WO2003097089A2 - Attenuierung von metapneumovirus - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a vaccine against members of the genus metapneumovirus or RSV, the vaccine being an attenuated live vaccine.
  • the vaccine is directed against metapneumovirus of avian or human origin.
  • the present invention also relates to a method for the production of a vaccine which is directed against members of the genus Metapneumovirus or RSV. Furthermore, the present invention relates to an attenuated living virus belonging to the genus metapneumovirus. It also relates to a host cell comprising such a virus. The present invention is also directed to a specific DNA or cDNA or RNA sequence as well as a vector or a plasmid comprising the DNA, cDNA or RNA sequence.
  • the present invention relates to an F protein which is modified and the use of the F protein to produce a vaccine for preventing a disorder or disease caused by viruses belonging to the genus metapneumovirus or RSV.
  • the Paramyxovirinae and Pneumovirinae subfamilies of the Paramyxoviridae family contain several important pathogens for humans and animals.
  • the Pneumovirinae are taxonomically divided into the Pneumovirus and the Metapneumovirus genus.
  • the human respiratory syncytic virus the type of pneumovirus genus, which is also described below, is the only and most important trigger of diseases of the lower respiratory tract in infancy and early childhood worldwide.
  • Other members of the pneumovirus genus include the bovine respiratory syncytic virus, the ovine respiratory syncytic virus, and the pneumonia virus in mice.
  • the avian pneumovirus APV is also further described below, and was previously known as Turkey Rhinotracheitis Virus (TRTV). It is considered an etiological agent of upper RTI and was previously considered the only member of the recently created genus metapneumovirus.
  • TRTV Turkey Rhinotracheitis Virus
  • the Paramyxoviridae family comprises a large number of different viruses which are involved in different, more or less serious disorders or diseases in both humans and animals.
  • the Paramyxoviridae contain a single molecule of single-stranded negative RNA as a genome and are all associated with acute respiratory disease of the host (Pringe, CR (1987) in Molecular Basis of Virus Disease, ed. WC Russell and JW Almond, Society for General Microbiology, Vol 40, pp. 91-138, Cambridge University Press).
  • the respiratory syncytic virus RS virus
  • the human RS virus is the main cause of severe diseases of the lower respiratory tract in children, which leads to annual epidemics worldwide (Chanock et al., 1991, in “Viral Infections of Humans", pages 525-544, ed. AS Evans, plenum Press). Although there is limited nucleotide or amino acid sequence homology between the pneumoviruses to which the RS virus belongs and other Paramyxoviridae, there are important structural features such as the main nucleoprotein (N) and the F protein (F) conserved in proteins with similar functions in a wide range of viruses (Barr et al., 1991, J. of Gen. Virol. 72, 677-685; Chambers et al., 1990, J. of Gen. Virol.
  • RNA synthesis methods are carried out by the helionucleocapsid complex, which is formed by an association of the genomic RNA, the nucleoprotein, a phosphoprotein (P) and the polymerase (L) protein.
  • the function of the nucleoprotein complex depends on the presence of all three proteins that interact with each other as well as with the genomic RNA and possibly with other virus and / or cell components (Barik, 1992, J. of Virol. 66, 6813-6818).
  • the maturation of the virion depends on a number of interactions between the ribonucleoprotein complex, the matrix (M) protein and the virus glycoproteins that are embedded in the modified cell membrane.
  • NS1 and NS2 are also involved in the virion structure and presumably in the assembly, but in a way that is still poorly understood.
  • the function of the pneumovirus proteins referred to as NS1 and NS2 is not known and does not appear to form part of the virus particle (Collins, 1991, in The Paramyxoviruses, pages 103-162, ed. DW Kingsbury, Plenum Press).
  • the APV virus is a member of the metapneumovirus genus. It triggers turkey rhinotracheitis, which is an acute respiratory disease in turkeys. It was first described in South Africa in the late 1970s and later in Europe and other parts of the world. The disease has been one of the main causes of economic losses in the turkey industry in recent years. In Europe, APV serotypes A and B are generally found, while similar infections have been found in Colorado in the United States. The APV strain isolated from it is the so-called Colorado or C strain. Another strain of APV was isolated from ducks in France.
  • APV avian metapneumovirus
  • F fusion protein
  • G glycoproteins
  • the original APV was classified into two subspecies. Originally v / ar APV from South Africa and Great Britain of subspecies A and the other European APV strains belonged to subtype B. As stated above, subtype C is now also known, in addition to presumably other subtypes that are non-A non- B are.
  • the avian metapneumovirus can be cultivated in tracheal ring cultures, where it exerts a ciliostatic effect. Furthermore, it can be found in embryonated eggs and others. Cell cultures are cultivated. The American strains were also cultivated in HEF (hen embryo fibroblasts), Vero cells and embryonated eggs.
  • turkey rhinotracheitis correspond to those of an acute rhinotracheitis infection. Two to three days after infection, the animals were apathetic and showed coughing, sneezing, and shaking their heads. If the infection is not complicated, the animals are normal seven to eight days after infection.
  • the clinical symptoms in hens correspond to those in turkeys, but are usually less severe. If E. coli or other bacteria are also involved, high losses can occur and the actual period of the disease can be lengthened unpleasantly. However, APV rarely leads to the "swollen head syndrome" with massive losses in chickens. It is probably more important for the continuous losses due to lower clinical illnesses. After infection with conventional APV, hens and turkeys produce neutralizing antibodies in the serum ELISA are detectable. These antibodies do not appear to have any real relevance for the control of rhinotracheitis.
  • Maternal antibodies are not effective for chicks against early infection with viral APV. Circulating antibodies, however, appear to be important for protecting the gonads in the event of infection in older animals.
  • Virus-specific IgA and IgG antibodies with a virus-neutralizing effect appear in the tear fluid after infections with virulent APV. To date, no therapy is known for the treatment of APV infections. With the exception of the USA, attempts are being made to control APV by vaccination.
  • Paramyxoviridae Another important member of Paramyxoviridae is the newly discovered human metapneumovirus, which has been isolated from young children with respiratory disorders. This virus was isolated from 28 young children in the Netherlands and was identified as a new member of the genus metapneumovirus based on virological data, sequence homology and gene constellation (Van Den Hoogen et al., Nature, Medicine, Vol. 7, No. 6, June 2001, pages 719-724). Until the discovery of this new metapneumovirus, APV was regarded as the only member of the recently named genus metapneumovirus as described above (Virus Taxonomy, Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ed.
  • Live vaccines are usually used as a spray or eye drops for chicks around day 1. Some manufacturers recommend repeating immunization with live vaccines one or more times. The live vaccines that are currently on the market are produced from different strains of different species and are more or less attenuated. Inactivated vaccines are sometimes also used for older animals, although even in this case they are usually first vaccinated with a live vaccine.
  • the live vaccines are subtypes A or B. Results from different experimental studies show that there is good cross-reactivity between the different strains, but homologous protection appears to be more complete.
  • the human metapneumovirus there is no vaccine at all, as it was only recently discovered. However, particularly with regard to the human metapneumovirus, it would be particularly desirable to obtain a vaccine that provides good and effective protection against the virus that leads to serious illnesses in children.
  • a vaccine is provided against members of the genus metapneumovirus and RSV as well as against viruses which have a significant genetic homology in the area of the F protein to members of the genus metapneumovirus, characterized in that it comprises a virus or part of a virus, the virus being modified in the region aa 293-296 of the amino acid sequence of the F protein (fusion protein) compared to the wild type virus, or in a region which shows the same function as aa 293-296.
  • part of a virus it is meant that the vaccine should comprise at least that part of the virus which comprises the modification in region aa 293-296 of the F protein or a functionally similar region and all other components of the virus which are necessary so that the virus can act as a vaccine, ie it produces immunogenicity but is not virulent.
  • the generation of such a virus is within the general specialist knowledge of a person skilled in the art. The invention is further described according to the figures included here, the figures representing the following:
  • Fig. 1 Exemplary sequence changes during attenuation and reversion
  • Fig. 4 changes at positions aa 293-296 of the fusion protein
  • the usual cleavage site of the fusion protein F e.g. common to A-type APVs and other APVs, as well as other members of Paramyxoviridae, has a motif with basic amino acids located approximately at aa 99-109, and the F protein, when cleaved by proteases, separates into Fl and F2, exposing the fusion-related domain. Therefore, the provision of an increased number of basic amino acids in region aa 293-296, which could be a second cleavage site or a functionally corresponding site, could lead to a similar cleavage site for proteases.
  • FIG. 1 shows a possibility of exemplary sequence changes during attenuation and reversion of viruses to virus vaccines and back to virulent viruses.
  • the abbreviations mean the following:
  • N nucleocapsid
  • Gen approximately 1,200 bases
  • M2 2nd matrix
  • Gen about 600 bases
  • G glycoprotein
  • Gen approximately 1,100 bases
  • M2 is believed to be a transcription elongation factor that is believed to be essential for virus rescue. It contains a second reading frame that does not appear to be expressed.
  • the G protein could be responsible for attachment to a target cell receptor. It is highly glycosylated and highly variable between different strains. L-polymerase affects the transcription and replication of the genome. N, P and L combine to provide the minimal replication unit called the nucleocapsid.
  • the fusion protein is responsible for the fusion of the virus with the target cell. It is translated as F0 and is cleaved by cellular proteases at aa positions 99-102 (RRRR) to form Fl (containing the fusion-related domain, membrane-bound) and F2 (which remains attached to Fl by disulphide bridges between cysteine cleavage residues).
  • RRRR cellular proteases at aa positions 99-102
  • F2 which remains attached to Fl by disulphide bridges between cysteine cleavage residues.
  • the potential additional cleavage site aa 293-296 in APV and hMPV and aa 323-328 in RSV
  • the virus arrangement is the wild-type virus arrangement.
  • the virus arrangement which is shown in white, is the virus arrangement of an attenuated virus, while on the right side the virus arrangement is the arrangement of a virus that has returned to virulence.
  • Sequence changes that can occur during attenuation and reversion and that are shown in FIG. 1 are only exemplary.
  • a modification in region aa 293-296 or a region with the same functionality leads to the generation of an attenuated virus which can be used as a vaccine against members of the genus metapneumovirus or RSV.
  • the present inventors have found that a modification in this region will produce an attenuated virus that has lost its virulent ability while still providing complete immunogenicity.
  • the modification in this region will also reduce the risk of returning to virulence.
  • Table 1 is provided, which provides an overview of the 20 amino acids, their single letter code (SLC) and their corresponding DNA codons.
  • Serine S 0 glycos TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC
  • the region aa 293-296 is located in the F protein, namely the fusion protein, from viruses of the genus Metapneumovirus and with RSV.
  • the location of the aa 293-296 region can be derived, for example, from SEQ ID NOS 28 to 34.
  • the present inventors were able to show that when the codons encoding the amino acids in the aa 293-296 region or a region with the same functionality as aa 323-328 were modified in RSV of the F gene, attenuated Virus strains could be generated that retained their immunogenicity, but lost their virulence.
  • APV type A RKEK (SEQ ID No 24), RKKE, REEK APV type B RHER (SEQ ID No 25)
  • APV type C SGKD (SEQ ID No 26) human metapneumovirus: SGKK (SEQ ID No 27)
  • TTNTKE SEQ ID No 77
  • the human metapneumovirus is meant as defined according to the article by Van den Hoogen et al. , Nature, Medicine, Vol. 7, No. 6, June 2001, pages 719-724. It appears likely that the hydrophilic region is needed to add function and structure to the functional protein. Therefore, the presence of basic amino acids should favor cleavage by serine proteases; Accordingly, a suitable modification of the four amino acids in the region aa 293-296 in APV or hMPV as well as a suitable modification of aa 323-328 in RSV should have a universal attenuating effect.
  • the virus described above is an attenuated live virus.
  • Live attenuated viruses are known in the art and their preparation can be easily accomplished by one of ordinary skill in the art.
  • the live attenuated virus needs a modification in region aa 293-296 of the amino acid sequence of the fusion protein compared to the wild type or in a region with the same functionality, e.g. aa 323-328 in RSV.
  • the attenuation of the virus occurs through the modification in the region (s) above.
  • known attenuation methods that are already known for these viruses can be used.
  • the modification comprises stabilizing region aa 293-296 or a region with the same functionality as aa 323-328 in RSV in the virus.
  • stabilization is intended to describe a situation in which the amino acids at position aa 293-296 or a region with the same functionality as aa 323-328 in RSV are coded by codons which cannot easily return to the wild type. Such stabilization is preferably achieved by substitution of codons which code for amino acids in the region Codons that need more mutations to return to the wild type. Such stabilization is exemplified as follows:
  • the goal is to replace the amino acid glutamic acid (E) with a basic amino acid.
  • Glutamic acid is encoded by the DNA codon GAA or GAG.
  • the amino acid lysine (K) is chosen to replace glutamic acid, the following situation arises: Lysine is encoded by the DNA codon AAA or AAG. If the DNA codon AAA is chosen for lysine, a mutation is required to become the DNA codon GAA, i.e. Glutamic acid to return. The same applies if the DNA codon AAG is selected which needs a mutation to return to the DNA codon GAG, which in turn codes for glutamic acid.
  • the stabilization is achieved by substitution of codons which code for the amino acid in the region, preferably the acidic amino acids in this region, with codons which are less likely to mutate into a codon which codes for glutamic acid.
  • the present inventors have found that the presence of glutamic acid in region aa 293-296 or a region with the same functionality, such as aa 323-328 in RSV of the F protein of viruses, reduces or prevents attenuation and increases virulence. There is no reference in any prior art document relating to this discovery.
  • Glutamic acid like other acidic amino acids, appears to contribute to the virulence of the virus when located in region aa 293-296 or a region with the same functionality as aa 323-328 in RSV, the F protein.
  • this enhancement of virulence with simultaneous weakening or elimination of attenuation could be attributed to a situation in which hydrophilic regions are needed to impart a functional structure to the F protein, while the presence of basic amino acids would favor serine protease cleavage.
  • the modification in region aa 293-296 or a region with the same functionality as aa 323-328 in RSV, the F protein of viruses, preferably the genus metapneumovirus comprises the substitution of at least one non-basic amino acid a basic amino acid. Even more preferably, at least two non-basic amino acids are replaced by basic amino acids. Even more preferably, at least three non-basic amino acids are replaced by basic amino acids. According to a particularly preferred embodiment, the amino acids in region aa 293-296 of the F protein of hMPV or APV are modified such that all four amino acids are basic amino acids.
  • all six amino acids of region aa 323-328 are basic amino acids in RSV.
  • the modification can comprise the addition of at least one amino acid.
  • This addition of at least one amino acid can be carried out in addition to the substitution mentioned above.
  • the addition of at least one relates Amino acid the addition of at least one basic amino acid, preferably arginine, lysine and / or histidine, particularly preferably arginine or lysine.
  • the modification can also include the deletion of at least one amino acid.
  • This at least one deleted amino acid is preferably an acidic amino acid.
  • the modification comprises the substitution of at least one glutamic acid residue by at least one basic amino acid.
  • the basic amino acid is preferably selected from the following group consisting of arginine, lysine and / or histidine. The use of arginine and / or lysine is particularly preferred.
  • region aa 293-296 of the wild-type virus has a sequence as shown in one of SEQ ID NO 24 to 27.
  • SEQ ID NO 24 represents, for example, the amino acids in region aa 293-296 of the wild-type APV-A-Starnms No. 8544, namely
  • SEQ ID NO 25 represents the typical amino acids in region aa 293-296 of APV-B viruses, namely
  • SEQ ID NO 26 represents, for example, the typical amino acids in positions aa 293-296 of viruses of the APV-C type, namely
  • SEQ ID NO 27 represents the amino acids in positions aa 293-296 of human metapneumovirus, namely
  • wild type virus refers to those viruses that do not have mutations in positions 293-296 or a region with the same functionality (e.g. aa 323-328 in RSV) of the F protein.
  • a wild-type virus is a virulent virus.
  • Preferred viruses which can be wild-type viruses in the sense of the present invention, are human metapneumovirus, APV virus of types A, B, C or non-A, non-B or RS virus.
  • the aa 293-296 region of the attenuated virus preferably has a sequence as shown in one of SEQ ID NOs 1 to 23.
  • SEQ ID NO 1 to 23 can also be selected to form part of region aa 323-328 in the RS virus.
  • SEQ ID NO 1 is an exemplary amino acid sequence at position aa 293-296, which, for example, makes an attenuated strain usable as a vaccine for e.g. Strain No. 8544 (APV type A) can be provided.
  • RRRR could also provide, for example, an attenuated human metapneumovirus or an attenuated APV virus of the B or C type or non-A-non-B type.
  • the F protein as disclosed according to the present invention By modifying the amino acids or the codons coding for the amino acids at positions aa 293-296 or in a region with the same functionality, e.g. aa 323-328 in RSV, the F protein as disclosed according to the present invention, it is possible to provide a live attenuated virus which is useful as a vaccine.
  • region aa 293-296 of the wild-type virus has the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO 24, the region of the attenuated virus having a sequence as shown in SEQ ID NO 1.
  • Such an embodiment would be an attenuated life virus for APV type A, e.g. Provide strain no. 8544.
  • region aa 293-296 of the wild-type virus has the sequence shown in SEQ ID NO 27, the region of the attenuated virus having the sequence shown in SEQ ID NO 1, 2, 10 or 21.
  • Such a modification in region aa 293-296 would provide, for example, a live attenuated virus for the human metapneumovirus.
  • the preferred sequences, shown in SEQ ID NO 1 to 23, may also include one or more histidines to replace either lysine or arginine. The above is mutatis mutandis also applicable to region aa 323-328 of RSV.
  • the present modification becomes in region aa 293-296 or in a region with the same functionality as aa 323-328 in RSV of the F protein a supply of attenuated live viruses, for example of the genus Metapneumovirus or RSV, which have the common feature of an F protein with a substantial genetic homology between the sequences of the respective F proteins in these viruses.
  • the vaccine provided according to the present invention is effective against the human metapneumovirus.
  • the metapneumovirus avian metapneumovirus, in particular APV, is further preferred.
  • the present invention is not limited to metapneumovirus, but is applicable to all viruses which have a clear genetic homology, e.g. more than 50%, preferably more than 65%, particularly preferably more than 75% sequence homology, determined based on
  • the attenuated live virus is preferably formulated with a suitable excipient and / or carrier and / or adjuvant.
  • the virus is a live attenuated virus formulated with an appropriate amount of interleukin-6 (IL-6).
  • IL-6 interleukin-6
  • Interleukin-6 formulation is particularly preferred when the virus is an avian metapneumovirus.
  • the virus is an attenuated virus and is formulated with a suitable amount of interleukin-12 (IL-12) and / or interleukin-18 ( ⁇ L-18).
  • the attenuated virus is preferably formulated with interleukin-12 and / or interleukin-18 if the virus is a human metapneumovirus or RSV.
  • an appropriate amount in the context of the present invention means an amount that when is formulated with the attenuated virus according to the present invention, provides the desired effect, but does not adversely affect the usefulness of the live attenuated virus as a vaccine.
  • Suitable amounts can be determined by those skilled in the art and will depend on the attenuated virus used and the subject to be treated, e.g. in terms of age, weight, physical condition and the disease to be treated.
  • a method for the production of a vaccine according to the present invention directed e.g. against members of the genus metapneumovirus includes the following steps:
  • the modification preferably relates to a modification as defined above, in particular in the appended claims 2 to 16.
  • the virus is more preferably a virus selected from the group as defined above, in particular according to the appended claims 17 to 19.
  • step b) affects region aa 293-296 if APV or hMPV is affected and affects region aa 323-328 if RSV is affected.
  • provision of a modification is preferably obtained as follows:
  • Changes are made in the fusion protein sequence, for example by PCR amplification, using primers that have been changed compared to the original sequence.
  • the sequence of primers 3.82 Sst neg and 3.82 Sst pos follow the embodiment sequence, except for the substitution of agg aaa aag aaa by agg aga cgc cgc.
  • Two PCRs, one from the leader side up to 3.82 Sst neg and the other from 3.82 Sst pos to a position downstream (trailer direction) are performed. Specifically, the PCR from LTZ 3.
  • lXho + to 3.82Sst- (designated as 3a) will have the changed sequence (change from aa, coding for RRRR) and will also contain a Sstll RE site (together with the neighboring gg, directly downstream) / up from this sequence, [Sstll recognition site ccgcgg]).
  • the PCR between the primers 3.82 Sstll pos and LTZ 4.6 Sal- (referred to as 3b) produces the same changes in the adjacent fragment, therefore when the two PCR products are cut with SstII and ligated together, the product becomes the have the original LTZ 3. lXho + to LTZ 4.6 Sal sequence, except for the change indicated above.
  • 3a is cloned first (bluntly), then - after checking the sequence - PCR 3b is added (after both the plasmid and 3b have been cut with Sstll and Sall).
  • the method can also be used for much longer PCRs using the same primers (3.82 Sst neg and 3.82 Sst pos) and their ligation will result in DNA that Sstll can be cut and then ligated together to go directly for virus rescue to be used, thereby avoiding any stages of cloning. In this way, it should be possible to generate rapidly attenuated viruses from either field isolates or RNA extracts.
  • FIGS. 2 and 3 A preferred cloning strategy is given in FIGS. 2 and 3.
  • the genome fragments were originally cloned in TWF 18 (LTZ T7 1 to LTZ 9 + 10 HDVR).
  • Each cloned area (starting with LTZ T7 1 and ending with LTZ 9 + 10 HDVR) was digested with Xhol and Sall, then each was sequentially cloned into CTPE.
  • ligation of the cut Sall (plasmid) and Xhol (leader end of the LTZ fragment) sites at the leader of the fragment resulted in the intragome sequence that is resistant to both enzymes, while a combination of two Sall cut ends at the trailer end ensured that Sall could still be there to be able to accept the next fragment. Therefore, after the addition of each genome area and subsequent cloning, the plasmid was digested again with Insert Sall and the next area (cut out of TWF with Xhol and Sall) was cloned into it.
  • a vaccine comprising a mixture of two or more live attenuated viruses, whereby one or more of the live attenuated viruses according to the present invention are obtained, i.e. a modification in the amino acid sequence at positions aa 293-296 or in a region with the same functionality as aa 323-328 in RSV of the F protein.
  • the present invention also relates to an attenuated live virus belonging to the genus metapneumovirus or RSV or to a virus which has a significant genetic homology in the F protein with viruses of the genus metapneumovirus, which is characterized in that it is a modification in region aa 293 -296 or a region with the same functionality, such as aa 323-328 in RSV, the F protein. Both the modification and the virus are as defined above.
  • the present invention also relates to a host cell comprising a virus that is attenuated by modification as described above.
  • the present invention also relates to a DNA or cDNA sequence as defined in one of SEQ ID NO 28 to 34. All these sequences 28 to 34 are total length sequences of the F protein of human metapneumovirus, comprising one suitable modification in region aa 293-296, which provide an attenuated live human metapneumovirus.
  • the present invention also relates to RNA sequences corresponding to the DNA sequences v / ie defined in SEQ ID NO 28 to 34.
  • the present invention also relates to a vector as well as a plasmid comprising the DNA, cDNA or RNA sequence as defined above.
  • the present invention further relates to a live attenuated virus obtainable by the method as described above.
  • the present invention also relates to an F protein of a member of the genus metapneumovirus or RSV or a virus which shares a significant genetic homology in the F protein range with a member of the genus metapneumovirus, characterized in that it comprises a modification or modifications as defined above , ie a modification (modifications) of the amino acids at positions 293-296 or in a region with the same functionality, e.g. aa 323-328 at RSV.
  • the modifications (modifications) that may be contained in the F protein according to the present invention are defined above.
  • the present invention also relates to the use of the F protein as defined above or an attenuated live virus as defined above for the production of a vaccine for the prevention of a disorder or disease caused by a virus as defined above.
  • the F protein or live attenuated virus of the present invention can be used to prepare a vaccine for preventing a disorder or disease caused by any of the following viruses: APV type A, B, C or non-A, non-B human metapneumovirus RS virus.
  • the leader area PCR used the APV-Lead primed RT reaction as a template and the PCR primers were APV-Lead ext (5 'ACGAGAAAAAAACGCATTCAAGCAGGTTCT3') (SEQ ID NO 37) and LTZ 8.2 sal neg (5 'GGGTATCTATGATGGTCGACAGATGTG3') (SE ID NO 38).
  • the trailer area used M2Start + primed RT reaction as a template and PCR primers were LT7
  • PCR primers included the sequence modifications that introduced restriction endonuclease recognition sites or other changes to DNA extremities and 3 'extremities, while, with the exception of LTZ 3, the encoded protein sequence remained unchanged.
  • the T7 promoter was added to the viral leader sequence in LTZ 1T7, a shortened form of the human RNA polymerase 1 promoter (pol 1) was added to the viral leader sequence in LTZ 1 pol, the region which encoded aa 293-296 of the fusion protein was changed so that RKKK became RRRR in LTZ 3 and in LTZ 10 HDVR the hepatitis delta virus ribozyme was added to the viral trailer area (LTZ 9 + 10).
  • the changes in the F protein gene sequence increased the number of mutations needed to allow the sequence to mutate into a sequence encoding acidic amino acids, as detailed in Figure 4.
  • each blunt-ended PCR product was ligated into the purpose-built plasmid pTWF 18, which was a pUC 18-derived plasmid in which the Sall site had been changed to EcoRI.
  • the plasmid was copied and modified using a modifying primer (pl8-eco420- 5 'TAG AAT TCA CCT GCA GGC ATG C3' (SEQ ID NO 60) in a pfu-based PCR (cycle 94 ° C 5s, 60 ° C 20s, 68 ° C 3 Min.
  • LTZ regions were ligated into the smal site of pTWFl ⁇ (Bioline QS ligase, 14 ° C. overnight). The ligation mixtures were used to transform competent DH5alpha cells. All bacterial cultivation work with plasmids containing the LTZ genome or portions thereof was done at 30 ° C based on stability considerations. LTZ 3 was cloned in half in pUC 18. The 5 'half (3a, antigenome sense) was amplified and modified using the primers LTZ 3.1 Xho + and F 3.82 Sst neg (see Table 2) in a PCR of 30 cycles (94 ° C 5s, 45 ° C 20s, 68 ° C 2 min.
  • the low copy plasmid pCTPE was a modification of pOLTV5 (Peeters et al (1999), J. Virol. 23, 5001-5009), in which the cloning efficiency was achieved by removing HDVR, T7 terminator and the remaining partial lac z genome regions using a Similar approach to that used to generate pTWFl ⁇ was strengthened.
  • both PCR primers were modifying (V5 630BE + 5 'CGG ATA TCC ACA GGA TCC GGG GAT AAC GC3' (SEQ ID NO 62) and V5 190 Barn- 5 'CGA GAT CCT CGA GCC GGA TCC TC3' (SEQ ID NO 63) and introduced new EcoRV blunt-ended sites flanked on each side by BamHI sites All growth media contained 15 ⁇ g / ml kanamycin (Gibco, Invirogen, Paisley, UK).
  • LTZ T71 was cloned into the EcoRV site of pCTPE, producing pCTPE-LTZT71 and the overall sequence of the insert was confirmed. It was then digested with Sall, in which LTZ2, cut from pTWFl ⁇ (Xhol Sall double digest), was ligated and cloned (DH5alpha (Invitrogen), kanamycin plates and broth). The orientation was checked by comparing a BamHl digest with a 3amHl, Sall double digest. The plasmid with the correctly oriented insert (pCTPE-LTZT71, 2) was cut with Sall only, and Xhol and Sall digested LTZ 3 RRRR were added and ligated as before.
  • Nucleocapsid (N), phospho (P) and matrix 2 (M2) sequences from strain LTZ1 were copied and cloned.
  • the RNA was extracted (Rnease, Qiagen), which was then reverse transcribed and amplified by RT-PCR (Superscript 2 Invitrogen; BioX-Act, Bioline; cycle of 94 ° C 5s, 50 ° C 20s, 68 ° C 2 min. [increasing 10s per cycle after cycle 5], repeated 29 times) using primers (see below) that introduced the T7 promoter sequence just before the start codon of each gene and proceeded beyond each stop codon.
  • T7 pre-fixed genes were cloned into the smal site of pUC18 using a procedure identical to that used for TWF above. PCR products without a T7 promoter were cloned into the smal site of pTarget (mammalian expression vector, Promega, Southhampton, UK).
  • the viral polymerase gene (L) was cloned into regions in the EcoRV site of pCTPE using the sequential approach used for the complete viral genome. In this order T7 L start, LTZ 6 + 7, LTZ8, LTZ 9 + 10 were ligated in pCTPE.
  • LTZ T7 L start was a PCR product (30 cycles 94 ° C 5s, 60 ° C 20s, 68 ° C 2 min. [Increasing 10s per cycle after cycle 5] repeated 29 times using Pfu [Stratagene]) from the 12 cycle trailer PCR described above using the primers T7-L (Table 3) and LTZ 7.6Xho- (Table 2).
  • LTZ T7start was ligated into the CPTE EcoRV site while the following areas of pTWF18 (Sall and Xhol) were cut and ligated into the new unique Sall site that was introduced at each stage of the cloning. The orientation was checked as with the full length genome.
  • the L gene was also cloned into pTarget in a manner similar to that described for the starter sequence (generated using the primers L Start Xho + (Table 2) and LTZ 7.6Xho (Table 2)) and this was not a T7 promoter upstream.
  • the primers used were as follows: leader area, T7-APV lead 1 and F 3.82 sst pos (5 'CCA CTC TGT AGG AGA CGC CGC GGC AAT TAT GCT TG3' (SEQ ID NO 75); central area F 3.82 sst neg (5 1 CAA GCA TAA TTG CCG CGG CGT CTC CTA CAG AGT GG3 ') (SEQ ID NO 76) and LTZ 8.2 Sal and the trailer area used LTZ 8.2 Xho + and APV trail ext.
  • Vero cells (70% confluent) in 35 mm wells were washed once with 1.0 ml Optimem 1, then combined with chickenpox T7 polymerase combined with an MOI of 0.2. After an incubation period of 1 hour, the medium was removed and the cells were washed with 1 ml Optimem 1, then with 2 ml.
  • the supernatant was collected, passed through a 0.2 ⁇ m filter and used to inoculate fresh Vero cells. CPE was observed and the cells were stained for the presence of TRT antigen using indirect immunofluorescent staining. The virus was confirmed to be derived from the full-length copy made by sequencing PCR copies from the unique RRRR regions of the F gene and other Sall / Xhol junction regions.
  • Vero cells (70% confluent) or CEFs in 35 mm wells were washed once with 1.0 ml Optimem 1; then 2 ml of MEM (5%) FCS was added.
  • the DNA / Fugene 6 (Boehringer Mannheim) complex was prepared by the four cloned carrier protein genes N, P, M2 (each 0.5 ⁇ g), L (50 ⁇ g) in pTarget, poll full-length genome (1 ⁇ g, cloned in pCPTE) and 10 ul Fugene 6 (Boehringer Mannheim) were mixed and dissolved in 300 ul dMEM. After complete mixing, this mixture was added dropwise to cells with gentle shaking.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Impfstoff gegen Mitglieder der Gattung Metapneumovirus oder RSV oder ein Virus, das eine bedeutende genetische Homologie im F-Protein zu Mitgliedern der Gattung Metapneumovirus aufweist, wobei der Impfstoff ein attenuierter Lebendimpfstoff ist. Insbesondere ist der Impfstoff gegen Metapneumovirus von aviärem oder menschlichem Ursprung gerichtet.

Description

Attenuierung von Metapneumovirus
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Impfstoff gegen Mitglieder der Gattung Metapneumovirus oder RSV, wobei der Impfstoff ein attenuierter Lebendimpfstoff ist. Insbesondere ist der Impfstoff gegen Metapneumovirus von aviärem oder menschlichem Ursprung gerichtet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Herstellung eines Impfstoffs, der gegen Mitglieder der Gattung Metapneumovirus oder RSV gerichtet ist. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein attenuiertes lebendes Virus, das der Gattung Metapneumovirus angehört. Sie betrifft auch eine Wirtszelle, umfassend ein solches Virus. Die vorliegende Erfindung ist auch auf eine spezifische DNA- oder cDNA- oder RNA-Sequenz wie auch einen Vektor oder ein Plasmid gerichtet, umfassend die DNA-, cDNA- oder RNA- Sequenz .
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein F-Protein, das modifiziert ist und die Verwendung des F-?roteins für die Herstellung eines Impfstoffs zur Verhinderung einer Störung oder Krankheit, ausgelöst durch Viren, die der Gattung Metapneumovirus angehören oder RSV.
Die Paramyxovirinae- und Pneumovirinae-Subfamilien der Paramyxoviridae-Familie beinhalten mehrere wichtige Pathogene für Menschen und Tiere. Die Pneumovirinae sind taxonomisch in die Pneumovirus- und die Metapneumovirus-Gattung unterteilt. Das menschliche respiratorische syncytische Virus, die Typart der Pneumovirus-Gattung, die auch unten weiter beschrieben wird, gilt als einziger und wichtigster Auslöser von Erkrankungen des unteren Respirationstrakts im Babyalter und während der frühen Kindheit weltweit. Andere Mitglieder der Gattung Pneumovirus beinhalten das bovine respiratorische syncytische Virus, das ovine respiratorische syncytische Virus und das Pneumonievirus bei Mäusen. Das aviäre Pneumovirus APV wird ebenfalls unten weiter beschrieben, und war früher als Truthahn-Rhinotracheitis-Virus (TRTV) bekannt Es gilt als etiologisches Agens von oberer RTI und wurde früher als einziges Mitglied der vor kurzem geschaffenen Gattung Metapneumovirus betrachtet.
Die Familie der Paramyxoviridae umfaßt eine Vielzahl von unterschiedlichen Viren, die an unterschiedlichen mehr oder weniger schweren Störungen oder Erkrankungen sowohl bei Menschen als auch bei Tieren beteiligt sind. Die Paramyxoviridae enthalten ein einzelnes Molekül einer einzelsträngigen negativen RNA als Genom und sind alle mit akuter respiratorischer Erkrankung des Wirts assoziiert (Pringe, C.R. (1987) in Molecular Basis of Virus Disease, Hrsg. W.C. Russell und J.W. Almond, Society for General Microbiology, Bd. 40, Seiten 91-138, Cambridge University Press) . Von den vielen Viren dieser Familie hat das respiratorische syncytische Virus (RS -Virus) nach dem Masernvirus die signifikanteste klinische Wirkung beim Menschen. Das menschliche RS -Virus ist der Hauptgrund für schwere Erkrankungen des unteren Respirationstrakts bei Kindern, was weltweit zu jährlichen Epidemien führt (Chanock et al . , 1991, in "Viral Infections of Humans", Seiten 525-544, Hrsg. A.S. Evans, Plenum Press) . Obwohl es zwischen den Pneumoviren, zu denen das RS-Virus gehört, und anderen Paramyxoviridae nur eine beschränkte Nucleotid- oder Aminosäuresequenz-Homologie gibt, gibt es gev/isse wichtige Strukturmerkmale, wie das Hauptnucleoprotein (N) und das F-Protein (F) , die in Proteinen mit ähnlichen Funktionen in einem breiten Bereich von Viren konserviert sind (Barr et al., 1991, J. of Gen. Virol . 72, 677-685; Chambers et al . , 1990, J. of Gen. Virol. 71, 3075-3080). Bei den Paramyxoviridae werden verschiedene RNA-Syntheseverfahren durch den Helionucleocapsidkomplex durchgeführt, der durch eine Assoziation der genomischen RNA, das Nucleoprotein, ein Phosphoprotein (P) und das Polymerase- (L) -Protein gebildet wird. Die Funktion des Nucleoproteinkomplexes hängt von der Gegenwart aller drei Proteine, die in Wechselwirkung miteinander sowie der genomischen RNA und möglicherweise mit anderen Virus- und/oder Zellbestandteilen treten, ab (Barik, 1992, J. of Virol. 66, 6813-6818). Die Reifung des Virions hängt von einer Reihe von Wechselwirkungen zwischen dem Ribonucleoproteinkomplex, dem Matrix- (M) -Protein und den Virusglycoproteinen ab, die in die modifizierte Zellmembran eingebettet sind. Bei Pneumoviren, wie RS, sind zwei weitere Proteine, nämlich ein membranassoziiertes kleines hydrophobes (SH) -Protein und ein zweites Matrixprotein (M2) ebenfalls an der Virionstruktur und vermutlich dem Zusammenbau beteiligt, jedoch in noch kaum verstandener Weise. Die Funktion der Pneumovirusproteine, die als NS1 und NS2 bezeichnet werden, ist nicht bekannt und sie scheinen nicht einen Teil des Viruspartikels zu bilden (Collins, 1991, in The Paramyxoviruses, Seiten 103-162, Hrsg. D.W. Kingsbury, Plenum Press) .
Ein weiteres ökonomisch wichtiges Virus, das zur Familie der Paramyxoviridae gehört, ist das APV-Virus, das früher als TRT-Virus bezeichnet wurde. Das APV-Virus ist ein Mitglied der Gattung Metapneumovirus. Es löst die Truthahn- Rhinotracheitis aus, wobei es sich um eine akute respiratorische Erkrankung bei Truthähnen handelt. Es wurde erstmalig Ende der siebziger Jahre in Südafrika und später in Europa und anderen Teilen der Welt beschrieben. Die Krankheit ist eine der Hauptgründe für ökonomische Verluste in der Truthahnindustrie in den letzten Jahren. In Europa werden im allgemeinen die Serotypen A und B von APV gefunden, während in den USA ähnliche Infektionen in Colorado nachgewiesen wurden. Der daraus isolierte APV-Stamm ist der sogenannte Colorado- oder C-Stamm. Ein anderer APV-Stamm wurde aus Enten in Frankreich isoliert. Abgesehen von den Typen A, B und C gibt es vermutlich weitere non-A, non-B-Arten von APV. Dadurch ist APV ein aviäres Mitglied der Gattung Metapneumovirus, das erstmalig aus Vögeln isoliert wurde. Die aviären Metapneumoviren sind vermutlich auch an dem "swollen head syndrome" beteiligt, das zu massiven Produktionsverlusten bei Hennen führen kann. Das aviäre Metapneumovirus (APV) ist ein pleo orphes RNA-Virus mit einem in der Hülle lokalisierten Fusionsprotein (F) und Spikes, bestehend aus Glycoproteinen (G) . Es wird als "Metapneumovirus" bezeichnet. Das Virus hat keine hämagluttinierenden Eigenschaften. Basierend auf den Nucleotiden und der geschätzten Aminosäuresequenz des Glycoproteins (G) wurde das ursprüngliche APV in zwei Unterarten klassifiziert. Ursprünglich v/ar APV aus Südafrika und Großbritannien von der Unterart A und die weiteren europäischen APV-Stä me gehörten zum Subtyp B. Wie oben angegeben, ist jetzt auch der Subtyp C bekannt, zusätzlich zu vermutlich weiteren Subtypen, die non-A non-B sind.
Das aviäre Metapneumovirus kann in Trachealringkulturen kultiviert werden, wo es eine ciliostatische Wirkung ausübt. Weiterhin kann es in embryonisierten Eiern und anderer. Zellkulturen kultiviert werden. Die amerikanischen Stämme wurden auch in HEF (Embryofibroblasten von Hennen) , Verozellen und embryonisierten Eiern kultiviert.
Die klinischen Symptome der Truthahn-Rhinotracheitis korrespondieren zu denjenigen einer akuten rhinotracheitischen Infektion. Zwei bis drei Tage nach der Infektion sind die Tiere apathisch und zeigten Husten, Niesen und Kopfschütteln. Wenn sich die Infektion nicht kompliziert, sind die Tiere sieben bis acht Tage nach der Infektion v/ieder normal. Die klinischen Symptome bei Hennen korrespondieren zu denjenigen bei Truthähnen, sind in der Regel jedoch weniger schwer. Wenn zusätzlich E. coli oder andere Bakterien beteiligt sind, können hohe Verluste auftreten und die tatsächliche Zeitspanne der Krankheit kann in unangenehmer Weise verlängert werden. Jedoch führt APV bei Hühnern nur selten zu dem "swollen head syndrome" mit massiven Verlusten. Es ist wahrscheinlich wichtiger für die kontinuierlichen Verluste aufgrund geringerer klinischer Erkrankungen. Nach der Infektion mit konventionellem APV erzeugen Hennen und Truthähne neutralisierende Antikörper im Serum, die durch ELISA nachweisbar sind. Diese Antikörper scheinen keine wirkliche Bedeutung für die Kontrolle der Rhinotracheitis zu haben .
Mütterliche Antikörper sind für Küken gegen eine Frühinfektion mit viralem APV nicht wirksam. Zirkulierende Antikörper scheinen jedoch für den Schutz der Gonaden im Falle einer Infektion von älteren Tieren wichtig zu sein.
Lokale Antikörper scheinen eine wichtige protektive Wirkung aufzuweisen. Virusspezifische IgA- und IgG-Antikörper mit einem virusneutralisierenden Effekt treten nach Infektionen mit virulentem APV in der Tränenflüssigkeit auf. Bis zum jetzigen Zeitpunk ist für die Behandlung von APV- Infektionen keine Therapie bekannt. Mit Ausnahme der USA versucht man, APV durch Vakzinierung zu kontrollieren.
Ein anderes wichtiges Mitglied der Paramyxoviridae ist das neu entdeckte menschliche Metapneumovirus, das aus jungen Kindern mit einer Erkrankung des Respirationstrakts isoliert wurde. Dieses Virus wurde aus 28 jungen Kindern in den Niederlanden isoliert und wurde als neues Mitglied der Gattung Metapneumovirus, basierend auf virologischen Daten, Sequenzhomologie und Genkonstellation, identifiziert (Van Den Hoogen et al . , Nature, Medicine, Bd. 7, Nr. 6, Juni 2001, Seiten 719-724) . Bis zur Entdeckung dieses neuen Metapneumovirus wurde APV wie oben beschrieben als einziges Mitglied der kürzlich benannten Gattung Metapneumovirus angesehen (Virus Taxonomy, Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Hrsg. Van Regen ortel, M.H., Fauquet, CM. und Bishop, D.H.) 551, 557, 559-560 (Academic, San Diego, 2000) . In dem obigen Artikel ziehen die Autoren jedoch den Schluß, basierend auf einer Sequenzhomologie und der Genkonstellation, daß die menschlichen Viren ein neues Mitglied der Gattung Metapneumovirus zu sein scheinen und haben diese daher vorläufig als menschliches Metapneumovirus bezeichnet. Eine genetische Homologie zwischen dem menschlichen MPV und zum Beispiel APV in der Region des F-Proteins liegt z.B. so hoch wie 80 %. Es wird also angenommen, daß das menschliche Metapneumovirus ursprünglich aus Vögeln stammen könnte und sich vor Jahren in der menschlichen Population verteilt hat.
Wie bereits oben angegeben, gibt es bis jetzt keine Behandlung für die obigen Erkrankungen.
Daher fokussierte sich die Aufmerksamkeit auf die Vakzination. Jedoch auch bei der Vakzination gibt es bis jetzt noch keinen erhältlichen Impfstoff, der einen langzeitigen und sicheren Schutz gegen die obigen Erkrankungen, die mit Viren z.B. der Gattung Metapneumovirus assoziiert sind, gibt.
Im Hinblick auf RSV bleibt die Entwicklung eines Vakzins ein wichtiges Ziel im Hinblick auf die klinische Wichtigkeit dieses Pathogens. Die gegenwärtigen Ansätze involvieren die Verwendung von temperaturempfindlichen Mutanten. Versuche, einen geeigneten Impfstoff gegen das RS-Virus bereitzustellen, haben sich auf zwei interessante Bereiche fokussiert, die spezifische Region der Polymerase (L-Gen) , einschließlich der putativen ATP-Bindungsstelle und der hoch konservierten zentralen Domäne der Polymerase und eine Mutation in der extrazellulären Domäne des Fusionsproteins (F) , von dem nachgewiesen wurde, daß es auch in einem unabhängig abgeleiteten, kodierten aktiven attenuierten Mutanten vorliegt (Connors et al . , 1995, Virology 208, Seiten 478-484 und Tolley et al . , 1996, Vaccine 14, 1637-1646).
Es wird versucht, eine Kontrolle von APV zu erreichen, indem z.B. attenuierte Lebendimpfstoffe durch Passage eines virulenten aviären Metapneumovirus in vitro erzeugt werden. Es konnte gezeigt werden, daß ungefähr 100 Passagen in Trachealringkulturen die Virulenz nicht verminderten, jedoch limitierten 39 Passagen in Embryoblasten von Hühnern die Immunogenität wie auch die Virulenz. Die Passage in Vero- Zellen reduzierte die Virulenz auf Null, erhielt jedoch die Immunogenität im wesentlichen; dadurch konnten akzeptable Vakzine erzeugt werden.
Lebendvakzine werden in der Regel für Küken um Tag 1 als Spray oder Augentropfen verwendet. Einige Hersteller empfehlen, die Immunisierung mit Lebendvakzinen einmal oder mehrmals zu wiederholen. Die Lebendvakzine, die zur Zeit auf dem Markt sind, werden aus unterschiedlichen Stämmen von unterschiedlichen Arten erzeugt und sind mehr oder weniger attenuiert . Manchmal werden auch inaktivierte Vakzine für ältere Tiere verwendet, obwohl diese selbst in diesem Fall in der Regel zunächst mit einem Lebendvakzin vakziniert werden.
Bis jetzt sind die Lebendvakzine vom Subtyp A oder B. Ergebnisse unterschiedlicher experimenteller Studien zeigen, daß es eine gute Kreuzreakcivitäc zwischen den unterschiedlichen Stämmen gibt, jedoch scheint eine homologe Protektion kompletter zu sein. Im Hinblick auf das menschliche Metapneumovirus gibt es noch gar keinen Impfstoff, da dieses auch erst kürzlich entdeckt wurde. Jedoch insbesondere im Hinblick auf das menschliche Metapneumovirus würde es besonders wünschenswert sein, einen Impfstoff zu erhalten, der einen guten und wirksamen Schutz gegen das Virus bereitstellt, das zu schweren Erkrankungen bei Kindern führt.
Es ist jedoch für alle so weit bekannten Impfstoffe nachweisbar, daß sie instabil sind und daß sie unter geeigneten Bedingungen zu einer Virulenz zurückkehren können.
Solche Eigenschaften sind natürlich bei einem Impfstoff sehr unerwünscht .
Es ist daher eine Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, einen Impfstoff bereitzustellen, der ein attenuierter Lebendimpfstoff sein kann, der gegen Mitglieder der Virusgattung Metapneumovirus und RSV gerichtet ist.
Insbesondere ist es eine Aufgabe, ein attenuiertes Lebendvirus bereitzustellen, das gegen Pathogene der Mitglieder der Gattung Metapneumovirus, insbesondere menschliches Metapneumovirus und APV sowie gegen RSV wirksam ist .
Weiterhin ist es eine Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bereitstellung geeigneter Impfstoffe gegen die obigen Viren bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst; bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Gemäß Anspruch 1 wird ein Impfstoff gegen Mitglieder der Gattung Metapneumovirus und RSV sowie gegen Viren bereitgestellt, die eine bedeutende genetische Homologie im Bereich des F-Proteins zu Mitgliedern der Gattung Metapneumovirus aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Virus oder ein Teil eines Virus umfaßt, wobei das Virus in der Region aa 293-296 der Aminosäuresequenz des F-Proteins (Fusionsprotein) modifiziert ist, im Vergleich mit dem Wildtypvirus, oder in einer Region, die dieselbe Funktion wie aa 293-296 zeigt.
Mit "Teil eines Virus" ist gemeint, daß der Impfstoff mindestens denjenigen Teil des Virus umfassen sollte, der die Modifikation in Region aa 293-296 des F-Proteins oder einer funktionell ähnlichen Region umfaßt und alle weiteren Bestandteile des Virus, die notwendig sind, so daß das Virus als Impfstoff wirken kann, d.h. Immunogenität erzeugt, jedoch nicht virulent ist. Die Erzeugung eines solchen Virus liegt im allgemeinen Fachwissen eines Fachmanns. Die Erfindung wird weiterhin gemäß den hier eingeschlossenen Figuren beschrieben, wobei die Figuren das Folgende darstellen:
Fig. 1 Beispielhafte Sequenzänderungen während Attenuierung und Reversion
Fig. 2 Klonierungsstrategie
Fig. 3 ETC bis zum Gesamtgenom
Fig. 4 Veränderungen an Positionen aa 293-296 des Fusionsproteins
Die gewöhnliche Spaltungsstelle des Fusionsproteins F, die z.B. den A-Typ APVs und anderen APVs wie auch weiteren Mitgliedern der Paramyxoviridae gemein ist, weist ein Motiv mit basischen Aminosäuren auf, die ungefähr an Stelle aa 99-109 lokalisiert sind, wobei sie das F-Protein, wenn es durch Proteasen gespalten wird, in Fl und F2 trennt, wobei es die fusionsbezogene Domäne exponiert . Daher könnte die Bereitstellung einer erhöhten Anzahl basischer Aminosäuren in Region aa 293-296, bei der es sich um eine zweite Spaltungsstelle handeln könnte, oder einer funktioneil entsprechenden Stelle, zu einer ähnlichen Spaltungsstelle für Proteasen führen.
In der Regel wird das gesamte Virus verwendet, umfassend die Modifikation in Region aa 293-296 oder einer funktioneil entsprechenden Region der Aminosäuresequenz des F-Proteins. Um die Anordnung des F-Proteins in einem typischen Virus zu zeigen, insbesondere einem Metapneumovirus, wird auf Fig. 1 Bezug genommen. Figur 1 zeigt eine Möglichkeit von beispielhaften Sequenzveränderungen während Attenuierung und Reversion von Viren zu Virusimpfstoffen und zurück zu virulenten Viren. In Fig. 1 bedeuten die Abkürzungen das Folgende:
N: Nucleocapsid; Gen: ungefähr 1.200 Basen
P: Phosphoprotein; Gen: ungefähr 850 Basen
M: Matrix; Gen: ungefähr 800 Basen
F: Fusion; Gen: ungefähr 1.600 Basen
M2 : 2. Matrix; Gen: ungefähr 600 Basen
SH: klein hydrophob; Gen: ungefähr 500 Basen
G: Glycoprotein; Gen: ungefähr 1.100 Basen
L: Polymerase; Gen: ungefähr 7.000 Basen
Es wird angenommen, daß das Fusionsprotein für die Fusion mit der Zielmembran verantwortlich ist. Von M2 nimmt man an, daß es sich um einen Transkriptions-Elongationsfaktor handelt, der vermutlich für die Virusrettung essentiell ist. Es enthält einen zweiten Leserahmen, der nicht exprimiert zu sein scheint. Das G-Protein könnte für die Anhaftung an einen Zielzellrezeptor verantwortlich sein. Es ist hoch glycosyliert und zwischen verschiedenen Stämmen hoch variabel. Die L-Polymerase betrifft die Transkription und Replikation des Genoms. N, P und L kombinieren sich, um die minimale Replikationseinheit bereitzustellen, die Nucleocapsid genannt wird.
Insbesondere ist das Fusionsprotein für die Fusion des Virus mit der Zielzelle verantwortlich. Es wird als F0 translatiert und wird durch zelluläre Proteasen an aa-Stellungen 99-102 (RRRR) gespalten, um Fl (enthaltend die fusionsbezogene Domäne, membrangebunden) und F2 (das nach Spaltung an Fl durch Disulphidbrücken zwischen Cysteinspaltresten angehaftet bleibt) zu bilden. Wie im Detail unten erklärt, wird die Hypothese aufgestellt, daß die potentielle zusätzliche Spaltungsstelle (aa 293-296 bei APV und hMPV und aa 323-328 bei RSV) in irgendeiner Weise die Fusion verändert und daß dies den Gewebstropismus beeinflußt. Durchgezogene Pfeile in Fig. 1 zeigen an, daß auf DNA-Level während der Attenuierung eine Sequenzveränderung stattgefunden hat, während gestrichelte Pfeile anzeigen, daß Sequenzveränderungen während der Attenuierung und Reversion auf Proteinlevel stattgefunden haben. Auf der linken Seite ist die Virusanordnung die Virusanordnung des Wildtypvirus. Im Mittelteil von Fig. 1 ist die Virusanordnung, die in weiß dargestellt ist, die Virusanordnung eines attenuierten Virus, während auf der rechten Seite die Virusanordnung die zur Virulenz zurückgekehrte Anordnung eines Virus ist.
Aus Fig. 1 kann abgeleitet werden, daß es eine Vielzahl von möglichen Sequenzveränderungen gibt; die
Sequenzveränderungen, die während Attenuierung und Reversion auftreten können und die in Fig. 1 dargestellt sind, sind nur beispielhaft .
Der Vergleich von Sequenzen vom Wildtyp, attenuiertem Virus und revertiertem Virus zeigt deutlich, daß es eine Vielzahl von Mutationen und eine Vielzahl von Kombinationen von Mutationen geben kann, die während Attenuierung und Reversion auftreten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde überraschend festgestellt, daß eine Modifikation in der Region aa 293-296 oder einer Region mit derselben Funktionalität zu einer Erzeugung eines attenuierten Virus führt, das als Impfstoff gegen Mitglieder der Gattung Metapneumovirus oder RSV verwendet werden kann. Die vorliegenden Erfinder stellten fest, daß eine Modifikation in dieser Region ein attenuiertes Virus erzeugen wird, das seine Fähigkeit zur Virulenz verloren hat, während es immer noch eine vollständige Immunogenität bereitstellt. Außerdem wird die Modifikation in dieser Region das Risiko des Zurückkehrens zu einer Virulenz reduzieren. Für ein besseres Verständnis der weiteren Diskussion wird die folgende Tabelle 1 bereitgestellt, die einen Überblick über die 20 Aminosäuren, ihren Einzelbuchstabenkode (SLC) und ihre korrespondierenden DNA-Kodons bereitstellt.
Tabelle 1
20 Aminosäuren, ihr Einzelbuchstabenkode (SLC) und ihre korrespondierenden DNA-Kodons
Aminosäure SLC Typ DNA- Kodons
Isoleucin I ATT, ATC, ATA
Leucin L CTT, CTC, CTA, CTG, TTA, TTG
Valin V GTT, GTC, GTA, GTG
Phenylalanin F TTT, TTC
Methionin M ATG
Cystein C S-S TGT, TGC
Alanin A GCT, GCC, GCA, GCG
Glycin G GGT, GGC, GGA, GGG
Prolin P CCT, CCC, CCA, CCG
Threonin T 0 glycos ACT, ACC, ACA, ACG
Serin S 0 glycos TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC
Tyrosin Y TAT, TAC
Tryptophan W TGG
Glutamin Q CAA, CAG
Asparagin N N glycos AAT, AAC
Histidin H basisch CAT, CAC
Glutaminsäure E sauer GAA, GAG
Asparaginsäure D sauer GAT, GAC
Lysin K basisch AAA, AAG
Arginin R basisch CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
Stop-Kodons Stop TAA, TAG, TGA
Die Region aa 293-296 ist im F-Protein lokalisiert, nämlich dem Fusionsprotein, von Viren der Gattung Metapneumovirus und bei RSV. Die Lokalisierung der aa 293-296 Region ist zum Beispiel aus SEQ ID NOS 28 bis 34 ableitbar.
Die vorliegenden Erfinder konnten zeigen, daß, wenn die für die Aminosäuren in der aa 293-296 Region oder einer Region mit derselben Funktionalität, wie aa 323-328 in RSV des F-Gens kodierenden Kodons modifiziert wurden, attenuierte Virusstämme erzeugt werden konnten, die ihre Immunogenität erhielten, jedoch ihre Virulenz verloren.
Es scheint, daß diese aa 293-296 Region in APV und hMPV oder aa 323-328 im RSV für die Virulenzveränderung verantwortlich war.
Der Mechanismus hierfür ist noch unklar. Ohne an diese Hypothese gebunden sein zu wollen, stellen die vorliegenden Erfinder die Theorie auf, daß diese Region durch Serinproteasen gespalten wird, jedoch durch S-S-Bindungen angehaftet bleibt, in ähnlicher Weise wie im Hinblick auf F-l und F-2. Ein PAGE des Impfstoffs zeigt, daß es Mobilitätsveränderungen im Vergleich zum Feldvirus gibt, was mit einem solchen Ereignis assoziiert sein könnte.
Die aa 293-296 Region bei APV und hMPV wie auch aa 323-328 bei RSV scheint im wesentlichen hydrophil zu sein, wobei die meisten Aminosäuren geladen sind (R, K, H, E, D) oder polar (S) . Nur eine Aminosäure, Glycin (G) , ist schwach hydrophob.
Die folgenden Aminosäuresequenzen sind typisch für unterschiedliche Mitglieder der Gattung Metapneumovirus in der Region aa 293-296:
APV Typ A RKEK (SEQ ID No 24), RKKE, REEK APV Typ B RHER (SEQ ID No 25) APV Typ C SGKD (SEQ ID No 26) menschlicher Metapneumovirus: SGKK (SEQ ID No 27)
Die folgenden Aminosäuresequenzen sind typisch für unterschiedliche Mitglieder von RSV in aa 323-328:
1: TTDNKE (SEQ ID No 79)
2 : TTNIKE (SEQ ID No 78)
3 : TTNTKE (SEQ ID No 77) Im folgenden ist, wenn auf humanen Metapneumovirus Bezug genommen wird, der humane Metapneumovirus gemeint, wie definiert gemäß dem Artikel von Van den Hoogen et al . , Nature, Medicine, Bd. 7, Nr. 6, Juni 2001, Seiten 719-724. Es erscheint wahrscheinlich, daß die hydrophile Region benötigt wird, um dem Fuktionsprotein Funktion und Struktur zu verleihen. Daher sollte die Gegenwart von basischen Aminosäuren die Spaltung durch Serinproteasen begünstigen; dementsprechend sollte eine geeignete Modifikation der vier Aminosäuren in der Region aa 293-296 in APV oder hMPV wie auch eine geeignete Modifikation von aa 323-328 in RSV universell attenuierend wirken.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das oben beschriebene Virus ein attenuiertes Lebendvirus. Attenuierte Lebendviren sind auf dem Gebiet bekannt, und ihre Herstellung kann durch einen Fachmann einfach durchgeführt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung muß das attenuierte Lebendvirus eine Modifikation in Region aa 293-296 der Aminosäuresequenz des Fusionsproteins im Vergleich mit dem Wildtyp oder in einer Region mit derselben Funktionalität, wie z.B. aa 323-328 in RSV, beinhalten. Die Attenuation des Virus geschieht durch die Modifikation in der (den) obigen Region (en). Zusätzlich können bekannte Attenuierungsverfahren verwendet v/erden, die für diese Viren bereits bekannt sind.
Vorzugsweise umfaßt die Modifikation eine Stabilisierung der Region aa 293-296 oder einer Region mit derselben Funktionalität wie aa 323-328 bei RSV in dem Virus.
Die Bezeichnung "Stabilisierung" soll hier eine Situation beschreiben, in der die Aminosäuren an Position aa 293-296 oder einer Region mit derselben Funktionalität, wie aa 323-328 bei RSV, durch Kodons kodiert werden, die nicht leicht zum Wildtyp zurückkehren können. Vorzugsweise wird eine solche Stabilisierung durch eine Substitution von Kodons erreicht, die für Aminosäuren in der Region kodieren, durch Kodons, die mehr Mutationen benötigen, um zum Wildtyp zurückzukehren. Eine solche Stabilisierung wird beispielhaft wie folgt dargestellt:
In diesem Beispiel ist es das Ziel, die Aminosäure Glutaminsäure (E) durch eine basische Aminosäure zu ersetzen. Glutaminsäure wird durch das DNA-Kodon GAA oder GAG kodiert. Wenn die Aminosäure Lysin (K) gewählt wird, um Glutaminsäure zu ersetzen, ergibt sich die folgende Situation: Lysin wird durch das DNA-Kodon AAA oder AAG kodiert. Wenn das DNA-Kodon AAA für Lysin gewählt wird, wird eine Mutation benötigt, um zum DNA-Kodon GAA, d.h. Glutaminsäure, zurückzukehren. Dasselbe gilt, wenn das DNA-Kodon AAG gewählt wird, das eine Mutation benötigt, um zum DNA-Kodon GAG zurückzukehren, was wiederum für Glutaminsäure kodiert. Wenn zum Beispiel jedoch das DNA-Kodon CGT (das für die basische Aminosäure Arginin (R) kodiert) gewählt wird, sind drei Mutationen notwendig, wenn die DNA-Kodons GAA oder GAG wieder erreicht werden sollen, die für Glutaminsäure kodieren. Daher werden durch die Auswahl des Kodons CGT (für Arginin) zum Ersatz des Kodons für Glutaminsäure mehr Mutationen benötigt, um zum Glutaminsäure DNA-Kodon zurückzukehren und daher wird eine höhere Stabilisierung erreicht.
Daher wird gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die Stabilisierung durch Substitution von Kodons erreicht, die für die Aminosäure in der Region kodieren, vorzugsweise die sauren Aminosäuren in dieser Region, durch Kodons, die mit weniger großer Wahrscheinlichkeit zu einem Kodon mutieren, das für Glutaminsäure kodiert. Die vorliegenden Erfinder haben festgestellt, daß die Gegenwart von Glutaminsäure in der Region aa 293-296 oder einer Region mit derselben Funktionalität, wie z.B. aa 323-328 bei RSV des F-Proteins von Viren, die Attenuierung verringert oder verhindert und die Virulenz verstärkt. Es gibt in keinem Dokument aus dem Stand der Technik irgendeinen Hinweis, der sich auf diese Entdeckung bezieht. Glutaminsäure, wie auch andere saure Aminosäuren, scheinen zur Virulenz des Virus beizutragen, wenn sie in der Region aa 293-296 oder einer Region mit derselben Funktionalität, wie aa 323-328 bei RSV, des F-Proteins, lokalisiert sind. Wie oben angegeben, könnte diese Verstärkung der Virulenz mit gleichzeitiger Abschwächung oder Eliminierung der Attenuierung einer Situation zugeschrieben werden, in der hydrophile Regionen benötigt werden, um dem F-Protein eine funktionelle Struktur zu vermitteln, während die Gegenwart von basischen Aminosäuren eine Serinproteasespaltung begünstigen würde.
Daher umfaßt gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die Modifikation in Region aa 293-296 oder einer Region mit derselben Funktionalität, wie aa 323-328 bei RSV, des F-Proteins von Viren, bevorzugt der Gattung Metapneumovirus, die Substitution von mindestens einer nichtbasischen Aminosäure durch eine basische Aminosäure. Noch bevorzugter werden mindestens zwei nichtbasische Aminosäuren durch basische Aminosäuren ersetzt. Noch bevorzugter werden mindestens drei nichtbasische Aminosäuren durch basische Aminosäuren ersetzt. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Aminosäuren in der Region aa 293-296 des F-Proteins von hMPV oder APV so modifiziert, daß alle vier Aminosäuren basische Aminosäuren sind.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind alle sechs Aminosäuren der Region aa 323-328 in RSV basische Aminosäuren.
Gemäß einer alternativen bevorzugten Ausführungsform kann die Modifikation die Zugabe von mindestens einer Aminosäure umfassen. Diese Zugabe von mindestens einer Aminosäure kann zusätzlich zu der oben erwähnten Substitution durchgeführt werden. Vorzugsweise betrifft die Zugabe von mindestens einer Aminosäure die Zugabe von mindestens einer basischen Aminosäure, bevorzugt Arginin, Lysin und/oder Histidin, besonders bevorzugt Arginin oder Lysin.
Gemäß einer weiteren Alternative kann die Modifikation auch die Deletion von mindestens einer Aminosäure umfassen. Vorzugsweise ist diese mindestens eine deletierte Aminosäure eine saure Aminosäure.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführun sform umfaßt die Modifikation die Substitution von mindestens einem Glutaminsäurerest durch mindestens eine basische Aminosäure. Die basische Aminosäure wird vorzugsweise ausgewählt aus der folgenden Gruppe, bestehend aus Arginin, Lysin und/oder Histidin. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Arginin und/oder Lysin.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Region aa 293-296 des Wildtypvirus eine Sequenz wie dargestellt in einer der SEQ ID NO 24 bis 27 auf.
SEQ ID NO 24 stellt zum Beispiel die Aminosäuren in Region aa 293-296 des Wildtyp APV-A-Starnms Nr. 8544 dar, nämlich
RKEK.
SEQ ID NO 25 stellt zum Beispiel die typischen Aminosäuren in Region aa 293-296 von APV-B-Viren dar, nämlich
RHER.
SEQ ID NO 26 stellt zum Beispiel die typischen Aminosäuren in Stellungen aa 293-296 von Viren des APV-C-Typs dar, nämlich
SGKD. SEQ ID NO 27 stellt zum Beispiel die Aminosäuren in Stellungen aa 293-296 von menschlichem Metapneumovirus dar, nämlich
SGKK.
Die Bezeichnung "Wildtypvirus", wie verwendet gemäß der vorliegenden Erfindung, betrifft diejenigen Viren, die keine Mutationen in Positionen 293-296 oder einer Region mit derselben Funktionalität (wie z.B. aa 323-328 bei RSV) des F-Proteins aufweisen. Im Regelfall ist ein solches Wildtypvirus ein virulentes Virus. Es ist jedoch auch möglich, ein bereits attenuiertes Lebendvirus als Wildtypvirus der vorliegenden Erfindung zu verwenden, das dann weiter durch die Modifikationen in Stellungen aa 293-296 oder in einer Region rr.it derselben Funktionalität, wie aa 323-328 bei RSV, des F-Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung attenuiert wird.
Bevorzugte Viren, die Wildtypviren im Sinne der vorliegenden Erfindung sein können, sind menschliches Metapneumovirus, APV-Virus der Typen A, B, C oder non-A, non-B oder RS-Virus.
Vorzugsweise weist die aa 293-296 Region des attenuierten Virus eine Sequenz auf, wie dargestellt in einer der SEQ ID NO 1 bis 23.
SEQ ID NO 1 bis 23 können auch gewählt werden, um einen Bestandteil der Region aa 323-328 im RS-Virus zu bilden.
SEQ ID NO 1 ist eine beispielhafte Aminosäuresequenz in Stellung aa 293-296, wodurch zum Beispiel ein attenuierter Stamm, der als Impfstoff verwendbar ist, für z.B. Stamm Nr. 8544 (APV-Typ A) bereitgestellt werden kann. Diese SEQ ID NO 1, nämlich
RRRR könnte zum Beispiel auch ein attenuiertes menschliches Metapneumovirus oder ein attenuiertes APV-Virus vom B- oder C-Typ oder non-A- non-B-Typ bereitstellen.
Durch Modifikation der Aminosäuren oder der Kodons, die für die Aminosäuren kodieren, an Stellungen aa 293-296 oder in einer Region mit derselben Funktionalität, wie z.B. aa 323-328 bei RSV, des F-Proteins wie offenbart gemäß der vorliegenden Erfindung, ist es möglich, ein attenuiertes Lebendvirus bereitzustellen, das als Impfstoff verwendbar ist .
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Region aa 293-296 des Wildtypvirus die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO 24 auf, wobei die Region des attenuierten Virus eine Sequenz wie dargestellt in SEQ ID NO 1 aufweist . Eine solche Ausführungsform würde ein attenuiertes Lebensvirus für APV-Typ-A, z.B. Stamm Nr. 8544, bereitstellen.
Gemäß einer weiteren spezifisch bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Region aa 293-296 des Wildtypvirus die in SEQ ID NO 27 dargestellte Sequenz auf, wobei die Region des attenuierten Virus die in SEQ ID NO 1, 2, 10 oder 21 dargestellte Sequenz aufweist. Eine solche Modifikation in Region aa 293-296 würde zum Beispiel ein attenuiertes Lebendvirus für das menschliche Metapneumovirus bereitstellen. Die bevorzugten Sequenzen, v/ie dargestellt in SEQ ID NO 1 bis 23, können auch ein oder mehrere Histidine als Ersatz für entweder Lysin oder Arginin umfassen. Das Obige ist mutatis mutandis ebenfalls für die Region aa 323-328 von RSV anwendbar.
Wie oben dargestellt, wird die vorliegende Modifikation in Region aa 293-296 oder in einer Region mit derselben Funktionalität, wie aa 323-328 bei RSV, des F-Proteins zu einer Bereitstellung von attenuierten Lebendviren z.B. der Gattung Metapneumovirus oder RSV führen, die das gemeinsame Merkmal eines F-Proteins mit einer substantiellen genetischen Homologie zwischen den Sequenzen der jeweiligen F-Proteine bei diesen Viren aufweisen. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Impfstoff, der gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, gegen das menschliche Metapneumovirus wirksam. Weiterhin bevorzugt ist das Metapneumovirus aviäres Metapneumovirus, insbesondere APV.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf Metapneumovirus begrenzt, sondern ist für all diejenigen Viren anwendbar, die eine deutliche genetische Homologie, z.B. mehr als 50 %, vorzugsweise mehr als 65 %, besonders bevorzugt mehr als 75 % Sequenzhomologie, bestimmt basierend auf
Sequenzhomologiestudien unter hoch stringenten Bedingungen, im Bereich des F-Proteins mit Mitgliedern der Gattung Metapneumovirus, insbesondere mit APV oder menschlichem Metapneumovirus, aufweisen.
Vorzugsweise wird das attenuierte Lebendvirus mit einem geeigneten Hilfsstoff und/oder Träger und/oder Adjuvans formuliert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Virus ein attenuiertes Lebendvirus, das mit einer geeigneten Menge Interleukin-6 (IL-6) formuliert wird. Die Formulierung mit Interleukin-6 wird besonders bevorzugt, wenn das Virus ein aviäres Metapneumovirus ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Virus ein attenuiertes Virus und wird mit einer geeigneten Menge Interleukin-12 (IL-12) und/oder Interleukin-18 (ΪL-18) formuliert. Das attenuierte Virus wird vorzugsweise mit Interleukin-12 und/oder Interleukin-18 formuliert, wenn das Virus ein menschliches Metapneumovirus oder RSV ist.
Die Bezeichnung "eine geeignete Menge" im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet eine Menge, die, wenn sie mit dem attenuierten Virus gemäß der vorliegenden Erfindung formuliert wird, die gewünschte Wirkung bereitstellt, jedoch die Verwendbarkeit des attenuierten Lebendvirus als Impfstoff nicht nachteilig beeinflußt.
Geeignete Mengen können vom Fachmann bestimmt werden und werden von dem verwendeten attenuierten Virus und dem zu behandelnden Subjekt abhängen, z.B. in Hinblick auf Alter, Gewicht, Körperzustand und die zu behandelnde Krankheit.
Ein Verfahren für die Erzeugung eines Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung, gerichtet z.B. gegen Mitglieder der Gattung Metapneumovirus, umfaßt die folgenden Schritte:
a) Bereitstellung eines virulenten Virus, gegen das ein Impfstoff entwickelt werden soll,
b) Bereitstellung einer Modifikation in der Nucleinsäuresequenz, die für Region aa 293-296 kodiert oder einer Region mit derselben Funktionalität, wie aa 323-328 bei RSV, des F-Proteins des Virus, und
c) Erhalt eines attenuierten Lebendvirus, umfassend die obige Modifikation.
Vorzugsweise betrifft die Modifikation eine Modifikation wie oben definiert, insbesondere in den beigefügten Ansprüchen 2 bis 16.
Weiter bevorzugt ist das Virus ein Virus, ausgewählt aus der Gruppe wie oben definiert, insbesondere gemäß den beigefügten Ansprüchen 17 bis 19.
Insbesondere betrifft die in Schritt b) oben genannte Modifikation die Region aa 293-296, wenn APV oder hMPV betroffen ist, und betrifft Region aa 323-328, wenn RSV betroffen ist. Wiederum wird die Bereitstellung einer Modifikation vorzugsweise wie folgt erhalten:
i) Herstellung einer Gesamtlängen-DNA-Kopie des viralen Genoms des Virus, gegen das ein Impfstoff entwickelt werden soll,
ii) Bereitstellung von Kopien von Gesamtlängen-DNA durch Ligation von Teillängen-PCR-Produkten, die eine Veränderung in Region aa 293-296 oder eine Region mit derselben Funktionalität, wie aa 323-328 bei RSV, einführen,
iii) Virusrettung von den Gesamtlängen-DNA-Kopien durch Verwendung von z.B. Hühnerpocken-T7- Polymeraserekombinant oder zellulärer ribosomaler pol 1 RNA-Polymerase .
Natürlich sind die spezifischen Verfahren, die verwendet werden um Mutationen an einer spezifischen Stelle in einem Genom einzuführen, dem Fachmann bekannt und/oder die gewöhnlichen Verfahren sind hier anwendbar.
Veränderungen werden in der Fusionsproteinsequenz z.B. durch PCR-Amplifikation durchgeführt, unter Verwendung von Primern, die im Vergleich mit der ursprünglichen Sequenz verändert sind. Die Sequenz von Primern 3,82 Sst neg und 3,82 Sst pos folgen der Ausführungsformsequenz, außer im Hinblick auf die Substitution von agg aaa aag aaa durch agg aga cgc cgc . Zwei PCRs, eine von der Leaderseite bis zu 3,82 Sst neg und die andere von 3,82 Sst pos zu einer Position stromabwärts (Trailerrichtung) werden durchgeführt. Spezifisch wird die PCR von LTZ 3. lXho+ bis 3,82Sst- (bezeichnet als 3a) die veränderte Sequenz aufweisen (Veränderung von aa, kodierend zu RRRR) und wird außerdem eine Sstll RE-Stelle enthalten (zusammen mit den benachbarten gg, direkt stromabv/ärts von dieser Sequenz, [Sstll Erkennungsstelle ccgcgg] ) . Die PCR zwischen den Primern 3,82 Sstll pos und LTZ 4,6 Sal- (bezeichnet als 3b) erzeugt dieselben Veränderungen in dem benachbarten Fragment, daher, wenn die beiden PCR- Produkte mit Sstll geschnitten und miteinander ligiert werden, wird das Produkt die ursprüngliche LTZ 3. lXho+ bis LTZ 4.6 Sal- Sequenz aufweisen, bis auf die oben angegebene Veränderung.
In der Praxis wird 3a zunächst (stumpf) kloniert, dann - nach Überprüfung der Sequenz - wird PCR 3b zugefügt (nachdem sowohl das Plasmid als auch 3b mit Sstll und Sall geschnitten wurden) .
Das Verfahren kann auch für sehr viel längere PCRs unter Verwendung derselben Primer (3,82 Sst neg und 3,82 Sst pos) verwendet werden und ihre Ligierung wird DNA ergeben, die Sstll geschnitten und dann miteinander ligiert werden kann, um direkt für die Virusrettung verwendet zu werden, wodurch irgendwelche Klonierungsstufen vermieden werden. Auf diesem Weg sollte es möglich sein, schnell attenuierte Viren entweder aus Feldisolaten oder RNA-Extrakten zu erzeugen.
Eine bevorzugte Klonierungsstrategie ist in Fig. 2 und Fig. 3 angegeben. Die Genomfragmente wurden ursprünglich in TWF 18 kloniert (LTZ T7 1 bis LTZ 9+10 HDVR) . Jeder klonierte Bereich (beginnend mit LTZ T7 1 und endend mit LTZ 9+10 HDVR) wurde mit Xhol und Sall verdaut, dann wurde jeder jeweils sequentiell in CTPE kloniert. Auf jeder Stufe führte die Ligierung der geschnittenen Sall- (Plasmid) und Xhol- (Leaderende des LTZ-Fragments) Stellen am Leader des Fragments zu der Intragenomsequenz, die gegen beide Enzyme resistent ist, während eine Kombination von zwei Sall geschnittenen Enden am Trailerende sicherstellte, daß Sall immer noch vorliegen konnte, um in der Lage zu sein, das nächste Fragment zu akzeptieren. Daher, nach Zugabe von jedem Genombereich und darauffolgendes Klonieren, wurde das Plasmid mit Insert Sall wieder verdaut und der nächste Bereich (ausgeschnitten aus TWF mit Xhol und Sall) wurde hineinkloniert .
Es ist gemäß der vorliegenden Erfindung auch möglich, einen Impfstoff bereitzustellen, der eine Mischung aus zwei oder mehr attenuierten Lebendviren umfaßt, wobei eines oder mehrere der attenuierten Lebendviren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden, d.h. eine Modifikation in der Aminosäuresequenz an Stellungen aa 293-296 oder in einer Region mit derselben Funktionalität, wie aa 323-328 bei RSV, des F-Protein umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein attenuiertes Lebendvirus, das zur Gattung Metapneumovirus oder RSV gehört oder ein Virus, das eine bedeutende genetische Homologie im F-Protein mit Viren der Gattung Metapneumovirus aufweist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Modifikation in der Region aa 293-296 oder einer Region mit derselben Funktionalität, wie z.B. aa 323-328 bei RSV, des F-Proteins aufweist. Sowohl die Modifikation als auch das Virus sind wie oben definiert .
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, umfassend ein Virus, das durch Modifikation wie oben beschrieben, attenuiert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform auch eine DNA- oder cDNA-Sequenz, wie definiert in einer der SEQ ID NO 28 bis 34. Alle diese Sequenzen 28 bis 34 sind Gesamtlängen-Sequenzen des F-Proteins von menschlichem Metapneumovirus, umfassend eine geeignete Modifikation in Region aa 293-296, die ein attenuiertes menschliches Lebend-Metapneumovirus bereitstellen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch RNA-Sequenzen, korrespondierend zu den DNA-Sequenzen v/ie definiert in SEQ ID NO 28 bis 34.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Vektor wie auch ein Plasmid, umfassend die DNA-, cDNA oder RNA-Sequenz wie oben definier .
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein attenuiertes Lebendvirus, das durch das Verfahren wie oben beschrieben erhältlich ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein F-Protein eines Mitglieds der Gattung Metapneumovirus oder RSV oder eines Virus, das eine bedeutende genetische Homologie im F-Proteinbereich mit einem Mitglied der Gattung Metapneumovirus teilt, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Modifikation oder Modifikationen wie oben definiert umfaßt, d.h. eine Modifikation (Modifikationen) der Aminosäuren an den Positionen 293-296 oder in einer Region mit derselben Funktionalität, wie z.B. aa 323-328 bei RSV. Die Modifikation (Modifikationen) , die im F-Protein gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten sein können, sind oben definiert.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung des F-Proteins wie oben definiert oder eines attenuierten Lebendvirus wie oben definiert für die Herstellung eines Impfstoffs zur Verhinderung einer Störung oder Erkrankung, ausgelöst durch ein Virus wie oben definiert .
Insbesondere kann das F-Protein oder das attenuierte Lebendvirus der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Impfstoffs zur Verhinderung einer Störung oder Krankheit verwendet werden, die durch einen der folgenden Viren ausgelöst wird: APV Typ A, B, C oder non-A, non-B humanes Metapneumovirus RS-Virus.
Im weiteren wird die Erfindung gemäß den Beispielen unten beschrieben werden.
Die Beispiele sollen die vorliegende Erfindung nur weiter beschreiben, ohne den Umfang der Erfindung auf die spezifischen Beispiele zu begrenzen.
Beispiele
1. Herstellung einer Gesamtlängen-DNA-Kopie eines viralen Genoms
RNA wurde aus einem in Verozellen vervielfältigen APV-Stamm LTZ 1 (deutsches Feldisolat, gesammelt von LTZ) unter Verwendung des Qiagen Rneasy Kits (Quiagen Ltd., Crawley, UK) extrahiert. Die RNA wurde revers transkribiert (Superskript II reverse Transkriptase (Invitrogen Ltd., Paisley, UK) ) , bei 42 °C, 1,5 Std. von einem viralen Leader unter Verwendung der Primer APV-Lead ( 5 ' CGAGAAAAAAACGCATTCAAGCAGG3 ' ) (SEQ ID NO 35) und M2Start+ (5 ' GATGTCTAGGCGAAATCCCTGC 31) (SEQ ID NO 36) , und die cDNA der Leader- und Trailerbereiche wurde in zwei 12-Zyklus PCRs (94°C 5s, 60°C 20s, 68°C 6 Min.
[ansteigend 30s pro Zyklus nach Zyklus 5] 11 mal wiederholt, mit Bio-X-Act DNA-Polymerase (Bioline, London, UK) ) amplifiziert . Die Leaderbereich PCR verwendete die APV-Lead geprimte RT-Reaktion als Matrize und PCR-Primer waren APV- Lead ext ( 5 ' ACGAGAAAAAAACGCATTCAAGCAGGTTCT3 ' ) (SEQ ID NO 37) und LTZ 8,2 sal neg (5 ' GGGTATCTATGATGGTCGACAGATGTG3 ' ) (SEQ ID NO 38) . Der Trailerbereich verwendete M2Start+ geprimte RT-Reaktion als Matrize und PCR-Primer waren LT7
( 5 ' TTAATACGACTCACTATAGGACCAATATGGAAATATCCGATGAG3 ■ ) (SEQ ID NO 39) und APV trail ext
( 5 ' GCTAAAAATTTGATGAATACGGTTTTTTTCTCGT3 ' ) (SEQ ID NO 40) . Die 2 PCRs wirkten als Matrizen für weitere 30 Zyklen PCRs (94°C 5s, 60°C 20s, 68°C 2 Min. [ansteigend 10s pro Zyklus nach Zyklus 5], 29 mal wiederholt) unter Verwendung von pfu (Stratagene, Amsterdam, NL) , was das Gesamtgenom in 8 Bereichen amplifizierte, bezeichnet als LTZ 1 bis 10. PCR-Primer beinhalteten die Sequenzmodifikationen, die Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen oder andere Veränderungen an DNA-Extremitäten und 3 ' -Extremitäten einführten, während, mit Ausnahme von LTZ 3, die kodierte Proteinsequenz unverändert blieb. Der T7 Promoter wurde der viralen Leadersequenz in LTZ 1T7 zugefügt, eine verkürzte Form des menschlichen RNA- Polymerase-1 -Promoters (pol 1) wurde der viralen Leadersequenz in LTZ 1 pol zugefügt, der Bereich, der für aa 293-296 des Fusionsproteins kodierte, wurde so verändert, daß aa RKKK RRRR in LTZ 3 wurde und in LTZ 10 HDVR wurde das Hepatitis-Delta-Virus-Ribozym dem viralen Trailerbereich (LTZ 9+10) zugefügt. Die Veränderungen in der F-Proteingensequenz erhöhten die Anzahl der Mutationen, die benötigt v/urden, damit die Sequenz zu einer Sequenz mutieren konnte, die für saure Aminosäuren kodierte, wie detailliert dargestellt in Figur 4.
Tabel le 2
Sequenz der PCR-Primer, die verwendet wurden, um Sall/Xhol flankierte Genombereiche zu erzeugen
LTZ- Primer Sequence 5 ' -3' SEQ
Be- ID NO reich
T7 1 T7 APV TAA 41 lead 1 TACGACTCACTATAGGACGAGAAAAAAACGCATTCAAGCAGG
LTZ 1.1 CTC AAG GTT GGG GGG TCG ACC 42 sal-
Pol 1 pol 1 ACG GGC CGG CCC CCT GCG TG 43 start+
Lead Sap AAAAGCTCTTCAATTACGAGAAAA.AAACGCATTCAAGCAGGTTC 44 1
LTZ 1.1 CTC AAG GTT GGG GGG TCG ACC 45 sal-
2 LTZ 1.1 GGC ATG TAC AAA GCT CGA GCC C 46 Xho+
LTZ 3.1 CAT TGC AAG TGA TGT TGT CGA CAT TCC C 47 sal-
3 LTZ 3.1 CCT CGA AAT AGG GAA TCT CGA GAA CAT CAC 48 Xho+
F 3.82 CAA GCA TAA TTG CCG CGG CGT CTC CTA CAG 49
Sst- AGTGG
F 3.82 CCA CTC TGT AGG AGACGC CGC GGC AAT TAT GCT 50 Sst+ TG
LTZ 4.6 GCA GGG ATT TCG CGT GGA CAT CTT C 51 sal-
4+5 LTZ 4.6 CAA GTG AAG ATC TCG AGG CGA AAT CCC 52 Xho+
LTZ 7.6 GAT CGT ATT CAA CTC GAG AAC TTA CCT GAC 53 sal-
6+7 LTZ 7.6 GAT CGT ATT CAA CTC GAG AAC TTA CCT GAC 54 Xho+
LTZ 9.9 GCT ATG ATC TTT TGC GTC GAC AAA GCA C 55 sal-
8 LTZ 9.9 GTA CAT CCA GTG CTT TCT CGA GGC 56 Xho+
LTZ11.9 CAG TGA CAG GTT TTT GGT CGA CTA TG 57 sal-
9+10 LTZ11.9 GCT GAG GGT GAC ATA CTC GAG C 58 Xho+
HDVR HDVR GCA GCC GGA CTC GAG CTC TCC C 59 Xho-
Mit Ausnahme von LTZ 3 wurde jedes stumpfendige PCR-Produkt in das zweckkonstruierte Plasmid pTWF 18 ligiert, das ein pUC 18 abgeleitetes Plasmid war, bei dem die Sall-Stelle zu EcoRl verändert worden war. Das Plasmid wurde kopiert und verändert unter Verwendung eines modifizierenden Primers (pl8-eco420- 5' TAG AAT TCA CCT GCA GGC ATG C3 ' (SEQ ID NO 60) in einer auf pfu basierenden PCR (Zyklus 94°C 5s, 60°C 20s, 68°C 3 Min. [ansteigend 10s pro Zyklus nach Zyklus 5] 29 mal wiederholt), einem anderen Primer pl8-400+ 51 GAG GAT CCC CGG GTA CCG AGC3 ' (SEQ ID NO 61) . Die PCR-Produkte wurden über Nacht selbst ligiert (Bioline QS Ligase, über Nacht 14 °C) und dann verwendet, um kompetente DH5alpha Zellen (Invitrogen) unter Standardbedingungen (LB Agar/Broth, Xgal- Platten, Ampicillin 100 μg/ml, 37°C) zu transformieren. Blaue Kolonien wurden selektiert und ein spezifischer Restriktionsendonucleaseverdau wurde durchgeführt, um zu bestätigen, daß zwei EcoRl-Stellen vorlagen und daß die Sall- Stelle entfernt worden war.
Die LTZ-Bereiche (außer T71 und 3) wurden in die smal-Stelle von pTWFlδ (Bioline QS Ligase, über Nacht 14°C) ligiert. Die Ligationsmischungen wurden verwendet, um kompetente DH5alpha Zellen zu transformieren. Die gesamte Kultivierungsarbeit der Bakterien mit Plasmiden, die die LTZ-Geno e oder Teile davon enthielten, v/urden bei 30 °C durchgeführt aufgrund von Stabilitätsüberlegungen. LTZ 3 wurde in pUC 18 in zwei Hälften kloniert. Die 5 '-Hälfte (3a, Antigenomsinn) wurde amplifiziert und modifiziert unter Verwendung der Primer LTZ 3.1 Xho+ und F 3.82 Sst neg (siehe Tabelle 2) in einer PCR von 30 Zyklen (94°C 5s, 45°C 20s, 68°C 2 Min. [ansteigend 10s pro Zyklus nach Zyklus 5] 29 mal wiederholt) unter Verwendung von pfu-Polymerase . Dies wurde in die Smal-Stelle von pUCI8 ligiert und in DH5alpha kloniert (pUC18-3a) . Die Orientierung wurde unter Verwendung eines Sstll, EcoRl Doppelverdaus überprüft. Die 3 ' -Halfte (3b) wurde unter Verwendung der Primer F 3.82 Sst pos und LTZ 4.6 sal- (siehe Tabelle 2) unter Verwendung eines Zyklus von 94°C 5s, 50°C 20s, 6S°C 2 Min. [ansteigend 10s pro Zyklus nach Zyklus 5] 29 mal wiederholt, unter Verwendung der pfu-Polymerase amplifiziert. Diese v/urde mit Sstll und Sall geschnitten und in Sstll und Sall geschnittenes pUC18-3a (Bioline QS Ligase) ligiert. Die resultierende Ligationsmischung wurde verwendet, um DH5alpha zu transformieren und die resultierenden Klone wurden pLTZ 3 RRRR benannt .
Alle klonierten LTZ-Bereiche wurden sequenziert (Imperial College Medical School Service) und, wenn Mutationen vorlagen, wurde der Bereich rekloniert, außer die Proteinsequenz war nicht betroffen.
Das low copy Plasmid pCTPE war eine Modifikation von pOLTV5 (Peeters et al (1999), J. Virol. 23, 5001-5009), worin die Klonierungseffizienz durch Entfernung von HDVR, T7 -Terminator und dem restlichen teilweisen lac z Genombereichen unter Verwendung eines ähnlichen Ansatzes wie dem, der verwendet wurde, um pTWFlδ zu erzeugen, verstärkt wurde. In diesem Fall waren beide PCR-Primer modifizierend (V5 630BE+ 5' CGG ATA TCC ACA GGA TCC GGG GAT AAC GC3 ' (SEQ ID NO 62) und V5 190 Barn- 5' CGA GAT CCT CGA GCC GGA TCC TC3 ' (SEQ ID NO 63) und führten neue EcoRV stumpfendige Stellen ein, flankiert auf jeder Seite von BamHl-Stellen. Alle Wachstumsmedien enthielten Kanamycin mit 15 μg/ml (Gibco, Invi rogen, Paisley, UK) .
Das PCR-Produkt LTZ T71 wurde in die EcoRV-Stelle von pCTPE kloniert, wodurch pCTPE-LTZT71 erzeugt wurde und die Gesamtsequenz des Inserts wurde bestätigt. Es wurde dann mit Sall verdaut, worin LTZ2 , ausgeschnitten aus pTWFlδ (Xhol Sall Doppelverdau) ligiert und kloniert wurde (DH5alpha (Invitrogen) , Kanamycinplatten und -broth) . Die Orientierung wurde durch Vergleich eines BamHl Verdaus mit einem 3amHl , Sall Doppelverdau überprüft. Das Plasmid mit dem korrekt orientierten Insert (pCTPE-LTZT71, 2) wurde nur mit Sall geschnitten und dazu wurde Xhol und Sall verdautes LTZ 3 RRRR hinzugefügt und wie vorher ligiert. Das Verfahren wurde in ähnlicher Weise vom 5 ' -Ende fortgeführt (Antigenomsinn) , bis das Gesamtgenom, zusammen mit dem T7-Promoter und HDVR, kloniert worden war (pCTPE-LTZT7, 1 , 2 , 3RRRR, 4+5 , 6+7,8,9+10- HDVR, besser pLTZ flT7 oder pLTZflpoll) .
2. Trägerproteine
Nucleocapsid- (N) , Phospho- (P) und Matrix 2- (M2) -Sequenzen von Stamm LTZ1 wurden kopiert und kloniert . Die RNA wurde extrahiert (Rnease, Qiagen) , die dann revers transkribiert und durch RT-PCR amplifiziert wurde (Superskript 2 Invitrogen; BioX-Act, Bioline; Zyklus von 94°C 5s, 50°C 20s, 68°C 2 Min. [ansteigend 10s pro Zyklus nach Zyklus 5] , wiederholt 29 mal) unter Verwendung von Primern (siehe unten) , die die T7-Promotersequenz direkt vor dem Startkodon von jedem Gen einführte und über jedes Stopkodon hinaus fortlief .
Tabelle 3
Sequenz von PCR-Primern, die verwendet wurden, um das
Trägerproteingen zu vervielfältigen
Figure imgf000032_0001
T7 vorfixierte Gene wurden in die smal-Stelle von pUC18 kloniert unter Verwendung einer Verfahrensweise, die zu der für TWF oben verwendeten identisch war. PCR-Produkte ohne T7-Promoter wurden in die smal-Stelle von pTarget (Säugerexpressionsvektor, Promega, Southhampton, UK) kloniert .
Das virale Polymerasegen (L) wurde in Bereichen in die EcoRV- Stelle von pCTPE unter Verwendung des sequentiellen Ansatzes, der für das komplette virale Genom verwendet wurde, kloniert. In der Reihenfolge wurden T7 L start, LTZ 6+7, LTZ8, LTZ 9+10 in pCTPE ligiert. LTZ T7 L start war ein PCR-Produkt (30 Zyklen 94°C 5s, 60°C 20s, 68°C 2 Min. [ansteigend 10s pro Zyklus nach Zyklus 5] wiederholt 29 mal unter Verwendung von Pfu [Stratagene] ) , hergestellt aus der oben beschriebenen 12 Zyklus Trailer PCR unter Verwendung der Primer T7-L (Tabelle 3) und LTZ 7.6Xho- (Tabelle 2). LTZ T7start wurde in die CPTE EcoRV-Stelle ligiert, während folgende Bereiche von pTWF18 (Sall und Xhol) geschnitten und in die neue einzigartige Sall-Stelle ligiert wurden, die in jeder Stufe der Klonierung eingeführt wurde. Die Orientierung wurde wie bei dem Volllängengenom überprüft.
Das L-Gen wurde ebenfalls in pTarget in ähnlicher Weise v/ie der für die Startersequenz beschriebenen kloniert (erzeugt unter Verwendung der Primer L Start Xho+ (Tabelle 2) und LTZ 7.6Xho- (Tabelle 2)) und diesem war kein T7-Promoter vorgeschaltet .
3. Gesamtlängenkopie durch PCR-Kopie
Das gesamte Genom, mit einem vorgeschalteten T7-Promoter, wurde kopiert und in 3 PCRs vervielfältigt (Bioline Bio-X-act, 30 Zyklen 94°C 5s, 60°C 20s, 68°C 4 Min. [ansteigend 10s pro Zyklus nach Zyklus 5] ) unter Verwendung von low copy (12x) PCRs, die vorher als Matrizen erwähnt wurden. Die Leader- und Zentralbereiche verwendeten das APV lead ext und LTZ 8.2 sal Produkt und der Trailerbereich verwendete das LT7 und APV trail ext Produkt.
Die verwendeten Primer waren die folgenden: Leaderbereich, T7-APV lead 1 und F 3.82 sst pos (5' CCA CTC TGT AGG AGA CGC CGC GGC AAT TAT GCT TG3 ' (SEQ ID NO 75); Zentralbereich F 3.82 sst neg (51 CAA GCA TAA TTG CCG CGG CGT CTC CTA CAG AGT GG3') (SEQ ID NO 76) und LTZ 8.2 Sal- und der Trailerbereich verwendete LTZ 8.2 Xho+ und APV trail ext. Auf diese Weise wurden die Restriktionsendonucleasestellen von Sstll) und Xho/Sal an Verbindungsbereichen 3826-3831 bzw. 8204-8209 zugefügt, um eine spätere Ligation der drei Bereiche zu ermöglichen, und es wurde weiterhin eine Veränderung der Proteinkodierung zu RRRR in F-Gen an den aa-Stellungen 293-296 eingeführt. Die Bereiche wurden mit Sstll geschnitten (Leaderbereich) , Sstll und Sall (Zentralbereich) und Xhol (Trailerbereich) und unter Verwendung von hoch konzentrierter T4 DNA-Ligase verbunden (über Nacht, Fermentas, Deutschland, 30 U/μl) .
4. Virusrettung
a) unter Verwendung von Hühnerpocken-T7- Polymeraserekombinant
Verozellen (70 % konfluent) in 35 mm Vertiefungen wurde einmal mit 1,0 ml Optimem 1 gewaschen, dann mit Hühnerpocken- T7-Polymeraserekombinant mit einer MOI von 0,2 infiziert. Nach einer Inkubationszeit von 1 Std. wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit 1 ml Optimem 1, dann mit 2 ml gewaschen.
MEM (5 %) FCS wurde zugefügt. DNA/Fugene 6 (Boehringer Mannheim, Lewes, UK) Komplex v/urde durch Vermischen von 4 klonierten Trägerproteingenen N, P, M2 in pUC18 (jeweils 0,5 μg) , L in pTWFlδ (50 ng) , Volllängengenom (1 μg entweder in pCPTE kloniert oder als ligiertes PCR-Produkt) und 10 μl Fugeneδ (Boehringer Mannheim) hergestellt und gelöst in 300 μl dMEM. Nach einem vollständigen Vermischen wurde diese Mischung tröpfchenweise auf Zellen unter vorsichtigem Schütteln hinzugefügt.
Fünf Tage später wurde der Überstand gesammelt, durch einen 0,2 μm Filter geführt und verwendet, um frische Verozellen zu inokulieren. CPE wurde beobachtet und die Zellen wurden auf Gegenwart von TRT-Antigen unter Verwendung von indirektem Immunofluoreszenzfärben gefärbt. Es wurde bestätigt, daß das Virus von der hergestellten Volllangenkopie abstammte, indem PCR-Kopien von den einzigartigen RRRR-Regionen des F-Gens und anderen Sall/Xhol Verbindungsregionen sequenziert wurden.
b) unter Verwendung von zellulärer ribosomaler poll RNA- Polymerase
Verozellen (70 % konfluent) oder CEFs in 35 mm Vertiefungen wurden einmal mit 1,0 ml Optimem 1 gewaschen; dann wurden 2 ml MEM (5 %) FCS zugefügt. Der DNA/Fugene 6 (Boehringer Mannheim) Komplex wurde hergestellt, indem die vier klonierten Trägerproteingene N, P, M2 (jeweils 0,5 μg) , L (50 μg) in pTarget, poll Volllängengenom (1 μg, kloniert in pCPTE) und 10 μl Fugene 6 (Boehringer Mannheim) gemischt und in 300 μl dMEM gelöst wurden. Nach einem vollständigen Vermischen wurde diese Mischung tröpfchenweise auf Zellen unter vorsichtigem Schütteln zugefügt.
Fünf Tage später wurden die Zellen gefriergetrocknet und die geklärten Überstände wurden verwendet, um frische Zellen zu infizieren. CPE wurde beobachtet und die Zellen wurden im Hinblick auf die Gegenwart von TRT-Antigen unter Verwendung von indirekter Immunofluoreszenzfärbung gefärbt. Es wurde bestätigt, daß das Virus von der hergestellten Volllangenkopie abstammte, indem die PCR-Kopien von den einzigartigen RRRR-Regionen des F-Gens und Sall/Xhol Bindungsregionen sequenziert wurden. Sequenzen - überblick
Seq ID NO
Modifizierte aa 293-296
1: RRRR
2 :
RRRK
3: RRKK
4 : RKKK
5:
KKKK
6:
KKKR
7: KK R
8: KRRR
9:
SKKK
10: SRRR
11: SKKR
12 :
SKRR
13: SRRK
14: SRKR
15: SKRK
16: KGKK 17: KGRR
18: KGRK
19: KG KR
20: RGKK
21: RGRR
22:
RGRK
23: RGKR
WILD-TYP aa 293-296 APV und hMPV
24: RKEK
25:
RHER
26: SGKD
27:
SGKK
F-Protein von hMPV mit modifizierten aa 293-296
28:
MSW WIIFSL ITPQHGLKESYLEESCSTITEGY SVLRTG YTNVFTLEVGDVENLTC ADGPS IKTELDLTKSALRE RTVSADQLAREEQIENPRQΞRFVLGAIALGVATAAAVTA GVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRV ATAVRE KDFVSKMLTRAINKN KCDIADLKMAVSFSQFNRRF NWRQFSDNAGITPAISLD MTDAELARAVSNMPTSAGQ IKLMLENRAMVRRKGFGF IGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCRRRRGNYA C LREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYP CKVSTGRHPISMVALSPLGA VACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTI DNTVYQ SKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQA VDQSNRI LSSAEKGNTGFIIVIILIAV GSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVΩ^GFIPHN
29: MS KWIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGY SVLRTGWYTNVFT EVGDVENLTC ADGPSLIKTELDLTKSA RE RTVSADQ AREEQIENPRQSRFV GAIALGVATAAAVTA GVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKN TRAINKN KCDIAD KMAVSFSQFNRRFLNWRQFSDNAGITPAIS D MTDAE ARAVSNMPTSAGQ IK MLENRAMVRRKGFGF IGVYGΞSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCRRRKGNYA C REDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYP CKVSTGRHPISMVALSP GA VACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTI DNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRI LSSAEKGNTGFIIVIILIAVLGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN
30:
MS KWIIFS LITPQHG KESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTC
ADGPSLIKTELDLTKSA RELRTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAA TA
GVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRV ATAVRELKDFVSKNLTRAINKN
KCDIAD KMAVSFSQFNRRFLNWRQFSDNAGITPAIS DLMTDAELARAVSNMPTSAGQ
IK MLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQ PIFGVIDTPCWIVKAAPSCRRKKGNYA
CL REDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYP
CKVSTGRHPISMVALSPLGA VACYKGVSCSIGSNRVGIIKQ NKGCSYITNQDADTVTI
DNTVYQLS CVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQA VDQSNRI
LSSAEKGNTGFIIVIILIAV GSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPE SGVTNNGFIPHN
31:
MSWKWIIFS LITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSV RTGWYTNVFT EVGDVENLTC ADGPSLIKTE DLTKSA RE RTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTA GVAIAKTIRLESEVTAIKNA KKTNEAVST GNGVRVLATAVRELKDFVSKN TRAINKN KCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNWRQFSDNAGITPAIS DLMTDAE ARAVSNMPTSAGQ IK M ENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCKKRRGNYA CLLREDQG YCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYP CKVSTGRHPISMVALSP GALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTI DNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRI LSSAEKGNTGFIIVIII-IAVLGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTMNGFIPHN
32 :
MSWKWIIFS LITPQHG KESYLEESCSTITEGY SV RTGWYTNVFTLEVGDVENLTC ADGPS IKTELDLTKSA RE RTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTA GVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST GNGVRVLATAVRE KDFVSKN TRAINKN KCDIADLKMAVSFSQFNRRF NWRQFSDNAGITPAIS D MTDAE ARAVSNMPTSAGQ IKLM ENRAMVRRKGFGF IGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVK.AAPSCKRRRGNYA C LREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYP CKVSTGRHPISMVALSP GA VACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTI DNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVA DQVFESIENSQA VDQSNRI SSAEKGNTGFIIVII IAV GSTMI VSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNΪTGFIPHN
33:
MSWKWIIFS LITPQHGLKESY EESCSTITEGYLSV RTG YTNTTLEVGDVENLTC ADGPS IKTE DLTKSALRELRTVSADQ AREEQIENPRQSRFVLGAIA GVATAAAVTA GVAIAKTIR ESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDrVS-αi TRAINKN KCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNWRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQ IKLM ENRAI'IVRRKGFGF IGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPC IVMAAPSCSRRRGNYA CL REDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYP CKVSTGRHPISMVALSPLGA VACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTI DNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRI LSSAEKGNTGFIIVIILIAVLGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN
34:
MSWKWIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTC
ADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTA
GVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKN
KCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNWRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQ
IKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPC IVKAAPSCRGRRGNYA
CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNIMISTTNYP
CKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTI
DNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRI
LSSAEKGNTGFIIVIILIAVLGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN
PRIMER
35 :
APV lead
CGAGAAAAAAACGCATTCAAGCAGG
36:
M2start+ GATGTCTAGGCGAAATCCCTGC
37:
APV lead ext ACGAGAAAAAAACGCATTCAAGCAGGTTCT
38:
LTZ 8.2 sal neg GGGTATCTATGATGGTCGACAGATGTG
39:
LT7 TTAATACGACTCACTATAGGACCAATATGGAAATATCCGATGAG
40:
APV trail ext
GCTAAAAATTTGATGAATACGGTTTTTTTCTCGT
41: T7 APV leadl TAATACGACTCACTATAGGACGAGAAAAAAACGCATTCAAGCAGG
42:
LTZ 1.1 sal - CTCAAGGTTGGGGGGTCGACC 43 : pol 1 start+ ACGGGCCGGCCCCCTGCGTG
44 :
Lead Sap 1
AAAAGCTCTTCAATTACGAGAAAAAAACGCATTCAAGCA-GTTC
45:
LTZ 1.1 sal -
CTCAAGGTTGGGGGGTCGACC
46:
LTZ 1.1 Xhθ+
GGCATGTACAAAGCTCGAGCCC
47:
LTZ 3.1 sal -
CATTGCAAGTGATGTTGTCGACATTCCC
48:
LTZ 3.1 Xho+
CCTCGAAATAGGGAATCTCGAGAACATCAC
49:
F 3.82 Sst-
CAAGCATAATTGCCGCGGCGTCTCCTACAGAGTGG
50:
F 3.82 Sst+
CCACTCTGTAGGAGACGCCGCGGCAATTATGCTTG
51:
LTZ 4.6 sal -
GCAGGGATTTCGCGTGGACATCTTC
52:
LTZ 4.6 Xhθ+
CAAGTGAAGATCTCGAGGCGAAATCCC
53:
LTZ 7.6 sal-
GATCGTATTCAACTCGAGAACTTACCTGAC
54:
LTZ 7.6 Xho+
GATCGTATTCAACTCGAGAACTTACCTGAC
55:
LTZ 9.9 sal-
GCTATGATCTTTTGCGTCGACAAAGCAC
56:
LTZ 9.9 xho+ GTACATCCAGTGCTTTCTCGAGGC
57:
LTZ11.9 sal-
CAGTGACAGGTTTTTGGTCGACTATG
58:
LTZ11.9 xho+
GCTGAGGGTGACATACTCGAGC
59:
HDVR Xho- GCAGCCGGACTCGAGCTCTCCC
60: pl8-eco420- TAGAATTCACCTGCAGGCATGC
61: pl8-400+ GAGGATCCCCGGGTACCGAGC .
62:
V5 630BE+ CGGATATCCACAGGATCCGGGGATAACGC
63:
V5 190 Bam-
CGAGATCCTCGAGCCGGATCCTC
64:
T7-N
TTAATACGACTCACTATAGGGACAAGTCAAAAATGTCTCTTG
65: N start+ GTCAAAATGTCTCTTGAAAG
66: Pstart- CAGGGAAAGACATTGTTAC
67: T7-P TTAATACGACTCACTATAGGGACAAGTAACAATGTCTTTCC
68: Pstart + GTAACAATGTCTTTCCCTG
69: Pstop neg ext GACTTGTCCCATTTTTTCATAACTACAGATCAAG
70: T7-M2 TTAATACGACTCACTATAGGGACAAGTGAAGATGTCTAG
71: M2start+ GATGTCTAGGCGAAATCCC
72:
M2-l3neg GCATTGCACTTAATTATTGCTGTCACCC
73: T7-L TTAATACGACTCACTATAGGACCAATATGGAAATATCCGATGAGTC 74: L start Xho+ GAATGAAAAACAAGGACCAATATGGAAATATCCGATGAG
75:
F3.82sstpos
CCACTCTGTAGGAGACGCCGCGGCAATTATGCTTG
76:
F3.82sstneg
CAAGCATAATTGCCGCGGCGTCTCCTACAGAGTGG
Wildtyp aa 323 - 328 von RSV
77:
Human RSV F 323-328
TTNTKE
78: human RSV F 323-328
TTNIKE
79:
Bovine RSV F 323-328
TTDNKE

Claims

Patentansprüche
1. Impfstoff gegen ein Mitglied der Gattung Metapneumovirus oder RSV oder ein Virus, das eine bedeutsame genetische Homologie mit einem Mitglied der Gattung Metapneumovirus im Bereich des F-Proteins aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Virus oder einen Teil eines Virus umfaßt, wobei das Virus in Region aa 293-296 der Aminosäuresequenz des F-Proteins (Fusionsprotein) oder in einer Region mit derselben Funktionalität, wie z.B. aa 323-328 bei RSV, im Vergleich zum Wildtypvirus modifiziert ist.
2. Impfstoff gemäß Anspruch 1, wobei das Virus ein Lebendvirus ist.
3. Impfstoff gemäß Anspruch 1, wobei das Virus ein attenuiertes Lebendvirus ist.
4. Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Modifikation eine Stabilisierung der Region aa 293-296 oder einer Region mit derselben Funktionalität wie aa 323-328 bei RSV umfaßt.
5. Impfstoff gemäß Anspruch 4, wobei die Stabilisierung durch Substitution von Kodons erreicht wird, die für die Aminosäuren in der Region kodieren, durch Kodons, die mehr Mutationen benötigen, um zum Wildtypvirus . zurückzukehren .
6. Impfstoff gemäß Anspruch 4 oder 5, v/obei die Stabilisierung durch Substitution von Kodons, die für Aminosäuren in der Region kodieren, durch Kodons erreicht wird, die mit geringerer Wahrscheinlichkeit zu einem Kodon zurückmutieren, das für Glutaminsäure kodiert .
7. Impfstoff gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei die Modifikation in der Region aa 293-296 oder einer Region mit derselben Funktionalität, wie aa 323-328 bei RSV, die Substitution von mindestens einer nichtbasischen Aminosäuren durch mindestens eine basische Aminosäure umfaßt.
8. Impfstoff gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei die Modifikation das Hinzufügen von mindestens einer Aminosäure umfaßt.
9. Impfstoff gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche 1 bis 7, wobei die Modifikation die Deletion von mindestens einer sauren Aminosäure umfaßt .
10. Impfstoff gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche 1 bis 8, wobei die Modifikation die Substitution von mindestens einem Glutaminsäurerest durch mindestens eine basische Aminosäure umfaßt .
11. Impfstoff gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine basische Aminosäure ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe Arginin, Lysin und/oder Histidin.
12. Impfstoff gemäß Anspruch 11, wobei die mindestens eine basische Aminosäure Arginin und/oder Lysin ist.
13. Impfstoff gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei die Region aa 293-296 des Wildtypvirus eine Sequenz hat wie dargestellt in einer der SEQ ID
NO 24 bis 27.
14. Impfstoff gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei die Region aa 293-296 des attenuierten Virus eine Sequenz aufweist wie dargestellt in einer der SEQ ID NO 1 bis 23.
15. Impfstoff gemäß Anspruch 13 und/oder 14, wobei die Region aa 293-296 des Wildtypvirus eine Sequenz wie dargestellt in SEQ ID NO 24 aufweist und wobei die Region des attenuierten Virus eine Sequenz wie dargestellt in SEQ ID NO 1 aufweist.
16. Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 13 und/oder 14, wobei die Region aa 293-296 des Wildtypvirus eine Sequenz wie dargestellt in SEQ ID NO 27 aufweist und wobei diese Region des attenuierten Virus eine Sequenz wie dargestellt in SEQ ID NO 1, 2, 10 oder 21 aufweist.
17. Impfstoff gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei eine Modifikation in Region aa 293-296 gewählt wird, um einen Impfstoff gegen APV oder hMPV bereitzustellen, während eine Modifikation in Region aa 323-328 gewählt wird, um einen Impfstoff gegen RSV bereitzustellen.
18. Impfstoff gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Metapneumovirus menschliches Metapneumovirus ist.
19. Impfstoff gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Metapneumovirus aviäres Metapneumovirus ist, insbesondere APV.
20. Impfstoff gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei das attenuierte Lebendvirus mit einem geeigneten Hilfsstoff und/oder Träger und/oder Adjuvans formuliert ist.
21. Impfstoff gemäß Anspruch 20, wobei das Virus ein attenuiertes Virus ist und wobei es mit einer geeigneten Menge Interleukin-6 (IL-6) formuliert v/ird.
22. Impfstoff gemäß Anspruch 20, wobei das Virus ein attenuiertes Virus ist und wobei es mit einer geeigneten Menge Interleukin-12 (IL-12) oder Interleukin-18 (IL-18) formuliert wird.
23. Verfahren für die Herstellung eines Impfstoffs, gerichtet gegen Mitglieder der Gattung Metapneumovirus oder RSV oder ein Virus, das eine bedeutende genetische Homologie im F-Proteinbereich mit einem Mitglied der Gattung Metapneumovirus aufweist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
a) Bereitstellung eines virulenten Virus, gegen das ein Impfstoff entwickelt werden soll,
b) Bereitstellung einer Modifikation in der Nucleinsäuresequenz, die für Region aa 293-296 des F-Proteins kodiert oder einer Region mit derselben Funktionalität, wie aa 323-328 bei RSV, des Virus und
c) Erhalt eines attenuierten Lebendvirus, umfassend die obige Modifikation.
24. Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei die Modifikation eine Modifikation wie definiert in einem der Ansprüche 2 bis 16 betrifft.
25. Verfahren gemäß Ansprüchen 23 oder 24, wobei das Virus ein Virus ist, ausgewählt aus der Gruppe wie definiert gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19.
26. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 23 bis 25, wobei die Bereitstellung einer Modifikation wie folgt erhalten wird: i) Herstellung einer Volllängen-DNA-Kopie des viralen Genoms des Virus, gegen das ein Impfstoff entwickelt werden soll,
ii) Bereitstellung von Kopien von Volllängen-DNA durch Ligation von Teillängen PCR- Produkten, die eine Veränderung in Region aa 293-296 einführen oder in eine Region mit derselben Funktionalität, wie aa 323-328 bei RSV, •
iii) Virusrettung von den Volllängen-DNA-Kopien unter Verwendung von z.B. Hühnerpocken-T7-Polyτnerase- Rekombinant oder zellulärer ribosomaler poll RNA- Polymerase .
27. Attenuiertes Lebendvirus, das zur Gattung Metapneumovirus oder Pneumovirus gehört, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Modifikation im Bereich aa 293-296 des F-Proteins oder in einem Bereich mit derselben Funktionalität, wie aa 323-328 bei RSV, umfaßt .
28. Attenuiertes Lebendvirus gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifikation eine Modifikation wie definiert in einem der Ansprüche 2 bis 16 ist.
29. Attenuiertes Lebendvirus gemäß Ansprüchen 27 oder 28, wobei das Virus ein Virus ist wie definiert in einem der Ansprüche 17 bis 19.
30. Wirtszelle, umfassend ein Virus gemäß einem der Ansprüche 27 bis 29.
31. DNA- oder cDNA-Sequenz wie definiert in einer der SEQ ID NO 28, 29, 30, 31, 32, 33 oder 34.
32. RNA-Sequenz korrespondierend zu der DNA- oder cDNA- Sequenz wie definiert in Anspruch 31.
33. F-Protein eines Mitglieds der Gattung Metapneumovirus oder RSV oder eines Virus, das eine bedeutende genetische Homologie im F-Protein zu einem Mitglied der Gattung Metapneumovirus aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Modifikation in der aa 293-296 Region oder einer Region mit derselben Funktionalität, wie aa 323-328 bei RSV, wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 16 umfaßt.
34. Vektor, umfassend die DNA-, cDNA- oder RNA-Sequenz gemäß Ansprüchen 31 oder 32.
35. Attenuiertes Lebendvirus, erhältlich durch das Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 23 bis 26.
36. Plasmid, umfassend die DNA-, cDNA- oder RNA-Sequenz gemäß Anspruch 31 oder 32.
37. Verwendung des F-Proteins wie definiert in Anspruch 33 oder des attenuierten Lebendvirus wie definiert in Ansprüche 27 bis 29 oder 35 für die Herstellung eines Impfstoffs zur Verhinderung einer Störung oder Erkrankung, ausgelöst durch einen der Viren wie definiert in einem der Ansprüche 17 bis 19.
38. Primer, gekennzeichnet durch eine der SEQ ID NO 35 bis 76.
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008512443A (ja) * 2004-09-09 2008-04-24 カイロン ベーリング ゲーエムベーハー アンド カンパニー インフルエンザワクチンに関連する潜在的医原性リスクの減少
US7449324B2 (en) 2002-02-21 2008-11-11 Vironovative Bv Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US7531342B2 (en) 2001-01-19 2009-05-12 Medimmune, Llc Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US7704720B2 (en) 2003-04-25 2010-04-27 Medimmune, Llc Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus
US8715922B2 (en) 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
RU2656188C1 (ru) * 2017-05-03 2018-06-04 Общество с ограниченной ответственностью "Анкрим" (ООО "Анкрим") Синтетическое анальгетическое средство пептидной природы и способ его применения

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010077712A1 (en) * 2008-12-09 2010-07-08 Novavax, Inc. Bovine respiratory syncytial virus virus-like particle (vlps)
WO2010149743A2 (en) * 2009-06-24 2010-12-29 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccine
US9512178B2 (en) * 2012-07-11 2016-12-06 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Neurogenic brain-derived neurotrophic factor peptides
WO2014208821A1 (ko) * 2013-06-27 2014-12-31 건국대학교기술지주 주식회사 신규한 조류메타뉴모바이러스 및 그 백신
KR101560337B1 (ko) 2013-06-27 2015-10-19 주식회사 카브 신규한 조류메타뉴모바이러스 및 그 백신
HUE059127T2 (hu) 2015-10-22 2022-10-28 Modernatx Inc Légúti vírusok elleni vakcinák
MA50335A (fr) 2016-12-08 2020-08-19 Modernatx Inc Vaccins à acide nucléique contre des virus respiratoires
FR3084079A1 (fr) * 2018-07-23 2020-01-24 Universite Claude Bernard Lyon 1 Nouvelle souche virale attenuee et son utilisation en tant que vaccin
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000053767A2 (en) * 1999-03-05 2000-09-14 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA93981C2 (ru) * 2001-01-19 2011-03-25 Вироновативе Б.B. Вирус, который вызывает заболевание дыхательных путей у чувствительных k этому млекопитающих

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000053767A2 (en) * 1999-03-05 2000-09-14 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CROWE J E: "Respiratory syncytial virus vaccine development" VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, Bd. 20, 15. Oktober 2001 (2001-10-15), Seiten S32-S37, XP004307328 ISSN: 0264-410X *
DUDAS R A ET AL: "Respiratory syncytial virus vaccines" CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, WASHINGTON, DC, US, Bd. 11, Nr. 3, Juli 1998 (1998-07), Seiten 430-439, XP002154718 ISSN: 0893-8512 *
HOOGEN VAN DEN BERNADETTE G ET AL: "A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease" NATURE MEDICINE, NATURE PUBLISHING, CO, US, Bd. 7, Nr. 6, Juni 2001 (2001-06), Seiten 719-724, XP002176554 ISSN: 1078-8956 & WO 02 057302 A (GROEN JAN; DE JONG JAN CORNELIUS; VIROCLINCS B V (NL); FOUCHIER RO)) 25. Juli 2002 (2002-07-25) & DATABASE GENBANK [Online] EMBL; Sequence from N.A., 1. Dezember 2001 (2001-12-01) VAN DEN HOOGEN, B.G. ET AL.: *
NAYLOR C J ET AL: "The ectodomains but not the transmembrane domains of the fusion proteins of subtypes A and B avian pneumovirus are conserved to a similar extent as those of human respiratory syncytial virus" JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, SOCIETY FOR GENERAL MICROBIOLOGY, READING, GB, Bd. 79, Nr. 6, 1. Juni 1998 (1998-06-01), Seiten 1393-1398, XP002095552 ISSN: 0022-1317 *
See also references of EP1503792A2 *

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9376726B2 (en) 2001-01-19 2016-06-28 Erasmus University Medical Center Rotterdam Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US7531342B2 (en) 2001-01-19 2009-05-12 Medimmune, Llc Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US11162148B2 (en) 2001-01-19 2021-11-02 Erasmus University Medical Center Rotterdam Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US10519517B2 (en) 2001-01-19 2019-12-31 Vironovative Bv Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US10167524B2 (en) 2001-01-19 2019-01-01 Erasmus University Medical Center Rotterdam Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US8715922B2 (en) 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US8722341B2 (en) 2001-01-19 2014-05-13 Vironovative B.V. Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and sequences
US9803252B2 (en) 2001-01-19 2017-10-31 Erasmus University Medical Center Rotterdam Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US9593386B2 (en) 2001-01-19 2017-03-14 Erasmus Universiteit Medical Center Rotterdam Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US9334543B2 (en) 2001-01-19 2016-05-10 Erasmus University Medical Center Rotterdam Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US8927206B2 (en) 2001-01-19 2015-01-06 Vironovative B.V. Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US7449324B2 (en) 2002-02-21 2008-11-11 Vironovative Bv Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US11220718B2 (en) 2002-02-21 2022-01-11 Erasmus University Medical Center Rotterdam Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US8841433B2 (en) 2002-02-21 2014-09-23 Vironovative Bv Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US9834824B2 (en) 2002-02-21 2017-12-05 Erasmus University Medical Center Rotterdam Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US9944997B2 (en) 2002-02-21 2018-04-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US10287640B2 (en) 2002-02-21 2019-05-14 Erasmus University Medical Center Rotterdam Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US9567653B2 (en) 2002-02-21 2017-02-14 Erasmus University Medical Center Rotterdam Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US7704720B2 (en) 2003-04-25 2010-04-27 Medimmune, Llc Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus
JP2011207911A (ja) * 2004-09-09 2011-10-20 Novartis Vaccines & Diagnostics Gmbh & Co Kg インフルエンザワクチンに関連する潜在的医原性リスクの減少
JP2008512443A (ja) * 2004-09-09 2008-04-24 カイロン ベーリング ゲーエムベーハー アンド カンパニー インフルエンザワクチンに関連する潜在的医原性リスクの減少
RU2656188C1 (ru) * 2017-05-03 2018-06-04 Общество с ограниченной ответственностью "Анкрим" (ООО "Анкрим") Синтетическое анальгетическое средство пептидной природы и способ его применения

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