明細書
安定同位体標識タンパク質の製造方法 発明の背景
本発明は、安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法に関するものである。 より具体的には、 異種夕ンパク質をコ一ドする遺伝子を含む遺伝子構築物を導入 したコリネホルム細菌またはバチルス属細菌を用いて安定同位体で標識された夕 ンパク質を製造する方法に関するものである。
NMRを用いて、 タンパク質の立 造解析、 相互作用解析、 リガンドスクリ一二 ングなどが精力的に行われている。 立^造解析はタンパク質の座標情報に基づ くリガンドデザィンゃ夕ンパク質工学へ結びつき、 医薬品や高機能酵素の作成へ と発展しうる。 さらに、 NMRは、細胞内の情報伝達機構や代謝の解析において相互 作用部位や相互作用に伴う構造変化を把握するために利用される上、 弱い相互作 用であっても検出可能であり、 かつ、 相互作用部位が明確になることから、 リガ ンドスクリーニングへの応用も進められている。 特に近年では、 さまざまな種の ゲノム情報の開示や cDNAの蓄積があり、 ポストゲノム解析の一環として、 これら 遺伝子がコードするタンパク質の立体 造解析を網羅的に行なうプロジェクトも 進行中である。 ここでも NMRが重要な役割を演じている。
NMRを用いてタンパク質を解析する場合、 しばしば安定同位体標識が行われる。
NMRで感度良く検出される核種としては、 Ή、 13C、 15Nなどが挙げられるが、 そのう ち Ή以外は天然存在比が低い。 そこで、 NMR解析においては、 ¾標識することによ つてタンパク質中の シグナル数を減少させ、 シグナルの尖鋭化をもたらすこと により解析を容易にする方法 (ネガティブ標識法) と、 13Cや15 Nへと置換して多次 元 NMRに利用する方法 (ポジティブ標識法) が用いられている。
安定同位体で夕ンパク質を標識するには、 主に大腸菌による発現系を構築した
後、 標識ィ匕合物を添加した培地で組換え体大腸菌を培養することにより行なわれ ている。 標識化合物としては13 C標識グルコース、 15NH4C1、 13C標識グリセロール、 各種標識アミノ酸などが挙げられる [Biochemistry 21, 6273. ( 1982), Biochemi stry 29, 4659. (1990), Journal of Biomol NMR, 20, 71. (2001)など]。大腸菌 を用いた系は構築するのが容易なため広く普及しているが、 タンパク質が菌体内 に顆粒として蓄積されてしまい、 リフォールディングゃ精製に困難を伴う場合が 多い。 また、 菌体を高密度で培養することができないため、 タンパク質の収率が 低く、 NMR試料を準備するために 1〜1 0リットルもの培養を必要とする。 さ らに、 安定同位体の標識率は、 高い場合においても、 ¾標識の場合で 60%、 13Cに ついては 95%、 15Nについては 90%程度である [Journal of Biomol NMR, 20, 71. (2001 ) ] o
大腸菌のほかに酵母や動物細胞などの発現系を用いた安定同位体標識タンパク 質の作製法も利用されており、 これらの系では標識タンパク質が活性体として発 現されることからリフォールディングの問題は回避されるものの、 発現させ得る タンパク質の種類は限定的であり、 発現量も低く、 安定同位体化合物を多く消費 するためにコス卜がかかるという大きな問題点を有する。 この中でも比較的効率 の高い、 メタノール資化性を付与した酵母 Pichia pastorisを用いた安定同位体 タンパク質の分泌生産についてはいくつか報告されている [Journal of Biomol N MR, 20, 251. (2001 ), Journal of Biomol NMR, 17, 337. (2000)など]。 しかし、 Pichia pastorisを用いた方法は、 標識効率が高いというものの、 300mlスケール の連続培養を行なうために、 高価な安定同位体化合物を含む培地を連続供給する 必要がある。
高標識率の安定同位体標識タンパク質を得るためには、 さらに高濃度の安定同 位体化合物を含む培地が必要となるため、 コストが嵩む。例えば、 およそ 8mgの安 定同位 票識タンパク質 (13C安定同位 m 識率 98%) を得るために、 トータル 15
gの13 Cグルコースと 50gの13 Cメタノールという大量の安定同位体標識ィ匕合物を使 用しなければならないこと 報告されている [Journal of Biomol NMR, 20, 251.
(2001)]。 また、 15 N標識の場合、 高い標識率を目指したいときにも、 Pichia pas torisの場合は ( 15NH4)2S04濃度が 20g/Lになると発現が低下してしまうという問題 点があった。このように発現量が比較的高い酵母 Pichia pastorisを用いた安定同 位体標識タンパク質の分泌生産法においても、 多くの課題を抱えていた。
さらに、 無細胞系によって安定同位 票識タンパク質を調製する方法も報告さ れているが [J. Biomol. NMR 2, 129. ( 1995)]、凝集体としてタンパク質が合成さ れ、 リフオールディングが困難な場合が多い。
一方、 コリネホルム細菌を利用して異種タンパク質を効率良く分泌生産するた めの研究としては、 これまでにコリネバクテリウム ·グル夕ミカム (Corynebact erium glutamicum) (以後、 glutamicumと略すことがある)によるヌクレア一 ゼ(nuclease)やリパーゼの分泌 [US4965197, J.Bacteriol . , 174, 1854-1861(199 2) ]及び、サチライシン等のプロテア一ゼの分泌 [Appl . Environ. Microbiol. , 61,
1610-1613(1995)]、 コリネホルム細菌の細胞表層タンパク質の分泌 [特表平 6-5 02548]、これを利用したフイブロネクチン結合タンパク質の分泌 [Appl. Environ.
Microbiol. , 63, 4392-4400( 1997)]、変異型分泌装置を利用してタンパク質の分 泌を向上させた報告 [特開平 11- 169182]等がある。最近になって、コリネホルム細 菌を利用して構築された EGF (ヒト上皮細胞増殖因子) や MTG (微生物由来トラン スグル夕ミナ一ゼ)の発現系 [W0 01/23591]については、高い生産量が得られてい 。
また、 コリネホルム細菌の遺伝子操作技術は、 プロトプラストによるトランス フォーメーション法の確立 [J.Bacteriol. , 159, 306-311( 1984) ; J.Bacteriol. , 161, 463-467(1985)]、 各種べクタ一の開発 [Agric. Biol . Chem. , 48, 2901-29 3(1984); J.Bacteriol. , 159, 306-311( 1984) ; J. Gen. Microbiol ·, 130, 2237
-2246(1984); Gene, 47, 301-306(1986); Appl. Microbiol. Biotechnol. , 31, 65-69(1989)]、 遺伝子発現制御法の開発 [Bio/Technology, 6, 428-430 (1988)]及 びコスミドの開発 [Gene, 39, 28卜 286(1985)]など、プラスミ ドゃファージを用い た系で発展してきた。 またコリネホルム細菌由来の遺伝子クローニング [Nucleic Acids Resつ 14, 10113-1011(1986) ; J. Bacteriol. , 167, 695-702(1986) ; Nu cleic Acids Res. , 15, 10598(1987) ; Nucleic Acids Res. , 15, 3922(1987); N ucleic Acids Res. , 16, 9859(1988) ; Agric. Biol. Chem. , 52, 525-531 (198
8) ; Mol. Microbiol. , 2, 63-72( 1988) ; Mol. Gen. Genet. , 218, 330-339( 198
9) ; Gene, 77, 237-251( 1989)]についても報告されている。
さらにコリネホルム細菌由来の転移因子についても報告されている [W093/1815 1 ; EP0445385; 特開平 6-46867; Mol. Microbiol. , 11, 739-746(1994); Mol.Mic robioL , 14, 571-581(1994); Mol. Gen. Genet. , 245, 397-405(1994); FEMS M icrobiol. Lett. , 126, 1-6(1995) ; 特開平 7- 107976]。
転移因子とは染色体上で転移し得る D N A断片で、 原核生物から真核生物まで の広い範囲の生物に存在する事が知られている。 転移因子を利用したトランス ポゾンが閧発され [W0 93/18151; 特開平 7-107976; Mol. Gen, Genet. , 245, 397 -405(1994) ; 特開平 9-70291]、 トランスポゾンで異種遺伝子を発現させることも 可能になってきた。
一方、 バチルス ·ブレビス (Bacillus brevis)を高密度で培養して異種タンパ ク質を効率よく分泌生産するための研究としては、 Bacillus brevis 47 (特開昭 6 0-58074、 特開昭 62- 201583) の主要菌体外タンパク質の 1種である履タンパク質 (middle wall protein(MWP)) 遺伝子のプロモー夕一およびその遺伝子にコード されるシグナルべプチド領域を利用した分泌べクタ一を作製し、 同じく Bacillus brevis 47菌を宿主とした系が確立されている。 そしてひ-アミラーゼ (特閧昭 6 - 201583、 J.Bacteriol.169, 1239(1987)) や豚べプシノ一ゲン (日本農芸化学会
誌、 61,68( 1987)) の分泌生産に成功している。 また、 バチルス 'ブレビスの中で プロテア一ゼの菌体外生産量が少ない菌株 Bacillus brevis HPD31 (別名 Bacillu s brevis H102) を分離し、 これを宿主として、 耐熱性ひ-アミラーゼの高分泌生 産 ( Agr ic . Biol . Chem. , 53 , 2279-2280 ( 1989 ) ) ゃヒト上皮細胞増殖因子 (EGF) の 高分泌生産 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,3589-3593(1989)、 特開平 4-278091) 、 ヒトインターロイキン- 2 (Biosci . Biotechnol . Biochem. , 61, 1858-1861(1997)) ゃヒトイン夕一ロイキン- 6 (Biosci . Biotechnol .Biochem. , 64,665-669(2000)) などの分泌生産に成功している。なかでも EGFについては l. lg/Lと極めて高い分泌 蓄積が得られている。
しかしながら、 なおコリネホルム細菌やバチルス属細菌を用いて、 安定同位体 標識タンパク質を分泌生産させた例は未だ報告されていなかった。 発明の開示
本発明の目的は、 標識率の高い安定同位体標識タンパク質を安価に、 高い収率 で、 高純度で提供することである。
本発明者らは、 コリネホルム細菌およびバチルス属細菌、 例えばコリネバクテ リウム■グル夕ミカムおよびバチルス ·ブレビスでは天然の菌体外分泌夕ンパク 質が極めて少なく、 異種タンパク質を分泌生産した場合の精製過程が簡略化、 省 匕できるであろうこと、 および、 コリネホルム細菌は、 糖、 アンモニアや無機 塩等のシンプルな培地で良く生育するため、 安定同位体標識を含む培地にかかる 費用や培養条件の設定、 生産性の点で優れていることに着目した。 さらに、 コリ ネホルム細菌およびバチルス属細菌、 例えばコリネパクテリゥム ·グルタミカム およびバチルス ·プレビスは菌体密度が高密度で培養が可能であり、 高い収率が 期待されることから、 高価な安定同位体化合物の消費量を低減できるであろう点 に着目した。 そこで、 安定同位体の供給源であるグルコースおよびアンモニゥム
塩、 2H20等を含む培地での高密度培養研究の結果、 これらが高濃度で存在する培 地においても、 標識率の極めて高い安定同位 票識タンパク質を分泌生産するこ とに成功した。 より具体的には、 培地に13 C標識グルコース、 15N標識塩化アンモニ ゥム塩、 を添加し、 これらを炭素源や窒素源とすることにより、 当該タンパク質 を高い標識率で、 13Cや15 N標識できることを見出し、 本発明を完成するに至った。 また、 90%の2 H20中で培養することにより、 標識率の極めて高い2 H標識タンパク 質を分泌生産できることを見出した。
即ち、 本発明は、 異種タンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子構築物を導 入したコリネホルム細菌またはバチルス属細菌を ¾、 13C、 15Nのうち、 1つ以上の安 定同位体により標識された炭素源および/または窒素源、 および/または2 0を含 有する培地で培養し、 培養液中に前記異種タンパク質を分泌させ、 これを回収す ることを特徴とする安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法である。 特に本発明は、 上記方法において、 コリネホルム細菌がコリネバクテリウム · グルタミカムである、 安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法でもある。 また、 本発明は、 上記方法において、 バチルス属細菌がバチルス 'ブレビスで ある、 安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法でもある。
さらに、 本発明は、 炭素源が、 グルコース、 グリセロール、 シェークロースか らなる群より選ばれ、 窒素源が、 塩化アンモニゥム塩または硫酸アンモニゥム塩 である、 上記安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法でもある。
なお、 本明細書において、 タンパク質またはペプチドが 「分泌」 されるとは、 タンパク質またはペプチドの分子が細菌菌体外 (細胞外) に移送されることをい い、 最終的にそのタンパク質またはべプチド分子が培地中に完全に遊離状態にお かれる場合はもちろん、 一部のみが菌体外に存在している場合、 および菌体表層 に存在している場合も含む。
図面の簡単な説明
図 1は、 培地に高濃度の標識ィ匕合物を用 、ることの利点を図解したものである。 図 2は、 本培養への前培養液の添加量と菌体の生育との関係を示した物である。 図 3は、 未標識 EGF、 15N標識- EGF、 13C, 15N標識- EGFの MSスペクトルである。 図 4は、 培地中に分泌された15 N標識 EGFおよび MTGの HSQCスぺクトルである。 図 5は、 コリネホルム細菌 (a ) および大腸菌 (b ) を用いて標識した MTGの H SQCスぺクトルである。 発明を実施するための最良の形態
前述したように、 安定同位 票識タンパク質を製造するにあたっては、 大腸菌 を用いる方法が一般的であるが、 活性型のタンパク質を得るためにはリフォール ディング操作を必要とし、 正しいリフォールディングを行うためには多くの試行 錯誤と労力を要する。 また、 産生されたタンパク質を活性型タンパク質として分 泌させる方法も知られているが、 もっとも効率が良いとされる酵母を用いた製造 法においてもなお収率は低く、 多くの高価な安定同位 票識化合物を消費する。 本発明はこのような問題を克服するものである。 以下に本発明の具体的ないくつ かの実施態様を例示する。
本発明においては、 高密度培養が可能で、 異種タンパク質を分泌生産できる微 生物、 例えば、 コリネホルム細菌やバチルス属細菌が使用されることが好ましい。 高密度培養が可能で、 異種タンパク質を分泌生産できる微生物、 特にコリネホル ム細菌やバチルス属細菌を使用することの利点は、 これまでタンパク質の分泌発 現に用いられてきた酵母や昆虫細胞と比べ、 菌体外に分泌される目的外のタンパ ク質が極めて少なく、 目的のタンパク質を分泌生産した場合に精製過程を簡略ィ匕 できることである。
また、 例えば昆虫細胞を利用する場合、 糖やアミノ酸を豊富に含んだ培地にて
生育する必要があるのに対し、 このような微生物を利用する場合は、 糖、 アンモ ニゥム塩などのみを炭素源と窒素源にすればよく、 従って安定同位体原子の導入 に適している。 さらに、 このような微生物を利用する場合は、 微生物における発 現量が高く、高密度培養が可能なため小スケールのバッチ培養にて NMR試料に十分 量のタンパク質を得ることが可能である。 従って、 安定同位体で標識されたタン パク質を簡易な設備で製造でき、 かつ、 高価な安定同位体化合物の消費量を酵母 に比べて大幅に低減することが可能であることから、 これまでの方法と比べて、 経済性および生産性が向上する。 さらに、 このような微生物は高濃度の安定同位 体供給源 (糖、 アンモニゥム塩など) 培地で培養が可能なため、 培地中の安定同 位体の濃度が高くなり、 99%以上という安定同位体標識率の極めて高い標識夕ン パク質を分泌生産することが可能となる。
本明細書において、 コリネホルム細菌とはパージヱイズマニュアルォブディ夕 —ミネ一ティブパクテリォロジ一第 8版 599ページ (1974) に記載されているよう に、 好気性のグラム陽性かん菌であり、 従来ブレビパクテリゥム属に分類されて いたが、 現在コリネパクテリゥム属に統合された微生物を含み [ Int. J. Syst. B acteriol. , 41, 255(1981)]、またコリネパクテリゥム属と非常に近縁なブレビバ クテリゥム属細菌を含む。
本発明において使用できるコリネホルム細菌には、 例えば L-グル夕ミン酸生産 菌に代表されるブレビパクテリゥム 'サッカロリテイクム ATCC14066、ブレビバク テリゥム,インマリオフィルム ATCC14068、 ブレビバクテリウム ·ラクトファ一メ ン夕ム (コリネバクテリゥム ·グル夕ミカム) ATCC13869、 ブレビパクテリゥム . ロゼゥム ATCC13825、 ブレビパクテリゥム ·フラバム (コリネバクテリゥム ·グル タミカム) ATCC14067、 コリネバクテリゥム ·ァセトァシドフィルム ATCC13870、 コリネバクテリウム ·グル夕ミカム ATCC13032、コリネバクテリウム ·リリウム(コ リネパクテリゥム■グゾレタミカム) ATCC15990、 ブレビパクテリゥム 'アンモニア
ゲネス (コリネバクテリゥム 'アンモニアゲネス) ATCC6871等の野生株、 及び、 これら野生株より誘導される変異株、 例えばグル夕ミン酸生産性を失った変異株、 更にはリジン等のアミノ酸生産変異株、 イノシン等の核酸のような他の物質を生 産する変異株が含まれる。
本発明で利用できるバチルス属細菌には、 例えば、 バチルス 'ブレビス細菌が 含まれる。 バチルス ·ブレビス細菌とは好気性のグラム陽性かん菌であり、 例え ば Bacillus brevis 47 (特開昭 60-58074、 特開昭 62-201583)、 Bacillus brevis H102 (特開昭 63-56277)が利用できる。好適には Bacillus brevis H102が用いら れる。 またこれらの変異株も本明細書における 「バチルス属細菌」 に含まれる。 本発明に使用される遺伝子構築物は、 一般にプロモーター、 適切なシグナルべ プチドをコードする配列および目的タンパク質をコードする核酸断片、 および宿 主中で目的タンパク質遺伝子を発現させるために必要な制御配列 (オペレーター や夕一ミネ一夕一等) を、 それらが機能し得るように適切な位置に有するもので ある。
例えば、 本発明に使用される遺伝子構築物は一般にプロモ一夕一、 適切なシグ ナルぺプチドおよび目的タンパク質をコードする核酸断片、 およびコリネホルム 細菌またはバチルス属細菌中で目的タンパク質遺伝子を発現させるために必要な 制御配列 (プロモーターやターミネ一夕一等) を含む適切な配列を適切な位置に 有するものである。 この構築物のために使用できるベクターは特に制限されず、 宿主、 例えばコリネホルム細菌またはバチルス属細菌中で機能しえるものであれ ばよく、 プラスミドのように染色体外で自律増殖するものであっても細菌染色体 に組み込まれるものであっても良い。 宿主に依存してコリネホルム細菌由来また はバチルス属細菌由来のプラスミ ドは特に好ましい。 これらには、 例えばこれら には、 例えば扉 519(Agric, Biol. Chem. , 48, 2901-2903( 1984) ), ρΑΜ330 (Ag ric. Biol. Chem. , 48, 2901-2903( 1984))、 pHT926(特願平 4-216605)、およびこ
れらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミ ドが含まれる。 バチルス ·ブレ ビスを宿主とする場合は チルス 'サチルスで利用される pUB110( J. Bacteriol., 134, 318- 329( 1978) )も利用できる。
また、 トランスポゾン等も利用することができる。 トランスポゾンが使用され る場合は相同組換えまたはそれ自身の転移能によって目的遺伝子が染色体中に導 入される。 使用できるプロモー夕一、 SD、 シグナルペプチドコード遺伝子として は、 特に限定されず、 宿主で機能するものであればいずれでもよい。
本発明に使用できるプロモー夕一は特に限定されず、 宿主微生物内で機能し得 るプロモー夕一であれば一般に使用でき、更に異種由来の、例えば tacプロモータ —等の E.coli由来のプロモ一夕一であってもよい。その中で、 tacプロモ一夕一等 の強力なプロモ一夕一がより好ましい。
コリネホルム細菌由来のプロモー夕一には、 例えば、 細胞表層タンパク質の PS 1、 PS2、 SlpAの遺伝子のプロモ一夕一、 各種アミノ酸生合成系、 例えばグルタミ ン酸生合成系のグル夕ミン酸脱水素酵素遺伝子、 グル夕ミン合成系のグル夕ミン 合成酵素遺伝子、 リジン生合成系のァスパルトキナ一ゼ遺伝子、 スレオニン生合 成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、 ィソロイシンおよびバリン生合成系のァセ トヒド口キシ酸合成酵素遺伝子、 口イシン生合成系の 2-ィソプロピルリンゴ酸合 成酵素遺伝子、 プロリンおよびアルギニン生合成系のグル夕ミン酸キナーゼ遺伝 子、 ヒスチジン生合成系のホスホリボシル -ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、 トリ ブトファン、 チロシンおよびフェニルァラニン等の芳香族ァミノ酸生合成系のデ ォキシァラビノヘプヅロン酸リン酸 (DAHP) 合成酵素遺伝子、 イノシン酸および グァニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート(PRP P)アミドトランスフェラ一ゼ遺伝子、 イノシン酸脱水素酵素遺伝子およびグァニ ル酸合成酵素遺伝子のプロモー夕一が含まれる。 宿主としてバチルス属細菌を用 いる場合、 特にバチルス ·プレビスを用いる場合は、 例えば、 Bacillus brevis
47あるいは H102由来のプロモー夕一、 SD、 シグナルペプチドをコードする遺伝子 (J. Bacteriol. , 170, 935-945( 1998), J.Bacteriol . , 172, 1312-1320(1990))を用 いることができる。
本発明によって標識されるタンパク質は特に限定されない。 天然で分泌型でな いタンパク質を本発明によって安定同位 票識する場合は、 上述したように、 適 切なシグナルペプチドを付加する等により分泌型タンパク質に改変した上で標識 することができる。
本発明によって安定同位体標識し得るタンパク質は、 本質的には動植物ゃ微生 物由来のタンパク質全般が含まれ、 特に限定されない。 例えば、 アルブミン、 ィ ムノグロプリン、 血液凝固因子などのヒト血漿成分;プロテァーゼ、 トランスフ エラーゼなどの酵素;成長ホルモン、 エリスロポエチンなどのホルモン;細胞増 殖、 抑制などの細胞増殖因子;細胞分化、 誘導、 刺激などの免疫反応調節因子; モノ力イン、 サイ ト力イン、 リンホカインなどの細胞産性生物学的活性タンパク 質;等のタンパク質を本発明によって安定同位体標識することができる。 以下の 実施例においては、本発明の方法により微生物由来トランスグル夕ミナーゼ (MTG) およびヒト上皮細胞増殖因子 (EGF)を安定同位^識した例が示される。
天然でプレブ口べプチドとして発現されるタンパク質を本発明によって標識す る場合に、 プロタンパク質をコードする遺伝子を使用することもできる、 その遺 伝子の発現によって得られるタンパク質のプロ構造部は適当な手段、 例えばプロ テア一ゼによって切断すればよく、 アミノぺプチダ一ゼ、 適切な位置で切断する エンドべプチダーゼ、 あるいは、 より特異的なプロテアーゼを使用することがで きる。
本発明において、 タンパク質を分泌させるために使用し得るシグナルべプチド は、 宿主であるコリネホルム細菌またはバチルス属細菌の分泌性タンパク質のシ グナルペプチドが好ましい。 例えば、 コリネホルム細菌を利用する場合は、 コリ
ネホルム細菌の細胞表層タンパク質のシグナルぺプチドが好ましい。 コリネホル ム細菌の細胞表層タンパク質には、 C. glutajnicumに由来する PS1及び PS2 (特表 平 6-502548) 、 及び ajmoniagenesに由来する SlpA (特開平 10-108675) が含ま れる。 また、 米国特許 4965197によれば、 コリネ型細菌由来の DNaseにもシグナル ぺプチドがあると言われており、 そのようなシグナルべプチドも利用することが できる。 バチルス属細菌を利用する場合は、 例えば、 Bacillus brevis 47 (特開 昭 60- 58074、特閧昭 62-201583)の主要菌体外タンパク質の 1種である層タンパク 質や 0Wタンパク質のシグナルペプチド、 バチルス ·サブチリス(Bacillus subtil is )のひ-アミラーゼのシグナルぺプチドを利用することができる。
シグナル配列は、 翻訳産物が菌体外に分泌される際にシグナルべプチダーゼに よって切断される。 従って、 シグナルペプチドをコードする遺伝子は、 天然型の ままでも使用できるが、 使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを 有するように改変してもよい。 これらのシグナルペプチドを使用する場合、 目的 とするタンパク質をコードする遺伝子は、 シグナルべプチドをコ一ドする遺伝子 の 3'-末端側に接続し、 かつ、 上記プロモーターにより発現の制御を受けるように 配置すればよい。
本発明において、 培地中の炭素源としてはグルコースおよびシュ一クロースの ような炭水化物、 酢酸のような有機酸、 グリセロールのようなアルコ一ル類、 ァ ミノ酸、 その他を使用することができる。 その中でも比較的安価なグルコース、 シュ一クロース、 グリセロールが好ましい。 窒素源としては、 アンモニアガス、 アンモニア水、 アンモニゥム塩、 アミノ酸、 その他が使用できる。 その中でも、 入手が容易で取り扱いやすい塩ィ匕アンモニゥムゃ硫酸アンモニゥムが好ましい。 安定同位体標識する場合は炭素源や窒素源の種類が少ないことが望ましい。 本発 明に用いるコリネホルム細菌は、 例えば、 グルコース、 アンモニゥム塩のみをそ れぞれ炭素源、 窒素源とすることができるので好ましい。 このとき、 グルコース
を 13C標識すれば13 C標識、 アンモニゥム塩を 15N標識すれば15 N標識される。
培地中の標識炭素源濃度は、 13C標識-グルコース濃度に換算して 5g/L〜150g/L (約 27mM〜約 0.81M) が好ましく、 さらに好ましくは、 20g/L〜60g/L (約 107mM〜 約 322m ) 、 特に好ましくは、 30g/L〜50g/L (約 160mM〜約 269mM) である。 また、 標識窒素源濃度は、 アンモニゥム塩として用いる場合に15 NH4 +濃度として 30mM〜: IM が好ましく、 より好ましくは、 50m〜600niM、 特に好ましくは、 200mM〜400mMであ る。
標識化合物を含む培地にて菌体を培養する (本培養) 前に、 実施例 1に示すよ うに前培養を行なうと菌体の生育が良い。 本培養液に添加する前培養液の量は少 ないほど標識率が高まるので好ましいが、 一方、 添加する前培養液の量が少なす ぎると菌の生育に悪影響を及ぼす。 一般に、 菌の良好な生育のためには本培養液 に添加する前培養液の割合は 0.5%以上が好ましく、標識率を高めるためには後述 するようにこの割合を高々 10%程度にすることが好ましい。 本発明の一実施態様 においては、 本培養液に添加する前培養液の割合は 2.5%(v/v)程度が最適である ことが示されている。
本培養液を構成する標識化合物の濃度が高いことにより、 タンパク質の標識率 を向上させることができる (図 1参照) 。 添加する前培養液に未標識のグルコ一 スが A g/L残存し、 これを 2.5%本培養液に添加すると仮定する。 従来、 大腸菌を 培養して標識タンパク質を取得する場合のように本培養液の13 Cグルコース濃度 が 2 g/Lとすると、 前培養液に含まれる未標識グルコースが 1.25 XA %取り込ま れてしまう。 一方、 本発明のように高濃度の13 Cグルコース、 例えば 60 g/Lの13 Cグ ルコースを用いた場合には、 未標識グルコースは 0.042 XA %しか取り込まれず、 高い標識率を達成することが可能となる。同様なことが2 Hや15 Nについても言える。 従って、 本培養液に添加する前培養液の割合は厳密に制限されるわけではないが、 菌の良好な生育を保証しつつ高い標識率を得るためには前記の割合は 0.5%〜1
5%(v/v)であることが好ましく、 より好ましくは、 1%〜: 10%(ν/ν)であり、 特に 標識率の高いタンパク質を製造する場合は 1.5%~5% (v/v)が好ましい。培地中 の安定同位体で標識された炭素源および/または窒素源の濃度は本培養液に添カロ する前培養液の割合に応じて変化させることもできる (図 1参照) 。
大腸菌などを用いた場合、 培地に含まれる安定同位体標識されたグルコースや 塩の濃度が高すぎると生育に支障が生じるが、 バチルス属細菌、 特にバチルス - ブレビスやコリネホルム細菌ではこれらのことは問題とならない。 また、 高濃度 のグルコースやアンモニゥム塩を用いたとしても、 これらの微生物の培養量が少 なくてすみ、 コストが高くなるおそれもない。
このように高濃度の標識ィ匕合物を含む培地中で培養することにより、 本発明の 一実施態様では、標識率が 100%に極めて近い安定同位 票識タンパク質を得るこ とができる (例えば、 実施例 3 ) 。 実施例 3では、 20mlスケールのフラスコ培養 を示した。 このように小容量、 高密度培養でかつ高収率で目的タンパク質が得ら れるため、 例えば、 安定同位 ί«票識タンパク質の量として、 標識グルコースを使 用する場合に 0.8g〜1.2g、塩化アンモニゥム塩を使用する場合に 0.35g〜0.6gとい う少量使用するだけで、 およそ 2mg〜9mgの安定同位体夕ンパク質を分泌生産する ことができる。 従って、 酵母 Pichia pastorisの場合が 8mgのタンパク質を生産す るために、 グリセロール 15g、 メタノール 50gを消費することと比較して、 安価に 目的標識タンパク質を製造することが可能である [Journal of Biomol MR, 20, 251. (2001 )]。
また、 グルコース、 コハク酸等を2 H標識した上で2 H20溶媒を含む培地にて培養 することによって、 2H標識タンパク質を作成することが可能である。 本発明の別 の実施態様においては、 高価な2 H標識グルコースやアミノ酸を使用しなくとも、 2¾0で作成した培地で培養することにより、 90%という髙レ、標識率で目的の安定 同位 票識タンパク質を分泌生産することができる (実施例 4 ) 。 さらに、 これ
らの安定同位体で標識された化合物を組み合わせて培地中に添加することによつ て 2種類あるいは 3種類の核種について安定同位 票識されたタンパク質を得る ことがでぎる。
2H標識タンパク質を作成する場合は、 2¾0溶媒を含む培地を必要とするため、 通常の方法では多量の2 0を必要とするが、本発明では、高密度培養であるため2 H20を用いた培地の容量が少なくてもよい。標識率についても、 大腸菌の 60%程度 と比較しても、遥かに高い2 H標識が可能である [Journal of Biomol NMR, 20, 71.
(2001 ) ]。 酵母については正確な標識率が記載された例はないが、 連続培養であ るため、 大量の2 ¾0を必要とする。
本発明において、 培地には菌の発育および夕ンパク質分泌生産を促進するため に、 アミノ酸やビタミンを添加してもよい。 炭素源と窒素源に加え、 無機イオン として、 カルシウムイオン、 マグネシウムイオン、 リン酸イオン、 カリウムィォ ン、 鉄イオン等を必要に応じて適宜使用する。 培養は宿主の生育に適した温度お よび pH、例えば、 H 5.0〜8.5、 15°C〜37°Cの適切な範囲にて好気的条件下で行な い、 1〜7日間程度行なえばよい。 このような条件下で形質転換体を培養するこ とにより、 目的タンパク質を菌体内で多量に生産され効率よく菌体外に分泌させ ることができる。 用いる菌にアミノ酸要求がある場合には、 菌の生育やタンパク 質の発現量を向上させるためにアミノ酸を添加することもできる。 この場合、 培 地中の他の物質を標識した安定同位体と同じ安定同位体で標識されたアミノ酸を 用いることが好ましい。
本発明によって培地中に分泌された安定同位体標識タンパク質は、 よく知られ た方法に従って培養後の培地から分離精製することができる。 例えば、 菌体を遠 心分離等により除去した後、 塩析、 エタノール沈殿、 限外濾過、 ゲル濾過クロマ トグラフィー、 イオン交換カラムクロマトグラフィー、 ァフィニーティークロマ トグラフィー、 中高圧液体クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、 疎水
クロマトグラフィ一等の既知の適切な方法、 またはこれらを組み合わせることに より分離精製することができる。 また、 このようにして得られた安定同位 票識 タンパク質は、良く知られた方法によって、 NMスぺクトルや MSスぺクトルを測定 することが可能である。 特に、 本発明においては、 培養後の培地中に夾雑タンパ ク質がほとんど存在しないため、 菌体を遠心分離等により除去した後、 透析によ る低分子化合物の除去及び限外ろ過によるタンパク質の濃縮の操作だけでも MR スぺクトルの測定が可能である。
本発明は以下の実施例によって更に具体的に説明されるが、 これらはいかなる 意味でも本発明を限定するものと解してはならない。 実施例
参考例 1 .コリネバクテリゥム'グル夕ミ力ム AJ12036より細胞表層夕ンパク質( P S 2 ) 遺伝子破壊株の作製
Corynebacterium glutajnicum ATCC13869より既にストレプトマイシン(Sm)耐性 株 AJ12036が育種されており、 Corynebacterium glutamicumでの遺伝子組換え用の 一つの宿主として使用されている (米国特許第 4, 822, 738号) 。 Corynebacterium glutamicum (旧名称 Brevibacterium lactofermentum)AJ12036は昭和 59年 3月 26日 付けで FERM P- 7559として、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(現、独 立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託セン夕一 日本国茨城県つくば 巿東 1一 1— 1中央第 6、郵便番号 305- 8566)に寄託され、昭和 60年 3月 13日付け で FERM BP- 734としてブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管されている。
AJ12036株は細胞表層タンパク質 (PS2)を少量、 培地中に分泌していることが確 認されたので、完全に PS2を生成しないように遺伝子破壊を行なえばタンパク質の 分泌効率をさらに向上させることができるのではないかと考えられる。 そこで以 下のように相同組換え法を用いて PS2遺伝子完全欠損株の作製を行なった。
斉藤、三浦の方法 [Biochim. Biophys. Acta. , 72, 619( 1963)]により調製した C orynebacterium glutamicum ATCC13869の染色体 DMから、 下記に示したプライマ 一を合成し、配列番号 1と 2および配列番号 3と 4の組み合わせでそれぞれ PCRを行な つた。 Corynebacterium glutamicum ( 13869の?32遺伝子配列は米国特許第5,5 47,864号に記載されている。
次に増幅したそれぞれの断片と配列番号 1と 3のプライマ一の組み合わせで Cros sover-PCRを行い、 PS2遺伝子のプロモーター領域およびコ一ディング領域の N末 端側を欠損させた APS2断片を増幅させた。 この断片を pUC19の Smal部位にクロ一 ン化し、 PUAPS2を構築した。 PUAPS2を Kpnlと Xbal消化して APS2断片を切り出し、 プラスミ ド PHM1519由来の温度感受性プラスミ ドベクターである pHS4(米国特許第 5, 616, 480号) の Kpnl- Xbal部位に挿入することにより、 pHSAPS2を構築した。 プ ラスミ ド pHS4で形質転換された Escherichia coli AJ12570は FERM P-11762とし て、 平成 2年 10月 11日付けで通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 (現、 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、 日本国茨城県つく ば巿東 1— 1— 1中央第 6、 郵便番号 305-8566) に寄託され、 平成 3年 8月 26日 付けで FERM BP-3523としてブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管されている。
(配列番号 1) 5, -act ggg agg cta tct cca tt-3'
(配列番号 2) 5, -ate gat ctg ate acg tta ca - 3,
(配歹 U番号 3) 5' -tgt aac gtg ate aga tcg att cac tgg tcg aca ccg ttg a- 3,
(配列番号 4) 5, -acg gaa get acc ttc gag gt-3'
<配列表フリーテキスト >
配列番号 1〜4: PCRプライマ一
次に pHSAPS2を AJ12036株にエレクトロポレーシヨンにより導入し、日本特許 第 2763054号に記載した相同組換え法により PS2遺伝子完全欠損株を取得した。 本株を YDK010株と命名した。 参考例 2 . C. glutamicum ATCC13869の細胞表層タンパク質のシグナル配列を有 する hEGF遺伝子の構築
C. glutamicumの細胞表層夕ンパク質である PS2の遺伝子の配列は既に決定され ている [Mol . Microbiol . , 9, 97-109( 1993) ]。 この配列を参考にして配列番号 5 と配列番号 6に示したプライマーを合成し、 斉藤、 三浦の方法 [Biochem. Biophy s. Act. , 72, 619( 1963) ]により調製した C. glutamicum ATCC13869の染色体 DM から PS2に相当するタンパク質の 5'-上流域とシグナル配列を含む N末端側ァミノ 酸を 4 4残基コードする領域を P C R法にて増幅した。 PCR反応には Pyrobest DN A ポリメラーゼ(宝酒造社製)を用いており、反応条件は添付のプロトコールに 従った。 配列番号 5に示したプライマ一は 5'端側にプラスミ ドへ挿入するために 必要な制限酵素 Kpnlの認識配列を含んでいる。
(配列番号 5 ) 5, -GCTCGGTACCCAAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(配列番号 6 ) 5, -GTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3 '
<配列表フリーテキスト>
配列番号 5、 6: PCRプライマ一 一方、 配列番号 7と配列番号 8に示したプライマーを合成し、 hEGF遺伝子の配 列を含んでいるプラスミ H pT13SAhIL2-KS-hEGF(H3 ) (特開昭 64-2583) から hEG Fをコードする領域を PCR法にて増幅した。 また当該遺伝子を含むプラスミ ド p Tl 3S厶 hIL2-KS-hEGF(H3)を形質転換した大腸菌 AJ12354は昭和 62年 11月 20日付けで F
ERM P-9719として、 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 (現、 独立行政 法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター) に寄託され、 平成 14年 3月 1 8日付けで FERM BP-7966としてブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管されてい 。
配列番号 7に示したプライマ一は PS2に相当するタンパク質の 5'-上流域と N末 端側アミノ酸を 44¾基コードする領域との融合遺伝子を構築するために PS2のシ グナル配列 C末端側のアミノ酸をコ一ドする遺伝子配列を含んでいる。
(配列番号 7 ) 5, -AACATCAACAACGGCTTCAACAATTCCGATTCTGAGTGCCCT-35
(配列番号 8 ) 55 -CGGCCACGATGCGTCCGGCG-35
<配列表フリーテキスト>
配列番号 7、 8 : PCRプライマー 次に、増幅させた C. glutamicumの PS2に相当するタンパク質の 5'-上流域と N末 端側ァミノ酸を 44¾基コ一ドする領域の PCR反応液 1〃 1と、 やはり増幅させた hE GFの遺伝子領域の PCR反応液 1〃1を混ぜて錡型とし、 配列番号 5と配列番号 8を 用いてクロスオーバー PCRを行い、 C. glutamicumの細胞表層タンパク質の 5'-上流 域と N末端側ァミノ酸を 4 4残基コ一ドする領域に接続された hEGFの融合遺伝子 を増幅させた。ァガロースゲル電気泳動により約 0.9kbの増幅断片を検出した。こ の断片を EASY TRAP Ver.2 (宝酒造社製) を用いてァガロースゲルから回収した。 回収した DNAを制限酵素 Kpnlと BajnHI (宝酒造社製) により切断し、 DNA Clean-UP system(Promega社製)により精製し、 特開平 9-322774記載のプラスミ ド PPK4の Kp nl-BamHI部位に挿入することによって、 pPKEGFを得た。 ダイ夕一ミネ一夕一サイ クルシークェンシングキット(PEアプライ ドバイオシステムズ社製)と DNAシーク ェンサ一 377 (PEアプライ ドバイオシステムズ社製)を用いて挿入断片の塩基配列
の決定を行い、 予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。 参考例 3 . hEGF生産株の作製
実施例 2で作製した hEGF発現プラスミド pPSEGFを用いて、実施例 1で作製した C. glutamic聰 YDK010株をエレクトロポレーシヨン法により形質転換し、 カナマイ シン耐性株を取得した。 得られた株を 25mg/lのカナマイシンを含む MMTG液体培地
(グルコース 60g、硫酸マグネシウム七水和物 0, 4g、硫酸アンモニゥム 30g、 リ ン酸ニ水素カリウム lg、 硫酸鉄七水和物 0.01g、 硫酸マンガン五水和物 0.01g、 チアミン塩酸塩 450 g、 ピオチン 450/zg、 DL-メチォニン 0. 15g、炭酸カルシゥ ム 50g、水で 1 Lにして p H7.5に調整)でそれぞれ 30°C、 3日間振とう培養した。 菌体を遠心除去した培養上清 を SDS-PAGEに供した。 市販 hEGF (PEPRO TECHE C LTD) を標準品として同時に泳動し、 クマシ一プリリアントブル一 (CBB) 染色 を行った結果、 同移動度の位置にバンドを検出した。 培養上清中に他の不純タン パク質はほとんど検出されなかった。 参考例 4 . コリネバクテリゥム ·グル夕ミカム YDK010を用いる MTGの分泌生産
参考例 1で作製した YDK010株にプロ構造改変型トランスグル夕ミナーゼ分泌発 現プラスミ ドである pPKSPTGll (特許公開 WO 01/23591) とセリンプロテア一ゼ(S AMP45)発現プラスミ ドである pVSSl (特許公開 W0 01/23591) を導入し、形質転換 体を得た。 5mg/lのクロラムフエ二コールと 25mg/lのカナマイシンを含む上記 CM2 S寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、選択した pVSSlと pPKSPTGllを有する C. glutamicum YDK010株を、 5mg/lのクロラムフエ二コールと 25mg/lのカナマイシ ンを含む MMTG液体培地(グルコース 60g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4g、硫酸 アンモニゥム 30g、 リン酸ニ水素力リゥム 1 g、硫酸鉄七水和物 0.01g、硫酸マ ンガン五水和物 0.01g、 チアミン塩酸塩 450〃g、 ピオチン 450 g、 D L—メチ
ォニン 0. 15g、 炭酸カルシウム 50g、 水で 1 Lにして pH7.5に調整) で 30°C、 70 時間培養した。
培養終了後 10〃1の培養上清を SDS-PAGEに供した。 C.glutamicum ATCC13869形質 変換体を用いて分泌生産、 精製したトランスグル夕ミナ一ゼ (特許公開 W0 01/23 591) を標準品として同時に泳動し、 クマシ一ブリリアントブル一 (CBB) 染色を 行った結果、 同移動度の位置にバンドを検出した。 培養上清中に他の不純タンパ ク質はほとんど検出されなかった。 その結果 SAMP45が正常に分泌発現し、 やはり 分泌されているプロ構造部付きトランスグル夕ミナ一ゼのプロ構造部が切断され、 天然型の成熟トランスグル夕ミナーゼとほぽ同じ分子量を有するトランスグル夕 ミナ一ゼの分泌が認められた。 実施例 1 . 前培養液の添加量の検討
本培養液に添加する前培養液の量が多すぎると安定同位^識率の低下原因と なる。 一方、 本培養液に添加する前培養液の添加量が少なすぎると菌体の生育が 低下してしまう。 そこで、 最適な前培養液添加量を検討することとした。
参考例 3で作成した EGF遺伝子を含むプラスミドを導入した Corynebacterium glutajiiicum YDK010形質転換体のカナマイシン耐性株を利用し、検討を行った。ま ず、 グルコース 5g/L、 ポリペプトン 10g/L、 イーストェクストラクト 10g/L、 N aCl 5g/L、 D L—メチォニン 0.2g/L、 pH7.2となるように調整し、 さらに、 25mg /Lのカナマイシンを含む CM2G液体培地を作成し 16時間、 前培養を行った。
続いて、 グルコース 60g/L、 塩化アンモニゥム 30g/L、 DL-メチォニン 0. 15g/ L、硫酸マグネシウム七水和物 0.4g/L、 リン酸二水素カリウム lg/L、硫酸鉄七水 和物 0.01g/L、 硫酸マンガン五水和物 0.01g/L、 チアミン塩酸塩 450mg/L、 ピオ チン 450mg/L、 炭酸カルシウム 50g/L、 pH7.5となるように調整し、 さらに、 25m g/Lのカナマイシンを含む MMM液体培地を作成した。前培養液の添加量を、 0. 1%、 0.
5%、 1.0% 2.5%、 5.0%、 10%とした上で、 30°Cにて 24時間本培養を実施した。本培 養液の吸光度 (0D562 nm) を図 2に示す。
図 2から、前培養液の本培養液への添加量は約 0.5%〜約 10%でよく、特に約 2. 5%程度とすることが最適であることが示された。 実施例 2 . コリネホルム細菌による EGFの安定同位体標識
参考例 3で作成した EGF 遺伝子を含むプラスミ ドを導入した Corynebacterium glutamicumYDKOlO形質転換体のカナマイシン耐性株を利用し、 安定同位体標識蛋 白質を調製することとした。 実施例 1と同様に CM2G液体培地を作成し 16時間、 前 培養を行った。 15 N標識-塩化アンモニゥム (CIL)、 13Cグルコース(CIL)については、 標識率がそれぞれ 99、 99%のものを使用し、 下記の実験を行った。
15N標識標識用培地調製
グルコース 60g/L、 15N標識-塩化アンモニゥム 30g/L、 15N標識 - L—メチォニン 0, 15g/L、 硫酸マグネシウム七水和物 0.4g/L、 リン酸二水素カリウム lg/L、 硫 酸鉄七水和物 0.01g/L、 硫酸マンガン五水和物 0.01g/L、 チアミン塩酸塩 450mg /L、 ピオチン 450 g/L、 炭酸カルシウム 50g/L、 pH7.5となるように調整し、 さら に、 25mg/Lのカナマイシンを添加することにより15 N標識匪液体培地を作成した。 また、 この他に、 グルコースと15 N標識-塩化アンモニゥムの量を 40g/L、 17.5g/L および 20g/L、 5g/L( 100mM)の15 N標識画液体培地を作成した。
13C、 15N標識用培地調製
13Cグルコース 60g/L、 15N標識-塩化アンモニゥム 30g/L、 I3C, 15N標識- L-メチォ ニン 0. 15g/L、 硫酸マグネシウム七水和物 0.4g/L、 リン酸二水素カリウム lg/L、 硫酸鉄七水和物 0.01g/L、 硫酸マンガン五水和物 0.01g/L、 チアミン塩酸塩 50
mg/L、 ピオチン 450mg/L、 炭酸カルシウム 50g/L、 pH 7.5となるように調整し、 さらに、 25 g/Lのカナマイシンを添加することにより13 C, 15N標 Ι^ΜΜΜ液体培地を 作成した。 また、 この他に、 グルコースと15 N標識-塩化アンモニゥムの量を 40g/L、 17.5g/Lおよび 20g/L、 5g/L (94mM) の15 N標識 MMM液体培地を作成した。
EGF産生菌株について、 実施例 1と同様な手順に従って前培養を実施した後、 本培養液 20mlに対して、 2.5%あるいは 10%の前培養液を、 20mlの15 N標識 MMM 液体培地、 あるいは13 C, 15N標識 MMM液体培地の入つた 500ml容坂ロフラスコへ 添カ卩し 30°Cにて 24時間振とう培養を行った。 対照として、 未標識グルコース、 未標識塩ィ匕アンモニゥムを含む同様な培地にても培養を行い、 15N標識率および1 標識率を算出することとした。未標識培地にて得られた EGFに対し、 15N標識 M MM液体培地、 および13 C, 15N標識 MMM液体培地にて調製した EGFを、 それぞれ15 N - EGF、 13C, 15N-EGFと呼ぶ。
実施例 3 . 15N-EGFおよび13 C, 15N-EGFの標識率の算出
実施例 2で培養した未標識 EGF、 15N-EGFおよび 13C, 15N-EGFの培養上清を HPLC力 ラム (Vydac, C18, 径 4.6讓 x 長さ 250議)、 バッファ一0.1% TFAヽ 0.1% TFA /90% ァセトニトリルを用いて分離精製し、 Q-T0F (マイクロマス社) にて分子 量を測定した結果を図 3に示す。 また、 培地中の炭素源および窒素源としてのグ ルコース、 塩ィ匕アンモニゥム濃度と添カ卩した前培養液の量と標識率について表 1 にまとめた。
m . グルコニス、 塩化アンモニゥム濃度と添加した前培養液の量と標識率 前培養液添加量 10%
炭素源 ·窒素源量 グ、ルコ-ス 20g/L ク、、ルコ-ス 60g/L
塩化アン ΐニゥム 5g/L(94mM) 塩化アン ゥム 30g/L
15N標識率 94.0% 98.4% 前培養液添加 J 2.5%
炭素源 ·窒素源量 ク、、ルコ-ス 0g/L ク、、ルコ-ス 60g/L
塩化アンモニゥム 17.5g/L 塩化アンモニゥム 30g/L
15N標識率 99.7% 99.6%
13C標識率 99.2% 98.8% グルコース濃度 40g/L、 塩化アンモニゥム濃度 17.5g/Lで、 前培養液添加量が 2. 5%の場合、使用した安定同位 票識ィ匕合物量は、 グルコースで 0.8g、塩化アンモ 二ゥムで 0.35gという少量で EGFの場合およそ 2mg (MTGの場合およそ 9mg)の安定同 位体標識夕ンパク質を分泌生産することができた。
質量分析の結果、 EGFの分子量は 6215.6であり、全培養液添加量 2.5%のときの 、 15N標識 EGFの分子量は 6288.0N 13C, 15N標識 EGFの分子量は 6553.7であった。 15 N標識率および13 C, 15N標識率が 100%の時の分子量がそれぞれ 6288.5と 6556.5で あることから、 15N標識率、 13C標識率ともに 99%以上の標識率が達成されたことが 示される。
以上の結果、 窒素源として塩化アンモニゥム、 炭素源としてグルコースのみを いずれも少量利用するだけで、標識率の極めて高い15 N標識蛋白質および13 C, 15N標 識蛋白質を調製できることが示された。 実施例 4 . 2H標識 EGFの分泌生産
参考例 3で作成した EGF 遺伝子を含むプラスミドを導入した Corynebacterium glutajnicum YDK010形質転換体のカナマイシン耐性株を利用し、 2H安定同位体標
識蛋白質を調製することとした。実施例 1に示した本培養用の培地成分のうち、 D , L-メチォニンを除いたものを¾0で調製し、 ¾0中にて菌体が生育するか確認す ることにした。 なお、 ¾0 については、 標識率が 98%のものを使用した。 EGF産 生菌株について実施例 1と同様な前培養を行ったのち、 20mlの2 ¾0で作成した本 培養液に、 2mlの前培養液を添加して、 30°C、 24時間培養を行った。
その結果、 吸光度 (0D562 nm) は 38.4 ( 100倍希釈して測定) となり、 十分成育 した。 さらに、 4 8時間培養し、 その上清を参考例 3に記載したように、 SDS— P AGEにて EGFの発現を確認した。 続いて、 実施例 3と同じ HPLCで精製を行い、 質量 分析測定を実施して、 安定同位体標識率を算出した。 その結果、 分子量が 6489. 5 であり、 標識率 91 %と非常に高 、ことが明らかとなった。 実施例 5 . 標識 MTGの分泌生産
参考例 4で作成した MTG遺伝子を含むプラスミドを導入した Corynebacteri議 glutamicumYDKOlO形質転換体のカナマイシン耐性およびクロラムフエニコ一ル耐 性株を利用し、安定同位 票識蛋白質を調製することとした。実施例 1と同様に C M2G液体培地を作成し 16時間、 前培養を行った。 15N標識-塩化アンモニゥム (CIL) 、 15N標識- L-メチォニン(Berlin chemie )については、 標識率がそれぞれ 99%、 95% のものを使用し、 実施例 2と同様の実験を行った。 実施例 6 . 15N標識 EGFおよび MTGの NMR測定
実施例 2および実施例 5で作成した培養上清 20 mlを分子量 3500 (EGFの場合) または分子量 6, 000 (MTGの場合)のポアサイズをもつ透析膜に注入し、 20mM リン 酸バッファ—、 pH6への透析を繰り返すことによって分子量 3500または 6,000以下 の低分子を取り除いた。 その後、 セントリブレップ (ミリポア) を用いて約 10倍 にまで濃縮し、 NMRロックのために 5 2H20を添加したものを NMR試料とした。
NMR測定には 3重核トリプルグラジェントプローブが装備された Bruker DMX600 NMR装置を用いた。 MTGと EGFの測定温度はそれぞれ 35°Cと 30°Cとし、得られたデー 夕については、 XWINNMR (Bruker)によってフーリエ変換を行った。 HSQCスぺクト
ルについては、 3- 9-19パルスを用いた WATERGATEシークェンス [J. Magn. Reson. Ser. A, 102, 241-245. (1993)]を組み込み、水シグナルの消去を行った。 Έのス ぺクトル幅を 10, 000 Hz、 15Nのスぺクトル幅を 2, 400 Hzとし、 t2方向に 1, 024、 tl 方向に 256ボイント取り込んだ。
EGFと MTGについて得られた結果を図 4 aと図 4 bに示す。図 4 aおよび図 4わから 分かるように、 15N標識-塩ィ匕アンモニゥムが取り込まれたことにより、 -1 由来 のシグナルが多数観測された。 また、.精製せずとも EGFや MTG由来のシグナルがー 部観測できた。
さらに実施例 5と同様の手順にて MTG産生菌株を 20 ml培養し、 CMセファロ一 スにより 15N標識 MTGを精製した。 20mM リン酸バッファ一、 pH6へ透析を繰り返 したのち、 セントリブレップ (ミリポア) を用いて 700 〃1にまで濃縮し、 NMR 口ックのために 5% 2¾0を添加したものを NMR試料とした。得られた HSQCスぺク トルを図 5 aに示す。また、 大腸菌によって15 N標識させた MTGについても同様な スぺクトルを測定した (図 5b)。両者のスぺクトルはほぼ等しく、 コリネホルム 細菌によって NMR解析可能な試料を調製できることが示された。
本発明により、 安定同位体標識タンパク質を安価に、 かつ簡便に生産するため の手段が提供される。 すなわち、 本発明により、 高濃度の標識化合物を含む培地 において、 コリネ型細菌およびバチルス ·ブレビスを高密度に培養することによ り、 目的タンパク質を多量に産生させ、 かつ効率よく菌体外に分泌させることに より、 高い標識率の安定同位 票識タンパク質を活性型の状態で得ることができ 。
特にコリネ型細菌は、 異種タンパク質の分泌に好適とされるカビ、 酵母ゃバチ ルス属細菌と比べて、 天然にはきわめてわずかにしか夕ンパク質を菌体外に分泌 していないため、 本発明により分泌生産された安定同位体標識タンパク質の精製 過程を簡 匕および/または省 ^匕でき、 そのまま NMRなどの構造解析に用いる
ことができる。 更に、 タンパク質分解酵素の菌体外分泌が極めて少ないため、 分 泌された安定同位 票識タンパク質はコリネ型細菌自身のタンパク質分解酵素に よる分解を受けにくく、 効率よく安定同位体標識タンパク質を培養液中に蓄積さ せることができる。 また、 コリネ型細菌およびバチルス属細菌は糖、 アンモニア や無機塩等を成分とする安価な完全合成培地において培養可能であり、 従ってグ ルコースやアンモニゥム塩等の安価な標識化合物のみで、 標識率の高い夕ンパク 質を生産することができる。 さらには、 培養液中に培地由来のタンパク質も少な く、 精製が更に容易になる。 また、 コリネ型細菌およびバチルス属細菌は、 高濃 度の糖、 アンモニゥム塩濃度の培地で培養することが可能であり、 従って培地中 の安定同位体元素濃度が高くなることから、 標識率の高い安定同位体を製造する ことが可能となる。 さらには、 高密度培養が可能であることから、 少量の培地で 標識率の高い安定同位体標識タンパク質を大量に製造することが可能であり、 従 つてこれらを安価に製造することができる。
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