WO2003106668A1

WO2003106668A1 - グルコース脱水素酵素

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Publication number: WO2003106668A1
Application number: PCT/JP2003/007542
Authority: WO
Inventors: 早出　広司
Original assignee: Sode Koji
Priority date: 2002-06-13
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2003-12-24
Also published as: JPWO2003106668A1; AU2003242384A1; DE60319842T2; EP1535996A4; US20060073580A1; EP1535996B1; ATE389713T1; EP1535996A1; DE60319842D1; US7244581B2

Abstract

ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、Acinetobacter calcoaceticus由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの３４９番目から３７７番目の残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ阻害定数（Ｋｓｉ）が２００ｍＭ以上であるグルコース脱水素酵素が提供される。本発明の改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨは、グルコースによる基質阻害が小さいため、高濃度のグルコースの存在下におけるグルコースの測定に有用である。

Description

グルコース脱水素酵素技術分野

本発明はピロ口キノリンキノン（PQQ) を補酵素とするグルコース脱水素酵素（GDH) の特定のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素に関する。本発明の改変型酵素は、臨床検査や食品分析などにおけるダルコースの定量に有用である。背景技術 '

血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上極めて重要な指標である。また、微生物を用いる発酵生産におけるグルコース濃度の定量がプロセスモニタリングにおいて重要な項目となっている。従来、グルコースはグルコー bスォキシダーゼ（GOD) あるいはグルコース 6リン酸脱水素酵素（G 6 PDH) を用いる酵素法により定量されていた。最近、新たな酵素としてピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（PQQGDH) の応用が注目されている。 PQQGDHはグルコースに対して高い酸化活性を有していること、および PQQGDHは補酵素結合型の酵素であるため電子受容体として酸素を必要としないことから、グルコースセンサーの認識素子をはじめとして、アツセィ分野への応用が期待されている。

PQQGDHは、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコースを酸ィ匕してダルコノラタトンを生成する反応を触媒する。 P QQGDHには、膜結合性酵素と水溶性酵素があることが知られている。膜結合十生 P QQGDHは、分子量約 87 k D aのシングルぺプチド蛋白質であり、種々のグラム陰性菌において広く見いだされている。一方、水溶性 PQQGDHは A c i n e t o b a c t e r c a 丄 c o a c e t i c u sのレヽくつ力の ¾におレ、てその存在が確認されており（B i o s c i . B i o t e c h. B i o c h em.

(1995) ， 59 (8) , 1548— 1555) 、その構造遺伝子がクロー二ングされアミノ酸配列が明らかにされている（Mo l . Ge n. Ge n e t. (1989) , 21 7 : 430— 436) 。 A. c a l c o a c e t i c u s由来水溶性 PQQGDHは、分子量約 50 kD aのサブュニット 2つからなるホモダイマーを形成する水溶性酵素であり、活性を示すために P QQと C a ^{2 +}を必要とし、 2200U/mg〜740 OU/mgという高い酵素活性を示す。等電点が、 PQQと結合していないアポ酵素で約 9. 2、ホロ酵素で約 10. 2である塩基性蛋白質であることなどが知られている（K. Ma t s u s h i t a, e t a 1. (1995) B i o s c i . B i o t e c h. B i o c h em. , 59, 1548— 1555) 。また、水溶性 P Q Q GDHの X線構造解析の結果が発表されており（A. O u b r i e , e t a 1. (1999) J. Mo 1. B i o. , 289, 319- 333、 A. Oub r i e, e t a 1. (199 9) Th e EMBO J o u r n a l , 18 (1 9) , 51 87- 51 94および A. Ou b r i e, e t a 1. (1999) , PNAS 96 (21) , 1 1 787-1 1 791) 、水溶性 P QQGDHの立体構造や P QQおよび C a ^{2 +}の推定存在位置などが明らかにされている。

野生型水溶性 P QQGDHでは、グルコース濃度が 100 mM以上のとき基質阻害による活性の低下が顕著に見られる。このため、高濃度の基質の存在下では、定量的な基質濃度の測定を行うことが困難である。現在のところ、この基質阻害のメカニズムは明らかにされていない。

したがって、本発明は、基質阻害による酵素活性の低下が少ない改変型水溶性 PQQGDHを提供することを目的とする。発明の開示

本発明者は従来の水溶性 P QQ GDHを改良して高濃度のグルコースの存在下においてもダルコースの定量を可能とする改変型 P Q Q G D Hを開発すベく鋭意研究を行なった結果、水溶性 P QQGDHの特定の領域においてァミノ酸変異を導入することにより、グノレコースによる基質阻害の少ない酵素を得ることに成功した。

すなわち、本発明は、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P QQGDHの 349 番目から 3 7 7番目の残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ阻害定数 (K s i ) が 2 0 0 mM以上であるグルコース脱水素酵素を提供する。

本明細書において用いる場合、阻害定数 (K s i ) とは、観察される最大酵素活性の二分の一の活性を与える基質濃度のうち、高濃度側の基質濃度を意味する。阻害定数とは、酵素活性において基質阻害が観察されるときにおいて、次式で定義される酵素固有の定数を意味する：

v=Vmax/ [l+(Km/S) + (S/K， si) ]

[ただし、 v は反応速度、 Vmax は最大反応速度、 Km はミノ、エリス · メンテン定数、 Sは基質濃度、 K' siは阻害定数の理論値を表す] 。 K' siが大きいほど、基質阻害が見られる基質濃度が大きくなり、基質阻害が緩和される。夾雑物を含む系で K' si を正確に測定することは困難であるため、本明細書においては、実測可能な値として上述した K s iを用いる。

特定の理論に拘束されるものではないが、 A. O u b r i eらが明らかにした P Q Q G D Hの立体構造に基づくトポロジーの予測にしたがえば、 3 4 9番目力、ら 3 7 7番目のアミノ酸の領域は 4 D 5 Aループを形成する領域に該当するため、この領域が基質であるグルコースとの相互作用に関与してレ、ると考えられる。本明細書においてアミノ酸残基または領域に関して用いる場合、「相当する」との用語は、構造上類似するが同一ではない 2以上の蛋白質において、あるアミノ酸残基または領域が等価の機能を有することを表す。例えば、 Acinetobacter calcoaceticus 以外の生物に由来する水溶性 P Q Q G D Hにおいて、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P Q Q G D Hの 3 4 9番目から 3 7 7 番目の残基の領域とアミノ酸配列類似性の高い領域が存在し、かつ蛋白質の二次構造から見て該領域がその蛋白質において同じ役割を果たしていると合理的に考えられる場合、該領域は「Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P Q Q G D Hの 3 4 9番目から 3 7 7番目の残基の領域に相当する」と言われる。さらに、該領域の第 1 7番目のアミノ酸残基は「Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P Q Q G D Hの 3 6 5番目の残基に相当する」と言われる。なお、本明細書においては、アミノ酸の位置は、開始メチォニンを 1として番号付けする。好ましくは、本発明のグルコース脱水素酵素は、配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 3 6 5番目のメチォニン、 3 6 6番目のトレオニン、 3 6 7番目のチロシン、 3 6 8番目のイソロイシン、 3 6 9番目のシスティンおよび 3 7 4番目のァラニンからなる群より選択されるァミノ酸残基が他のァミノ酸残基で置換されていることを特徴とする。

より好ましくは、本発明のグルコース脱水素酵素は、配列番号 1で表されるァミノ酸配列において、 Met365Trp、 Met365Phe、 Thr366Asn、 Thr366Ile、 Thr366Asp、 Thr366Lys、 Tyr367Asp、 Ile368Asn、 Cys369Argおよび Ala374Proからなる群より選択される変異を有する。

また別の態様においては、本発明の改変型 P Q Q GD Hは、上述の置換に加えて、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 6 7番目のァスパラギン酸残基が同時に他のァミノ酸残基で、特に好ましくはグルタミン酸残基で置換されている。 1 6 7番目のァスパラギン酸残基が P Q Q G D Hによる基質の認識および結合に関与することは、特開 2001-346587 に記載されている。し力し、一般的には、 4 D 5 Aループに存在するアミノ酸残基と、これらとは異なるドメインに存在するアミノ酸残基とに同時に変異を導入することにより、基質の選択性や酵素活性がどのように変化するかについては、全く予測することができない。したがって、本発明において、これらの変異を同時に導入することによりグルコースの選択性の向上と高い酵素活性の両方が得られたことは、驚くべき発見であった。

また別の観点においては、本発明は、

Cys Gly Glu Xaa Thr Tyr lie

(式中、 Xaaは Metまたは Trpである）；

Gly Glu Met Xaa Tyr lie Cys

(式中、 Xaaは Asp、 Lys、 lieまたは Asnである）；

Glu Met Thr Asp lie Cys Trp；

Met Thr Tyr Asp Cys Trp Pro；

Thr Tyr lie Arg Trp Pro Thr；および

Pro Thr Val Pro Pro Ser Ser

力なる群より選択される配列を含む、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素を提供する。

本発明はまた、上述の P Q Q G D Hをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび該遺伝子を含む形質転換体、およぴ本発明の P Q Q G D Hの製造方法、ならびに本発明の P Q Q G D Hを含むグルコースアツセィキットおよびダルコ一スセンサーを提供する。

本発明の P Q Q G D Hの酵素蛋白質はグルコースによる基質阻害が小さいため、高濃度のダルコースの存在下におけるダルコースの測定に有用である。図面の簡単な説明

図 1は、本発明において用いたプラスミド p GB 2の構造を示す。

図 2は、本発明の改変型酵素をコードする突然変異遺伝子を作成する方法を示す。

図 3は、本発明の改変型酵素 T y r 367As pの S Vプロットを示す。

図 4は、本発明の改変型酵素 C 7 3 369 1' _§の3 Vプロットを示す。発明の詳細な説明

改変型 P Q Q G D Hの製造方法

Ac i n e t o b a c t e r c a l c o a c e t i c u s由来の天然の水溶性 P QQGDHをコードする遺伝子の配列は配列番号 2で規定される。

本発明の改変型 PQQGDHをコードする遺伝子は、天然の水溶性 PQQGD Hをコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が、当該技術分野において知られており、例えば、 S amb r o o kら， " Mo l e c u l a r C l on i n g ; A La b o r a t o r y Ma nu a l ，第 2fe， 1 989, Co l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s, New Y o r kに記載されている。

このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例えば大月昜菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター ·宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。

本発明の改変型 PQQGDHにおいては、所望のグルコースデヒドロゲナーゼ活"生を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が当該技術分野において知られており、例えば、 Sambrook ら， Molecular Cloning; A Laboratory Manual ，第 2 片反， 1989， Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに載されている。

さらに、当業者は、他の細菌に由来する水溶性 PQQGDHについても、蛋白質の一 7火構造を並列して比較すること、あるいは当該酵素の一次構造をもとに予測された二次構造を比較することにより、 Acinetobacter calcoaceticus 由来の水溶性 PQQGDHの 349番目から 377番目の領域に相当する領域を容易に認識することができ、本発明にしたがって、この領域中のアミノ酸残基を他のァミノ酸残基で置換することにより、基質阻害の減少した改変型 P Q Q G D Hを得ることができる。これらの改変型 PQQGDHも本発明の範囲内である。

上述のようにして得られた、改変型 P Q Q GD Hを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破碎する力またはォスモティックショックによりペリブラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心分離し、 PQQGDHを含む水溶性画分を得ることができる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現した PQQ GDHを培養液中に分泌させることもできる。

次に、得られた水溶性画分を、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。精製は、蛋白質のクロマトグラフィー精製についての当該技術分野において一般に知られる教科書の記載にしたがって行うことができる。蛋白質の精製に用いることができる種々の陽ィオン交換ク口マトグラフィ一用カラムが当該技術分野において知られており、これらのいずれを用いてもよい。例えば、 CM— 5 P W、 CM— T o y o p e a r l 650M、 SP— 5 PW (以上、東ソー株式会社）、 S—セファロース、 Mo n o— S、 S— R e s o r c e (以上ファノレマシァ社）を用いることができる。カラムを適当なバッファーで平渙 Ϊィ匕し、試料を力ラムに負荷し、未吸着成分を洗い流す。バッファ一としては、例えばリン酸バッファー、 MOP Sバッファ一等を用いることができる。

次に、塩濃度のより高いバッファーを用いて、カラムに吸着された成分を溶出する。塩濃度は、塩濃度の異なる複数のバッファーを用いて、段階的に、直線勾配により、またはこれらの組み合わせにより変化させることができる。試料の溶出は吸光度測定などによりモニターし、適当な量ずつ分取する。各画分について酵素活性を測定して、所望の画分を回収することにより、本発明の改変型酵素を精製標品として得ることができる。

さらに、陽イオンクロマトグラフィーの前または後に、必要に応じて、濾過、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー等の、蛋白質の精製に関して当該技術分野において知られる他の手法による精製を行つてもよい。

酵素活性の測定方法

本発明の PQQGDHは、 PQQを補酵素として、ダルコースを酸化してダルコノラタトンを生成する反応を触媒する作用を有する。酵素活性の測定は、 PQ Q G D Hによるグルコースの酸化にともなつて還元される P Q Qの量を酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈色試薬としては、例えば、 PM S (フエナジンメトサルフェート）一 DC I P (2, 6ージクロロフエノールインドフエノール）、フェリシアン化カリウム、フエ口センなどを用いることができる。

基質阻害の評価方法

本発明の PQQGDHの基質阻害の程度は、阻害定数 (K s i) を用いて評価することができる。 Ks iは、種々の濃度のグルコースを基質として用いて、上述のように酵素活性を測定したとき、観察される最大酵素活性の二分の一の活性を与える基質濃度のうち、高濃度側の基質濃度として表される。

基質特異性の評価方法

本発明の PQQGDHのグルコースに対する選択性は、基質として、 2—デォキシー D—グノレコース、マンノースくァロース、 3— o—メチノレー D—グノレコース、ガラクトース、キシロース、ラクトースおよびマルトース等の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調べることにより評価することができる。

グノレコースアツセィキット

本発明はまた、本発明に従う改変型 PQQGDHを含むグルコースアツセィキットを特徴とする。本発明のグルコースアツセィキットは、本発明に従う改変型 PQQGDHを少なくとも 1回のアツセィに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型 PQQGDHに加えて、アツセィに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならぴに使用の指針を含む。本発明に従う改変型 PQQGDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型 PQQGDHはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。

グルコースセンサー

本発明はまた、本発明に従う改変型 PQQGDHを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定ィ匕方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフエ口センあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよレ、。好ましくは本発明の改変型 PQQGDHはホロ化した形態で電極上に固定化する力アポ酵素の形態で固定化し、 PQQを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、ダルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型 PQQ GDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してダルタルアルデヒドの遊離官能基をブロッキングする。

グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、 PQQおよび C a C 1₂、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フエナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型 PQ QGDHを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えば Ag/Ag C l電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキヤリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願 2003-71744ならびに 2002— 172 955号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によつて限定されることはない。実施例 1

改変型酵素 P Q Q G D H遺伝子の構築

配列番号 2に示される Acinetobacter calcoaceticus由来 P QQGDHの構造遺伝子をもとに、変異の導入を行った。プラスミド pGB2は、ベクター pT r c 99 A (フアルマシア社製）のマルチクローニング部位に、 Ac i n e t o b a c t e r c a l c o a c e t i c u s由来 P QQGDHをコードする構造遺伝子を揷入したものである（図 1) 。常法に従って部位特異的変異法により、天然の PQQGDHをコードする塩基配列をそれぞれ目的とする変異を有する P Q QGDHをコードする塩基配列に置換した。部位特異的変異はプラスミド pGB 2を用いて、図 2に示す方法により行った。変異に用いた合成オリゴヌクレオチドターゲットプライマーの配列を以下に示す。 2力所の変異を有する変異体を作成するためには、 2種類のオリゴヌクレオチドターゲットプライマーを同時に用いて上記と同様に変異を導入した。 Met365Trp 3' -GT TGA ACA CCT CTC CCA TGG ATG TAA AC- 5'

Met365Phe 3' -GT TGA ACA CCT CTC CCT TGG ATG TAA AC- 5'

Thr366Asn 3' -GGT TGA ACA CCT CTC TAC TTG ATG ΤΑΔ ACG AC- 5' Thr366lle 3' -GGT TGA ACA CCT CTC TAC TAG ATG TAA ACG AC- 5' Thr366Asp 3' -GA ACA CCT CTC TAC CTG ATG TAA ACG ACC G-5', Thr366Lys 3' -GA ACA CCT CTC TAC TTT ATG TAA ACG ACC G-5' Tyr367Asp 3' -GGT TGA ACA CCT CTC TAC TGG CTG TAA ACG ACC- 5' ェ le368Asn 3' -AC TGG ATG TTA ACG ACC GG-5'

Cys369Arg 3' -GG ATG TAA ACG ACC GGT TGT C-5'

Ala374Pro 3' -C GGT TGT CAA GGT GGC AGT AGA CG-5'

Aspl67Glu 3 ' -GGA AGT AGT TTT CTT GTA GTC AGT CC-5 ' ベクタープラスミド p K F l 8 k (宝酒造（株））に Acinetobacter calcoaceticus 由来 P Q Q GDHをコードする遺伝子の一部を含む Kpn I - Hind III断片を組み込み、これをテンプレートとした。このテンプレート 5 Ofmolと宝酒造（株）製 Mu t a n (登録商標） —Ex p r e s s Kmキットに付属のセレクションプライマー 5pmol、リン酸化したターゲットプライマー 5 O raol を全体 (20 μ 1 ) の 1/1 0量の同キットのァニーリングバッファーとともに混合し、 1 00°C、 3分間の熱処理でプラスミドを変性させ、 1本鎖にした。セレクシヨンプライマーは p KF 1 8 kのカナマイシン而性遺伝子上にある二重のアンバー変異を復帰させるためのものである。これを 5分間氷上に置き、プライマーをアニーリングさせた。これに 3 μ 1の同キットエクステンションバッファ一、 1 1の丁4 DNAリガーゼ、 1 1の丁4 DNAポリメラーゼおよび 5 IX 1の滅菌水を加えて相補鎖を合成した。これを DNAのミスマッチ修復能欠損株である E. coli BMH 71— 1 8mutS に形質転換し、ー晚振とう培養を行つてプラスミドを増幅させた。

次に、菌体から抽出したプラスミドを E. coli MV1 1 84に形質転換し、そのコロニーからプラスミドを抽出した。そしてこれらのプラスミドについてシークエンスを行い、目的とした変異の導入を確認した。この断片を、プラスミド p GB 2上の野生型 PQQGDHをコードする遺伝子の Kpn I- Hind III 断片と入れ替え、各変異を有する改変型 P Q Q G D Hの遺伝子を構築した。実施例 2

改変型酵素の調製

野生型または改変型 PQQGDHをコードする遺伝子を、 E. c o 1 i用の発現べクタ一である p T r c 99 A (フアルマシア社）のマルチクローニングサイトに揷入し、構築されたプラスミドを大腸菌 DH5ct株に形質転換した。これを 4 5 Om lの L培地（アンピシリン 50 μ g/m 1含有）で坂口フラスコを用いて 3 7。Cでー晚振とう培養し、 ImM C a C 1 ₂、 5 00 MP Q Qを含む 7 L の L培地に植菌した。培養開始後約 3時間でィソプロピルチオガラクトシドを終濃度 3 mMになるように添加し、その後 1. 5時間培養した。菌体を遠心分離（5, O O O X g, 1 0m i n， 4°C) で集菌した後、 0. 8 5 % N a C 1溶液で 2回洗浄した。この菌体を 1 OmMリン酸緩衝液 (pH7. 0) で懸濁し、フレンチ 'プレスで破砕（l l OMP a) した後、遠心分離（1 5， 000 X g， 1 5m i n， 4°C) を 2回行い、未破砕菌体を沈殿として除去した。この上清を超遠心分離（40， 000 r . p. m. , 90m i n, 4°C) し、その上清を水溶液画分として得た。これを Aバッファー（10mM MOP S— Na OH緩衝液 (pH7. 0) ) で 4 °Cにて一晩透析し、粗精製画分を得た。実施例 3

酵素活性の測定

酵素活性の測定は、室温で 1 0 mM MOP S _Na O H緩衝液（ p H 7. 0) 中において PMS (フエナジンメトサルフェート）一 DC I P (2, 6—ジクロ口フエノールインドフエノール）を用い、 DC I Pの 6 00 nmの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。このとき、 1分間に 1 μπιο 1の DC I Pが還元される酵素活性を 1ュニットとした。また、 D C I Pの p H 7. 0におけるモル吸光係数は 1 6. 3 mM一 ¹とした。実施例 4

基質阻害の評価

実施例 3で得られた野生型 PQQGDHおよび各改変型 P QQGD Hの粗精製酵素標品を用いて、実施例 5と同様にそれぞれ 1 iMP QQ, I mM C a C 1 ₂存在下で 1時間以上ホロ化した。これを 1 8 7 μ 1ずつ分注し、 3 μ 1の活性試薬（6mMD C I Ρ 48 μ 1 , 6 0 OmMPMS 8 μ I , 1 0mMリン酸緩衝液 p H7. 0 1 6 ^ 1 ) およぴ各濃度の D—グルコース溶液 1 0 μ 1を加え、実施例 4に示す方法により室温で酵素活性を測定した。基質濃度対酵素活性のプロットから、 Km、 Vma xおよび K s iを求めた。結果を表 1に示す。また、 Ty r 3 6 7A s pの S Vプロットおよび C y s 3 6 9 A r gの S Vプロットをそれぞれ図 3および図 4に示す。これらの結果から明らかなように、本発明の改変型 PQQGDHは野生型 PQQGDHと比較して高い K s i値を示し、基質阻害が有意に低下していた。表 1

実施例 5 実施例 2で得られた粗精製酵素を 10 mMリン酸緩衝液 pH7. 0で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラム TSKg e 1 CM-TOYO PEARL 650M (東ソ一株式会社）に吸着させた。このカラムを 10mM リン酸緩衝液 pH 7. 0、 75 Omlで洗浄した後、 0— 0. 2M Na C lを含む 10 mMリン酸緩衝液 pH7. 0を用い、酵素を溶出させた。流速は 5 m 1 /m i 11で行った。 GDH活性を有する画分を回収し、 10 mM MOPS—N a O H緩衝液（ p H 7 , 0 ) でー晚透析した。このようにして電気泳動的に均一な改変型 PQQGDH蛋白質を得た。得られた精製酵素標品について、 0. 6m Mの PMS存在下で、酵素活性および基質の阻害を測定した。結果を表 2に示す。本発明の改変型酵素 Thr366Asnおよび Thr366Aspは、高い K s i値を有するのみならず、野生型と匹敵するかまたはそれより高い酵素活性を示した。表 2

実施例 6 二重変異酵素 Aspl67Glu/Thr366Asn を製造し、その性質を調べた。 Aspl67Glu 変異を有する改変型酵素は、グルコースに対する基質特異性が高いことが知られている。実施例 5と同様にして基質阻害を調べたところ、 K s i =600 mM, Km= 26mMであり、したがって K s i /Km= 23であった。この値は実施例 5で測定した本発明の各改変型酵素と同等であり、野生型酵素より大きい。次に、この二重変異酵素の基質特異性を調べた。実施例 2で得られた野生型おょぴ各改変型 PQQGDHの粗精製酵素標品をそれぞれ 1 / MPQQ、 1 mM C a C 1₂存在下で 1時間以上ホロ化した。これを 187 μ 1ずつ分注し、 3 μ 1の電子受容体を含む活性試薬（6mM - DC I Ρ， 600 mM PMS, 10 mMリン酸緩衝液 p H 7. 0を含む）および基質を加えた（終濃度 0. 06 mM DC I P、 0. 6mM PMS) 。基質として、それぞれ終濃度 100 mMとなるように 40 OmMのグルコース、ラクトースおよびマルトースを 10 μ 1加え、室温で 30分間インキュベートして、実施例 3と同様に酵素活性を測定した。値はグルコースを基質としたときの活性を 100とし、これに対する相対活性で表した。結果を表 3に示す。 Thr366Asnと Aspl67Gluとの二重変異を有する改変型酵素は、野生型および Aspl67Glu単独の変異を有する改変型酵素と比較してダルコースに対する高い基質特異性を示した。なお、 Thr366Asn 単独の変異を有する改変型酵素は野生型と同等の基質特異性を有する (データ示さず) 。表 3

さらに、この二重変異酵素について、電子受容体として終濃度 0. 06mMの DC I Pの存在下で、基質濃度 1 OmMのグルコースを用いて、実施例 3と同様にして酵素活性を測定した。値は野生型の活性を 100とし、これに対する相対活性で表した。結果を表 4に示す。 Thr366Asnと Aspl67Gluとの二重変異を有する改変型酵素は、野生型酵素と比較して高い酵素活性を有していた。

表 4

野生型 100%

Thr366Asn 126%

Asp167Glu 54%

Asp167Glu/Thr366Asn 291% 実施例 Ί

酵素センサ一の作製および評価

5 Uの改変型酵素にカーボンペースト 20 m gを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約 4 Omg充填されたカーボンぺースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を 1%のグルタルァルデヒドを含む 10 mM MOPS緩衝液 (pH 7. 0 ) 中で室温で 30分間処理した後、 2 OmMリジンを含む 1 OmM MO PS緩衝液 (pH 7. 0) 中で室温で 20分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を 1 OmM MOP S緩衝液（pH7. 0) 中で室温で 1時間以上平衡ィ匕させた _q 電極は 4 °Cで保存した。

作製した酵素センサーを用いてグルコース濃度の測定を行った。本発明の改変型 PQQGDHを固定ィヒした酵素センサーを用いて、 5mM— 5 OmMの範囲でグルコースの定量を行うことができた。産業上の利用性

本発明の改変型水溶性 P QQGDHは、グルコースによる基質阻害が小さいため、高濃度のグルコースの存在下におけるダルコースの測定に有用である。

Claims

請求の範囲

1 . ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶个生 P Q Q G D Hの 3 4 9番目カゝら 3 7 7 番目の残基に相当するアミノ酸残基が他のァミノ酸残基で置換されており、かつ阻害定数（K s i ) が 2 0 O mM以上であるグルコース脱水素酵素。

2 . 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 3 6 5番目のメチォニンが他のァミノ酸残基で置換されており、かつ K s iが 2 0 O mM以上である、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。

3 . 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 3 6 5番目のメチォニンがトリプトファンまたはフエ-ルァラニンで置換されている、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。

4 . 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 3 6 6番目のトレオニンが他のァミノ酸残基で置換されており、かつ K s iが 2 0 O mM以上である、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。

5 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 3 6 6番目のトレオニンがァスパラギン酸、リジン、イソロイシンまたはァスパラギンで置換されている、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。

6 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 3 6 7番目のチロシンが他のアミノ酸残基で置換されており、かつ K s iが 2 0 O mM以上である、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。

7 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 3 6 7番目のチロシンがァスパラギン酸で置換されている、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素

8 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 3 6 8番目のイソロイシンが他のァミノ酸残基で置換されており、かつ K s iが 2 0 O mM以上である、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするダルコース脱水素酵素。

9 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 3 6 8番目のイソロイシンがァスパラギンで置換されている、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水

1 0 . 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 3 6 9番目のシスティンが他のァミノ酸残基で置換されており、かつ K s iが 2 0 O niM以上である、ピロ口キノリンキノンを捕酵素とするグルコース脱水素酵素。

1 1 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 3 6 9番目のシスティンがアルギニンで置換されている、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素

1 2 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 3 7 4番目のァラニンが他のアミノ酸残基で置換されており、かつ K s iが 2 0 O mM以上である、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。

1 3 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 3 7 4番目のァラニンがプロリンで置換されている、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。

1 4 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 3 4 9 目から 3 7 7番目のいずれかのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ 1 6 7番目のァスパラギン酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、ピロ口キノリンキノンを捕酵素とするダルコース脱水素酵素。

1 5 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 3 6 5番目のメチォニン、 3 6 6番目のトレオニン、 3 6 7番目のチロシン、 3 6 8番目のイソロイシン、

3 6 9番目のシスティンおょぴ 3 7 4番目のァラニンからなる群より選択されるアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ 1 6 7番目のァスパラギン酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。

1 6 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 3 6 5番目のメチォニン、 3 6 6番目のトレオニン、 3 6 7番目のチロシン、 3 6 8番目のイソロイシン、 3 6 9番目のシスティンおょぴ 3 7 4番目のァラニンからなる群より選択されるァミノ酸残基が他のァミノ酸残基で置換されており、かつ 1 6 7番目のァスパラギン酸残基がグノレタミン酸残基で置換されている、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。

1 7 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 3 6 6番目のトレオニンがァスパラギン酸、リジン、イソロイシンまたはァスパラギンで置換されており、かつ 1 6 7番目のァスパラギン酸残基がグ ·；レタミン酸残基で置換されている、ピロロキノリンキノンをネ甫酵素とするグルコース脱水素酵素。

1 8 . 配列：

Cys Gly Glu Xaa Thr Tyr lie

(式中、 Xaaは Metまたは Trpである）を含む、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするダルコース脱水素酵素。

1 9 . 配列：

Gly Glu Met Xaa Tyr lie Cys

(式中、 Xaaは Asp、 Lys、 lieまたは Asnである）を含む、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。

2 0 . 配列：

Glu Met Thr Asp lie Cys Trp

を含む、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素。

2 1 . 配列：

Met Thr Tyr Asp Cys Trp Pro

含む、ピロ口キノリンキノンを捕酵素とするグルコース脱水素酵素。

2 2 . 配列：

Tnr Tyr lie Arg Trp Pro Thr

2 3 . 配列：

Pro Thr Val Pro Pro tier Ser

2 4 . 請求項 1一 2 3のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子。

2 5 . 請求項 2 4に記載の遺伝子を含むベタタ一。

2 6 . 請求項 2 4に記載の遺伝子を含む形質転換体。

2 7 . 請求項 2 4に記載の遺伝子が主染色体に組み込まれてレ、る、請求項 2 2 記載の形質転換体。

28. 請求項 27に記載の形質転換体を培養し、菌体から水溶性画分を調製することを含む、水溶性 PQQGD Hの製造方法。

29. 請求項 1— 23のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素を含むダルコースアツセィキット。

30. 請求項 1— 23のレ、ずれかに記載のダルコース脱水素酵素を含むダルコ