MXPA04011226A - Atenuacion de metalpneumovirus. - Google Patents

Atenuacion de metalpneumovirus.

Info

Publication number
MXPA04011226A
MXPA04011226A MXPA04011226A MXPA04011226A MXPA04011226A MX PA04011226 A MXPA04011226 A MX PA04011226A MX PA04011226 A MXPA04011226 A MX PA04011226A MX PA04011226 A MXPA04011226 A MX PA04011226A MX PA04011226 A MXPA04011226 A MX PA04011226A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
virus
val
leu
lie
ser
Prior art date
Application number
MXPA04011226A
Other languages
English (en)
Inventor
J Naylor Clive
Original Assignee
Lohmann Animal Health Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lohmann Animal Health Gmbh filed Critical Lohmann Animal Health Gmbh
Publication of MXPA04011226A publication Critical patent/MXPA04011226A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1013—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
    • C12N2760/18322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
    • C12N2760/18334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
    • C12N2760/18361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/18362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18561—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/18562—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

La presente invencion se relaciona a una vacuna contra miembros del genero metapneumovirus o RSV o un virus que comprende una homologia genetica significativa en la proteina F a miembros del genero metapneumovirus, por lo que la vacuna es un virus vivo atenuado. En particular, la vacuna se dirige contra metapneumovirus de origen aviar o humano.

Description

ATENUACIÓN DE METAPNEUMOVIRUS La presente invención se relaciona a una vacuna contra miembros del género metapneumovirus o RSV, la vacuna que es una vacuna de virus vivos atenuados. En particular, la vacuna se dirige contra metapneumovirus de origen aviar o humano . La presente invención además se relaciona a un método para la producción de una vacuna que se dirige contra miembros del género metapneumovirus o RSV. La presente invención se relaciona además a una vacuna de virus vivos atenuados del género metapneumovirus. La invención también se relaciona a una célula huésped que comprende tal virus. La presente invención se dirige además a una secuencia de ADN especifico o ADNc o ARN asi como también a un vector o un plásmido, que comprende la secuencia de ADN, ADNc o ARN. Finalmente, la presente invención se relaciona a una proteina F que se modifica, y al uso de la proteina F para la producción de una vacuna para la prevención de un trastorno o una enfermedad producida por virus que pertenecen al género metapneumovirus o RSV. Las subfamilias paramixovirus o neumovirus de la familia paramixovirus incluyen varios patógenos importantes para seres humanos y animales. En relación a la taxonomía, los neumovirus se subdividen en el género neumovirus y metapneumovirus . El virus sincitial respiratorio humano, el tipo del género neumovirus, que se describe también posteriormente, se estima alrededor del mundo como el único y más importante accionador de enfermedades en el tracto respiratorio inferior en bebés durante infancia temprana. Otros miembros del género neumovirus incluyen el virus sincitial respiratorial de bovino, el virus sincitial respiratorial de ovino y el virus de neumonía en ratones. El neumovirus aviar APV se describe también posteriormente y se conoce previamente como el virus de rinotraqueitis de pavo (TRTV) . Se estima que es un agente etiológico del RT.I superior y se estima previamente como el único miembro del género metapneurovirus recientemente creado. La familia de los paramixovirus comprende una pluralidad de varios virus que están implicados en varios trastornos o enfermedades más o menos severas ambos en seres humanos y animales. Los paramixovirus contienen una sola molécula de un ARN negativo de una sola cepa como genoma y se asocian todos con una enfermedad respiratoria aguda del huésped (Pringue, C.R. (1987) en "Molecular Basis of Virus Disease", pub. W.C. Russell y J.W. Almond, Society for General Microbiology, vol. 40, páginas 91 a 138, Cambridge University Press) . De los muchos virus de esta familia, el virus sincitial respiratorio (virus RS) tiene el efecto clínico más significativo en seres humanos que existen después del virus de sarampión. El virus RS humano es la razón principal para enfermedades severas en el tracto de respiración inferior en niños que conduce anualmente a epidemias alrededor del mundo (Chanock et al., 1991, en "Viral Infections of Humans", páginas 525 a 544, pub. A.S. Evans, Plenum Press) . Mientras únicamente una homología de secuencia de nucleótido o aminoácido limitada se presenta entre el neumovirus incluyendo el virus RS y los otros paramixovirus, ciertas características estructurales importantes, tales como la nucleoproteína principal (N) y la proteína F (F) se presentan sin embargo las cuales se conservan en proteínas con funciones similares en un amplio rango de virus (Barr et al., 1991, J. of Gen. Virol. 72, 677 a 687; Chamber et al., 1990, J. of Gen. Virol. 71, 3075 a 3080). Varios métodos de síntesis de ARN se llevan a cabo para los paramixovirus por el complejo helinucleocápsida que se forma por una asociación del ARN genómico, la nucleoproteína, una proteína fosforosa (P) y la proteína de polimerasa (L) . La función del complejo de nucleoproteína depende de la presencia de las tres proteínas que interactúan entre sí y con el ARN genómico y, posiblemente, con otros virus y/o componentes celulares (Barik, 1992, J. of Virol. 66, 6813 a 6818) . La maduración del virión depende de una serie de interacciones entre el complejo de ribonucleoproteína, la proteína matriz (M) y las glicoproteínas de virus incrustadas en la membrana celular modificada. En neumovirus, tales como RS, dos proteínas adicionales, particularmente una proteina hidrofóbica pequeña asociada con membrana (SH) y una segunda proteína de matriz (M2) se implican también en la estructura de virión y, presumiblemente, el ensamble, sin embargo en una manera que no se entiende todavía. La función de las proteínas de neumovirus, designadas NS1 y NS2, no se conoce y no parece formar una parte de la partícula del virus (Collins, 1991, en "The Paramyxoviruses", páginas 103 a 162, pub. D. . Kingsbury, Plenum Press) . Un virus económicamente importante adicional, que pertenece a la familia de paramixovirus, es el virus APV, que se designó previamente virus TRT. El virus APV es un miembro del género metapneumovirus . Éste acciona la rinotraqueitis de pavo que es una enfermedad respiratoria aguda en pavos. Se describe por primera vez a finales de los setentas en Sudáfrica y luego en Europa y otras partes del mundo. La enfermedad es una de las razones principales para pérdidas económicas en la industria del pavo durante los últimos años. Los serotipos A y B de APV se encuentran generalmente en\ Europa, mientras que infecciones similares se encontraron en Colorado, E.U. La cepa APV aislada de la misma es la así llamada cepa Colorado o C. Otra cepa APV se aisló a partir de patos en Francia. Aparte de los tipos A, B y C, tipos no A y no B adicionales de APV presumiblemente existen. Por consiguiente, APV es un miembro aviar del género metapneumovirus que fue aislado por primera vez a partir de aves. El metapneumovirus aviar presumiblemente participa también en el "fiebre de lechuguilla" que puede conducir a pérdida de producción masiva en gallinas. El metapneumovirus aviar (APV) es un virus de ARN pleomorfo con una proteina de fusión (F) localizada en la cáscara y, con espigas que consisten de glicoproteinas (G) . Éste se designa "metapneumovirus". El virus no tiene propiedades de aglutinación de glóbulos rojos. Basado en los nucleótidos y la secuencia de aminoácido estimada de la glicoproteina (G) , el APV inicial se clasificó en dos subtipos. APV de Sudáfrica y Gran Bretaña tuvieron inicialmente el subtipo A, y las cepas de APV europeas adicionales pertenecieron al subtipo B. Como se indicó anteriormente, adicionalmente a subtipos presumiblemente adicionales que son no A, no B, el subtipo C se conoce también actualmente. El metapneumovirus aviar puede cultivarse en cultivos anulares traqueales que tienen en la presente un efecto ciliostático . Éste puede cultivarse además en huevos embrionizados y en otros cultivos celulares. Las cepas americanas se cultivaron también en HEF (embriofibroblastos de gallina), células Vero y huevos embrionizados .
Los síntomas clínicos de la rinotraqueitis de pavo corresponden a aquellos de una infección de rinotraqueitis aguda. Los animales fueron apáticos y exhibieron expectoración, estornudo y sacudida de cabeza dos a tres días después de la infección. Si la infección no llega a ser más complicada, los animales son normales nuevamente siete a ocho días después de la infección. Los síntomas clínicos en gallinas corresponden a los síntomas en pavos, sin embargo, como una regla, estos son menos severos. Si E. coli u otra bacteria están participando adicionalmente, pérdidas elevadas pueden resultar y el periodo actual de la enfermedad puede tener una duración desagradable. Sin embargo, APV en pollos únicamente rara vez conduce a la "fiebre de lechuguilla" con pérdida masiva. Es probablemente más importante para la pérdida continua debido a las enfermedades clínicas inferiores. Después de la infección por APV convencional, las gallinas y los pavos crearon anticuerpos neutralizantes en el suero, los cuales pueden detectarse por ELISA. Estos anticuerpos no parecen ser de importancia significativa para el control de rinotraqueitis. Los anticuerpos maternos no son efectivos para pollos contra una infección temprana con APV viral. Sin embargo, los anticuerpos circulantes parecen ser importantes para la protección de las gónadas en caso de infección en animales viejos.
Los anticuerpos locales parecen tener un efecto protector importante. Los anticuerpos IgA e IgG específicos de virus que tienen un efecto neutralizante del virus aparecen en el fluido lagrimal después de la infección con APV virulento. Hasta el momento, ninguna terapia se conoce para el tratamiento de infecciones de APV. Con la excepción de los Estados Unidos, se han hecho intentos para controlar APV por vacunación. Otro miembro importante del paramixovirus es el metapneumovirus humano recientemente descubierto que se aisló de infantes que tienen una enfermedad del tracto respiratorio. Este virus se aisló de 28 infantes en los Países Bajos y, con base en los datos virológicos, la homología de secuencia y constelación genética, se identificó como un nuevo miembro del género metapneumovirus (Van Den Hoogen et al., Nature, Medicine, vol . 7, no. 6, Junio 2001, páginas 719 a 724). Hasta el descubrimiento de este nuevo metapneumovirus, APV se estimó como se describe anteriormente, como el único miembro del género metapneumovirus recientemente designado (Virus Taxonomy, Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Pub. Van Regenmortel, M.H., Fauquet, C. . y Bishop, D.H.) 551, 557, 559 a 560 (Academic, San Diego, 2000). En el artículo anterior, los autores llegan sin embargo a la conclusión, basada en una homología de secuencia y constelación genética, que el virus humano parece ser un nuevo miembro del género metapneumovirus y por lo tanto designados preliminarmente como metapneumovirus humano. Una homología genética entre el MPV humano y por ejemplo, APV en la región de las proteínas F tiene por ejemplo, el porcentaje elevado de 80. Se asume así que el metapneumovirus humano podría inicialmente tener proviene de las aves y se ha dispersado recientemente a la población humana. Como se establece anteriormente, hasta el momento ningún tratamiento ha sido encontrado para las enfermedades indicadas anteriormente. Por esta razón, se ha centrado atención en la vacunación. Sin embargo, ninguna vacuna es obtenible hasta el momento para la vacunación que podría proporcionar un periodo prolongado y protección segura contra las anteriores enfermedades asociadas con virus, por ejemplo del género metapneumovirus . Con respecto a RSV, el desarrollo de una vacuna es todavía un objetivo importante en vista de la importancia clínica de este patógeno. Los presentes enfoques implican el uso de mutantes sensibles a la temperatura. Los intentos para proporcionar una vacuna adecuada contra el virus RS se enfocaron en dos áreas interesantes, la región específica de la polimerasa (gen L) incluyendo el sitio de unión ATP putativo y el dominio central altamente conservado de la polimerasa y una mutación en el dominio extracelular de las proteínas de fusión (F), a partir de lo cual podría mostrarse que está también presente en un mutante atenuado, activo, codificado, independientemente derivado (Connors et al., 1995, Virology 208, páginas 478 a 484 y Tolley et al., 1996, Vaccine 14, 1637 a 1646). El intento que se ha hecho para lograr un control de APV en que por ejemplo, se generaron vacunas de virus vivos atenuados in vitro por el paso de un metapneumovirus aviar virulento. Podría mostrarse que aproximadamente 100 pasos en los cultivos anulares traqueales no redujeron la virulencia, pero que 39 pasos en los embrioblastos de pollos limitó tanto la inmunogenicidad como la virulencia. El paso en células Vero redujo la virulencia a cero, sin embargo, se mantuvo esencialmente la inmunogenicidad; las vacunas aceptables podrían generarse consecuentemente . Como una regla, las vacunas de virus vivos se utilizan en aproximadamente pollos de un día de nacidos en la forma de un rocío o como gotas para los ojos. Algunos productores recomiendan repetir la inmunización con vacunas de virus vivos una vez o varias veces. Las vacunas de virus vivos que están actualmente en el mercado se producen de varias cepas de diferentes clases y más o menos atenuados. Algunas veces, las vacunas inactivadas se utilizan también para animales viejos, aunque como una regla, estos están en este caso primero vacunados con una vacuna de virus vivo . Hasta el momento, las vacunas de virus vivos son del subtipo A o B. Los resultados de varios estudios experimentales muestran que existe una buena reactividad de cruce entre las diversas cepas, sin embargo, una protección homologa parece ser más completa. Una vacuna contra el metapneumovirus humano no existe todavía en todo ya que se descubrió únicamente hace poco. En vista del metapneumovirus humano, éste fue, sin embargo, particularmente deseable para obtener una vacuna que proporciona protección buena y efectiva contra el virus que conduce a severas enfermedades en niños. Sin embargo, para todas las vacunas conocidas hasta el momento, puede demostrarse que son inestables y que pueden regresar a virulencia bajo condiciones adecuadas. Tales propiedades son naturalmente indeseables en una vacuna. Es por lo tanto un objeto de la presente invención proporcionar una vacuna que pueda ser una vacuna de virus vivos atenuados y que se dirija contra miembros del virus del género metapneumovirus y RSV. Es en particular un objeto proporcionar una vacuna de virus vivos atenuada que es efectiva contra patógenos del miembro del género metapneumovirus, en particular el metapneumovirus humano y APV, asi como contra RSV. Es adicional un objeto de la presente invención proporcionar un método para la provisión de vacunas adecuadas contra los virus anteriores. Este objeto se logra por la materia objeto de las reivindicaciones independientes; las modalidades preferidas se indican en las reivindicaciones dependientes. De acuerdo a la reivindicación 1, se proporciona una vacuna contra miembros del género metapneumovirus y RSV asi como contra virus que tienen una homología genética importante en el área de la proteina F a miembros del género metapneumovirus, caracterizados porque comprenden un virus o una parte de un virus, el virus que se modifica en la región aa 293-296 de la secuencia de aminoácido de la proteina F (proteina de fusión) cuando se compara con el virus de tipo silvestre, o en una región que exhibe la misma función como por ejemplo 323-328. Una "parte de un virus" significa que la vacuna debe incluir al menos la parte del virus que comprende la modificación en la región aa 293-296 de la proteina F o una región funcionalmente similar y todos los componentes adicionales del virus que se requieren de manera que el virus pueda actuar como una vacuna, es decir, genera inmunogenicidad, pero no es virulento. La generación de tal virus es una medida dentro del conocimiento especial general de una persona experimentada. La invención se describirá además de acuerdo con las figuras ilustradas en la presente, las figuras que representan lo siguiente: Figura 1 Cambios de Secuencia a modo de ejemplo durante la atenuación y retroceso Figura 2 Estrategia de Clonación Figura 3 ETC al genoma completo Figura 4 Cambios en las posiciones aa 293-296 de la proteína de fusión La posición de desdoblamiento usual de la proteína de fusión F, que es por ejemplo, la misma para el tipo A de los APV y los otros APV así como para los otros miembros del paramixovirus , tiene un motivo con aminoácidos básicos que se ubican aproximadamente en la posición aa 99-109, por lo que se divide la proteína F en Fl y F2 si se desdobla por proteasas, por lo que se expone el dominio relacionado con fusión. Por esta razón, la provisión de un número incrementado de aminoácidos básicos en la región aa 293-296, que podría representar una segunda posición de desdoblamiento, o una posición que corresponde a la funcionalidad, podría conducir a una posición de desdoblamiento similar para proteasas .
Como una regla, se utiliza el virus completo que comprende la modificación en la región aa 293-296 o en una región que funcionalmente corresponde a la de la secuencia de aminoácido de la proteina F. Para mostrar la proteina F en un virus típico, en particular un metapneumovirus , se hace referencia a la Figura 1. La Figura 1 muestra a modo de ejemplo la posibilidad de cambios de secuencia durante la atenuación y retroceso de virus a vacunas de virus y detrás de los virus virulentos . Las abreviaturas en la Figura 1 tienen los siguientes significados: N: nucleocápsida; gen: aproximadamente 1,200 bases P: fosfoproteína; gen: aproximadamente 850 bases M: matriz; gen: aproximadamente 800 bases F: fusión; gen: aproximadamente 1,600 bases M2 : 2a matriz; gen: aproximadamente 600 bases SH: hidrófobo pequeño; gen: aproximadamente 500 bases G: glicoproteína; gen: aproximadamente 1,100 bases L: polimerasa; gen: aproximadamente 7,000 bases Se asume que la proteína de fusión es responsable de la fusión con la membrana objetivo. Se asume que M2 es un factor de alargamiento de transcripción que es se supone esencialmente para recuperación de virus. Éste contiene un segundo cuadro de lectura que no parece ser extremo. La proteína G podría ser responsable para la adhesión a un receptor celular objetivo. Es altamente glicosilado y altamente variable entre varias cepas. La polimerasa L libera a la transcripción y replicación del genoma . N, P y L se combinan para proporcionar la unidad de replicación mínima que se llama nucleocápsida . La proteína de fusión es en particular responsable para la fusión del virus con la célula objetivo. Se traduce como FO y desdobla por las proteasas celulares en posiciones aa 99-102 (RRRR) de manera que forma Fl (conteniendo el dominio relacionado con la fusión, unión de membrana) y F2 (que permanece adherido a Fl después del desdoblamiento por puentes disulfuro entre los residuos de desdoblamiento de cisteína) . Como se explica en detalle posteriormente, se hizo la hipótesis que la posición de desdoblamiento adicional potencial (aa 293-296 en APV y hMPV y aa 323-328 en RSV) de algún modo cambia la fusión y que esta tiene una influencia en el tropismo del tejido. Las flechas de línea sólida en la Figura 1 indican que un cambio de secuencia tomó lugar durante la atenuación en el nivel de ADN, mientras las flechas de línea trazada muestran que los cambios de secuencia tomaron lugar en el nivel de proteína durante la secuencia de atenuación y retroceso. La disposición del virus en el lado izquierdo es aquel del virus de tipo silvestre. La disposición del virus en la porción central de la Figura 1, representado en blanco, es aquel de un virus atenuado, mientras que la disposición del virus en el lado derecho es la disposición de un virus que ha regresado a la virulencia. Puede derivarse a partir de la Figura 1 que existe una pluralidad de posibles cambios de secuencia. Los cambios de secuencia que pueden ocurrir durante la atenuación y retroceso y que se representan en la Figura 1 se indican únicamente como ejemplos. La comparación de la secuencias de tipo silvestre, virus atenuado y virus revertido claramente muestra que puede ser una pluralidad de mutaciones y una pluralidad de combinaciones de mutaciones que ocurren durante la atenuación y retroceso. De acuerdo con la presente invención, se determinó sorprendentemente que una modificación en la región aa 293-296 o en una región que tiene la misma funcionalidad conduce a una generación de un virus atenuado que puede utilizarse como una vacuna contra miembros del género metapneumovirus o RSV. Se ha encontrado una modificación en esta región que generará un virus atenuado que ha perdido su capacidad de virulencia, mientras aún proporciona inmunogenicidad completa. Además, la modificación en esta región reducirá el riesgo de regresar a la virulencia. La siguiente Tabla 1 se presenta para un mejor entendimiento de la discusión adicional. Ésta da un sondeo de los 20 aminoácidos, su código de letra único (SLC) y sus codones de ADN correspondientes. Tabla 1 20 Aminoácidos, su código de letra único (SLC) y sus codones de ADN correspondientes Aminoácido SLC Tipo Codones de ADN Isoleucina I ATT, ATC, ATA Leucina L CTT, CTC, CTA, CTG, TTA, TTG Valina V GTT, GTC, GTA, GTG Fenilalanina F TT, TTC Metionina M ATG Cisteina C S-S TGT, TGC Alanina A GCT, GCC, GCA, GCG Glicina G GGT, GGC, GGA, GGG Prolina P CCT, CCC, CCA, CCG Treonina T 0 glicos ACT, ACC, ACA, ACG Serina S 0 glicos TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC Tirosina Y TA , TAC Triptofano w TGG Glutamina Q CAA, CAG Asparagina N N glicos AAT, AAC Histidina H Básico CAT, CAC 1 Ácido glutámico E Acidico GAA, GAG Ácido Aspártico D Acidico GAT , GAC Lisina K Básico AAA, AAG Arginina R Básico CGT , CGC, CGA, CGG, AGA, AGG Codones de Detención TAA, TAG, TGA Detención La región aa 293-296 se ubica en la proteina F, es decir, la proteina de fusión, de virus del género metapneumovirus y en RSV. La ubicación de la región aa 293-296 puede por ejemplo derivarse de la SEC. DE IDENT. NOS. 28 a 34. En la presente invención se podría demostrar que las cepas de virus atenuados podrían generarse si los codones que codifican en RSV del gen F para los aminoácidos en la región aa 293-295 o en una región que tiene la misma funcionalidad, tal como aa 323-328, se modificaron, los cuales mantuvieron su inmunogenicidad pero perdieron su virulencia . Se cree que esta región aa 293-296 en APV y hMPV o aa 323-328 en RSV fue responsable del cambio de virulencia. El mecanismo para este fenómeno es aún incierto. Sin pretender unirse a esta hipótesis, En la presente invención se propone la teoría de que esta región se desdobla por proteasas de serina, pero aún se adhiere debido a uniones S-S, en una manera similar como es el caso con F-l y F-2. Un PAGE de la vacuna muestra que, comparado con el virus de campo, existen cambios de movilidad que podrían asociarse con tal hecho. La región aa 293-296 en APV y hMPV así como la aa 323-328 en RSV parece ser esencialmente hidrofílica, con la mayoría de los aminoácidos que se cargan (R, K, H, E, D) o que tiene una polaridad (S) . Únicamente un aminoácido, glicina (G) , es ligeramente hidrofóbico. Las siguientes secuencias de aminoácido son típicas para los diferentes miembros del género metapneumovirus en la región aa 293-296: APV tipo A: RKEK (SEC. DE IDEN . NO. 24), RKKE, REEK APV tipo B: RHER (SEC. DE IDENT. NO. 25) APV tipo C: SGKD (SEC. DE IDENT. NO. 26) Metapneumovirus humano: SGKK (SEC. DE IDENT. NO. 27) Las siguientes secuencias de aminoácido son típicas para los diferentes miembros de RSV en aa 323-328: 1: TTDNKE (SEC. DE IDENT. NO. 79) 2: TTNIKE (SEC. DE IDENT. NO. 78) 3: TTNTKE (SEC. DE IDENT. NO. 77) Cuando se hace referencia en lo siguiente a metapneumovirus humano, a que el metapneumovirus humano se relaciona como se define de acuerdo con el articulo por Van den Hoogen et al., ature, Medicine, vol. 7, no. 6, Junio del 2001, páginas 719 a 724. Parece ser probable que la región hidrofílica es necesaria para impartir función y estructura a la proteína de función. De este modo, la presencia de aminoácidos básicos parece facilitar el desdoblamiento por proteasas de serina; por consiguiente, una modificación adecuada de los cuatro aminoácidos en la región aa 293-296 en APV o hMPV así como una modificación adecuada de aa 323-328 en RSV parece tener un efecto universalmente atenuante . De acuerdo a una modalidad preferida, el virus descrito anteriormente es un virus vivo atenuado. Los virus vivos atenuados se conocen en la técnica y su producción puede lograrse en una simple manera por una persona experimentada. De acuerdo a la presente invención, el virus vivo atenuado debe incluir una modificación en la región aa 293-296 de la secuencia de aminoácido de las proteínas de fusión cuando se compara con el tipo silvestre o en una región que tiene la misma funcionalidad, tal como por ejemplo aa 323-328 en RSV. La atenuación del virus se obtiene por modificación en la o las regiones anteriores. Adicionalmente, pueden utilizarse métodos de atenuación conocidos, los cuales ya se conocen por estos virus.
Preferiblemente, la modificación comprende una estabilización de la región aa 293-296 o una región que tiene la misma funcionalidad como aa 323-328 de RSV en el virus. La designación "estabilización" significa describir una situación en la cual los aminoácidos se codifican por codones en la posición aa 293-296 o en una región que tiene la misma funcionalidad como aa 323-328 en RSV, que no puede fácilmente regresar al tipo silvestre. Tal estabilización se obtiene preferiblemente por una sustitución de codones que codifican aminoácidos en la región, por codones, que necesitan más mutaciones para regresar al tipo silvestre. Tal estabilización es por ejemplo demostrada como sigue: Es el objeto del presente ejemplo sustituir el ácido glutámico del aminoácido (E) por un aminoácido básico. El ácido glutámico se codifica por el codón de ADN GAA o GAG. Si la lisina del aminoácido (K) se selecciona para la sustitución del ácido glutámico, la siguiente situación resulta: La lisina se codifica por el codón de ADN AAA o AAG. Si el codón de ADN AAA se. selecciona para lisina, una mutación se requiere para regresar al codón de ADN GAA, es decir, ácido glutámico. Lo mismo se aplica si se selecciona el codón de ADN AAG lo cual requiere una mutación para regresar al codón de ADN GAG que, a su vez codifica para el ácido glutámico. Si, por ejemplo, el codón de ADN CGT (que codifica para la arginina del aminoácido básico (R) ) se selecciona sin embargo, tres mutaciones son necesarias si los codones de ADN GAA o GAG que van a obtenerse nuevamente los cuales codifican para el ácido glutámico. De este modo, debido a la selección del codón CGT (para arginina) como una sustitución para el codón para el ácido glutámico, más mutaciones se requieren para regresar al codón de ADN del ácido glutámico, y una estabilización más elevada se logrará por lo tanto. Por esta razón, de acuerdo con una modalidad preferida adicional, la estabilización se obtiene por sustitución de codones que codifican para el aminoácido en la región, preferiblemente los aminoácidos acidicos en esta región, por codones que mutan en una probabilidad menos grande a un codón que codifica para el ácido glutámico. Los inventores de la presente invención han encontrado que la presencia del ácido glutámico en la región aa 293-296 o en una región de la misma funcionalidad, tal como por ejemplo aa 323-328 en RSV de la proteina F, reduce o evita la atenuación y mejora la virulencia del virus. Ningún documento de la técnica anterior proporciona cualquier indicio que se relaciona a este descubrimiento. Como otros aminoácidos acidicos, los ácidos glutámicos también parecen contribuir a la virulencia del virus cuando se ubican en la región aa 293-296 de la proteina F o en una región que tiene la misma funcionalidad, tal como aa 323-328 en RSV. Como se establece anteriormente, esta mejora de la virulencia con una atenuación simultánea o eliminación de la atenuación podría atribuirse a una situación en la cual las regiones hidrofílicas se requieren para dar a la proteína F una estructura funcional mientras que la presencia de aminoácidos básicos podría promover un desdoblamiento de serina proteasa. Por esta razón, de acuerdo a una modalidad preferida adicional, la modificación en la región aa 293-296 de la proteína F de virus o en una región de la misma funcionalidad, tal como aa 323-328 en RSV, preferiblemente del mismo género metapneumovirus, comprende la sustitución de al menos un aminoácido no básico con un aminoácido básico. Más preferidos, al menos dos aminoácidos no básicos se sustituyen por aminoácidos básicos. Aún más preferidos, al menos tres aminoácidos no básicos se sustituyen por aminoácidos básicos. De acuerdo a una modalidad particularmente preferida, los aminoácidos en la región aa 293-296 de la proteína F de hMPV o APV se modifican de manera que todos los cuatro aminoácidos son aminoácidos básicos. De acuerdo a una modalidad preferida adicional de la presente invención, todos los seis aminoácidos de la región aa 323-328 en RSV son aminoácidos básicos. De acuerdo a una modalidad preferida alternativa, la modificación puede comprender la adición de al menos un aminoácido. Esta adición de al menos un aminoácido puede llevarse a cabo además de la sustitución indicada anteriormente. Preferiblemente, la adición de al menos un aminoácido significa que la adición de al menos un aminoácido básico, preferiblemente arginina, lisina y/o histidina, particularmente preferida es la arginina o lisina. De acuerdo a una modalidad alternativa, la modificación puede también comprender la eliminación de al menos un aminoácido. Al menos un aminoácido eliminado es preferiblemente un aminoácido acidico. De acuerdo a una modalidad particularmente preferida, la modificación comprende la sustitución de al menos un residuo de ácido glutámico por al menos un aminoácido básico. El aminoácido básico se selecciona preferiblemente del siguiente grupo que consiste de arginina, lisina y/o histidina. Especialmente preferido es el uso de arginina y/o lisina. De acuerdo a una modalidad particularmente preferida, la región aa 293-2.96 del virus de tipo silvestre tiene una secuencia tal como se representa en una de las SEC. DE IDENT. NOS. 24 a 27. La SEC. DE IDENT. NO. 24 por ejemplo, representa los aminoácidos en la región aa 293-296 de la cepa APV-A del tipo silvestre NO. 8544, particularmente. RKEK.
SEC. DE IDENT. NO. 25, por ejemplo, representa los aminoácidos típicos en la región aa 293-296 de los virus APV-B, particularmente RHER. SEC. DE IDENT. NO. 26 representa por ejemplo los aminoácidos típicos en las posiciones aa 293-296 de virus del tipo APV-C, particularmente. SGKD. SEC. DE IDENT. NO. 27 por ejemplo, representa los aminoácidos en las posiciones aa 293-296 del metapneumovirus humano, particularmente. SGKK. La designación "virus de tipo silvestre" como se utiliza de acuerdo a la presente invención, se relaciona a virus que no exhiben mutaciones en las posiciones 293-296 o en una región de la misma funcionalidad (tal como por ejemplo aa 323-328 en RSV) de la proteína F. Como una regla, tal virus del tipo silvestre es un virus virulento. Sin embargo es también posible que un virus vivo ya atenuado se utilice como el virus de tipo silvestre de la presente invención que se atenúa entonces además por las modificaciones en las posiciones aa 293-296 o en una región que tiene la misma funcionalidad como aa 323-328 en RSV, de la proteína F de acuerdo con la presente invención .
Los virus preferidos que pueden ser virus de tipo silvestre junto con las lineas de la presente invención son el metapneumovirus humano, virus APV de los tipos A, B, C o no A, no B o los virus RS . La región aa 293-296 de los virus atenuados tiene preferiblemente una secuencia como se muestra en una de las SEC. DE IDENT. NOS .1 a 23. Las SEC. DE IDENT. NOS .1 a 23 pueden también seleccionarse para formar un componente de la región aa 323-328 en el virus RS . La SEC. DE IDENT. NO. 1 es una secuencia de aminoácido ejemplar en la posición aa 293-296, que permite que por ejemplo, una cepa atenuada va a utilizarse como una vacuna pueda proporcionarse por ejemplo por la cepa NO. 8544 (APV tipo A) . Esta SEC. DE IDENT. NO. 1, particularmente RRRR Se podría por ejemplo proporcionar también un metapneumovirus humano atenuado o un virus APV atenuado del tipo B o C o del tipo no A, no B. Es posible proporcionar un virus vivo atenuado que puede utilizarse como una vacuna por modificación de los aminoácidos o los codones que codifican los aminoácidos en las posiciones aa 293-296 o en una región que tiene la misma funcionalidad, tal como por ejemplo, aa 323-328 en RSV, de las proteínas F como se describe de acuerdo a la presente invención . De acuerdo con una modalidad particularmente preferida, la región aa 293-296 del virus de tipo silvestre tiene la secuencia de aminoácido como se representa en la SEC. DE IDENT. NO. 24, la región del virus atenuado que tiene una secuencia como se muestra en la SEC. DE IDENT. NO. 1. Tal modalidad proporcionaría un virus vivo atenuado para el tipo APV, por ejemplo, la cepa No. 8544. De acuerdo con otra modalidad preferida de la presente invención, la región aa 293-296 del virus de tipo silvestre tiene la secuencia representada en la SEC. DE IDENT. NO. 27, con la región del virus atenuado que tiene la secuencia representada en la SEC. DE IDENT. NO. 1, 2, 10 o 21. Tal modificación en la región aa 293-296 proporcionaría por ejemplo un virus vivo atenuado para metapneumovirus humano. Las secuencias preferidas, como se representan en la SEC. DE IDENT. NO. 1 a 23, podrían también comprender una o más histidinas como una sustitución ya sea para lisina o arginina. Lo anteriormente indicado es mutatis mutandis también aplicable para la región aa 323-328 en RSV. Como se describe anteriormente, la presente modificación en la región aa 293-296 o en una región de la misma funcionalidad como aquella de 323-328 en RSV de la proteína F conducirá a una provisión de virus vivos atenuados, por ejemplo del género metapneumovirus o RSV, que tienen la característica común de una proteína F que tiene sustancialmente homología genética entre las secuencias de las proteínas F respectivas en estos virus. De acuerdo a una modalidad particularmente preferida, la vacuna producida de acuerdo con la presente invención es efectiva contra el metapneumovirus humano. Adicionalmente preferido es el metapneumovirus aviar, en particular APV. La presente invención no se limita a metapneumovirus, aunque es aplicable para todos los virus que tienen una homología genética clara, por ejemplo homología de secuencia más elevada de 50%, preferiblemente más elevada de 65%, y particularmente preferida, más elevada de 75%, basada en los estudios de homología de secuencia bajo condiciones altamente rigurosas, en el área de la proteína F con miembros del género metapneumovirus, en particular con APV o metapneumovirus humano. Los virus vivos atenuados se formulan preferiblemente con un agente auxiliar adecuado y/o portador y/o adyuvante. De acuerdo a una modalidad preferida, el virus es un virus vivo atenuado que se formula con una cantidad adecuado de interleucina-6 (IL-6) . La formulación con interleucina-6 es especialmente preferida si el virus es un metapneumovirus aviar.
De acuerdo con una modalidad adicional, el virus es un virus atenuado y se formula con una cantidad adecuada de inteleucina-12 (IL-12) y/o interleucina-18 (IL-18) . Si el virus es un metapneumovirus humano o RSV, el virus atenuado se formula preferiblemente con interleucina-12 y/o interleucina-18. La designación "una cantidad adecuada" en el contexto de la presente invención designa una cantidad que proporciona el efecto deseado si se formula con el virus atenuado de acuerdo a la presente invención, pero no afecta adversamente la utilidad del virus vivo atenuado como una vacuna . Cantidades adecuadas pueden determinarse por una persona experimentada y dependerá del virus atenuado utilizado en el sujeto para tratarse, por ejemplo, en vista de la edad, peso, condición del cuerpo y la enfermedad que va a tratarse. Un método para la producción de una vacuna de acuerdo a la presente invención dirigida por ejemplo contra miembros del género metapneumovirus comprende las siguientes etapas : a) proporcionar un virus virulento contra lo cual una vacuna va a desarrollarse, b) proporcionar una modificación en la secuencia de ácido nucleico codificada para la región aa 293-295 o para una región que tiene la misma funcionalidad, tal como aa 323-328 en RSV, de la proteina F del virus y c) obtener un virus vivo atenuado que comprende la modificación anterior. La modificación preferiblemente se relaciona a una modificación como se define anteriormente, en particular de acuerdo a las siguientes reivindicaciones 2 a 16. Adicionalmente preferido, el virus es un virus seleccionado del grupo como se define anteriormente, en particular de acuerdo a las siguientes reivindicaciones 17 a 19. La modificación indicada anteriormente en la etapa b) se relaciona particularmente a la región aa 293-296 si APV o hMPV se asocia y relaciona a la región aa 323-328 si RSV se asocia . Además, la provisión de una modificación se obtiene preferiblemente como sigue: i) la producción de una copia de ADN de longitud total del genoma viral del virus contra lo cual una vacuna va a desarrollarse, ii) la provisión de copias del ADN de longitud total por ligación de productos PCR de longitud parcial que introducen un cambio en la región aa 293-296 o en una región que tiene la misma funcionalidad tal como aa 323-328 en RSV, iii) recuperación del virus a partir de las copias de ADN de longitud total por uso de por ejemplo polimerasa pox T7 de pollo recombinante o polimerasa de ARN pol 1 ribosomal celular. Los métodos específicos que se utilizan para introducir mutaciones en una posición específica en un genoma se conocen por supuesto por la persona experta y/o los métodos comunes pueden aplicarse en la presente. Las alteraciones se llevan a cabo en la secuencia de proteína de fusión, por ejemplo por amplificación de PCR utilizando cebadores que han sido cambiados cuando se compara con la secuencia original. La secuencia de cebadores 3.82 Sst neg y 3.82 Sst pos sigue la secuencia de la modalidad, excepto para la sustitución de agg aaa aag aaa por agg aga cgc cgc. Dos PCR, uno en el lado del conductor a 3.82 Sst neg y el otro de 3.82 Sst pos a una posición corriente abajo (dirección de rastreo) se llevan a cabo. El PCR de LTZ 3. lXho+ a 3.82Sst- (designado 3a) comprenderá la secuencia cambiada (cambio de aa, codificando a RRRR) y contendrá adicionalmente una posición Sstll RE (junto con gg adyacente, directamente corriente arriba de esta secuencia, [posición de reconocimiento Sstll ccgcgg]) . El PCR entre los cebadores 3.82 Sstll pos y LTZ 4.6 Sal- (designado como 3b) genera los mismos cambios en el fragmento adyacente, de este modo, si los dos productos PCR se cortan con Sstll y se ligan entre si, el producto tendrá la secuencia LTZ 3. lXho+ a LTZ 4.6 Sal- original, excepto para el cambio indicado anteriormente. En la práctica, 3a se clona inicialmente (bruscamente) , luego - después de verificar la secuencia - se agrega PCR 3b (después tanto el plásmido y 3b se cortan con Sstll y Salí) . El método puede también utilizarse para PCRs mucho más largos utilizando los mismos cebadores (3.82 Sst neg y 3.82 Sst pos) y su ligación resultará en ADN que puede cortarse con Sstll y luego ligarse entre si para utilizarse directamente para recuperación de virus, por lo que cualesquiera etapas de clonación se evitan. Este enfoque debe permitir la producción de virus rápidamente atenuados ya sea de aislados de campo o extractos de ARN. La Figura 2 y la Figura 3 indican una estrategia de clonación preferida. Los fragmentos del genoma se clonaron inicialmente TWF 18 (LTZ T7 1 a LTZ 9+10 HDVR) . Cada área clonada (empezando con LTZ T7 1 y finalizando con LTZ 9+10 HDVR) se digirió con Xhol y Salí, luego cada uno se clonó secuencialmente de manera individual en CTPE. En cada etapa, la ligación de las posiciones de corte Salí (plásmido y Xhol-(conductor final del fragmento LTZ) del fragmento condujo al conductor a la secuencia de intragenoma que es resistente contra ambas enzimas, mientras una combinación de dos cortes finales Salí en el rastreo final aseguró que Salí podría aún presentarse de manera que sea capaz de aceptar el siguiente fragmento. De este modo, después de la adición de cada . área de genoma y la subsecuente clonación, el plásmido se digirió nuevamente con el inserto Salí y la siguiente área (corte a partir de TWF con Xhol y Salí) se clonó en éste. De acuerdo con la presente invención, es también posible proporcionar una vacuna que comprende una mezcla de dos o más virus vivos atenuados, uno o una pluralidad de los virus vivos atenuados que se obtienen de acuerdo con la presente invención, es decir, una modificación en la secuencia de aminoácido en las posiciones aa 293-296 o en una región que tiene la misma funcionalidad, tal como aa 323-328 en RSV, de la proteína F. La presente invención también se relaciona a un virus vivo atenuado que pertenece al género metapneumovirus o RSV o un virus que tiene una homología genética significativa en la proteína F con virus del género metapneumovirus, que se caracteriza porque comprende una modificación en la región aa 293-296 o en una región que tiene la misma funcionalidad, tal como por ejemplo, aa 323-328 en RSV, de la proteína F. Tanto la modificación así como el virus son como se definen anteriormente . La presente invención también se relaciona a una célula huésped que comprende un virus que se atenúa por la modificación como se describe anteriormente.
De acuerdo a una modalidad preferida adicional, la presente invención también se relaciona a una secuencia de ADN o ADNc, como se define en una de las SEC. DE IDENT. NOS. 28 a 34. Todas estas secuencias 28 a 34 son secuencias de longitud total de la proteina F de metapneumovirus humano, que comprende una modificación adecuada en la región aa 293-296 que proporciona un metapneumovirus vivo humano atenuado. La presente invención también se relaciona a secuencias de ARN que corresponden a las secuencias de ADN, como se define en la SEC. DE IDENT. NOS. 28 a 34. La presente invención también se relaciona a un vector asi como a un plásmido que comprende la secuencia de ADN, ADNc o ARN, como se describe anteriormente. La presente invención se relaciona además a un virus vivo atenuado que es obtenible por el método como se describe anteriormente. La presente invención también se relaciona a una proteina F de un miembro del género metapneumovirus o RSV o un virus que comparte una homología genética significativa en el área de proteína F con un miembro del género metapneumovirus y que se caracteriza porque comprende una modificación o modificaciones, tal como se define anteriormente, es decir, una modificación (modificaciones) de los aminoácidos en las posiciones 293-296 o en una región que tiene la misma funcionalidad, tal como por ejemplo aa 323-328 en RSV. La modificación (modificaciones) que pueden contenerse en la proteina F de acuerdo con la presente invención se definen anteriormente. Finalmente, la presente invención también se relaciona al uso de la proteina F, como se define anteriormente, o un virus vivo, atenuado, como se define anteriormente, para la producción de una vacuna para la prevención de un trastorno o una enfermedad producida por un virus como se define anteriormente. La proteina F o el virus vivo atenuado de la presente invención puede utilizarse para la producción de una vacuna para la prevención de un trastorno o una enfermedad que se acciona por uno de los siguientes virus: - APV tipo A, B, C o no-A, no-B - metapneumovirus humano - virus RS . La invención se describe de acuerdo con los siguientes ejemplos. Los ejemplos se pretenden para describir la invención en mayor detalle sin limitar el alcance de la invención a los ejemplos específicos.
Ejemplos 1. Producción de una copia de ADN de longitud total de un genoma viral Se extrajo el ARN a partir de una cepa de APV LTZ1 multiplicada en células Vero (aislado de campo alemán, recolectado a partir de LTZ) utilizando Equipos Qiagen Rneasy (Quiagen Ltd., Crawley, UK) . El ARN se transcribió inversamente (Transcriptasa inversa Superskript II (Invitrogen Ltd., Paisley, UK) ) , a 42°C, 1.5 horas, a partir del conductor viral utilizando el conductor APV cebador ( 5 ' CGAGAAAAAACGCATTCAAGCAGG3 ' ) (SEC. DE IDENT. NO. 35) y M2Start+ (5' GATGTCTAGGCGAAATCCCTGC 3') (SEC. DE IDENT. NO. 36) , y el ADNc del conductor y las áreas de rastreo se repitieron 11 veces en dos PCR de 12 ciclos (94 °C 5 segundos, 60°C 20 segundos, 68°C, 6 minutos, [incrementando 30 segundos por ciclo después del ciclo 5], amplificado con polimerasa de ADN Bio-X-Act (bioline, London, UK) ) . El área conductor PCR utilizó la reacción RT cebada con el conductor APV como una matriz y los cebadores PCR fueron la extensión del Conductor APV ( 5 ' ACGAGAAAAAAACGCATTCAAGCAGGTTCT3 ' ) (SEC. DE IDENT. NO. 37) y LTZ 3.2 sal neg ( 5' GGGTATCTATGATGGTCGACAGATGTG3 ' ) (SEC. DE IDENT. NO. 38) . El área de. rastreo utilizó la reacción de RT cebada con M2Start+ como una matriz y los cebadores PCR fueron LT7 (5' TTAATACGACTCACTATAGGACCAATATGGAAATATCCGATGAG3' ) (SEC. DE IDENT. NO. 39) y extensión de rastreo APV ( 5' GCTAAAAATTTGATGAATACGGTTTTTTTCTCGT3 ' ) (SEC. DE IDENT. NO. 40) . Los 2 PCR actúan como matriz durante los PCR de 30 ciclos (94 °C 5 segundos, 60°C 20 segundos, 68°C 2 minutos [incrementando 10 segundos por ciclo después del ciclo 5], repetidos 29 veces) utilizando pfu (Stratagene, Ámsterdam, NL) que amplificó el genoraa completo en 8 áreas, designadas como LTZ1 a 10. Los cebadores PCR incluyen las modificaciones de secuencia que introdujeron las posiciones de reconocimiento de endonucleasa de. restricción u otros cambios en las extremidades de ADN y extremidades 3', mientras que, con la excepción de LTZ 3, la secuencia de proteína codificada permaneció sin cambio. Se agregó el promotor T7 a la secuencia conductor viral en LTZ 1T7, una forma acortada del promotor de polimerasa 1 de ARN humano (pol 1) se agregó a la secuencia conductor viral en LTZ 1 pol, el área que codifica para aa 293-296 de las proteínas de fusión se cambió de manera que aa RKKK llegó a ser RRRR en LTZ 3, y en LTZ 10 HDVR se agregó la ribozima del virus Delta de hepatitis al área de rastreo viral (LTZ 9+10) . Los cambios en la secuencia del gen de proteína F incrementó el número de mutaciones que se requirieron de manera que la secuencia pudo mutar a una secuencia que codifica para aminoácidos acídicos, como se representa en detalle en la Figura 4.
Tabla 2 Secuencia de los cebadores PCR utilizados para generar de genoma flanqueados con Sall/Xhol sal - 8 LTZ 9.9 GTA CAT CCA GTG CTT TCT CGA GGC 56 Xho+ LTZ11.9 CAG TGA CAG GTT TTT GGT CGA CTA TG 57 sal - 9+10 LTZ11.9 GCT GAG GGT GAC ATA CTC GAG C 58 Xho+ HDVR HDVR GCA GCC GGA CTC GAG CTC TCC C 59 Xho- Con la excepción de LTZ 3, cada producto de PCR terminado en forma brusca se ligó en el plásmido pTWF 18 deliberadamente construido, que fue un plásmido derivado de püC 18 en donde la posición Salí se cambió a EcoRl . El plásmido se copió y cambió utilizando un cebador modificado (pl8-eco420- 5' TAG AAT TCA CCT GCA GGC ATG C3' (SEC. DE IDENT. NO. 60) en un PCR basado en pfu (ciclo 94°C 5 segundos., 60°C 20 segundos, 68°C 3 minutos [incrementando 10 segundos por ciclo después del ciclo 5] 29 veces repetidas), en otro cebador pl8-400 + 5' GAG GAT CCC CGG GTA CCG AGC3 ' (SEC. DE IDENT. NO. 61) . Los productos de PCR mismos se ligaron durante la noche (Bioline QS ligasa, durante la noche a 14°C) y luego se utilizaron para transformar células DH5 alfa competentes (Invitrogen) bajo condiciones estándares (Agar LB/Caldo, placas Xgal, ampicilina 100 µ?/p??, 37°C) . Las colonias azules se seleccionaron y una digestión de endonucleasa de restricción especifica se llevó a cabo para confirmar que las posiciones EcoRl se presentaron y que la posición Salí se eliminó. Las áreas LTZ (excepto para T71 y 3) se ligaron en la posición smal de pTWF18 (ligasa Bioline QS, durante la noche a 14°C) . Las mezclas de ligación se utilizaron para la transformación de células DH5 alfa competentes. Para consideraciones de estabilidad, se realizó la labor de cultivo completo de la bacteria con plásmidos que contienen los genomas LTZ o partes de los mismos a 30°C. Se clonó LTZ 3 en pUC 18 en dos mitades. La mitad 5' (3a, en sentido anti-genómico) se amplificó y modificó utilizando los cebadores LTZ 3.1 Xho+ y F 3.82 Sst neg (véase la Tabla 2) en un PCR de 30 ciclos (94°C 5 segundos, 45°C 20 segundos, 68°C 2 minutos, [incrementando 10 segundos por ciclo después del ciclo 5] repetidos durante 29 veces) utilizando la polimerasa pfu. El mismo se ligó en 1 posición Smal de pUC18 y se clonó en DH5 alfa (pUC18-3a) . La orientación se verificó mediante el uso de una doble digestión Sstll, EcoRl . La mitad 3' (3b) se amplifica utilizando el cebado F 3.82 Sst pos y LTZ 4.6 sal- (véase Tabla 2) y utilizando un ciclo de 94°C 5 segundos, 50°C 20 segundos, 68°C 2 minutos [incrementando 10 segundos por ciclo después del ciclo 5] repetido durante 29 veces y utilizando la pfu polimerasa. El mismo se corto con Sstll y Salí y cortó pUC18-3a (ligasa Bioline QS) se ligó en Sstll y Salí. La mezcla de ligación resultante se utilizó para la transformación de DH5alfa y los clones resultantes se designaron pLTZ 3 RRRR. Todas las áreas LTZ clonadas se secuenciaron (Imperial College Medical School Service) y, excepto para el caso que la secuencia de proteina no se relacionó, el área se volvió a clonar si las mutaciones, se presentaron. El plásmico pCTPE de copia baja fue una modificación de pOLTVS (Peeters et al. (1999), J. Virol. 23, 5001-5009) en donde la eficiencia de clonación se amplificó por la eliminación de HDVR, terminador T7 y el resto, parcialmente lac z, las áreas de genoma utilizando en la presente un enfoque similar como aquel utilizado para producir pTWF18. En este caso, ambos cebadores PCR se modificaron (V5 630BE + 5' CGG ATA TCC ACA GGA TCC GGG GAT AAC GC3 ' (SEC. DE IDENT. NO. 62) y V5 190 Bara- 5' CGA GAT CCT CGA GCC GGA TCC TC3 ' (SEC. DE IDENT. NO. 63) e introdujo nuevas posiciones terminadas bruscamente en EcoRV, cada lado flanqueado por posiciones BamHl. Todos los medios de crecimiento contuvieron kanamicina con 15 pg/ml (Gibco, Invitrogen, Paisley, UK) . El producto PCR LTZ T71 se clonó en la posición EcoRV de pCTPE, por lo que se produjo pCTPE-LTZT71 y la secuencia completa del inserto se confirmó. Se digirió entonces con Salí, en donde LTZ2 se ligó y clonó el cual se cortó a partir de pTWF18 (doble digestión Xhol Salí) (DH5alfa ( invitrogen) , placas de kanamicina y caldo de kanamicina). La orientación se verificó comparando una digestión BamHl con una doble digestión BamHl, Salí. El plásmido con el inserto correctamente orientado (pCTPE-LTZT71 , 2) se cortó únicamente con Salí y Xhol- y Salí- digirió LTZ 3 RRRR se agregó al mismo y luego se ligó en la manera previa. El método se continuó en una manera similar a partir del extremo 5' (en sentido anti-genómico) , hasta que el genoma completo se clonó junto con el promotor T7 y HDVR, (pCTPE-LTZT7 , 1, 2, 3RRRR, 4+5, 6+7, 8, 9+10-HDVR, mejor pLTZ flT7 o pLTZflpoll) . 2. Proteínas portadoras Las secuencias de nucleocápsida (N) , fosfo (P) y matriz 2 (M2) de la cepa LTZ1 se copiaron y clonaron. El ARN se extrajo (Rnease, Qiagen) el cual se transcribió después inversamente y se amplificó por RT-PCR (Superskript 2 Invitrogen; BioX-Act, Bioline; ciclo de 94 °C 5 segundos, 50°C 20 segundos, 68 °C 2 minutos [incrementando 10 segundos por ciclo después del ciclo 5], 29 veces repetidas) utilizando en la presente cebadores (véase posteriormente) , que introdujo la secuencia del promotor T7 directamente antes del codón de inicio de cada gen y se continuó además más allá de cada codón de detención. Tabla 3 Secuencia de cebadores PCR que se utilizaron para multiplicar el gen de proteína portadora Gen Cebador Secuencia 51 - 31 SEC. DE IDENT. NO.
N T7-N TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG ACA AGT 64 CAA TGT CTC TTG N GTC AAA ATG TCT CTT GAA AG 65 start+ Pstart- CAG GGA AAG ACA TTG TTA C 66 P T7-P TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG ACA AGT 67 AAC AAT GTC TTT CC Pstart+ GTA ACA ATG TCT TTC CCT G 68 Pstop GAC TTG TCC CAT TTT TTC ATA ACT ACA 69 neg ext GAT CAA G M2 T7-M2 TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG ACA AGT 70 GAA GAT GTC TAG M2start GAT GTC TAG GCG AAA TCC C 71 + M2-lat GCA TTG CAC TTA ATT ATT GCT GTC ACC 72 neg C L T7-L TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGA CCA ATA 73 TGG AAA TAT CCG ATG AGT C L start GAA TGA AAA ACA AGG ACC AAT ATG GAA 74 Xho+ ATA TCC GAT GAG Se clonaron los genes prefijados T7 en la posición smal de pUC18, utilizando un procedimiento el cual fue idéntico a aquel utilizado para TWF anterior. Los productos PCR sin el promotor T7 se clonaron en la posición smal del p objetivo (vector de expresión de mamífero, Promega, Southhampton, UK) . Se clonó el gen de polimerasa viral (L) en áreas en la posición EcoRV de pCTPE utilizando la preparación secuencial que se utilizó para el genoma viral completo. La ligación se llevó a cabo en la siguiente secuencia: inicio T7 L, LTZ 6+7, LTZ8 , LTZ 9+10 en pCTPE. El punto de partida LTZ T7 L fue un producto de PCR (30 ciclos 94 °C 5 segundos, 60CC 20 segundos, 68 °C 2 minutos [incrementado 10 segundos por ciclo después del ciclo 5], 29 veces repetidas, utilizando Pfu [Stratagene]) , producido del PCR de rastreo de 12 ciclos descrito anteriormente, utilizando el cebador T7-L (Tabla 3) y LTZ 7.6Xho- (Tabla 2). El punto de partida LTZ T7 se ligó en la posición CPTE EcoRV, mientras las siguientes áreas de pTWF18 (Salí y Xhol) se cortaron y ligaron en la nueva posición Salí única, que se introdujo en cada etapa de la clonación. La orientación se verificó en la misma manera como para el genoma de longitud completa. El gen L también se clonó en el p Objetivo en una manera similar como aquella descrita para la secuencia iniciadora (producida con el uso del cebador L Start Xho+ (Tabla 2) y LTZ 7.6 Xho - (Tabla 2)) y no se agregó previamente el promotor T7 al mismo. 3. Copia de longitud total por copia PCR El genoma completo con un promotor T7 agregado previamente se copió y multiplicó en 3 PCR (Bioline Bio-X-act, 30 ciclos 94°C 5 segundos, 60°C 20 segundos, 68°C 4 minutos [incrementando 10 segundos por ciclo después del ciclo 5]), utilizando PCRs de copia baja (12x) que se mencionaron previamente como matrices. El conductor y las áreas centrales utilizaron la extensión conductor APV y producto LTZ 8.2 sal, y el área de rastreo utilizó el producto de extensión de rastreo LT7 y APV. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: área conductor, conductor 1 T7-APV y F 3.82 sst pos (5' CCA CTC TGT AGG AGA CGC CGC GGC AAT TAT GCT TG3 ' (SEC. DE IDENT. NO. 75); área central F 3.82 sst neg (5' CAA GCA TAA TTG CCG CGG CGT CTC CTA CAG AGT GG3 ' ) (SEC. DE IDENT. NO. 76) y LTZ 8.2 Sal- y el área de rastreo utilizó LTZ 8.2 Xho+ y la extensión de rastreo APV. En esta manera, las posiciones de endonucleasa de restricción de SstII) y Xho/Sal se agregaron a las posiciones vinculantes 3826-3831. y 8204-8209, respectivamente, de manera que se permite una última ligación de las tres áreas y un cambio de la codificación de la proteina a RRRR se introdujo además en el gen F en las posiciones aa 293-296. Las áreas se cortaron con SstII (área conductor), SstII y Salí (área central) y Xhol (área de rastreo) y conectaron utilizando ligasa de ADN T4 altamente concentrada (durante la noche, Fermentas, Germany, 30 U/µ?) . 4. Recuperación de virus a) Utilizando polimerasa pox T7 de pollo combinante Las células Vero (70% confluentes) en recesos de 35 mm se lavaron una vez con 1.0 mi de Optimem 1 y luego se infectaron con polimerasa pox T7 de pollo combinante que tiene un MOI de 0.2. Después de un tiempo de incubación de 1 hora, el medio se removió y las células se lavaron con 1 mi de Optimem 1 y subsecuentemente con 2 mi de Optimem 1. Se agregó MEM (5%) FCS. Un complejo de ADN/Fugene 6 (Boehringer Mannheim, Lewes, UK) se clonó mezclando 4 genes de proteina portadoras clonadas N, P, M2 en pUC18 (0.5 g cada uno), L en pTWF18 (50 ng)., genoma de longitud total (1 pg ya sea clonado en pCPTE o como producto PCR ligado), y 10 µ? de Fugene6 (Boehringer Mannheim) se produjo y disolvió en 300 µ? de dMEM. Después de completar la mezcla, esta mezcla se agregó gota por gota a células mientras se agita cuidadosamente la misma. Cinco días después, el sobrenadante se recolectó, se alimentó a través de un filtro de 0.2 pm y se utilizó para inocular células Vero nuevas. Se observó CPE y las células se tiñeron para detectar la presencia de antigeno TRT utilizando tinte de inmunofluorescencia indirecta. Se confirmó que el virus originado a partir de la copia de longitud total producidas en esas copias de PCR de las únicas regiones RRRR del gen F y otras regiones de conexión Sall/Xhol se secuenciaron . b) Utilizando polimerasa de ARN poli ribosomal celular Las células Vero (70% confluente) o las CEF en recesos de 35 mm se lavaron una vez con 1.0 mi de Optimem 1, después de lo cual 2 mi de MEM (5%) FCS se agregaron. Se produjo el complejo ADN/Fugene 6 (Boehringer Mannheim) en donde los cuatro genes de proteina portadora clonada N, P, M2 (0.5 pg cada uno), L (50 pg) en pObjetivo, genoma de longitud total poli (1 pg, clonado en pCPTE) y 10 pl de Fugene 6 (Boehringer Mannheim) se mezclaron y disolvieron en 300 pl de dMEM. Después de completar la mezcla, esta mezcla se agregó gota por gota a las células mientras se agita cuidadosamente la misma. Cinco días después, las células se liofilizaron y los sobrenadantes clarificados se utilizaron para infectar células nuevas. Se observó CPE y las células . se tiñeron para detectar la presencia de antigeno TRT utilizando tinte de inmunofluorescencia indirecta. Se confirmó que el virus originado a partir de la copia de longitud total producida, en donde las copias PCR se secuenciaron a partir de las únicas regiones RRRR del gen F y regiones de unión Sall/Xhol.
LISTADO DE SECUENCIAS <110> Lohmann Animal Health GmBh&Co KG <120 Atenuación de Me apneumovirus <130> 91691m6 <140> <141> <160> 79 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 4 <212> P T <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial <400> 1 Arg Arg Arg Arg 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 2 Arg Arg Arg Lys 1 <210> 3 <211> ' <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 3 Arg Arg Lys Lys 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial <400> 4 Arg Lys Lys Lys 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial <400> 5 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 6 Lys Lys Lys Arg 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 7 Lys Lys Arg Arg 1 <210> 8 <211>.4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 8 Lys Arg Arg Arg 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial <400> 9 Ser Lys Lys Lys 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial <400> 10 Ser Arg Arg Arg 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 11 Ser Lys Lys Arg 1 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 12 Ser Lys Arg Arg 1 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial <400> 13 Ser Arg Arg Lys 1 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223 Descripción de la Secuencia Artificial <400> 14 Ser Arg Lys Arg 1 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 15 Ser Lys Arg Lys 1 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 16 Lys Gly Lys Lys 1 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial c220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 17 Lys Gly Arg Arg 1 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial 220? <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 18 Lys Gly Arg Lys 1 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 19 Lys Gly Lys Arg 1 210> 20- 211> 4 212> PRT 213> Secuencia Artificial 220> 223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 20 Arg Gly Lys Lys 1 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 21 Arg Gly Arg Arg 1 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 22 Arg Gly Arg Lys 1 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 23 Arg Gly Lys Arg 1 <210> 24. <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido <400> 24 Arg Lys Glu Lys 1 <210> 25 <211> 4 <212> PRT <213> Virus APV tipo <400> 25 Arg His Glu Arg 1 <210> 26 <211> 4 <212> PRT <213> Virus APV tipo C <400> 26 Ser Gly Lys Asp 1 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Metapneumovirus humano <400> 27 Ser Gly Lys Lys 1 <210> 28 <211> 539 <212> PRT <213> Metapneumovirus humano <220> <223> Proteína F modificada <400> 2 °, Met Ser .Trp Lys Val Val lie lie Phe Ser Leu Leu lie Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr lie Thr 20 " 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu lie Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln lie Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala lie Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp lie Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln he Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 lie Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Phe Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Arg Arg Arg Arg Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie 340 345 350 Asn lie Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr lie Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val lie Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser lie Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg lie 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe lie lie Val lie lie 485 490 495 Leu lie Ala Val Leu Gly Ser Thr Met lie Leu Val Ser Val Phe lie 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe lie Pro His Asn 530 535 <210> 29 <211> 539 <212> PRT <213> Metapneumovirus humano <220> <223> Proteína F modificada <400> 29 Met Ser Trp Lys Val Val lie lie Phe Ser Leu Leu lie Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr lie Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu lie Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln lie Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala lie Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp lie Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 lie Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Phe Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Arg Arg Arg Lys Gly Asn Tyr , Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie 340 345 350 Asn lie Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro lie Ser et Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr lie Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val lie Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser He Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg lie 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe lie lie Val lie lie 485 490 495 Leu lie Ala Val Leu Gly Ser Thr Met lie Leu Val Ser Val Phe lie 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe lie Pro His Asn 530 535 <210> 30 <211> 539 <212> PRT <213> Metapneumovirus humano <220> <223> Proteína F modificada <400> 30 Met Ser Trp Lys Val Val lie lie Phe Ser Leu Leu lie Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr lie Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu lie Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln lie Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala lie Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp lie Ala Asp Leu Lys et Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 . 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 lie Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Phe Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro Iüe Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Arg Arg Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie 340 345 350 Asn lie Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr lie Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val lie Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser ·?1ß Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg lie 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe lie lie Val lie lie 485 490 495 Leu lie Ala Val Leu Gly Ser Thr Met lie Leu Val Ser Val Phe lie 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe lie Pro His Asn 530 535 . <210> 31 <211> 539 <212> PRT <213> Metapneumovirus humano <220> <223> Proteína F modificada <400> 31 et Ser Trp Lys Val Val lie lie Phe Ser Leu Leu lie Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr lie Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu lie Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln lie Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala lie Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp lie Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 lie Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Phe Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Lys Lys Arg Arg Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie 340 345 350 Asn lie Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr lie Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val lie Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser lie Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg lie 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe lie lie Val lie lie 485 490 495 Leu lie Ala Val Leu Gly Ser Thr Met lie Leu Val Ser Val Phe lie 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe lie Pro His Asn 530 535 <210> 32 <211> 539 <212> PRT <213> Metapneumovirus humano <220> <223> Proteína F modificada <400> 32 Met Ser Trp Lys Val Val lie lie Phe Ser Leu Leu lie Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr lie Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu lie Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln lie Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala lie Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp lie Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 lie Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Phe Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Lys Arg Arg Arg Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp, 325 330 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie 340 345 350 Asn lie Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Ásn Arg Val Gly lie lie 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr lie Thr Asn Gln Asp Ala As 405 410 415 Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val lie Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser lie Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg lie 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe lie lie Val lie lie 485 490 495 Leu lie Ala Val Leu Gly Ser Thr Met lie Leu Val Ser Val Phe lie 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe lie Pro His Asn 530 535 <210> 33 <211> 539 <212> PRT <213> Metapneumovirus humano <220> <223> Proteína F modificada <400> 33 Met Ser Trp Lys Val Val lie lie Phe Ser Leu Leu lie Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr lie Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu lie Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln lie Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala lie Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp lie Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp: 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 lie Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Phe Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Arg Arg Arg Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr. 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie 340 345 350 Asn lie Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr lie Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val lie Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser lie Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg lie 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe lie lie Val lie lie 485 490 495 Leu lie Ala Val Leu Gly Ser Thr Met lie Leu Val Ser Val Phe lie 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe lie Pro His Asn 530 535 <210> 34 <211> 539 <212> PRT <213> Metapneumovirus humano <220> <223> Proteína F modificada <400> 34 Met Ser Trp Lys Val Val lie lie Phe Ser Leu Leu lie Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr lie Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu lie Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln lie Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala lie Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp lie Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 lie Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Phe Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Arg Gly Arg Arg Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 ' 330 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie 340 345 350 Asn lie Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr lie Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val lie Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser lie Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg lie 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe lie lie Val lie lie 485 490 495 Leu lie Ala Val Leu Gly Ser Thr Met lie Leu Val Ser Val Phe lie 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe lie Pro His Asn 530 535 <210> 35 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 35 cgagaaaaaa acgcattcaa gcagg 25 <210> 36 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 36 gatgtctagg cgaaatccct ge <210> 37 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 37 acgagaaaaa aaegeattea agcaggttct 30 <210> 38 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 38 gggtatctat gatggtcgac agatgtg 27 <210> 39 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 39 ttaatacgac tcactatagg accaatatgg aaatatccga tgag 44 <210> 40 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 40 gctaaaaatt tgatgaatac ggtttttttc tcgt 34 <210> 41 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 41 taatacgact cactatagga cgagaaaaaa acgcattcaa gcagg 45 <210> 42 <2tl> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 42 ctcaaggttg gggggtcgac c <210> 43 <211 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 43 acgggccggc cccctgcgtg 20 210> 44 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 44 aaaagctctt caattacgag aaaaaaacgc attcaagcag gttc 44 <210> 45 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 45 ctcaaggttg gggggtcgac c 21 210> 46 211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <22 > <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 46 ggcatgtaca aagctcgag 22 <210> 47 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 47 cattgcaagt gatgttgtcg acattccc 28 <210> 48 <211 30· <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 48 cctcgaaata gggaatctcg agaacatcac 30 <210> 49 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 49 caagcataat tgccgcggcg tctcctacag agtgg 35 <210> 50 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 50 ccactctgta ggagacgccg cggcaattat gcttg 35 <210> 51 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> 223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 51 gcagggattt cgcgtggaca tcttc 25 <210> 52 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 52 caagtgaaga tctcgaggcg aaatccc 27 <210> 53 <211> 30 <212> ADN <213 Secuencia Artificial <22Q> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 53 gatcgtattc aactcgagaa cttacctgac 30 <210> 54 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 54 gatcgtattc aactcgagaa cttacctgac 30 210> 55 211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 55 gctatgatct tttgcgtcga caaagcac 28 <210> 56 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 56 gtacatccag tgctttctcg aggc 24 <210> 57 <211> 26· <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 57 cagtgacagg tttttggtcg actatg 26 <210> 58 <211> 22 <212> ADN c213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 58 gctgagggtg acatactcga ge 22 <210> 59 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 59 gcagccggac tcgagctctc ce <210> 60 <211> 22 <212> ADN 213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 60 tagaatteac ctgcaggcat ge 22 <210> 61 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 61 gaggatcccc gggtaccgag c 21 <210> 62 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 62 cggatatcca caggatccgg ggataacgc 29 <210> 63 211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 63 cgagatcctc gagccggatc ctc 23 <210> 64 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 64 ttaatacgac tcactatagg gacaagtcaa aaatgtctct tg 42 <210> 65 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 65 gtcaaaatgt ctcttgaaag 20 <210> 66 <211> 19 212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 66 Ciigggaaaga cattgttac 19 <210> 67 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 67 ttaatacgac tcactatagg gacaagtaac aatgtctttc c 41 <210> 68 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 68 gtaacaatgt ctttccctg <210> 69 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400 69 gacttgtccc attttttcat aactacagat caag 34 <210> 70 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 70-ttaatacgac tcactatagg gacaagtgaa gatgtctag <210> 71 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 71 gatgtctagg cgaaatccc <210> 72 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 72 gcattgcact taattattgc tgtcaccc 28 <210> 73 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleó ido <400> 73 ttaatacgac tcactatagg accaatatgg aaatatccga tgagtc 46 <210> 74 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 74 gaatgaaaaa caaggaccaa tatggaaata tccgatgag 39 <210> 75 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 75 ccactctgta ggaga<_gccg cggcaattat gcttg 35 <210> 76 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 76 caagcataat tgccgcggcg tctcctacag agtgg 35 <210> 77 <211> 6 <212> PRT <213> RSV humano <400> 77 Thr Thr Asn Thr Lys Glu 1 5 <210> 78 <211 6 <212> PRT <213> RSV humano <400> 78 Thr Thr Asn lie Lys Glu 1 5 <210> 79 <211> 6 <212> PRT <213> RSV bovino <400> 79 Thr Thr Asp Asn Lys Glu 1 5

Claims (1)

  1. R E I V I N D I C A C I O N E S 1. Una vacuna contra un miembro del género metapneumovirus o RSV o un virus el cual tiene una homología genética significativa en el área de proteína F con un miembro del género metapneumovirus, caracterizada porque comprende un virus o parte de un virus, el virus se modifica en la región aa 293-296 de la secuencia de aminoácido de la proteína F (proteína de fusión) o en una región que tiene la misma funcionalidad como por ejemplo aa 323-328 en RSV cuando se compara con el virus de tipo silvestre. 2. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, en donde el virus es un virus vivo. 3. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el virus es un virus vivo atenuado. 4. La vacuna de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la modificación comprende una estabilización de la región aa 293-296 o una región que tiene la misma funcionalidad como aa 323-328 en RSV. 5. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la estabilización se logra por la sustitución de codones, que codifican aminoácidos en la región, por codones que requieren más mutaciones para regresar al virus de tipo silvestre . 6. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, en donde la estabilización se logra por la sustitución de codones, que codifican aminoácidos en la región, por codones que con menos probabilidad mutan detrás de un codón el cual codifica para ácido glutámico. 7. La vacuna de acuerdo con una o una pluralidad de las reivindicaciones anteriores, en donde la modificación en la región aa 293-296 o en una región que tiene la misma funcionalidad como aa 323-328 en RSV comprende la sustitución de al menos un aminoácido no básico por al menos un aminoácido básico. 8. La vacuna de acuerdo con una o una pluralidad de las reivindicaciones anteriores, en donde la modificación comprende la adición de al menos un aminoácido. 9. La vacuna de acuerdo con una o una pluralidad de las reivindicaciones anteriores 1 a 7, en donde la modificación comprende la eliminación de al menos un aminoácido acidico. 10. La vacuna de acuerdo con una o una pluralidad de las reivindicaciones anteriores 1 a 8, en donde la modificación comprende la sustitución de al menos un residuo de ácido glutámico por al menos un aminoácido básico. 11. La vacuna de acuerdo con una o una pluralidad de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos un aminoácido básico se selecciona del siguiente grupo: arginina, . lisina y/o histidina. 12. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, en donde al menos un aminoácido básico es arginina y/o lisina . 13. La vacuna de acuerdo con una o una pluralidad de las reivindicaciones anteriores, en donde la región aa 293-296 del virus de tipo silvestre tiene una frecuencia como se representa en una de las SEC. DE IDENT. NOS. 24 a 27. 14. La vacuna de acuerdo con una o una pluralidad de las reivindicaciones anteriores, en donde la región aa 293-296 del virus atenuado tiene una secuencia como se representa en una de las SEC. DE IDENT. NOS. 1 a 23. 15. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 13 y/o 14, en donde la región aa 293-296 del virus de tipo silvestre tiene una secuencia como se representa en la SEC. DE IDENT. NO. 24, y en donde la región del virus atenuado tiene una secuencia como se representa en la SEC. DE IDENT. NO. 1. 16. La vacuna de acuerdo con una de las reivindicaciones 13 y/o 14, en donde la región aa 293-296 del virus de tipo silvestre tiene una secuencia como se representa en la SEC. DE IDENT. NO. 27, y en donde esta región del virus atenuado tiene una secuencia como se representa en las SEC . DE IDENT. N0S. 1, 2, 10 o 21. 17. La vacuna de acuerdo con una o una pluralidad de las reivindicaciones anteriores, en donde una modificación en la región aa 293-296 se selecciona de manera que proporciona una vacuna contra APV o hMPV, mientras una modificación se selecciona en la región aa 323-328 para la provisión de una vacuna contra RSV. 18. La vacuna de acuerdo con una o una pluralidad de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el metapneumovirus es un metapneumovirus humano. 19. La vacuna de acuerdo con una o una pluralidad de las reivindicaciones 1 bis 17, en donde el metapneumovirus es un metapneumovirus aviar, en particular APV. 20. La vacuna de acuerdo con una o una pluralidad de las reivindicaciones anteriores, en donde el virus vivo atenuado se formula con un agente auxiliar adecuado y/o portador y/o adyuvante. 21. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el virus es un virus atenuado, el cual se formula con una cantidad adecuada de interleucina-6 (IL-6) . 22. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el virus es un virus atenuado el cual se formula con una cantidad adecuada de interleucina-12 (IL-12) o interleucina-18 (IL-18) . 23. El método para la producción de una vacuna dirigida contra los miembros del género metapneumovirus o RSV o un virus que tiene una homología genética significativa en el área de proteína F con un miembro del género metapneumovirus, el método comprende las siguientes etapas: a) proporcionar un virus virulento contra el cual una vacuna va a desarrollarse, b) proporcionar una modificación en la secuencia de ácido nucleico que codifica la región aa 293-296 de la proteina F o para una región que tiene la misma funcionalidad, tal como aa 323-328 en RSV, del virus, y c) obtener un virus vivo atenuado que comprende la modificación anterior. 24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, la modificación se relaciona a una modificación de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 16. 25. El método de acuerdo con la reivindicación 23 ó 24, en donde el virus es un virus seleccionado del grupo como se define de acuerdo a una de las reivindicaciones 17 a 19. 26. El método de acuerdo con una o una pluralidad de las reivindicaciones 23 a 25, en donde la provisión de una modificación se obtiene como sigue: i) la producción de una copia de ADN de longitud total del genoma viral del virus contra lo cual una vacuna va a desarrollarse, i.i) provisión de copias de ADN de longitud total por la ligación de longitudes parciales de productos PCR que introduce un cambio en la región aa 293-296 o en una región que tiene la misma funcionalidad tal como aa 323-328 en RSV, iii) la recuperación del virus a partir de copias de ADN de longitud total utilizando por ejemplo, polimerasa de ARN poli ribosomal recombinante o celular de polimerasa pox T7 de pollo. 27. Un virus vivo atenuado que pertenece al género metapneumovirus o pneumovirus, caracterizado porque comprende una modificación en la región aa 293-296 de la proteina F o en un área que tiene la misma funcionalidad, tal como aa 323-328 en RSV. 28. El virus vivo atenuado de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizado porque la modificación es una modificación como se define en una de las reivindicaciones 2 a 16. 29. El virus vivo atenuado de acuerdo con la reivindicación 27 o 28, en donde el virus es un virus como se define en una de las reivindicaciones 17 a 19. 30. Una célula huésped, en donde comprende un virus de acuerdo con una de las reivindicaciones 27 a 29. 31. Una secuencia de ADN o ADNc de acuerdo con una de las SEC. DE IDENT. NOS. 28, 29, 30, 31, 32, 33 ó 34. 32. Una secuencia de ARN correspondiente al ADN o ADNc de la .secuencia de acuerdo con la reivindicación 31. 33. Una proteina oF de un miembro del género metapneumovirus o RSV o de un virus el cual tiene una homología genética significativa en la proteína F a un miembro del género metapneumovirus, caracterizado porque comprende una modificación en la región aa 293-296 o en una región que tiene la misma funcionalidad, tal como aa 323-328 en RSV, de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16. 34. Un vector, que comprende la secuencia de ADN, ADNc, o ARN, de acuerdo con las reivindicaciones 31 ó 32. 35. Un virus vivo atenuado, obtenible por el método de acuerdo con una o una pluralidad de las reivindicaciones 23 a 26. 36. Un plásmido, que comprende secuencia de ADN, ADNc o ARN de acuerdo con la reivindicación 31 ó 32. 37. El uso de la proteina F de acuerdo con la reivindicación 33 ó del virus vivo atenuado de acuerdo con las reivindicaciones 27 a 29 ó 35, para la producción de una vacuna para la prevención de un trastorno o enfermedad accionada por uno de los virus de acuerdo con una de las reivindicaciones 17 a 19. 38. Los cebadores, caracterizados por una de las SEC. DE IDENT. NOS. 35 a 76.
MXPA04011226A 2002-05-16 2003-05-16 Atenuacion de metalpneumovirus. MXPA04011226A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10221836A DE10221836A1 (de) 2002-05-16 2002-05-16 Attenuierung von Metapneumovirus
PCT/EP2003/005187 WO2003097089A2 (de) 2002-05-16 2003-05-16 Attenuierung von metapneumovirus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MXPA04011226A true MXPA04011226A (es) 2005-06-20

Family

ID=29413891

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA04011226A MXPA04011226A (es) 2002-05-16 2003-05-16 Atenuacion de metalpneumovirus.

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20060002958A1 (es)
EP (1) EP1503792A2 (es)
JP (1) JP2005538702A (es)
CN (1) CN1652819A (es)
AU (1) AU2003240668A1 (es)
BR (1) BR0310046A (es)
CA (1) CA2484295A1 (es)
DE (1) DE10221836A1 (es)
IL (1) IL164698A0 (es)
MX (1) MXPA04011226A (es)
PL (1) PL372529A1 (es)
WO (1) WO2003097089A2 (es)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8715922B2 (en) 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
CA2435180C (en) 2001-01-19 2019-04-09 Vironovative B.V. A virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
CA2477234C (en) 2002-02-21 2014-12-30 Medimmune Vaccines, Inc. Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
CA2523319A1 (en) 2003-04-25 2004-11-11 Medimmune Vaccines, Inc. Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus
WO2006027698A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-16 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg. Decreasing potential iatrogenic risks associated with influenza vaccines
WO2010077712A1 (en) * 2008-12-09 2010-07-08 Novavax, Inc. Bovine respiratory syncytial virus virus-like particle (vlps)
CA2766205A1 (en) * 2009-06-24 2010-12-29 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccine comprising at least two paramyxovirus f protein antigens
US9512178B2 (en) * 2012-07-11 2016-12-06 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Neurogenic brain-derived neurotrophic factor peptides
WO2014208821A1 (ko) * 2013-06-27 2014-12-31 건국대학교기술지주 주식회사 신규한 조류메타뉴모바이러스 및 그 백신
KR101560337B1 (ko) 2013-06-27 2015-10-19 주식회사 카브 신규한 조류메타뉴모바이러스 및 그 백신
HUE059127T2 (hu) 2015-10-22 2022-10-28 Modernatx Inc Légúti vírusok elleni vakcinák
WO2018107088A2 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
RU2656188C1 (ru) * 2017-05-03 2018-06-04 Общество с ограниченной ответственностью "Анкрим" (ООО "Анкрим") Синтетическое анальгетическое средство пептидной природы и способ его применения
FR3084079A1 (fr) * 2018-07-23 2020-01-24 Universite Claude Bernard Lyon 1 Nouvelle souche virale attenuee et son utilisation en tant que vaccin
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6083925A (en) * 1995-06-07 2000-07-04 Connaught Laboratories Limited Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines
CA2435180C (en) * 2001-01-19 2019-04-09 Vironovative B.V. A virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003097089A2 (de) 2003-11-27
WO2003097089A3 (de) 2004-02-05
CN1652819A (zh) 2005-08-10
CA2484295A1 (en) 2003-11-27
PL372529A1 (en) 2005-07-25
JP2005538702A (ja) 2005-12-22
AU2003240668A1 (en) 2003-12-02
DE10221836A1 (de) 2003-12-04
IL164698A0 (en) 2005-12-18
BR0310046A (pt) 2005-02-15
US20060002958A1 (en) 2006-01-05
EP1503792A2 (de) 2005-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100801180B1 (ko) 약독화된 재조합 뉴캐슬병 바이러스 및 이를 함유하는뉴캐슬병 백신
ES2273852T3 (es) Proteinas v de morbillivirus modificadas.
EP2451827B1 (en) Chimaeric protein
MXPA04011226A (es) Atenuacion de metalpneumovirus.
US6699476B1 (en) Production of recombinant respiratory syncytial viruses expressing immune modulatory molecules
JP2002502241A (ja) クローン化されたヌクレオチド配列からの弱毒化パラインフルエンザウィルスワクチンの製造
AU783900B2 (en) Production of recombinant respiratory syncytial viruses expressing immune modulatory molecules
US10980872B2 (en) Genetically stable live attenuated respiratory syncytial virus vaccine and its production
KR100940776B1 (ko) 약독화된 사람-소 키메라 파라인플루엔자바이러스(ｐｉｖ) 백신
JP2021152024A (ja) 多価エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）ワクチン組成物およびそれに関連する使用
JP2022088376A (ja) さまざまな弱毒化表現型をもたらすｍ２－２ ｏｒｆにおける突然変異を含む組換えｒｓウイルス株
RU2773746C2 (ru) Рекомбинантные штаммы респираторно-синцитиального вируса с мутациями в м2-2 orf, обеспечивающими диапазон аттенуирующих фенотипов
CA2399504C (en) Methods for producing temperature-sensitive morbillivirus
NZ512800A (en) An IBDV mutant in a vaccine for poultry
Sureshkumar et al. Expression of Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene in mammalian expression vector.
Longhurst Genetic variability of measles virus during propagation in cultured cells
CA2503512A1 (en) Avian pneumovirus genes, recombinant avian pneumovirus and methods of making

Legal Events

Date Code Title Description
FA Abandonment or withdrawal