WO2003102198A1 - Verfahren zur stabilen expression von nukleinsäuren in transgenen pflanzen unter der kontrolle eines petersilie-ubiquitin-promoters - Google Patents

Verfahren zur stabilen expression von nukleinsäuren in transgenen pflanzen unter der kontrolle eines petersilie-ubiquitin-promoters Download PDF

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Gunnar Plesch
Marcus Ebneth
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for the stable expression of nucleic acids in transgenic plants.
  • the invention further relates to nucleic acid constructs
  • transgenic plants Vectors, transgenic plants and the use of these transgenic plants for the production of food, animal feed, seeds, pharmaceuticals or fine chemicals.
  • herbicide resistance can be achieved by introducing foreign genes, which optimizes the cultivation conditions and reduces crop losses (Ott KH et al., J Mol Biol. 1996; 263 (2): 359-368).
  • the quality of the products can also be improved.
  • the shelf life and shelf life of crop products can be increased, for example, by inactivating certain ripening genes. This was shown, for example, on the tomato by inactivating the polygalacturonase (Hamilton AJ et al., Curr Top Microbiol Immunol 1995; 197: 77-89). 45 Furthermore, by introducing additional genes from metabolic genes in plants, certain products and by-products of naturally occurring metabolic processes can advantageously be used for a broad spectrum of industries, including the feed, food, cosmetics and pharmaceutical industries.
  • These molecules include, for example, vitamins, amino acids, carbohydrates or lipids and fatty acids, among which an exemplary class is the polyunsaturated fatty acids (PUFAs).
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • polyunsaturated fatty acids are added to children's foods in order to produce a higher nutritional value for these foods.
  • PUFAs have a positive influence on the cholesterol level in the blood of humans and are therefore suitable for protection against heart diseases.
  • Fatty acids and triglycerides have a multitude of applications in the food industry, animal nutrition, cosmetics and pharmaceuticals.
  • a basic requirement for the transgenic expression of certain genes in plants is the provision of plant-specific promoters.
  • Various plant promoters are known. There can be constitutive promoters that allow local and temporally limited expression in different parts of a plant and specific promoters that only express in certain parts or cells of a plant (e.g. root, seeds, pollen, leaves, etc.) or allow to be differentiated only at certain times of development. Constitutive promoters are used advantageously for the expression of so-called selection markers. Selection markers (e.g. antibiotic or herbicide resistance genes) allow the transformation event to be filtered out from the large number of untransformed, but otherwise identical plant individuals.
  • Selection markers e.g. antibiotic or herbicide resistance genes
  • genes to be expressed In all cases it is necessary to control the expression of the genes to be expressed depending on the task of the genes. All expressed genes in all organisms have a promoter region 5 'of the coding sequence. This region is responsible for the start of the transcription itself as well as for the regulation of the transcription. This regulation usually takes place by binding transcription factors to regulatory sequences within the promoter region. Promoters are usually freely portable within a species, i.e. a promoter from one gene can be used to control the transcription of another gene.
  • This control of the new gene is then usually identical to the control of the original gene from which the promoter comes.
  • the expression of any gene can thus be controlled in a known manner using a known promoter whose regulation is known. This no longer applies in general as soon as the promoter is used in other species.
  • promoters from the Streptomyces bacterium are not or only poorly recognized in the E. coli bacterium. The same applies to promoters of animal or vegetable origin which cannot easily be used mutually or in microorganisms.
  • TR double promoter from Agrobacterium tumefaciens the promoters of the vacuolar ATPase subunits or the promoter of a proline-rich protein from wheat (WO 91/13991) and the Ppcl promoter from Mesembryanthemum crystallinum (Cushman et al. (1993) Plant Mol Biol 21 : 561-566).
  • the constitutive promoters currently used predominantly in plants are almost exclusively of viral or bacterial origin, for example from Agrobacterium. These are specifically the nopaline synthase (nos) promoter [Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12 (20): 7831-7846], the mannopine synthase (as) promoter [Comai et al.
  • the ScBV promoter mediated expression level was comparable to that of the ubiquitin promoter from maize (see below). Furthermore, the ScBV promoter-mediated expression rate was tested in transgenic banana and tobacco plants and showed essentially constitutive expression in both plant species.
  • the most common promoters for the expression of selection markers in plants are the nos promoter, but also the mas and ocs promoter, all of which have been isolated from Agrobacterium strains.
  • the expression pattern of the two promoters Ubi-1 and Ubi-2 from maize is in Plant. Mol. Biol., (1992), 18 (4): 675-689. While the Ubi-1 promoter has good expression activity in maize and other monocotyledon plants, it shows in the dicotyledon tobacco plants only 10% of the activity which was achieved in comparable experiments with the 35S viral promoter.
  • the maize Ubi-1 promoter is therefore suitable for the overexpression of genes in monocot plant systems. It is also sufficiently strong to mediate herbicide resistance by expression of selection markers [Christensen and Quail (1996) Transgenic Res 5 (3) .213-218]. However, the Ubi-1 promoter proved unsuitable for dicotyledon expression systems.
  • WO01 / 18220 describes an ubiquitin regulator system which lacks the sweatshock elements, which means that it is no longer heat-inducible. This regulator system was developed based on the maize Ubi promoter system by removing the heat-inducible elements.
  • Ubiquitins are omnipresent proteins that have been found in all eukaryotes analyzed so far.
  • Kawalleck et al. [Plant Molecular Biology, 21, 1993: 673-684] described two parsley (Petroselinum crispum) ubiquitins ubi4-l and ubi4-2. The promoter was isolated from ubi4-2. Among those described by Kawalleck et al. No heat inducibility of ubi4-l and ubi4-2 could be shown under the conditions examined.
  • the leaf-specific barley thionine promoter was inactive in the majority of the transformed lines, while the Arabidopsis UBQ1 promoter gave medium expression rates.
  • McElroy and co-workers reported a construct based on the rice actin 1 (Actl) promoter for the transformation of monocotyledonous plants [McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231: 150-1609]. Overall, it was concluded from the investigations described above that the expression vectors based on the Actl promoter are suitable for controlling a sufficiently strong and constitutive expression of foreign DNA in transformed cells of monocotyledonous plants.
  • the promoter is also one
  • WO 99/31258 describes chimeric, constitutive plant
  • Promoters which are composed of different elements of different promoters with complementary expression patterns, so that the combination of individual tissue specificities leads additively to a constitutive expression pattern. This is a very complex process for the production of apparently constitutive promoters.
  • promoters with specificities for the anthers ovaries, flowers, leaves, stems, roots and seeds have been described.
  • the stringency of the specificity as well as the expression activity of these promoters is very different. Promoters that ensure leaf-specific expression are to be mentioned, such as the promoter of the cytosolic FBPase from potato (WO 97/05900), the SSU promoter (small subunit) of the Rubisco (ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase), the ST-LSI promoter from potatoes [Stockhaus et al.
  • FNR promoter the predominantly leaf-specific ferredoxin NADPH oxidoreductase promoter which has a light-inducible element [Oelmüller et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 237: 261-72] or the leaf-specific promoter of the triose phosphate translocator (TPT).
  • promoters are, for example, promoters with specificity for tubers, storage roots or roots, such as, for example, the patatin promoter class I (B33), the promoter of the cathepsin D inhibitor from potato, the promoter of the starch synthase
  • GBSS1 sporamine promoter
  • fruit-specific promoters such as, for example, the fruit-specific promoter made of tomato (EP-A 409625), fruit-ripening-specific promoters, such as, for example, the fruit ripening-specific promoter made of tomato (WO 94/21794), flower-specific promoters, such as the phytoene synthase promoter (WO 92/16635) or the promoter of the P-rr gene (WO 98/22593).
  • Promoters are described with tissue specificity for the mesophyll and pallisade cells in leaves (Broglie et al. (1984) Science 234: 838-845), the dividing shoot and the root meristem [Atanassova et al. (1992) Plant J 2: 291-300], pollen [Guerrero et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 161-168], seed endosperm [Stalberg et al. (1993) Plant Mol Biol 23: 671-6839, lavenderepide ⁇ rtis [Suzuki et al. (1993) Plant Mol Biol 21: 109-119], as well as for the root meristem, root vessel tissue and root nodules [Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2: 633-641].
  • Promoters are also known which control expression in seeds and plant embryos.
  • Seed-specific promoters are, for example, the promoter of phaseoline [US 5,504,200, Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9): 839-53], 2S albuming [Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201], leguminum [Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215 (2): 326-331], of the USP [unknown seed protein; Baumlein H et al. (1991) Molecular & General Genetics 225 (3): 459-67] of the Napin gene [Stalberg K, et al.
  • tissue-dependent expression pattern Because of the tissue-dependent expression pattern, the aforementioned tissue-specific promoters are poorly suited for the expression of selection markers. Here, a selection in as many tissue parts as possible is necessary to ensure an efficient selection.
  • the so-called “constitutive" promoters described in the prior art have one or more of the following disadvantages:
  • the known, so-called “constitutive” promoters often show a different level of expression depending on the tissue or cell type.
  • the expression property is often strongly dependent on the insertion site of the host genome. This shows that the effects to be achieved by heterologous expression cannot be achieved to the same extent in the plant to the same extent. Underdosing or overdosing may occur. This can adversely affect plant growth or plant value.
  • Promoters of viral origin can be influenced by virus infections of the transgenic plant and can then no longer express the desired property [Al-Kaff et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 995-99]. Public acceptance of the use of promoters and elements from plant systems is higher than that of viral systems.
  • the number of promoters suitable for the expression of selection markers in plants is small and they are usually of viral or bacterial origin.
  • An ideal constitutive promoter should have as many of the following properties as possible:
  • the object on which the present invention is based was therefore to provide a method for the stable expression of nucleic acids in transgenic plants under the control of a plant promoter which fulfills as many of the abovementioned properties as possible, above all a ubiquitous and development-independent (constitutive) expression of a expressing nucleic acid sequence - advantageously coding for a selection marker - mediated. Furthermore, the task was to provide a nucleic acid construct for the expression process that would allow the broadest possible expression of the expressed nucleic acid in various plant tissues enables one type of plant and is widely applicable in various plants.
  • nucleic acid construct into a plant, which is formed from the nucleic acid to be expressed, which is under the control of the 5 'region of the promoter mentioned under a) or b), and the promoter
  • the nucleic acid to be expressed in the method according to the invention can advantageously be functionally linked to further regulatory sequences 25.
  • Expression in the sense of the method encompasses the transcription of the nucleic acid sequence to be expressed transgenically, but can - in the case of an open reading frame in "sense" orientation - also include the translation of the transcribed RNA of the transgenic nucleic acid sequence to be expressed into a corresponding polypeptide.
  • GUS fusions ß-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.
  • the expression level is also preferred as a comparison value.
  • nucleic acid sequence preferably those nucleic acid sequences which code for easily quantifiable proteins.
  • Reporter proteins Schoenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (l): 29-44) such as "green fluorescence protein” (GFP) (Chui
  • the method according to the invention advantageously leads to stable, strong expression of the nucleic acids in a very large number of individuals. That means the nucleic acid or the ones expressed in the method according to the invention
  • nucleic acids (the singular should include the plural for the application and vice versa) is / are expressed very evenly within the transgenic plants regardless of their place of insertion and regardless of the tissue.
  • gene silencing in which the nucleic acids or genes to be expressed by inter
  • FIG. 1 shows the structure of a vector which is advantageously used. A comparison with the prior art, in which the GUS gene was connected behind the d35S promoter, can be seen in FIG. 3. The advantageous properties of the method are clearly shown.
  • FIG. 3 shows the GUS staining of leaves of transgenic C24 Arabidopsis plants containing the GUS gene under the control of the d35S promoter.
  • the d35S promoter also showed a different level of expression within a leaf of a plant, ie it shows a mosaic-like expression depending on the different situation within a leaf of a plant.
  • the expression behavior under the control of the PcUbi4-2 promoter within a leaf of a plant is very homogeneous, which means that there is no mosaic-like expression. The method thus enables the strong, uniform expression of genes in stably transformed plants.
  • Uniformly strong expression in the sense of the invention means that within a plant tissue at least 60%, advantageously at least 70%, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90%, very particularly preferably at least 95%, of the cells of a tissue have an expression of the nucleic acid.
  • FIG. 4 shows the expression in the bud of a transgenic C24 Arabidopsis plant which contains the GUS gene under the control of the Pc-Ubi4-2 promoter from P. crispum.
  • the dark gray areas show the expression of the ⁇ -glucoronidase.
  • FIG. 5 shows the GUS coloration of the flower of a transgenic C24 Arabidopsis plant which contains the GUS gene under the control of the Pc-Ubi4-2 promoter from P. crispum.
  • the dark gray areas are due to the enzymatic activity of the expressed ⁇ -glucoronidase.
  • a strong expression can also be observed in the root in transgenic C24 Arabidopsis plants which contain the GUS gene under the control of the Pc-Ubi4-2 promoter from P. crispum, as can be seen in FIG. 6.
  • the dark gray areas reflect the activity of the ⁇ -glucoronidase.
  • FIG. 7 shows the GUS staining of seeds transgenic C24 Arabidopsis Plants that contain the GUS gene under the control of the Pc-Ubi4-2 promoter from P. crispum (middle and right) or under the control of the d35S promoter (left).
  • the dark gray supernatant reflects the ⁇ -glucoronidase activity. It can clearly be seen that the Pc-Ubi4-2 promoter has a stronger activity in the seed than the d35S promoter.
  • the method and the nucleic acid constructs according to the invention are therefore advantageously suitable for expressing a practically unlimited number of genes in plants such as monocotyledon or dicotyledonous plants, advantageously in dicotyledonous plants. Selection genes can advantageously be expressed in the method under the control of the advantageous promoter.
  • the expression is advantageously constitutive, but induction via, for example, exposure to heat is conceivable.
  • the HSE is within the intron range. This heat shock inducible element does not agree with the consensus sequences given by Mycogen 5 '-CTNGAANNTTCNAG-3' or CTGGAATNTTCTAGA-3 '(US 5,510,474) or with that of Drosophila (US 6,054,574, column 18, lines 59-64) agreed and was not recognized as HSE in a promoter analysis for plant-based cis-active elements with the website PLACE.
  • the intron is located in the intron and not as described by Mycogen 5 'relative and thus upstream to the intron.
  • FIG. 8 also shows the following further elements, which are the same as those described by Higo et al. [(1999) Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database: 1999, Nucl. Acid. Res., Vol. 27, No.l, 297-300]:
  • TATATATA A TATA box in the range 291 to 297 and thus at the expected distance from the start of transcription at position 237.
  • the elements mentioned under a) to c) are marked in FIG. 8 by 15 boxes, the AACAAAC and CAAACAC boxes of the opposite strand being highlighted.
  • the start of transcription is marked with an arrow.
  • the promoter contains an intron immediately before the start of translation (positions 396 to 982, see FIG. 8). The intron is immediately followed (not specified) by the start codon ATG.
  • the program also identified the following putative elements of the promoter:
  • the specified TATA box (see FIG. 8) is essential for the function of the promoter. It should advantageously be in a range from -20 to -50, preferably from -25 to -35, at the start of the transcription.
  • a sequence comparison between PcUbi4-2 and the Ubi promoter from maize shows that the genes of maize and P. crispum are identical at the nucleotide level to 66.1%, while the promoters are 26% identical, that is to say for AT-rich promoters no significant identity (gap opening penalty 15, gap extension penalty 6.66) [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410, Altschul et al. , 1997, Nucl. Acid Res., 25: 3389-3402]. The promoters are not found in each other in blast.
  • the ubiquitin promoter advantageously used in the method according to the invention proved to be sufficiently strong to stably express nucleic acid sequences, in particular selection marker genes, in dicotyledons and monocotyledons in the genome of the plant. This is all the more surprising since the Arabidopsis thaliana ubiquitin promoter [Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-646] proved unsuitable.
  • This advantageously used ubiquitin promoter can be further optimized for its task using methods which are known to the person skilled in the art. Those skilled in the art can use the in the examples isolate given assay using the ß-glucuronidase slightly improved mutants of the promoter.
  • Mutations include substitutions, additions, deletions, inversions or insertions of one or more nucleotide residues.
  • the present invention also includes those nucleotide sequences which are obtained by modification of the ubiquitin promoter according to SEQ ID NO: 1. The aim of such a modification may be to further narrow down the essential promoter sequence contained therein or e.g. also the insertion of further restriction enzyme interfaces, the removal of superfluous DNA or the addition of further sequences, for example further regulatory sequences.
  • Transitions and transversions in question, techniques known per se, such as in vitro mutagenesis, "primer repair", restriction or ligation can be used. Through manipulations, such as Restriction, “chewing-back” or filling of overhangs for "blunt ends”, complementary ends of the fragments can be made available for the ligation. Analogous results can also be obtained using the polymerase chain reaction (PCR) using specific oligonucleotide primers.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Functional equivalents or functional fragments derived from SEQ ID NO: 1, for example by substitution, insertion or deletion of nucleotides, have a homology of at least 30%, preferably 50%, preferably at least 70%, particularly preferably at least 90%, very particularly preferably at least 95%, and are characterized by essentially the same properties as the parsley ubiquitin promoter according to SEG ID NO: 1.
  • non-essential sequences of the parsley promoter can be deleted without significantly impairing the promoter property.
  • deletion variants represent functionally equivalent parts of the promoter described by SEQ ID NO: 1.
  • the method according to the invention is advantageously used for the stable expression of nucleic acids in transgenic plants which are selected from the group consisting of a gene for a gene Selection marker, a reporter gene, an RNAi construct, an enzyme, a protein which mediates resistance to insects, viruses, bacteria, fungi or nematodes, a nucleic acid sequence or a protein which is resistant to drought, cold, heat or salt in plants mediates, an inhibitor, a lectin, an RNAase, a ribozyme, an antibody, a vaccine, a pharmaceutical, an "antifreezing" protein, a cytochrome P-450 protein, a transcription activator or repressor or a protein that involved in the biosynthesis of fine chemicals.
  • the protein which is involved in the biosynthesis of fine chemicals is preferably a protein from the fatty acid metabolism, the amino acid metabolism, the vitamin metabolism, the carotenoid metabolism or the carbohydrate metabolism.
  • genes or nucleic acids are to be expressed in the process according to the invention, these can also be expressed from parsley under the control of the ubiquitin promoter, or advantageously under the control of further promoters. These can be constitutive, inducible and / or tissue-specific.
  • the nucleic acid construct used in the method is advantageously inserted between two T-DNA sections. This facilitates stable integration into the plant genome.
  • the transgenic plant used in the process is a monocot or dicot plant, advantageously a dicot plant.
  • Monocotyledons selected from the group consisting of corn, rice, triticale, wheat, rye, barley, oats, ryegrass or millet are examples of monocotyledonous plants.
  • dicotyledonous plants for example, dicotyledons are selected from the group consisting of grass, evening primrose, canola, peanut, mullein, thistle, hazelnut, almond, macadamia, avocado, laurel, wild rose, pumpkin, pistachio, sesame, flax, sunflower, safflower, soybean , Borretseh, poppy seeds, mustard,
  • nucleic acids used in the method according to the invention can be expressed constitutively or inducibly. Constitutive expression is preferred.
  • the products resulting from the expression of the nucleic acids in the transgenic plants can be isolated from them after cultivation of the plants.
  • the products from callus cultures, from fermentation cultures or from cultivated and harvested plants or parts of plants such as leaves, stems, roots, flowers or seeds can be isolated using methods known to those skilled in the art.
  • fatty acid esters with polyunsaturated cis, C 2 n and / or C 2 fatty acid molecules may be mentioned as examples.
  • These can be in the form of an oil or lipid, for example in the form of compounds such as sphingolipids, phosphoglycerides, lipids, glycolipids such as glycoshingolipid, phospholipids such as phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol or diphosphatidyl, diacylglycerol acid glyceride, glycylglycerol acid glycerol, glycylglycerol acid, glycylglycerol acid, glycylglycerol acid Acetyl CoenzymA esters containing the polyunsatur
  • the various aforementioned compounds (fatty acid esters and free fatty acids) in the plant are in an approximate distribution of 80 to 90% by weight triglycerides, 2 to 5% by weight diglycerides, 5 to 10% by weight monoglycerides, 1 up to 5% by weight of free fatty acids, 2 to 8% by weight of phospholipids, the sum of the various compounds adding up to 100% by weight.
  • Linoleic acid (C18: 2), linolenic acid (C18: 3), arachidonic acid (ERA) or eicosapentaenoic acid (EPA) can advantageously be prepared and isolated in the process according to the invention.
  • Plants belonging to the oil-producing plants that is to say used for the production of oils, such as oil-fruit plants which contain large amounts of lipid compounds, such as peanut, rapeseed, canola, sunflower, are advantageously used in the process according to the invention.
  • Safflower poppy seeds, mustard, hemp, castor oil, olive, sesame, calendula, punica, Evening primrose, mullein, thistle, wild roses, hazelnut, almond, macadamia, avocado, laurel, pumpkin, flax, soy, pistachios, borage, trees (oil palm, coconut or walnut) or crops such as corn, wheat, rye, oats, triticale, Rice, barley, cotton, cassava, pepper, tagetes, solanaceae plants, such as potatoes, tobacco, aubergine and tomato, Vicia species, peas, alfalfa or bush plants (coffee, cocoa, tea), Salix species as well as perennial grasses and forage crops , Preferred plants are oil fruit plants, such as peanut, rapeseed, canola, sunflower, safflower (safflower), poppy, mustard, hemp, castor oil, calendula, punica, evening primrose
  • Plants rich in C18: 2 and / or C18: 3 fatty acids such as sunflower, safflower, tobacco, mullein, sesame, cotton, pumpkin, poppy, evening primrose, walnut, flax, hemp, thistle or safflower are particularly preferred. Plants such as safflower, sunflower, poppy, evening primrose, walnut, flax or hemp are particularly preferred.
  • nucleic acids when producing PUFAS, nucleic acids are expressed which code, for example, for polypeptides with ⁇ -5, ⁇ -6 desaturase or ⁇ -6 elongase activity.
  • mixtures of the various aforementioned compounds or individual compounds such as EPA or ERA can be prepared in free or bound form.
  • transgenic plants are also understood to mean plant cells, tissues, organs or whole plants which are suitable for the expression of nucleic acids.
  • Cultivation means, for example, the cultivation of the transgenic plant cells, tissues or organs on a nutrient medium or the whole plant on or in a substrate, for example in hydroponics or on a field soil.
  • nucleic acids can be used in the method according to the invention. These nucleic acids are advantageously derived from plants such as algae, diatoms, mosses or higher plants, but they can also come from microorganisms such as fungi, yeasts or animals such as nematodes, insects or humans.
  • a transgenic plant is understood to mean that the nucleic acids used in the method are not stably integrated in their natural location in the genome of a plant; the nucleic acids can be expressed homologously or heterologously. Tansgen also means that the nucleic acids according to the invention are in their natural place in the genome of an organism, but that the sequence above the natural sequence was changed and / or that the regulatory sequences of the natural sequences were changed. Transgenic is preferably understood to mean the expression of the nucleic acids according to the invention at a non-natural location in the genome, that is to say a homologous or preferably heterologous expression of the nucleic acids is present.
  • Transgenic plants which contain the nucleic acids expressed in the process according to the invention can be marketed directly without isolating the synthesized compounds.
  • Plants in the process according to the invention are understood to mean all parts of plants, plant organs such as leaves, stems, roots, tubers or seeds or the entire plant.
  • the semen comprises all parts of the semen such as the seminal shell, epidermis and sperm cells, endospe m or embyro tissue.
  • the compounds produced in the process according to the invention can also be isolated from the plants in the form of the free products, for example their oils, fats, lipids and / or free fatty acids.
  • Compounds made by this method can be harvested by harvesting the organisms either from the culture in which they grow or from the field.
  • oils for example, this can be done in a manner known to those skilled in the art by pressing or extracting the plant parts, preferably the plant seeds.
  • the oils, fats, lipids and / or free fatty acids can be obtained by cold pressing or cold pressing without the addition of heat by pressing.
  • the seeds pretreated in this way can then be pressed or extracted with solvents such as warm hexane. The solvent is then removed again. In this way, more than 96% of the compounds produced in the process can be isolated.
  • the products thus obtained are then processed further, that is to say refined. First, the plant mucilages and cloudy substances.
  • degumming can be carried out enzymatically or, for example, chemically / physically by adding acid such as phosphoric acid.
  • the free fatty acids are then removed by treatment with a base, for example sodium hydroxide solution.
  • the product obtained is washed thoroughly with water to remove the lye remaining in the product and dried.
  • the products are subjected to bleaching with, for example, bleaching earth or activated carbon.
  • the product is still deodorized with steam, for example.
  • the term "oil” or "fat” is understood to mean a fatty acid mixture which contains unsaturated, saturated, preferably esterified fatty acid (s).
  • the oil or fat has a high proportion of unsaturated, non-conjugated esterified fatty acid (s), in particular linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, ⁇ -linolenic acid, stearidonic acid, eicosatetraenoic acid or eicosapentaenoic acid.
  • s unsaturated, non-conjugated esterified fatty acid
  • the proportion of unsaturated esterified fatty acids is about 30%, more preferred is 50%, more preferred is 60%, 70%, 80% or more.
  • the proportion of fatty acid after the fatty acids have been converted into the methyl esters can be determined by gas chromatography by transesterification.
  • the oil or fat can contain various other saturated or unsaturated fatty acids. In particular, the proportion of the various fatty acids in the oil or fat can fluctuate depending on the starting plant.
  • the polyunsaturated fatty acids containing can be liberated, for example via an alkali treatment, for example aqueous KOH or NaOH or acid hydrolysis, advantageously in the presence of an alcohol such as methanol or ethanol, or via an enzymatic cleavage and isolated via, for example Phase separation and subsequent acidification using, for example, H 2 S0 4 .
  • the fatty acids can also be released directly without the workup described above.
  • Another embodiment of the invention is the use of the transgenic plant or the products obtained from the plants in animal feed, foodstuffs, seeds, fine chemicals, cosmetics or pharmaceuticals.
  • a further subject of the invention is a nucleic acid construct for the stable transgenic expression of nucleic acids in the aforementioned method according to the invention
  • nucleic acid construct advantageously contains at least one further element selected from the following group:
  • nucleic acid sequence to be expressed is functionally linked to further genetic control sequences, or
  • nucleic acid construct contains additional functional elements
  • a polylinker is present between the promoter and the nucleic acid sequence to be expressed, or
  • the nucleic acid construct contains at least one further nucleic acid under the control of the promoter according to SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent or equivalent fragment or another promoter.
  • the T-DNA has a so-called right and left T-DNA border, which mediate the transfer of the area between them.
  • Important for this transfer are two almost identical sequences of approximately 25 bp in length (right and left T-DNA border), which flank the T-DNA on the Ti plasmid and which are recognized by a nuclease encoded by a Ti plasmid. This nuclease is able to cut out a single strand of T-DNA from the plasmid, which is then stably inserted into the plant genome at any point. So can. any nucleic acid sequences can be inserted into the plant genome.
  • the nucleic acid sequence to be expressed transgenically in the nucleic acid construct is selected from the group of nucleic acids consisting of a selection marker, a reporter gene, an RNAi construct, an enzyme, a protein which confers resistance to insects, viruses, bacteria, fungi or nematodes Nucleic acid sequence or a protein which confers resistance to drought, cold, heat or salt in plants, an inhibitor, a lectin, an RNAase, a ribozyme, an antibody, a vaccine, a pharmaceutical, an "antifreezing" protein, a cytochrome P-450 protein, a transcriptional activator or repressor or a protein involved in the biosynthesis of fine chemicals.
  • the nucleic acids or nucleic acid constructs used in the process are stably integrated into the genome of the host cell after introduction into a plant cell or plant.
  • the integration can be random or by recombination such that the native gene is replaced by the inserted copy, thereby modulating the production of the desired compound by the cell, or by using a gene in trans so that the gene is functionally linked to a functional expression unit which contains at least one sequence ensuring expression of a gene and at least one sequence ensuring polyadenylation of a functionally transcribed gene.
  • the nucleic acids are advantageously introduced into the plants in a nucleic acid construct in the form of so-called multi-expression cassettes or constructs for the multiparallel expression of genes.
  • the aim of the present invention is to integrate the nucleic acids or the codogenic gene segments in the genome of the plants.
  • a certain codogenic gene segment can be integrated as a continuous coding sequence (ORF) or contain one or more introns. If the latter is the case, such sequences are usually spliced in the course of expression by the plant, the splicing pattern being able to correspond to that of the donor organism, but not necessarily so.
  • the nucleic acids can be introduced into the extranuclear genome, e.g. the plastid genome, a plant. According to the invention, however, integration into the nuclear genome is preferred.
  • nucleic acid or the codogenic gene segment can be determined; * The nucleic acid or the codogenic gene segment can be inherited as a characteristic of the plant, with nuclear integration according to Mendelian rules.
  • the number of integrated copies of a nucleic acid or of a specific codogenic gene segment per cell is less than 20 and in most cases less than 10. Plants with cells which have about 1 to 5 copies and in particular 1 copy of a nucleic acid are preferred according to the invention or a specific codogenic gene segment.
  • the number of copies per cell can be determined in a manner known per se by means of “Southern blot” analysis (extraction of the genomic DNA, restriction-enzymatic digestion, electrophoretic separation, membrane transfer, hybridization with labeled DNA-specific probe) or quantitative PCR.
  • the advantageously heterologous nucleic acids or codogenic gene segments in the genome of the transgenic plants are flanked on one or preferably on both sides by T-DNA sequences, in particular Agrobacterium Ti plasmid sequences. This is also an expression of the stable integration according to the invention of the codogenic gene segments into the genome of the plants.
  • nucleic acid construct according to the invention can then be inserted into a vector for introduction into the transgenic plant. But it can also be introduced directly into the plant.
  • nucleic acids or nucleic acid constructs can be used for the genetic engineering modification of a broad spectrum of plants, so that this becomes a better or more efficient producer of one or more of the aforementioned products. This can improve production or production efficiency caused by the direct effect of the manipulation or an indirect effect of this manipulation.
  • nucleic acid sequences used in the method are advantageously introduced into the plant in the form of a nucleic acid construct which enables stable expression of the nucleic acids in plants.
  • nucleic acids for example, the functionalities for the desaturases used in the production of PUFAS and / or the nucleic acid sequences coding for the elongases are advantageously functionally linked with one or more regulatory signals to increase gene expression.
  • upiquitin promoter can advantageously be used in these constructs instead of one or all of the stated and existing promoters or in combination with the mentioned or other promoters. These regulatory sequences are intended to enable targeted expression of the genes and protein expression.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thus regulate the expression of the nucleic acid.
  • the natural regulation of these sequences may still be present in front of the actual structural genes and may have been genetically modified so that the natural regulation has been switched off and the expression of the genes has been increased.
  • the gene construct can also advantageously contain one or more so-called "enhancer sequences" functionally linked to the promoter, which enable increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences.
  • the nucleic acids to be expressed can be in one or more copies in the expression cassette
  • the promoter / terminator constructs mentioned above advantageously consist of at least two functional units such as a promoter and a terminator.
  • further desired gene sequences such as targeting sequences, coding regions of further genes or parts thereof, etc. can be added between promoter and terminator. be inserted.
  • promoters and terminators are used (USP promoter: Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67); OCS terminator: Gielen et al. EMBO J. 3 (1984) 835ff.) Isolated using the polymerase chain reaction and tailored with flanking sequences of your choice based on synthetic oligonucleotides.
  • oligonucleotides can be used, for example:
  • a promoter and a terminator are amplified via PCR. Then the terminator is cloned into a recipient plasmid and in a second step the promoter is inserted in front of the terminator.
  • An expression cassette is thus obtained on a carrier plasmid.
  • PUC19 can advantageously be used for this purpose, but the use of any other common vector is also possible.
  • the DC3 promoter is described in Thomas, Plant Cell 1996,
  • 35 263: 359-368 consists only of the region -117 to +26 which is why it is one of the smallest known seed-specific promoters.
  • the expression cassettes can contain the same promoter several times or can be constructed using three different promoters.
  • ubiquitin 0 promoter used in the process according to the invention (see SEQ ID NO: 1) and / or b) the 2.7 kB fragment of the LeB4 promoter and / or c) the phaseolin promoter and / or d) the constitutive v -ATPase cl promoter.
  • the additional regulatory sequences or factors which are advantageously present in the nucleic acid construct can, as described above, preferably have a positive influence on the gene expression of the introduced genes and thereby increase them.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers. Besides it is also possible to increase translation, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • Genetic regulatory sequences also include the 5 'untranslated region, introns or the non-coding 3' region of genes. It has been shown that these can play a significant role in regulating gene expression. It has been shown that 5 'untranslated sequences can advantageously increase the transient stable expression of heterologous genes.
  • promoters as in the CaMV / 35S plant promoters [Franck et al. , Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al. , Plans. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos or in the ubiquitin or phaseolin promoter.
  • inducible promoters are also advantageous, such as those in EP-A-0 388 186 (benzylsulfonamide inducible), Plant J.
  • Seed-specific promoters such as the USP promoter according to the embodiment, but also other promoters such as the LeB4, DC3, phaseolin or napin promoter are also advantageous. Further particularly advantageous promoters are seed-specific promoters which can be used for monocotyledonous or dicotyledonous plants and in US 5,608,152 (napin promoter from rapeseed), WO 98/45461 (oleosin promoter from Arobidopsis), US 5,504,200 (phaseolin promoter from Phaseolus vulgaris) ), WO 91/13980 (Brassica Bce4 promoter), by Baeumlein et al.
  • promoters Plant J., 2, 2, 1992: 233-239 (LeB4 promoter from a legume) these promoters are suitable for dicotyledons.
  • the following promoters are suitable, for example, for monocotyledons lpt-2 or lpt-1 promoter made from barley (WO 95/15389 and WO 95/23230), Hordein pro totor made from barley and other suitable promoters described in WO 99/16890.
  • seed-specific promoters can be isolated both from dicotyledonous and from monocotyledonous plants.
  • Amy 6-6 and Aleurain [US 5,677,474], Bce4 (rapeseed) [US 5,530,149], glycinin (soy) [EP 571 741], phosphoenol pyruvate carboxylase (soy) [JP 06/62870], ADR12-2 (soy) [ WO 98/08962], isocitrate lyase (rape) [US 5,689,040] or ⁇ -amylase (barley) [EP 781 849].
  • Plant gene expression can also be facilitated via a chemically inducible promoter (see an overview in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108).
  • Chemically inducible promoters are particularly suitable if it is desired that the gene expression be carried out in a time-specific manner. Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) and an ethanol-inducible promoter.
  • each of the nucleic acids used in the method should be expressed under the control of its own, preferably a different promoter, since repeating sequence motifs relating to instability of the T-DNA or to recombination events or genes Can lead to silencing.
  • the expression cassette is included advantageously constructed in such a way that a promoter is followed by a suitable interface for inserting the nucleic acid to be expressed, in a polylinker advantageously then optionally a terminator is located behind the polylinker. This sequence is repeated several times, preferably three, four or five times, so that up to five genes are brought together in one construct and can thus be introduced into the transgenic plant for expression.
  • the sequence is advantageously repeated up to three times (see sequence listing SEQ ID NO: 2 to 6).
  • the nucleic acid sequences are inserted for expression via the suitable interface, for example in the polylinker behind the promoter.
  • Each nucleic acid sequence advantageously has its own promoter and possibly its own terminator. However, it is also possible to insert several nucleic acid sequences behind a promoter and possibly in front of a terminator.
  • the insertion point or the sequence of the inserted nucleic acids in the expression cassette is not of critical importance, ie a nucleic acid sequence can be inserted in the first or last position in the cassette without the expression being significantly influenced thereby.
  • Different promoters such as, for example, the parsley ubiquitin promoter, the USP, the LegB4 or the DC3 promoter and different terminators can advantageously be used in the expression cassette.
  • Homologous recombination for stable integration is a relatively rare event in higher eukaryotes, especially in plants. Random integrations into the host genome predominate.
  • One way of removing the randomly integrated sequences and thus enriching cell clones with a correct homologous recombination is to use a sequence-specific recombination system as described in US Pat. No. 6,110,736. This consists of three elements: two pairs of specific recombination sequences and a sequence-specific recombinase. This recombinase catalyzes recombination only between the two pairs of specific recombination sequences.
  • One pair of these specific DNA sequences is located outside the DNA sequence to be integrated, ie outside the two homologous DNA sequences. In the case of a correct homologous recombination, these sequences are not transferred into the genome. In the case of accidental integration, they usually insert together with the rest of the construct. Using a special recombinase and a construct containing a second pair of the specific sequences, the randomly inserted sequences can be cut out or inverted by inversion. activated while the sequences correctly inserted via homologous recombination remain in the genome.
  • a variety of sequence-specific recombination systems can be used, examples being the Cre / lox system of Bacteriophagen Pl, the FLP / FRT system of yeast, the gin recombinase of Mu Phage, the pin recombinase from E. coli and the R / RS system of called pSRI plasmids.
  • the bacteriophage Pl Cre / lox and the yeast FLP / FRT system are preferred.
  • the recombinase (Cre or FLP) interacts specifically with its respective recombination sequences (34bp lox sequence or 47bp FRT sequence) in order to delete or invert the intermediate sequences.
  • the FLP / FRT and cre / lox recombinase system has already been used in plant systems (Odell et al., Mol. Gen. Genet., 223: 369-378, 1990.)
  • the transcription of the introduced genes should advantageously be terminated by suitable terminators at the 3 'end of the introduced biosynthetic genes (behind the stop codon). You can use e.g. the OCSl Terminator. As for the promoters, different terminator sequences should be used for each gene.
  • the nucleic acid construct can advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which enable increased transgenic expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the nucleic acid sequences to be expressed transgenically.
  • the nucleic acid sequences to be expressed transgenically can be contained in one or more copies in the gene construct.
  • Control sequences are also to be understood as those which enable homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or which allow removal from the genome.
  • homologous recombination for example, the natural promoter of a specific gene can be exchanged for the nucleic acid sequence to be expressed and / or the promoter.
  • Methods such as cre / lox technology allow tissue-specific, possibly inducible removal of the expression cassette from the genome of the host organism (Sauer B. Methods. 1998; 14 (4): 381-92).
  • certain flanking sequences are added to the target gene (lox sequences), which later enable removal using the cre recombinase.
  • the nucleic acid construct can also comprise further genes which are to be introduced into the organisms. It is possible and beneficial in the host organism to introduce and express regulatory genes, such as genes for inducers, repressors or enzymes, which intervene in the regulation of one or more genes of a biosynthetic pathway by their enzyme activity. These genes can be of heterologous or homologous origin. Furthermore can be advantageous in
  • Nucleic acid construct or gene construct may contain further biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism, or these genes may be on another or more further nucleic acid constructs.
  • the above-mentioned desaturases in combination with elongases and other desaturases can be cloned into the nucleic acid constructs according to the invention and used to transform plants with the aid of Agrobacterium.
  • Other transformation methods are the protoplast polyethylene glycol (PEG) method, the protoplast electroporation, the protoplast microinjection or the balistic methods.
  • a selectable marker into the nucleic acid construct which, for example, provides resistance to a biocide (for example a herbicide), a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose, to the successfully recombined cells. 6-phosphate (WO 98/45456) or an antibiotic.
  • the selection marker allows the selection of the transformed cells from untransformed ones (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
  • selection markers are, for example, selectable markers such as biocides such as phosphinotricin, glyphosate, sulfonylurea and imidazolinone or bromoxynil; Metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate or antibiotics such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin.
  • biocides such as phosphinotricin, glyphosate, sulfonylurea and imidazolinone or bromoxynil
  • Metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate or antibiotics such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin.
  • pathogen resistance genes such as insect, fungal, bacterial and / or virus resistance genes can also be advantageously used in the method according to the invention.
  • pathogen resistance genes such as insect, fungal, bacterial and / or virus resistance genes can also be advantageously used in the method according to the invention.
  • So-called metabolism inhibitors such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) are also suitable as selection markers.
  • reporter genes which code for easily quantifiable proteins and which, by means of their own color or enzyme activity, ensure an evaluation of the transformation efficiency, the expression site or the time.
  • Genes coding for reporter proteins see also Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (l): 29-44) such as the "green fluorescence protein” (GFP) [Chui WL et al. , Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23 (5): 12-8, 1997; Sheen et al. (1995) Plant Journal 8 (5): 777-784; Haseloff et al.
  • GFP green fluorescence protein
  • genes for enzymes such as the oxidoredetases, the transferases, the hydrolases, the lyases, the isomerases or ligases.
  • the preferred enzymes are the hydrolases.
  • Genes for pharmaceuticals such as for insulin or for the various mediators such as EPO or interferons can also be included.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • the expression cassettes can be inserted directly can be used in the plant or introduced into a vector.
  • vectors preferably expression vectors
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid to which it is attached.
  • plasmid which stands for a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • viral vector Another type of vector is a viral vector, whereby additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors can replicate autonomously in a host cell into which they have been introduced (e.g. bacterial vectors with a bacterial origin of replication).
  • vectors are advantageously integrated into the genome of a host cell when introduced into the host cell and are thereby replicated together with the host genome.
  • certain vectors can control the expression of genes to which they are operably linked. These vectors are referred to here as "expression vectors".
  • expression vectors suitable for recombinant DNA techniques are in the form of plasmids.
  • plasmid and vector can be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used vector form.
  • the invention is intended to encompass these other expression vector forms, such as viral vectors, which perform similar functions.
  • vector is also intended to include other vectors which are known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, TMV, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA.
  • the recombinant nucleic acid construct which is advantageously used in the method and which is suitable for the stable expression of the nucleic acids used in a host cell comprises one or more regulatory sequences, selected on the basis of the host cells to be used for expression, which is functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed.
  • “operably linked” means that the nucleotide sequence of interest is bound to the regulatory sequence (s) in such a way that expression of the nucleotide sequence is possible and they are linked to one another, so that both sequences have the predicted sequence ascribed to the sequence Perform function (for example in an in vitro transcription / translation system or in a host cell when the vector is introduced into the host cell).
  • regulatory sequence is intended to encompass promoters, enhancers and other expression control elements (for example polyadenylation signals). These regulatory sequences are described, for example, in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), or see: Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton , Florida, ed. : Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108, including the literature therein. Regulatory sequences include those that control the constitutive expression of a nucleotide sequence in many host cell types and those that control the direct expression of the nucleotide sequence only in certain host cells under certain conditions. The person skilled in the art knows that the design of the expression vector can depend on factors such as the selection of the host cell to be transformed, the extent of expression of the desired protein, etc.
  • the recombinant nucleic acid constructs and vectors used can be used for stable expression in algae (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology .1, 3: 239-251) and preferably in cells of multicellular plants (see Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988 ) "High efficiency Agrobacterium tu efaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.: 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Chapter 6/7, Pp. 71-119 (1993); FF White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol.
  • nucleic acid sequences used in single-cell plant cells such as algae
  • plant cells from higher plants eg spermatophytes, such as crops
  • plant expression vectors include those described in detail in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border ", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, MW (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, ed. : Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.
  • a plant expression cassette preferably contains regulatory sequences which can control gene expression in plant cells and are operably linked so that each sequence can fulfill its function, such as termination of transcription, for example polyadenylation signals.
  • Preferred polyadenylation signals are those derived from Agrobacterium tumefaciens-t-DNA, such as gene 3 of the Ti plasmid pTiACH5 known as octopine synthase (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) Or functional equivalents thereof, but all other terminators that are functionally active in plants are also suitable.
  • a plant expression cassette preferably contains other functionally linked sequences, such as translation enhancers, for example the overdrive sequence, which is the 5 'untranslated leader sequence from tobacco mosaic virus which contains the protein / RNA ratio increased (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
  • translation enhancers for example the overdrive sequence, which is the 5 'untranslated leader sequence from tobacco mosaic virus which contains the protein / RNA ratio increased (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
  • the plant gene expression must be operably linked to a suitable promoter which carries out the gene expression in a timely, cell- or tissue-specific manner.
  • suitable promoters are constitutive promoters (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), such as those derived from plant viruses, such as 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (see also US 5352605 and WO 84/02913) or plant promoters, such as that of the small subunit of the Rubisco described in US 4,962,028. These can advantageously be combined with the parsley ubiquitin promoter in the process according to the invention.
  • Chemically inducible promoters are particularly suitable if it is desired that the gene expression be carried out in a time-specific manner.
  • Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) and an ethanol-inducible promoter.
  • Promoters that react to biotic or abiotic stress conditions are also suitable promoters, for example the pathogen-induced PRPl gene promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), the heat-inducible hsp80 promoter Tomato (US 5,187,267), the cold-inducible alpha amylase promoter from potato (WO 96/12814) or the wound-inducible pinII promoter (EP-A-0 375 091).
  • Suitable promoters are the Napingen promoter from rapeseed (US 5,608,152), the USP promoter from Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), the oleosin
  • Arabidopsis promoter (WO 98/45461), the Phaseolin promoter from Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), the Bce4 promoter from Brassica (WO 91/13980) or the legumin B4 promoter (LeB4; Baeumlein et al., 1992 , Plant Journal, 2 (2): 233-9) and promoters which bring about the seed-specific expression in monocotyledonous plants, such as maize, barley, wheat, rye, rice, etc.
  • Suitable noteworthy promoters are the lpt2 or lptl gene promoter from barley (WO 95/15389 and WO 95/23230) or those described in WO 99/16890 (promoters from the barley hordein gene, the rice glutelin gene , the rice oryzin gene, the rice prolamin gene, the wheat gliadin gene, wheat glutelin gene, the maize zein gene, the oat glutelin gene, the sorghum kasirin gene, the Rye secalin gene).
  • the multiparallel expression of the nucleic acid sequences used in the method may be desired alone or in combination with other genes.
  • Such expression cassettes can be introduced via a simultaneous transformation of several individual expression constructs or, preferably, by combining several expression cassettes on one construct.
  • Several vectors, each with several expression cassettes can also be transformed and transferred to the host cell.
  • Promoters which bring about plastid-specific expression are also particularly suitable, since plastids are the compartment in which the precursors and some end products of lipid biosynthesis are synthesized.
  • Suitable 5 promoters such as the viral RNA polymerase promoter, are described in WO 95/16783 and WO 97/06250, and the clpP promoter from Arabidopsis, described in WO 99/46394.
  • the nucleic acid constructs or vectors can be introduced into plants 10 using conventional transformation techniques.
  • the nucleic acid constructs or vectors can be introduced into plants 10 using conventional transformation techniques.
  • transformation is intended to include a variety of methods known in the art for introducing foreign nucleic acid (e.g., DNA) into a host cell, including chemically mediated transfer, electroporation, or particle bombardment. Suitable methods for transforming or transfecting host cells, including plant cells, can be found in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 20 1989) and other laboratory manuals, such as Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, eds: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
  • Host cells which in principle are used to take up the nucleic acid
  • 25 nucleic acid construct according to the invention or the vector according to the invention are suitable, all plants or parts thereof, preferred plants are dicotyledonous or monocotyledonous plants such as rape, evening primrose, hemp, diesel, peanut, canola, flax, soy, safflower, sunflower, borage, or plants like corn, wheat,
  • 35 selected transgenic plants according to the invention are selected from the group consisting of corn, rice, triticale, wheat, rye, barley, oats, ryegrass, millet, rapeseed, evening primrose, canola, peanut, mullein, thistle, hazelnut, almond, macadamia, avocado, Laurel, wild roses, pumpkin, pistachios, sesame, flax, sunflower,
  • the promoter advantageously used in the method with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, a functional equivalent or an equivalent fragment can be isolated using standard molecular biological techniques and the sequence information provided here.
  • a homologous sequence or homologous, conserved sequence regions at the DNA or amino acid level can also be identified with the aid of comparison algorithms.
  • These can be used as hybridization probes as well as standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) Isolation of further promoter sequences useful in the method can be used.
  • nucleic acid molecule comprising a complete sequence of SEQ ID NO: 1 or a part thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using oligonucleotide primers based on this sequence or parts thereof (for example comprising a nucleic acid molecule the entire sequence or a part thereof can be isolated by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers which have been prepared on the basis of this same sequence).
  • Methods for isolating genomic DNA from plants are known to the person skilled in the art.
  • Promoters advantageous for the method according to the invention can be isolated on the basis of their homology to the nucleic acids disclosed here using the sequences or a part thereof as a hybridization probe according to standard hybridization techniques under stringent hybridization conditions.
  • isolated nucleic acid molecules can be used that are at least 18 nucleotides long and hybridize under stringent conditions with the nucleic acid molecules that comprise a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. At least 25, 50, 100, 250 or more nucleotides can also advantageously be used.
  • hybridizes under stringent conditions is intended to describe hybridization and washing conditions under which nucleotide sequences which are at least 60% homologous to one another usually remain hybridized to one another.
  • the conditions are preferably such that sequences which are at least about 65%, more preferably at least about 70% and even more preferably at least about 75% or more homologous to one another usually remain hybridized to one another.
  • stringent conditions are known to the person skilled in the art and can be found in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6.
  • a preferred, non-limiting example of stringent hybridization conditions are hybridizations in 6 x sodium chloride / sodium citrate (SSC) at about 45 ° C, followed by one or more washing steps in 0.2 x SSC, 0.1% SDS at 50 to 65 ° C.
  • hybridization conditions differ depending on the type of nucleic acid and, if organic solvents are present, for example, with regard to the temperature and the concentration of the buffer.
  • the temperature differs for example under "standard hybridization conditions” depending on the type of nucleic acid between 42 and 58 ° C in aqueous buffer with a concentration of 0.1 to 5 x SSC (pH 7.2). If there is organic solvent in the above buffer, for example 50% formamide, the temperature is about 42 ° C under standard conditions.
  • the hybridization conditions for DNA DNA hybrids are preferably, for example, 0.1 ⁇ SSC and 20 to 45 ° C., preferably between
  • RNA hybrids are preferably, for example, 0.1 ⁇ SSC and 30 ° C. to 55 ° C., preferably between 45 ° C. and 55 ° C.
  • the person skilled in the art knows how the required hybridization conditions are based on textbooks such as that mentioned above or from the following textbooks Sambrook et al. , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Harnes and Higgins (ed.) 1985,
  • the sequences are written for the purpose of optimal comparison with one another (for example, gaps can be inserted into the sequence of one promoter in order to optimally align with the other protomotor and to generate the elements that are essential for the function such as the start of transcription or the TATA box).
  • the nucleotides at the corresponding nucleotide positions are then compared. If a position in a sequence is occupied by the same nucleotide as the corresponding position in the other sequence, then the molecules at this position are homologous (ie nucleic acid "homology” as used here corresponds to nucleic acid "identity").
  • Another object of the invention are transgenic plants which contain the nucleic acid construct according to the invention or the vector according to the invention.
  • Example 1 Isolation of genomic DNA from Petroselinum crispum var. Hamburger section
  • Hamburger cut was harvested and snap frozen in liquid nitrogen. 100 mg of material were homogenized in a mortar and isolated from the homogenate genomic DNA (gDNA) using Macherey and Nagel NucleoSpin Plant-Kit according to the manufacturer's instructions. The gDNA was taken up in 100 ul TE buffer. The concentration was then determined photometrically. The yield was 1.05 ⁇ g / ⁇ l.
  • gDNA homogenate genomic DNA
  • Example 2 Isolation of the promoter from genomic DNA by means of PCR
  • oligonucleotides were derived.
  • the oligos were derived from the sequence of base pairs 1 to 22 and 982 to 959.
  • recognition sequences of restriction enzymes were added to the oligonucleotides.
  • the sequence of the oligos was:
  • PcUbi4-2fw gctctagaattcgaatccaaaaattacg
  • PcUbi4-2rev gggctgcacatacataacatatcaaga
  • the oligos were adjusted to a concentration of 20 ⁇ M and used in a PCR.
  • the PCR approach contained:
  • the 25 PCR mixture was cleaned according to the manufacturer's instructions using the Qiagen PCR cleaning kit.
  • the DNA was then taken up in 30 ⁇ l of TE buffer and completely digested with Xbal (MBI-Fermentas).
  • the restriction mixture contained: 30 ul DNA, 4 ul water, 4 ul buffer and 2 ul enzyme (MBI Fermentas). Was incubated overnight at 30 37 ° C.
  • the fragment was cloned into a binary vector with an expression cassette and uidA as a reporter gene, which had previously been opened with the restriction enzymes Xbal, Smal (MBI Fermentas)
  • the construct lbxPcUbi4-2GUS was transformed into the agrobacterial strain pGV3101 containing the plasmid pMP90 by means of electroporation and the colonies were plated on TB medium (QBiogen, Germany) containing the selection markers kanamycin, gentamycin and rifampicin and incubated at 28 ° C. for 2 days.
  • the preculture grew for 48 hours at 28oC and 120 rpm in a shaking incubator. 400 ml LB medium with the corresponding antibiotics were used for the main culture. The preculture was transferred to the main culture, which grew for 18 hours at 28 ° C. and 120 rpm.
  • the pellet was resuspended in infiltration medium (M&S medium with 10% sucrose).
  • the seedlings were transferred to pots containing the same substrate (Teku pots, 10 cm 0, LC series, manufacturer Pöppelmann GmbH & Co, Germany). 9 plants were pricked into a pot. The pots were then put back into the short day phytotron for further growth. After 10 days they came into a greenhouse cabin 16 h 340 ⁇ E 22 ° C and 8 h dark 20 ° C. Here they continued to grow for 10 days.
  • the harvested seeds were placed in the greenhouse and subjected to spray selection, or, after sterilization on agar plates, were grown with the respective selection agent. After about 10 to 14 days, the transformed resistant plants clearly differed from the dead wild-type seedlings and could be pricked into 6 cm pots.
  • Example 9 Quantitative determination of the amount of GUS mRNA in 10 leaves of transgenic Arabidopsis plants
  • the reagents for cDNA synthesis and Q-PCR reaction came from Applied Biosystems and were used according to the manufacturer's instructions. The analysis was carried out using quantitative PCR, TaqMan probes and the ABIPrism7700 (PE Aplied Biosystems) [Gibson et al. , (1996) A novel method for real time
  • Oligol 5 'ccatctcataaataacgtcatgcattac 3' probe: 5 'tgtaaatcatcgcaagaccggcaacag 3' 01igo2: 5 'aacatttggcaataaagtttcttaaga 3' 30
  • the probe was labeled with FAM (fluorescein), the quencher was TAMRA (rhodamine)
  • a 35 probe system was used to compare the amount of total RNA used, which detects the mRNA of the ubiquitin-conjugating enzyme 18 (Ubil8):
  • Oligol 5 'agttcacccgaaaagcaacg 3'
  • Probe 5 'cccactgataatgatcgatatgtgaagaactgc 3'
  • 01igo2 5 'cgtcatggaaccaccacct 3'
  • the probe was marked with VIC (trade name), the quencher was TAMRA.
  • the Ct value for Ubil8 mRNA determined for each plant was subtracted from the Ct value for GUS mRNA determined from the same reaction mixture.
  • the delta Ct value calculated from this is a relative value and a measure of the amount of GUS mRNA which was contained in a certain amount of mRNA (Tab. 3).
  • the Q-PCR is followed over 40 cycles. Samples with a Ct value of 40 are negative because they did not develop any fluorescence above the background even in the 40 cycle.
  • Table 3 Ct values for Tl plants containing the constructs D35S35SGUS or PcUbi4-2GUS.
  • Tl lines were selected from each construct to determine the expression of GUS in the progeny. To this end, 10 offspring were raised from each line and leaves were harvested 3 weeks after sowing, and the amount of GUS transcript was determined using qPCR as described.
  • the fluctuation range within the T2 of a line is smaller in the progeny of the lbxPcUbiGUS plants (Tab. 4).
  • Table 4 Determination of GUS expression in progeny of transgenic Arabidopsis plants. The median of the delta Ct values is given from the measurement of 10 T2 plants in each line and the range of the measured values.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur stabilen Expression von nukleinsäuren in transgenen Pflanzen unter der kontrolle eines Petersilie-Ubiquitin -Promoters (PCUbi4-2). Dieser aus Petersilie (Petroselinum crispum) isolierte Promoter zeigt in fast allen transgenen Pflanzen eine starke konstitutive Epxression in nahezu allen pflanzlichen Geweben einschliesslich der Samen. Er enthält unter anderem ein mögliches Hitzeschock induzierbares Element (HSE). Weiterhin betrifft die Erfindung Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren, transgene Pflanzen sowie die Verwendung dieser transgenen Pflanzen zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

Description

VERFAHREN ZUR STABILEN EXPRESSION VON NUKLEINSÄUREN IN TRANSGENEN PFLANZEN UNTER DER KONTROLLE EINES PETERSILIE-UBIQUITIN-PROMOTERS
5 Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur stabilen Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen.
10 Weiterhin betrifft die Erfindung Nukleinsäurekonstrukte,
Vektoren, transgene Pflanzen sowie die Verwendung dieser transgenen Pflanzen zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
15 Verschiedene Methoden zum Einschleusen von Genen in das Genom von Pflanzen sind bekannt (Haiford NG, Shewry PR, Br Med Bull 2000; 56 (1) : 62-73 ) . Ziel ist die Herstellung von Pflanzen mit vorteilhaften, neuen Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität, zur Qualitätssteigerung bei
20 Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika (Dunwell JM, J Exp Bot. 2000.51 Spec No:487-96).
Zudem sind die natürlichen Abwehrmechanismen der Pflanze zum Beispiel gegen Pathogene unzureichend.
25 Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren oder mikro- biellen Quellen kann beispielsweise die Abwehr verstärken. Beispiele sind der Schutz gegen Insektenfraß in Tabak durch Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin unter Kontrolle des 35 S CaMV Promotors (Vaeck et al . , Nature 1987, 328, 33-37)
30 oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des 35SCaMV Promotors (Broglie et al . , Science 1991, 254, 1194-1197).
Ferner kann durch die Einführung fremder Gene eine Herbizid- 35 resistenz erzielt werden, was die Anbaubedingungen optimiert und Ernteverluste verringert (Ott KH et al., J Mol Biol . 1996; 263(2) :359-368) .
Auch kann die Qualität der Erzeugnisse verbessert werden. So kann 40 die Haltbarkeit und Lagerfähigkeit von Ernteerzeugnissen zum Beispiel durch Inaktivierung bestimmter Reifungsgene erhöht werden. Gezeigt wurde dies zum Beispiel an der Tomate durch Inaktivierung der Polygalacturonase (Hamilton AJ et al . , Curr Top Microbiol Immunol 1995; 197: 77-89). 45 Weiterhin können durch das Einführen weiterer Gene vorteilhaft von Stoffwechselgenen in Pflanzen bestimmte Produkte und Nebenprodukte natürlich vorkommender Stoffwechselprozesse für ein breites Spektrum an Industrien, einschließlich der Futtermittel-, Nahrungsmittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie, nutzbar gemacht werden. Zu diesen gemeinsam als "Feinchemikalien" bezeichneten Molekülen gehören beispielsweise Vitamine, Aminosäuren, Kohlenhydrate oder Lipide und Fettsäuren, unter denen eine beispielhafte Klasse die mehrfach ungesättigten Fettsäuren ( olyunsaturated fatty acids, PUFAs) sind. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren werden beispielsweise Nahrungsmittel für Kinder zugegeben, um einen höheren Nährwert dieser Nahrungsmittel zu erzeugen. PUFAs haben zum Beispiel einen positiven Einfluss auf den Cholesterinspiegel im Blut von Menschen und eignen sich daher zum Schutz gegen Herzkrankheiten. Fettsäuren und Triglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereich.
Eine Grundvoraussetzung für die transgene Expression bestimmter Gene in Pflanzen ist die Bereitstellung pflanzenspezifischer Promotoren. Verschiedene pflanzliche Promotoren sind bekannt. Dabei kann zwischen konstitutiven Promotoren, die eine lokal und zeitlich nur wenig beschränkte Expression in verschiedenen Teilen einer Pflanze ermöglichen, und spezifischen Promotoren, die eine Expression nur in bestimmten Teilen oder Zellen einer Pflanze (z.B. Wurzel, Samen, Pollen, Blättern etc.) oder nur zu bestimmten Zeitpunkten der Entwicklung gestatten, unterschieden werden. Konstitutive Promotoren werden vorteilhaft für die Expression sogenannter Selektionsmarker verwendet. Selektions- marker (z.B. Antibiotika- oder Herbizidresistenzgene) erlauben es, das Transformationsereignis aus der Vielzahl der nicht transformierten, aber ansonsten identischen pflanzlichen Individuen herauszufiltern .
In allen Fällen ist es notwendig die Expression der zu exprimierenden Gene abhängig von der Aufgabe der Gene gezielt zu steuern. Alle exprimierten Gene in allen Organismen besitzen 5' der kodierenden Sequenz eine Promotorregion. Diese Region ist für den Start der Transkription selbst verantwortlich als auch für die Regulation der Transkription. Diese Regulation findet in der Regel statt durch Bindung von Transkriptionsfaktoren an regulatorische Sequenzen innerhalb der Promotorregion. Promotoren sind in der Regel innerhalb einer Spezies frei portierbar, d.h. man kann einen Promotor von einem Gen ver- wenden, um die Transkription eines anderen Gens zu steuern.
Diese Steuerung des neuen Gens ist dann in der Regel identisch zur Steuerung der originären Gens von dem der Promotor stammt. Man kann somit mit einem bekannten Promotor, dessen Regulation man kennt, die Expression eines beliebigen Gens in bekannter Weise steuern. Dies gilt nicht mehr generell, sobald man den Promotor in anderen Spezies verwendet. So werden beispielsweise Promotoren aus dem Bakterium Streptomyces nicht oder nur schlecht in dem Bakterium E. coli erkannt. Gleiches gilt für Promotoren tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, die nicht ohne weiteres wechselseitig oder in Mikroorganismen verwendet werden können.
Konstitutive in Pflanzen aktive Promotoren sind bislang relativ selten beschrieben. Zu nennen sind der TR-Doppelpromotor aus Agrobacterium tumefaciens, die Promotoren der vakuolären ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991) sowie der Ppcl Promotor aus Mesembryanthemum crystallinum (Cushman et al . (1993) Plant Mol Biol 21:561-566).
Die derzeit in Pflanzen überwiegend verwendeten konstitutiven Promotoren sind fast ausschließlich viralen oder bakteriellen Ursprungs beispielsweise aus Agrobacterium. Dabei handelt es sich im einzelnen um den Nopalinsynthase (nos) Promotor [Shaw et al . (1984) Nucleic Acids Res . 12 (20) : 7831-7846] , den Mannopin- synthase ( as) promotor [Comai et al . (1990) Plant Mol Biol 15 (3) .373-381] und den Octopinsynthase ( ocs) Promotor [Leisner and Gelvin (1988) Proc Natl Acad Sei USA 85 (5 ): 2553-2557] aus Agro- jbacterium tu_ne.facie.ns oder der CaMV35S Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus (US 5,352,605). Dieser ist der am häufigsten verwendete Promotor in Expressionssystemen mit ubiquitärer und andauernder Expression [Odell et al.(1985) Nature 313:810-812; Battraw and Hall (1990) Plant Mol Biol 15:527-538; Benfey et al . (1990) EMBO J 9 (69) : 1677-1684; US 5,612,472], Der häufig als konstitutiver Promoter angewandte CaMV 35S Promotor zeigt jedoch Variationen in der Aktivität in unterschiedlichen Pflanzen und in unterschiedlichen Geweben derselben Pflanze [Atanassova et al. (1998) Plant Mol Biol 37:275-85; Battraw and Hall (1990) Plant Mol Biol 15:527-538; Holtorf et al . (1995) Plant Mol Biol 29:637-646; Jefferson et al . (1987) EMBO J 6:3901-3907]. Ein weiterer Nachteil des 35S Promotors ist, das er beispielsweise bei einer Infektion mit dem Blumenkohlmosaikvirus und seinen typischen pathogenen Varianten die Expression des Transgens verändert wird. So sind Pflanzen, die das BAR Gen (Bialaphos- Resistenzgen, Alanylalanylphosphinothricin) unter der Kontrolle des 35S Promotors exprimieren nicht mehr resistent nach Infektion mit dem Virus, der in der Natur typischerweise vorkommt [Al-Kaff et al. (2000) Nature Biotechnology 18:995-99]. Als Alternative zum CaMV 35S Promotor aus dem Bereich viraler Promotoren wurde der Sugarcane bacilliform badnavirus (ScBV) beschrieben [Schenk et al . (1999) Plant Mol Biol 39 (6) : 1221-1230] , der ein dem CamV ähnliches Expressionsmuster vermittelt. Die Aktivität des ScBV Promotors wurde in transienten Expressionsanalysen mit verschiedenen zweikeimblättrigen Pflanzen, darunter Nicotiana tabacum und N. benthamiana, Sonnenblume und Raps, und einkeimblättrigen Pflanzen, wie Banane, Mais und Hirse, analysiert. In den transienten Analysen in Mais war das ScBV Promotor vermittelte Expressionsniveau vergleichbar mit dem des Ubiquitin-Promotors aus Mais (s. unten). Weiterhin wurde die ScBV Promotor-vermittelte Expressionsrate in transgenen Bananen- und Tabakpflanzen getestet und zeigte in beiden Pflanzenspezies im wesentlichen konstitutive Expression.
Als gängige Promotoren zur Expression von Selektionsmarkern in Pflanzen werden vor allem der nos-Promotor, aber auch der mas- und ocs-Promotor verwendet, die allesamt aus Agrobacterium- Stämmen isoliert wurden.
Der Verwendung viraler Sequenzen wird seitens des Verbrauchers oft mit großem Vorbehalt begegnet . Diese Bedenken werden nicht zuletzt durch Untersuchungen genährt, die die Sicherheit des 35S CaMV Promotors - aufgrund eines möglichen horizontalen Gen- transfers bedingt durch einen Rekombinations-"Hot Spot" - in Frage stellen [Ho MW et al . (1999) Microbial Ecology in Health and Disease 11:194-197; Cummins J et al . (2000) Nature Bio- technology 18:363]. Ein Ziel künftiger biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist daher der Ersatz viraler genetischer Elemente durch regulatorische pflanzliche Elemente, um so nah wie möglich am pflanzlichen System zu bleiben.
Aufgrund der herrschenden Bedenken hinsichtlich viraler Promotoren gibt es umfangreiche Bemühungen, diese durch pflanz- liehe Promotoren zu ersetzen. Ein den viralen Elementen vergleichbarer Promotor pflanzlicher Herkunft ist bislang jedoch noch nicht beschrieben worden.
Beschrieben wurde ein pflanzlicher Ubiquitin-Promotor aus Arabidopsis thaliana [Callis et al.(1990) J Biol Chem 265:12486- 12493; Holtorf S et al . (1995) Plant Mol Biol 29:637-747]. Eigene Untersuchungen zeigten jedoch, dass der Arabidopsis Ubiquitin Promotor für die Expression von Selektionsmarkergenen ungeeignet ist . Von Christensen et al . wurden mit den beiden Mais-Ubiquitin Promotoren Ubi-1 und Ubi-2 weitere Promotoren beschrieben, die neben einer konstitutiven Grundexpression eine Hitzeinduzier- barkeit zeigen (US 5,510,474; US 6,020,190 und US 6,054574). Das Expressionsmuster der beiden Promotoren Ubi-1 und Ubi-2 aus Mais wird in Plant. Mol. Biol., (1992), 18 (4) : 675-689 beschrieben. Während der Ubi-1 Promotor in Mais und anderen monokotylen Pflanzen gute Expressionsaktivität aufweist, zeigt er in der dikotylen Tabakpflanzen nur 10 % der Aktivität, die in vergleich- baren Experimenten mit dem viralen 35S Promotor erzielt worden waren. Der Mais Ubi-1 Promotor ist damit für die Überexpression von Genen in monokotylen Pflanzensystemen geeignet. Er ist darüber hinaus auch hinreichend stark genug, um eine Herbizid- Resistenz durch Expression von Selektionsmarkern zu vermitteln [Christensen and Quail (1996) Transgenic Res 5 (3 ) .213-218] . Für dikotyle Expressionssysteme erwies sich der Ubi-1 promotor jedoch als ungeeignet .
In WO01/18220 wird ein Ubiquitin Regulatorsystem beschrieben, dem die Heatshock-Elemente fehlen, das heißt, dass nicht mehr hitzeinduzierbar ist. Diese Regulatorsystem wurde ausgehend von dem Mais Ubi-Promotorsystem durch entfernen der hitzeinduzier- baren Elemente entwickelt.
Ubiquitine sind omnipresente Proteine, die in allen bisher analysierten Eukaryonten gefunden wurden. So werden von Kawalleck et al. [Plant Molecular Biology, 21, 1993: 673-684] zwei Petersilie (Petroselinum crispum) Ubiquitine ubi4-l und ubi4-2 beschrieben. Von ubi4-2 konnte der Promotor isoliert werden. Unter den von Kawalleck et al. untersuchten Bedingungen konnte keine Hitzeinduzierbarkeit von ubi4-l und ubi4-2 gezeigt werden.
Ein Vergleich der Organspezifität und Stärke verschiedener konstitutiver Promotoren wurde von Holtorf [Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 2 (4) : 637-6469] anhand stabil transformierter Arabidopsis-Pf1anzen durchgeführt. Die Studie umfasste u.a. den CaMV35S-Promotor, den blattspezifischen Thionin-Promotor aus Gerste und den Arabidopsis Ubiquitin-Promotor (UBQ1) . Die höchste Expressionsrate zeigte der CaMV35S-Promotor . Anhand der Ver- wendung eines zusätzlichen translationalen Enhancers (TMV omega element) konnte die Expressionsrate des Promotors bei unveränderter Organspezifität um das Zwei- bis Dreifache gesteigert werden. Der blattspezifische Thionin-Promotor aus Gerste war in der Mehrzahl der transformierten Linien inaktiv, während der UBQ1 Promotor aus Arabidopsis mittlere Expressionsraten ergab. McElroy und Mitarbeiter berichteten von einem auf dem Reis Actin 1 (Actl) Promotor basierenden'Konstrukt zur Transformation monokotyler Pflanzen [McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231:150-1609]. Insgesamt wurde aus den zuvor beschriebenen Untersuchungen geschlussfolgert , dass die auf dem Actl-Promotor basierenden Expressionsvektoren dazu geeignet sind, eine hinreichend starke und konstitutive Expression von Fremd-DNA in transformierten Zellen monokotyler Pflanzen zu steuern.
Als konstitutiver Promotor ist ferner der Promotor einer
S-Adenosyl-L-Methionin Synthetase beschrieben (WO 00/37662) . Nachteilig ist hier vor allem eine Abhängigkeit der Expressionsstärke von der Methioninkonzentration.
WO 99/31258 beschreibt chimäre, konstitutive pflanzliche
Promotoren, die sich aus verschiedenen Elementen verschiedener Promotoren mit komplementären Expressionsmustern zusammensetzen, so dass die Kombination einzelner Gewebespezifitäten additiv zu einem konstitutiven Expressionsmuster führt . Dies ist ein sehr aufwendiges Verfahren zur Herstellung von scheinbar konstitutiven Promotoren.
Weiterhin sind Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen beschrieben worden. Die Stringenz der Spezifität, als auch die Expressionsaktivität dieser Promotoren ist sehr unterschiedlich. Zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten, wie der Promotor der zytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1, 5-bisphosphatcarboxylase) , der ST-LSI Promotor aus Kartoffel [Stockhaus et al . (1989) EMBO J 8:2445-2245], der vorwiegend blattspezifische Ferredoxin NADPH Oxidoreduktase-Promotor (FNR-Promotor) , der ein lichtinduzierbares Element besitzt [Oel- müller et al . (1993) Mol. Gen. Genet. 237:261-72] oder der blatt- spezifische Promotor des Triose-Phosphat-Translokators (TPT) .
Weitere Promotoren sind beispielsweise Promotoren mit Spezifität für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel, der Promotor der Stärke Synthase
(GBSS1) oder der Sporamin Promotor, fruchtspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A 409625), fruchtreifungsspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifungspezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794) , blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen-Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).
Ein entwicklungsabhängig regulierter Promotors ist unter anderem bei Baerson et al . beschrieben (Baerson SR, Lamppa GK (1993) Plant Mol Biol 22 (2) : 255-67) .
Es sind Promotoren beschrieben mit Gewebespezifität für das Mesophyll und die Pallisadenzellen in Blättern (Broglie et al . (1984) Science 234:838-845), den sich teilenden Spross und das Wurzelmeristem [Atanassova et al . (1992) Plant J 2:291-300], Pollen [Guerrero et al . (1990) Mol Gen Genet 224:161-168], Samen- endosperm [Stalberg et al. (1993) Plant Mol Biol 23:671-6839, Wurzelepideπrtis [Suzuki et al . (1993) Plant Mol Biol 21:109-119], sowie für das Wurzelmeristem, Wurzelgefäßgewebe und Wurzel- knötchen [Bogusz et al . (1990) Plant Cell 2:633-641].
Bekannt sind ferner Promotoren, die eine Expression in Samen und pflanzlichen Embryonen steuern. Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseolins [US 5,504,200, Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9) : 839-53] , des 2S Albumingens [Joseffson LG et al . (1987) J Biol Chem 262:12196-12201], des Legumins [Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215 (2) : 326-331] , des USP [unknown seed protein; Bäumlein H et al . (1991) Molecular & General Genetics 225 (3) :459-67] des Napin Gens [Stalberg K, et al. (1996) Planta 199:515-519], des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor [Bäumlein H et al.(1991) Mol Gen Genet 225:121-128]. Diese steuern eine samenspezifische Expression von Speicherproteinen.
Viele der vorgenannten Promotoren zeigen neben der Haupaktivität noch sogenannte Nebenaktivitäten in anderen Geweben.
Aufgrund des gewebeabhängigen Expressionsmusters sind die vor- genannten gewebespezifischen Promotoren schlecht geeignet für die Expression von Selektionsmarkern. Hier ist eine Selektion in möglichst allen Gewebeteilen erforderlich, um eine effiziente Selektion zu gewährleisten. Die im Stand der Technik beschriebenen, sogenannten "konstitutiven" Promotoren weisen einen oder mehrere der nachfolgenden Nachteile auf :
1. Mangelhafte Homogenität der Expression:
Die bekannten, sogenannten "konstitutiven" Promotoren zeigen vielfach eine unterschiedliche Expressionshöhe je nach Gewebe- oder Zelltyp. Zudem ist die Expressions- eigenschaft oft stark von dem Insertionsort des Wirtsgenoms abhängig. Dies zeigt, dass die durch heterologe Expression zu erzielenden Effekte nicht in dem gleichen Ausmaß homogen in der Pflanze erreicht werden können. Es kann zu Unteroder Überdosierungen kommen. Dies kann sich nachteilig auf das Pflanzenwachstum oder den Pflanzenwert auswirken.
2. Mangelhaftes Zeitprofil:
Die im Stand der Technik bekannten sogenannten "konstitu- tiven" Promotoren zeigen oft eine nicht konsistente Aktivität während der Entwicklung eines Gewebes. Damit können zum Beispiel in der frühen Phase der so atischen Embryogenese keine wünschenswerten Effekte (wie Selektion) erzielt werden, was gerade hier - aufgrund der Empfindlichkeit des Embryos gegen in vitro Bedingungen und Stressfaktoren - vorteilhaft wäre.
3. Mangelnde Anwendbarkeit auf viele Pflanzenarten:
Die im Stand der Technik beschriebenen sogenannten "konstitu- tiven" Promotoren sind oft nicht in allen Arten in gleicher Weise aktiv.
4. Gene Silencing
Beim Vorliegen mehrerer Expressionskassetten mit jeweils dem gleichen "konstitutiven" Promotor in einem Organismus kann es zu Wechselwirkungen zwischen denselben und sogar zum Abschalten ("Gene Silencing") einzelner Expressionskassetten kommen [Mette et al . (1999) EMBO J 18:241-248].
Virale und bakterielle Promotoren
Promotoren viralen Ursprungs können durch Virusinfektionen der transgenen Pflanze beeinflusst werden und die gewünschte Eigenschaft dann nicht mehr ausprägen [Al-Kaff et al . (2000) Natur Biotechnology 18:995-99]. Die öffentliche Akzeptanz gegenüber der Verwendung von Promotoren und Elementen aus pflanzlichen Systemen ist höher als bei viralen Systemen.
Die Zahl der für die Expression von Selektionsmarkern in Pflanzen geeigneten Promotoren ist gering und sie sind gewöhnlicher Weise viralen oder bakteriellen Ursprungs.
Ein idealer konstitutiver Promotor sollte möglichst zahlreiche der nachfolgenden Eigenschaften haben:
a) Möglichst homogene lokale und zeitliche Genexpression d.h. eine Expression in möglichst vielen Zelltypen oder Geweben eines Organismus während der verschiedenen Phasen des Ent- wicklungszyklus. Eine wünschenswerte Expression sollte schon im EmbryonalStadium erfolgen. Gewünscht wird ferner eine effiziente Selektion in dedifferenzierten Zellen (verschiedenen Kallus-Phasen) aus einer Gewebekultur und weiteren Entwicklungsstadien, die für die Gewebekultur geeignet sind.
b) Möglichst breite Anwendbarkeit auf verschiedene Pflanzenarten bzw. Anwendbarkeit auf Arten, in denen mit den bisher bekannten "konstitutiven" Promotoren keine Expression erreicht werden kann.
c) Um eine Kombination von mehreren Transgenen in einer Pflanze zu realisieren, ist es wünschenswert, mehrere Transformationen hintereinander zu schalten oder Konstrukte mit mehreren Promotor-Kassetten zu verwenden, ohne dass durch die mehrmalige Verwendung identischer regulatorischer Sequenzen Silencing-Effekte erzeugt werden.
d) Einen pflanzlichen Ursprung zur Vermeidung von Akzeptanz- Problemen beim Konsumenten und eventuellen zukünftigen Zulassungsproblemen.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand daher in der Bereitstellung eines Verfahrens zur stabilen Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen unter der Kontrolle eines pflanzlichen Promotors, der möglichst viele der oben genannten Eigenschaften erfüllt, vor allem eine ubiquitäre und entwicklungsunabhängige (konstitutive) Expression einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz - vorteilhaft kodierend für einen Selektionsmarker - vermittelt. Weiterhin bestand die Auf- gäbe darin ein Nukleinsäurekonstrukt für das Expressionsverfahren zur Verfügung zu stellen, das ein möglichst breite Expression der exprimierten Nukleinsäure in verschiedenen pflanzlichen Geweben einer Pflanzenart ermöglicht und breit in verschiedenen Pflanzen anwendbar ist .
Diese Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur Expression von 5 Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen unter der Kontrolle eines Petersilie-Ubiquitin-Promotors gelöst, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst:
a) Verknüpfung der zu exprimierenden Nukleinsäure mit einem 10 Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 oder
b) einem funktionellen Äquivalent oder äquivalenten Fragment, das im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie a) besitzt und
15 b) Einbringen des Nukleinsäurekonstrukts in eine Pflanze, das aus der zu exprimierenden Nukleinsäure, die unter der Kontrolle der 5 '-Region des unter a) oder b) genannten Promotors liegt, und dem Promotor gebildet wird, unter
20 Bedingungen die die stabile Integration der Nukleinsäure in das Pflanzengenom ermöglicht.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren zu exprimierende Nukleinsäure kann vorteilhaft mit weiteren regulatorischen Sequenzen 25 funktioneil verknüpft sein.
Expression im Sinne des Verfahrens umfasst die Transkription der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz , kann aber - im Falle eines offenen Leserasters in "sense"-Orientierung - 30 auch die Translation der transkribierten RNA der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in ein korrespondierendes Polypeptid umfassen.
Eine Promotoraktivität wird im wesentlichen als gleich bezeich- 35 net, wenn sich die Transkription/Translation beispielsweise des im folgenden beschriebenen GUS-Gens [= ß-Glucuronidasegen, uidA, Jefferson, R.A. , Kavanagh, T.A., Bevan, M.V. (1987) GUS fusions: ß-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907; Martin, T., Wöhner, R.V. , 40 Hummel, S., Willmitzer, L., Frommer, W.B. (1992) The GUS reporter System as a tool to study plant gene expression. In: Gallagher (Hrsg.) : GUS Protocols : Using the GUS gene as a reporter of gene expresion. Academic Press, 23-43] um nicht mehr als 50 %, vorteilhaft um nicht mehr als 40 %, bevorzugt um nicht mehr als 45 30 %, besonders vorteilhaft um nicht mehr als 20 %, ganz besonders vorteilhaft um nicht mehr als 10 % von einem Vergleichswert, der mit dem unter SEQ ID NO: 1 ermittelt wurde, unterscheidet. Dabei kann die Expressionshöhe sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu einem Vergleichswert abweichen.
Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, 5 gemessen anhand der transkribierten mRNA, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um nicht mehr als 50, bevorzugt 25 %, besonders bevorzugt 10 % von einem Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO: 1 beschriebenen Promotor unterscheidet. Bevorzugt ist ferner als Vergleichswert die Expressionshöhe er-
10 halten mit einer beliebigen, aber bestimmten Nukleinsäuresequenz, bevorzugt solchen Nukleinsäuresequenzen, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren. Vorteilhaft werden dabei Reporter- Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol . 1999; 13(l):29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Chui
15 WL et al., Curr Biol 1996, 6:325-330; Leffel SM et al., Bio- techniques . 23(5):912-8, 1997), die Chloramphenicoltransferase oder eine Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10:324-414) oder die ß-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson et al . , EMBO J. 1987, 6,
20 3901-3907) verwendet.
Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete vorgenannte Peter- silie-Ubiquitin-Promotor zeigte im Nukleinsäurekonstrukt eine vorteilhafte starke Expression der exprimierten Nukleinsäuren
25 in nahezu allen pflanzlichen Geweben, einschließlich dem der Samen. Vorteilhafterweise führt das erfindungsgemäße Verfahren zu einer stabilen starken Expression der Nukleinsäuren in einer sehr großen Zahl an Individuen. Das heißt die im erfindungs- gemäßen Verfahren exprimierte Nukleinsäure bzw. die exprimierten
30 Nukleinsäuren (der Singular soll für die Anmeldung den Plural und umgekehrt umfassen) wird/werden sehr gleichmäßig innerhalb der transgenen Pflanzen unabhängig von ihrem Insertionsort und unabhängig vom Gewebe exprimiert . Das sogenannte Gene Silencing bei dem die zu exprimierenden Nukleinsäuren bzw. Gene durch Inter-
35 aktionen im Genom des Wirtsorganismus im Falle des vorliegenden Verfahrens innerhalb der transgenen Pflanze in ihrer Expressionsaktivität herunterreguliert oder sogar ganz abgeschaltet werden, tritt nicht oder nur sehr unwesentlich auf. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird damit eine starke Expression der Nukleinsäuren
40 in mindestens 60 %, vorteilhaft mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 % der im Verfahren erzeugten transgenen Pflanzen erreicht. Das Verfahren bzw. das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt ist damit unempflindlich gegenüber epi-
45 genetischen Einflüssen. Figur 2 zeigt diese vorteilhafte Eigenschaft des erfindungsgemäßen Verfahrens an der GUS-Färbung von Blättern transgener C24 Arabidopsis Pflanzen, die das GUS-Gen (= ß-Glucoronidase-Gen, uidA) unter Kontrolle des PcUbi4-2 Promotors aus P. crispum wieder. Es wurden 48 unabhängige Tl-Linien untersucht . Figur 1 ist der Aufbau eines vorteilhaft verwendeten Vektors zu entnehmen. Ein Vergleich mit dem Stand der Technik, bei dem das GUS-Gen hinter den d35S-Promotor geschaltet wurde, ist Figur 3 zu entnehmen. Es zeigen sich deutlich die vorteilhaften Eigenschaften des Verfahrens. Figur 3 gibt die GUS-Färbung von Blättern transgener C24 Arabidopsis Pflanzen enthaltenden das GUS-Gen unter Kontrolle des d35S-Promotors wieder. Es wurden ebenfalls 48 unabhängige Tl-Linien untersucht. Der d35S-Promotor zeigte außerdem noch eine unterschiedliche Expressionsstärke innerhalb eines Blattes einer Pflanze, das heißt er zeigt eine mosaikartige Expression abhängig von der verschiedenen Situation innerhalb eines Blattes einer Pflanze. Dem gegenüber ist das Expressionsverhalten unter Kontrolle des PcUbi4-2 Promotors innerhalb eines Blattes einer Pflanze sehr homogen, das heißt es zeigt sich keine mosaikartige Expression. Das Verfahren ermöglicht damit die starke gleichmäßige Expression von Genen in stabil transformierten Pflanzen.
Unter gleichmäßig starker Expression im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass innerhalb eines pflanzlichen Gewebes mindestens 60 %, vorteilhaft mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevor- zugt mindestens 95 %, der Zellen eines Gewebes eine Expression der Nukleinsäure aufweisen.
Neben der starken Expression im Blatt wird im erfindungsgemäßen Verfahren auch in anderen Geweben eine starke Expression der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren erreicht. So wird ebenfalls eine starke Expression in der Knospe, in der Blüte, in der Wurzel, im Stengel und im Samen erreicht. Figur 4 gibt die Expression einer transgenen C24 Arabidopsis Pflanze, die das GUS-Gen unter Kontrolle des Pc-Ubi4-2 Promotors aus P. crispum enthält, in der Knospe wieder. Die dunkelgrauen Bereiche zeigen die Expression der ß-Glucoronidase. In Figur 5 wird die GUS- Färbung der Blüte einer transgenen C24 Arabidopsis Pflanze, die das GUS-Gen unter Kontrolle des Pc-Ubi4-2 Promotors aus P. crispum enthält, wiedergegeben. Die dunkelgrauen Bereiche sind auf die enzymatische Aktivität der exprimierten ß-Glucoronidase zurückzuführen. Auch in der Wurzel ist eine starke Expression in transgenen C24 Arabidopsis Pflanzen, die das GUS-Gen unter Kontrolle des Pc-Ubi4-2 Promotors aus P. crispum enthalten, zu beobachten, wie Figur 6 zu entnehmen ist. Auch hier geben die dunkelgrauen Bereiche die Aktivität der ß-Glucoronidase wieder. Gleiches gilt auch für die Expression in Samen wie Figur 7 zu entnehmen ist. Figur 7 zeigt die GUS-Färbung von Samen transgener C24 Arabidopsis Pflanzen, die das GUS-Gen unter Kontrolle des Pc-Ubi4-2 Promotors aus P. crispum (mitte und rechts) oder unter Kontrolle des d35S-Promotors (links) enthalten. Der dunkelgraue Überstand spiegelt die ß-Glucoronidase-Aktivität wieder. Es ist klar zu erkennen, das der Pc-Ubi4-2 Promotor eine stärkere Aktivität im Samen aufweist, als der d35S-Promotor.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird damit eine starke Expression der verwendeten Nukleinsäuren in fast allen transgenen Pflanzen erreicht. Außerdem erfolgt diese starke Expression vorteilhaft in allen untersuchten pflanzlichen Geweben. Das Verfahren und die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte sind daher vorteilhaft zur Expression einer praktisch unbegrenzten Zahl von Genen in Pflanzen wie monokotyle oder dikotyle Pflanzen vorteilhaft dikotyle Pflanzen geeignet. Vorteilhaft können Selektionsgene unter Kontrolle des vorteilhaften Promotors im Verfahren exprimiert werden. Die Expression erfolgt vorteilhaft konstitutiv, eine Induktion über beispielsweise eine Hitzeeinwirkung ist jedoch denkbar. Figur 8 gibt die für die Funktion des Promotors wichtigen Elemente wie ein mögliches putatives Hitzeschock induzierbares Element (= HSE, Position 534-547) wieder. Dies kann die Expression noch verstärken. Das HSE liegt innerhalb des Intron-Bereiches . Dieses Hitzeschock induzierbare Element stimmt nicht mit den von Mycogen angegebenen Consensus- Sequenzen 5 ' -CTNGAANNTTCNAG-3 ' bzw. CTGGAATNTTCTAGA-3 ' (US 5,510,474) oder mit dem von Drosophila (US 6.054,574, Spalte 18, Zeile 59-64) überein und wurde bei einer Promtoranalyse auf pflanzliche cis-aktive Elemente mit der Internetseite PLACE nicht als HSE erkannt. Außerdem befindet sich das Intron im Unterschied zu den in den Mycogen-Patenten annotierten HSE im Intron und nicht wie von Mycogen beschrieben 5 'relativ und damit upstream zum Intron.
Figur 8 sind außerdem folgende weitere Elemente zu entnehmen, die mit dem von Higo et al . [(1999) Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database : 1999 , Nucl. Acid. Res., Vol. 27, No.l, 297-300] gefunden wurden:
a) Zwei CAAACAC-Ele ente, Position 264 bis 270 und 716 (Gegen- sträng) , konserviert in vielen Speicherproteinpromotoren, notwendig für die Expression des napA-Promotors in Samen [Stalberg K, Ellerstom M, Ezcurra I, Ablov S, Rask L Disruption of an overlapping E-box/ABRE motif abolished high transcription of the napA storage-protein promoter in 'transgenic Brassica napus seeds. Planta 199:515-519 (1996)] b) Zwei AACAAAC-Elemente, Position 140 bis 146 und 461 (Gegenstrang) , wichtig für endosperm-spezifische Expression [Wu C, Washida H, Onodera Y, Harada K, Takaiwa F Quantitative nature of the Prolamin-box, ACGT and AACA motifs in a rice glutelin
5 gene promoter: minimal cis-element requirements for endo- sperm-specific gene expression Plant J 23: 415-421 (2000)]
c) Eine TATA-Box (TATATATA) im Bereich 291 bis 297 und damit im erwarteten Abstand zum Transkriptionsstart bei Position 237.
10 [Joshi CP. An inspection of the domain between putative TATA box and translation start site in 79 plant genes. Nucleic Acids Research. 15 ( 16 ): 6643-53 , 1987 Aug 25.]
Die unter a) bis c) genannten Elemente sind in Figur 8 durch 15 Boxen markiert, wobei die AACAAAC- und CAAACAC-Boxen des Gegenstranges extra hervorgehoben sind. Der Transkriptionsstart ist mit einem Pfeil markiert. Außerdem enthält der Promotor unmittelbar vor dem Translationsstart ein Intron (Position 396 bis 982, siehe Fig. 8). Auf das Intron folgt (nicht angegeben) unmittelbar 20 das Startkodon ATG.
Mit dem Programm wurden außerdem folgende weitere putative Elemente des Promotors identifiziert:
25 Insgesamt vier ACGTA-Boxen (Positionen 214, 674, 692, 880) wichtig u.a. auch für Zuckerrepression und die Expression in Samen. Abzisinsäure-responsives Element (227) [Hattori T, Totsuka M, Hobo T, Kagaya Y, Yamamoto-Toyoda A Experimentally Determined Sequence Requirement of ACGT-Containing Abscisic Acid Response
30 Element Plant Cell Physiol 43: 136-140 (2002)]; Mehrere „Amylase- Boxen", Positionen 139, 421 (Gegenstrang), 462 (Gegenstrang), 789 (Gegenstrang) und 871 (Gegenstrang) [Huang N, Sutliff TD, Litts JC, Rodriguez RL Classification and characterization of the rice alpha-amylase multigene fa ily. Plant Mol Biol 14:655-668
35 (1990)]; Ein CACGTG-Motif in Position 565, u.a. in lichtregulierten Promotoren vorhanden [Menkens AE, Schindler U, Cashmore AR The G-box: a ubiquitous regulatory DNA element in plants bound by the GBF family of bzip proteins Trends in Biochemistry 20:506-510 (1995)]; Insgesamt 16 GATA-Boxen, beteiligt an starker licht-
40 abhängiger Expression [Gilmartin PM, Sarokin L, Memelink J, Chua N-H Molecular light Switches for plant genes. Plant Cell 2:369-378 (1990)]; 5 GTl-Consensus-Bindestellen (GRWAAW) , die in vielen licht-regulierten Genen vorhanden sind, finden sich in Position 395, sowie auf dem Gegenstrang die Positionen 52,
45 387, 504 und 647 [Villain P, Mache R, Zhou DX The mechanism of GT element-mediated cell type-specific transcriptional control. J Biol Chem 271:32593-32598 (1996)]; Eine Ibox (GATAAG) findet sich in Position 474 auf dem Gegenstrang. Dabei handelt es sich um ein konserviertes Element in lichtregulierten Promotoren [Rose A, Meier I, Wienand U The tamato I-box binding factor LeMYBI is a member of a novel RT class of Myb-like proteins Plant J 20: 641-652 (1999)]; Ein LTRE (low-temperature-responsive element), CCGAAA, findet sich in Position 632 [Dünn MA, White AJ, Vural S, Hughes MA Identification of promoter elements in a low- temperature-responsive gene (blt4.9) from barley (Hordeum RT vulgäre L.) Plant Mol Biol 38:551-564 (1998)]; Mehrere Binde- stellen für verschiedene Klassen von myb-Transkriptionsfaktoren [Jin H. Martin C. Multifunctionality and diversity within the plant MYB-gene family. Plant Molecular Biology. 41 (5) : 577-85 , 1999 Nov.]; Mehrere W-Box-Bindungsstellen (549, 61, 550, 919), welche durch WRKY-Transkriptionsfaktoren gebunden werden. Die Faktoren sind an unterschiedlichen physiologischen Prozessen, wie Pathogenabwehr, Seneszens und Trichombildung beteiligt [Eulgem T, Rushton PJ, Robatzek S, So ssich IE RT The WRKY superfamily of plant transcription factors RL Trends Plant Sei (2000) 5:199-206] .
Für die Funktion des Promotors ist die angegebene TATA-Box (siehe Figur 8) wesentlich. Sie sollte vorteilhaft in einem Bereich von -20 bis -50, bevorzugt von -25 bis -35, zum Transkriptionsstart liegen.
Ein Sequenzvergleich zwischen PcUbi4-2 und den Ubi-Promotor aus Mais zeigt, dass die Gene von Mais und P. crispum auf Nucleotid- ebene zu 66,1 % identisch sind, während die Promotoren zu 26 % identisch sind, das heißt es besteht für AT-reiche Promotoren keine signifikante Identität (Gap opening penalty 15, Gap extension penalty 6,66) [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410, Altschul et al . , 1997, Nucl. Acid Res., 25:3389-3402]. In Blast werden die Promotoren gegenseitig nicht gefunden.
Der im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft verwendete Ubiquitin-Promotor erwies sich als hinreichend stark, um Nuklein- säuresequenzen insbesondere Selektionsmarkergene in Dikotyledonen und Monokotyledonen erfolgreich stabil integriert im Genom der Pflanze zu exprimieren. Dies ist umso überraschender als sich der Arabidopsis thaliana Ubiquitin-Promotor [Holtorf et al . (1995) Plant Mol Biol 29:637-646] als nicht geeignet erwies.
Dieser vorteilhaft verwendete Ubiquitin-Promotor kann mit Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, weiter für seine Aufgabe optimiert werden. Der Fachmann kann über den in den Beispielen gegebenen Assay mit Hilfe der ß-Glucuronidase leicht verbesserte Mutanten des Promotors isolieren.
Mutationen umfassen dabei Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation des Ubiquitin-Promotors gemäß SEQ ID NO: 1 erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen essentiellen Promotor-Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung überflüssiger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum Beispiel weiterer regulatorischer Sequenzen, sein.
Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z.B.
Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese , "primer repair" , Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Über- hängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymeraseketten- reaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid- Primer kommen .
Funktionelle Äquivalente oder funktioneile Fragmente, abgeleitet von SEQ ID NO : 1 zum Beispiel durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden, haben eine Homologie von mindestens 30 %, bevorzugt 50 %, vorzugsweise mindestens 70 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 %, und zeichnen sich durch im wesentlichen gleiche Eigenschaften wie der Petersilie Ubiquitin Promotor gemäß SEG ID NO: 1 aus .
Diese funktionellen Äquivalente lassen sich künstlich erzeugen oder aber aus verschiedenen Organismen wie Pflanzen durch Homologievergleiche und biochemische Tests isolieren.
Alternativ können nicht-essentielle Sequenzen des Petersilie Promotors deletiert werden ohne die Promotor Eigenschaft wesentlich zu beeinträchtigen. Derartige Deletionsvarianten stellen funktioneil äquivalente Teile des Promoters beschrieben durch SEQ ID NO: 1 dar.
Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren zur stabilen Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen verwendet, die für ein Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Selektionsmarker, einem Reportergen, einem RNAi-Konstrukt, einem Enzym, einem Protein das Insekten-, Virus-, Bakterien-, Pilzoder Nematodenresistenz vermittelt, einer Nukleinsäuresequenz oder einem Protein, das Trocken-, Kälte-, Hitze- oder Salz- resistenz in Pflanzen vermittelt, einem Inhibitor, einem Lektin, einer RNAase, einem Ribozym, einem Antikörper, einem Vaccin, einem Pharmazeutikum, einem "antifreezing"-Protein, einem Cytochrom P-450-Protein, einem Transkriptions-Aktivator oder -Repressor oder einem Protein, das an der Biosynthese von Fein- Chemikalien beteiligt ist, codieren.
Bevorzugt ist das Protein, das an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt ist, ein Protein aus dem Fettsäurestoffwechsel, dem Aminosäurestoffwechsel, dem Vitamin-Stoffwechsel, dem Carotinoidstoffwechsel oder dem Kohlenhydratstoffwechsel .
Sollen neben den vorgenannten Genen weitere Gene bzw. Nukleinsäuren im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden, so können diese ebenfalls unter der Kontrolle des Ubiquitin- Promotors aus Petersilie exprimiert werden, oder aber vorteilhaft unter Kontrolle weiterer Promotoren. Diese können konsti- tutiv, induzierbar und/oder gewebespezifisch sein.
Die im Verfahren zu exprimierende Nukleinsäure kann in sense oder antisense-Richtung oder sense- und antisense-Richtung (= dsRNAi) zum Promotor orientiert sein und damit exprimiert werden .
Vorteilhaft wird das im Verfahren verwendete Nukleinsäurekon- strukt zwischen zwei T-DNA-Abschnitte inseriert. Dies erleichtert die stabile Integration ins Pflanzengenom.
Bei der im Verfahren verwendeten transgenen Pflanze handelt es sich um eine monokotyle oder dikotyle Pflanze, vorteilhaft um eine dikotyle Pflanze.
Als monokotyle Pflanzen seien beispielsweise Monokotyledonen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Reis, Triticale, Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Ryegras oder Hirse genannt.
Als dikotyle Pflanzen seien beispielsweise Dikotyledonen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ra s, Nachtkerze, Canola, Erdnuss, Königskerze, Distel, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Wildrosen, Kürbis, Pistazien, Sesam, Lein, Sonnenblume, Färberdistel, Soja, Borretseh, Mohn, Senf,
Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Zuckerrübe, Tomate, Kartoffel, Tabak, Karotte, Pappel, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Aubergine, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss oder Arabidopsis genannt.
Wie oben genannt, können die im erfindungsgemäßen Verfahren ver- wendeten Nukleinsäuren konstitutiv oder induzierbar exprimiert werden. Eine konstitutive Expression ist bevorzugt.
Werden im Verfahren beispielsweise Feinchemikalien hergestellt, so können die durch die Expression der Nukleinsäuren in den transgenen Pflanzen entstandenen Produkte nach Kultivierung der Pflanzen aus diesen isoliert werden. Dabei können die Produkte aus Kalluskulturen, aus Fermentationskulturen oder aus kultivierten und geernteten Pflanzen oder Pflanzenteilen wie Blätter, Stengel, Wurzel, Blüte oder Samen über dem Fachmann bekannte Methoden isoliert werden.
Als ein Beispiel für eine Feinchemikalie, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt und isoliert werden kann, seien beispielhaft Fettsäureester mit mehrfach unge- sättigten Cis-, C2n- und/oder C2 -Fettsäuremolekülen genannt. Diese können in Form eines Öls oder Lipids beispielsweise in Form von Verbindungen wie Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide wie Glycoshingolipid, Phospholipide wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phoshatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol oder Diphosphatidyl- glycerol, Monoacylglyceride, Diacylglyceride, Triacylglyceride oder sonstige Fettsäureester wie die AcetylCoenzymA-Ester, die die mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei bevorzugt drei Doppelbindungen enthalten, isoliert werden. In der Regel liegen die verschiedenen vorgenannten Verbindungen (Fettsäureester und frei Fettsäuren) in der Pflanze in einer ungefähren Verteilung von 80 bis 90 Gew.-% Triglyceride, 2 bis 5 Gew.-% Diglyceride, 5 bis 10 Gew.-% Monoglyceride, 1 bis 5 Gew.-% freie Fettsäuren, 2 bis 8 Gew.-% Phospholipide vor, wobei sich die Summe der verschiedenen Verbindungen zu 100 Gew.-% ergänzt .
Vorteilhaft können im erfindungsgemäßen Verfahren Linolsäure (C18:2), Linolensäure (C18:3), Arachidonsäure (ÄRA) oder Eicosa- pentaensäure (EPA) hergestellt und isoliert werden.
Vorteilhaft werden dabei im erfindungsgemäßen Verfahren Pflanzen verwendet, die zu den Öl-produzierenden Pflanzen gehören, das heißt die für die Herstellung von Ölen verwendet werden, wie Öl- fruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel) , Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Sesam, Calendula, Punica, Nachtkerze, Königskerze, Distel, Wildrosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Kürbis, Lein, Soja, Pistazien, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss oder Walnuss) oder Feldfrüchte, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa oder Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee) , Salix-Arten sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Bevorzugte Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel), Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis, Lein, Soja, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss) . Besonders bevorzugt sind C18:2- und/oder C18 : 3-Fettsäure reiche Pflanzen wie Sonnenblume, Färberdistel, Tabak, Königskerze, Sesam, Baumwolle, Kürbis, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Lein, Hanf, Distel oder Färberdistel. Ganz besonders bevorzugt sind Pflanzen wie Färberdistel, Sonnenblume, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Lein oder Hanf.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden bei der Herstellung von PUFAS Nukleinsäuren exprimiert, die beispielsweise für Poly- peptide mit Δ-5-, Δ-6-Desaturase- oder Δ-6-Elongaseaktivität codieren. Je nach Auswahl der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Pflanze lassen sich Mischungen der verschiedenen vorgenannten Verbindungen oder einzelne Verbindungen wie EPA oder ÄRA in freier oder gebundener Form herstellen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren sind unter transgenen Pflanzen auch Pflanzenzellen, -gewebe, -organe oder ganze Pflanzen zu verstehen, die zur Expression von Nukleinsäuren geeignet sind. Unter Anzucht ist beispielsweise die Kultivierung der transgenen Pflanzenzellen, -gewebe oder -organe auf einem Nährmedium oder der ganzen Pflanze auf bzw. in einem Substrat beispielsweise in Hydrokultur oder auf einem Ackerboden zu verstehen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können prinzipiell alle Nukleinsäuren verwendet werden. Vorteilhaft Stammen diese Nukleinsäuren aus Pflanzen wie Algen, Diatomeen, Moosen oder höheren Pflanzen, sie können aber auch von Mikroorganismen wie Pilzen, Hefen oder Tieren wie Nematoden, Insekten oder dem Menschen stammen.
Unter transgener Pflanze im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom einer Pflanze stabil integriert sind, dabei können die Nukleinsäuren homolog oder hetero- log exprimiert werden. Tansgen bedeutet aber auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegen- über der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor.
Transgene Pflanzen, die die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimierten Nukleinsäuren enthalten, können direkt vermarktet werden ohne die synthetisierten Verbindungen zu isolieren. Unter Pflanzen im erfindungsgemäßen Verfahren sind alle Pflanzenteile, Pflanzenorgane wie Blatt, Stiel, Wurzel, Knollen oder Seimen oder die gesamte Pflanze zu verstehen. Der Samen umfasst dabei alle Samenteile wie die Samenhüllen, Epidermis- und Samenzellen, Endo- spe m oder Embyrogewebe . Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen können aber auch aus den Pflanzen in Form der freien Produkte beispielsweise ihrer Öle, Fett, Lipide und/ oder freien Fettsäuren isoliert werden. Durch dieses Verfahren hergestellte Verbindungen lassen sich durch Ernten der Organismen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder vom Feld ernten. Dies kann beispielsweise im Falle von Ölen in dem Fachmann bekannter Weise über Pressen oder Extraktion der Pflanzenteile bevorzugt der Pflanzensamen erfolgen. Dabei können die Öle, Fette, Lipide und/oder freien Fettsäuren durch sogenanntes kalt schlagen oder kalt pressen ohne Zuführung von Wärme durch Pressen gewonnen werden. Damit sich die Pflanzenteile speziell die Samen leichter aufschließen lassen, werden sie vorher zerkleinert, gedämpft oder geröstet. Die so vorbehandelten Samen können anschließend gepresst werden oder mit Lösungsmittel wie warmen Hexan extrahiert werden. Anschließend wird das Lösungsmittel wieder entfernt. Auf diese Weise können mehr als 96 % der im Verfahren hergestellten Verbindungen isoliert werden. Anschließend werden die so erhaltenen Produkte weiter bearbeitet, das heißt raffiniert. Dabei werden zunächst die Pflanzenschleime und Trüb- Stoffe. Die sogenannte Entschleimung kann enzymatisch oder beispielsweise chemisch/physikalisch durch Zugabe von Säure wie Phosphorsäure erfolgen. Anschließend werden die freien Fettsäuren durch Behandlung mit einer Base beispielsweise Natronlauge entfernt. Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung der im Produkt verbliebenen Lauge mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Um die noch im Produkt enthaltenen Farbstoffe zu entfernen werden die Produkte einer Bleichung mit beispielsweise Bleicherde oder Aktivkohle unterzogen. Zum Schluss wird das Produkt noch beispielsweise mit Wasserdampf noch desodoriert . Unter dem Begriff "Öl" oder "Fett" wird ein Fettsäuregemisch verstanden, das ungesättigte, gesättigte, vorzugsweise veresterte Fettsäure (n) enthält. Bevorzugt ist, dass das Öl oder Fett einen hohen Anteil an ungesättigter, unkonjugierter veresterter Fett- säure (n), insbesondere Linolsäure, γ-Linolensäure, Dihomo-γ- linolensäure, Arachidonsäure, α-Linolensäure, Stearidonsäure, Eicosatetraensäure oder Eicosapentaensäure hat. Vorzugsweise ist der Anteil an ungesättigten veresterten Fettsäuren ungefähr 30 %, mehr bevorzugt ist ein Anteil von 50 %, noch mehr bevorzugt ist ein Anteil von 60 %, 70 %, 80 % oder mehr. Zur Bestimmung kann z.B. der Anteil an Fettsäure nach Überführung der Fettsäuren in die Methylestern durch Umesterung gaschromatographisch bestimmt werden. Das Öl oder Fett kann verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren enthalten. Insbesondere kann je nach Ausgangspflanze der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in dem Öl oder Fett schwanken.
Aus den so im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen der allgemeinen Formel I lassen sich die enthaltenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren beispielsweise über eine Alkalibehandlung beispielsweise wässrige KOH oder NaOH oder saure Hydrolyse vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol oder über eine enzymatische Abspaltung freisetzen und isolieren über beispielsweise Phasentrennung und anschließender Ansäuerung über z.B. H2S04. Die Freisetzung der Fettsäuren kann auch direkt ohne die vorhergehend beschriebene Aufarbeitung erfolgen.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung der transgenen Pflanze oder der aus den Pflanzen gewonnenen Produkte in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Saatgut, Feinchemikalien, Kosmetika oder Pharmazeutika.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Nukleinsäure- konstrukt zur stabilen transgenen Expression von Nukleinsäuren im erfindungsgemäßen vorgenannten Verfahren enthaltend
a) einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 oder
b) funktioneile Äquivalente oder äquivalente Fragmente, das im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) besitzt,
wobei a) oder b) funktioneil mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind. Vorteilhaft enthält das Nukleinsäurekonstrukt mindestens ein weiteres Element ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
a) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, oder
b) das Nukleinsäurekonstrukt zusätzliche Funktionselemente enthält, oder
c) das zwischen dem Promotor und der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ein Polylinker vorhanden ist, oder
d) das Nukleinsäurekonstrukt mindestens eine weitere Nuklein- säure unter Kontrolle des Promotors gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines funktionellen Äquivalents oder äquivalenten Fragments oder eines weiteren Promotors enthält.
Zur vorteilhaften Integration des Nukleinsäurekonstrukt in das Genom der transgenen Pflanze wird das Nukleinsäurekonstrukt zwischen zwei T-DNA-Abschnitten (= T-DNA-Borders) inseriert.
Unter T-DNA-Abschnitten (= T-DNA-Borders) versteht der Fachmann einen Abschnitt, der die Übertragung von DNA in eine Pflanze ermöglicht. Die T-DNA besitzt eine sogenannte rechte und linke T-DNA-Border, die den Transfer des zwischen ihnen liegenden Bereiches vermitteln. Wichtig für diese Übertragung sind zwei nahezu identische ca. 25 bp lange Sequenzen (rechte und linke T-DNA-Border) , die die T-DNA auf dem Ti-Plasmid flankieren und die von einer Ti-Plasmid codierten Nuklease erkannt werden. Diese Nuklease ist in der Lage, einen Einzelstrang der T-DNA aus dem Plasmid herauszuschneiden, der dann in das Pflanzengenom an einer beliebigen Stelle stabil inseriert wird. So können . beliebige Nukleinsäuresequenzen ins Pflanzengenom inseriert werden.
Die im Nukleinsäurekonstrukt transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz wird ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäuren bestehend aus einem Selektionsmarker, einem Reportergen, einem RNAi-Konstrukt, einem Enzym, einem Protein das Insekten-, Virus-, Bakterien-, Pilz- oder Nematodenresistenz vermittelt, einer Nukleinsäuresequenz oder einem Protein, das Trocken-, Kälte-, Hitze- oder Salzresistenz in Pflanzen vermittelt, einem Inhibitor, einem Lektin, einer RNAase, einem Ribozym, einem Antikörper, einem Vaccin, einem Pharmazeutikum, einem "antifreezing"-Protein, einem Cytochrom P-450-Protein, einem Transkriptions-Aktivator oder -Repressor oder einem Protein, das an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt ist.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäure- konstrukte sind nach Einbringung in eine Pflanzenzelle bzw. Pflanze stabil in das Genom der Wirtszelle integriert . Bei der Integration in das Genom kann die Integration zufallsgemäß sein oder durch derartige Rekombination erfolgen, dass das native Gen durch die eingebrachte Kopie ersetzt wird, wodurch die Produktion der gewünschten Verbindung durch die Zelle moduliert wird, oder durch Verwendung eines Gens in trans, so dass das Gen mit einer funktionellen Expressionseinheit, welche mindestens eine die Expression eines Gens gewährleistende Sequenz und mindestens eine die Polyadenylierung eines funktioneil transkribierten Gens gewährleistende Sequenz enthält, funktioneil verbunden ist. Vorteilhaft werden die Nukleinsäuren in einem Nukleinsäurekonstrukt in Form von sogenannten Multiexpressionskassetten oder Konstrukte zur multiparallelen Expression von Genen in die Pflanzen gebracht.
Wie oben beschrieben, ist für die vorliegende Erfindung eine Integration der Nukleinsäuren bzw. der kodogenen Genabschnitte im Genom der Pflanzen angestrebt. Dabei kann ein bestimmter kodogener Genabschnitte als fortlaufende kodierende Sequenz (ORF) integriert sein oder ein oder mehrere Introns beinhalten. Ist letzteres der Fall, werden derartige Sequenzen im Zuge der Expression durch die Pflanze in der Regel gespleißt, wobei das Spleißmuster dem des Spenderorganismus entsprechen kann, aber nicht muss .
Grundsätzlich können die Nukleinsäuren in das extranukleare Genom, z.B. dem Piastidengenom, einer Pflanze integriert sein. Erfindungsgemäß bevorzugt ist allerdings die Integration in das nukleare Genom.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, die Sequenzen, welche die heterologen kodogene Genabschnitte umfassen, stabil in das Genom der Pflanzen zu integrieren. Dies ist verbunden mit einem oder mehreren der folgenden Aspekte :
* die Anzahl an Kopien einer bestimmten Nukleinsäure bzw. eines bestimmten kodogenen Genabschnitts pro Zelle ist während des Lebenszyklus einer Pflanze im Wesentlichen konstant;
* die Anzahl an Kopien einer Nukleinsäure bzw. eines bestimmten kodogenen Genabschnitts pro Zelle ist bestimmbar; * die Nukleinsäure bzw. der kodogene Genabschnitt ist als Merkmal der Pflanze vererbbar, bei nuklearer Integration nach den Mendelschen Regeln.
In der Regel beträgt die Anzahl an integrierten Kopien einer Nukleinsäure bzw. eines bestimmten kodogenen Genabschnitts pro Zelle weniger als 20 und in den meisten Fällen weniger als 10. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Pflanzen mit Zellen, die etwa 1 bis 5 Kopien und insbesondere 1 Kopie einer Nukleinsäure bzw. eines bestimmten kodogenen Genabschnitts umfassen. Die Anzahl an Kopien pro Zelle können in an sich bekannter Weise mittels „Southern-Blot"-Analyse (Extraktion der genomischen DNA, restriktionsenzymatischer Verdau, elektrophoretische Auftrennung, Membrantransfer, Hybridisierung mit markierter DNA-spezifischer Sonde) oder quantitativer PCR bestimmt werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die vorteilhaft heterologen Nukleinsäuren bzw. kodogenen Genabschnitte im Genom der transgenen Pflanzen von T-DNA- Sequenzen, insbesondere von Agrobakterium-Ti-Plasmidsequenzen, einseitig oder vorzugsweise beidseitig flankiert. Dies ist ebenfalls Ausdruck der erfindungsgemäßen stabilen Integration der kodogenen Genabschnitte in das Genom der Pflanzen.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt kann dann zum Einbringen in die transgenen Pflanze in einen Vektor inseriert werden. Es kann aber auch direkt in die Pflanze eingebracht werden.
Unter der Verwendung von Klonierungsvektoren in Pflanzen und bei der Pflanzentransformation, wie denjenigen, die veröffentlicht sind in und dort zitiert sind: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and
Utilization, Hrsgb. : Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molee . Biol. 42 (1991), 205-225)), lassen sich die Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäurekonstrukte zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an Pflanzen verwenden, so dass diese ein besserer oder effizienterer Produzent eines oder mehrerer der vorgenannten Produkte, wird. Diese verbesserte Produktion oder Effizienz der Produktion kann durch direkte Wirkung der Manipulation oder eine indirekte Wirkung dieser Manipulation hervorgerufen werden.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen werden im Verfahren vorteilhaft in Form eines Nukleinsäurekonstrukts, die die stabile Expression der Nukleinsäuren in Pflanzen ermöglicht, in die Pflanze eingebracht.
Vorteilhafte für die Konstruktion der Nukleinsäurekonstrukte (= Expressionskonstrukt = Genkonstrukt) verwendbare Promotor/ Terminator-Konstrukte in pUC19 werden in SEQ ID NO: 2 bis 6 wiedergegeben. Dabei werden Nukleinsäuren beispielsweise die für die bei der Herstellung von PUFAS verwendeten Desaturasen und/oder die für die Elongasen codierenden Nukleinsäuresequenzen mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktioneil verknüpft. Der vorgenannte Upiquitin-Promotor kann in diesen Konstrukten vorteilhaft Anstelle eines oder aller der angegebenen und vorhandenen Promotoren oder in Kombination mit den genannten oder anderen Promotoren verwendet werden. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktioneil verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 ' -Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die zu exprimierenden Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette
{ = Genkonstrukt) enthalten sein. Vorteilhaft liegt nur jeweils eine Kopie der Gene in der Expressionskassette vor. Dieses Genkonstrukt oder die Genkonstrukte können zusammen im Wirtsorganismus exprimiert werden. Es ist vorteilhaft für die Insertion weiterer Gene im Wirtsgenom, wenn die zu exprimierenden Gene zusammen in einem Genkonstrukt vorliegen. Dir vorgenannten Promotor/Terminator-Konstrukte bestehen vorteilhaft aus wenigstens zwei funktionellen Einheiten wie einem Promotor und einem Terminator. Zwischen Promotor und Terminator können neben der im Verfahren zu exprimierenden Nukleinsäure weitere gewünschte Gensequenzen wie Targetting-Sequenzen, Kodierregionen von weiteren Genen oder Teilen davon etc . eingefügt werden. Zum Aufbau von Expressionskassetten werden Promotoren und Terminatoren (USP Promotor: Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3) : 459-67 ) ; OCS Terminator: Gielen et al . EMBO J. 3 (1984) 835ff.) mithilfe der Polymerasekettenreaktion isoliert und mit flankierenden Sequenzen nach Wahl auf Basis von synthetischen Oligonukleotiden maßgeschneidert.
Folgende Oligonukleotide können beispielsweise verwendet werden:
USP1 vorne : CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA USP2 vorne : CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA USP3 vorne : CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA USP1 hinten:AAAACTGCAGGCGGCCGCCCACCGCGGTGGGCTGGCTATGAAGAAATT USP2 hinten:CGCGGATCCGCTGGCTATGAAGAAATT
USP3 hinten:TCCCCCGGGATCGATGCCGGCAGATCTGCTGGCTATGAAGAAATT OCSl vorne: AAAACTGCAGTCTAGAAGGCCTCCTGCTTTAATGAGATAT 0CS2 vorne: CGCGGATCCGATATCGGGCCCGCTAGCGTTAACCCTGCTTTAATGAGATAT 0CS3 vorne : TCCCCCGGGCCATGGCCTGCTTTAATGAGATAT OCSl hinten:CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGAATTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA 0CS2 hinten:CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGAATTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA 0CS3 hinten: CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA
Die Methoden sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind allgemein literaturbekannt.
In einem ersten Schritt werden ein Promotor und ein Terminator über PCR amplifiziert . Dann wird der Terminator in ein Empfänger- plasmid kloniert und in einem zweiten Schritt der Promotor vor den Terminator inseriert. Mithin erhält man eine Expressionskassette auf einem Trägerplasmid vorteilhaft kann hierfür pUC19 verwendet werden, jedoch ist auch die Verwendung jedes anderen gängigen Vektors möglich.
Die Promotor/Terminator-Konstrukte sind in SEQ ID NO: 2 bis 6 (pUTl = SEQ ID NO: 2, pUT2 = SEQ ID NO : 3, pUT3 = SEQ ID NO: 4, PUT12 = SEQ ID NO: 5, pUT123 = SEQ ID NO: 6) wiedergegeben. Sie enthalten beispielhaft den USP-Promotor und den OCS Terminator. Auf Basis dieser Plasmide lassen sich in dem Fachmann bekannter- weise Nukleinsäurekonstrukte herstellen, die die zu exprimierenden Nukleinsäuren enthalten. Auf diese Weise wird ein Set von Multiexpressionskassetten geschaffen, dass für die Insertion gewünschter Nukleinsäuren genutzt werden kann und in Tabelle 1 beschrieben wird und zudem noch weitere Expressionskassetten aufnehmen kann.
5 Diese enthalten folgende Elemente:
Tabelle 1
10
15
20
Figure imgf000028_0001
25 Weiterhin lassen sich wie beschrieben und wie in Tabelle 2 näher spezifiziert weitere Multiexpressionskassetten mithilfe des
i) USP-Promotors oder mithilfe des ii) 700 Basenpaare 3 ' -Fragmentes des LeB4-Promotors oder mithilfe
30 des iii) DC3-Promotors erzeugen und für samenspezifische Genexpression einsetzen.
Der DC3-Promotor ist beschrieben bei Thomas, Plant Cell 1996,
35 263:359-368 und besteht lediglich aus der Region -117 bis +26 weshalb er mithin einer der kleinsten bekannten samenspezifischen Promotoren darstellt . Die Expressionskassetten können mehrfach den selben Promotor enthalten oder aber über drei verschiedene Promotoren aufgebaut werden.
40
45 Tabelle 2: Multiple Expressionskassetten
0
5
0
Figure imgf000029_0001
EcoRV Schnittstelle schneidet im 700 Basenpaarfragment des LeB4 Promotors (LeB4-700) 5
Analog lassen sich weitere Promotoren für Multigenkonstrukte erzeugen insbesondere unter Verwendung des
a) im erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Ubiquitin- 0 Promotors (siehe SEQ ID NO: 1) und/oder b) des 2 , 7 kB Fragmentes des LeB4-Promotors und/oder c) des Phaseolin-Promotors und/oder d) des konstitutiven v-ATPase cl-Promotors .
*5 Es kann weiterhin wünschenswert sein, weitere geeignete Promotoren zum Aufbau samenspezifischer Multiexpressions- kassetten wie z.B. den Napin-Promotor oder den Arcelin-5 Promotor zu verwenden.
0 Die im Nukleinsäurekonstrukt vorteilhaft vorhanndenen zusätzlichen regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der 5 Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Genetische regulatorische Sequenzen umfassen ferner auch die 5 ' -untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3 ' -Region von Genen. Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5 ' -untranslatierte Sequenzen die transiente vorteilhaft die stabile Expression heterologer Gene verstärken können.
Vorteilhafte weitere Regulationssequenzen für das neue Verfahren, die zusätzlich im Nukleinsäurekonstrukt vorhanden sein können, liegen beispielsweise in Promotoren vor, wie in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al . , Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al . , Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor vor. In diesem Zusammenhang vorteilhaft sind ebenfalls induzierbare Promotoren, wie die in EP-A-0 388 186 (Benzylsulfonamid- induzierbar) , Plant J. 2, 1992:397-404 (Gatz et al . , Tetra- cyclin-induzierbar) , EP-A-0 335 528 (Abzisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbar) beschriebenen Promotoren. Weitere geeignete Pflanzenpromotoren sind der Promotor von cytosolischer FBPase oder der ST-LSI-Promotor der Kartoffel (Stockhaus et al . , EMBO J. 8, 1989, 2445), der Phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase-Promotor aus Glycine max (Genbank-Zugangsnr. U87999) oder der in EP-A-0 249 676 beschriebene nodienspezifische Promotor. Vorteilhaft sind auch samenspezifische Promotoren, wie der ausführungsgemäße USP Promotor aber auch andere Promotoren wie der LeB4-, DC3 , Phaseolin- oder Napin-Promotor . Weitere besonders vorteilhafte Promotoren sind samenspezifische Promotoren, die für monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden können und in US 5,608,152 (Napin-Promotor aus Raps), WO 98/45461 (Oleosin- Promotor aus Arobidopsis) , US 5,504,200 (Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris) , WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica) , von Baeumlein et al . , Plant J., 2, 2, 1992:233-239 (LeB4- Promotor aus einer Leguminose) beschrieben sind, wobei sich diese Promotoren für Dikotyledonen eignen. Die folgenden Promotoren eignen sich beispielsweise für Monokotyledonen lpt-2- oder lpt-1-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230), Hordein-Pro otor aus Gerste und andere, in WO 99/16890 beschriebene geeignete Promotoren.
Es ist im Prinzip möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen, wie die oben genannten, für das neue Verfahren zu verwenden. Es ist ebenfalls möglich und vorteilhaft, zusätzlich oder alleine synthetische Promotoren zu verwenden, besonders wenn sie eine Samen-spezifische Expression vermitteln, wie z.B. beschrieben in WO 99/16890.
Weitere vorteilhafte Samen-spezifische Promotoren können prinzipiell sowohl aus dikotyledonen als auch aus monokotyledonen Pflanzen isoliert werden. Im folgenden sind vorteilhafte bevorzugte Promotoren aufgeführt: USP (= unknown seed protein) und Vicilin (Vicia faba) [Bäumlein et al . , Mol. Gen Genet., 1991, 225(3)], Napin (Raps) [US 5,608,152], Acyl-Carrier Protein (Raps) [US 5,315,001 und WO 92/18634], Oleosin (Arabidopsis thaliana) [WO 98/45461 und WO 93/20216], Phaseolin (Phaseolus vulgaris) [US 5,504,200], Bce4 [WO 91/13980], Leguminosen B4 (LegB4- Promotor) [Bäumlein et al . , Plant J., 2,2, 1992], Lpt2 und lpt1 (Gerste) [WO 95/15389 u. WO95/23230] , Samen-spezifische Promotoren aus Reis, Mais u. Weizen [WO 99/16890], Amy32b,
Amy 6-6 und Aleurain [US 5,677,474], Bce4 (Raps) [US 5,530,149], Glycinin (Soja) [EP 571 741] , Phosphoenol-Pyruvatcarboxylase (Soja) [JP 06/62870], ADR12-2 (Soja) [WO 98/08962], Isocitrat- lyase (Raps) [US 5,689,040] oder ß-Amylase (Gerste) [EP 781 849].
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure- induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzier- barer Promotor (Gatz et al . (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
Um eine stabile Integration der Nukleinsäurekonstrukte in die transgene Pflanze über mehrere Generation sicherzustellen, sollte jede der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines eigenen bevorzugt eines unterschiedlichen Promotors exprimiert werden, da sich wiederholende Sequenzmotive zu Instabilität der T-DNA bzw. zu Rekombinationsereignissen oder Gene Silencing führen können. Die Expressionskassette ist dabei vorteilhaft so aufgebaut, dass einem Promotor eine geeignete Schnittstelle zur Insertion der zu exprimierenden Nukleinsäure folgt vorteilhaft in einem Polylinker anschließend gegebenenfalls ein Terminator hinter dem Polylinker liegt. Diese Abfolge wieder- holt sich mehrfach bevorzugt drei-, vier- oder fünfmal, so dass bis zu fünf Gene in einem Konstrukt zusammengeführt werden und so zur Expression in die transgene Pflanze eingebracht werden können. Vorteilhaft wiederholt sich die Abfolge bis zu dreimal (siehe Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 2 bis 6) . Die Nukleinsäure- sequenzen werden zur Expression über die geeignete Schnittstelle beispielsweise im Polylinker hinter den Promotor inseriert. Vorteilhaft hat jede Nukleinsäuresequenz ihren eigenen Promotor und gegebenenfalls ihren eigenen Terminator. Es ist aber auch möglich mehrere Nukleinsäuresequenzen hinter einem Promotor und ggf. vor einem Terminator zu inserieren.
Dabei ist die Insertionsstelle bzw. die Abfolge der inserierten Nukleinsäuren in der Expressionskassette nicht von entscheidender Bedeutung, das heißt eine Nukleinsäuresequenz kann an erster oder letzter Stelle in der Kassette inseriert sein, ohne dass dadurch die Expression wesentlich beeinflusst wird. Es können in der Expressionskassette vorteilhaft unterschiedliche Promotoren wie beispielsweise der Petersilie-Ubiquitin-Promotor, der USP-, der LegB4- oder der DC3-Promotor und unterschiedliche Terminatoren verwendet werden. Es ist aber auch möglich nur einen Promotortyp in der Kassette zu verwenden. Dies kann jedoch zu unerwünschten Rekombinationsereignissen führen.
Homologe Rekombination zur stabilen Integration ist ein relativ seltenes Ereignis in höheren Eukaryoten, vor allem in Pflanzen. Zufällige Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit die zufällig integrierten Sequenzen zu entfernen und so Zeilklone mit einer korrekten homologen Rekombination anzureichern, besteht in der Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems wie in US 6,110,736 beschrieben. Dieses besteht aus drei Elementen: zwei Paaren von spezifischen Rekombinationssequenzen und einer sequenzspezifischen Rekombinase. Diese Rekombinase katalysiert eine Rekombination lediglich zwischen den beiden Paaren von spezifischen Rekombinationsequenzen. Das eine Paar dieser spezifischen DNA-Sequenzen wird außerhalb der zu integrierenden DNA-Sequenz, d.h. außerhalb der beiden homologen DNA-Sequenzen lokalisiert. Im Falle einer korrekten homologen Rekombination werden diese Sequenzen nicht mit in das Genom übertragen. Im Falle einer zufälligen Integration insertieren sie in der Regel zusammen mit dem Rest des Konstruktes. Unter Einsatz einer speziellen Rekombinase und eines Konstruktes enthaltend ein zweites Paar der spezifischen Sequenzen können die zufällig insertierten Sequenzen herausgeschnitten oder durch Inversion in- aktiviert werden, während die korrekt über homologe Rekombination insertierten Sequenzen im Genom verbleiben. Eine Vielzahl von sequenzspezifischen Rekombinationssystemen kann verwendet werden, beispielhaft sind das Cre/lox-System des Bacteriophagen Pl, das FLP/FRT System der Hefe, die Gin Recombinase des Mu Phagen, die Pin Rekombinase aus E. coli und das R/RS System des pSRl Plasmids genannt. Bevorzugt sind das Bacteriophagen Pl Cre/lox und das Hefe FLP/FRT System. Hier interagiert die Rekombinase (Cre oder FLP) spezifisch mit ihren jeweiligen RekombinationsSequenzen (34bp lox-Sequenz bzw. 47bp FRT-Sequenz) um die zwischengelagerten Sequenzen zu deletieren oder zu invertieren. Das FLP/FRT und cre/lox Rekombinasesystem wurde bereits in pflanzlichen Systemen angewendet (Odell et al . , Mol. Gen. Genet., 223:369-378, 1990.)
Wie oben beschrieben sollte die Transkription der eingebrachten Gene vorteilhaft durch geeignete Terminatoren am 3 '-Ende der eingebrachten Biosynthesegene (hinter dem Stoppcodon) abgebrochen werden. Verwendet werden kann hier z.B. der OCSl Terminator. Wie auch für die Promotoren, so sollten hier für jedes Gen unter- schiedliche Terminatorsequenzen verwendet werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktioneil verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 ' -Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz und/oder dem Promotor ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wir sorganismus (Sauer B. Methods. 1998; 14 (4) : 381-92) . Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen) , die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
Das Nukleinsäurekonstrukt kann, wie oben beschrieben, auch weitere Gene umfassen, die in die Organismen eingebracht werden sollen. Es ist möglich und vorteilhaft, in die Wirtsorganismen Regulationsgene, wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, welche durch ihre Enzymaktivität in die Regulation eines oder mehrerer Gene eines Biosynthesewegs eingreifen, einzubringen und darin zu exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein. Weiterhin können vorteilhaft im
Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt weitere Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels enthalten sein oder aber diese Gene können auf einem weiteren oder mehreren weiteren Nukleinsäurekonstrukten liegen. Vorteilhaft werden als Bio- synthesegene im Falle des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ein Gen ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase (n) , Acyl-ACP[= acyl carrier protein] -Desaturase (n) , Acyl-ACP- Thioesterase(n) , Fettsäure-Acyl-Transferase (n) , Fettsäure- Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase (n) , Acetyl-Coenzym A-Carboxy- lase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase (n) , Fettsäure-Desaturase (n) , Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure- Elongase(n) oder deren Kombinationen verwendet.
Dabei können die vorgenannten Desaturasen in Kombination mit Elongasen und anderen Desaturasen in die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte kloniert werden und zur Transformation von Pflanzen mithilfe von Agrobakterium eingesetzt werden. Weitere Transformationsmethoden sind die Protoplasten Poly- ethylenglycol- (PEG) Methode, die Protoplasten-Elektroporation, die Protoplasten-Mikroinjektion oder die balistischen Methoden.
Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektionierbaren Marker in das Nukleinsäurekonstrukt zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen beispielsweise eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid) , einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektions- marker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al . , Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84) .
Weitere Selektionsmarker sind beispielsweise selektionierbaren Marker wie Biozide wie Phosphinotricin, Glyphosat, Sulfonylurea und Imidazolinon oder Bromoxynil; Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat oder Antibiotika wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin.
Neben den vorgenannten Selektionsmarkern lassen sich im erfindungsgemäßen Verfahren auch vorteilhaft Pathogenresistenz- Gene wie Insekten-, Pilz-, Bakterien- und/oder Virenresistenz- Gene exprimieren. Diese sollten möglichst gleichmäßig innerhalb der Pflanze und/oder Pflanzengeweben exprimiert werden.
Als Selektionsmarker eignen sich auch sogenannte Metabolismus- inhibitoren wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) .
Vorteilhafte weitere Gene im Nukleinsäurekonstrukt sind Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Trans- formationseffizienz, des Expressionsortes oder -Zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Gene codierend für Reporter-Proteine (siehe auch Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol . 1999; 13(l):29-44) wie dem "green fluorescence protein" (GFP) [Chui WL et al . , Curr Biol 1996, 6:325-330; Leffel SM et al., Biotechniques . 23(5): 12-8, 1997; Sheen et al.(1995) Plant Journal 8 (5) : 777-784 ; Haseloff et al.(1997) Proc Natl Acad Sei USA 94(6) :2122-2127; Reichel et al.(1996) Proc Natl Acad Sei USA 93 (12) :5888-5893; Tian et al . (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228], der Chloramphenicoltransferase, der Luziferase [Millar et al . , Plant Mol Biol Rep 1992 10:324-414; Ow et al. (1986) Science, 234:856-859], die eine Bioluminescenz- detektion erlaubt; die ß-Galactosidase, kodiert für ein Enzym für das verschiedenen chromogene Substrate zur Verfügung stehen, die in Pflanzen aufgrund einer hohen Grundaktivität weniger bevorzugt sind; die ß-Glucuronidase (GUS) [Jefferson et al . , EMBO J. 1987, 6, 3901-3907, uidA Gen], die ein Enzym für verschiedene chromogene Substrate kodiert. Weitere Gene sind beispielsweise das xylE, die Alpha-Amylase, Tyrosinase oder Aequorin.
Weitere vorteilhafte Gene sind Gene für Enzyme wie den Oxido- reduetasen, den Transferasen, den Hydrolasen, den Lyasen, den Isomerasen oder Ligasen bevorzugte Enzyme sind die Hydrolasen.
Auch Gene für Pharmazeutika wie für Insulin oder für die ver- schiedenen Mediatoren wie EPO oder Interferone können enthalten sein.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. Die Expressionskassetten können prinzipiell direkt zum Einbringen in die Pflanze verwendet werden oder aber in einen Vektoren eingebracht werden.
Diese vorteilhaften Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, enthalten die im Verfahren verwendeten Nukleinsäurekonstrukte, die die verwendeten Nukleinsäure allein oder in Kombination mit weiteren Genen enthalten. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppel- strängige DNA-Schleife steht, in die zusätzlichen DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirts- zelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (z.B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung) . Andere Vektoren werden vorteilhaft beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben Expressionsvektoren, die für DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch diese anderen Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren, die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen. Ferner soll der Begriff Vektor auch andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, wie Phagen, Viren, wie SV40, CMV, TMV, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA, umfassen.
Die im Verfahren vorteilhaft verwendeten rekombinanten Nuklein- säurekonstrukt, die sich zur stabilen Expression der verwendeten Nukleinsäuren in einer Wirtszelle eignen, umfassen eine oder mehrere Regulationssequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist. In einem rekombinanten Nukleinsäurekonstrukt bzw Vektor bedeutet "funktionsfähig verbunden", dass die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die Regulationssequenz (en) gebunden ist, dass die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist und sie aneinander gebunden sind, so dass beide Sequenzen die vorhergesagte, der Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen (z.B. in einem In-vitro- Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird) . Der Begriff "Regulationssequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungs- signale) umfassen. Diese Regulationssequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsgb. : Glick und Thompson, Kapitel 7, 89-108, einschließlich der Literaturstellen darin. Regulationssequenzen umfassen solche, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, welche die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern. Der Fachmann weiß, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren, wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression des gewünschten Proteins usw., abhängen kann.
Die verwendeten rekombinanten Nukleinsäurekonstrukte und Vektoren können zur stabilen Expression in Algen (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology .1, 3:239-251) sowie bevorzugt in Zellen vielzelliger Pflanzen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tu efaciens-mediated trans- formation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep. : 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechno- logy, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb. : Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus , Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molee. Biol. 42 (1991), 205-225 (und darin zitierte Literaturstellen) ) nach den vorgenannten Methoden verwendet werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens können die verwendeten Nukleinsäuresequenzen in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al . , 1999, Marine Biotechnology 1 (3):239-251 und darin zitierte Literaturangaben, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z.B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation" , Nucl. Acids Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb. : Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise Regulationssequenzen, welche die Genexpression in Pflanzenzellen steuern können und funktionsfähig verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription, erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agro- bacterium tumefaciens-t-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al . , EMBO J. 3 (1984) 835ff.) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen in Pflanzen funktioneil aktiven Terminatoren sind geeigne .
Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf Transkriptionsebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbunden Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz , welche die 5' -untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711).
Die Pflanzengenexpression muss wie oben beschrieben funktions- fähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression auf rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise durchführt. Nutzbare Promotoren sind konstitutive Promotoren (Benfey et al . , EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913) oder Pflanzenpromotoren, wie der in US 4,962,028 beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco. Diese können vorteilhaft mit dem Ubiquitin-Promotor aus Petersilie im erfindungsgemäßen Verfahren kombiniert werden.
Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment notwendig sind (siehe eine Über- sieht in Kermode, Crit . Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) 285-423 und darin zitierte Literaturstellen) , beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Piastiden, wie Amylo- plasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen. Die Pflanzengenexpression lässt sich auch wie oben beschrieben über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetra- cyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al . (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte PRPl-Gen-Promotor (Ward et al . , Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), der hitzeinduzierbare hsp80- Promotor aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierbare Alpha- amylase-Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch Wunden induzierbare pinll-Promotor (EP-A-0 375 091) .
Es sind insbesondere solche zusätzlichen Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Lipid- und Ölbiosynthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos . Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Raps (US 5,608,152), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):459-67), der Oleosin-
Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461) , der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al . , 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9) sowie Promotoren, welche die samenspezifische Expression in Mono- kotyledonen-Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der lpt2- oder lptl-Gen-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die in WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem Gersten-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin- Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum- Kasirin-Gen, dem Roggen-Secalin-Gen) .
Insbesondere kann die multiparallele Expression der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen allein oder in Kombination mit anderen Genen gewünscht sein. Die Einführung solcher Expressions- kassetten kann über eine simultane Transformation mehrerer einzelner Expressionskonstrukte erfolgen oder bevorzugt durch Kombi- nation mehrerer Expressionskassetten auf einem Konstrukt. Auch können mehrere Vektoren mit mit jeweils mehreren Expressionskassetten transformiert und auf die Wirtszelle übertragen werden. Ebenfalls besonders geeignet sind Promotoren, welche die plastidenspezifische Expression herbeiführen, da Piastiden das Kompartiment sind, in dem die Vorläufer sowie einige Endprodukte der Lipidbiosynthese synthetisiert werden. Geeignete 5 Promotoren, wie der virale RNA-Polymerase-Promotor, sind beschrieben in WO 95/16783 und WO 97/06250, und der clpP- Promotor aus Arabidopsis, beschrieben in WO 99/46394.
Die Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren lassen sich in Pflanzen 10 über herkömmliche Transformationstechniken einbringen. Der
Begriff "Transformation", wie hier verwendet, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (z.B. DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich chemisch vermittelter Transfer, Elektroporation oder Teil- 15 chenbeschuss, umfassen. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, lassen sich finden in Sambrook et al . (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 20 1989) und anderen Labor-Handbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsgb: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Wirtszellen, die im Prinzip zum Aufnehmen der Nukleinsäure, des
25 erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts oder des erfindungsgemäßen Vektors geeignet sind, sind alle Pflanzen oder Teile davon, bevorzugte Pflanzen sind dikotyle oder monokotyle Pflanzen wie Raps, Nachtkerze, Hanf, Diestel, Erdnuss, Canola, Lein, Soja, Safflor, Sonnenblume, Borretsch, oder Pflanzen, wie Mais, Weizen,
30 Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee) , Salix-Arten, Bäume (Ölplame, Kokosnuss) sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Besonders bevor-
35 zugte erfindungsgemäße transgene Pflanzen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Reis, Triticale, Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Ryegras, Hirse, Raps, Nachtkerze, Canola, Erdnuss, Königskerze, Distel, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Wildrosen, Kürbis, Pistazien, Sesam, Lein, Sonnenblume,
40 Färberdistel, Soja, Borretsch, Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Zuckerrübe, Tomate, Kartoffel, Tabak, Karotte, Pappel, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Aubergine, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss oder Arabidopsis .
45 Der im Verfahren vorteilhaft verwendete Promotor mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l, einem funktionellen Äquivalent oder eines äquivalenten Fragments, kann unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken und der hier bereitgestellten SequenzInformation isoliert werden. Auch kann mithilfe von Vergleichsalgorithmen beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzbereiche auf DNA oder Aminosäureebene identifiziert werden. Diese können als Hybridisierungssonde sowie Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) zur Isolierung weiterer im Verfahren nützlicher Promotorsequenzen verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül , umfassend eine vollständige Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei Oligonukleotid- primer, die auf der Basis dieser Sequenz oder von Teilen davon, verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die vollständigen Sequenz oder einen Teil davon, durch Poly- merasekettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern isoliert werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz erstellt worden sind) . Methoden zur Isolierung von genomischer DNA aus Pflanzen sind dem Fachmann bekannt.
Für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafte Promotoren können auf der Grundlage ihrer Homologie zu der hier offenbarten Nukleinsäuren unter Verwendung der Sequenzen oder eines Teils davon als Hybridisierungssonde gemäß Standard-Hybridi- sierungstechniken unter stringenten Jiybridisierungsbedingungen isoliert werden. Dabei können beispielsweise isolierte Nuklein- säuremoleküle verwendet werden, die mindestens 18 Nukleotide lang sind und unter stringenten Bedingungen mit den Nukleinsäure- molekülen, die eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 umfassen, hybridisieren. Es können auch vorteilhaft Nukleinsäuren minde- stens 25, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide verwendet werden. Der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen", wie hier verwendet, soll Hybridisierungs- und Waschbedingungen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60 % homolog zueinander sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen sind vorzugsweise derart, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 % und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 75 % oder stärker zueinander homolog sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und lassen sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6., finden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 x Natriumchlorid/Natriumcitrat (sodium Chloride/sodiumcitrate = SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 x SSC, 0,1 % SDS bei 50 bis 65°C. Dem Fachmann ist bekannt, dass diese Hybridisierungs- bedingungen sich je nach dem Typ der Nukleinsäure und, wenn beispielsweise organische Lösungsmittel vorliegen, hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers unterscheiden. Die Temperatur unterscheidet sich beispielsweise unter "Standard- Hybridisierungsbedingungen" je nach dem Typ der Nukleinsäure zwischen 42 und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 x SSC (pH 7,2). Falls organisches Lösungsmittel im obengenannten Puffer vorliegt, zum Beispiel 50 % Formamid, ist die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride zum Beispiel 0,1 x SSC und 20 bis 45°C, vorzugsweise zwischen
30 und 45°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride zum Beispiel 0,1 x SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die vorstehend genannten Hybridi- sierungstemperaturen sind beispielsweise für eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen anhand von Lehrbüchern, wie dem vorstehend erwähnten oder aus den folgenden Lehrbüchern Sambrook et al . , "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Harnes und Higgins (Hrsgb.) 1985,
"Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford, bestimmt werden können.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie (= Identität) von zwei Sequenzen (z.B. SEQ ID NO: 1) werden die Sequenzen zum Zweck des optimalen Vergleichs untereinander geschrieben (z.B. können Lücken in die Sequenz eines Promotors eingefügt werden, um ein optimales Alignment mit dem anderen Protmotor und dessen für die Funktion wesentlichen Elemente wie den Transkriptionsstart oder die TATA-Box zu erzeugen) . Die Nukleotide an den entsprechenden Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz durch das gleiche Nukleotid wie die entsprechende Stelle in der anderen Sequenz belegt wird, dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d.h. Nukleinsäure-"Homologie" , wie hier verwendet, entspricht damit Nukleinsäure-" Identität" ) . Die prozentuale Homologie zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen, die den Sequenzen gemeinsam sind (d.h. % Homologie = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positionen x 100) . Die Begriffe Homologie und Identität sind damit als Synonym anzusehen.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind transgene Pflanzen, die das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder den erfindungsgemäßen Vektor enthalten.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten. Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme aufgenommen .
Beispielteil
Beispiel 1: Isolierung genomischer DNA aus Petroselinum crispum var. Hamburger Schnitt
Blattmaterial von 3 Wochen alten Petersiliepflanzen var.
Hamburger Schnitt wurde geerntet und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. 100 mg Material wurden im Mörser homogenisiert und aus dem Homogenat genomische DNA (gDNA) isoliert mit Macherey und Nagel NucleoSpin Plant-Kit nach Herstellerangaben. Die gDNA wurde in 100 μl TE-Puffer aufgenommen. Anschließend wurde die Konzentration photometrisch bestimmt. Die Ausbeute betrug 1,05 μg/μl.
Beispiel 2 : Isolierung des Promotors aus genomischer DNA mittels PCR
Von der Sequenz mit der NCBI-Accessionsnummer X64345.1 [Kawalleck et al . , (1993) Polyubiquitin gene expression and structural properties of the ubi4-2 gene in Petroselinum. Plant Molecular Biology. 21 (4) : 673-84] wurden Oligonukleotide abgeleitet. Die Oligos wurden abgeleitet von der Sequenz von Basenpaar 1 bis 22 sowie 982 bis 959. Zur Klonierung des Promotors wurden an die Oligonukleotide ErkennungsSequenzen von Restriktionsenzymen angefügt. Die Sequenz der Oligos lautete:
PcUbi4-2fw: gctctagaattcgaatccaaaaattacg PcUbi4-2rev: gggctgcacatacataacatatcaaga
Die Oligos wurden eingestellt auf eine Konzentration von 20 μM und eingesetzt in einer PCR. Der PCR-Ansatz enthielt:
5,0 μl Puffer für Pfu-Polymerase (Stratagene)
'0,4 μl dNTPs (25 mM each) (Amersham)
5 0,5 μl Primer PcUbi4-2fw
0,5 μl Primer PcUbi4-2rev
0,5 μl Pfu Polymerase (Stratagene)
0 , 5 μl gDNA
42, 6 μl Wasser
10
Das Programm der PCR-Reaktion (MJ-Cycler Tetrad, BioZym) lautete:
4 min 94°C
1 min 94°C 15 1 min 50°C
2 min 72°C 10 min 72°C
25°C
20 Der mittlere Zyklus wurde 30 mal wiederholt.
Beispiel 3 : Klonierung des Promotor PCR-Fragments
Für die Klonierung des 982 bp großen PCR-Fragments wurde der 25 PCR-Ansatz nach Herstellerangaben mit Qiagen PCR-Reinigungskit gereinigt. Die DNA wurde anschließend in 30 μl TE-Puffer aufgenommen und vollständig mit Xbal (MBI-Fermentas) verdaut. Der Restriktionsansatz enthielt: 30 μl DNA, 4 μl Wasser, 4 μl Puffer und 2 μl Enzym (MBI Fermentas) . Inkubiert wurde über Nacht bei 30 37°C.
Nach der Reinigung wurde das Fragment in einen binären Vektor mit Expressionskassette und uidA als Reportergen kloniert, der zuvor mit den Restriktionsenzymen Xbal, Smal (MBI Fermentas) geöffnet
35 worden war. Es entstand das Konstrukt lbxPcUbi4-2GUS (Figur 1) enthaltend den Promotor PcUbi4-2 vor dem GUS-Gen, welches zur Promotoranalyse geeignet ist [Jefferson et al . , (1987) GUS fusions: ß-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907].
40
45 Beispiel 4: Transformation des Konstrukts lbxPcUbi4-2GUS in Arabidopsis
Das Konstrukt lbxPcUbi4-2GUS wurde in den Agrobakterienstamm pGV3101 enthaltend das Plasmid pMP90 mittels Elektroporation transformiert und die Kolonien auf TB-Medium (QBiogen, Deutschland) enthaltend die Selektionsmarker Kanamycin, Gentamycin und Rifampicin platiert und 2 Tage inkubiert bei 28°C.
Es wurde mit Hilfe eines Zahnstochers eine Kolonie von der Agarplatte gepickt und in 3 ml TB Medium flüssig mit den oben genannten Antibiotika aufgenommen.
Die Vorkultur wuchs 48 h bei 28oC und 120 rpm im Schüttel- inkubator. Zur Hauptkultur wurden 400 ml LB Medium mit den entsprechenden Antibiotika verwendet . Die Vorkultur wurde überführt in die Hauptkultur, diese wuchs 18 h bei 28°C und 120 rpm.
Nach dem Zentrifugieren bei 4000 rpm wurde das Pellet in Infiltrationsmedium (M & S Medium mit 10 % Saccharose) resuspendiert .
Beispiel 5 : Anzucht der Pflanzen
Schalen (Piki Saat 80, grün mit Siebboden, 30 x 20 x 4,5 cm, Firma Wiesauplast, Kunststofftechnik, Deutschland)) wurden mit einem GS 90 Substrat (Einheitserde, Werkverband E.V. , Deutschland) ) bis zur Hälfte gefüllt. Die Schalen wurden über Nacht mit 0,05 % Previcur Lösung (Previcur N, Aventis CropScience) gewässert. Arabidopsis thaliana, C24 Samen wurden auf die Schale gestreut, ca 1000 Samen je Schale. Die Schalen wurden mit einer Haube abgedeckt und in die Stratifizierung gestellt (8 h 110 μE, 5°C; 16 h Dunkel 6°C) . Nach 5 Tagen wurden die Schalen in das Kurztag Phytotron gestellt (8 h 130 μE, 22°C; 16 h Dunkel 20°C) . Hier blieben sie 10 Tage, bis die ersten Laubblätter gebildet ware .
Die Keimlinge wurden in Töpfe, die das gleiche Substrat ent- hielten transferiert (Teku-Töpfe, 10 cm 0, Serie LC, Hersteller Pöppelmann GmbH & Co, Deutschland) . Es wurden 9 Pflanzen in einen Topf pikiert . Die Töpfe wurden dann wieder zum weiteren Wachstum in das Kurztag Phytotron gestellt . Nach 10 Tagen kamen sie dann in eine Gewächshauskabine 16 h 340 μE 22°C und 8 h dunkel 20°C. Hier wuchsen sie noch 10 Tage weiter.
Beispiel 6: Methode Transformation
7 Wochen alte gerade blühende Arabidopsis Pflanzen wurden für 10 sec in die oben beschriebene Agrobakterien Suspension getaucht. Diese wurde vorher mit 10 μl Silwett L77 (Crompton S.A., Osi Specialties, Schweiz) versetzt. Die Methode ist beschrieben in Bechtold N. und Pelletier G. [In planta Agro- bacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology, 82:259-66, 1998]. Anschließend wurden die Pflanzen für 18 h in eine feuchte Kammer gelegt, danach stellte man die Töpfe zum weiteren Wachstum wieder ins Gewächshaus. Hier verblieben die Pflanzen noch 10 Wochen, bis die Samen geerntet wurden.
Beispiel 7 : Selektion
Je nach verwendetem Resistenzmarker für die Selektion der transformierten Pflanzen wurden die geernteten Samen im Gewächshaus ausgebracht und der Sprühselektion unterworfen, oder aber nach Sterilisation auf Agarplatten mit dem respektiven Selektionsagens angezogen. Nach ca. 10 bis 14 Tagen unterschieden sich die transformierten resistenten Pflanzen deutlich von den abgestorbenen Wildtypkeimlingen und konnten in 6-cm-Töpfe pikiert werden.
Beispiel 8: Qualitative Bestimmung der GUS Aktivität in Geweben transgener Arabidopsis Pflanzen
Transgene Arabidopsispflanzen wurden pikiert und im Gewächshaus angezogen. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde von unterschiedlichen Geweben Proben genommen. Mit diesen Proben wurden GUS- Färbungen durchgeführt [Martin et al . , (1992) The GUS reporter System as a tool to study plant gene expression. In: Gallagher (Hrsg.): GUS Protocols: Using the GUS gene as a reporter of gene expresion. Academic Press, 23-43] um zu untersuchen, in welchen Geweben der PcUbi4-2 Promotor aktiv ist. Zum Vergleich wurden Pflanzen analysiert, die bei gleichem Vektor vor dem GUS-Gen den doppelten 35S-Promotor (d35S) enthielten [Kay et al, 1987, Science, 236, 1299-1302. Hierbei handelt es sich um einen bereits sehr gut charakterisierten konstitutiven Promotor [Comai et al . , 1990, Plant Molecular Biology 15, 373-381, 1990]. In Blättern 3 Wochen alter individueller, unabhängiger Pflanzen zeigte sich eine starke, einheitliche Färbung aller Gewebe (Figur 2) . Im Vergleich dazu waren die Blätter der mit d35S:GUS transformierten Pflanzen sehr variabel in der Färbung und zeigten 5 teilweise ein fleckiges Färbungsmuster (Figur 3). In Samen zeigte der d35S kaum Aktivität, wohingegen der PcUbi4-2 eine starke Aktivität aufwies (Figur 7) .
Beispiel 9: Quantitative Bestimmung der Menge GUS mRNA in 10 Blättern transgener Arabidopsis Pflanzen
Blätter 3 Wochen alter transgener Arabidopsispflanzen wurden geerntet und gesamt RNA extrahiert mit dem Invisorb Plant Kit (Invitek, Deutschland) . Die RNA wurde eingesetzt um daraus die
15 Menge GUS mRNA zu bestimmen. Die Reagenzien für cDNA-Synthese und Q-PCR Reaktion stammten von Applied Biosystems und wurden nach Herstellerangaben eingesetzt. Die Analyse erfolgte mit quantitativer PCR, TaqMan Sonden und dem ABIPrism7700 (PE Aplied Biosystems) [Gibson et al . , (1996) A novel method for real time
20 quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001; Lie Y.S. and Petro- pulos C.J. (1998) Advances in quantitative PCR technology: 5'nu- clease assays] .
Zur Detektion der GUS mRNA wurde folgendes Sondensysthem ver- 25 wendet :
Oligol: 5' ccatctcataaataacgtcatgcattac 3' Sonde : 5 ' tgtaaatcatcgcaagaccggcaacag 3 ' 01igo2 : 5 ' aacatttggcaataaagtttcttaaga 3 ' 30
Die Sonde war mit FAM (Fluorescein) markiert, der Quencher war TAMRA (Rhodamin)
Zum Abgleich der Menge eingesetzter gesamt RNA wurde ein 35 Sondensystem verwendet, das die mRNA des Ubiquitin-conjugating- enzyme 18 (Ubil8) detektiert:
Oligol: 5' agttcacccgaaaagcaacg 3' Sonde: 5' cccactgataatgatcgatatgtgaagaactgc 3' 40 01igo2 : 5 ' cgtcatggaaccaccacct 3'
Die Sonde war mit VIC (Tradename) markiert, der Quencher war TAMRA.
45 Der für jede Pflanze ermittelte Ct-Wert für Ubil8 mRNA wurde vom aus dem gleichen Reaktionsansatz bestimmten Ct-Wert für GUS mRNA abgezogen. Der daraus berechnete delta Ct Wert ist ein relativer Wert und ein Maß für die Menge GUS mRNA die in einer bestimmten Menge mRNA enthalten war (Tab. 3). Die Q-PCR wird über 40 Zyklen verfolgt. Proben, bei denen ein Ct-Wert von 40 angezeigt wird sind negativ, da sie auch beim 40 Zyklus keine Fluoreszenz oberhalb des Hintergrundes entwickelt haben.
Beide Promotoren zeigen in einem vergleichbaren Bereich
Expression. Die Varianz in der Menge GUS mRNA ist beim PcUbi4.2 Promotor allerdings niedriger als bei d35S. Der Mediän der Expression in Tl Pflanzen exprimierend GUS unter Kontrolle des PcUbi4-2 Promotors war 2.25, der Range aller Pflanzen 10.47. Beim Promotor d35S war der Mediän 2.38, der Range 13.44
Tabelle 3 : Ct Werte für Tl Pflanzen enthaltend die Konstrukte D35S35SGUS oder PcUbi4-2GUS.
Sample Ct GUS Ct deltaCt Sample Ct GUS Ct Ubilδ deltaCl
Name Ubil8 Name
D35S1 31.15 28.47 2.6S PcUbil 34.88 29.18 5.70
D35S2 30.21 27.46 2.75 PcUbi2 31.54 29.57 1.97
D35S3 29.18 27.11 2.07 PcUbi3 31.39 28.99 2.40
D35S4 29.40 27.39 2.02 PcUbi4 32.98 29.36 3.62
D35S5 28.78 27.32 1 46 PcUbi5 32.95 28.79 4.16
D35S6 28.35 28.19 0.15 PcUb.6 32.57 28.96 3.62
D35S7 32.03 29.04 2.99 PcUbi7 34.60 29.51 5.10
D35S8 30.72 28.39 PcUbiδ 33.09 27.67 5.42
D35S9 31.28 28.37 2.92 PcUbi9 32.47 29.41 3.07
D35S10 30.30 28.07 2.23 PcUbilO 34.34 29.16 5 18
D35S11 31.90 28.22 3.68 PcUbill 32.25 29.60 2.65
D35S12 29.73 28.33 1.41 PcUbil 3 34.84 29.86 4.98
D35S13 30.67 28.82 1 86 PcUbil4 32.63 29.95 2.69
D35S14 33.16 28.59 4 58 PcUbil 5 34.78 30.46 4.32
D35S15 32.40 28.11 4 29 PcUbil 6 31.07 29.70 1.37
D35S16 32.09 27.85 4.25 PcUbil 7 31.85 29.77 2.08
D35S17 30.03 27.88 2 16 PcUbil 8 32.01 29.66 2.36
D35S18 31.44 28.35 3.09 PcUbil 9 32.37 29.43 2.94
D35S19 31.57 28.17 3 41 PcUbi20 35.12 30.09 5.03
D35S20 30.28 28.20 2 08 PcUbi21 31.30 29.59 1.71
D35S21 32.32 29.08 3 24 PcUbi22 30.16 29.18 0.98
D35S22 29.44 28.12 1 32 PcUbi23 33.66 29.24 4.42
D35S23 27.00 28.06 -1.06 PcUbi24 29.88 27.85 2.03
D35S24 28.39 27.24 1 15 PcUbi25 37.94 29.16 8.78
D35S25 29.66 27.01 2 65 PcUbi26 29.94 29.43 0.51
D35S26 30.40 27.56 2 84 PcUbi27 32.27 29.03 3.24
D35S27 29.16 26.98 2 18 PcUbi28 30.99 29.17 1.82
D35S28 27.22 28.27 - 1.05 PcUbi29 31.14 29.05 2.09
D35S29 26.32 27.30 -0.98 PcUbi30 29.97 29.34 0.63
D35S30 28.77 27.54 1 23 PcUbi31 33.97 29.69 4.29
D35S31 29.77 27.23 2 54 PcUbi32 27.26 27.09 0.18
D35S32 28.35 27.60 0 75 PcUbi33 29.41 28.81 0.60
D35S33 31.34 27.41 3 93 PcUbi34 32.83 29.09 3.74
D35S34 39.05 28.03 11.02 PcUbi35 28.96 28.62 0.35
D35S35 27.61 27.75 0.14 PcUbi36 33.75 29.03 4.72
D35S36 40.00 27.62 12.38 PcUbi37 30.65 28.22 2.43
D35S37 29.74 28.15 1.59 PcUbi38 31.25 30.22 1.04
D35S38 29.12 27.42 1 70 PcUbi39 29.11 28.93 0.18
D35S39 27.25 27.60 -0.34 PcUbi40 27.02 26.99 0.04
D35S40 29.83 27.72 2.11 PcUbi41 30.82 29.69 1.1.5
D35S41 34.31 28.21 6 10 PcUbi42 33.73 34.80 -1.07
D35S42 33.09 28.32 4.77 PcUbi43 30.90 30.41 0.49
D35S43 29.91 28.36 1 55 PcUbi44 32.39 30.15 2.25
D35S44 32.17 28.07 4.10 PcUbi45 28.45 30.14 -1.69
D35S45 30.74 28.31 2.43 PcUbi46 29.88 30.07 -0.19
D35S46 40.00 28.41 1 1.59 PcUbi47 34.13 32.72 1.41
D35S47 32.05 28.03 4 02 PcUbi48 29.65 28.31 1.34
D35S48 30.98 28.02 2.96 Beispiel 10 : Untersuchung der Stabilität der GUS-Expressionshöhe in Blättern transgener T2 Arabidopsis Pflanzen
12 Tl Linien wurden von jedem Konstrukt ausgewählt um die Expression von GUS in den Nachkommenschaften zu ermitteln. Dazu wurden von jeder Linie 10 Nachkommen angezogen und 3 Wochen nach Aussaat Blätter geerntet und wie beschrieben die Transkriptmenge von GUS mittels qPCR bestimmt.
Die Schwankungsbreite innerhalb der T2 einer Linie ist geringer in den Nachkommenschaften der lbxPcUbiGUS Pflanzen (Tab. 4) .
Tabelle 4: Bestimmung der GUS Expression in Nachkommenschaften transgener Arabidopsispflanzen. Angegeben ist der Mediän der delta Ct Werte aus der Messung von jeweils 10 T2 Pflanzen jeder Linie sowie der Range der Messwerte .
Mediän d35S Range d35S Mediän PcUbi Range PcUbi
0.92 1.09 3.81 1.28
0.46 1.18 1.47 1.42
3.00 1.51 -0.56 1.47
1.00 2.13 1.79 1.58
1.28 2.16 1.26 1.68
-0.77 2.55 1.28 1.97
0.11 2.80 0.22 2.05
2.12 2.84 -0.13 2.24
5.18 4.16 1.39 2.33
2.50 4.94 0.10 2.65
2.65 5.92 1.38 2.97
6.27 7.91 6.69 4.15
Äquivalente
Der Fachmann erkennt oder kann viele Äquivalente der hier beschriebenen erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen, indem er lediglich Routineexperimente verwendet. Diese Äquivalente sollen von den Patentansprüchen umfasst sein.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen unter der Kontrolle eines Petersilie-Ubiquitin-
Promotors dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst:
a) Verknüpfung der zu exprimierenden Nukleinsäure mit einem Promotor gemäß SEQ ID NO : 1 oder
b) einem funktionellen Äquivalent oder äquivalenten Fragment, das im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie a) besitzt und
c) Einbringen des Nukleinsäurekonstrukts in eine Pflanze, das aus der zu exprimierenden Nukleinsäure, die unter der Kontrolle der 5 '-Region des unter a) oder b) genannten Promotors liegt, und dem Promotor gebildet wird, unter Bedingungen die die stabile Integration der Nukleinsäure in das Pflanzengenom ermöglicht .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu exprimierende Nukleinsäure mit weiteren regulatorischen Sequenzen funktioneil verknüpft ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure für ein Gen codiert ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Selektionsmarker, einem Reporter- gen, einem Enzym, einem Protein das Insekten-, Virus-,
Bakterien-, Pilz- oder Nematodenresistenz vermittelt, einer Nukleinsäuresequenz oder einem Protein, das Trocken-, Kälte-, Hitze- oder Salzresistenz in Pflanzen vermittelt, einem Inhibitor, einem Lektin, einer RNAase, einem Ribozym, einem Antikörper, einem Vaccin, einem Pharmazeutikum, einem "anti- freezing"-Protein, einem Cytochrom P-450-Protein, einem Transkriptions-Aktivator oder -Repressor oder einem Protein, das an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt ist.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein, das an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt ist, ein Protein aus dem Fettsäurestoffwechsel, dem Aminosäurestoffwechsel, dem Vitaminstoffwechsel, dem Carotinoidstoffwechsel oder dem Kohlenhydrat- Stoffwechsel ist.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Nukleinsäurekonstrukt weitere Gene unter der Kontrolle des Petersilie-Ubiquitin-Promotors oder eines anderen Promotors enthalten sind.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in sense oder antisense-Richtung oder sense- und antisense-Richtung exprimiert wird.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt zwischen zwei T-DNA-Abschnitte inseriert ist .
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekenn- zeichnet, dass es sich bei der transgenen Pflanze um eine monokotyle oder dikotyle Pflanze handelt .
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der transgenen Pflanze um eine monokotyle Pflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Mais, Reis, Triticale, Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Ryegras oder Hirse handelt.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeich- net, dass es sich bei der transgenen Pflanze um eine dikotyle
Pflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Raps, Nachtkerze, Canola, Erdnuss, Königskerze, Distel, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Wildrosen, Kürbis, Pistazien, Sesam, Lein, Sonnenblume, Färberdistel, Soja, Borretsch, Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Zuckerrübe, Tomate, Kartoffel, Tabak, Karotte, Pappel, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Aubergine, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss oder Arabidopsis handelt.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der Nukleinsäuren konstitutiv erfolgt .
12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die durch die Expression der Nukleinsäuren in den transgenen Pflanzen entstandenen Produkte nach Kultivierung der Pflanzen isoliert werden.
13. Nukleinsäurekonstrukt zur stabilen transgenen Expression von Nukleinsäuren in einem Verfahren gemäß Anspruch 1 enthaltend
a) einen Promotor gemäß SEQ ID NO : 1 oder
b) funktionelle Äquivalente oder äquivalente Fragmente, das im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) besitzt,
wobei a) oder b) funktioneil mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.
14. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 13 , dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein weiteres Element ausgewählt aus der folgenden Gruppe enthält
a) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen funktioneil verknüpft ist, oder
b) das Nukleinsäurekonstrukt zusätzliche Funk ionselemente enthält, oder
c) das zwischen dem Promotor und der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ein Polylinker vorhanden ist, oder
d) das Nukleinsäurekonstrukt mindestens eine weitere Nukleinsäure unter Kontrolle des Promotors gemäß
SEQ ID NO: 1 oder eines funktionellen Äquivalents oder äquivalenten Fragments oder eines weiteren Promotors enthält .
15. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt zwischen zwei T-DNA-Abschnitten inseriert ist.
16. Nukleinsäurekonstrukt nach den Ansprüchen 13 bis 15, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäuren bestehend aus einem Selektionsmarker, einem Reportergen, einem RNAi-Konstrukt, einem Enzym, einem Protein das Insekten-, Virus-, Bakterien-, Pilz- oder Nematodenresistenz vermittelt, einer Nukleinsäuresequenz oder einem Protein, das Trocken-, Kälte-, Hitze- oder Salzresistenz in Pflanzen vermittelt, einem Inhibitor, einem Lektin, einer RNAase, einem Ribozym, einem Antikörper, einem Vaccin, einem Pharmazeutikum, einem "antifreezing"-Protein, einem Cytochrom P-450-Protein, einem Transkriptions-Aktivator oder -Repressor oder einem Protein, das an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt ist.
17. Vektoren enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß den Ansprüchen 13 bis 16.
18. Transgene Pflanze transformiert mit einem Nukleinsäurekonstrukt gemäß den Ansprüchen 13 bis 16 oder einem Vektor gemäß Anspruch 17.
19. Transgene Pflanze nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine dikotyle oder monokotyle Pflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Reis, Triticale, Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Ryegras, Hirse, Raps, Nacht- kerze, Canola, Erdnuss, Königskerze, Distel, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Wildrosen, Kürbis, Pistazien, Sesam, Lein, Sonnenblume, Färberdistel, Soja, Borretsch, Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Zuckerrübe, Tomate, Kartoffel, Tabak, Karotte, Pappel, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Aubergine, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss oder Arabidopsis handelt.
20. Verwendung einer transgenen Pflanze nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut,
Kosmetika, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
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