltosa, dihidrofolato reductasa, Tage*100 epítope (EETARFQPGYRS),
epítope c-myc (EQKLISEEDL), epítopo FLAG® (DYKDDDK)
LacZ, CMP (péptido enlazante de la calmodulina), epítopo HA
(YPY-DVPDYA), epítope de la proteína C
(EDQVDPRLIDGK) y epítopo VSV (YTDIMNRLGK).
Las variaciones de eliminación de una proteína
de la invención están caracterizadas por la eliminación de uno o
más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de dicha
proteína.
Las variantes de aminoácido de la proteína de la
invención pueden hacerse fácilmente utilizando técnicas de síntesis
de péptidos bien conocidas en el arte, tales como síntesis de
péptidos en fase sólida y similares, o por manipulaciones de ADN
recombinante. La manipulación de las secuencias de ADN para producir
proteínas variantes se manifestarán como variantes sustitucionales
insercionales o de eliminación bien conocidas en la técnica. Por
ejemplo, las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios
predeterminados en secuencias conocidas que tienen ADN son bien
conocidas para los expertos en la técnica, tales como la mutagénesis
por M13, la mutagénesis por T7- gen in vitro como un sistema
(USB, Cleveland, OH), el juego de mutagénesis, QuickChange Site
Directed (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida a un
sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigidas a
un
sitio.
sitio.
En la presente invención los porcentajes de
"identidad" y/o "similitud" entre secuencias de ADN y/o
proteínas se calculan utilizando programas de ordenador conocidos
en la técnica tales como los programas DNAstar/MegAlign en
combinación con el método Clustal.
"Los Derivados" de una proteína de la
invención son aquellos péptidos, oligopétidos, polipétidos,
proteínas y enzimas que comprenden por lo menos cinco residuos de
aminoácidos contiguos de dicho polipétido pero que retienen la
actividad biológica de dicha proteína. Un "derivado" puede
comprender adicionalmente residuos de aminoácidos de origen
natural, alterados por glicosilación, acilación o que no son de
origen natural en comparación con la secuencia de aminoácidos de
una forma presente en la naturaleza de dicho polipéptido.
Alternativamente o adicionalmente, un derivado puede comprender uno
o más sustituyentes ajenos a aminoácidos comparados con la
secuencia de aminoácidos de una forma natural de dicho polipétido,
por ejemplo una molécula mensajera u otro ligando, enlazada
covalente o no covalentemente a la secuencia de aminoácidos tal como
por ejemplo una molécula mensajera que está enlazada al mismo para
facilitar su detección.
Con "inmunológicamente activo" se da a
entender que una molécula o un fragmento específico de la misma tal
como un epítope específico o un hapteno específico son reconocidos,
por ejemplo, por enlazarse a los anticuerpos. Epítopes específicos
pueden determinarse utilizando, por ejemplo, técnicas de barrido de
péptidos como se describe en Geysen et al. (1996) (Geysen,
H.M., Rodda, S.J. and Mason, T.J. (1986). A priori
delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic
determinant. Mol. Immunol. 23, 709-715).
El término "fragmento de una secuencia" o
"parte de una secuencia" significa una secuencia truncada de la
secuencia original referida. La secuencia truncada (ácido nucleico
o secuencia de proteínas) puede variar ampliamente en longitud. El
tamaño mínimo de una secuencia para que tenga suficiente tamaño como
para proveer una secuencia con por lo menos una función y/o
actividad comparable a la secuencia original referida (por ejemplo
"fragmento funcional"), mientras que el tamaño máximo no es
crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo usualmente no es
sustancialmente mayor que el requerido para proporcionar la
actividad y/o función deseada de la secuencia
original.
original.
Típicamente, la secuencia de aminoácido truncada
variará desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60
aminoácidos de longitud. Más típicamente, sin embargo, la secuencia
tendrá un máximo de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud,
preferiblemente un máximo de aproximadamente 60 aminoácidos. En
general es deseable seleccionar secuencias de por lo menos 10, 12 o
15 aminoácidos hasta un máximo de aproximadamente 20 o 25
aminoácidos.
Los fragmentos funcionales también pueden
incluir los que comprenden un epítope que es específico para las
proteínas de acuerdo a la invención. Los fragmentos funcionales
preferidos tienen una longitud de por lo menos, por ejemplo, 5, 10,
25, 100, 150 0 200 aminoácidos.
Debe entenderse por lo tanto que los fragmentos
funcionales pueden ser fragmentos inmunológicamente activos o
no.
\newpage
En el contexto de la presente especificación se
incorporan homólogos derivados y/o fragmentos inmunológicamente y/o
funcionalmente activos de las citoquinina oxidasas como se definió
supra. Homólogos, derivados y/o fragmentos inmunológicamente
y/o funcionalmente activos particularmente preferidos de las
citoquinina oxidasas que se contemplan para su uso en la presente
especificación son derivados de plantas, más específicamente de
Arabidopsis thaliana, aún más específicamente dichas
citoquinina oxidasas son la Arabidopsis thaliana
(At)CKX, o son capaces de ser expresados en las mismas. La
presente especificación contempla claramente el uso de homólogos o
derivados funcionales y/o de fragmentos inmunológicamente activos de
las proteínas AtCKX y no se limita en aplicación al uso de la
secuencia de nucleótidos que codifica una de dichas proteínas
AtCKX.
Cualquiera de dichas proteínas, polipéptidos,
péptidos y fragmentos de las mismas pueden ser producidos en un
sistema biológico, por ejemplo un cultivo celular. Alternativamente,
cualquiera de dichas proteínas, polipéptidos, péptidos y fragmentos
de los mismos pueden ser manufacturados químicamente, por ejemplo,
por síntesis de péptidos en fase sólida. Dichas proteínas o
fragmentos de las mismas pueden ser parte de una proteína de fusión
como es en el caso de por ejemplo, una prueba de dos híbridos que
permite, por ejemplo, la identificación de proteínas que
interactúan con una citoquinina oxidasa de acuerdo con la
invención.
Las proteínas o fragmentos de las mismas son
útiles adicionalmente por ejemplo, para modular la interacción
entre una citoquinina oxidasa de acuerdo con la invención y
asociados proteínicos que interactúan mediante un método de la
invención. Los péptidos sintetizados químicamente son
particularmente útiles, por ejemplo, como fuente de antígenos para
la producción de antisueros y/o anticuerpos.
"Anticuerpos" incluyen anticuerpos
monoclonales, policlonales, sintéticos o de cadena pesada así como
fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fv o scFv. Los
anticuerpos monoclonales pueden ser preparados por las técnicas que
se describen por ejemplo, en Liddle y Cryer (1991) que comprende la
fusión de células de mieloma de ratón en células de bazo derivadas
de animales inmunizados. Adicionalmente los anticuerpos o fragmentos
de los mismos para una molécula o fragmentos de los mismos pueden
ser útiles obtenidos utilizando métodos como los descritos en por
ejemplo Harlow and Lane (1988). En el caso de anticuerpos dirigidos
contra péptidos pequeños tales como fragmentos de una proteína de
la invención, tales péptidos están generalmente acoplados a una
proteína portadora antes de la inmunización de los animales. Tales
proteínas portadoras incluyen hemocianina de cerradura magnética
(KLH), albúmina de suero bovino, (BSA), ovoalbúmina y toxoides de
tétano. La proteína portadora potencia la respuesta inmune en el
animal y proporciona epítopes para los sitios de enlace del receptor
de las células T. El término "anticuerpos" incluye
adicionalmente derivados de los mismos tales como anticuerpos
marcados. Marcadores de anticuerpos incluyen fosfatasa alcalina,
PKH2, PKH26, PKH67, fluoresceína (FITC), Hoechst 33258,
R-fiocoeritrina (PE), rodamina (TRITC), Rojo
Quantum, Rojo Texas, Cy3, biotina, agarosa, peroxidasa y esferas de
oro. Las herramientas en la biología molecular que se basan en
anticuerpos contra una proteína incluyen análisis por gel,
selección de la expresión por bibliotecas que permiten la
identificación de genes, métodos cuantitativos para proteínas
incluyendo ELISA y RIA, purificación de proteínas por
inmunoafinidad, inmunoprecipitación de proteínas (véase por ejemplo
el ejemplo 6) e inmunolocalización.
Otros usos de anticuerpos y especialmente de
anticuerpos peptídicos incluyen el estudio del procesamiento
proteolítico (Loffler et al. 1994, Woulfe et al.
1994), la determinación de sitios activos en las proteínas (Lerner
1982), el estudio de posicionamiento translacional y precursores
(Baron and Baltimore 1982, Lerner et al. 1981),
identificación de dominios de proteínas involucrados en la
interacción proteína-proteína (Murakami et
al. 1992) y el estudio del uso de exon en la expresión genética
(Tamura et al. 1991).
Incorporados en la siguiente especificación
están los anticuerpos que específicamente reconocen una citoquinina
oxidasa o un homólogo, derivados o fragmentos de los mismos como se
definió supra. Dicha citoquinina oxidasa preferiblemente es
una citoquinina oxidasa de una planta, más específicamente una de la
citoquinina oxidasas de la Arabidopsis thaliana (ATCKX).
Los términos "gene o (s)",
"polinucleótidos (s)", "ácido nucleico (s)", "secuencia
de ácido nucleico (s)", "secuencia de nucleótido (s)" o
"molécula de ácido nucleico (s)", cuando se usan aquí se
refieren a nucleótidos, bien sea ribonucleótidos o
desoxirribonucleótidos o combinaciones de ambos, en una forma
polimérica de cualquier longitud. Dichos términos incluyen
adicionalmente ADN y ARN de cadena doble y cadena sencilla. Dichos
términos también incluyen modificaciones a nucleótidos conocidas
tales como metilación, ciclización y "tapones", y sustitución
de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo tal
como inosina. Las modificaciones de nucleótidos incluyen la adición
de acridina, amina, biotina, azul cascada, colesterol, CY3®, CY5®,
CY5.5®, Dabicil, digoxigenina, dinitrofenilo, Edans,
6-FAM, fluoreceina, 3'-glicerilo,
HEX, IRD-700, IRD-800, JOE, fosfato
psoraleno, rodamina, ROX, tiol (SH), espaciadores, tamra, TET,
AMCA-S®, SE, BODIPY®, Marina Blue®, Pacific Blue®,
Oregon Green®, Rhodamine Green®, Rhodamine Red®, Rhodol Green® y
Texas Red®. Las modificaciones en el esqueleto de los
polinucleótidos incluyen metilfosfonato,
2'-OMe-metilfosfonato ARN,
fosforotiorata, ARN, 2'-OMeARN. Las modificaciones
de base incluyen 2-amino-dA,
2-aminopurina, 3'-(ddA), 3'dA-(cordicepina),
7-deaza-dA,
8-Br-dA,
8-oxo-dA,
n^{8}-Me-dA, un sitio abásico
(despaciador) biotina dT,
2'-OMe-5Me-C,
2'-OMe-propinil-C,
3'-(5-Me-dC), 3'-(ddC),
5-Br-dC, 5-1dC,
5-Me-dC,
5-F-dC, carboxi-dT,
dA convertible, dC convertible, dG convertible, dT convertible, dU
convertible, 7-deaza-dG,
8-Br-dG,
8-oxo-dG,
O^{6}-Me-Dg,
S6-DNP-dG,
4-metil-indol,
5-nitroindol,
2'-OMe-inocina,
2'-dL,
0^{6}-fenil-dL,
4-metil-indol,
2'-desoxinebularina, 5-nitroiridol,
2-aminopurina, dP(análogo de la purina),
dK(análogo de la pirimidina), 3-nitropirrol,
2-tio-dT,
4-tio-dT,
biotina-dT,
carboxi-dT,O^{4}-Me-dT,
O^{4}-triasol dT,
2'-OMe-propinil-U,
5-Br-dU, 2'-dU,
5'-F-dU,
5-I-dU,
O^{4}-triasol-dU. Dichos términos
también abarcan ácidos nucleicos péptídicos (PNA), un análogo de ADN
en el cual el esqueleto es un seudopéptido que consiste de unidades
de N-(2-aminoetil)-glicina en vez de
un azúcar. Los PNA imitan el comportamiento del ADN y se enlazan de
manera complementaria a las cadenas de ácidos nucleicos. El
esqueleto neutro de los PNA resulta en un enlazamiento más fuerte y
en una especificidad mayor que la alcanzada normalmente. Además,
las propiedades químicas, físicas y biológicas únicas de los PNA han
sido explotadas para producir herramientas biomoleculares
poderosas, agentes antisentido y antígenos, sondas moleculares y
biosensores.
La presente invención también provee
ventajosamente secuencias de ácidos nucleicos de por lo menos
aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de un ácido nucleico de
acuerdo con la invención y preferiblemente de 15 a 50 nucleótidos.
Estas secuencias pueden, de manera ventajosa, ser usadas como sondas
para hídridizar específicamente en secuencias de la invención como
se define más arriba o en iniciadores para iniciar la amplificación
o replicación especifica de secuencias de la invención como se
define más arriba, o similares. Tales secuencias de ácidos nucleicos
pueden ser producidas de acuerdo con técnicas bien conocidas en el
arte, tales como por medio recombinantes o sintéticos. También
pueden ser usadas en conjuntos de diagnóstico o similares para
detectar la presencia de un ácido nucleico de acuerdo con la
invención. Estas pruebas en general comprenden poner en contacto la
sonda con la muestra bajo condiciones de híbridización y detectar la
presencia de cualquier formación de duplex o triplex entre la sonda
y cualquier ácido nucleico en la muestra.
De manera ventajosa, las secuencias de ácido
nucleico, de acuerdo con la invención, pueden ser producidas
utilizando medios tales como recombinación o síntesis, tales como
por ejemplo utilizando mecanismos de clonación por PCR los cuales
generalmente involucran realizar un par de cebadores, los cuales
pueden ser aproximadamente de 15 a 50 nucleótidos en una región del
gen que se desea clonar, poniendo los cebadores en contacto con el
ARNm, ADNc o ADN genómico de una célula, llevando a cabo una
reacción en cadena de polimeras bajo condiciones que producen la
amplificación de la región deseada, aislando la región amplificada o
su fragmento y recuperando el ADN amplificado. En general, tales
técnicas tal como se definen aquí son bien conocidas en el arte, tal
como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning: a
Laboratory Manual, 1989).
Una "secuencia de codificación" o "marco
de lectura abierto" u "ORF" se define como una secuencia de
nucleótidos que puede ser transcrita en ARNm y/o traducida en un
polipéptido cuando se coloca bajo control de secuencias de control
apropiadas o secuencias reguladoras, esto es, cuando dicha secuencia
de codificación u ORF está presente en un formato que se puede
expresar. Dicha secuencia de codificación de ORF está enlazada por
un codón de inicio de traducción 5' y un codón de detención de
traducción 3'. Una secuencia de codificación u ORF puede incluir,
pero no se limita a ARN, ARNm, ADNc, secuencias de nucleótidos
recombinantes, secuencias de nucleótidos manufacturada
sintéticamente o ADN genómico. Dicha secuencia de codificación u ORF
puede ser interrumpida mediante la intervención de secuencias de
ácidos nucleicos.
Los genes y secuencias de codificación que
codifican esencialmente la misma proteína pero se aíslan de
diferentes fuentes pueden consistir de secuencias de ácidos
nucleicos divergentes sustancialmente. De manera recíproca, las
secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente divergentes pueden
ser diseñadas para efectuar la expresión de esencialmente la misma
proteína. Dichas secuencias de ácidos nucleicos son el resultado de,
por ejemplo, la existencia de diferentes alelos de un gen dado, de
la degeneración del código genético o de diferencias en el uso de
codones. Así, como se indica en la Tabla 2, los aminoácidos tales
como la metionina y el triptófano son codificados por un codón
individual mientras que otros aminoácidos tales como la arginina,
leucina y serina pueden ser traducidos a partir de 6 codones
diferentes. Las diferencias entre el uso de codón preferido se
ilustran en la Tabla 3 para Agrobacterium tumefaciens (una
bacteria), A. thaliana, M. sativa (2 plantas dicotiledoneas)
y Oryza sativa (una planta monocotiledonia). Para extraer un
ejemplo, el codón GGC (para la glicina) es el codón más
frecuentemente usado en A. tumefaciens (36.2 por 1000), es el
segundo más frecuentemente utilizado en O. sativa pero se
usa con frecuencia muchísimo menor en A. thaliana y M.
sativa (9\textperthousand y 8.4\textperthousand
respectivamente). De los 4 codones posibles que codifican la
glicina (véase Tabla 2), dicho codón GGC se usa más preferiblemente
en A. tumefaciens y O. sativa. Sin embargo, A.
thaliana este es el codón GGA (y GGU) mientras que en M.
sativa este es el codón GGU
(y GGA).
(y GGA).
La secuencias de ADN como se define en la
presente invención pueden ser interrumpidas por secuencias de
intervención. Con "secuencias de intervención" se entiende
cualquier secuencia de ácidos nucleicos que interrumpa una secuencia
de codificación comprendiendo dicha secuencia de ADN de la
invención o que interrumpe el formato que se puede expresar de una
secuencia de ADN que comprende dicha secuencia de ADN de la
invención. La eliminación de la secuencia de intervención restaura
dicha secuencia de codificación o dicho formato que se puede
expresar. Ejemplos de secuencias de intervención incluyen intrones
y secuencias de ADN movilizables tales como transposones. Con
"secuencia de ADN movilizable" se entiende cualquier secuencia
de ADN que pueda ser movilizada como resultado de un evento de
recombinación.
\vskip1.000000\baselineskip
"Hibridización" es el proceso donde
secuencias de nucleótidos complementariamente homólogas de manera
sustancial se fusionan una con otra. El proceso de hibridización
ocurre completamente en solución, esto es los ácidos nucleicos
complementarios están en solución. Las herramientas en la biología
molecular que se basan en tal proceso incluyen PCR, hibridización
sustractiva y determinación de la secuencia de ADN. El proceso de
hibridización puede ocurrir con uno de los ácidos nucleicos
complementarios inmovilizados en una matriz tal como perlas
magnéticas, perlas de Shepharose o cualquier otra resina. Las
herramientas en biología molecular que se basan en tal proceso
incluyen el aislamiento de ARNm poli (A+). El proceso de
hibridización puede ocurrir además con uno de los ácidos nucleicos
complementarios inmovilizados en un soporte sólido tal como
nitrocelulosa o membrana de naylon o inmovilizado por ejemplo
mediante fotolitografía en un soporte por ejemplo vidrio silíceo
(conocido este último como disposiciones o microdisposiciones de
ácidos nucleicos o como chips de ácidos nucleicos). Las
herramientas en biología molecular que se basan en tal proceso
incluyen el análisis de separación por gel de ARN y ADN,
hibridización por colonia, hibridización en placa e hibridización
por microdisposición. Con el fin de permitir que ocurra la
hibridización, las moléculas de ácido nucleico son desnaturalizadas
en general de manera térmica o química (por ejemplo mediante NaOH)
para fusionar una doble cadena en dos cadenas individuales y/o para
remover cortes u otras estructuras secundarias a partir de ácidos
nucleicos de cadena individual. La restricción de la hibridización
es influenciada por condiciones tales como la temperatura,
concentración de sal y composición reguladora de hibridización.
Condiciones de alta restricción para la hibridización incluyen alta
temperatura y/o bajas concentraciones de sal (las sales incluyen
NaCl y Na3-citrato) y/o la inclusión de formamida
en el regulador de hibridización y/o la disminución de la
concentración de compuestos tales como SDS (detergentes) en el
regulador de hibridización y/o la exclusión de compuestos tales como
sulfato de dextrano o polietilen glicol (que promueven la
aglomeración molecular) del regulador de hibridización. Las
condiciones convencionales de hibridización se describen en por
ejemplo, Sambrook et al. (1989) pero la persona
experimentada en la técnica entenderá que pueden diseñarse numerosas
condiciones diferentes de hibridización en función de la homología
conocida o esperada y/o de la longitud de la secuencia del ácido
nucleico. De manera suficiente las condiciones de hibridización de
baja restricción son particularmente preferidas para aislar ácidos
nucleicos heterólogos a las secuencias de ADN de la invención
definida supra. Los elementos que contribuyen a dicha
heterología incluyen alelismo, degeneración del código genético y
diferencias en el uso de codón preferido como se discutió más
arriba.
\newpage
Claramente, la presente especificación incorpora
el uso de secuencias de ADN que codifican una citoquinina oxidasa,
homóloga, derivada de fragmentos inmunológicamente activos y/o
funcionales de la misma como se define más arriba en cualquier
método de hibridización. La presente especificación adicionalmente
se relaciona con secuencias de ADN que hibridizan a dichas
secuencias de ADN. Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una
citoquinina oxidasa de plantas, más específicamente la
Arabidopsis thaliana (At) CKX.
Para efectuar la expresión de una proteína en
una célula, tejido u órgano, preferiblemente de origen vegetal, la
proteína puede ser introducida directamente en dicha célula, por
ejemplo por microinyección o por medios balísticos o
alternativamente, una molécula de ácido nucleico que codifica dicha
proteína puede ser introducida en dicha célula, tejido u órgano en
un formato que se pueda expresar.
Preferiblemente, la secuencia de ADN comprende
una secuencia codificante o un marco de lectura abierto (ORF) que
codifica una proteína de citoquinina oxidasa o un homólogo derivado
de la misma o fragmentos inmunológica y/o funcionalmente activos de
la misma como se definió supra.
La proteína preferida de la especificación
comprende la secuencia de aminoácidos de dicha citoquinina oxidasa.
Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa
de planta y más específicamente una Arbabidopsis thaliana
(At)CKX.
Con "vector" o "secuencia vectora" se
refiere a una secuencia de ADN que puede ser introducida en un
organismo por transformación y que puede ser mantenida de manera
estable en dicho organismo. El mantenimiento de un vector es
posible por ejemplo en cultivos de Escherichia coli, A.
tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces
pombe. Otros vectores tales como fagémidos y vectores cósmidos
pueden ser mantenidos y multiplicados en bacterias y/o virus. Las
secuencias de vectores generalmente comprenden un conjunto de
sitios únicos reconocidos por enzimas de restricción, en sitios de
clonación múltiple (MCS) donde una o más secuencias no vectoras
pueden ser
insertadas.
insertadas.
Con "secuencia no vectora" concordantemente
se hace referencia a una secuencia de ADN que está integrada en uno
o más de los sitios del MCS comprendido dentro de un vector.
"Vectores de expresión" forman un
subconjunto de vectores los cuales, en virtud de comprender las
secuencias reguladoras o de control apropiadas habilitan la
creación de un formato que se puede expresar para la inserción de
secuencias no vectoras permitiendo así la expresión de la proteína
codificada por dichas secuencias no vectoras. Los vectores de
expresión son conocidos en la técnica porque habilitan la expresión
de las proteínas en organismos que incluyen bacterias (por ejemplo
E. coli), hongos (por ejemplo S. cerevislae, S. pombe,
Pichia pastoris), células de insectos (por ejemplo vectores de
expresión báculoviral), células animales (por ejemplo células COS o
CHO) y células vegetales (por ejemplo vectores de expresión basados
en el virus X de la patata).
La presente especificación incluye claramente
cualquier citoquinina oxidasa, homólogo, derivado y/o fragmento
inmunológicamente activo y/o funcional de la misma como se definió
supra. Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una
citoquinina oxidasa de planta más, más específicamente una
Arabidopsis thaliana (At)CKX.
Como una alternativa a la producción de
proteínas mediada por el vector de expresión en sistemas biológicos,
la síntesis química de proteínas puede aplicarse también. Los
péptidos sintéticos pueden ser manufacturados en fase de solución o
en fase sólida. La síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield
1963) es sin embargo la manera más común e involucra la adición
secuencial de aminoácidos para crear una cadena de péptidos lineal.
La síntesis de péptidos en fase sólida incluye ciclos consistentes
de tres etapas: (i) inmovilización del aminoácido carboxi terminal
de la cadena creciente de péptidos a un soporte o resina sólidos;
(ii) ensamblaje de la cadena, un proceso que consiste de
activación, acoplamiento y desprotección del aminoácido que se va a
añadir a la cadena de péptido en crecimiento; y (iii) ruptura
involucrando la remoción de la cadena peptídica completa a partir
de la resina y remoción de los grupos protectores de las cadenas
laterales de los aminoácidos. Las modalidades comunes en la
síntesis de péptidos en fase sólida incluyen Fmoc/tBu
(9-fluorenilmetiloxicarbonil/t-butil)
y Boc (t-butiloxicarbonilo) como los grupos
protectores de las aminoácidos terminales de la cadena lateral de
aminoácidos con grupos que incluyen metilo (Me), Formilo (CHO),
etilo (Et), acetilo (Ac), t-butilo
(t-Bu), anisilo, bencilo (Bzl), trifluoroacetilo
(Tfa), N-hidoxisuccinimida (ONSu, Osu), benzoilo
(Bz), 4- metilbencilo (Meb), tioanicilo, tiopercilo, bencil
oximetilo (Bom), 4-nitrofenilo (ONp),
benciloxicarbonilo (Z), 2-nitrobenciloxi (NBz),
2-nitrofenilsulfenilo (Nps),
4-toluenosulfonilo (Tosilo, Tos), pentafluorofenilo
(Pfp), difenilmetilo (Dpm),
2-chlorobenciloxicarbonilo (Cl-Z),
2,4,5-triclorofenilo,
2-bromobenciloxicarbonilo (Br-Z),
trifenilmetilo (Tritilo, Trt), y
2,5,7,8-pentametil-croman-6-sulfonilo
(Pmc). Durante el ensamblaje de la cadena, el Fmoc o el Boc son
eliminados resultando en un extremo amino activado del residuo de
aminoácidos enlazado a la cadena en crecimiento. El extremo carboxi
del aminoácido entrante es activado por conversión en un éster
altamente reactivo, como por ejemplo, mediante HBTU. Con
tecnologías normales, (por ejemplo el sintetizador PerSeptive
Biosystems 9050, Applied Biosystems Modelo 431A Sintetizador de
Péptidos), puede manufacturarse péptidos lineales de hasta 50
residuos. Está disponible un cierto numero de guías para producir
péptidos que son adecuados para su uso en sistemas biológicos
incluyendo (i) limitar el uso de aminoácidos difíciles tales como
cys, met, trp (fácilmente oxidados y/o degradados durante la
síntesis de péptidos) o arg; (ii) minimizar los aminoácidos
hidrófobos (pueden impedir la solubilidad de los péptidos); y (iii)
evitar un ácido glutámico terminal en amino (puede ciclizarse
a
piroglutamato).
piroglutamato).
Por "formato que se puede expresar" se
entiende que la molécula de ácido nucleico aislada está en una forma
adecuada para ser transcrita en ARNm y/o traducida para producir
una proteína, bien de manera constitutiva o siguiendo inducción
mediante una señal intracelular o extracelular, tal como un estímulo
ambiental o de estrés (mitógenos, anoxia, hipoxia, temperatura,
sal, luz, deshidratación, etc.) o un compuesto químico tal como
IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido)
tal como un antibiótico (tetraciclina, ampicilina, rifampicina,
kanamicina) una hormona (por ejemplo giberelina, auxina,
citoquinina, glucocorticoides, brasinosteroide, etileno, ácido
abscísico, etc.), un análogo de una hormona (ácido indolacético
(IAA) 2,4-D, etc.), un metal (zinc, cobre, hierro,
etc.) o dexametasona, entre otros. Como será evidente para aquellos
expertos en la técnica, la expresión de una proteína funcional
puede también requerir una o más modificaciones
post-translacionales, tales como glicosilación,
fosforilación, desfosforilación, o una o más interacciones
proteína-proteína, entre otras. Todos estos
procesos están incluidos dentro del alcance del término "formato
que se puede expresar".
Preferiblemente, la expresión de una proteína en
una célula, tejido u órgano específico, preferiblemente de origen
vegetal se efectúa introduciendo y expresando una molécula de ácido
nucleico aislada que codifica dicha proteína, tal como una molécula
de ADNc, un gen genómico, una molécula de oligonucleótido sintética,
una molécula de ARNm o un marco de lectura abierto, a dicha célula,
tejido u órgano, donde dicha molécula de ácido nucleico se coloca
de manera operativa en conexión con secuencias reguladoras o de
control adecuadas que incluyen un promotor, preferiblemente un
promotor que se puede expresar en una planta y una secuencia de
terminación.
Las referencias aquí a un "promotor" deben
tomarse en su contexto más amplio e incluyen las secuencias
reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico
eucariótico clásico, incluyendo la caja TATA la cual se requiere
para una iniciación de la transcripción exacta, con o sin una
secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores o de control
adicionales (esto es, secuencias activadoras corriente arriba,
potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión genética en
respuesta a estímulos de desarrollo y/o externos, o en una forma
específica para un
tejido.
tejido.
El término "promotor" también incluye las
secuencias reguladoras transcripcionales de un gen procariótico
clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y
secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10.
El término "promotor" también se utiliza
para describir una molécula sintética o de fusión, o derivados que
confieren, activan o potencian la expresión de una molécula de ácido
nucleico en una célula, tejido u órgano.
Los promotores pueden contener copias
adicionales de uno o más elementos reguladores específicos, para
potenciar adicionalmente la expresión y/o para alterar la expresión
espacial y/o la expresión temporal de una molécula de ácido
nucleico a la cual se conecta de manera operativa. Tales elementos
reguladores pueden ser colocados adyacentes a una secuencia
promotora heteróloga para conducir la expresión de la molécula de
ácido nucleico en respuesta a, por ejemplo, cobre,
glucocorticoides, dexametasona, tetraciclina, giberelina, AMPc,
ácido abscísico, auxina, heridas, etileno, jasmonato o ácido
salicílico o para conferir la expresión de una molécula de ácido
nucleico a células, tejidos y órganos específicos tales como
meristemas, hojas, raíces, embriones, flores, semillas o
frutos.
frutos.
En el contexto de la presente invención, el
promotor preferiblemente es una secuencia promotora que se puede
expresar en una planta. Los promotores que también funcionan o
funcionan unicamente en células que no provienen de plantas tales
como bacterias, células de levadura, células de insectos y células
animales no están excluidas de la invención. Por "que se puede
expresar en una planta", se entiende que la secuencia promotora,
incluyendo cualquier elemento regulador adicional añadido a la
misma o contenido en la misma, es por lo mismo capaz de inducir,
conferir, activar o potenciar la expresión en una célula, tejido u
órgano de una planta, preferiblemente una célula, tejido u órgano
de una planta monocotiledonea o dicotiledonea.
Los términos "operable en planta" y
"operable en una planta", cuando se usan aquí, con respecto a
una secuencia promotora, deben tomarse como equivalentes a una
secuencia promotora que se puede expresar en una planta.
Los promotores regulables como parte de un
sistema de expresión viral binario en una planta también son
conocidos para las personas expertas (Yadav 1999 - W09922003; Yadav
2000 - WO0017365).
En el contexto presente, una "secuencia
promotora regulable" es un promotor que puede ser capaz de
conferir expresión sobre un gen estructural en una célula, tejido u
órgano en particular o grupos de células, tejidos u órganos de una
planta, opcionalmente bajo condiciones específicas, aunque
generalmente no confieren expresión a través de la planta bajo
todas las condiciones. De acuerdo con ello, una secuencia promotora
regulable puede ser una secuencia promotora que confiere expresión
sobre un gen al cual está conectada de manera operable en una
localización particular dentro de la planta o alternativamente, a
través de la planta bajo un conjunto específico de condiciones,
tales como la inducción siguiente de la expresión del gen mediante
un compuesto químico u otro elicitor.
De manera preferible, el promotor regulable
utilizado en el desarrollo de la presente invención confiere
expresión en una localización específica dentro de la planta, bien
constitutivamente o siguiendo la inducción, sin embargo no en la
planta completa bajo ninguna circunstancia.
\newpage
Incluidos dentro del alcance de tales promotores
están las secuencias promotoras específicas para células,
secuencias promotoras específicas para tejidos, secuencias
promotoras específicas para órganos, secuencias promotoras de genes
específicas para el ciclo celular, secuencias promotoras inducibles
y otras secuencias promotoras constitutivas que pueden haber sido
modificadas para conferir expresión en una parte particular de la
planta en cualquier momento dado, tal como mediante la integración
de dicho promotor constitutivo dentro de un elemento genético
trasponible (Ac, Ds, Spm, En, o sus transposones).
De la misma forma, el término "específico para
tejido" debe tomarse para indicar que la expresión está
predominantemente en un tejido o tipo de tejido particular,
preferiblemente de origen vegetal, aunque no necesariamente
exclusivo en dicho tejido o tipo de tejido.
De la misma forma, el término "específico para
órganos" debe tomarse para indicar que la expresión está
particularmente en un órgano, preferiblemente de origen vegetal,
aunque no de manera necesaria exclusivamente en dicho órgano.
De la misma forma, el término "específico de
ciclo celular", debe tomarse para indicar que la expresión es
predominantemente cíclica y ocurre en una o más fases, no
necesariamente consecutivas del ciclo celular si bien no
necesariamente de forma exclusiva en células cíclicas,
preferiblemente de origen vegetal.
Los expertos en la técnica estarán atentos a que
"un promotor inducible" es un promotor de la actividad
transcripcional de la cual es incrementado o inducido en respuesta
a un estímulo de desarrollo, químico, ambiental o físico. De la
misma forma, la persona experta en la técnica entenderá que un
"promotor constitutivo" es un promotor que es
transcripcionalmente activo a lo largo de la mayoría de, pero
necesariamente no de todas las partes de un organismo,
preferiblemente una planta, durante la mayor parte de, pero no
necesariamente todas las fases de su crecimiento y desarrollo.
Las personas expertas en la técnica serán
fácilmente capaces de seleccionar secuencias promotoras apropiadas
para su uso en la expresión apropiada reguladora de la proteína de
citoquinina oxidasa a partir de fuentes públicamente disponibles o
fácilmente disponibles, sin una experimentación indebida.
Colocar una molécula de ácido nucleico bajo el
control regulador de una secuencia promotora o en una conexión
operativa con una secuencia promotora significa posicionar dicha
molécula de ácido nucleico de manera tal que la expresión es
controlada por la secuencia promotora. Un promotor es usualmente,
pero no necesariamente, posicionado corriente arriba o en el
extremo 5', y dentro de 2 kb del sitio de inicio de la
transcripción, de la molécula de ácido nucleico que regula. La
construcción de combinaciones promotor/gen estructural heterólogas
se prefiere generalmente posicionar el promotor a una distancia del
sitio de inicio de la transcripción del gen que es aproximadamente
la misma que la distancia entre el promotor y el gen que controla en
su disposición natural (esto es, el gen desde el cual se deriva el
promotor). Como se conoce en la técnica, puede acomodarse alguna
variación en la distancia sin pérdida de la función promotora. De la
misma forma, el posicionamiento preferido de un elemento de
secuencia regulador con respecto a un gen heterólogo que puede ser
colocado bajo su control está definido por el posicionamiento del
elemento en su localización natural (esto es, el gen desde el cual
es derivado). De nuevo, como se conoce en la técnica, puede también
presentarse alguna variación en la distancia.
Ejemplos de promotores adecuados para su uso en
constructos de genes de la presente invención incluyen los que
aparecen en lista en la Tabla 4, entre otros. Los promotores en
lista en la Tabla 4 se proveen para los propósitos de
ejemplificación solamente y la presente invención no está limitada
por la lista provista aquí. Los expertos en la técnica estarán
fácilmente en posición de proveer promotores adicionales que son
útiles en llevar a cabo la presente
invención.
invención.
En el caso de promotores constitutivos o
promotores que inducen la expresión a lo largo de la planta
completa, se prefiere que tales secuencias sean modificadas
mediante la adición de secuencias de nucleótidos derivadas de uno o
más de los promotores específicos de tejido que se listan en la
Tabla 4, o alternativamente, secuencias de nucleótido derivadas de
uno o más de los anteriores promotores inducibles específicos de
tejido mencionados, para conferir especificidad al tejido sobre las
mismas. Por ejemplo, el promotor CaMV 35S puede ser modificado
mediante la adición de la secuencia promotora Adh1 del maíz,
para conferir una expresión específica de raíz regulada de manera
anaerobia, como se describió previamente (Ellis et al.,
1987). Otro ejemplo describe el conferir una expresión genética
abundante para raíz o específica de raíz fusionando el promotor
CaMV35S con elementos de la proteína de maíz rica en glicina del
gen GRP3 (Feix and Wulff 2000 - WO0015662). Tales modificaciones
pueden ser alcanzadas mediante experimentación de rutina por las
personas expertas en la técnica. El término "terminador" se
refiere a una secuencia de ADN al final de una unidad
transcripcional que señala la terminación de la transcripción. Los
terminadores son secuencias de ADN 3' no traducidas que contienen
una señal de poliademilación, la cual facilita la adición de
secuencias de poliademilato al extremo 3' de un transcripto
primario. Los terminadores activos en las células derivadas de
virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y
plantas son conocidos y descritos en la literatura. Pueden ser
aislados a partir de bacterias, hongos, virus, animales y/o
plantas.
plantas.
Ejemplos de terminadores particularmente
adecuados para uso en constructos genéticos de la presente invención
incluyen la nopalina sintasa de la Agrobacterium tumefaciens
(NOS) como terminador de gen, la secuencia terminadora de gen de
octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (OCS), la
secuencia terminadora de gen de (CaMV) 35S del virus mosaico de la
coliflor, la secuencia terminadora de la ADP-glucosa
pirofosforilaza de Oryza sativa (t3'Bt2), la secuencia
terminadora de gen de la zeina de la Zea mays, el terminador
de gen de rbcs-1A, y las secuencias
terminadoras de gen rbcs-3A, entre otros.
Secuencias promotoras preferidas de la invención
incluyen promotores específicos de raíz tales como pero no
limitados a los que aparecen enlistados en la Tabla 5 y que se
bosquejan en los ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los expertos en la técnica estarán atentos a
secuencias promotoras y secuencias terminadoras adicionales que
pueden ser adecuadas para ejecutar la invención. Tales secuencias
pueden ser utilizadas fácilmente sin ninguna experimentación
indebida. En el contexto de la presente invención, "expresión
ectópica" o "sobreexpresión ectópica" de un gen o una
proteína se refieren a patrones de expresión y/o niveles de
expresión de dicho gen o proteína que normalmente no se presentan
bajo condiciones naturales, más específicamente significan
expresión incrementada y/o niveles de expresión incrementada. La
expresión ectópica puede alcanzarse de diversas maneras incluyendo
el enlace operativo de dicha proteína que codifica la secuencia de
codificación con un promotor homólogo o heterólogo aislado con el
fin de crear un gen quimérico y/o enlazando de manera operativa
dicha secuencia codificadora a su propio promotor aislado (esto es,
el promotor no aislado que conduce de manera natural la expresión
de dicha proteína) con el fin de crear una duplicación de gen
recombinante o un efecto de multiplicación de gen. Con
"coexpresión ectópica" se indica la expresión ectópica o la
sobreexpresión ectópica de dos o más genes o proteínas. Los mismos,
o más preferiblemente, promotores diferentes se utilizan para
conferir expresión ectópica de dichos genes o
proteínas.
proteínas.
Preferiblemente, la secuencia promotora
utilizada en el contexto de la presente invención está enlazada de
manera operativa a una secuencia codificadora o a un marco de
lectura abierto (ORF) que codifica una proteína citoquinina oxidasa
o un homólogo derivado o un fragmento inmunológicamente activo y/o
funcional de la misma como se definió supra.
"La regulación en disminución de la
expresión" como se usa aquí significa disminuir los niveles de la
expresión genética y/o niveles de producto del gen activo y/o
niveles de la actividad del producto del gen.
Los descensos en la expresión pueden ser
alcanzados por ejemplo mediante la adición de secuencias
codificadoras o partes de las mismas en una orientación en sentido
(si resulta en una cosupresión) o en una orientación antisentido
con respecto a la secuencia del promotor y adicionalmente por
ejemplo mediante la inserción de mutagénesis (por ejemplo,
inserción de T-ADN o inserción de transposones) o
por estrategias de silenciamiento de genes como se describen por
ejemplo Angell y Baulcombe (1998 - WO9836083), Lowe et al.
(1989 - WO9853083), Lederer et al. (1999- WO9915682) or Wang
et al. (1999 - WO9953050). Los constructos genéticos buscados
con la expresión de silenciamiento de gen pueden tener la secuencia
del nucleótido y dicho gen (o una o más partes del mismo contenidas
en una orientación sentido y/o antisentido con respecto a la
secuencia del promotor. Otro método para regular hacia el descenso
la expresión del gen comprende el uso de ribozimas.
La modulación, incluyendo la disminución, del
nivel de los productos del gen activo o la actividad del producto
del gen pueden ser alcanzados si administrando o exponiendo las
células, tejidos órganos u organismos a dicho producto del gen o a
un homólogo, derivado y/o fragmento inmunológicamente activo del
mismo. La inmunomodulación es otro ejemplo de una técnica capaz de
niveles de regulación hacia el descenso de un producto activo del
gen y/o de la actividad del producto del gen y comprende la
administración de, o la exposición a los anticuerpos que expresan
dicho producto de gen hacia o en células, tejidos, órganos u
organismos donde los niveles de dicho producto de gen y/o actividad
de producto de gen deben ser modulados. Tales anticuerpos comprenden
"planticuerpos", anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos
IgG y anticuerpos de cadena pesada así como fragmentos de los
mismos.
La modulación, incluyendo la disminución, del
nivel de productos activos de gen o de la actividad del producto de
gen pueden adicionalmente ser alcanzados administrando o exponiendo
las células, tejidos, órganos u organismos a un agonista de dicho
producto de gen o de la actividad del mismo. Tales agonistas
incluyen proteínas (que comprenden por ejemplo, quinasas y
proteinasas) y compuestos químicos identificados de acuerdo con la
invención presente como se describió más arriba.
En el contexto de la presente especificación se
prevé la regulación hacia el descenso de la expresión de un gen de
citoquinina oxidasa como se definió más arriba. Preferiblemente
dicho gen de citoquinina oxidasa es un gen de citoquinina oxidasa
de una planta, más específicamente un AtCKX. La especificación
comprende adicionalmente la regulación en descenso de niveles de
una proteína de citoquinina oxidasa o de una actividad de
citoquinina oxidasa mediante la cual dicha proteína de citoquinina
oxidasa ha sido definida más arriba. Preferiblemente dicha proteína
citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa de una planta más
específicamente una AtCKX.
Por el término "modificando el destino de la
planta y/o el desarrollo y/o la morfología y/o la bioquímica y/o la
fisiología de la planta" se da a entender que una o más
características de desarrollo y/o morfológicas y/o bioquímicas y/o
fisiológicas de una planta se alteran mediante la ejecución de una o
más etapas que incumben a la invención descrita aquí.
"Destino de las células" se refiere al tipo
de célula o características celulares de una célula particular que
son producidas durante el desarrollo de la planta o de un proceso
celular para la misma en particular durante el ciclo celular o como
consecuencia de un proceso de ciclo celular.
"Desarrollo de planta" o el término
"característica de desarrollo de planta" o un término similar,
cuando se use aquí se tomará el significado de cualquier proceso
celular de una planta que está involucrado en la determinación del
destino de desarrollo de una célula de una planta, en particular el
tipo de tejido u órgano específico en el cual se desarrollará una
célula progenitora. Los procesos celulares relevantes para el
desarrollo de las plantas serán conocidos por aquellos
experimentados en la técnica. Tales procesos incluyen, por ejemplo,
morfogénesis, fotomorfogénesis, desarrollo de brotes, desarrollo de
raíces, desarrollo vegetativo, desarrollo reproductivo, elongación
del tallo, floración, y mecanismos reguladores involucrados en
determinar el destino de la célula, en particular un proceso o un
proceso regulador que involucra el ciclo celular.
"Morfología de planta" o el término
"característica de la morfología de la planta" o término
similar, cuando se use aquí será entendido por aquellos expertos en
la técnica como referencia a la apariencia externa de una planta,
incluyendo uno cualquiera o más rasgos estructurales o combinación
de rasgos estructurales de la misma. Tales rasgos estructurales
incluyen la forma, tamaño, número, posición, color, textura,
disposición, y patrones de cualquier célula, tejido u órgano o
grupos de células, tejidos u órganos de una planta, incluyendo la
raíz, tallo, hoja, brote, pecíolo, tricomo, flor, pétalo, estigma,
estilo, estamen, polen, óvulo, semilla, embrión, endoesperma,
recubrimiento de semilla, aleurona, fibra, fruto, cambium, madera,
maderamen, parénquima, arénquima, elemento de tamiz, floema, o
tejido vascular, entre otros.
"Bioquímica de la planta" o el término
"característica bioquímica de la planta" o un término similar
cuando se use aquí, será entendido por aquellos expertos en la
técnica como referencia a los procesos metabólicos y catalíticos de
una planta, incluyendo el metabolismo primario y secundario y el
proceso de los mismos, incluyendo cualquier molécula pequeña,
macromoléculas o compuestos químicos, tales como pero no limitándose
a almidones, azúcares, proteínas, péptidos, enzimas, hormonas,
factores de crecimiento, moléculas de ácidos nucleicos, celulosas,
hemicelulosas, callosas, lectinas, fibras, pigmentos tales como
antocianinas, vitaminas, minerales, micronutrinetes o
macronutrientes, que son producidos por las plantas.
"Fisiología de la planta" o el término
"característica fisiológica de una planta" o términos
similares, cuando se usen se entenderán como referencia a los
procesos funcionales de una planta, incluyendo procesos de
desarrollo tales como crecimiento, expansión y diferenciación,
desarrollo sexual, reproducción sexual, producción de semillas,
desarrollo de semillas, llenado de granos, reproducción asexual,
división celular, latencia, germinación, adaptación a la luz,
fotosíntesis, expansión de las hojas, producción de fibras,
crecimiento secundario o producción de madera, entre otros;
respuestas de una planta a factores aplicados externamente tales
como metales, productos químicos, hormonas, factores de
crecimiento, ambiente factores de estrés ambiental (por ejemplo
anoxia, hipoxia, alta temperatura, baja temperatura, deshidratación,
luz, duración del día, inundación, sal, metales pesados, entre
otros), incluyendo respuestas adaptativas de las plantas a dichos
factores aplicados externamente.
Los medios para introducir ADN recombinante en
los tejidos o células de una planta incluyen, pero no se limitan, a
la transformación utilizando CACL2 y variaciones de la misma, en
particular el método descrito por Hanahan (1983), consumo directo
de ADN en los protoplastos (Krens et al, 1982
Paszkowski et al, 1984), consumo de protoplastos mediados
por PEG (Armstrong et al, 1990), bombardeo con
micropartículas, electroporación (Fromm et al, 1985),
microinyección de ADN (Crossway et al, 1986), bombardeo con
micropartículas de esquejes o células de tejido (Christou et
al, 1998; Sanford, 1988), infiltración al vacío de tejidos con
ácidos nucleicos, o en el caso de las plantas, transferencia mediada
por T-ADN desde Agrobacterium al tejido de
la planta como se describe esencialmente por An et al.
(1985), Dodds et al., (1985),
Herrera-Estrella et al. (1983a, 1983b,
1985). Los métodos para la transformación de plantas
monocotiledoneas son bien conocidos en la técnica e incluyen la
transformación mediada por Agrobacterium (Cheng et
al., 1997 - WO9748814; Hansen 1998 - WO9854961; Hiei et
al., 1994 - WO9400977; Hiei et al., 1998 - WO9817813;
Rikiishi et al., 1999 - WO9904618; Saito et al., 1995
- WO9506722), bombardeo con microproyectiles (Adams et al.,
1999 - US5969213; Bowen et al., 1998 - US5736369; Chang
et al:, 1994 - WO9413822; Lundquist et al., 1999 -
US5874265/US5990390; Vasil and Vasil, 1995 - US5405765. Walker
et al., 1999 - US5955362), DNA uptake (Eyal et al.,
1993 - WO9318168), microinyección de células de
agrobacterium (von Holt, 1994-De 4309203), y
sonicación (Finer et al, 1997- US5693512).
Para el bombardeo con micropartículas de
células, una micropartícula es impulsada hacia una célula para
producir una célula transformada. Cualquier metodología y aparato
para transformación celular por balística adecuados pueden ser
utilizados para ejecutar la presente invención. Aparatos y
procedimientos de ejemplos están descritos por Stomp et al.
(U.S. Patent No. 5,122,466) y Sanford y Wolf (U.S. Patent No.
4,945,050). Cuando se utilizan procedimientos de transformación
balística, el constructo del gen puede incorporar un plásmido capaz
de replicar en la célula que va ser transformada. Ejemplos de
micropartículas adecuadas para su uso en tales sistemas incluyen
esferas de oro de 1 a 5 \mum. El costructo de ADN puede ser
depositado sobre la micropartícula por cualquier técnica adecuada,
tal como precipitación.
Una planta completa puede ser regenerada a
partir de la célula transformada o transfectada; de acuerdo con
procedimientos bien conocidos en la técnica. El tejido de planta
capaz de una propagación clonal subsecuente, bien por organogénesis
o embriogénesis, puede ser transformado con un constructo de gen de
la presente invención y regenerarse una planta completa a partir
del mismo. El tejido particular escogido variará dependiendo de los
sistemas de propagación clonales disponibles, para, y mejor
adecuados a, las especies particulares que están siendo
transformadas. Ejemplos de dianas de tejido incluyen discos de
hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos,
tejido de callus, tejido meristemático existente (por ejemplo
meristema apical, brotes axilares y meristemas de raíz), y tejido
de meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledon y
meristema de hipocotilo.
El término "organogénesis" tal como se usa
aquí significa un proceso mediante el cual brotes y raíces se
desarrollan secuencialmente a partir de centros meristemáticos.
El término "embriogénesis", tal como se usa
aquí, significa un proceso mediante el cual brotes y raíces se
desarrollan juntos de una forma concertada (no secuencialmente),
bien a partir de células somáticas o gametos.
Preferiblemente, la planta producida de acuerdo
con el método de la invención es transfectada o transformada con
una secuencia genética, o es suscepetible de la introducción de una
proteína, por medios reconocidos en la técnica, tales como el
bombardeo con microproyectiles, microinyección, transformación
mediada por Agrobacterium (incluyendo la transformación
in planta), fusión de protoplastos o electroporación, entre
otros. Más preferiblemente dicha planta es producida por
transformación mediada por Agrobacterium.
La transformación mediada por
Agrobacterium o la transformación agrolística de las plantas,
levaduras, mohos u hongos filamentosos se basa en la transferencia
de parte de las secuencias vectoras de la transformación, llamadas
el ADN-T, al núcleo y por integración de dicho
ADN-T en el genoma de dicha eucariota.
Con "Agrobacterium" se indica un
miembro de la Agrobacteriaceae con más preferiblemente
Agrobacterium o Rhizobacterium y más preferiblemente
Agrobacterium tumefaciens.
Con "ADN-T" o ADN
transferido, se indica que parte del vector de transformación
flanqueado por las fronteras del ADN-T el cual es,
después la activación del género Agrobacterium vir, unido a
las fronteras de ADN-T y es transferido como un ADN
de cadena sencilla al núcleo de una célula eucariota.
Cuando se usa aquí, con "fronteras de
ADN-T", "región de frontera de
ADN-T", o "región de frontera", se indica
bien la frontera de ADN-T (BR) de la derecha, o la
frontera de ADN-T (Lb) de la izquierda. Tal frontera
comprende una secuencia núcleo flanqueada por una región interna de
frontera como parte del ADN-T que flanquea la
frontera y/o una región de frontera externa como parte del
esqueleto vector que flanquea la frontera. La secuencia núcleo
comprende 22 bp en caso de los vectores tipo octopina y 25 bp en
caso de los vectores tipo nopalina. Las secuencias de núcleo en la
región de frontera derecha y en la región de frontera izquierda
forman repeticiones imperfectas. Las secuencias de núcleo en la
frontera son indispensables para el reconocimiento y procesamiento
del complejo de unión con Agrobacterium que consiste de por
lo menos VirD1 y VirD2. Las secuencias núcleo que flanquean un
ADN-T son suficientes para promover la transferencia
de dicho ADN-T. Sin embargo, la eficiencia de la
transformación utilizando vectores de transformación que portan
dicho ADN-T únicamente flanqueado por dicha
secuencias núcleo es baja. Las regiones de frontera interna y
frontera externa son conocidas por modular la eficiencia de la
transferencia de ADN-T (Wang et al, 1987). Un
elemento que potencia la transferencia de ADN-T ha
sido caracterizado y reside en la región de la frontera externa
derecha y se denomina sobreconductora (Peralta et al. 1986,
van Haaren et al. 1987).
Con "vector de transformación de
ADN-T" o "vector ADN-T" se
indica cualquier vector que abarque una secuencia
ADN-T flanqueada por una frontera de
ADN-T derecha e izquierda consistente de por lo
menos las secuencias de núcleo de frontera derecha e izquierda,
respectivamente, y se utiliza para la transformación de cualquier
célula eucariótica.
Con "secuencia de esqueleto de vector de
ADN-T" o "secuencias de esqueleto de vector de
ADN-T" se indica todo el ADN de un vector que
contiene ADN-T que cae por fuera de las fronteras
del ADN-T y, más específicamente, por fuera de los
sitios de unión de las repeticiones imperfectas del núcleo de
frontera.
La presente invención incluye vectores de
ADN-T optimizados de tal manera que la integración
del esqueleto del vector en el genoma de una célula eucariótica es
minimizada o ausente. Con "vector de ADN-T
optimizado" se indica un vector de ADN-T
diseñado bien para disminuir o abolir la transferencia de secuencias
del esqueleto del vector al genoma de una célula eucariótica. Tales
vectores de ADN-T son conocidos para los que están
familiarizados con la técnica e incluyen los descritos por Hanson
et al. (1999) and by Stuiver et al. (1999 -
WO9901563).
La presente especificación considera claramente
la inclusión de una secuencia de ADN que codifica una citoquinina
oxidasa, homólogo, derivado o fragmento immunológicamente activo y/o
funcional de la misma como se define más arriba, en cualquier
vector de ADN-T que comprende vectores de
transformación binaria, vectores de transformación superbinaria,
vectores de transformación cointegrada, vectores de transformación
derivados de Ri así como en vectores de transporte de
ADN-T usados en la transformación agrolística.
Preferiblemente, dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina
oxidasa de una planta, más específicamente una Arabidopsis
thaliana (At) CKX.
Con "vector de transformación binaria" se
indica un vector de transformación de ADN-T que
comprende:
- (a)
- una región de ADN-T que comprende por lo menos un gen de interés y/o por lo menos un marcador activo seleccionable en la célula eucariótica que va ser transformada; y
- (b)
- una región de esqueleto de vector que comprende por lo menos los orígenes de replicación activa en E. coli y Agrobacterium y marcadores para la selección en E. coli y Agrobacterium.
Las fronteras de ADN-T del
vector de transformación binaria pueden ser derivadas a partir de
plásmidos tipo octopina o tipo nopalina Ti o de ambos. El
ADN-T de un vector binario solamente es transferido
a una célula eucariótica en conjunción con un plásmido de
ayuda.
Con "plásmido de ayuda" se indica un
plásmido que se mantiene de manera estable en el
Agrobacterium y que por lo menos porta un conjunto de genes
vir necesarios para permitir la transferencia del
ADN-T. Dicho conjunto de genes vir puede ser
derivado bien de los plásmidos tipo octopina o tipo nopalina Ti o de
ambos.
Con "vector de transformación superbinaria"
se indica un vector de transformación binaria que porta
adicionalmente en la región del esqueleto del vector una región
vir del plásmido Ti pTiBo542 de la sepa supervirulenta A.
tumefaciens A281 (EP0604662, EP0687730). Los vectores de
transformación binaria son utilizados en conjunción con un plásmido
de ayuda.
Con "vector de transformación cointegrado"
se indica un vector ADN-T que comprende por lo
menos:
- (a)
- una región ADN-T que comprende por lo menos un gen de interés y/o por lo menos un marcador seleccionable activo en plantas; y
- (b)
- una región de esqueleto de vector que comprende por lo menos orígenes de replicación activos en Escherichia coli y Agrobacterium, y marcadores para selección en E. coli y Agrobacterium, y un conjunto de genes vir necesarios para habilitar la transferencia del ADN-T.
Las fronteras de ADN-T y dicho
conjunto de genes vir de dicho vector ADN-T
pueden derivarse a partir de los plásmidos tipo octopina o tipo
nopolina Ti o de ambos.
Con "vectores de transformación de planta
derivado de Ri" se indica un vector de transformación binario en
el cual las fronteras de ADN-T son derivadas de un
plásmido Ti y dicho vector de transformación binario se usa en
conjunción con un plasmido Ri "de ayuda" que porta el conjunto
necesario de genes vir.
Según se usa aquí, el término "gen marcador
seleccionable" o "marcador seleccionable" o "marcador para
selección" incluye cualquier gen que confiera un fenotipo sobre
una célula en la cual se expresa para facilitar la identificación
y/o selección de células que son transfectadas o transformadas con
un constructo de gen de la invención o un derivado de la misma.
Genes marcadores seleccionables adecuados contemplados aquí incluyen
el de resistencia a ampicilina (AMP^{r}), gen de resistencia a la
tetraciclina (TC^{r}), gen de resistencia bacteriana a la
canamicina (KAN^{r}), gen de resistencia a la fosfinotricina, gen
de fosfotransferasa neomicina (NPTIL), gen de resistencia a la
higromicina, gen de \beta-glucuronidasa (GUS), gen
de la cloramfenicol acetil transferasa (CAT), gen de la proteína de
fluorescencia verde (gfp) (Haseloff et al, 1997), y gen
luciferasa, entre otros.
Con "agrolísticos", "transformación
agrolística" o "transferencia agrolística" se indica aquí un
método de transformación que combina características de la
transformación mediada por Agrobacterium y de la
administración de ADN biolístico. Como tal, un
ADN-T que contiene el plásmido objetivo es
coadministrado con ADN/ARN habilitando la producción in
planta de VirD1 y VirD2 con o sin VirE2 (Hansen y Chilton 1996;
Hansen et al. 1997; Hansen and Chilton 1997 - WO9712046).
Con "ADN foráneo" se indica cualquier secuencia de ADN que es
introducida en el genoma del huésped por técnicas de recombinación.
Tal ADN foráneo incluye por ejemplo una secuencia de
ADN-T o una parte de la misma tal como la secuencia
de ADN-T que comprende el marcador seleccionable en
un formato que se puede expresar. El ADN
\hbox{foráneo incluye adicionalmente secuencias interventoras de ADN como se definió más arriba.}
Con "evento de recombinación" se indica
cualquier evento de recombinación especifico de un sitio o un evento
de recombinación efectuado por "salto" de transposones.
Con "recombinasa" se indica cualquier
recombinasa específica del sitio o una transposasa.
Con "sitio de recombinación" se indica
cualquier sitio de recombinación específica para el sitio o
secuencias de frontera del transposón.
Con "evento de recombinación específico del
sitio" se indica cualquier evento catalizado por un sistema que
consiste generalmente de tres elementos: una pareja de secuencias de
ADN (las secuencias o sitios de recombinación específicas del
sitio) y una enzima específica (la recombinasa específica del
sitio). La recombinasa específica del sitio cataliza una reacción
de recombinación solamente entre dos secuencias de recombinación
específicas del sitio dependiendo de la orientación de las
secuencias de recombinación específicas del sitio. Las secuencias
que intervienen entre dos sitios de recombinación específicos del
sitio serán invertidas en la presencia de la recombinasa específica
del sitio cuando las secuencias de recombinación específicas del
sitio sean orientadas en direcciones opuestas con respecto una a
otra (esto es, repeticiones invertidas). Si las secuencias de
recombinación específicas del sitio están orientadas en la misma
dirección una con respecto a la otra (esto es, repeticiones
directas), entonces todas las secuencias que intervienen serán
eliminadas por interacción con la recombinasa específica del sitio.
Así, si las secuencias de recombinación específicas del sitio están
presentes como repeticiones directas en ambos extremos de una
secuencia de ADN foráneo integrada al genoma eucariótico, tal
integración de dichas secuencias puede ser revertida
subsecuentemente por interacción de las secuencias
\hbox{de recombinación específicas del sitio con las correspondientes recombinasas específicas del sitio.}
Puede usarse un gran número de diferentes
sistemas de recombinasa específicos incluyendo pero no limitándose
al sistema Cre/Iox del bacteriófago P1, el sistema FLP/FRT de la
levadura, la recombinasa Gin del fago Mu, la recombinasa Pin de
E. coli, la PinB, PinD y PinF de la Shigella, y el
sistema R/RS del plásmido pSR1. Las recombinasas en general son
integrasas, resolvasas o flipasas. También las recombinasas duales
específicas pueden usarse en conjunción con repeticiones directas o
indirectas de los dos sitios de recombinación específicos del sitio
correspondientes a la recombinasa específica dual (WO99/25840). Los
dos sistemas de recombinasa específicos del sitio preferido son los
sistemas del bacteriófago P1 Cre/Iox y la levadura FLP/FRT. En estos
sistemas una recombinasa (Cre o FLP) interactúa específicamente con
su respectiva secuencia de recombinación específica del sitio (Iox
o FRT respectivamente) para invertir o escindir las secuencias que
intervienen. Las secuencias de recombinación específicas del sitio
para cada uno de estos dos sistemas son relativamente cortas (34 bp
para Iox y 47 bp para FRT). Algunos de estos sistemas ya han sido
usados con alta eficiencia en plantas tales como tabaco (Dale et
al. 1990) y Arabidopsis (Osborne et al. 1995). Los
sistemas de recombinación específicos del sitio tienen muchas
aplicaciones en biología molecular de plantas incluyendo los métodos
para controlar la recombinación homóloga (por ejemplo US5527695),
para inserción específica, apilación de génes, etc. (WO99/25821) y
para la resolución de patrones de integración complejos de
ADN-T o para la escisión de un marcador
seleccionable (WO99/23202).
Aunque las secuencias de recombinación
específica del sitio deben ser unidas a los extremos del ADN que se
va a escindir o se va a invertir, el gen que codifica la recombinasa
específica del sitio puede estar localizado en cualquier lugar. Por
ejemplo, el gen de la recombinasa podría ya estar presente en el ADN
de la eucariota o podría ser suministrado por un fragmento de ADN
introducido posteriormente bien introducido de manera directa en
las células, a través de cruzamiento o a través de polinización
cruzada. Alternativamente, una proteína recombinasa purificada
podría ser introducida directamente en la célula eucariótica, por
ejemplo por microinyección o bombardeo con partículas. Típicamente,
la región de codificación de recombinasa específica del sitio será
unida de manera operable a las secuencias reguladoras que permiten
la expresión de la recombinasa específica del sitio en la célula
eucariótica.
Con "evento de recombinación efectuado por
salto de transposón" o "recombinación mediada por
transposasa" indica un evento de recombinación catalizado por un
sistema consistente de tres elementos: un par de secuencias de ADN
(las secuencias de frontera del transposón) y una enzima específica
(la transposasa). La transposasa cataliza una reacción de
recombinación solamente entre dos secuencias de frontera de
transposón que están dispuestas como repeticiones invertidas.
Pueden utilizarse diversos sistemas diferentes
transpsón/transposasa incluyendo pero no limitándose al sistema
Ds/Ac, el sistema Spm y el sistema Mu. Estos sistemas se originan a
partir del maíz pero se ha demostrado que por lo menos que el
sistema Ds/Ac y el sistema Spm también funcionan en otras plantas
(Federoff et al. 1993, Schlappi et al. 1993, Van
Sluys et al. 1987). Se prefieren los trasnposones tipo Ds y
Spm que son delineados por secuencias de frontera 11 bp y 13 bp
respectivamente.
Aunque las secuencias de frontera del transposor
deben estar unidas a los extremos del ADN que se va a escindir, el
gen que codifica la transposasa puede estar localizado en cualquier
lugar. Por ejemplo, el gen de recombinasa podría ya estar presente
en el ADN de la eucariótica o podría ser suministrado por un
fragmento de ADN introducido posteriormente bien sea introducido
directamente en las células, a través de entrecruzamiento o de
polinización cruzada. Alternativamente, una proteína de transposasa
sustancialmente purificada podría ser introducida directamente en
las células, por ejemplo, por microinyección o por bombardeo con
partículas.
Como parte de la presente invención, las
secuencias de frontera del transposor son incluidas en una secuencia
de ADN foráneo de tal manera que caigan fuera de dicha secuencia de
ADN y transformen dicho ADN en una entidad similar al transposón
que puede moverse por la acción de una transposasa.
Puesto que los transposones se reintegran
frecuentemente en otra localización el genoma del huésped, la
segregación de la progenie de los huéspedes en los cuales se dejó
actuar la transposasa podría ser necesario separar los huéspedes
transformados que contienen por ejemplo solamente la huella del
transposón y los huéspedes transformados que aún contienen el ADN
foráneo.
Para llevar a cabo la presente invención, el
elemento genético se induce preferiblemente para movilizarse, tal
como, por ejemplo, mediante la expresión de una proteína recombinasa
en la célula que entre en contacto con el sitio de integración del
elemento genético y facilite un evento de recombinación en el mismo,
escindiendo el elemento genético completamente o alternativamente,
dejando una "huella" generalmente de aproximadamente 20
nucleótidos de longitud o mayor, en el sitio de integración
original. Estos huéspedes y partes de huéspedes que han sido
producidos de acuerdo con el método de la invención pueden ser
identificados mediante hibridización de ácidos nucleicos estándar
y/o técnicas de amplificación para detectar la presencia del
elemento genético movilizable o un constructo genético que
comprende el mismo. Alternativamente, en el caso de células huésped,
tejidos y huéspedes donde el elemento genético movilizable ha sido
escindido, es posible detectar una huella en el genoma del huésped
que ha sido dejada después del evento de escisión, utilizando tales
técnicas. Tal como se usa aquí, el término "huellas" debe
tomarse para hacer referencia a cualquier derivado de un elemento
genético movilizable o constructo de gen que comprende el mismo tal
como se describió aquí cuando se produce por escisión, eliminación
u otro tipo de remoción del elemento genético movilizable del genoma
de una célula previamente transformada con dicho constructo de gen.
Una huella generalmente comprende por lo menos una copia sencilla
de los loci o los transposones utilizados para promover la escisión.
Sin embargo, una huella puede comprender secuencias adicionales
derivadas del constructo del gen, por ejemplo secuencias de
nucleótidos derivadas de la secuencia de frontera izquierda, de la
secuencia de frontera derecha, del origen de la replicación, de la
codificación de la recombinasa o de la secuencia de recombinación de
la transposasa si se usa, u otras secuencias de nucleótidos
derivadas de vectores. De acuerdo con ello, una huella es
identificable de acuerdo con la secuencia de nucleótido del locus
de recombinación o transposón del constructo de gen usado, tal como,
por ejemplo, una secuencia de nucleótidos correspondiente o
complementarias a un sitio Iox o un sitio frt.
El término "ciclo celular" significa los
eventos bioquímicos y estructurales cíclicos asociados con el
crecimiento y con la división de las células y en particular con la
regulación de la replicación del ADN y la mitosis. El ciclo celular
incluye fases llamadas: G0, Gap1 (G1), síntesis de ADN (S), Gap2
(G2), y mitosis (M). Normalmente estas cuatro fases ocurren de
manera secuencial, pero sin embargo el ciclo celular también incluye
ciclos modificados donde una o más fases están ausentes lo que se
traduce en un ciclo celular modificado tal como endomitósis,
acitoquinésis, poliploide, politénia y endorreduplicación.
El término "progresión del ciclo celular"
se refiere al proceso de pasar a través de las diferentes fases del
ciclo celular. El término "rata de progresión del ciclo
celular" de acuerdo con lo anterior se refiere a la velocidad a
la cual dichas fases del ciclo celular son atravesadas por el tiempo
de barrido requerido para concretar dichas fases de ciclo
celular.
Con "prueba de dos híbridos" se indica
cualquier prueba que se base en la observación de que muchos
factores de transcripción eucarióticos comprenden dos dominios, un
dominio de enlace del ADN (DB) y un dominio de activación (AD) los
cuales, cuando son separados físicamente (esto es, perturbación de
la unión covalente) no efectúan la expresión del gen objetivo. Dos
proteínas capaces de interactuar físicamente con una de dichas
proteínas fusionadas al DB y la otra de dichas proteínas fusionadas
al AD reunirán los dominios DB y AD del factor de transcripción
resultando en la expresión del gen objetivo. El gen objetivo en el
ensayo de dos híbridos de levadura es usualmente un gen informador
como el gen \beta-galactosidasa. La interacción
entre las proteínas asociadas en la prueba de dos híbridos de
levadura puede ser entonces cuantificada midiendo la actividad del
producto gen informador (Bartel y Fields. 1997). De manera
alternativa, un sistema de dos híbridos de un mamífero puede ser
utilizado el cual incluye una proteína fluorescente verde quimérica
por ejemplo, que codifica el gen informador (Shioda et al.,
2000).
Adicionalmente, las simulaciones de
multiplicación y el rediseño por ordenador de las unidades
estructurales de la proteína de la invención pueden ser llevadas a
cabo utilizando programas de ordenador apropiados (Olszewski,
Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl.
Biosci. 1 (1995), 675-679). La modelación por
ordenador de la multiplicación de proteínas puede ser utilizada
para los análisis conformacionales y energéticos de modelos de
proteínas y péptidos detallados (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995),
995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995),
37-45). En particular, pueden usarse los programas
apropiados para la identificación de sitios interactivos de
citoquinina oxidasas, sus ligandos u otras proteínas interactuantes
mediante búsquedas asistidas por ordenador de secuencias de
péptidos complementarias (Fassina, Immunomethods 5 (1994),
114-120). Sistemas de ordenador apropiados para el
diseño de proteínas y péptidos se describen en la técnica anterior,
por ejemplo en Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994),
1033-1036; Wodak, Ann, N. Y. Acac. Sci. 501 (1987),
1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986),
5987-5991. Los resultados obtenidos del análisis por
ordenador antes descrito pueden ser utilizados por ejemplo, para la
preparación de peptidomiméticos de la proteína de la invención o
fragmentos de la misma. Tales análogos pseudopeptídicos de la
secuencia de aminoácidos natural de la proteína pueden imitar muy
eficientemente la proteína original (Benkirane, J. Biol. Chem. 271
(1996), 33218-33224). Por ejemplo, la incorporación
de residuos \Omega aminoácidos aquirales en una proteína de la
invención o un fragmento de la misma resultan la sustitución de
enlaces amino por unidades polimetileno de una cadena alifática,
proveyendo por lo tanto una estrategia conveniente para construir
un péptido mimético (Banerjee, Biopolymers 39 (1996),
769-777). Los análogos peptidomiméticos superactivos
de hormonas peptídicas pequeñas en otros sistemas son descritos en
la técnica anterior (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224
(1996), 327-331). Los peptidomiméticos apropiados
de la proteína de la presente invención también pueden ser
identificados por la síntesis de las bibliotecas combinatoriales
peptidomiméticas a través de aminoalquilación sucesiva y de pruebas
de los compuestos resultantes, por ejemplo, en cuanto a sus
propiedades de enlace, inhibidoras de la quinasa y/o inmunológicas.
Los métodos para la generación y uso de las bibliotecas
combinatoriales peptidomiméticas se describen en la técnica
anterior, por ejemplo en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996),
220-234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996),
709-715.
Adicionalmente, una estructura tridimensional
y/o cristalográfica de la proteína de la invención puede ser
utilizada para el diseño de inhibidores peptidomiméticos de la
actividad biológica de la proteína de la invención (Rose,
Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Ruterber,
Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).
Los compuestos que van a obtenerse o
identificarse en los métodos de la invención pueden ser compuestos
que son capaces de enlazar con cualquiera de los ácidos nucleicos,
péptidos o proteínas de la invención. Otros compuestos interesantes
para ser identificados son los compuestos que modulan la expresión
de los génes o las proteínas de la invención de tal manera que bien
la expresión de dicho gen o proteína es potenciada o disminuida por
la acción de dicho compuesto. Alternativamente el compuesto puede
ejercer su acción potenciando o disminuyendo la actividad de
cualquiera de las proteínas de la invención. Aquí, las proteínas
preferidas son citoquina oxidasas novedosas.
Dicho compuesto o pluralidad de compuestos puede
estar comprendida en, por ejemplo, muestras, por ejemplo extractos
celulares de, por ejemplo plantas, animales o microorganismos.
Adicionalmente, dichos compuestos pueden ser conocidos en la
técnica pero hasta ahora no conocidos como capaces de suprimir o
activar las proteínas que interactúan con la citoquinina oxidasa.
La mezcla de reacción puede ser un extracto libre de células que
puede comprender un cultivo celular o de tejidos. Los parámetros
adecuados para el método de la invención son conocidos por las
personas expertas en la técnica y están, por ejemplo, descritos en
general en Alberts et al., Molecular Biology of the Cell,
third edition (1994), en particular Capítulo 17. La pluralidad de
compuestos puede ser, por ejemplo, añadida a la mezcla de reacción,
al medio de cultivo o inyectada en la célula.
Si una muestra que contiene un compuesto o una
pluralidad de compuestos es identificada en el método de la
invención, entonces es posible aislar el compuesto de la muestra
original identificada por contener el compuesto capaz de actuar
como un agonista, o puede adicionalmente subdividirse la muestra
original, por ejemplo, si consiste de una pluralidad de diferentes
compuestos, de manera que reduzca el número de sustancias diferentes
por muestra y repita el método con la subdivisiones de la muestra
original. Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas
descritas anteriormente pueden llevarse a cabo varias veces,
preferiblemente hasta que la muestra identificada de acuerdo con el
método de la invención comprenda solamente un número limitado de o
solamente una sustancia. Preferiblemente dicha muestra comprende
sustancias o propiedades químicas y/o físicas similares, y lo más
preferiblemente dichas sustancias son idénticas. Preferiblemente, el
compuesto identificado de acuerdo con el método antes descrito o su
derivado es formulado adicionalmente en una forma adecuada para la
aplicación en el cultivo de plantas o en el cultivo de células y
tejidos de plantas.
El término "vigor temprano" se refiere a la
capacidad de la planta para crecer rápidamente durante su desarrollo
temprano, y se relaciona con el establecimiento exitoso, después de
la germinación, de un sistema radicular bien desarrollado y un
aparato fotosintético bien desarrollado.
El término "resistencia a alojamiento" o
"permanencia" se refiere a la capacidad de una planta para
fijarse por si misma al suelo. Para plantas con un hábito de
crecimiento erecto o semierecto este término se refiere a la
capacidad de mantener una posición vertical bajo condiciones
adversas (ambientales). Esta virtud se relaciona con el tamaño,
profundidad y morfología del sistema radicular.
El término "injerto" como se usa aquí, se
refiere a poner juntas las partes de dos plantas diferentes de
manera que se unan entre si y la savia pueda fluir, formado así una
nueva planta individual que pueda crecer y desarrollarse. Un
injerto consiste entonces de dos partes: (i) la parte inferior que
es la raíz tal como se cita aquí y esencialmente consiste del
sistema radicular y una porción del tallo, y (ii) la parte superior,
el scion o injerto, que da lugar a las partes aéreas de la
planta.
Tal como se usa aquí tblastn se refiere a una
herramienta de alineamiento que es parte del BLAST (Herramienta de
Búsqueda de Alineamiento Local Básica) de una familia de programas
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). BLAST apunta a identificar
regiones de alineamiento local óptimo, esto es el alineamiento de
alguna porción de las dos secuencias de aminoácidos o proteínas,
para detectar relaciones entre las secuencias que comparten
solamente regiones aisladas de similitud (Altschul et al.,
1990). En la presente invención, tblastn del conjunto de programas
BLAST 2.0 se utilizó para comparar la secuencia de proteína de
citoquinina oxidasa de maíz contra una base de datos de secuencia
de nucleótidos traducido dinámicamente en todos los marcos de
lectura (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:
3389-3402 (1997)).
Los siguientes ejemplos y figuras se dan a
manera de ilustración de la presente invención y no son de ninguna
manera limitantes.
Figura 1. Representación esquemática de genes
de citoquinina oxidasa de plantas.
Se muestran las estructuras de diferentes genes
de citoquinina oxidasa aislados de maíz (ZmCKX1, número de
acceso AF044603, Biochem. Biophys. Res. Com. 255:
328-333, 1999) y Arabidopsis (AtCKX1 a
AtCKX4). Los exones están denominados con "E" y se representan
por cajas sombreadas, los intrones son representados por cajas
blancas. Se indican adicionalmente los tamaños del gen (en Kb,
encima de cada estructura), los números de acceso del gen (bajo los
nombres) y una barra de tamaño que representa 0.5 kb.
Figura 2. Alineación de secuencias de
aminoácidos de citoquinina oxidasa de plantas.
La secuencia de aminoácidos de citoquinina
oxidasas del maíz (ZMCKX1) y Arabidopsis (AtCKX1 a AtCKX4)
son alineadas. Residuos de aminoácidos idénticos son marcados
mediante una caja negra, y residuos de aminoácidos similares están
en una caja gris. Grupos de similitud de aminoácidos: (M,I,L,V),
(F,W,Y), (G,A,), (S,T), (R,K,H), (E,D), (N,Q),
Figura 3. Análisis Northern blot de plantas
de tabaco y Arabidopsis que expresan AtCKX1
- (A)
- análisis northern blot de plantas de tabaco que expresan constitutivamente (líneas 1-8) en comparación con tabaco silvestre tipo SNN (línea 9)
- (B)
- comparación de expresión de gen inducido por tetraciclina en hojas después de 12 horas inducción con un clon constitutivamente expresado. Líneas 2-9 hojas de cuatro diferentes clones AtCKX1-W38TetR (+,-, con o sin tratamiento con tetraciclina), línea 1, clon que expresa constitutivamente 35S::AtCKX1.
- (C)
- Análisis northern blot de plantas del gen que expresa constitutivamente AtCKX1 de plantas de Arabidopsis. Líneas 2-4, tres clones 35S::AtCKX1 que expresan constitutivamente en comparación con planta tipo Arabidopsis (línea 1).
Figura 4. Características de crecimiento de
plantas de Arabidopsis 35S::AtCKX1 transénicas
- (A)
- Dos tipos de semillas (izquierda) comparados con dos semillas que expresan 35S::AtCKX1 (derecha). Nótese la formación incrementada de raíces adventicias y la ramificación de raíces incrementada en las siembras transgénicas. Las imágenes fueron tomadas 14 días después de la germinación. Las plantas fueron cultivadas in vitro sobre medio MS en cajas de petri en una posición vertical.
- (B)
- Como A, pero con raíces teñidas con azul de toluidina.
- (C)
- Vista superior de una caja de petri con siembra hasta de 35S::AtCKX1 transgénico tres semanas después de la germinación.
- (D)
- Una planta transgénica 35S::AtCKX1 cultivada en cultivo líquido. Las raíces de las siembras tipo salvaje crecieron pobremente bajo estas condiciones (no mostradas).
- (E)
- Transformantes (TO) que expresan el gen 35S::AtCKX1 (tres plantas a la derecha) una planta tipo silvestre se muestra en la izquierda.
- (F)
- Fenotipo de plantas T1 cultivadas en suelo. Planta tipo salvaje (izquierda) comparada con dos plantas transgénicas 35S::AtCKX1.
Figura 5: Fenotipo de plantas de
Arabidopsis que sobreexpresan AtCKX2
Generación T1 de plantas de Arabidopsis
que expresan 35S::AtCKX2 (dos plantas a la derecha)
comparadas con tipo silvestre (planta a la izquierda).
Figura 6. Análisis northern blot de plantas
de tabaco y arabidopsis que expresan AtCKX2
- (A)
- Análisis northern blot de plantas de tabaco que expresan constitutivamente (líneas 1-7) en comparación con tabaco tipo silvestre SNN (línea 8).
- (B)
- Análisis northern blot de plantas de Arabidopsis que expresan constitutivamente el gen AtCKX2.
Figura 2-b, siete diferentes
clones que expresan constitutivamente 35S::AtCKX2 en
comparación con planta de Arabidopsis tipo silvestre (línea
1).
Figura 7. Fenotipo de brote de plantas de
tabaco que expresan AtCKX1 y AtCKX2
- (A)
- Vista superior de plantas de seis semanas de edad.
- (B)
- Plantas de tabaco en la etapa de floración.
- (C)
- Cinética de la elongación de tallos. Las flechas marcan el surgimiento de la floración. Edad de las plantas (días después de la germinación) y el número de hojas en esa etapa se indica encima de las flechas. Las barras indican SD; n = 12.
- (D)
- Número de hojas (n = 12) formadas entre el día 68 y el día 100 después de la germinación y área superficial final de estas hojas (100% de tipo silvestre es 3646 +/- 144 cm^{2}; n = 3).
- (E)
- Comparación del tamaño y senescencia de la hoja. Las hojas fueron de nódulos números 4, 9, 12, 16 y 20 de la parte superior (de izquierda a derecha).
Figura 8. Fenotipo de raíz de plantas de
tabaco transgénicas que expresan AtCKX
- (A)
- Siembras 17 días después de la germinación.
- (B)
- Sistema radicular de plantas crecidas en el suelo en la etapa de floración.
- (C)
- Longitud de raíces, número de raíces laterales (LR) y raíces adventicias (AR) en el día 10 después de la germinación.
- (D)
- Curva de respuesta a la dosis de la inhibición del crecimiento de raíces por citoquinina exógena. Las barras indican +/- SD; n = 30.
Figura 9. Crecimiento de meristemas de brote
axilar en plantas de tabaco que expresan 35S::AtCKX1 .
Figura 10: Histología de los meristemas de
brote, hojas y meristemas de raíz de plantas de tabaco que
sobreexpresan AtCKX1 versus tabaco tipo silvestre
(WT).
- (A)
- Sección medina longitudinal a través del meristema apical del brote vegetativo. P, hoja primordia.
- (B)
- Tejido bascular en venas de segundo orden de hojas. X, xilema, PH, un agrupamiento de floema.
- (C)
- Secciones transversales de hojas completamente desarrolladas.
- (D)
- Microscopia de barrido electrónico de la epidermis superior de la hoja.
- (E)
- Ápices de raíz teñidos con DAPI, RM, meristema de raíz.
- (F)
- Secciones longitudinales medianas en meristemas de raíz 10 días después de la germinación. RC, punta de raíz; PM, promeristema.
- (G)
- Secciones transversales de raíces 10 mm del ápice. E, epidermis, C1-C4, capa de célula cortical, X, xilema, PH, floema. Las barras son 100 \mum.
Figura 11. Análisis northern blot de plantas
de tabaco que expresan AtCKX3 y AtCKX4 .
- (A)
- Análisis northern blot de plantas de tabaco que constitutivamente expresan AtCKX3. Las designaciones de las líneas indican números de plantas transgénicas e individuales. WT es tabaco tipo SNN silvestre. La mancha en la parte superior fue ensayada con una sonda especifica AtCKX3, la mancha en la parte inferior con una sonda especifica para el ARNr 25S y sirve como control para la carga de ARN.
- (B)
- Análisis northern blot de plantas de tabaco que expresan constitutivamente AtCKX4. Las designaciones de líneas indican números de plantas transgenicas individuales, WT es tabaco SNN tipo silvestre. La mancha en la parte superior fue probada con una sonda especifica AtCKX4, la mancha inferior con una sonda especifica para el ARNr 25S y sirve como un control para la carga de ARN.
Figura 12: Injertos recíprocos de plantas de
tabaco transgénicas AtCKX2 y plantas tipo silvestre.
- (A)
- Dos plantas a la izquierda: Control (scion injertado WT sobre una raíz base WT).
- \quad
- Dos plantas a la derecha: scion WT injertado sobre una raíz de base transgénica AtCKX2-38.
- (B)
- Izquierda: Control (scion injertado WT sobre una raíz de base WT).
- \quad
- Derecha: scion de planta AtCKX2-38 injertado sobre raíz de base WT.
- (C)
- Magnificación del área radicular.
- \quad
- Izquierda: Control (scion injertado WT sobre una raíz de base WT).
- \quad
- Derecha: scion WT injertado sobre una raíz de base transgénica AtCKX2-38.
- (D)
- Formación de raíces adventicias.
- \quad
- Izquierda: control (scion injertado WT sobre una raíz de base WT).
- \quad
- Derecha: scion injertado WT sobre una raíz transgénica AtCKX 2-38.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos 2B, 4, 9 y 11 a 15 se relaciona
particularmente con la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se identificaron seis génes diferentes de
Arabidopsis thaliana que portan una similar similitud de
secuencia al gen de la citoquinina oxidasa del maíz (Morris et
al., Biochem Biophys Res Comm 255:328-333, 1999;
Houda-Herin et al. Plant J
17:615-626; WO 99/06571). Estos genes fueron
encontrados seleccionando seis traducciones de marco de secuencias
de nucleótido de bases de datos genómicas públicas con la secuencia
de proteínas del maíz, empleando el programa tblastn. Estas
secuencias fueron designadas como genes similares a la citoquinina
oxidasa de Arabidopsis thaliana o AtCKX. Fueron
numerados arbitrariamente desde AtCKX1 hasta AtCKX6.
La lista de más abajo resume la información sobre estos genes. Las
fronteras ORF señaladas y las proyecciones de proteínas son
indicativas, con el fin de ilustrar por aproximación la divergencia
en secuencia de proteínas entre la citoquinina oxidasas de
Arabidopsis y de maíz, así como entre las diferentes
citoquinina oxidasas de Arabidopsis. Las fronteras ORF y las
secuencias de proteínas no deberían ser tomadas como evidencias
concluyentes para el modo de acción de estos genes AtCKX.
Para comparaciones de ADN y secuencias de proteínas se utilizó el
programa MegAlign de DNAstar. Este programa utiliza el método
Clustal para las alineaciones. Para alineaciones múltiples de
proteínas y secuencias de ADNc la diferencia por espacio vacío y la
diferencia en longitud por espacio vacío fueron establecidas en 10
cada una. Para alineamientos pareados de proteína los parámetros
fueron como sigue: Ktuple en 1; diferencia de espacio vacío en 3:
ventana en 5; diagonales salvadas en 5. Para alineamientos pareados
de los ADNc los parámetros fueron como sigue: Ktuple en 2;
diferencia de espacio vacío en 5; ventana en 4; las diagonales
salvadas en 4. Los grupos de similitud para alineaciones de
proteínas fueron: (M,I,L,V), (F,W,Y), (G,A), (S,T), (R,K,H), (E,D),
(N,Q). Los valores que están indicados entre el ADNc y secuencias de
proteína de Arabidopsis representan los valores más bajos y
más altos encontrados con todas la combinaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Nombre de gen: AtCKX1 (proteína
similar a la citoquinina oxidasa y Arabidopsis thaliana 1,
SEQ ID No1)
Localización en la base de datos (número de
acceso, localización en bac): AC002510, cromosoma Arabidopsis
thaliana II sección 225 de 255 de la secuencia completa.
Secuencia desde los clones T32G6.
ORF predicho en la base de datos:
15517..16183, 16415..16542, 16631..16891,
16995..17257, 17344..17752
La secuencia de ADNc AtCKK1 está listada
en SEG ID No 25.
Secuencia de proteína predicha: SEQ ID No
2
% de identidad con ADNc de Z. mays:
31.5% (Dnastar/MegAlign-método
Clustal)
% de similitud con proteína de Z.
mays:
32.2% (Dnastar/MegAlign-método
Clustal).
% de identidad con otros ADNc de
Arabidopsis (rango):
38.2% (AtCKX2) -54.1% (AtCKK6)
(Dnastar/MegAlign-método Clustal)
% de similitud con otras proteínas de
Arabidopsis (rango):
37.1% (AtCKX2) -58.1% (AtCKX6)
(Dnastar/MegAlign-método Clustal).
\vskip1.000000\baselineskip
B. Nombre de gen: AtCKX2
(proteína 2, SEG ID No. 3 similar a citoquinina oxidasa de
Arabidopsis thliana).
Localización en base de datos (No. de
acceso, localización en bac): AC005917, cromosoma 2 de
Arabidopsis thaliana sección 113 de 255 de la secuencia
completa. Secuencia de los clones F27 F23-F3
P11.
ORF predicho en la base de datos:
Complemento 40721..41012, 41054..41364,
41513..41770, 42535..42662, 43153..4371
Por favor nótese: La secuencia ADNc
identificada por el inventor utilizando el programa de predicción de
genes NetPlantGene (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) fue
diferente que el anotado en la base de datos. Con base en la nueva
secuencia de ADNc el ORF predicho en la base de datos fue
revisado:
Complemento Y 40721..41012, 41095..41364,
41513..41770, 42535..42662, 43153..43711
La secuencia de proteína codificada por este
ADNc se lista en SEG ID No. 4. El ADNc de AtCKX2 fue clonado
por RT-PCR a partir de RNA total de tejido de planta
transgénica AtCKX2 con el sistema de una etapa
RT-PCR (Qiagen, Hilden, Alemania), y se secuenció
utilizando un conjunto de reacción de secuenciación cíclica ABI
PRISM Big Dye Terminator (Perkin Elmer Applied Biosystems Division).
Esto confirmó que la secuencia ADNc identificada y predicha por el
inventor era correcta. La nueva secuencia ADNc AtCKX2 está
listada en SEQ ID No. 26. Un fragmento 84-bp
correspondiente a los nucleótidos 1171 a 1254 del ADNc AtCKX2
está listado en SEQ ID No31. La secuencia de péptidos
correspondiente de esta secuencia ADNc 84-bp está
listada como SEQ ID No32.
% de identidad con ADNc de Z. mays:
38.4% (Dnastar/MegAlign-método
Clustal)
% de similitud con proteína de Z.
mayz:
37.5% (Dnastar/MegAlign-método
Clustal)
% de identidad con otros ADNc de
Arabidopsis (rango):
34.9% (AtCKX6)-64.5%
(AtCKX4) (Dnastar/MegAlign-método
Clustal).
% de similitud con otras proteínas de
Arabidopsis (rango):
36.5% (AtCKX6)-66.1%
(AtCKX4) (Dnastar/MegAlign-método
Clustal).
\vskip1.000000\baselineskip
C. Nombre de gen: AtCKX3
(proteína 3, SEG ID No. 5 similar a citoquinina oxidasa de
Arabidopsis thaliana)
Localización en la base de datos (número de
acceso, localización en bac): AB024035, ADN genómico de
Arabidopsis thaliana, cromosoma 5, clon P1: MHM17, secuencia
completa.
No hay predicción del ORF en base de
datos.
El gen fue identificado por el inventor
utilizando varios programas de predicción de génes incluyendo GRAIL
(ftp://arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail), Genscan
(http://CCR-081.mit.edu/GEN SCAN.html) and
NetPlantGene
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).
Complemento, 43756..44347, 44435..44562,
44700..44966, 45493..45755, 46200..46560. La nueva secuencia
AtCKX3 ADNc identificada por el inventor esta listada como SEQ ID No. 27.
AtCKX3 ADNc identificada por el inventor esta listada como SEQ ID No. 27.
Secuencias de proteínas predicha con base en
la predicción propia ORF: SEQ ID No. 6.
% de identidad con ADNc de Z. mays:
38.7% (Dnastar/MegAlign-método
Clustal).
% de similitud con proteína de Z maíz:
39.2% (Dnastar/MegAlign-método
Clustal).
% de identidad con otros ADNc de
Arabidopsis (rango):
38.8% (AtCKX6) -51.0% (AtCKX2)
(Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de similitud con otras proteínas de
Arabidopsis (rango):
39.9 (AtCKX6)-46.7%
(AtCKX2) (Dnastar/MegAlign-método
Clustal).
\vskip1.000000\baselineskip
D. Nombre de gen: AtCKX4
(proteína 4, SEQ ID No 7 similar a citoquinina oxidasa de
Arabidopsis thaliana).
Localización en base de datos (número de
acceso, localización en bac): 1) AL079344 cromosoma 4 ADN de
Arabidopsis thaliana, clon BAC VÉASE T16L4 (proyecto
ESSA).
2) AL161575, cromosoma 4 ADN de Arabidopsis
thaliana, contiguo a fragmento No. 71.
\newpage
ORF predicho en la base de datos:
1) 1) 76187..76814, 77189..77316, 77823..78080,
78318..78586, 78677..78968
2) 101002..101629, 102004..102131,
102638..102895, 103133..103401, 103492..103783.
La secuencia de ADNc AtCKX4 aparece
listada en SEQ ID No. 28.
Secuencia de proteína predicha: SEG ID
No. 8.
% de identidad con ADNc de Z. mays:
41.0% (Dnastar/MegAlign-método
Clustal).
% de similitud con proteína de Z.
mays:
41.0% (Dnastar/MegAlign-método
Clustal).
% de identidad con otros ADNsc de
Arabidopsis (rango):
35.2% (AtCKX6) -64.5% (AtCKX2)
(Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de similitud con otras proteínas de
Arabidopsis (rango):
35.1% (AtCKX6) -66.1% (AtCKX2)
(Dnastar/MegAlign-m'étodo Clustal).
\vskip1.000000\baselineskip
E. Nombre de gen: AtCKX5
(proteína 5, SEQ ID No. 9 similar a citoquinina oxidasa de
Arabidopsis thaliana).
Localización en base de datos (número de
acceso, localización en bac): AC023754, F1 B16, secuencia completa,
cromosoma 1.
No hay predicción del ORF en la base de
datos.
El gen fue identificado por los inventores
utilizando diversos programas de predicción de genes incluyendo
GRAIL (ftp://arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail), Genscan
(http://CCR-081.mit.edu/GEN SCAN.html) y
NetPlantGene
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).
43756..44347, 44435..44562, 44700..44966,
45493..45755, 46200..46560 La nueva secuencia de ADNc AtCKX5
identificada y predicha por el inventor está listada en SEQ ID
No.27. La secuencia de proteína predicha para este ADNc está
listada en SEQ ID No. 10. Un segundo codón de inicio potencial ATG
está presente 9 nucleótidos corriente arriba en la secuencia
genómica. No es claro cual de estos dos codones de inicio codifica
el primer aminoácido de la proteína. Por lo tanto, un segundo
potencial AtCKX5 ADNc que se inicia en este codón corriente
arriba también está listado en esta invención como SEQ ID No. 34. La
secuencia genómica correspondiente está listada como SEQ ID No. 33
y la proteína codificada como SEQ ID No. 35.
% de identidad con ADNc de Z. mays:
39.1% (Dnastar/MegAlign-método
Clustal).
% de similitud con proteína de Z.
mays:
36.6% (Dnastar/MegAlign-método
Clustal).
% de identidad con otros ADNc de
Arabidopsis (rango):
40.1% (AtCKX2) -44.0% (AtCKX3) y
(Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de similitud con otras proteínas de
Arabidopsis (rango):
41.6% (AtCKX4) -46.4% (AtCKX6) y
(Dnastar/MegAlign-método Clustal).
\newpage
F. Nombre de gen: AtCKX6
(proteína 6, SEQ ID No. 11similar a citoquinina oxidasa de
Arabidopsis thaliana).
Localización en base de datos (número de acceso,
localización en bac): AL163818, cromosoma 3 de ADN de Arabidopsis
thaliana, clon P1MAA21 (proyecto ESSA).
ORF predicho en la base de datos:
46630..47215,47343..47470,47591 ..47806,
47899..48161, 48244..48565 La secuencia de ADNc AtCKX6 está listada
como SEQ ID No. 30.
Secuencia de proteína predicha: SEQ ID
No. 12.
% de identidad con ADNc de Z. mays:
37.3% (Dnastar/MegAlign-método
Clustal).
% de similitud con proteína de Z.
mays:
36.1% (Dnastar/MegAlign-método
Clustal).
% de identidad con otros ADNc de
Arabidopsis (rango):
34.9% (AtCKX2) -54.1% (AtCKX1)
(Dnastar/MegAlign-método Clustal).
% de similitud con otras proteínas de
Arabidopsis (rango):
35.1% (AtCKX4) -58.1% (AtCKX1)
(Dnastar/MegAlign-método Clustal).
Los genes AtCKX3 y AtCKX5 no
fueron anotados como citoquinina oxidasas putativas en la base de
datos y no se dieron ORF para estos genes. Además, el ORF (y
consecuentemente las estructuras de las proteínas) predichas para
AtCKX2 fueron diferentes de nuestra propia predicción y
nuestra predicción fue confirmada por el secuenciamiento del ADNc
AtCKX2.
Una comparación de la estructura genética de los
genes AtCKX de Arabidopsis 1 a 4 y del gen CKX de
maíz se muestra en la Figura 1.
Las proteínas predichas codificadas por los
genes AtCKX de Arabidopsis mostraron entre 32% y 41%
de similitud en secuencia con la proteína de maíz, mientras que
mostraron entre 35% y 65% de similitud de secuencia entre uno y
otro. Debido a esta conservación reducida de la secuencia, no es
claro a priori si los genes AtCKX de
Arabidopsis codifican proteínas con actividad de citoquinina
oxidasa. Una alineación de las proteínas predichas AtCKX de
Arabidopsis 1 a4 y el gen CKX de maíz se muestra en la Figura
2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Los siguientes cebadores fueron utilizados para
amplificar por PCR el gen AtCKX1 de Arabidopsis thaliana,
acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para clonar
están en minúscula):
Secuencia de cebador 5':primer:
cggtcgacATGGGATTGACCTCATCCTTACG (SEQ ID No:13).
Secuencia del cebador 3':primer
gcgtcgacTTATACAGTTCTAGGTTTCGGCAGTAT (SEQ ID No: 14).
Un fragmento de PCR 2235-bp,
amplificado por estos cebadores fue insertado en el sitio Sal I de
pUC19. El inserto fue secuenciado y se confirmó que el producto de
amplificación de PCR no contenía mutaciones. El fragmento Sall/Sall
de este vector fue subclonado en el sitio Sall corriente abajo de un
promotor 35 SCaMV modificado (que llevaba tres secuencias de
operador de tetraciclina) en el vector binario
pBinHyg-Tx (Gatz et al., 1992). El
constructor resultante fue introducido en tabaco y Arabidopsis
thaliana a través de transformación mediada por
Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación
estándar.
Varias líneas transgénicas fueron identificadas
tales que sintetizan el transcripto AtCKX1 a niveles altos
(Figura 3). Las líneas transgénicas que expresan el transcripto
AtCKX1 también mostraron actividad de citoquinina oxidasa
incrementada según se determinó mediante un ensayo estándar de la
actividad de la citoquinina oxidasa con base en la conversión de
[2-^{3}H]iP a adenina como ha sido descrito
(Motyka et al., 1996).
Esto se ejemplifica para dos líneas de tabaco y
dos de Arabidopsis en la tabla 6. Este resultado prueba que
el gen AtCKX1 codifica una proteína con actividad de
citoquinina oxidasa.
Las plantas tenían un fenotipo enano con
dominancia apical reducida (Figura 7A, B y C) e incrementaron la
producción de raíces (Figura 8).
- 1)
- fuerte- 2 clones.
- 2)
- intermedio- 3 clones.
- 3)
- débil- 4 clones.
- 4)
- plantas altas (como WT), con gran inflorescencia- 5 clones
- 5)
- similar a WT, 9 clones.
- WT: entre 100-150 cm
- débil: aproximadamente 75 cm
- intermedio: aproximadamente
40-45 cm (tallo principal aproximadamente 25 cm pero
con sobrecrecimiento por ramificaciones laterales).
- fuerte: aproximadamente 10 cm
Los transgénicos
AtCKX1-48 y AtCKKI-50
desplegaron un fenotipo fuerte. Abajo están las mediciones de la
elongación de los tallos en comparación con las plantas WT:
Parte experimental. Las plantas fueron
cultivadas en suelo en un invernadero. Los datos fueron recolectados
de por lo menos 10 plantas por línea.
La forma de las hojas de los expresores
transgénicos AtCKX1 fue lanceolada (larga y estrecha): la
proporción anchura a longitud de las hojas maduras fue reducido de
1:2 en plantas tipo silvestre a 1:3 en transgénicos AtCKX1
(Figura 7E). El número de hojas y la superficie de las hojas fue
reducida en comparación con WT (véase Figura 7D). También se notó
una diferencia prominente para la progresión de la senescencia de
las hojas. En tabaco WT, la senescencia de las hojas comienza en
las hojas más basales y lleva a una reducción uniforme del pigmento
de las hojas (Figura 7E). En contraste, el envejecimiento de las
hojas de plantas AtCKX1 con fuerte expresión permaneció en
verde a lo largo de las venas de las hojas y se hizo amarillo en las
regiones intercostales, indicando una senescencia de hojas
alterada. La textura de las hojas más viejas fue más rígida.
Plantas cultivadas in vitro que
expresaban el gen altamente fueron distinguibles fácilmente de las
WT por su capacidad para formar más raíces que eran más gruesas
(más fuertes) (Figura 8A), Así como por formar raíces aéreas a lo
largo del tallo.
La raíz primaria era más larga y el número de
raíces laterales y adventicias era más alto como se ilustra en la
Figura 8C para siembras que sobreexpresaban AtCKX1-50 (véase
también ejemplo 9).
La curva de respuesta a la dosis de la
inhibición del crecimiento de raíces por citoquinina exógena mostró
que las raíces de las siembras transgénicas eran más resistentes a
la citoquinina que las raíces WT (Figura 8D). La resistencia de los
transgénicos AtCKX1 al iPR fue menos marcada que para
AtCKX2, lo cual es consistente con los cambios más pequeños
en la citoquininas tipo iP en estas ultimas (véase Tabla 10).
Se observó un gran incremento en la biomasa de
raíces para plantas adultas cultivadas en suelo (véase Figura 8B
para una planta cultivada en suelo durante cuatro a cinco meses) a
pesar del hecho de que el crecimiento de las partes aéreas de la
planta se vio altamente reducido.
\bullet Fenotipo intermedio: el quinto
internodo por debajo de la inflorescencia tiene aproximadamente 2.5
cm de longitud y el noveno internodo tenía aproximadamente 0.5 cm
de longitud en comparación con 5 cm y 2 cm para la longitud del
quinto y noveno internodo respectivamente, en plantas WT.
\bullet Fenotipo fuerte: planta
AtCKX1-50. La longitud del vigésimo internodo de la parte
inferior medido el día 131 después de la germinación era 1,3 \pm
0.4 mm comparado con 39,2 \pm 3,8 mm para WT.
Se formaron más ramificaciones laterales que
indicaban una dominancia apical reducida en comparación con las
plantas WT durante el crecimiento vegetativo (véase Figura 9). Las
plantas laterales hicieron sobrecrecer el tallo principal,
alcanzando una altura de 40-45 cm para expresores
intermedios AtCKX1. Incluso aparecieron ramificaciones
secundarias. Sin embargo, las yemas no se liberaron completamente de
la dominancia apical, esto es, los brotes laterales no continuaron
realmente su desarrollo. La dominación apical reducida podría
deberse a la producción reducida de auxina por el meristema apical
de los brotes más pequeños (véase ejemplo 10).
La aparición de la floración en los transgénicos
AtCKX1 fue retrasada, el número de flores y las semillas producidas
por cápsula fue reducido. El tamaño de las flores no fue alterado en
las plantas transgénicas y el peso de las semillas individuales fue
comparable con el peso de las semillas de las plantas tipo
silvestre. Los datos para dos transgénicos representativos AtCKX1
se resumen más abajo:
\vskip1.000000\baselineskip
Datos recolectados para por lo menos diez
plantas por línea. La elongación completa de la primera flor fue
definida como el inicio de la floración. DAG = días después de la
germinación.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte experimental. El número de cápsulas
de semillas fue determinado en por lo menos cinco plantas
diferentes. Por favor nótese que estas plantas fueron cultivadas
bajo condiciones de invernadero durante el período de invierno.
Esto afecta negativamente el número de flores que se forman, en
particular en los clones transgénicos. Sin embargo, el cuadro
general de que forman un número reducido de flores es correcto,
n.d., no determinado.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte experimental. El rendimiento de
semillas fue determinado para por lo menos doce cápsulas de
semillas. El tamaño de las cápsulas de semillas fue muy variable,
por lo tanto las desviaciones estándar fueron grandes. n.d., no
determinado.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte experimental: La biomasa de
semillas fue determinada como el peso de 100 semillas de por lo
menos cinco cápsulas de semillas diferentes. n.d., no
determinado.
\global\parskip0.930000\baselineskip
- El inicio de la germinación fue el mismo que
para WT.
- El sistema radicular total fue agrandado y el
número de raíces laterales y raíces adventicias fue potenciado
(véase Figura 4A a D).
- El crecimiento de los órganos aéreos fue
reducido resultando en un fenotipo enano (véase Figura 4E y F) y la
biomasa de las hojas fue reducida. La formación de hojas y flores se
retrasó.
- El ciclo de vida fue más largo comparado con
WT y el rendimiento de semillas fue más bajo comparado con WT.
Los siguientes datos morfométricos ilustran
estos fenotipos:
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Parte experimental: Las mediciones se
llevaron a cabo en plantas ocho días después de la germinación in
Vitro sobre medio MS. Por lo menos se registraron 17 plantas
por línea.
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Parte experimental: Se midió el área
superficial de las hojas de hojas de roseta principales formadas
después de 30 días después de la germinación. Se analizaron tres
plantas por clon.
Inicio de la floración.
Parte experimental. Las plantas se
cultivaron bajo condiciones de invernadero. Por lo menos se
analizaron 13 plantas por clon. DAG = días después de la
germinación.
Conclusión: El análisis de las plantas
transgénicas AtCKX1 de Arabidopsis confirmó sobradamente
resultados obtenidos del tabaco e indican la naturaleza general de
las consecuencias de un contenido de citoquinina reducido. El
sistema radicular total fue agrandado (longitud total de raíces se
incrementó aproximadamente 110-140% en los
transgénicos AtCKX1), los brotes se desarrollaron más lentamente
(floración retardada) y la biomasa de hojas fue reducida. El
rendimiento de semillas fue más bajo en los transgénicos también
(datos no mostrados).
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Ejemplo
4
Los siguientes cebadores fueron utilizados para
amplificar por PCR del gen AtCKX2 de Arabidopsis
thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas
usadas para clonación están en letras mayúsculas):
Secuencia de cebador 5':
gcggtaccAGAGAGAGAAACATAAACAAATGGC (SEQ ID NO: 15).
Secuencia de cebador 3':
gcggtaccCAATTTTACTTCCACCAAAATGC (SEQ ID NO:16).
Un fragmento de PCR 3104-bp,
amplificado por estos cebadores, fue insertado en el sitio Kpnl de
pUC19. El inserto fue secuenciado para verificar que no se
introdujeron diferencias a la secuencia publicada por el
procedimiento de PCR. El fragmento Kpnl/Kpnl de este vector fue
subclonado en el sitio Kpnl corriente abajo de un promotor CaMV 35S
modificado (que llevaba tres secuencias de operador tetraciclina) en
el vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et al.,
1992) el constructor resultante fue introducido en tabaco y
Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por
Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación
estándar.
Fueron identificadas varias líneas transgénicas
que sintetizan el transcripto AtCKX2 a niveles altos (Figura 6).
Las líneas transgénicas que expresan el transcripto AtCKX2 también
mostraron una actividad incrementada de citoquinina oxidasa. Esto
es ejemplificado por dos líneas de tabaco y tres de
Arabidopsis en la Tabla 7. Este resultado prueba que el gen
AtCKX2 codifica una proteína con actividad de citoquinina
oxidasa.
Tres categorías de fenotipo:
- 1)
- Fuerte-15 clones (similar al fenotipo intermedio de AtCKX1).
- 2)
- Débil-6 clones.
- 3)
- Otros-similar a plantas WT, 7 clones.
Las observaciones concernientes a la altura,
distancia internodal, ramificación, forma de hojas y amarillamiento
de las plantas fueron similares a las de los transgénicos AtCKX1 con
algunas diferencias cuantitativas menores en general en que las
características de enanismo fueron más severas en transgénicos
AtCKX1 que en transgénicos AtCKX2 (compárese plantas AtCKX1 con
plantas AtCKX2 en la Figura 7A y B). Esto se ilustra más abajo para
las mediciones de elongación del tallo y de la distancia internodal
de clones con fuerte fenotipo AtCKX2-38 y
AtCKX2-40.
Parte experimental: Las plantas fueron
cultivadas en el suelo en un invernadero. Los datos fueron
recolectados a partir de por lo menos 10 plantas por línea.
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Parte experimental: La longitud del
vigésimo internodo a partir de la parte inferior fue medida en el
día 131 después de la germinación.
Las plantas cultivadas in vitro que
expresan altamente el gen fueron fácilmente distinguibles de las
plantas WT por su capacidad para formar más raíces las cuales son
más gruesas (más fuertes) así como por formar raíces aéreas a lo
largo del tallo.
La raíz primaria fue más larga y el número de
raíces laterales y adventicias fue más alto según se ilustra en la
figura 8C para siembras que sobreexpresan AtCKX2-38
(véase también ejemplo 9).
La curva dosis-respuesta de la
inhibición del crecimiento de la raíz por citoquinina exogéna mostró
que las raíces de las siembras transgénicas fueron más resistentes
a la citoquinina que las raíces WT (Figura 8D). La resistencia de
los transgénicos AtCKX1-28 a iPR fue menos marcada
que para AtCKX2-38, lo cual es consistente con los
cambios más pequeños en la citoquininas del tipo jP en la última
(véase Tabla 10).
Un incremento en el peso fresco y seco de la
biomasa de raíz de las líneas TO de plantas transgénicas AtCKX2
comparadas con WT se observó para plantas cultivadas en el suelo,
tal como se ilustra en la siguiente tabla:
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Parte experimental: Seis plantas WT y
seis líneas independientes T0 del clon 35S:: AtCKX2 fueron
cultivadas en suelo. Después de la floración el sistema radicular
fue lavado con agua, el suelo fue eliminado tanto como fue posible
y se midió el peso fresco y el peso seco.
Un incremento en peso fresco y peso seco de la
biomasa radicular también se observó para la progenie F1 de los
transgénicos AtCKX2 cultivados en hidropónico en comparación con WT,
como se ilustra en la siguiente tabla:
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Parte experimental: Las plantas
cultivadas en suelo fueron transferidas 60 días después de la
germinación a un sistema hidropónico (solución de Hoagland) y se
cultivaron por 60 días adicionales. La solución hidropónica fue
aireada continuamente y remplazada por solución fresca cada tercer
día.
En resumen, las plantas transgénicas cultivadas
en solución hidropónica formaron aproximadamente
65-150% más biomasa de raíz (peso fresco) que las
plantas tipo silvestre. El incremento en peso fresco fue
10-50%. Esta diferencia es posiblemente debida en
parte al volumen celular más grande de los transgénicos. Esto reduce
la porción relativa de paredes celulares, la cual forma el volumen
de materia seca. La biomasa de brotes fue reducida a 20%-70% de los
brotes tipo silvestre. La diferencia en peso fresco lleva a una
desviación en la proporción brote/raíz, la cual fue aproximadamente
8 en tipo silvestre pero aproximadamente 1 en los clones
transgénicos.
Un incremento en el crecimiento de las raíces y
la biomasa fue observado para siembras transgénicas AtCKX2 y
plantas adultas cultivadas bajo condiciones diferentes en
comparación con los controles WT a pesar del hecho de que el
crecimiento de las partes aéreas de la planta es reducido. Las
diferencias cuantitativas fueron observadas entre plantas
transgénicas diferentes: Los incrementos más altos en las biomasas
radiculares fueron observados para los clones de expresión más
fuerte.
El inicio de la floración en los transgénicos
AtCKX2 fue retrasado, y se redujo el número de flores y el
rendimiento en semillas por cápsula. Estos efectos fueron muy
similares a los observados en las plantas transgénicas AtCKX1 pero
fueron menos prominentes en las transgénicas AtCKX2, como se indica
en las tablas más abajo. El tamaño de las flores no fue alterado en
las plantas transgénicas y el peso de las semillas individuales fue
comparable al peso de las semillas de las plantas tipo
silvestre.
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Parte experimental: Datos recolectados
para por lo menos 10 plantas por línea. La elongación completa de la
primera flor fue definida como inicio de la floración. DAG = días
después de la germinación.
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Parte experimental: El número de cápsulas
de semillas fue determinado por lo menos para 5 plantas diferentes.
Por favor, nótese que estas plantas fueron cultivadas bajo
condiciones de invernadero durante el período de invierno. Esto
afecta negativamente el número de flores que se forman, en
particular en los clones transgénicos. Sin embargo, el cuadro
general que ellas forman un número reducido de flores es correcto.
n.d., no determinado.
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Parte experimental: El rendimiento en
semillas fue determinado para por lo menos 12 cápsulas de semillas.
El tamaño de las cápsulas de semillas fue muy variable, por lo tanto
las desviaciones estándar fueron grandes. n.d., no determinado.
Parte experimental: La biomasa de
semillas fue determinada como el peso de 100 semillas de por lo
menos 5 cápsulas de semillas diferentes. n,d., no determinado.
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Los siguientes datos morfométricos fueron
obtenidos para transgénicos AtCKX2:
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Parte experimental: Las mediciones fueron
llevadas a cabo en plantas 8 d.a.g . in vitro sobre medio MS.
Por lo menos 17 plantas por línea fueron registradas.
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Parte experimental: Se midió el área
superficial de hojas de roseta principales formadas después de 30
días después de la germinación. Se analizaron tres plantas por
clon.
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Parte experimental: Las plantas fueron
cultivadas bajo condiciones de invernadero. Por lo menos 13 plantas
por clon fueron analizadas. DAG = días después de la
germinación.
Conclusión: Los transgénicos de
arabidopsis AtCKX2 habían reducido la biomasa de hojas y un
fenotipo de enanismo similar a los transgénicos AtCKX1 (compare
Figura 5 con Figura 4F). El sistema radicular total también se
había agrandado en Arabidopsis transgénico AtCKX2. Longitud
de raíz total se incrementa aproximadamente 50% en transgénicos
AtCKX2. Los transgénicos AtCKX1 tiene raíces primarias más largas,
más raíces laterales y forman más raíces adventicias. Los
transgénicos AtCKX2 carecen del crecimiento potenciado de la raíz
primaria pero forman más raíces laterales y raíces adventicias que
WT.
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Los fenotipos observados para transgénicos
AtCKX2 fueron muy similares pero no idénticos a los transgénicos
AtCKX1 los cuales a su vez fueron muy similares pero no idénticos a
los resultados obtenidos para los transgénicos de tabaco. Esto
confirma la naturaleza general de las consecuencias del contenido
reducido de citoquinina en estas dos especies de plantas y por lo
tanto, pueden esperarse fenotipos similares en otras especies de
plantas también. La principal diferencia entre tabaco y
Arabidopsis es la carencia de crecimiento de raíces
primarias potenciadas en plantas que sobreexpresan AtCKX2 (datos no
mostrados).
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Ejemplo
5
Los siguientes cebadores fueron utilizados para
amplificar por PCR el gen AtCKX3 de Arabidopsis thaliana,
acceso Columbia (las secuencias no homólogas utilizadas para
clonación están en minúscula):
- Secuencia de cebador 5' primer gcggtaccTTCATTGATAAGAATCAAGCTATTCA
- (SEQ ID NO: 17).
- Secuencia de cebador 3'primer gcggtaccCAAAGTGGTGAGAACGACTAACA
- (SEQ ID NO: 18).
Un fragmente DPCR 3397-bp,
producido por esta amplificación por PCR, fue insertado en el sitio
Kpnl del pBluescript. El inserto fue secuenciado para confirmar que
el producto de PNR no tenía cambios de secuencia comparado con el
gen. El fragmento Kpnl/Kpnl de este vector fue subclonado en el
sitio Kpnl corriente abajo de un promotor CaMV 35S modificado
(portador de tres secuencias operadoras de tetraciclina) en el
vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et
al.,1992). El constructo resultante fue introducido en tabaco y
Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por
Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación
estándar.
Varias líneas transgénicas de tabaco fueron
identificadas que sintetizaron el transcripto AtCKX3 a niveles
altos (figura 11A). Las líneas de tabaco transgénico que expresaban
el transcripto AtCKX3 también mostraron una actividad incrementada
de citoquinina oxidasa. Esto es ejemplificado para tres plantas en
la tabla 8. Esto prueba que el gen AtCKX3 codifica una proteína con
actividad de citoquinina oxidasa.
Los fenotipos generados por sobreexpresión del
gen AtCKX3 en tabaco y Arabidopsis fueron similares
básicamente a las de las plantas que expresan AtCKX1 y AtCKX2, esto
es, una formación de raíz y enanismo potenciados. Sin embargo, las
sobreexpresión del gen AtCKX3 en tabaco resultó en un fenotipo más
fuerte comparado con AtCKX2. En este sentido la expresión de AtCKX3
fue más similar a la sobreexpresión de AtCKX1.
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Ejemplo
6
Los siguientes cebadores fueron usados para
amplificar por PCR el gen AtCKX4 de Arabidopsis thaliana,
acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para clonación
están en minúsculas):
- Secuencia del cebador 5': primer: gcggtaccCCCATTAACCTACCCGTITG
- (SEQ ID NO:19).
- Secuencia del cebador 3': primer: gcggtaccAGACGATGAACGTACTTGTCTGTA
- (SEQ ID NO:20).
Un fragmento de PCR 2890-bp,
producido por esta amplificación por PCR, fue insertado en el sitio
Kpnl del pBluescript. El inserto fue secuenciado para confirmar que
el producto de PCR no tenía cambios de secuencia comparado con el
gen. El fragmento Kpnl/Kpnl de este vector fue subclonado en el
sitio Kpnl corriente abajo de un promotor CaMV 35S modificado
(portador de tres secuencias operadoras de tetraciclina) en el
vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et al.,
1992). El constructo resultante fue introducido en tabaco y
Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por
Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación
estándar.
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Varias líneas transgénicas de tabaco
sintetizaron el transcripto AtCKX4 a niveles altos (Figura 11
B.). Las líneas transgénicas que expresaban el transcripto AtCKX4
también mostraron actividades citoquinina oxidasa incrementada.
Esto es ejemplificado por 3 líneas de Arabidopsis y 3 de
tabaco en la Tabla 9. Este resultado muestra que el gen
AtCKX4 codifica una proteína con actividades citoquinina
oxidasa.
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Por encima de todo, los datos muestran que los
valores aparentes K_{m}, para las cuatro citoquinina oxidasas
estuvieron en el rango de 0.2 a 9.5 \muM con iP como sustrato, lo
cual demuestra adicionalmente que las proteínas codificadas por
AtCKX1 a 4 son en efecto enzimas citoquinina oxidaxas como se
describe aquí.
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Los fenotipos generados por la sobrexpresión del
gen AtCKX4 en tabaco y Arabidopsis fueron similares
básicamente a los de las plantas que expresan AtCKX1 y
AtCKX2, esto es, formación de raíces potenciada, dominación
apical reducida, enanismo y amarillamiento de las regiones
intercostales en hojas más viejas de tabaco. Un fenotipo adicional
en tabaco fue hojas lanceoladas (proporción longitud a anchura
alterada).
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En general, el análisis fenotípico demostró que
la sobreexpresión del gen AtCKX causó alteraciones de
desarrollo drásticas en los brotes y en el sistema radicular de la
planta en tabaco, incluyendo el desarrollo potenciado del sistema
radicular y el enanismo de la parte aérea de la planta. Otros
efectos tales como la senescencia alterada de las hojas, formación
de raíces adventicias en tallos, y otros fueron observados también
como se divulga aquí. Las alteraciones fueron muy similares pero no
idénticas para los diferentes genes. En tabaco, las
sobreexpresiones de AtCKX1 y AtCKX3 fueron similares
como en AtCKX2 y AtCKX4. En general, los dos primeros
mostraron una más alta expresión de los cambios, particularmente en
el brote. Por lo tanto, un gen de citoquinina oxidasa en particular
puede ser preferido para alcanzar los fenotipos que se describen en
las realizaciones de esta invención.
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Ejemplo
7
Los siguientes cebadores fueron utilizados para
amplificar por PCR el gen AtCKX5 de Arabidopsis
thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas
para la clonación están en minúscula):
- Secuencia del cebador 5': ggggtaccTTGATGAATCGTGAAATGAC
- (SEQ ID NO: 21)
- Secuencia del cebador 3': ggggtaccCTTTCCTCTTGGTTTTGTCCTGT
- (SEQ ID NO: 22)
La secuencia del cebador 5' incluye los dos
codones de inicio potenciales de la proteína AtCKX5, el codón
de inicio máximo 5' está subrayado y un segundo AtG está indicado
en itálicas. Un fragmento de PCR 2843-bp,
producido por esta amplificación por PCR, fue insertado en un
producto cerrado en un extremo en un vector de clonación
pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen).
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Ejemplo
8
Los siguientes cebadores fueron utilizados para
amplificar por PCR el gen AtCKX6 de Arabidopsis
thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas
usadas para la clonación están en minúsculas):
- Secuencia de cebador 5' gctctagaTCAGGAAAAGAACCATGCTTATAG
- (SEQ ID NO: 23)
- Secuencia de cebador 3': gctctagaTCATGAGTATGAGACTGCCTTTTG
- (SEQ ID NO: 24)
Un fragmento de PCR 1949-bp,
producido por esta amplificación de PCR, fue insertado en un
producto de extremo cerrado pCRBlunt II-TOPO como
vector de clonación (Invitrogen)
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Ejemplo
9
Semillas de transgénicos que sobreexpresaban
AtCKX1-50 y AtCKX2-38 y de tabaco WT
fueron cultivadas in vitro sobre medio MS, puestos en un
cuarto de cultivo 4 días después del tratamiento por frío y
germinaron después de 6 días. Las observaciones sobre el
crecimiento de las siembras fueron hechas 10 días después de la
germinación (véase también figura 8C) y se resumen más abajo. Por
lo menos 20 individuos fueron registrados por clon. Datos similares
han sido obtenidos en otros dos experimentos.
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Las siembras de plantas de tabaco que
sobreexpresan AtCKX1 y AtCKX2 tenían 60% más de raíces adventicias y
3 veces más de raíces laterales que las plantas de control no
transformadas 10 días después de la germinación. La longitud de la
raíz primaria se incrementó en aproximadamente en 70%. Esto - con
más y más largas raíces laterales y raíces secundarias, resultó en
un incremento de 70-100% de la longitud radicular
total. Estos resultados mostraron que la sobreexpresión de la
citoquinina oxidasa potencia el crecimiento y desarrollo tanto de
la raíz principal como de las raíces adventicias, resultando en un
vigor temprano.
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Ejemplo
10
El análisis microscópico de diferentes tejidos
reveló que los cambios morfológicos en transgénicos AtCKX son
reflejados por cambios distinguibles en número de células y rata de
formación de células (véase figura D). El meristema apical del
brote (SAM) de transgénicos AtCKX1 fue más pequeño que en el tipo
silvestre y más pocas células ocupan el espacio entre la zona
central y la zona periférica de la formación del órgano lateral,
pero las células fueron del mismo tamaño (figura 10A). El número
reducido de células y tamaño de las SAM como consecuencia del
contenido reducido de citoquinina indica que las citoquininas juegan
un papel en el control de proliferación de SAM. No se presentaron
cambios obvios en el patrón de diferenciación, sugiriendo que la
organización espacial de las zonas de diferenciación SAM es
principalmente independiente del número de células y de la
concentración local de citoquinina. El patrón general de tejido de
las hojas en sobreexpresión de citoquinina oxidasa no cambió. Sin
embargo, el tamaño del floema y el xilema fue significativamente
reducido (figura 10B). En contraste, el tamaño promedio de células
del parénquima y de las células epidérmicas se incrementó de 4 a 5
veces (figura 10 C, D). Nuevas células de transgénicos AtCKX1 se
forman a 3-4% de la rata de las hojas de tipo
silvestre y el número final de hojas fue estimado en el rango de
5-6% del tipo silvestre. Esto indica un absoluto
requerimiento de citoquinina en hojas para mantener el ciclo de
división celular. Ni el tamaño de las células ni la forma de las
células de los órganos florales fueron alterados y el rendimiento
en semillas por cápsulas fue similar en el tipo silvestre y en
plantas transgénicas AtCKX. La población celular de meristemas de
raíz de las plantas transgénicas AtCKX1 se agrandó aproximadamente
cuatro veces y el número de células tanto en la columnela central
como en la lateral fue potenciado (figura 10 E, F), El diámetro
final de la raíz se incrementó en un 60% debido a un diámetro
incrementado en todos los tipos de raíz de células de la raíz. Los
patrones de raíces radiales fueron idénticos en el tipo silvestre y
en transgénicos, con excepción, de que frecuentemente se notó una
cuarta capa de células de cortex en la raíces transgénicas (figura
10G). El número de células incrementado y la longitud celular
ligeramente reducida índica que el crecimiento radicular potenciado
es debido a un número incrementado de células de ciclización más que
al crecimiento incrementado de las células. En la presencia de un
contenido disminuido de citoquinina, las células del meristema de la
raíz deben sufrir rondas adicionales de mitosis antes de que salgan
del meristema y comiencen a elongarse. La salida del meristema es
por lo tanto regulada por un mecanismo que es sensible a las
citoquininas. Aparentemente, las citoquininas tienen un papel
regulador negativo en el meristema de la raíz y las concentraciones
de citoquinina tipo silvestre son inhibidoras para el desarrollo de
un sistema radicular máximo. Por lo tanto, al reducir el nivel de
citoquininas activas sobreexpresando las citoquininas oxidasas
estimula al desarrollo de la raíz, lo que resulta en un incremento
en el tamaño de la raíz con más raíces laterales y adventicias en
comparación con las plantas WT.
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Ejemplo
11
Entre los 16 diferentes metabolitos de
citoquinina que fueron medidos, el cambio más grande ocurrió en la
citoquininas de tipo iP sobrexpresadores AtCKX2 (tabla 10): El
descenso general en el contenido de citoquininas tipo iP es más
pronunciado en plantas que expresan AtCKX2 que en transgénicos
AtCKX1. Los transgénicos AtCKX1 mostraron un fenotipo más fuerte en
el brote. No se sabe qué metabolito de la citoquinina es relevante
para los diferentes ensayos que fueron analizados. Puede ser que
diferentes formas de citoquinina jueguen papeles diferentes en los
diversos procesos de desarrollo. Se notaron alteraciones menores
para citoquininas tipo Z, las cuales podrían ser debidas a una
diferente accesabilidad del sustrato o a una especificidad del
sustrato más baja de la proteína. El contenido total de metabolitos
iP y Z en clones transgénicos individuales estuvo entre 31% y 63%
del tipo silvestre. La reserva en citoquinina de los
O-glucosidos también disminuyó en los transgénicos
(tabla 10). La concentración de N-glucosidos y
citoquininas tipo DHZ fue muy baja y no fue o no fue marginalmente
alterada en siembras transgénicas (datos no mostrados).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Ejemplo
12
Para investigar cuales efectos fenotípicos de
la sobreexpresión de citoquinina oxidasa están restringidos a los
tejidos que se expresan, esto es, si son ensayos autónomos en
células u órganos, se llevaron a cabo experimentos de injerto. Se
hicieron injertos recíprocos entre una planta de tabaco transgénica
AtCKX2 y una planta de tabaco UVT. La planta transgénica utilizada
en este experimento fue AtCKX2.38, la cual desplegó un fuerte
fenotipo caracterizado por crecimiento potenciado de raíces y
desarrollo reducido de las partes aéreas de la planta. Como se
describe en los ejemplos 3 a 6, estos fueron dos importantes
fenotipos que resultaron de la sobreexpresión de citoquinina
oxidasa en tabaco y Arabidopsis.
Las plantas tenían aproximadamente 15 cm de
altura cuando fueron injertadas y la unión del injerto sucedió a
aproximadamente 10 cm por encima del suelo. La figura 12 muestra
plantas 15 semanas después del injerto. Los principales resultados
fueron que:
(i) El fenotipo aéreo de un scion WT injertado
sobre una raíz de reserva transgénica fue similar al injerto de
control WT (igual al WT scion sobre raíz de reserva WT). De manera
importante, esto mostró que la sobreexpresión del transgen AtCKX2
en la reserva de raíz no indujo el enanismo de las partes aéreas no
transgénicas de la planta (véase figura 12 A). El crecimiento de
raíces mejorado de la reserva de raíces transgénicas fue mantenido,
indicando que el crecimiento radicular mejorado de los transgénicos
AtCKX es autónomo y no depende del brote transgénico AtCKX (figura
12C). De manera interesante, los sciones WT injertados sobre las
reservas de raíz transgénicas lucían más saludables y estaban más
desarrollados. De forma notable, la senescencia de las hojas
basales se retrasó en estas plantas (véase figura 12 A); (ii) el
scion transgénico injertado sobre la reserva de raíz WT se mostró
similar a la parte aérea de la planta transgénica de la cual era
derivado, esto es, el fenotipo de enanismo del brote también es
autónomo y no depende del crecimiento mejorado de la raíz (véase
figura 12B).
Además de la mejor apariencia antes mencionada
de los brotes WT injertados sobre una raíz de reserva transgénica,
la formación de raíces adventicias sobre la parte basal de los
brotes WT fue notable (figura 12D, planta de la derecha). La
formación de raíces adventicias también se presentó en el tallo de
los transgénicos AtCKX pero no sobre los tallos de los injertos de
control WT (figura 12D, planta de la izquierda) por lo tanto parece
ser un comportamiento no autónomo.
En resumen, se divulga en esta invención que la
formación potenciada de raíces y el enanismo del brote en tabaco
que sobreexpresa AtCKX son comportamientos autónomos que pueden ser
desacoplados por procedimientos de injerto. Sorprendentemente, el
injerto de un scion WT sobre una raíz de reserva transgénica AtCKX
se traduce en plantas de crecimiento más vigoroso y en un retardo
de la senescencia de las hojas.
Como alternativa al injerto, podrían usarse
promotores específicos de tejidos para desacoplar los efectos
fenotípicos autónomos de la sobreexpresión de citoquinina. Por lo
tanto, se divulga en esta invención que la coexpresión de la
citoquinina oxidasa en una manera específica para un tejido puede
ser utilizada para alterar la morfología de una planta tal como el
brote o su sistema radicular.
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Ejemplo
13
Un gen AtCKK (véase ejemplo 4) es clonado bajo
control del promotor homologo de la raíz clavata de
Arabidopsis (SEQ IS NO 36), el cual es un promotor que
conduce una expresión específica de la raíz. Otros promotores
específicos de la raíz también pueden ser utilizados para
propósitos de esta invención. Véase la tabla 5 para promotores
específicos de raíz a manera de ejemplo.
Las plantas transgénicas que expresan el gen
AtCKX específicamente en las raíces muestran una producción de
raíces incrementadas sin afectar negativamente el crecimiento y
desarrollo de las partes aéreas de la planta. Se observan efectos
positivos sobre la senescencia de las hojas y el crecimiento de las
partes aéreas de la planta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
Un constructo de gen quimérico derivado de un
gen AtCKX y diseñado para suprimir la expresión de genes de
citoquinina oxidasa endógenos es clonado bajo el control de un
promotor de senescencia inducida. Por ejemplo, los promotores
derivados de genes asociados con la senescencia (SAG) tales como el
promotor SGA12 pueden ser usados (Quirino et al., 2000). Las
plantas transgénicas que suprimen los genes de citoquinina oxidasa
endógenos específicamente en las hojas senescentes muestran una
senescencia retardada de las hojas y un mayor rendimiento en
semillas sin afectar negativamente la morfología y desarrollo de la
planta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
El marco de lectura abierto de un gen AtCKX es
clonado bajo el control de un promotor que confiere sobreexpresión
en los órganos reproductivos femeninos tal como por ejemplo el
promotor Defy9 de Antirrhinum majus o uno de sus homólogos,
el cual tiene una alta especificidad en la placenta y los óvulos.
Las plantas transgénicas con actividad potenciada de citoquinina
oxidasa en estos tejidos muestra un desarrollo partenocárpico de
frutos.
\vskip1.000000\baselineskip
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Esta lista de referencias citadas por los
solicitantes es solamente para la conveiencia del lector. No forma
parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse
errores u omisiones y la EPO no reconoce responsabilidad alguna en
este aspecto..
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<211> 1515
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<213> Arabidopsis thaliana
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2814
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1620
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 539
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 842
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (56)
1. Uso de un ácido nucléico que codifica una
citoquinina oxidasa de una planta para estimular el crecimiento
radicular para potenciar la formación de raíces laterales o
adventicias o para alterar el geotropismo radicular.
2. Un método para estimular el crecimiento
radicular o para potenciar la formación de raíces laterales o
adventicias o para alterar el geotropismo radicular que comprende
la expresión de un ácido nucleico que codifica una citoquinina
oxidasa de una planta seleccionada del grupo consistente de:
- (a)
- ácidos nucléicos que comprenden una secuencia de ADN tal como está dada por SEQ ID Nos. 3, 26 o 31, o el complemento de los mismos,
- (b)
- ácidos nucléicos que comprenden la secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de las SEQ ID Nos. 3, 26 o 31, o el complemento de las mismas,
- (c)
- ácidos nucléicos que hibridizan específicamente a cualquiera de las secuencias de las SEQ ID Nos. 3, 26 o 31 o el complemento de los mismos
- (d)
- ácidos nucléicos que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las SEQ ID Nos. 4 o 32, o el complemento de las mismas,
- (e)
- ácidos nucléicos como se define en cualquiera de (a) a (d) caracterizados porque dicho ácido nucléico es ADN, ADN genómico, ADNc, ADN o ARN sintético donde T es reemplazado por U,
- (f)
- un ácido nucléico que es degenerado a un ácido nucléico como el dado en cualquiera de SEQ ID Nos. 3, 26 o 31, o el cual es degenerado a un ácido nucléicos como se define en cualquiera de (a) a (e) como un resultado del código genético,
- (g)
- ácidos nucléicos que son divergentes de un ácido nucléico que codifica una proteína como se da en SEQ ID No. 4 o los cuales son divergentes de un ácido nucléico como se define en cualquiera de (a) a (e), debido a las diferencias en el uso de codón entre los organismos,
- (h)
- ácidos nucléicos que codifican una proteína como se da en SEQ ID No. 4 o ácidos nucléicos como se definen en (a) a (e) los cuales son divergentes debido a las diferencias entre alelos,
- (i)
- ácidos nucléicos que codifican una proteína como se da en SEQ ID No. 4,
- (j)
- fragmentos funcionales de ácidos nucléicos como se definen en cualquiera de (a) a (i) que tienen la actividad biológica de una citoquinina oxidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un ácido nucléico aislado que codifica una
proteína de planta que tiene actividades citoquinina oxidasa
seleccionado del grupo consistente de:
- (a)
- un ácido nucléico que comprende una secuencia de ADN como se da en SEQ ID No. 3, o los complementos de los mismos,
- (b)
- un ácido nucléico que comprende las secuencias de ARN correspondientes a SEQ ID No 3, o los complementos de las mismas,
- (c)
- un ácido nucléico que hibridiza específicamente a un ácido nucléico como se da en SEQ ID No. 3, o el complemento de las mismas,
- (d)
- un ácido nucléico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se da en SEQ ID No. 4,
- (e)
- un ácido nucléico que se degenera a un ácido nucléico como se da en SEQ ID No. 3 o el cual es degenerado a un ácido nucléico como se define en cualquiera de (a) a (d) como resultado del código genético,
- (f)
- un ácido nucléico que es divergente de un ácido nucléico que codifica una proteína como se da en SEQ ID No. 4 o el cual es divergente de un ácido nucléico como se define en cualquiera de (a) a (e) debido a las diferencias en el uso de codón entre los organismos,
- (g)
- un ácido nucléico que codifica una proteína como se da en SEQ ID No.4, o un ácido nucléico como se define en (a) a (e) el cual es divergente debido a las diferencias entre alelos,
- (h)
- un ácido nucléico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificada por un ácido nucléico como se da en SEQ ID No. 3, o un fragmento funcional de un ácido nucléico como se define en cualquiera de (a) a (g), donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa,
- (i)
- un ácido nucléico que codifica una proteína como se define en SEQ ID No. 4,
- (j)
- un ácido nucléico como se da en SEQ ID No.26,
dado que dicho ácido nucléico no es el ácido
nucléico tal como se depositó en el número de acceso Genbank
AC005917, y
dado que dicho ácido nucléico no es SEQ ID No.
38443 de EP 1 033 405.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un ácido nucléico aislado de acuerdo con la
reivindicación 3 el cual es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético,
o ARN donde T está reemplazado por U.
5. Una molécula de ácido nucléico de al menos 15
nucleótidos en longitud que hibridiza específicamente con un ácido
nucléico de la reivindicación 3 o 4.
6. Una molécula de ácido nucléico de al menos 15
nucleótidos de longitud que amplifica específicamente un ácido
nucléico de la reivindicación 3 o 4.
7. Un vector que comprende un ácido nucléico de
la reivindicación 3 o 4.
8. Un vector de acuerdo con la reivindicación 7
el cual es un vector de expresión donde el ácido nucléico se enlaza
de manera operativa a una o más secuencias de control que permiten
la expresión de dicho ácido nucléico en células huésped procariotas
y/o eucariotas.
9. Una célula huésped que contiene un ácido
nucléico de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 o un vector de
acuerdo con la reivindicación 7 u 8.
10. La célula huésped de la reivindicación 9,
donde la célula huésped es una célula bacteriana, de insecto,
fúngica, de planta o animal.
11. Un polipétido aislado codificable por un
ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4, o un derivado
biológicamente activo del mismo donde dicho derivado comprende
adicionalmente residuos de aminoácidos de origen natural alterados
glicosilados acilados o de origen no natural y/o comprende uno o más
sustituyentes no aminoácidos en comparación con la secuencia de
aminoácidos de una forma presente en la naturaleza de dichos
polipéptidos, o un fragmento funcional de dicho polipéptido, el
cual no es SEQ ID No. 38444 de EP 1 033 405.
12. El polipétido de la reivindicación 11 el
cual tiene una secuencia de aminoácidos como se da en SEQ ID No. 4,
o un derivado biológicamente activo del mismo donde dicho derivado
comprende adicionalmente residuos de aminoácidos alterados
glicosilados, acilados o de presencia no natural y/o comprende uno o
más sustituyentes no aminoácidos en comparación con la secuencia de
aminoácidos de una forma de ocurrencia natural de dicho
polipéptido, o un fragmento funcional de dicho polipéptido.
13. Un método para producir un polipéptido de
acuerdo con la reivindicación 11 o 12 cultivando una célula huésped
de la reivindicación 9 o 10 bajo condiciones que permiten la
expresión del polipéptido y recuperar el polipéptido producido a
partir del cultivo.
14. Un anticuerpo que específicamente reconoce
un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 o un epítope específico
del mismo.
15. Un método para la producción de plantas
transgénicas, células de plantas o tejidos de plantas que comprenden
la introducción de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 en
un formato expresable o en un vector de la reivindicación 7 u 8 en
dicha planta, célula de planta o tejido de planta.
16. Un método para la producción de plantas,
células de plantas o tejidos de plantas alterados que comprende la
introducción de un polipétido de la reivindicación 11 o 12
directamente en una célula, un tejido o un órgano de dicha
planta.
17. Un método para efectuar la expresión de un
polipéptido de la reivindicación 11 o 12 que comprende la
introducción de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 unido
de manera operativa a una o más secuencias de control o un vector
de la reivindicación 7 u 8 de manera estable en el genoma de una
célula de una planta.
\newpage
18. El método de la reivindicación 16 o 17 que
comprende adicionalmente regenerar una planta a partir de dicha
célula de planta.
19. Una célula de planta transgénica para el
ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 obtenible introduciendo a
una célula de planta el ácido nucléico aislado de la reivindicación
3 o 4 unido operativamente a elementos reguladores que permiten la
transcripción y/o expresión de dicho ácido nucléico en células de
planta, o una célula de planta transgénica obtenible por un método
de la reivindicación 16 o 17.
20. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 19 donde dicho ácido nucléico de la reivindicación 3
o 4 está integrado de manera estable en el genoma de dicha célula de
planta.
21. Una planta o un tejido de planta transgénico
que comprende células de planta de la reivindicación 19 o 20.
22. Una parte recolectable de una planta de la
reivindicación 21, donde dicha parte recolectable comprende células
de planta de la reivindicación 19 o 20.
23. La parte recolectable de una planta de la
reivindicación 22 que es seleccionada del grupo consistente de
semillas, hojas, frutos, cultivos de tallo, rizomas, raíces,
tubérculos y bulbos.
24. La progenie transgénica derivada de
cualquiera de las plantas o partes de plantas de cualquiera de las
reivindicaciones 21 o 23 que comprende células de la planta de la
reivindicación 19 o 20.
25. Un método para estimular el crecimiento de
la raíz que comprende la expresión de un ácido nucléico de la
reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la
reivindicación 2.
26. Un método para potenciar la formación de
raíces laterales o adventicias que comprende la expresión de un
ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como
se define en la reivindicación 2.
27. Un método para alterar el geotropismo
radicular que comprende alterar la expresión de un ácido nucléico
de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la
reivindicación 2.
28. Un método de cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 27, llevando dicho método a un incremento en
rendimiento.
29. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 28 donde dicha expresión de dicho ácido
nucléico se presenta bajo el control de un promotor constitutivo
fuerte.
30. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 28 donde dicha expresión de dicho ácido
nucleico se presenta bajo el control de un promotor que es
preferencialmente expresado en raíces.
31. Un método para identificar y obtener
proteínas que interactuan con un polipéptido de la reivindicación
11 o 12 que comprenden una prueba de selección donde se usa un
polipétido de la reivindicación 11 o 12.
32. El método de la reivindicación 31 que
comprende una prueba de selección de dos híbridos donde se usan un
polipéptido de la reivindicación 11 o 12 como cebo y una biblioteca
de ADNc como presa.
33. Un método para identificar compuestos o
mezclas de compuestos que se enlazan específicamente a un
polipéptido de la reivindicación 11 o 12 que comprende:
- (a)
- combinar un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 con dicho compuesto o mezclas de compuestos bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de complejos, y
- (b)
- detectar la formación compleja, donde la presencia de un complejo identifica un compuesto o mezcla que enlaza específicamente dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
34. Un método para el diseño de o la selección
para productos químicos promotores del crecimiento o herbicidas que
comprenden el uso de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o
un ácido nucleico como se define en la reivindicación 2 o un vector
de la reivindicación 7 u 8.
35. Uso de una molécula de ácido nucléico de la
reivindicación 3 o 4 o un ácido nucleico como se define en la
reivindicación 2, el vector de la reivindicación 7 u 8, un
polipéptido de la reivindicación 11 o 12 para un rendimiento
incrementado.
36. Uso de una molécula de ácido nucléico de la
reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la
reivindicación 2, el vector de la reivindicación 7 u 8, un
polipéptido de la reivindicación 11 o 12 para estimular el
crecimiento radicular.
37. El uso de una molécula de ácido nucléico de
la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la
reivindicación 2, el vector de la reivindicación 7 u 8, un
polipéptido de la reivindicación 11 o 12 para potenciar la
formación de raíces laterales o adventicias.
38. Uso de una molécula de ácido nucléico de la
reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se definió en la
reivindicación 2, el vector de la reivindicación 7 u 8, un
polipéptido de la reivindicación 11 o 12 para alterar el
geotropismo radicular.
39. Composición de diagnóstico que comprende por
lo menos una molécula de ácido nucléico de cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, el vector de la reivindicación 7 u 8, un
polipéptido de la reivindicación 11 o 12 o un anticuerpo de la
reivindicación 14.
40. Un método para incrementar el tamaño del
meristema radicular que comprende la expresión de un ácido nucléico
de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la
reivindicación 2 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en
raíces.
41. Un método para incrementar el tamaño de la
raíz que comprende la expresión de un ácido nucléico de la
reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la
reivindicación 2 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en
raíces.
42. Un método para incrementar el tamaño del
meristema radicular que comprende la regulación en descenso de la
expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido
nucléico como se define en la reivindicación 2, preferiblemente en
brotes.
43. Un método para retrasar la senescencia de
las hojas que comprende la regulación en descenso de la expresión
de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico
como se define en la reivindicación 2 en hojas, preferiblemente en
hojas senescentes.
44. Un método para alterar la senescencia de las
hojas que comprende la expresión de un ácido nucleico de la
reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la
reivindicación 2 en hojas senescentes.
45. Un método para incrementar el espesor de las
hojas que comprende la expresión de un ácido nucléico de la
reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la
reivindicación 2 en plantas o partes de plantas.
46. Un método para reducir el tamaño de vaso que
comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3
o 4 un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en
plantas o partes de la planta.
47. Un método para incrementar el tamaño de los
vasos que comprende la regulación descendente de la expresión de un
ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como
se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de
plantas.
48. Un método para inducir la partenocarpia que
comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3
o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en
plantas o partes de plantas, preferiblemente en la placenta, óvulos
y tejidos derivados de los mismos.
49. Un método para mejorar la permanencia de
siembras que comprende la expresión de un ácido nucléico de la
reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la
reivindicación 2 en siembras, preferiblemente en las raíces de las
siembras.
50. Un método para incrementar la ramificación
que comprende la expresión en ácido nucléico de la reivindicación 3
o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en
plantas o partes de plantas.
51. Un método para mejorar la resistencia al
alojamiento que comprende la expresión de un ácido nucléico de la
reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la
reivindicación 2 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en
tallos o nódulos axilares.
52. Uso de una raíz de reserva transgénica que
comprende un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido
nucléico como se define en la reivindicación 2 en procedimientos de
injerto con un scion para mejorar las características relacionadas
con la raíz de la planta o árbol resultante caracterizado por
un crecimiento potenciado de la raíz debido a la expresión de una
citoquinina oxidasa de la planta codificada por dicho ácido
nucléico en dicha raíz de reserva.
53. Una planta transgénica que comprende una
raíz de reserva transgénica que expresa una citoquinina oxidasa de
planta de acuerdo con la reivindicación 52 y comprende
adicionalmente un sción.
54. Una parte recolectable de una planta de la
reivindicación 53, donde dicha parte recolectable comprende el
ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como
se define en la reivindicación 2.
55. Un método para estimular el crecimiento y
desarrollo radicular que comprende la expresión de un ácido
nucléico que codifica una citoquinina oxidasa de planta en una
célula o cultivo de tejidos de una planta transgénica.
56. Un método de acuerdo con la reivindicación
55 donde dicho ácido nucléico es por lo menos uno de los ácidos
nucléicos de la reivindicación 3 o como se define en la
reivindicación 2.
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