WO2003080736A1 - Verwendung von oxazin-farbstoffen als markierungsgruppen für die einzelmolekülanalyse - Google Patents

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WO2003080736A1
WO2003080736A1 PCT/EP2003/002981 EP0302981W WO03080736A1 WO 2003080736 A1 WO2003080736 A1 WO 2003080736A1 EP 0302981 W EP0302981 W EP 0302981W WO 03080736 A1 WO03080736 A1 WO 03080736A1
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carboxyl
sulfonyl
hydroxyl
alkyl
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PCT/EP2003/002981
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Rudolf Rigler
Holger Winter
Kerstin Korn
Klaus Mühlegger
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Gnothis Holding Sa
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B19/00—Oxazine dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D265/28—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines
    • C07D265/34—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines condensed with carbocyclic rings
    • C07D265/38—[b, e]-condensed with two six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D498/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the invention relates to the use of oxazine dyes as labeling groups for single-molecule analysis, in particular for single-molecule sequencing of nucleic acids. Furthermore, new oxazine compounds are disclosed.
  • Oxazine dyes and their use as fluorescent markers are known (see e.g. EP-A-0 747 447 or Bioforum 1 -2 (2001), 32-34). The use of these fluorescent dyes for single-molecule sequencing has not previously been proposed.
  • the present invention therefore relates to the use of compounds of the general formulas (I) or (II)
  • each R 1 is independently selected from hydrogen, alkyl, alkoxy or polyoxyhydrocarbyl, wherein alkyl or alkoxy is optionally substituted by one or more groups, such as hydroxyl, sulfonyl, carboxyl, halogen, NO 2 , amino, Alkoxycarbonyl or / and aminocarbonyl
  • each R 2 is independently selected from hydrogen, sulfonyl (SO 3 H or SO 3 ⁇ ) carboxyl, hydroxyl, halogen, NO 2 , alkyl, alkoxy or polyoxyhydrocarbonyl, wherein alkyl or alkoxy is optionally substituted by hydroxyl, sulfonyl, carboxyl, halogen, NO 2 , amino, alkoxycarbonyl or / and aminocarbonyl, in which an R 2 with an adjacent R 1 can form a five- or six-membered saturated or unsaturated heterocyclic ring, and in which at least one radical
  • the alkyl and alkoxy groups preferably contain 1-7, particularly preferably 1-4 and most preferably 1-3 carbon atoms, where the groups can be branched or straight-chain .
  • the term “polyhydroxycarbyl units” is to be understood as meaning polymeric or oligomeric organic groups which are linked to one another via O groups.
  • the polyethyleneoxy groups with 2-4 ethylene oxide units are particularly preferred.
  • the radicals R 2 are particularly preferably hydrogen, sulfonyl, carboxyl, hydroxyl, NO 2 or / and halogen (F, Cl, Br or I).
  • radicals R 1 the alkyl, alkoxy and polyoxyhydrocarbyl groups are as defined for the radicals R 2 . It is particularly preferred if at least one radical R 1 contains at least one substituent selected from sulfonyl, carboxyl and / or hydroxyl. Particularly preferably at least two radicals R 1 contain such substituents, most preferably contain at least two of the radicals R 1 sulfonyl groups. Preferred examples of the compounds (I) are shown in FIG. 1.
  • At least one of the radicals R 1 and R 2 contains a group capable of coupling or is attached to a biomolecule, for example a protein, a peptide
  • nucleic acid e.g. a DNA or RNA or a nucleotide, in particular coupled to a nucleoside triphosphate.
  • group capable of coupling is particularly preferably a carboxyl group which is formed by
  • derivatization to an active ester such as an N-hydroxysuccinimide ester or a mixed anhydride can be activated and with an amino group on a biomolecule, e.g. can react with an amino group on a nucleobase to form an amide.
  • an active ester such as an N-hydroxysuccinimide ester or a mixed anhydride
  • an amino group on a biomolecule e.g. can react with an amino group on a nucleobase to form an amide.
  • Another suitable marker group is one
  • Isothiocyanate group that can react with an amino group on a biomolecule to form a thiourea.
  • the compounds of the formula (I) or (II) are particularly suitable for single-molecule analysis by means of confocal detection, such as by means of fluorescence correlation spectroscopy (FCS).
  • confocal detection such as by means of fluorescence correlation spectroscopy (FCS).
  • a very small, preferably confocal volume element for example 0.1 x 10 "15 to 20 x 10 " 12 I of a sample is exposed to an excitation light from a light source, for example a laser, so that the molecules of the fluorescent dye in this measurement volume are emitted are excited by fluorescence, the emitted fluorescent light from the measurement volume being measured by means of a photodetector, so that individual molecules in the measurement volume can be identified if they are diluted appropriately.
  • the labeling groups according to the invention are preferably coupled to a nucleoside triphosphate, for example a deoxyribonucleoside triphosphate or ribonucleoside triphosphate.
  • the coupling is preferably via a linker to the nucleobase, the sugar or a phosphate group, particularly preferably to an amino group of the nucleobase.
  • the linker is preferably a flexible molecule with a chain length of 2-30 atoms, which in addition to CH 2 groups can also contain heteroatoms, such as nitrogen or oxygen, for example as carbonyl, aminocarbonyl or hydroxyl-substituted CH groups.
  • Linker molecules constructed in this way advantageously increase the water solubility of the labeled nucleotides or can be the site of further derivatization.
  • the linkers can either be coupled on the nucleotide side or on the dye side in a manner known to the person skilled in the art. As a rule, they are therefore primarily bifunctional molecules.
  • nucleoside triphosphates labeled with the compounds (I) or (II) are enzymatically incorporated into the nucleic acid molecules to be sequenced.
  • nucleoside triphosphates which carry an oxazine group according to the invention can be incorporated into nucleic acid strands with high efficiency and the resulting highly labeled nucleic acid strands are easy to sequence.
  • Non-radioactive nucleic acid labeling and detection has experienced a rapid development in the past approx. 1 5 years (see, for example, "Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules" (Kessler, C, ed.), Springer Verlag Berlin, Heidelberg 1 992).
  • nucleic acid molecules to be sequenced for example DNA molecules or RNA molecules, can be used in single-stranded form or double-stranded form. In the case of double-stranded molecules, it must be ensured that labeled nucleotide building blocks can only be split off from a single strand.
  • essentially all, for example at least 90%, preferably at least 95% of all nucleotide building blocks of at least one base type is a fluorescent labeling group.
  • essentially all nucleotide building blocks of at least 2 base types, for example 2, 3 or 4 base types carry a fluorescent label, each base type advantageously carrying a different fluorescent label group.
  • the labeled nucleic acids can be extended by enzymatic primer extension on a nucleic acid matrix and using a suitable polymerase, for example a DNA polymerase, such as a DNA polymerase from Thermococcus gorgonarius or other thermostable organisms (Hopfer et al., PNAS USA 96 (1 999) , 3600-3605) or a modified Taq polymerase (Patel and Loeb, PNAS USA 97 (2000), 5095-5100) using nucleotide building blocks labeled with the compounds (I) or (II).
  • a suitable polymerase for example a DNA polymerase, such as a DNA polymerase from Thermococcus gorgonarius or other thermostable organisms (Hopfer et al., PNAS USA 96 (1 999) , 3600-3605) or a modified Taq polymerase (Patel and Loeb, PNAS USA 97 (2000), 5095-5100) using nucle
  • Another object of the invention is thus a method for sequencing nucleic acids, comprising the steps:
  • This method examines a single molecule immobilized on a carrier particle.
  • the particle size is preferably in Range from 0.5-10 ⁇ m and particularly preferably from 1 -3 ⁇ m.
  • suitable materials for carrier particles are plastics, glass, quartz, metals or semimetals, metal oxides or composite materials which contain several of the aforementioned components.
  • Optically transparent carrier particles for example made of plastics, or particles with a plastic core or a silicon dioxide shell are particularly preferably used.
  • the nucleic acid molecules are preferably immobilized on the carrier particle via their 5 'ends.
  • the binding to the carrier can be done according to known. Methods are based on covalent or noncovalent interactions.
  • Carrier particles to which only a single nucleic acid molecule is bound are used for the method.
  • Such carrier particles can be produced by bringing the nucleic acid molecules intended for sequencing into contact with the carrier particles in a molar ratio of preferably 1: 5 to 1:20 under conditions in which the nucleic acid molecules are immobilized on the carrier.
  • the resulting carrier particles are then e.g. on the basis of the fluorescent labeling groups contained on the nucleic acid molecules, sorted and separated from particles to which no nucleic acid molecule is bound.
  • the loaded carrier particles are introduced into a sequencing device, which preferably contains a microchannel.
  • a capture laser e.g. an IR laser
  • the carrier particle can be held in a capillary or a microchannel (Ashkin et al., Nature 330 (1987), 24-31; Chu, Science 235 (1991), 861-866).
  • the sequencing reaction comprises the progressive cleavage of individual nucleotide building blocks from the immobilized nucleic acid molecules.
  • An enzymatic is preferably carried out Cleavage using an exonuclease, single-strand or double-strand exonucleases that degrade in the 5 ' ⁇ 3' direction or 3 ' ⁇ 5' direction - depending on the type of immobilization of the nucleic acid strands on the support - can be used.
  • T7 DNA polymerase, E. coli exonuclease I or E. coli exonuclease III are particularly preferably used as exonucleases.
  • the evaluation is preferably carried out with confocal single-molecule detection.
  • the detection can also be carried out by a time-resolved decay measurement, a so-called time gating.
  • time gating a so-called time gating.
  • the invention further relates to new compounds of the general formulas (I) or (II)
  • each R 1 is independently selected from hydrogen, alkyl, alkoxy or polyoxyhydrocarbyl, wherein alkyl or alkoxy is optionally substituted by one or more groups such as hydroxyl, sulfonyl, carboxyl, halogen, NO 2 , amino, alkoxycarbonyl or / and aminocarbonyl or Salts or addition compounds thereof, wherein each R 2 is independently selected from hydrogen, sulfonyl (SO 3 H or SO 3 e ) carboxyl, hyd roxyl, halogen, NO 2 , alkyl, alkoxy or polyoxyhydrocarbonyl, wherein alkyl or alkoxy is optionally substituted by hydroxyl , Sulfonyl, carboxyl, halogen, NO 2 , amino, alkoxycarbonyl and / or aminocarbonyl, in which an R 2 with an adjacent R 1 can form a five- or six-membered saturated or unsaturated heterocyclic ring, and in which at least
  • R 1 and R 2 are as previously defined and R 1 a is an optionally substituted alkyl group which is a carboxyl or activated carboxyl group, or is coupled via the carboxyl group to a binding molecule.
  • R 1 contains a sulfonyl group and R 1a is an alkyl group substituted by aminocarboxyl which bears a carboxy terminus.
  • R 1a is an alkyl group substituted by aminocarboxyl which bears a carboxy terminus.
  • FIG. 2 A particularly preferred embodiment of the compounds (Ia) is shown in FIG. 2.
  • Figure 1 shows preferred examples of compounds (I) or (II) according to the invention.
  • FIG. 2 shows a particularly preferred example of the compound (Ia) according to the invention.
  • Example 2 The residue from Example 2 is taken up in about 50 ml of semi-concentrated hydrochloric acid without further purification and cooled to 0 ° C. in an ice bath. A solution of 100 mmol Na nitrite in approx. 25 ml H 2 O is slowly added dropwise; the reaction temperature should not rise above 5 ° C. When the addition is complete, stirring is continued for 2 h, during which the nitroso compound is separated off. The precipitate is filtered off, washed with ether and dried in a high vacuum.
  • the dry adsorbent is then placed on a silica gel column and first eluted with ethanol (less separation polar connections). Then more water is gradually added to the eluent to desorb the dye. The appropriate fractions are combined and the solvent is distilled off. The residue is dissolved in H 2 O and chromatographed a second time on a reversed phase (RP) column (H 2 O-methanol 9: 1). The combined fractions are evaporated to dryness, the residue is dissolved in methanol with a little H 2 O, the solution is filtered and evaporated again. After drying in a high vacuum, approx. 1 5-20% of theory obtained on pure dye.
  • Example 5 ⁇ 3- [N, N-Di- (3-sulfopropyl-) amino] -7- (N-carboxyethyl-N-methylamino) phenoxazine ⁇ - [5- (3-aminoallyl) -2 ' -deoxy-uridine-5'- triphosphate]
  • UV / VIS spectrum (0.1 M phosphate buffer, pH 7.0): ⁇ max 655 nm
  • Example 6 ⁇ 3- [N, N-Di- ⁇ 3-sulfopropyl-) amino] -7- (N-carboxyethyl-N-methyl-aminq) -phenoxazine ⁇ - [7- (3-aminopropyn-1-yl ) -7-desaza-2'- deoxy-guanosine-5'-triphosphate]
  • the compound was prepared analogously to Example 5, using 5 ⁇ mol 7- (3-aminopropyn-1-yl) -7-desaza-2'-deoxy-guanosine-5'-triphosphate (commercially available) as the nucleotide in the reaction. Working up and chromatography was carried out as described in Example 5.

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Oxazin-Stoffen als Markierungsgruppen für die Einzelmolekülanalyse, insbesondere für die Einzelmolekül-Sequenzierung von Nukleinsäuren. Weiterhin werden neue Oxazin-Verbindungen offenbart.

Description

Verwendung von Oxazin-Farbstoffen als Markierungsgruppen für die Einzelmolekülanalyse
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Oxazin-Farbstoffen als Markierungsgruppen für die Einzelmolekülanalyse, insbesondere für die Einzelmolekul-Sequenzierung von Nukleinsäuren. Weiterhin werden neue Oxazin-Verbindungen offenbart.
Oxazin-Farbstoffe und ihre Verwendung als Fluoreszenzmarker sind bekannt (siehe z.B. EP-A-0 747 447 oder Bioforum 1 -2 (2001 ), 32-34) . Eine Verwendung dieser Fluoreszenzfarbstoffe für die Einzelmolekül- Sequenzierung wird bisher nicht vorgeschlagen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) oder (II)
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oder Salzen oder Additionsverbindungen davon, worin jedes R1 unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy oder Polyoxyhydrocarbyl ausgewählt ist, worin Alkyl oder Alkoxy gegebenenfalls substituiert ist durch eine oder mehrere Gruppen, wie etwa Hydroxyl, Sulfonyl, Carboxyl, Halogen, NO2, Amino, Alkoxycarbonyl oder/und Aminocarbonyl, worin jedes R2 unabhängig aus Wasserstoff, Sulfonyl (SO3H oder SO3 θ) Carboxyl, Hydroxyl, H alogen , NO2, Alkyl , Al koxy oder Polyoxyhydrocarbonyl ausgewählt ist, worin Alkyl oder Alkoxy gegebenenfalls substituiert ist durch Hydroxyl, Sulfonyl, Carboxyl, Halogen, NO2, Amino, Alkoxycarbonyl oder/und Aminocarbonyl, worin ein R2 mit einem benachbarten R1 einen fünf- oder sechsgliedrigen gesättigten oder ungesättigten heterocyclischen Ring bilden kann, und worin mindestens ein Rest R1 oder R2 eine zur Kopplung fähige Gruppe darstellt oder an ein Biomolekül gekoppelt ist, als Fluoreszenz- Markierungsgruppen für die Einzelmolekülanalyse.
In den Resten R2 der Verbindungen (I) oder (II) enthalten die Alkyl- und Alkoxy-Gruppen vorzugsweise 1 -7, besonders bevorzugt 1 -4 und am meisten bevorzugt 1 -3 Kohlenstoff atome, wobei die Gruppen verzweigt oder geradkettig sein können. Unter dem Begriff "Polyhydroxycarbyl- Einheiten" sind polymere oder oligomere organische Gruppen zu verstehen, die über O-Gruppen miteinander verknüpft sind. Besonders bevorzugt sind die Polyethylenoxy-Gruppen mit 2-4 Ethylenoxideinheiten. Besonders bevorzugt sind die Reste R2 Wasserstoff, Sulfonyl, Carboxyl, Hydroxyl, NO2 oder/und Halogen (F, Cl, Br oder I).
In den Resten R1 sind die Alkyl-, Alkoxy- und Polyoxyhydrocarbylgruppen wie für die Reste R2 definiert. Besonders bevorzugt ist, wenn mindestens ein Rest R1 zumindest einen Substituenten ausgewählt aus Sulfonyl, Carboxyl oder/und Hydroxyl enthält. Besonders bevorzugt enthalten mindestens zwei Reste R1 derartige Substituenten, am meisten bevorzugt enthalten mindestens zwei der Reste R1 Sulfonylgruppen. Bevorzugte Beispiele der Verbindungen (I) sind in Figur 1 dargestellt.
Mindestens einer der Reste R1 und R2 enthält eine zur Kopplung fähige Gruppe oder ist an ein Biomolekül, z.B. ein Protein, ein Peptid, ein
Saccharid, ein Nukleinsäure, z.B. eine DNA oder RNA oder ein Nukleotid, insbesondere an ein Nukleosidtriphosphat gekoppelt. Besonders bevorzugt ist die zur Kopplung fähige Gruppe eine Carboxylgruppe, die durch
Derivatisierung beispielsweise zu einem Aktivester, wie etwa einem N- Hydroxysuccjnimidester oder zu einem gemischten Anhydrid aktiviert werden kann und mit einer Aminogruppe auf einem Biomolekül, z.B. mit einer Aminogruppe auf einer Nukleobase unter Bildung eines Amids reagieren kann. Eine weitere geeignete Markierungsgruppe ist eine
Isothiocγanatgruppe, die mit einer Aminogruppe auf einem Biomolekül zu einem Thioharnstoff reagieren kann. Andere geeignete zur Kopplung fähige
Gruppen sind dem Fachmann bekannt.
Die Verbindungen der Formel (I) oder (II) sind insbesondere für die Einzelmolekülanalyse mittels konfokaler Detektion, wie etwa durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS), geeignet. Dabei wird ein sehr kleines, vorzugsweise konfokales Volumenelement, beispielsweise 0, 1 x 10"15 bis 20 x 10"12 I einer Probe einem Anregungslicht einer Lichtquelle, beispielsweise eines Lasers, ausgesetzt, so dass die in diesem Messvolumen befindlichen Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs zur Emission von Fluoreszenz angeregt werden, wobei das emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Messvolumen mittels eines Photodetektors gemessen wird, so dass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne Moleküle in dem Messvolumen identifiziert werden können. Auf Einzelheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details zu den für die Detektion verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung des europäischen Patents 0 679 251 verwiesen. Als besonders geeignet haben sich die Verbindungen (I) oder (II) bei der Einzelmolekülsequenzierung von Nukleinsäuren erwiesen. Verfahren zur Einzelmolekülsequenzierung sind beispielsweise in Dörre et al. (Bioimaging 5 ( 1 997), 1 39-1 52) und in WO 02/02225 beschrieben. Auf die Offenbarung dieser Dokumente hinsichtlich der Verfahrensführuήg und der apparativen Details wird hiermit Bezug genommen.
Zur Verwendung in einem Einzelmolekül-Sequenzierungsverfahren werden die erfindungsgemäßen Markierungsgruppen vorzugsweise an ein Nukleosidtriphosphat, z.B. ein Deoxyribonukleosidtriphosphat oder Ribonukleosidtriphosphat, gekoppelt. Die Kopplung erfolgt vorzugsweise über einen Linker an die Nukleobase, den Zucker oder eine Phosphatgruppe, besonders bevorzugt an eine Aminogruppe der Nukleobase. Der Linker ist vorzugsweise ein flexibles Molekül mit einer Kettenlänge von 2-30 Atomen, welches neben CH2-Gruppen auch Heteroatome, wie etwa Stickstoff oder Sauerstoff, enthalten kann, beispielsweise als Carbonyl-, Aminocarbonyl- oder Hydroxyl-substituierte CH-Gruppen. Derartig aufgebaute Linkermoleküle erhöhen vorteilhaft die Wasserlöslichkeit der markierten Nukleotide bzw. können Ort weiterer Derivatisierung sein. Die Linker können entweder in dem Fachmann bekannter Weise nukleotidseitig oder aber farbstoffseitig angekoppelt werden. In der Regel sind es daher primär bifunktionelle Moleküle.
Die mit den Verbindungen (I) oder (II) markierten Nukleosidtriphosphate werden enzymatisch in die zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküle eingeb aut. Ü berraschenderweise wu rde festg estel lt, d ass Nukleosidtriphosphate, die eine erfindungsgemäße Oxazingruppe tragen, mit hoher Effizienz in Nukleinsäurestränge eingebaut werden können und die resultierenden hochmarkierten Nukleinsäurestränge gut sequenzierbar sind. Die nichtradioaktive Nukleinsäure-Markierung und -Detektion hat in den letzten ca. 1 5 Jahren eine stürmische Entwicklung erfahren (siehe z.B. "Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules" (Kessler, C, Hrsg.), Springer Verlag Berlin, Heidelberg 1 992).
Während sich aber gängige Nachweisverfahren mit einer Markierung jeder 20-30 Nukleobase begnügen, sind die Anforderungen der Einzelmolekülanalyse ungleich höher, d.h. es muss jede Base der Sequenz mit einer Signalgruppe markiert werden.
Es hat sich in früheren Arbeiten gezeigt, dass der hochdichte Einbau von Farbstoffmolekülen eine neusynthetisierte Nukleinsäure mit relativ hydrophoben Eigenschaften liefert, was bei der weiteren Versuchsführung Probleme machen kann. Es war daher auch eine Aufgabe der Erfindung, durch geeignete Substitution der Farbstoffe die Wasserlöslichkeit derselben zu erhöhren. Zwar ist eine solche Vorgehensweise bekannt, die Erkenntnis aber, dass dadurch die Polymerase-Akzeptanz der markierten Nukleosidtriphosphate bzw. das Polymerisationsverhalten der Polymerase im Sinne einer höheren Einbau- und Polymerisationsrate positiv beeinflusst werden, ist neu und überraschend.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass insbesondere eine Kombination von wasserlöslichen Linkermolekülen mit hydrophilen Oxazin- Farbstoffen und ihre Konjugation mit Nukleosidtriphosphaten zu der Lösung des Problems beitragen.
Die zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküle, z.B. DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle, können in einzelsträngiger Form oder doppelsträngiger Form eingesetzt werden. Bei doppelsträngigen Molekülen muss sichergestellt sein, dass markierte Nukleotidbausteine nur von einem einzigen Strang abgespalten werden können. Bei den zu sequenzierenden Nukleinsäuresträngen tragen im Wesentlichen alle, z.B. mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 %, aller Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp eine Fluoreszenz-Markierungsgruppe. Vorzugsweise tragen im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens 2 Basentypen, beispielsweise 2, 3 oder 4 Basentypen, eine Fluoreszenzmarkierung, wobei jeder Basentyp günstigerweise eine unterschiedliche Fluoreszenz- Markierungsgruppe trägt. Die markierten Nukleinsäuren können durch enzymatische Primer-Extension an einer Nukleinsäurematrize und Verwendung einer geeigneten Polymerase, z.B. einer DNA-Polymerase, wie etwa einer DNA-Polymerase von Thermococcus gorgonarius oder anderen thermostabilen Organismen (Hopfer et al., PNAS USA 96 (1 999), 3600- 3605) oder einer modifizierten Taq-Polymerase (Patel und Loeb, PNAS USA 97 (2000), 5095-5100) unter Verwendung von mit den Verbindungen (I) oder (II) markierten Nukleotidbausteinen erzeugt werden. Alternativ können die markierten Nukleinsäurestränge auch durch Amplifikationsreaktionen, z.B. PCR, hergestellt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekül, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsäuremoleküls als Fluoreszenzmarkierung eine Verbindung (I) oder (II) enthalten,
(b) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, (c) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung,
(d) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine durch von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül und
(e) Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsäuremoleküls aufgrund der Abfolge der abgespalteten Nukleotidbausteine.
Bei diesem Verfahren wird ein einzelnes, auf einem Trägerpartikel immoblisiertes Molekül untersucht. Die Partikelgröße liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5-10 μm und besonders bevorzugt von 1 -3 μm. Beispiele für geeignete Materialien von Trägerpartikeln sind Kunststoffe, Glas, Quarz, Metalle oder Halbmetalle, Metalloxide oder Verbundmaterialien, die mehrere der zuvor genannten Komponenten enthalten. Besonders bevorzugt werden optisch transparente Trägerpartikel, beispielsweise aus Kunststoffen, oder Partikel mit einem Kunststoffkern oder einer Siliciumdioxidhülle eingesetzt.
Die Nukleinsäuremoleküle werden vorzugsweise über ihre 5'-Enden auf dem Trägerpartikel immobilisiert. Die Bindung an den Träger kann nach bekannten . Methoden über kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkungen erfolgen.
Für das Verfahren werden Trägerpartikel verwendet, an die nur ein einziges Nukleinsäuremolekül gebunden ist. Derartige Trägerpartikel können dadurch erzeugt werden, dass die zur Sequenzierung vorgesehenen Nukleinsäuremoleküle in einem molaren Verhältnis von vorzugsweise 1:5 bis 1:20 mit den Trägerpartikeln unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen eine Immobilisierung der Nukleinsäuremoleküle an den Träger stattfindet. Die resultierenden Trägerpartikel werden dann, z.B. anhand der auf d en Nu klei nsäuremolekülen enth altenen Fluoreszenzmarkierungsgruppen, sortiert und von Partikeln, an die kein Nukleinsäuremolekül gebunden ist, abgetrennt.
Die beladenen Trägerpartikel werden in eine Sequenziervorrichtung eingebracht, die vorzugsweise einen Mikrokanal enthält. Mit Hilfe eines Einfanglasers, z.B. eines IR-Lasers, kann das Trägerpartikel in einer Kapillare oder einem Mikrokanal festgehalten werden (Ashkin et al., Nature 330 (1987), 24-31; Chu, Science 235 (1991), 861-866).
Die Sequenzierungsreaktion umfasst das fortschreitende Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den immobilisierten Nukleinsäuremolekülen. Vorzugsweise erfolgt eine enzymatische Abspaltung unter Verwendung einer Exonuklease, wobei Einzelstrang- bzw. Doppelstrang-Exonukleasen, die in 5'→3'-Richtung oder 3'→5'-Richtung abbauen - je nach Art der Immobilisierung der Nukleinsäurestränge auf dem Träger - eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt werden als Exonukleasen T7 DNA-Polymerase, E.coli Exonuklease I oder E.coli Exonuklease III verwendet.
Die Auswertung erfolgt - wie zuvor beschrieben - vorzugsweise mit konfokaler Einzelmolekül-Detektion. Alternativ bzw. zusätzlich kann die Detektion auch durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time-Gating, erfolgen. Für Einzelheiten wird auf WO 02/02225 Bezug genommen.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind neue Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) oder (II)
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2 V-
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worin jedes R1 unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy oder Polyoxyhydrocarbyl ausgewählt ist, worin Alkyl oder Alkoxy gegebenenfalls substituiert ist durch eine oder mehrere Gruppen, wie etwa Hydroxyl, Sulfonyl, Carboxyl, Halogen, NO2, Amino, Alkoxycarbonyl oder/und Aminocarbonyl oder Salzen oder Additionsverbindungen davon, worin jedes R2 unabhängig aus Wasserstoff, Sulfonyl (SO3H oder SO3 e) Carboxyl , Hyd roxyl, Halogen , NO2, Alkyl, Alkoxy oder Polyoxyhydrocarbonyl ausgewählt ist, worin Alkyl oder Alkoxy gegebenenfalls substituiert ist durch Hydroxyl, Sulfonyl, Carboxyl, Halogen, NO2, Amino, Alkoxycarbonyl oder/und Aminocarbonyl, worin ein R2 mit einem benachbarten R1 einen fünf- oder sechsgliedrigen gesättigten oder ungesättigten heterocyclischen Ring bilden kann, und worin mindestens ein Rest R1 oder R2 eine zur Kopplung fähige Gruppe darstellt oder an ein Biomolekül gekoppelt ist mit der Maßgabe, dass mindestens zwei Reste R1 oder/und R2 durch Sulfonyl, Carboxyl oder/und Hydroxyl substituiert sind.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel (la)
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oder Salze oder Additionsverbindungen davon, worin R1 und R2 wie zuvor definiert sind und R1 a eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe ist, die eine zur Kopplung fähige Carboxyl- oder aktivierte Carboxylgruppe trägt, oder über die Carboxylgruppe an ein Bindemolekül gekoppelt ist.
Bei den Verbindungen (la) enthält vorzugsweise mindestens einer der Reste R1 eine Sulfonylgruppe und R1a ist eine durch Aminocarboxyl substituierte Alkylgruppe, die einen Carboxyterminus trägt. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Verbindungen (la) ist in Figur 2 dargestellt.
Weiterhin soll die Erfindung durch die folgenden Figuren und Beispiele erläutert werden.
Figur 1 zeigt bevorzugte Beispiele für erfindungsgemäße Verbindungen (I) oder (II).
Figur 2 zeigt ein besonders bevorzugtes Beispiel für die erfindungsgemäße Verbindung (la).
Beispiele
Beispiel 1: N,N-Di-(3-sulfopropyI)-m-aminophenol-IMa2-Salz
100 mmol 3-Aminophenol und 250 mmol Propansulfon werden in 150 ml Dimethylf ormamid gelöst. Dazu gibt man 250 mmol Natriumhydrogencarbonat und erhitzt die Mischung während 2 h auf 100 °C. Man lässt auf Raumtemperatur abkühlen und zieht das Lösungsmittel im Hochvakuum ab. Der Rückstand wird in Aceton auf geschlämmt, filtriert und der Filterrückstand mit Aceton und Diethylether mehrfach gewaschen. Man trocknet anschließend im Hochvakuum. Das Rohprodukt enthält noch etwa 10 Gew.-% NaHCO3 und wird ohne weitere Reinigung in die Phenoxazin-Synthese (Beispiel 4) eingesetzt. Beispiel 2: N-Carboxyethyl-N-methyl-anilin
1 00 mmol N-Methylanilin und 1 20 mmol Acrylsäure werden in 100 ml Eisessig gelöst undmit ca. 0,3 mmol Hydrochinon (als Katalysator) versetzt. Das Reaktonsgemisch wird zum Rückfluss erhitzt und der Reaktionsverlauf mittels Dünnschichtchromatographie (DC) verfolgt. Nach ca. 5-6 h ist in der Regel kein Edukt mehr nachweisbar. Das Lösungsmittel wird daraufhin in Vakuum abdestilliert und der dunkelgelbe Rückstand im Hochvakuum gut getrocknet.
Beispiel 3: 4-Nitroso-N-carboxyethyl-N-methyl-anilin
Der Rückstand aus Beispiel 2 wird ohne weitere Reinigung in ca. 50 ml halbkonzentrierter Salzsäure aufgenommen und im Eisbad auf 0 °C gekühlt. Dazu wird langsam eine Lösung von 100 mmol Na-nitrit in ca. 25 ml H2O zugetropft; die Reaktionstemperatur soll dabei nicht über 5 °C ansteigen. Nach beendeter Zugabe wird 2 h nachgerührt, wobei die Nitrosoverbindung abgeschieden wird. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit Ether gewaschen und im Hochvakuum getrocknet.
Beispiel 4: 3-[N,N-Di-(3-sulfopropyl-)amino]-7-(N-carboxyethyl-N-methyl- amino)-phenoxazin
50 mmol 4-Nitroso-N-carboxethyl-N-methylanilin aus Beispiel 3 und 60 mmol N,N-Di(3-sulfopropyl)-m-aminophenol-Na2-Salz werden in 1 00 ml Eisessig gelöst und während 20 min in einem auf 1 60 °C vorgeheizten Ölbad zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Lösungsmittel abdestilliert, restliche Spuren Essigsäure durch dreimalige azeotrope Destillation mit H2O entfernt. Man löst den Rückstand in einem Gemisch aus Wasser und Ethanol (3: 1 ) und zieht auf Kieselgel (Normalphase 60-22 μm) auf. Das trockene Adsorbens wird anschließend auf eine Kieselgel- Säule gegeben und zunächst mit Ethanol eluiert (Abtrennung weniger polarer Verbindungen). Danach wird sukzessiv mehr Wasser zum Elutionsmittel gegeben, um den Farbstoff zu desorbieren. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Lösungsmittel abdestilliert. Man löst den Rückstand in H2O und chromatografiert ein zweites Mal an einer Reversed Phase (RP)-Säule (H2O-Methanol 9: 1 ) . Die vereinigten Fraktionen werden zur Trockene eingedampft, der Rückstand in Methanol unter Zusatz von wenig H2O gelöst, die Lösung filtriert und erneut eingedampft. Nach Trocknung im Hochvakuum werden ca. 1 5-20 % d.Th. an reinem Farbstoff erhalten.
Beispiel 5: {3-[N,N-Di-(3-sulfopropyl-)amino]-7-(N-carboxyethyl-N-methyl- amino)-phenoxazin}-[5-(3-aminoallyl)-2'-desoxy-uridin-5'- triphosphat]
2,5 mg (4,4 μmol) des Farbstoffes aus Beispiel 4 werden in 200 μl Dimethylsulfoxid gelöst und 2 μl Diisopropylethylamin sowie 2 mg (6,6 μmol) N,N,N',N'-Tetramethyl-succinimido-uronium-tetrafluorborat (TSTU) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 10 min bei Raumtemperatur gerührt, dann eine Lösung von 5 μmol 5-(3-Aminoallyl)-dUTP (kommerziell erhältlich) in 500 μl H2O in zwei Portionen innerhalb ca. 5 min zugefügt. Nach einer weiteren Reaktionszeit von 10 min wird die Lösung filtriert und das Filtrat auf eine Sepharose "HighLoad 1.6/10"-Säule (Pharmacia) gegeben. Man chromatografiert mit einem Gradient aus Puffer A (H2O/Acetonitril) und Puffer B ( 1 ,5 M LiCI) . Die Produktfraktionen werden vereinigt, auf ein Gesamtvolumen von ca. 3 ml konzentriert und in 50 ml eines Gemisches von Aceton/H2O (3: 1 ) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Der Rückstand wird in 1 ml Na-phosphatpuffer, 20 mM/l, pH 7,2 aufgenommen und bei -20 °C aufbewahrt.
Ausbeute: 1 , 1 μmol entspr. ca 25 % d. Th.
UV/VIS-Spektrum (0, 1 M Phosphatpuffer, pH 7,0): Λmax655 nm Beispiel 6: {3-[N,N-Di-{3-sulfopropyl-)amino]-7-(N-carboxyethyl-N-methyl- aminq)-phenoxazin}-[7-(3-aminopropyn-1 -yl)-7-desaza-2'- desoxy-guanosin-5'-triphosphat]
Die Verbindung wurde analog Beispiel 5 hergestellt, indem als Nukleotid 5 μmol 7-(3-Aminopropyn-1 -yl)-7-desaza-2'-desoxy-guanosin-5'-triphosphat (kommerziell erhältlich) in die Reaktion eingesetzt wurden. Die Aufarbeitung und Chromatografie erfolgte wie unter Beispiel 5 beschrieben.
Ausbeute: 0,3 μmol entspr. ca 20 % d. Th.
UV/VIS-Spektrum (0, 1 M Phosphatpuffer, pH 7,0): Λmax655 nm

Claims

Ansprüche
Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) oder (II)
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0002
oder Salzen oder Additionsverbindungen davon, worin jedes R1 unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy oder
Polyoxyhydrocarbyl ausgewählt ist, worin Alkyl oder Alkoxy gegebenenfalls substituiert ist durch eine oder mehrere Gruppen, ausgewählt aus Hydroxyl, Sulfonyl, Carboxyl, Halogen, NO2, Amino,
Alkoxycarbonyl und Aminocarbonyl, worin jedes R2 unabhängig aus Wasserstoff, Sulfonyl (SO3H oder
SO3 θ) Carboxyl, Hydroxyl, Halogen, NO2, Alkyl, Alkoxy oder
Polyoxyhydrocarbonyl ausgewählt ist, worin Alkyl oder Alkoxy gegebenenfalls substituiert ist durch eine oder mehrere Gruppen, ausgewählt aus Hydroxyl, Sulfonyl, Carboxyl, Halogen, NO2, Amino, Alkoxycarbonyl oder/und Aminocarbonyl, worin ein R2 mit einem benachbarten R1 einen fünf- oder sechsgliedrigen gesättigten oder ungesättigten heterocyclischen Ring bilden kann, und worin mindestens ein Rest R1 oder R2 eine zur Kopplung fähige Gruppe darstellt oder an ein Biomolekül gekoppelt ist, als Fluoreszenz-Markierungsgruppen für die Einzelmolekülanalyse.
2. Verwendung nach Anspruch 1 für die Einzelmolekülanalyse durch konfokale Detektion, insbesondere durch Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie (FCS).
3. V e rwe n d u n g n ach A n s p ru c h 1 o d e r 2 f ü r d i e Einzelmolekülsequenzierung von Nukleinsäuren.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen (I) oder (II) an ein Nukleosidtriphosphat gekoppelt sind.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Reste R2 jeweils unabhängig aus Wasserstoff, Sulfonyl, Carboxyl, Hydroxyl, Halogen und NO2 ausgewählt sind.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Rest R1 durch Sulfonyl, Carbonyl oder/und Hydroxyl substituiert ist.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Reste R1 durch Sulfonyl, Carbonyl oder/und Hydroxyl substituiert sind.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Kopplung fähige Gruppe einen Linker enthält.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Kopplung fähige Gruppe einen hydrophilen Linker enthält.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen (!) oder (II) ausgewählt sind aus den in Figur 1 und 2 dargestellten Verbindungen.
1 1 . Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekül, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsäuremoleküls als
Fluoreszenzmarkierung eine Verbindung (l) oder (II) enthält,
(b) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung,
(c) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung,
(d) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine durch von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül und
(e) Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsäuremoleküls aufgrund der Abfolge der abgespalteten Nukleotidbausteine.
2. Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) oder (II)
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000018_0002
worin jedes R1 unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy oder Polyoxyhydrocarbyl ausgewählt ist, worin Alkyl oder Alkoxy gegebenenfalls substituiert ist durch eine oder mehrere Gruppen, ausgewählt aus Hydroxyl, Sulfonyl, Carboxyl, Halogen, NO2, Amino, Alkoxycarbonyl und Aminocarbonyl oder Salzen oder
Additionsverbindungen davon, worin jedes R2 unabhängig aus Wasserstoff, Sulfonyl (SO3H oder SO3 θ) Carboxyl, Hydroxyl, Halogen, NO2, Alkyl, Alkoxy oder Polyoxyhydrocarbonyl ausgewählt ist, worin Alkyl oder Alkoxy gegebenenfalls substituiert ist durch eine oder mehrere Gruppen, ausgewählt aus Hydroxyl, Sulfonyl, Carboxyl, Halogen, NO2, Amino, Alkoxycarbonyl und Aminocarbonyl, worin ein R2 mit einem benachbarten R1 einen fünf- oder sechsgliedrigen gesättigten oder ungesättigten heterocyclischen Ring bilden kann, und worin mindestens ein Rest R1 oder R2 eine zur Kopplung fähige Gruppe darstellt oder an ein Biomolekül gekoppelt ist mit der Maßgabe, dass mindestens zwei Reste R1 oder/und R2 durch Sulfonyl, Carboxyl oder/und Hydroxyl substituiert sind.
1 3. Verbindungen nach Anspruch 1 2, ausgewählt aus den in Figur 1 gezeigten Verbindungen und Salzen oder Additionsverbindungen davon.
14. Verbindungen nach Anspruch 1 2 der allgemeinen Formel (la):
Figure imgf000019_0001
oder Salze oder Additionsverbindungen davon, worin R1 und R2 wie zuvor definiert sind und R1 a eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe ist, die eine zur Kopplung fähige Carboxyl- oder aktivierte Carboxylgruppe trägt, oder über die Carboxylgruppe an ein Biomolekül gekoppelt ist.
1 5. Verbindungen nach Anspruch 14, ausgewählt aus den in Figur 2 gezeigten Verbindungen oder Salzen oder Additionsverbindungen davon.
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