WO2003076652A1

WO2003076652A1 - Reactif pour la mesure de l'activite de l'alanine aminotransferase

Info

Publication number: WO2003076652A1
Application number: PCT/JP2003/002897
Authority: WO
Inventors: Takayuki Fujii
Original assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc.
Priority date: 2002-03-12
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2003-09-18
Also published as: JPWO2003076652A1; KR20040095275A; EP1484414A1; EP1484414B1; DE60324259D1; EP1484414A4; US20050221416A1; KR100918590B1; JP3756832B2; JP2005124401A; US7192727B2

Description

明細書ァラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬技術分野

本発明は、ァラニンアミノ卜ランスフェラーゼ活性測定試薬に関する。背景技術

ァラニンアミノトランスフェラーゼ（以下、 ALTと略称する）は、心臓や肝に多く分布する酵素であり、各種疾患時に血中に遊出されるので、尿や血液等の生体液中 A LT活性の測定は、心疾患又は肝疾患の診断や治療の経過観察の指標として重要な項目の一つである。

A LT活性の測定法としては、 L—ァラニン及び 2—ォキソグルタル酸を基質として、 ALTによって生成されるピルビン酸を乳酸脱水素酵素（以下、 LDと略称する）によって乳酸に変え、共存させておいた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、 NADHと略称する）量の減少量を、波長 340 nm 付近で測定することによリ A L T活性を測定する方法が汎用されている。

この反応式を示せば、以下のとおりである。

ALT

L—ァラニン +2—ォキソダルタル酸 > L _グルタミン酸 +ピルビン酸

L D

ピルビン酸 + NAD H >乳酸 + NAD なお、前記式中で、 NADは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドでめる。

先に述べたとおり、 ALT活性測定は、心疾患又は肝疾患の診断や治療の経過観察の指標として重要な項目の一つであるため、国際的に測定されている。しかし、 ALT活性の測定法は各種知られており、いろいろな測定法が用いられているため、施設間や測定者間で測定値が異なり、その測定値の互換性がとりずらく、臨床的な診断に支障をきたす恐れがある。そのため、各国において、反応原理、試薬組成、及び試薬濃度等を規定した勧告法が提唱されており、勧告法で求められた測定値と互換性が得られるよう、各施設において A L T活性測定が行われるようになってぎた。

日本でも日本臨床化学会（J SCC) が 1 989年に ALT活性測定の勧告法を公表している [日本臨床化学会：ヒト血清中酵素活性測定の勧告法一ァラニンァミノトランスフェラーゼ一（1 989— 08— 30) , 臨床化学， 1 8 (4) ， 250— 262 (1 989) ] 。

日本臨床化学会の公表した前記勧告法は、測定値の互換性を取るために、臨床検査室等の技術レベルで共有することのできる共通の酵素活性測定を最適な条件で測定する方法であるため、一般には日常の検査法として使用することのできるものではない。そこで、臨床検査薬メーカーは、日本臨床化学会の勧告法と測定値との互換性が取れるような試薬を提供している。そして、日本臨床化学会の勧告法と測定値との互換性が取れることを前提に、正確で、精密な測定値を得られるような、より安定で、安価な試薬を提供しようと日々努力している。

このように、臨床検査室等の A LT活性測定を行なっている施設では、日常の検査法として曰本臨床化学会の勧告法と測定値との互換性が取れるような臨床検査薬メーカーの提供する ALT活性測定試薬を使用しているのが一般的である。しかしながら、生体試料は多種類の成分の混合物であり、また、 ALT活性測定試薬も多種類の成分の混合物であることから、試薬の安定化や夾雑物の影響を受けないような A L T活性測定試薬の開発は極めて困難である。

特に、測定試薬をセッ卜し、条件を設定するだけで自動的に測定する自動分析機と呼ばれている分析装置では、数週間に渡り蓋を開けたまま放置して測定することが多く、この場合、大気中の二酸化炭素を吸収し、 A LT活性測定試薬の p Hが変化し、試薬ブランク反応も変わり、得られる ALT活性測定値に誤差が発生する問題点があった。

従って、本発明の課題は、試薬ブランク反応の上昇、すなわち、初期吸光度の上昇を抑制することのできる A L T活性測定試薬を提供することにある。発明の開示

前記課題は、本発明による、 L—ァラニン、 2—ォキソダルタル酸、乳酸脱水素酵素、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含むァラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬において、乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質を、更に含むことを特徴とする、前記ァラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬によリ解決することができる。

本発明の好ましい態様においては、前記ァラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬は、 2試薬からなり、第一試薬又は第二試薬のいずれか一方、あるいは、両方に、乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質を含有する。本発明の更に好ましい態様においては、前記ァラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬は、 2試薬からなり、同一試薬中に、乳酸脱水素酵素と乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質とを含有する。

本発明の別の好ましい態様においては、前記ァラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬は、少なくとも乳酸脱水素酵素を第一試薬として、少なくとも 2 —ォキソグルタル酸を第二試薬として含有する 2試薬系である。

本発明の測定試薬の更に別の好ましい態様においては、乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質が、ォキサミン酸又はその塩である。

また、本発明は、ァラニンアミノトランスフェラーゼを含有する可能性のある被検試料と、 Lーァラニン、 2—ォキソダルタル酸、乳酸脱水素酵素、還元型二コチンアミドアデニンジヌクレオチド、及び乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質とを接触させることを特徴とする、ァラニンアミノトランスフエラーゼ活性の測定方法に関する。

また、本発明は、ァラニンアミノトランスフェラーゼを含有する可能性のある被検試料と、 L—ァラニン、 2—ォキソダルタル酸、乳酸脱水素酵素、還元型二コチンアミドアデニンジヌクレオチド、及び乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質とを接触させ、前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの減少量又は生成する酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの増加量を測定することを特徴とする、ァラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定方法に関する。本発明の測定方法の好ましい態様においては、乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質が、ォキサミン酸又はその塩である。

本発明の測定方法の別の好ましい態様においては、ォキサミン酸又はその塩の濃度が、測定系における終濃度として、 0. 005〜 5 mm o 1 1_である。本発明の測定方法の更に別の好ましい態様においては、乳酸脱水素酵素の濃度が、測定系における終濃度として、 1 00UZL以上である。図面の簡単な説明

図 1は、本発明及び比較用の ALT活性測定試薬における、ブランク感度の経時的変化を示すグラフである。

図 2は、本発明及び比較用の ALT活性測定試薬を用いて測定した、プール血清中 ALT活性測定値の経時的変化を示すグラフである。

図 3は、本発明及び比較用の ALT活性測定試薬における、 LD安定性を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

本発明の A LT活性測定試薬は、 L—ァラニン、 2—ォキソグルタル酸、 LD, 及び NAD Hを含む公知の ALT活性測定試薬の改良試薬である。 L—ァラニン、 2—ォキソグルタル酸、 L D、及び NAD Hを含む A LT活性測定試薬では、 L —ァラニン及び 2—ォキソグルタル酸を基質として、 A LTによって生成されるピルビン酸を L Dによって乳酸に変え、共存させておいた N A D H量の減少量を、あるいは、生成する NADの増加量を、波長 340 nm付近で測定することによリ、 A LT活性を測定することができる。

本発明の ALT活性測定試薬は、これらの公知の構成成分に加え、 LD活性に対する阻害作用を有する物質（以下、 LD阻害剤と称する）を含む。本発明で用いる LD阻害剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、ォキサミン酸、シユウ酸、ォキサ口酢酸、ピルビン酸、ホスホェノールピルビン酸、ドデシル硫酸ナトリウム、乳酸、若しくはヒドロキシグルタル酸、又はそれらの塩を用いることができ、 ALT活性測定に誤差を与えることがない点で、ォキサミン酸又はその塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はリチウム塩）が好ましい本発明の A L T活性測定試薬に含有される L D阻害剤の濃度は、使用する L D 阻害剤の種類によリ変化するので、 A L T活性測定試薬に影響を与えない L D活性が存在する濃度である限り、特に限定されるものではないが、一般的には、測定系における終濃度が 0. 001〜1 O Ommo I ZLとなるように、測定試薬中の含有濃度を調整して用いることができる。

「A LT活性測定試薬に影響を与えない LD活性が存在する」とは、被検試料中の A L T活性を測定するために最低必要な L D活性が少なくとも残存していることを意味し、 LD阻害剤により LD活性が阻害されても最低必要量の LD活性が残存していれば、 ALT活性測定試薬としては問題にはならない。更に、本発明の目的は試薬ブランク反応を抑制することにあるので、 A LT活性測定試薬に影響を与えない LD活性を有し、しかも、試薬ブランク反応がなるべく小さくなるような、 L D添加量及び L D阻害剤量の組み合わせを適宜設定すればよい。より具体的には、例えば、 LD阻害剤としてォキサミン酸を用いる場合には、測定系における終濃度が、好ましくは 0. 005〜5mmo I ZL、より好ましくは 0. 02〜1 mmo I Z Lとなる量で添加することにより、期待される効果を得ることができる。後述するように、試薬構成を第一試薬と第二試薬とに分ける場合においても、終濃度が前記と同様であれば、第一試薬又は第二試薬のいずれか一方に、あるいは、両方に添加しても同様の効果を得ることができる。また、 L D阻害剤を L Dと共存させることにより、 LDを安定化させる効果も併せて得ることができる。

本発明の A L T活性測定試薬に含有される構成成分の内、公知の A L T活性測定試薬に含まれる各種成分、すなわち、 LD、 NADH、 L—ァラニン、及び 2 —ォキソグルタル酸については、公知の A LT活性測定試薬と同様に用いることができる。

例えば、 LDとしては、例えば、ニヮトリ心臓由来、ブタ心臓由来、ブタ筋肉由来、若しくはロイコノストック 'メセンテロイデス（L e u c o n o s t o c me s e n t e r o i d e s) 由来の天然型 LD、又はそれらの組換え型 LD を用いることができ、その由来は特には限定されない。また、本発明の ALT活性測定試薬に含有される LDの濃度は、測定系における終濃度が、少なくとも 1 OOUZし以上となるように、適宜選択して用いることができる。なお、本発明の A LT活性測定試薬は LD阻害剤を更に含むことを特徴としているので、 LD阻害剤による LD阻害分を考慮し、終濃度活性が少なくとも 1 0 OUZし以上となるように、適宜選択して用いることができる。例えば、 L D阻害剤としてォキサミン酸を 0. 02〜 1 mmo I ZLとなる量で添加する場合においても、終濃度活性が少なくとも 1 OOUZL以上となるように、適宜選択して用いることができる。

なお、本明細書において「LD活性」とは、ピルビン酸を乳酸に還元する活性を意味する。また、その単位「U」は、 1分間に 1 mo Iの基質（ピルビン酸）を生成物（乳酸）に転換する酵素活性の量（標準温度は 30°G) で定義される。

本発明の A L T活性測定試薬に含有される N A D Hの濃度は、測定系における終濃度が、好ましくは 0. 05~2mmo I ZL、より好ましくは 0. "！〜 0. 5mmo I ZLとなる範囲で使用することができる。

基質であるし一ァラニンの濃度は、測定系における終濃度が、好ましくは 1 0 0〜3000mmo I ZL、より好ましくは 200〜 2000 mm o I ZLとなる範囲で使用することができる。

また、もう一つの基質である 2—ォキソグルタル酸の濃度は、測定系における終濃度が、好ましくは 1〜50 Ommo I ZL、より好ましくは 5〜 1 00 mm o I ZLとなる範囲で使用することができる。

本発明の ALT活性測定試薬は、公知の ALT活性測定試薬と同様に、適当な緩衝剤を更に含むことができ、前記緩衝剤としては、 ALT活性測定への悪影響がない限り、従来公知の緩衝液を適宜選択して使用することができる。具体的には、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン、リン酸、 2— [4— (2—ヒドロキシェチル）一 1—ピペラジル]エタンスルホン酸、ビス（2—ヒドロキシェチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン、 2—ヒドロキシ一 N—トリス（ヒドロキシメチル）メチル一3—ァミノプロパンスルホン酸、 N— トリス（ヒドロキシメチル）メチル一2—アミノエタンスルホン酸、又は n—ェチルモルフオリン等を使用することができる。

更に、本発明の A L T活性測定試薬は、前記必須配合成分及び緩衝剤の他に、必要により、一般的に添加される成分、例えば、キレート剤 [例えば、エチレンジァミン四酢酸（E D T A ) 等] 、防腐剤（例えば、アジ化物等）、安定化剤

(例えば、アルブミン又はグリセロール等）、及び又は各種界面活性剤等を適宜添加することができる。

本発明の A L T活性測定試薬の試薬構成は、公知の A L T活性測定試薬と同様に、特に限定されるものではなく、例えば、 1試薬にまとめることもできるし、あるいは、 2試薬以上の試薬構成とすることもできるが、一般的には、各構成成分が安定な条件に分け、活性測定に至適な条件にて反応することができる試薬構成にすることが好ましい。このような試薬構成としては、例えば、アルカリ性で安定な N A D H及び L D等を含む第一試薬と、 2—ォキソグルタル酸等を含む第二試薬とに分け、反応時に活性測定に至適な試薬濃度及び p Hになるようにこれらの各試薬を構成し、更に、第一試薬又は第二試薬のいずれか一方、あるいは、両方に、 L D阻害剤及び L—ァラニンを添加することができるが、これに限定されるものではない。

また、被検試料として、ピルビン酸を含有する可能性のある被検試料（例えば, 血液、血清、血漿、若しくは尿等の体液、又は細胞組織等）を測定する場合には, 被検試料由来のピルビン酸の影響を排除するために、少なくとも L Dを第一試薬として含有し、 2—ォキソグルタル酸を第二試薬として含有する 2試薬系とすることが好ましい。ピルビン酸を含有する可能性のある被検試料と、 L Dを含む第一試薬とを混合し、被検試料由来のピルビン酸を消去した後、第二試薬を添加することにより、被検試料由来のピルビン酸の影響を受けることなく、 A L T活性を測定することができる。

なお、少なくともし D及び 2—ォキソダルタル酸を第二試薬として含有する 2 試薬系であっても、第二試薬添加後、例えば、数十秒から 1分間程度で被検試料由来のピルビン酸を消去した後、 A L T活性を測定することができるし、あるいは、 1試薬系であっても同様の目的を果たすことができ、従って、本発明の A L T活性測定試薬は、特定の試薬構成に限定されるものではない。本発明の ALT活性測定試薬は、例えば、本発明の A LT活性測定方法に用いることができる。本発明の ALT活性測定方法では、被検試料と、 Lーァラニン、 2—ォキソグルタル酸、 l_D、 NADH、及び LD阻害剤とを接触させ、 NAD H量の減少量を、あるいは、生成する NADの増加量を、波長 340 nm付近で測定することにより、 ALT活性を測定することができる。

前記被検試料は、 A L T活性を含有する可能性のある被検試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、臨床診断に一般的に用いられる生体由来液、例えば、血液、血清、血漿、若しくは尿、又は細胞組織、あるいは実験サンプルなどを挙げることができる。作用

本発明者は、本発明の ALT活性測定試薬において、試薬ブランク反応が抑制される理由を、以下の作用によるものと考えている。なお、本発明は、以下の推論に限定されるものではない。

本発明の A L T活性測定試薬に含まれる L Dは、主たる酵素活性である乳酸に対する脱水素酵素活性に加え、 2—ォキソグルタル酸を還元する活性、すなわち、 2—ヒドロキシダルタル酸脱水素酵素（HGD) 活性を有することが知られている [臨床化学， 1 8 (4) , 250— 262 (1 989) ] 。この反応を示せば、以下のとおりである。

HG D

2一ォキソグルタル酸 + N ADH > 2—ヒドロキシグルタル酸 + NAD 従来技術欄で先述したように、日本臨床化学会の公表した勧告法も含め、汎用されている A L T活性測定は、基質として 2—ォキソグルタル酸を用いているため、 LDが 2—ォキソグルタル酸に対する脱水素酵素活性（すなわち、 HGD活性）を有すると、 NADHを酸化し、試薬ブランクや試薬ブランク反応を大きくしてしまう。

また、 2—ォキソグルタル酸に対する脱水素酵素活性は、 p H変化により酵素活性が変化してしまい、得られる ALT活性測定値に誤差が発生する。例えば、測定試薬をセッ卜し、条件を設定するだけで自動的に測定する自動分析機と呼ばれている分析装置では、数週間に渡り蓋を開けたまま放置して測定することが多く、大気中の二酸化炭素を吸収し、 ALT活性測定試薬の p Hが変化し、試薬ブランク反応も変わり、得られる ALT活性測定値に誤差が発生する。

更に、 2—ォキソダルタル酸に対する脱水素酵素活性の存在は、 ALT活性測定でピルビン酸に対する LDの見かけの Km上昇をきたし、活性測定値への負の誤差を与えることが問題となっている。ここで起きる試薬ブランク反応は、 LD 自体が示す 2—ォキソダルタル酸を還元する反応、すなわち、 HGD活性であると考えられる。

本発明者が確認したところ、し0中に^160活性が存在し、 ALT活性測定試薬に添加されている L D量に依存して試薬ブランクも変化する。また、 HGD活性は、弱酸性から中性付近に至適 p Hを持っている。例えば、 LD量を増やせば、試薬ブランクも大きくなるほか、弱アル力リ性条件下で A L T活性を測定する場合、試薬容器開封保存後の試薬 p H低下によリ試薬ブランクが大きくなつてしまし、、正確な ALT活性測定値を得ることができない。

試薬ブランクを小さくするには、 L D量を少なくすることが考えられるが、 L D量が少なすぎると、 ALT活性測定を測定するための必要な LD量が不足し、定量性が得られなくなってしまう。また、試薬容器開封保存後の試薬 pH低下による試薬ブランク上昇は、 ALT活性測定時の p Hをアル力リ性に移動することにより、試薬ブランクを回避できるが、 ALT活性の至適 p Hは弱アルカリ性であるので、適当な方法とは言えない。

従来、 HGD活性の阻害剤は全く知られておらず、このような状況下、本発明者は、公知の A LT活性測定試薬に LD阻害剤を添加することにより、 LD自体が示す HGD活性を阻害し、その結果、定量性が損なわれることなく、試薬ブランクを小さくし、試薬容器開封保存後の試薬 p H低下による試薬ブランク上昇の回避や、ピルビン酸に対する L Dの見かけの Km上昇による Aし T活性測定値への負の誤差を低減することができたものと考えている。実施例以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

調製実施例 1

本発明の ALT活性測定試薬として、表 1に示す組成からなる第一試薬と、表 2に示す組成からなる第二試薬とからなる 2試薬系試薬を調製した。

また、比較用の従来公知の ALT活性測定試薬として、第一試薬中にォキサミン酸を含まないこと以外は、前記第一試薬と前記第二試薬と同じ組成からなる 2 試薬系試薬を調製した。

以下、比較用の前記 2試薬系試薬を「試薬 A」と称し、本発明の前記 2試薬系試薬を「試薬 B」と称する。調製した試薬 A及び試薬 Bは、以下の評価例で使用するまで、それぞれ、密封可能な容器に入れ、密封状態で保存した。含有成分

2 Omm o I / L T r i s一塩酸（p H 9. 20)

200 mm o I Z L Lーァラニン

◦ . 5 mm o I Z L ォキサミン酸

0. 095% アジ化ナトリウム

0. 25 mm o I ZL N A D H

3 KU/L LD (組換型 LD；オリエンタル酵母工業株式会社製）表 2

含有成分

360mmo l /L T r i s_塩酸（p H4. 50)

1 08 Ommo I /L L—ァラニン

63mmo l ZL 2—ォキソグルタル酸

0. _01 % 一 EDTA2N a 評価例 1 ：本発明の A L T活性測定試薬の評価

(1 ) 試薬ブランクの測定前記調製実施例 1で調製した比較用の試薬 Aの第一試薬 6 Om L及び第二試薬 2 OmL、並びに本発明の試薬 Bの第一試薬 6 OmL及ぴ第二試薬 2 Omしを、それぞれ、自動分析装置（フ 1 7 OS ；株式会社日立製作所製）用の試薬容器に充填し、これらの試薬容器を自動分析装置にセットし、 5週間放置した。評価中の自動分析装置は、試薬容器がセッ卜されている部分には冷却装置が付いており、約 1 0°Cに保たれている。また、試薬容器の蓋は開けた状態のままにした。

放置直後、 1週間経過後、 2週間経過後、 3週間経過後、 4週間経過後、及び 5週間経過後に、それぞれ、以下の手順に従って、試薬 A及び試薬 Bの試薬ブランクを測定した。

より具体的には、自動分析装置の反応セルに、検体として生理食塩水 7. 5 μ Lを加えたところに、第一試薬 1 50 Lを加えて撹拌し、 37 °Cで 5分間加温した後、第二試薬 50 jU Lを加えて撹拌し、更に 37°Cで 5分間加温した。第二試薬を添加してから約 1分経過後から 5分経過後まで（すなわち、 4分間）の波長 340 nmにおける吸光度変化量を測定し、 1分間当たりの吸光度変化量を算出し、ブランク感度とした。結果を図 1に示す。

図 1に示すように、蓋を開けた状態で放置しておくと、比較用の試薬 Aでは、試薬ブランクが経時的に上昇していくのに対して、本発明の試薬 Bでは、試薬ブランクがほとんど変化しなかった。

(2) プール血清における A LT活性の測定

前記評価例 1 ( 1 ) と同様に、前記調製実施例 1で調製した試薬 A及び試薬 B を 5週間放置した。放置直後、 1週間経過後、 2週間経過後、 3週間経過後、 4 週間経過後、及び 5週間経過後に、それぞれ、以下の手順に従って、検体（ブール血清）中の A LT活性を測定した。

すなわち、プール血清又は生理食塩水（試薬ブランク） 7. 5 jU Lに第一試薬 ^ 50U Lを加えて撹拌し、 37 °Cで 5分間加温した後、第二試薬 50 Lを加えて撹拌し、更に 37°Cで 5分間加温した。第二試薬を添加してから約 1分経過後から 5分経過後まで（すなわち、 4分間）の波長 340 nmにおける吸光度変化量を測定し、 1分間当たりの吸光度変化量を算出した。 AT L活性は、プール血清の代わりに、酵素キヤリブレーター（国際試薬株式会社製）を用いて得られた測定結果に基づいて、換算した。

結果を図 2に示す。図 2に示すように、プール血清の測定値に関しても、蓋を開けた状態で放置しておくと、比較用の試薬 Aでは、 ALT活性測定値が経時的に上昇していくのに対して、本発明の試薬 Bでは、 ALT活性測定値の変動がほとんど見られなかった。

評価例 2 ：本発明の A L T活性測定試薬における L Dの安定性に関する評価本評価例では、前記調製実施例 1で調製した比較用の試薬 Aの第一試薬 6 Om L及び本発明の試薬 Bの第一試薬 6 OmLを、それぞれ、 70mL容の蓋付きポリエチレン製瓶に密封し、 25°C又は 37°Cにて 3週間保管し、各第一試薬中に含まれる L D活性の残存率の経時変化を調べた。

具体的には、保存直後、並びに保管開始から 1週間経過後、 2週間経過後、及び 3週間経過後に、それぞれ、各試薬を採取し、測定時に各試薬を 0. 1 %ゥシ血清アルブミン含有 5 Omm o I Lリン酸緩衝液（p H7. 50) にて 1 Z1 0濃度に希釈したものを検体とし、以下の手順に従って、自動分析装置（7 1 7 OS ；株式会社日立製作所製）を用いて実施した。

検体 7. に、 LD活性測定試薬 1 [50mmo I /Lリン酸緩衝液（p

H 7. 50) 及び 0. 25mmo I /L-NADH] 1 50jU Lを加え、 37 °C で 5分間加温した後、 LD活性測定試薬 2 [5 Ommo I Z Lリン酸緩衝液（p H 7. 50) 及び 1 2mmo I ZLピルビン酸リチウム塩] 30j« Lを加えて撹袢し、更に 37 °Cで 5分間加温した。 LD活性測定試薬 2を添加してから約 1分経過後から 2分経過後までの波長 340 n mにおける 1分間当たりの吸光度変化量を測定した。保存初日の吸光度変化量を 1 00%として LD活性の残存率を算出した。

結果を図 3に示す。図 3において、各記号「1W」、「2WJ 、及び「3W」は、それぞれ、保管開始から 1週間経過後、 2週間経過後、及び 3週間経過後の結果であることを意味する。

図 3に示すように、 37 °C及び 25 °Cのいずれの条件下においても、本発明の試薬 Bの方が、比較用の試薬 Aと比べて、 LD活性の残存率が高かった。産業上の利用可能性

本発明の ALT活性測定試薬によれば、試薬ブランク反応の上昇、すなわち、初期吸光度の上昇を抑制することができるので、正確な A LT活性測定値を得ることができる。また、 LDの安定化効果を有する。以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims

請求の範囲

1 . Lーァラニン、 2—ォキソダルタル酸、乳酸脱水素酵素、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含むァラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬において、

乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質を、更に含むことを特徴とする、前記ァラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬。

2. 2試薬からなり、第一試薬又は第二試薬のいずれか一方、あるいは、両方に、乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質を含有する、請求項 1に記載のァラニンアミノ卜ランスフ Iラーゼ活性測定試薬。

3 . 同一試薬中に、乳酸脱水素酵素と乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質とを含有する、請求項 2に記載のァラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬。

4. 少なくとも乳酸脱水素酵素を第一試薬として、少なくとも 2—ォキソグルタル酸を第二試薬として含有する 2試薬系である、請求項 1に記載のァラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬。

5. 乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質が、ォキサミン酸又はその塩である、請求項 1〜4のいずれか一項に記載のァラニンアミノトランスフエラーゼ活性測定試薬。

6. ァラニンアミノトランスフヱラーゼを含有する可能性のある被検試料と、 L ーァラニン、 2—ォキソグルタル酸、乳酸脱水素酵素、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、及び乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質とを接触させることを特徴とする、ァラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定方法。

7 . ァラニンアミノトランスフェラーゼを含有する可能性のある被検試料と、 L ーァラニン、 2—ォキソグルタル酸、乳酸脱水素酵素、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、及び乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質とを接触させ、前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの減少量又は生成する酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの増加量を測定する、請求項 6に記載のァラニンアミノトランスフエラーゼ活性の測定方法。

8. 乳酸脱水素酵素活性に対する阻害作用を有する物質が、ォキサミン酸又はその塩である、請求項 6又は 7に記載のァラニンアミノトランスフェラ一ゼ活性の測定方法。

9. ォキサミン酸又はその塩の濃度が、測定系における終濃度として、 0. 00 5~5mmo I ZLである、請求項 8に記載のァラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定方法。

10. 乳酸脱水素酵素の濃度が、測定系における終濃度として、 100UZL以上である、請求項 6又は 7に記載のァラニンアミノトランスフ: nラーゼ活性の測定方法。