JP2019505786A - インシュリン類似体のためのバイオ分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
タンパク質を基礎とした生物学的薬物に関して、タンパク質の機能を解明するために、またはタンパク質の試験およびスクリーニングのために、またはタンパク質の全身曝露を測定するために、タンパク質(血漿、血清、または他のいずれかの体液中に含有されるインシュリン等)を検出し、定量的にそれらを測定することが、必要である。それゆえ、高感度でインシュリン量を定量するためのより一般的な方法が確立される場合、前臨床試験の間または臨床試験において、薬物動力学を推定することが、可能になる。従つて、ヒトにおける薬物動力学を薬物開発の初期に推定することが、可能となる。
本発明の目的は、0.20ng/ml〜50.0ng/mlの濃度範囲での、ヒト血漿中のインシュリンまたはインシュリン類似体IN−105の検出および定量化のための、感度が高い分析方法を提供することである。
本方法は、窒素、すなわち15Nの安定同位体による、インシュリンまたはインシュリン類似体の標識化を含む。標識化は、増殖および発酵培地中の標識化窒素を提供することによって、窒素(15N)の安定同位体によって達成される。該細胞は、それゆえ、インシュリンまたはインシュリン類似体のほとんどすべての窒素原子が、安定同位体15Nにより置換される標識化培地において、増殖される。本方法のために使用される標識化窒素源は、硫酸アンモニウム[(15NH4)2SO4]である。
本発明は、タンデムマススペクトロメトリー検出法を伴う液体クロマトグラフィーを使用するインシュリンまたはインシュリン類似体の検出のためのバイオ分析方法に関する。
特に、本発明は、生体マトリックス中のIN−105の定量化のための、高度に特異的な方法に関する。
態様の1つにおいて、生体マトリックスは、全血、血清、血漿、尿、発酵ブロス、または緩衝液である。
該プロセスのスキームは、図1中に描かれている。
該方法の高度な特異性により、IN−105は、あらゆるヒトインシュリンまたは共に投与されたインシュリン様のインシュリンGlargineの存在のもとで、選択的に定量されることができる。T1D(1型糖尿病)を伴う患者への10mg投与から得られた薬動力学的プロフィールから実証されるように、これは、該方法を、経口投与の後のIN−105の薬動力学的曝露を決定することにおいてきわめて有用にする。
本方法は、ヒト血漿中のインシュリンまたはインシュリン類似体の決定に関する。
好ましくは、本方法は、0.200ng/mL〜50.0ng/mLの濃度範囲にわたる、インシュリンまたはインシュリン類似体を決定するために用いる。
接種菌フラスコ:標識化のための手順は、表1に示されるのと同様に設計されて、培地を含有する接種菌フラスコの細胞株の播種(直接または種フラスコを通して)で始まる。
2.オートクレーブ処理の後、3つの成分は、2000mLのフラスコ中で混合し、1つの培養バイアルで接種した。
3.フラスコは、30℃±1℃で24±2時間、培養のための振盪機インキュベーターに保った。
OD(光学密度)が所望のレベル(10)に達したとき、接種菌フラスコからの接種菌を、発酵のために更に移した。発酵には、バッチ相およびメタノールがフィードされたバッチが関与した。
表2−4中に記載された発酵培地の組成。
ビオチン(0.2g/L)は、使用の前に、飲料水に溶解し、0.2μでフィルター滅菌した。
手順:
1.発酵培地を、次に、121℃で60分間、オートクレーブ処理した。
2.発酵は、30℃、350 rpmでスタートした。
3.発酵槽を接続した後に、pHを、20%w/w NaOH(水酸化ナトリウム)溶液で4.9に調整した。
4.無菌の微量塩液とビオチンを、加えた(それぞれ4.35ml/L)。
微量塩を加えるとすぐに、DOは下がった。
5.メタノール1リットル当たり、12.0mLの微量塩液、12mLのD−ビオチン溶液、および2.5gmの20%H2SO4(w/w)を加える。
メタノールは、発酵槽にフィードする前に、0.2μでフィルター滅菌する。
6.6.一旦接種菌フラスコ中ODが10−15まで達すると、250mlの接種菌を加えた。
7.7.RPMを、7〜8段階でで350から800に増やした。
バッチ相発酵のパラメータは、
1.pH:5.0±0.2
2.温度:30±2℃
3.溶存酸素(DO):30%
DOは、最初、手動でRPMを増加させることによって維持した。DOが40%まで達したとき、RPMは、200に、1工程で最大まで増やした。
一旦RPM(RPM)が最大まで達すると、DO(溶存酸素)は、最小10%および最大30%から開始し、ガス混合物のカスケードに置かれ、次に要求に応じて増やした。
DOが急上昇し始めそしてpHが上昇し始めたとき、試料を取り、および湿潤細胞重量のための分析を行った。次に、pHは、設定値6.0に変化させ、温度は、23℃に調整した。
バッチ相が終わったとき、1時間後に、メタノール相をスタートさせた。
メタノールがフィードされたバッチの発酵(メタノール誘導相)のパラメーターは、
1.pH:6.0±0.2
2.温度:23±2℃
一旦、DOが、バッチ相において上昇すると、メタノール添加を、スタートした。
(表4を参照)。
メタノールの流速は、天秤(0.8密度ファクター)を使用することにより、周期的にチェックした。
天秤読み取りは、連続的に記録した。
発酵は、表5で述べたとおり、メタノール誘導相の間、メタノール蓄積に関して周期的にチェックした(1−5分)。
発酵の後、最終的なブロスのpHは、オルトリン酸でpH 2.5に調整し、続く遠心分離によって無細胞上清を得て、それをさらに下流の精製プロセスに付し、無細胞上清からインシュリンまたはインシュリン類似体前駆体を単離し、それをメトキシ−トリエチレングリコール−プロピオニル−N−ε−B29組換え型インシュリンまたはインシュリン類似体前駆体に変換し、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼBで触媒した反応を、それを通して、インシュリンまたはインシュリンに類似体に変換する。IN−105前駆体の変換のプロセスのスキームは、図3において描かれる。
ストック溶液、較正標準、および試料の調製
コントロール血漿:
正常で健康なボランティア(NHV)からのコントロールヒト血漿(K2EDTA)が、得られた。
1型(T1DM)または2型(T2DM)糖尿病のいずれかと診断された患者からのコントロールヒト血漿(K2EDTAまたはK3EDTA)も、得られた。
1型および2型糖尿病を有する患者からの血漿は、外部の供給者から調達し、Di−カリウムEDTA(K2EDTA)またはTri−カリウムEDTA(K3EDTA)も、入手できた。
高脂血症血漿は、コントロールヒト血漿(K2EDTA)に、1:9の比率でのイントラリピッドの添加によって調製し、該方法への高脂血症の影響を評価するために使用した。
溶血した(血漿中に2%の全血)血漿も、得られた。
外部の供給者または社内ボランティアから得られたすべての血漿は、使用の前に−20℃で保存し、全血は、4℃で保存した。
2つの別々のストック溶液は、2mgのIN−105を溶解し、メタノール:水を30:70v/vの比率で含有する2%酢酸1mL中に溶解することによって、調製した。
従つて、2000μg/mLのストック溶液を、調製した。
1つは「較正ストック」と名付け、その他は、「品質管理ストック」と名付けた。ストック溶液は、−20℃で40日間保存した。
品質管理(QC)試料は、0.2(LLOQ QC)、0.6(LoQC)、20(MeQC)、40(HiQC)、および50(ULOQ QC)の最終的な濃度を有するやり方で、表6に従って調製した。これらのQC試料は、−20℃および−80℃で73日間保存し、バリデーション目的のためだけに、使用した。
種々の標準を、分析標準、内部標準、共投与した標準および較正標準を含むバリデーション検討のために、調製した。
●分析標準:96.3%の純度の標準、IN−105は、その既知の安定期間の間で使用した。
●内部標準:内部標準のストック溶液は、その既知の安定期間において使用し、構成溶液と同じやり方で15N標識化IN−105を使用して調製した。内部標準溶液の最終的な濃度は、96.1%の純度で100ng/mLであった。
●較正標準:較正標準は、「較正ストック溶液」から新たに調製した。較正標準は、適切な体積の較正ストックを使用し、それをK2EDTAまたはK3EDTAを含有している正常で健康なボランティアからの血漿で希釈して調製した。較正標準は、大量に調製し、最高244日まで−200℃または−800℃で保存し、そして、ヒト血漿中でIN−105の既知の安定性の範囲内で使用することができる。表7は、手順およびその調製のために使用した較正標準を詳述する。
試料は、96ウェル形成のオフライン固相抽出(SPE)、続くオンラインSPEによって、生体マトリックス中の標識化インシュリンまたはインシュリン類似体を使用して、得られた。
試料採取は、毎日(24時間ごと)を基本として、無菌性、湿潤細胞重量(WCW)、力価、pH、および伝導率について行った。
品質管理試料は、分析日に、MeCN:H2O、50:50中のTFA(0.1%)の品質管理使用液中で新たに調製した。
1つの態様において、全血中のIN−105の安定性評価については、IN−105は、LoQCおよびHiQCの濃度で、全血試料においてスパイクされた。該試料は、室温かつ氷上で、再等分し、保存した。全血の一定分量を、最高2時間までとった。試料は、20℃、4000rpmで10分間、遠心分離によって、分析のために処理した。分離血漿は、収集し、分析時間まで−80℃で保存した。
表(8)(容認判定基準を、名目上スパイクされた濃度の±15%の範囲内に回復した濃度として定義した)に従って、保存(保存安定性)上の試料安定性の評価を、実行した。すべての標準は、その安定期間の範囲内で使用した。
固相抽出は、ウォーターズOasis Max(10mg)SPEプレートを使用して実行した。試料を、オフラインSPE続いて抽出オンラインSPEを使用して、調製した。標識化インシュリンが得られた際、較正標準および品質管理標準を調製した。
各バリデーションの実行の前に、システム適合性試料を、分析した。これらの試料は、典型的には、LLOQ、ULOQでの試料、および2つのブランクマトリックス試料から成り、これにより、クロマトグラフィー、感度、およびキャリーオーバーの品質の定量評価を可能にする;ただしULOQ試料の後で1つのみのマトリックスブランク試料を注入した分析実行1〜7を除く(表7で述べたとおり)。これは、分析方法からの逸脱であったが、観察したいかなるキャリーオーバーも、分析実行に影響を与えたとは考えなかった。
SPEカートリッジを、メタノール(300μL)によって調節して、300μLの水によって平衡化した。試料を、プレートに載せ、十分な混合を確実にするために、それらを吸引および吐出させた。該プレートは、MeCN:水(1:10:90v/v/v)中1Mの酢酸アンモニウム500μLによって洗浄し、続いてMeCN:水(1:50:50v/v/v)中1Mの酢酸アンモニウム500μLによって洗浄した。充填材料は、最大圧力を使用して乾燥させた。0.1%のトリトンX−100を、新たな1mLウェルプレートへ加えた。該試料は、トリトンX−100を含有しているプレートに、MeCN:水(50:50のv/v)中の2%ギ酸250μLによって溶出させた。
これらの溶出液のそれぞれに、水中の0.1%TFA300μLを、加え、吸引および吐出により混合した。試料は、蓋をして、分析に供した。
クロマトグラフィーの条件:
移動相Aは、アセトニトリル:水(10:90v/v)中の0.02%TFAであった;移動相Bは、アセトニトリル:水(90:10v/v)中の0.02%TFAであった;移動相Aの初期濃度は、30秒まで85%であり、30秒から4分30秒まで85%から60%に直線的に変化し、次の10秒間にわたって移動相Aは、10%に変化し、そして5分30秒まで10%にとどまった。平衡化のために、次の10秒間にわたって、移動相Aは、85%に戻るように変化した。実行時間は、6分30秒で完了した。溶出の温度は、50℃に維持した。溶出は、0.5mL/分の流速を使用して実行した。注入体積は、500μLであった。試料は、シークエンスの間、10℃に維持した。洗浄溶媒1は、アセトニトリル:水(10:90v/v)中の0.01%TFAであり、洗浄溶媒2は、メタノール:水:トリトン−X100(70:30:0.05v/v/v)中の0.01%TFAであり、洗浄溶媒3は、メタノール:水(80:20v/v)中のアンモニア(28%の0.5%)であった。
カートリッジを、メタノール500μLを使用して、5mL/分の流速で調節した。オンラインカートリッジは、MeCN:水(10:90v/v)中の(0.1%TFA)500μLによって平衡化した。バックフラッシュ洗浄は、2ml/分の流速で、MeCN:水(10:90v/v)中の(0.1%のTFA)1mLを使用して与えた。それに続いてカートリッジは、5ml/分の流速で、MeCN:水(20:80v/v)中の(0.1%TFA)1mLを使用して洗浄した。クランプフラッシュ1は、5mL/分の流速で、MeCN:水(10:90v/v)中の(0.1%のTFA)500μLを使用して実行し、クランプフラッシュ2は、5ml/分の流速で、MeCN:水(90:10v/v)中の(0.1%のTFA)を使用して実行し、クランプフラッシュ3は、5ml/分の流速で、MeCN:水(10:90v/v)中の(0.1%のTFA)500μLを使用して実行した。
IN−105に関して、親イオンとして1506.9m/zの四電荷状態を単離し、その1820m/zの娘イオンへの移行をモニターした。15N標識化IN−105に関して、1520m/zを単離し、その1838.5m/zの娘イオンへの移行を、定量化のためにモニターした。分子量および移行に伴うヒトインシュリンの電荷状態は、MRMモードにおいてモニターし、そして、表10において、以下の通りに要約した。
バリデーションの検討は、直線性、正確さおよび精密さ、選択性および特異性、反復性および再現性を含んだ。バリデーションは、実行内の精度およびバイアス、実行間の精度およびバイアス、希釈の妥当性、イオン化修飾に関連したマトリックス、自動注入装置のキャリーオーバー、室温および氷上の全血の安定性、5サイクル以上の血漿の凍結解凍安定性、血漿の24hの室温安定性、−20および−80℃での73日間の血漿における凍結安定性、10℃での回収、および10℃での抽出物安定性からなった。
以下の表11は、バリデーション検討のパラメーターを詳述する。
徹底的なチェックを、種々の条件で、血漿の安定性に関して遂行した。
*ただし、分析方法に対して行った改変の妥当性を決定する検討設計の一部では、改変された分析方法を使用して調べたわけではない
該方法は、個人間の多様性、脂肪血症、および溶血によって、または、Glargineの存在によって影響を受けなかった。該観察により、方法が十分に正確で精密であり、調査した範囲にわたってヒト血漿試料中のインシュリンの決定を可能にする充分な選択性および信頼性を有すると推察される。
標識化インシュリンは、−20℃で最高40日間まで保存した場合、および、室温で最高24時間まで保存した場合、メタノール:水(30:70のv/v)中の酢酸(2%)中で安定であった。
血液試料は、K2−EDTAを含有しているチューブ中に収集した。15N標識化IN−105は、内部標品(ISTD)として使用し、血清または血漿の分離の後、チューブに加えた。ISTDスパイク試料は、96ウェルフォーマットにおける混在モード陰イオン交換−逆相固相抽出プロセスに付した。混在モードSPEからの溶出液は、96ウェルフォーマットにおいてセットアップした逆相(C8)SPEに移す。このRP SPEは、分析逆相HPLCシステムを伴うセットアップオンラインであった。
RP SPEから溶出液は、C18分析クロマトグラフィーカラムにオンラインで移し、逆相HPLCに付した。
該イオンは、狭い範囲のm/z値を有するイオンが選択される第1の4重極子の中へと通る。この狭いm/z範囲内のイオンは、第2の4重極子へと通りぬけることを許容される。
第3の4重極子を通ることが許容された断片だけを、次にイオン電流として検出する。
IN−105およびISTDのピークに関する抽出したイオンクロマトグラム(XIC)は、両方とも統合するとわかった。統合した領域のISTDに対するIN−105の比率は、試料中に存在するIN−105の基準として使用した。
それが、バリデーションプロトコールのすべての所定の判定基準に合格したので、該方法は、首尾よく検証されたと考えた。検証した方法は、その後1型糖尿病を伴う患者において実行した正常血糖クランプ検討におけるIN−105レベルの測定のために、使用した。ヒト血漿中のIN−105の決定のための方法は、0.200ng/ml〜50.0ng/mLの濃度範囲を通じて首尾よく検証されていた。
各患者および処置に関する血漿濃度データは、非コンパートメント法によって分析した。AUC0−tのための血漿レベル曲線の下の領域は、台形公式によって算出した。主要な薬動力学的パラメーター(平均値±SD)は、Cmax、AUClast、Tmaxであり、PDパラメーターは、Tmin、Cmin、AUClastであった。幾何平均の比率および90%CIは、PKおよびPDパラメーターに関して、シークエンス、期間、および処置のための固定した効果を伴う混合効果モデル、そして、ログ変換CmaxおよびAUCのためのランダムな効果としてのシークエンスの範囲内の患者から算出した。IN−105の最大血漿濃度ならびにPK曲線下の領域は、用いた用量と有意に(p<0.05)線形に相関している(下記の表16のとおり)。
ボランティアにおけるIN−105錠剤の投与後に得られた、IN−105の平均血漿中濃度時間プロフィールを、図13〜14において示した。
**AUClastに関する面積単位およびCmaxに関する濃度単位
投与後の時間の関数としての平均血漿濃度のプロットは、血漿中の薬物濃度の予想した時間プロフィールを示す。30mg/kg用量に関するプロットは、図15において示し、ここで、明確に定義したピーク濃度およびその後のクリアランスは、明らかである。
Claims (19)
- 生体マトリックス中のインシュリンまたはインシュリン類似体の定量化および検出のための方法であって、以下の工程:
i.安定同位体によって既知の量のインシュリンまたはインシュリン類似体を標識し、標識化インシュリンまたはインシュリン類似体を形成すること;
ii.生体マトリックスに標識化インシュリンまたはインシュリン類似体を導入すること;
および
iii.液相クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー(LC−MS/MS)によってインタクトなインシュリンまたはインシュリン類似体に関して生体マトリックスを分析すること
を含む、前記方法。 - 標識化インシュリン類似体が、IN−105であり、以下の構造を有する、請求項1に記載の方法。
- 安定同位体によって既知の量のインシュリンまたはインシュリン類似体を標識し、標識化インシュリンまたはインシュリン類似体を形成する工程が、発酵プロセスの間にプロインシュリンまたはプロインシュリン類似体の発現をコードする遺伝子を担持するPichia pastorisの組換え株を含む培養培地を含む、請求項1に記載の方法。
- 同位体が、窒素(15N)、硫黄(34S)、酸素(18O)、水素(2H)、および炭素(13C)のうちの少なくとも1つである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 培養培地中の同位体窒素(15N)源が、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、メチルアミン、および尿素の少なくとも一つである、請求項4に記載の方法。
- 培養培地中の同位体炭素(13C)源が、メタノール、グリセロール、グルコース、およびソルビトールの少なくとも1つである、請求項4に記載の方法。
- 培養培地中の同位体硫黄(34S)源が、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸カリウムの少なくとも1つである、請求項4に記載の方法。
- 発酵プロセスが、二相であり、第1の相が、炭素源としてグリセロールを含むことにより細胞量を増加させるためのバッチ相、および、標識化インシュリンまたはインシュリン類似体の前駆体の分泌を誘発するためのメタノール、および発現される標識化インシュリンまたはインシュリン類似体中への封入のための同位体ソースを使用するフィードされたバッチ相である、請求項3に記載の方法。
- 標識化インシュリンまたはインシュリン類似体の前駆体を、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼBによって処置して、標識化インシュリンまたはインシュリン類似体を形成する、請求項8に記載の方法。
- 生体マトリックスが、全血、血清、血漿、尿、発酵ブロス、または緩衝液である、請求項1に記載の方法。
- 生体マトリックスが、ジカリウムまたはトリカリウムEDTAと結合される、請求項1に記載の方法。
- 生体マトリックスが、−20℃または−80℃で保存されるか、または、サイクルごとに新たに調製される、請求項1に記載の方法。
- 保存期間が、1日から250日間までであった、請求項12に記載の方法。
- 工程(ii)が、オフライン固相抽出(SPE)を使用する試料処理、続く96ウェル形成におけるオンラインSPEをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 標識化インシュリンまたはインシュリン類似体が、外部から送達されたインシュリン類似体を内因性のインシュリンから見分けるために使用される、請求項1に記載の方法。
- 生体マトリックス中で、0.200ng/mLから50ng/mLまでの範囲の同位体標識化インシュリンまたはインシュリン類似体の濃度を決定する、請求項15に記載の方法。
- インシュリンまたはインシュリン類似体の少なくとも1つの追加のタイプを含む生体マトリックス中のIN−105インシュリンの安定性を決定するための方法であって、以下:
i)窒素の安定同位体によって既知の量のIN−105を標識して、標識化IN−105を形成すること;
ii)標識化IN−105を、少なくとも1つの追加のインシュリンまたはインシュリン類似体を備える生体マトリックスに導入すること;
iii)工程ii)から得られた溶液を、オフライン固相抽出(SPE)、続いて96オンラインSPEウェル形成を使用する、混在モード陰イオン交換逆相固相抽出プロセスに付すこと;
iv)インタクトな標識化IN−105を、液相クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー(LC−MS/MS)によって、インシュリンまたはインシュリン類似体の少なくとも1つの追加のタイプのそれと比較して分析すること
を含む、前記方法。 - 標識化IN−105が、室温で24時間安定であった、請求項17に記載の方法。
- IN−105が、以下の構造を有する、請求項17に記載の方法。
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