WO2003070268A1 - Remede contre les infections - Google Patents

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WO2003070268A1
WO2003070268A1 PCT/JP2003/001970 JP0301970W WO03070268A1 WO 2003070268 A1 WO2003070268 A1 WO 2003070268A1 JP 0301970 W JP0301970 W JP 0301970W WO 03070268 A1 WO03070268 A1 WO 03070268A1
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granulysin
gene
therapeutic agent
active ingredient
expression vector
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Masaji Okada
Yasushi Takamori
Kazuyuki Ogawa
Kinya Nagata
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National Hospital Organization
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for infectious diseases for treating infectious diseases such as tuberculosis.
  • antibacterial agents which are mainly provided as therapeutic agents for infectious diseases, are accompanied by the inevitable problem of emergence of resistant bacteria.
  • the ironic state of providing new antimicrobial agents and creating new resistant bacteria has continued.
  • tuberculosis which has the highest mortality rate among single infectious diseases, has recently become a global problem with an increasing trend.
  • the existence of resistant bacteria that have resistance to most antibiotics has been confirmed, and this problem is becoming apparent.
  • a molecule called nahiulysin which is expressed in NK cells and CTLs, has a direct killing ability against bacteria such as Mycobacterium tuberculosis [Stenger, S. et al. , Science 282, 121-125 (1998)].
  • glaeulysin After being produced as a 15K precursor, glaeulysin is processed to 9K in cytotoxic granules, and it is known that 9K muddyiyulysin has antibacterial activity (Pena, SV et al., J. Immunol, 158, 2680-2688 (1997)) 0
  • 9K muddyiyulysin has antibacterial activity
  • the same cytotoxic intragranular molecule, perforin punctures the target cell, and daranii ulysin enters the cell from here.
  • a route for killing infected bacteria in cells has been reported [Stenger, S. et al., Science 282, 121-125 (1998)].
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a means for examining in more detail daraunilysin and using it as a therapeutic agent for infectious diseases. Disclosure of the invention
  • the present inventor has conducted intensive studies in order to solve this problem. As a result, they found that a new pathway existed in which 15K dalaunilysin was taken up by macrophages, then activated, and killed the bacteria taken up in the macrophages.
  • the present invention is to provide a therapeutic agent for infectious diseases (hereinafter, also referred to as the present therapeutic agent) comprising 15K granulysin as an active ingredient.
  • the 15K nahiulysin is, as described above, a protein having a molecular weight of 15,000 (15k) and consisting of 144 amino acids, which is localized in cytotoxic granules. . It is partially cleaved in cytotoxic granules and exists as a protein with a molecular weight of 9,000 (9k) (Pena, SV, et al., J. Immunol., 158, 2680-2688 (1997), Stenger, S., et al., Science, 282, 121-125 (1998)).
  • BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a drawing showing the results of examining the antibacterial effect of 15K dala-uraisin against Mycobacterium tuberculosis. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • 15K dalaunilysin used as the active ingredient of this therapeutic agent can be used separately from living organisms, but it is obtained by expressing the gene encoding 15K granulysin because it is a minor component of living organisms. It is preferable to use it as a recombinant protein. Further, it is also a preferable means to produce 15K granulyulysin in the body by using an in vivo expression vector of 15K daraniilysin into which a gene encoding 15K ongiulysin is incorporated as an active ingredient. .
  • the gene sequence encoding 15K daraniilysin has already been reported (Jongstra, et al., J. Exp. Med, 165, 601), and specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 It is a 15K granulysin protein of the sequence gene and the corresponding amino acid sequence. Based on this, it is possible to efficiently prepare a gene encoding 15K daraniilysin and express this gene to prepare a recombinant protein of 15K granuliysin.
  • primers for amplifying nucleotide strands complementary to both ends of the gene sequence encoding 15K dalaunilysin were used to generate 15K dalaunilysin by PCR or other gene amplification methods.
  • the gene expression vector used here it is preferable to use a vector having a promoter, enhancer, and a transcription termination sequence in the upstream region of the gene to be usually expressed, and the downstream region.
  • the expression of the 15K dalaunilysin gene is not limited to the direct expression system, but includes, for example, the ⁇ -galactosidase gene, the daltathione-S-transferase gene, and the like.
  • a fusion protein expression system using the thioredoxin gene can also be used.
  • the gene expression vector include, for example, pQE, pGEX, pT7-7, pMAL, pTrxFus, pET, pNT26CII, etc. when the host is Escherichia coli. be able to. Also, host the assumption that the B.
  • subtilis subtilis, p PL 608, p NC 3 , p SM23, p KH 80 and the like can be exemplified c Further, as for a host of a yeast, pGT 5, p DB 248 X, pART1, pREP1, YE13, YRp7, YCp50 and the like.
  • p91023, pCDM8, pcDL-SRa296, pBCMGSNeo, pSV2dhfr, pSvdhfr, pAc373, pAc YM1, pRc / CMV, pREP4, pcDNAI and the like can be exemplified.
  • These gene expression vectors can be selected depending on the purpose of expressing the 15K dalaunilysin. For example, when expressing 15K khaiulysin, it is preferable to select a gene expression vector that can select Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, or the like as a host. When expressing 5K daranii lysin, it is preferable to select a gene expression vector that can select a mammalian cell or an insect cell as a host.
  • the above-described gene expression vector incorporating the 15K nahulisin gene into a host cell and the transformation method using the same are commonly used.
  • the host cell is Escherichia coli or Bacillus subtilis
  • the calcium chloride method or the like can be used.
  • the method can be performed by a calcium phosphate method, an electoral poration method, a ribosome method, or the like.
  • the desired 15K daraniilysin is accumulated.
  • the medium used for such culture can be appropriately selected depending on the properties of the host.
  • an LB medium or a TB medium can be appropriately used, and when the host is a mammalian cell, an RPMI164 medium or the like can be appropriately used.
  • Isolation and purification of 15K dala-lysin from the culture obtained by this culture can be carried out according to a conventional method. Alternatively, it can be performed using various processing operations utilizing chemical properties.
  • treatment with a protein precipitant ultrafiltration, gel filtration, high-performance liquid chromatography, centrifugation, electrophoresis, affinity mouth chromatography using specific antibodies, dialysis, etc., alone or by these methods can be used in combination.
  • 15K daraunilysin is used as an active ingredient in the treatment of infectious diseases, is taken up by macrophages in the blood, and is activated in it. By killing bacteria, viruses, fungi, and the like that cause the disease, it becomes possible to treat infectious diseases caused by these microorganisms.
  • 15K khaiulysin has no cytotoxicity per se and is expected to be effective as a therapeutic agent for infectious diseases with few side effects upon administration.
  • the active ingredient of this form of the therapeutic agent was used for expression of the above-mentioned recombinant protein
  • Examples of the in vivo expression vector include, but are not limited to, an adenovirus vector, a retrovirus vector, and the like.
  • a recombinant in vivo expression vector is prepared by incorporating a gene capable of expressing 15K granulyulysin into a cosmid vector incorporating the above-mentioned viral gene, and treating the cosmid vector with restriction enzymes.
  • the first form of the present therapeutic agent is the ability to mix 15K nahiulysin as an active ingredient. At the same time, it can be formulated into a pharmaceutical composition by mixing an appropriate pharmaceutical carrier. Of course, it is also possible to use only the 15 K dala niyu lysin).
  • Pharmaceutical carriers include, for example, fillers, extenders, binders, moisturizers, stabilizers, solubilizers, disintegrants, which can be appropriately used as pharmaceutical carriers according to the specific dosage form. Excipients and diluents such as surfactants can be freely selected.
  • the form of the pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it can use 15K dalaunilysin effectively for the treatment of infectious diseases.
  • examples include tablets, powders, granules, and pills. Even if it is a solid, it can be in the form of an injection, such as a liquid, suspension, or emulsion.
  • an appropriate carrier to 15 K granulysin, it is possible to obtain a dry product that should be liquid when used.
  • the dose of the therapeutic agent thus obtained can be appropriately selected according to the method of administration of the agent, the mode of administration, the symptoms of the patient, and the like, and is not particularly limited.
  • Such various forms of pharmaceutical preparations are administered by an appropriate route of administration depending on the form, for example, in the case of an injection form, intravenous, intramuscular, intraosseous, intraarticular, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal In the case of a solid form by internal administration or the like, it can be administered orally or enterally.
  • the administration form in this case is generally an injection form, and can be administered by intravenous, intramuscular, intraosseous, intraarticular, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal administration, or the like.
  • the dose of the present therapeutic agent can be appropriately selected depending on the administration method of the agent, the administration form, the patient's symptoms, etc., and is not particularly limited. In general, it is preferable to appropriately prepare an in vivo expression vector that expresses the active ingredient, 15K mikiulysin, and to administer this formulation in an appropriate amount, once or several times a day. .
  • RNA as ⁇
  • RT- PCR method PCR Plastic one more 1 : SEQ ID NO: 2, PCR primer 2: SEQ ID NO: 3
  • gene portion containing a region encoding the full length protein of 15K granulysin [: Tongstra, et al., J. Exp. Med, 165, 601 : A portion corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1]
  • the recombinant vector obtained was incorporated into MV or pcDL-SR ⁇ 296, dissolved in physiological saline, and immunized subcutaneously or intradermally in mice. 1-2 weeks apart, 4-
  • mice After 5 immunizations, spleen cells from mice whose antibody titer was found to increase by indirect fluorescent antibody method (performed in accordance with the method described below) were fused according to a standard method, and then specifically bound to granulysin. The antibody-producing Hypri 'doma was again searched by the indirect fluorescent antibody method. That is, cells transformed with the gene encoding 15K dalaunilysin described above and expressing the same (Cos 7) were fixed with 4% paraformaldehyde, and then fixed with 0.5% tween.
  • step 20 After solubilizing the membrane in step 20, adding the culture supernatant of Hydriloma and reacting with the antibody, reacting with a fluorescently labeled anti-mouse IgG antibody, and detecting the fluorescence, -Screened for hybridomas that produce antibodies that specifically bind to ulysin. As a result, 9 dala Hybridomas producing antibodies that specifically bind to eulysin were obtained. Using the culture supernatant of each of the obtained hybridomas, purification was performed using an ammonium sulfate precipitation protein G column to prepare two types of monoclonal antibodies against 15K granulysin.
  • nucleotide sequence of the nucleotide sequence encoding the portion corresponding to the 15K dura-lysin protein in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was incorporated into pFLAG-CMV vector (Sigma) by a conventional method. Genetic recombination vectors were created. As a control, the above-mentioned p FLAG-C
  • the MV vector was used. These recombinant vectors were introduced into C os 7 cells, this, in DMEM medium (Gipuko Inc.), 5% C0 2 ⁇ 37 . C. Culture was performed for 72 hours. After the culture is completed, the culture is centrifuged (2500 rpm.
  • Proteins were separated from each culture supernatant by SDS-PAGE. Transfer the protein from the SDS-PAGE gel subjected to electrophoresis to a nylon membrane, and then use the blocking solution.
  • the band was developed by binding a specific monoclonal antibody RF10 to raniulysin and reacting it with an enzyme-labeled anti-mouse antibody and a chromogenic substrate.
  • a band having a molecular weight of 15K appeared, but this band was not observed in the control.
  • a similar test was performed using a polyclonal antibody N5-1 that binds to 15K and 9K daranii lysin, a band indicating 15K was observed, but 9K was observed. Was not observed.
  • Lymphocytes isolated from human blood are transferred to a plastic culture plate (24-well Z-plate) in a culture medium (RPM 11 640, 10% human serum) in a standard method at 2 x 10 Suspension was carried out to about 7 cells, and this was dispensed into each well by lml, and left at 37 ° C for 24 hours to attach lymphocytes to the plate wall. The antibacterial effect of 15K granulysin on macrophages was examined.
  • the R PM I 1 640 (1 0 % human serum) in Ueru, and lml ⁇ Ka ⁇ , in here, Mycobacterium tuberculosis (H 37 RV, 1 X 1 0 5 ⁇ 1 X 10 6 cfu ) and, 37 ° C, 5% C_ ⁇ 2 under, 4 to 1 2 hours, and subjected to stationary culture, macrophages were infected with Mycobacterium tuberculosis. After the infection was completed, the Grn supernatant or the Cont supernatant was added to each ml and the wells, and the cells were allowed to stand and cultured under the same conditions for 2 to 12 hours.
  • Fig. 1 shows the results.
  • Cont represents a control culture supernatant
  • Grn represents a dalaunilysin culture supernatant.
  • the vertical axis indicates the number of colonies.
  • Horizontal axis 1 shows the result of contacting the macrophages, Mycobacterium tuberculosis, and the culture supernatant as described above.
  • an effective therapeutic agent for infectious diseases which has no side effect and contains 15K nigiulysin as an active ingredient.

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Description

感染症治療剤 技術分野
本発明は、 結核等の感染症を治療するための感染症治療剤に関する発明である。 背景技術
医療において、 感染症治療剤の存在が不可欠であることは言うまでもないこと である。 現在、 数多くの抗生物質や合成抗菌剤等の感染症治療剤が提供されてお り、 医療現場において用いられている。
しかしながら、 現在、 感染症治療剤として、 主に提供されている抗菌剤には、 耐性菌の出現という、 不可避の問題が伴っていることも事実である。 つまり、 新 たな抗菌剤が提供されることにより、 新たな耐性菌が生み出されている、 という 皮肉な状態が続いている。
例えば、 単一感染症において、 死亡率第 1位を占めている結核は、 最近の増加 傾向が、 世界的な問題となっている。 さらに、 殆どの抗生物質に対して耐性を有 する耐性菌の存在も確認されており、 この問題も顕在化しつつある。
最近になって、 ダラ二ユライシンと呼ばれる、 N K細胞や C T Lに発現してい る分子が、 結核菌等の細菌に対する、 直接の殺傷能力を有することが明らかとな つている 〔Stenger， S. et al. , Science 282， 121- 125 (1998)〕 。
グラエユライシンは、 1 5 Kの前駆体として造られた後、 細胞傷害性顆粒内で、 9 Kにプロセシングされ、 この 9 Kダラ二ユライシンが、 抗菌活性を有すること が知られている (Pena, S. V. et al. , J. Immunol, 158, 2680-2688 (1997) ) 0 さらに、 同じ細胞傷害性顆粒内分子であるパーフォリンが、 標的細胞に穴を空け、 ダラ二 ユライシンが、 ここから細胞内に入り込み、 細胞内において感染している細菌を 殺傷する経路が報告されている 〔Stenger, S. et al.， Science 282, 121-125 (1998)〕 。
このように、 ダラ-ユライシンは、 感染防御に重要な役割を果たしていると考 えられる。 活性型の 9 Kダラ二ユライシンは、 それに対する細菌の耐性の獲得も 考え難く、 抗生物質とは異なる特徴を有する感染症治療薬への応用が考えられる。 また、 最近になって、 9 Κダラ二ユライシンによる細胞内感染菌の除去に関する パーフォリン経路の存在が疑問視されている（David, H. C. et al. , J. Immunol, 167， 2734 - 2742 (2001) )。 その上、 この分子には、 細胞傷害性が認められており （ Pena, S. V. et al. , J. Immunol, 158, 2680-2688 (1997) ) N これをそのまま投与した場 合には、 相当の副作用が懸念される。
本発明が解決すべき課題は、 ダラ二ユライシンについて、 さらに詳細に検討を 行い、 これを感染症治療剤として用いる手段を提供することにある。 発明の開示
本発明者は、 この課題を解決するために、 鋭意検討を行った。 その結果、 1 5 Kダラ二ユライシンが、 マクロファージに取り込まれ、 その後、 活性化し、 マク 口ファージ内に取り込まれた細菌を殺傷する、 新たな経路が存在することを見出 した。
すなわち、 それ自体、 細胞傷害性を示さない 1 5 Kダラ二ユライシンを有効成 分とすることにより、 副作用が少なく、 かつ、 細菌が耐性獲得をし難く、 有効な 感染症治療剤を提供し得ることを見出した。
本発明は、 1 5 Kグラニユライシンを有効成分とする、 感染症治療剤 （以下、 本治療剤ともいう） を提供する発明である。
なお、 本発明において、 1 5 Kダラ二ユライシンとは、 上述したように、 細胞 傷害性顆粒に局在する、 1 4 5アミノ酸からなる、 分子量 1万 5千（15k) のタン パク質である。 細胞傷害性顆粒内では一部切断されて、 分子量 9千 (9k)のタンパ ク質として存在している（Pena, S. V.， et al. , J. Immunol. , 158， 2680-2688 (1997) , Stenger, S. , et al. , Science, 282, 121 - 125 (1998) )。 図面の簡単な説明
第 1図は、 1 5 Kダラ-ユライシンの、 結核菌に対する抗菌効果を検討した結 果を示す図面である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について説明する。
A . 本治療剤の有効成分
本治療剤の有効成分として用いる 1 5 Kダラ二ユライシンは、 生体から分離し て用いることも可能であるが、 生体微量成分である故、 1 5 Kグラニユライシン をコードする遺伝子を発現させて得られる、 組換え蛋白質として用いることが好 適である。 また、 1 5 Kダラ二ユライシンをコードする遺伝子が組み込まれた、 1 5 Kダラ二ユライシンの体内発現ベクターを有効成分として、 体内で 1 5 Kグ ラニユライシンを産生させることも、 好適な手段である。
① 1 5 Kダラ二ユライシンの組換え蛋白質
1 5 Kダラ二ユライシンをコードする遺伝子配列は、 既に報告されており （ Jongstra, et al.， J. Exp. Med, 165， 601) 、 具体的には、 配列番号 1で表される塩 基配列の遺伝子およびこれに対応するァミノ酸配列の 1 5 Kグラニユライシン蛋 白質である。 これを基に、 1 5 Kダラ二ユライシンをコードする遺伝子を効率的 に調製して、 この遺伝子を発現させることにより、 1 5 Kグラニユライシンの組 換え蛋白質を調製することが可能である。
具体的には、 1 5 Kダラ二ユライシンをコードする遺伝子配列の両端に対して 相補的なヌクレオチド鎖を増幅用プライマーして、 P C R法等の遺伝子増幅法に より、 1 5 Kダラ二ユライシンをコードする遺伝子の遺伝子増幅産物を調製して する。
これを、 適切な遺伝子発現用ベクターに組み込み、 かかる組換えベクターで形 質転換を行った大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞などの適切な宿主から、 所望す る 1 5 Kダラ二ユライシンを得ることができる。
ここで用いる遺伝子発現用ベクターは、 通常発現しょうとする遺伝子の上流域 にプロモーター， ェンハンサー， およぴ下流域に転写終了配列などを保有するも のを用いるのが好適である。
また、 1 5 Kダラ二ユライシン遺伝子の発現は、 直接発現系に限らず、 例えば β —ガラクトシダーゼ遺伝子， ダルタチオン一 S—トランスフェラーゼ遺伝子や チォレドキシン遺伝子を利用した融合タンパク質発現系とすることもできる。 遺伝子発現用ベクターとしては、 例えば、 宿主を大腸菌とするものとしては、 p QE, p GEX, p T 7 - 7, pMAL, p T r x Fu s , p ET, p NT 2 6 CIIなどを例示することができる。 また、 宿主を枯草菌とするものとしては、 p P L 608, p NC 3, p SM23 , p KH 80などを例示することができる c また、 宿主を酵母とするものとしては、 pGT 5， p DB 248 X, p ART 1， pREP l, YE 1 3, YR p 7, Y C p 50などを例示することができ る。
また、 宿主を哺乳動物細胞または昆虫細胞とするものとしては、 p 9 1 023， p CDM8 , p cDL-SRa 296, p BCMGSNe o, p SV2 d h f r, p SVd h f r , p A c 373 , p A c YM 1 , p R c/CMV, p RE P 4, p c DNA Iなどを例示することができる。
これらの遺伝子発現ベクターは、 1 5 Kダラ二ユライシンを発現させる目的に 応じて選択することができる。 例えば、 1 5Kダラ二ユライシンを発現させる場 合には、 宿主として大腸菌， 枯草菌または酵母などを選択し得る遺伝子発現べク ターを選択するのが好ましく、 少量でも確実に活性を有するように 1 5Kダラ二 ユライシンを発現させる場合には、 哺乳動物細胞や昆虫細胞を宿主として選択し 得る遺伝子発現ベクターを選択するのが好ましい。
また、 上記のように既存の遺伝子発現ベクターを選択することも可能であるが、 目的に応じて適宜遺伝子発現ベクターを作出して、 これを用いることも勿論可能 である。
1 5 Kダラニュライシン遺伝子を組み込んだ上記遺伝子発現用ベクターの宿主 細胞への導入およびこれによる形質転換法は、 一般的な方法、 例えば宿主細胞が 大腸菌や枯草菌である場合には、 塩化カルシウム法やエレクトロポレーシヨン法 などを；宿主が哺乳動物細胞や昆虫細胞の場合はリン酸カルシウム法， エレク ト 口ポレーション法またはリボソーム法などの手段により行うことができる。
このようにして得られる形質転換体を常法に従レ、培養することにより、 所望す る 1 5 Kダラ二ユライシンが蓄積される。
かかる培養に用いられる培地は、 宿主の性質に応じて適宜選択することができ るが、 例えば宿主が大腸菌である場合には、 L B培地や T B培地などが、 宿主が 哺乳動物細胞の場合には、 R P M I 1 6 4 0培地などを適宜用いることができる。 この培養により得られる培養物からの 1 5 Kダラ-ユライシンの単離おょぴ精 製は、 常法に従い行うことが可能であり、 例えば培養物を、 1 5 Kダラニュライ シンの物理的およびノまたは化学的性質を利用した各種の処理操作を用いて行う ことが可能である。
具体的には、 タンパク沈澱剤による処理， 限外濾過， ゲル濾過， 高速液体クロ マトグラフィー， 遠心分離， 電気泳動， 特異抗体を用いたァフイエテイク口マト グラフィー， 透析法などを単独でまたはこれらの方法を組み合わせて用いること ができる。
以上のようにして、 1 5 Kダラ二ユライシンを単離 ·精製することが可能であ る。
1 5 Kダラ二ユライシンは、 これを、 感染症治療剤の有効成分として使用する ことにより、 血液中のマクロファージに取り込まれて、 その中で活性化されるこ とにより、 マクロファージが貪食した、 感染症を惹き起こす細菌類、 ウィルス類、 真菌類等を殺傷することにより、 これらの微生物による感染症を治療することが 可能となる。 前述したように、 1 5 Kダラ二ユライシンは、 9 Kグラニユライシ ンと異なり、 それ自体に細胞傷害性は認められず、 投与による副作用が少ない感 染症治療剤として、 その効果が期待される。
② 1 5 Kグラニユライシンの体内発現ベクター
この形態の本治療剤の有効成分は、 上記の組換え蛋白質の発現に用いられた、
1 5 Kグラニユライシンをコードする遺伝子を、 体内発現ベクターに組み込んだ、 組換えベクターである。
体内発現ベクターとしては、 例えば、 アデノウイルスベクター、 レトロウィル スベクター等を挙げることができるが、 これらに限定されるものではない。
組換え体内発現ベクターは、 例えば、 上記のウィルス遺伝子を組み込んだコス ミ ドベクターに、 さらに、 1 5 Kグラン二ユライシンを発現可能な遺伝子を組み 込んで、 このコスミ ドベクターと、 制限酵素処理を行った親ウィルス D N A— T
Pを、 2 9 3細胞にトランスフエクシヨンすることにより、 この 2 9 3細胞内で 相同組換えが起こり、 所望する体内発現ベクターが生産される。
B . 本治療剤の形態
① 1 5 Kグラニユライシンの組換え蛋白質を有効成分とした本治療剤
本治療剤の第 1の形態は、 1 5 Kダラ二ユライシンを有効成分として配合する 力 これと共に、 適切な医薬製剤担体を配合して、 製剤組成物の形態に調製する ことが可能である （1 5 Kダラ二ユライシンのみでも勿論可能である） 。 医薬製 剤担体としては、 例えば、 具体的な剤型に応じて、 適宜医薬製剤担体として慣用 され得る、 充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 安定剤、 溶解補助剤、 崩壌剤、 表 面活性剤などの賦形剤や希釈剤を自由に選択することができる。 製剤組成物の形 態は、 1 5 Kダラ二ユライシンを、 感染症の治療用途に効果に用い得る形態であ れば特に限定されず、 例えば、 錠剤、 粉末剤、 顆粒剤、 丸剤などの固剤であって も、 液剤、 懸濁剤、 乳剤などの注射剤形態とすることもできる。 また、 1 5 Kグ ラニユライシンに適切な担体を添加することによって、 用時に液状とするべき乾 燥品とすることも可能である。
このようにして得られる本治療剤の投与量は、 剤の投与方法、 投与形態、 患者 の症状などに応じて適宜選択することが可能であり、 特に限定されるべきもので はない。
このような各種の形態の医薬製剤は、 その形態に応じて適当な投与経路、 例え ば、 注射剤形態の場合には、 静脈内、 筋肉内、 骨内、 関節内、 皮下、 皮内、 腹腔 内投与などにより、 固剤形態の場合には、 経口や経腸投与などにより投与され得 る。
② 1 5 Kダラ二ユライシンの体内発現ベクターを有効成分とした本治療剤 上述のようにして調製され得る体内発現ベクターを、 単離 ·精製して、 これを 生体に投与することにより、 生体内に 1 5 Kダラ二ユライシンが産生され、 この 1 5 Kダラ-ユライシンの薬理効果が発揮され得る。
この場合の投与形態は、 注射剤形態であることが一般的であり、 静脈内、 筋肉 内、 骨内、 関節内、 皮下、 皮内、 腹腔内投与などにより、 投与され得る。
このような本治療剤の投与量は、 剤の投与方法、 投与形態、 患者の症状などに 応じて適宜選択することが可能であり、 特に限定されるべきものではないが.、 一 般には、 有効成分である、 1 5Kダラ二ユライシンを発現する体内発現ベクター を適度に調製して、 この製剤を、 適量、 一日 1回または数回に分けて投与するの が好適である。 実施例
以下に、 本発明の実施例を記載する。
〔試験例〕 15 Kダラ二ユライシンとマクロファージを共存させた場合の、 結 核菌に対する抗菌効果についての検討
(1) 1 5 Kダラ二ユライシンに対して特異的なモノクローナル抗体の調製 1 00〜 200 unit/ml の I L _ 2の存在下で培養したヒ トの末梢血リンパ球
(2 X 106細胞 Zmlのヒ ト末梢血リンパ球を、 1 0 %牛胎児血清含有 R PM I
1640培地で、 37°C · 5 %C02下で 1 0日間培養を行った） より、 常法に 従って RNAを抽出し、 この RNAを錶型として、 RT— PCR法 （PCRプラ イマ一 1 ：配列番号 2、 PCRプライマー 2 ：配列番号 3) を行い、 1 5 Kグラ 二ユライシンの蛋白質全長をコードする領域を含む遺伝子部分 〔： Tongstra, et al., J. Exp. Med, 165， 601：配列番号 1のァミノ酸配列に相当する部分〕 を相補的
DNA (cDNA) の増幅産物として合成した。 この 1 5 Kグラュユライシンの 蛋白質全長をコードする c DNAを、 哺乳動物用発現ベクターである p R c/C
MVまたは p cDL-SR« 296に組み込み、 得られた組換えベクターを生理 食塩水に溶かして、 マウスの皮下または皮内に免疫した。 1〜2週間隔で、 4〜
5回免疫後、 間接蛍光抗体法 （後述の方法に準じて行った） により抗体価の上昇 が認められたマウスの脾細胞を、 常法に従って細胞融合した後、 グラニユライシ ンに特異的に結合する抗体を産生するハイプリ'ドーマを、 再び間接蛍光抗体法で 検索した。 すなわち、 上述した 1 5Kダラ二ユライシンをコードする遺伝子で形 質転換して、 これを発現させた細胞 （C o s 7) を、 4%パラフオルムアルデヒ ドで固定後、 0. 5% t we e n 20で膜を可溶化し、 これに、 ハイプリ ドーマ の培養上清を加えて、 抗体を反応させた後、 蛍光ラベルされた抗マウス I gG抗 体を反応させ、 蛍光を検出することにより、 ダラ-ユライシンに特異的に結合す る抗体を産生するハイプリ ドーマをスクリーニングした。 その結果、 9個のダラ ェユライシンに特異的に結合する抗体を産生するハイプリ ドーマが得られた。 得 られたハイプリ ドーマのそれぞれの培養上清を用いて、 硫安沈澱おょぴプロティ ン Gカラムによる精製を行い、 1 5Kグラニユライシンに対するモノクローナル 抗体を、 2種類調製した。 以下、 これをモノクローナル抗体 RF 10 (1 5Kグ ラニユライシンに対して結合するが、 9 Kダラニュライシンに対しては結合しな い） と、 モノクローナル抗体 RC 8 (1 5 Kダラ二ユライシンに対しても、 9K ダラ二ユライシンに対しても結合する） ともいう。
(2) 1 5 Kダラ-ユライシンに対するポリクローナル抗体の調製
ダラ二ユライシンの部分アミノ酸配列 （29アミノ酸） （J. Exp. Med.
165:601 - 614 (1987), J. Exp. Med. , 172:1159—1163 (1990) ) ： Arg Thr Gly Arg Ser Arg Trp Arg Asp Val Cys Arg Asn Phe Met Arg Arg Tyr Gin Ser Arg Val Thr Gin Gly Leu Val Ala Gly (N 5— 1 ：配列番号 4) の傘貝へモシァニンと の結合体で、 ゥサギを常法に従って免疫し、 抗血清を得た。 得られだ抗血清につ いて、 硫安沈澱およびプロテイン Gカラムによる精製を行い、 さらに上記の合成 ペプチド （N5— 1) を結合したカラムによるァフイエティークロマトグラフィ 一による精製を行い、 ダラ二ユライシンに対するポリクローナル抗体 （抗 N5— 1抗体） を調製した。
(3) ダラ二ユライシン含有培養上清の調製
配列番号 1の塩基配列のうち、 1 5 Kダラ-ユライシン蛋白質に相当する部分 をコードする塩基配列のヌクレオチド鎖を、 常法により、 p F LAG— CMVベ クタ一 （シグマ社製） に組み込んだ、 遺伝子組換えベクターを作出した。 なお、 コントロールとして、 遺伝子による組換えを行っていない、 上記 p FLAG— C
MVベクターを用いた。 これらの遺伝子組換えベクターを、 C o s 7細胞に導入 し、 これを、 DMEM培地 （ギプコ社製） において、 5%C02 · 37。Cで培養 を、 72時間行った。 培養終了後、 培養物に、 遠心分離 （2500rpm . 20分
• 4°C) を施し、 その培養上清を得た。
各々の培養上清について、 SDS- PAGEにより、 蛋白質を分離した。 電気泳動を行 つた SDS- PAGEのゲルから、 蛋白質をナイロン膜に転写した後、 ブロッキング液
(1% スキムミルク/洗浄液） で膜をブロックした後、 この膜に対して、 1 5Kグ ラニユライシンに特異的なモノクローナル抗体 RF 1 0を結合させて、 これに対 して酵素標識抗マウス抗体と発色基質を作用させて、 バンドの発色を行った。 そ の結果、 1 5 Kダラ-ユライシン蛋白質をコードする遺伝子を発現させて得た上 清においては、 分子量 1 5 Kを示すパンドが現れたが、 コントロールは、 このパ ンドは認められなかった。 また、 同様の試験を、 1 5 Kと 9 Kのダラ二ユライシ ンに対して結合するポリクローナル抗体 N 5— 1を用いて行ったところ、 1 5 K を示すバンドは認められたが、 9 Kを示すバンドは認められなかった。
この結果により、 上記のダラ-ユライシン培養上清には、 1 5Kダラニュライ シンが特異的に存在し、 コントロール培養上清には、 ダラ二ユライシンは存在し ないことが明らかとなった。
(4) 抗菌効果の検討
常法により、 ヒ ト血液から分離したリンパ球を、 プラスチック製のカルチャー プレート （24ゥエル Zプレート） に、 培地 （RPM 1 1 640， 1 0%ヒト血 清） に、 培地 lml当り、 2 X 107細胞程度になるように、 懸濁させ、 これを、 各ゥエルに lmlずつ分注して、 37°Cで、 24時間放置して、 リンパ球をプレー ト壁に付着させて、 この付着したマクロファージにおいて、 1 5Kグラニュライ シンの抗菌効果を検討した。
次に、 ゥエル中に R PM I 1 640 (1 0%ヒ ト血清） を、 lml添カ卩して、 こ こに、 結核菌 （H 37 R V , 1 X 1 05〜 1 X 106 c f u) を、 37°C、 5 % C〇2下で、 4〜1 2時間、 静置培養を行って、 マクロファージに、 結核菌を感 染させた。 感染完了後、 G r n上清または C o n t上清を、 各 lml、 ゥエルに添 加して、 同条件で、 2〜 1 2時間静置培養を行つた。
培養終了後、 培養上清を除去して、 プレート内の付着細胞を、 PB Sで 3回洗 浄して、 トータル 5mlの 1 %サポニン水溶液で、 細胞内の結核菌を抽出して、 こ の抽出液を希釈し、 平板寒天培地 〔7H1 1培地 （ギブコ社製） 〕 に播いて、 3 7 °Cで 14日間静置培養し、 コロニー数を数えた。
その結果を、 第 1図に示す。
第 1図において、 C o n tは、 コントロール培養上清を表し、 G r nは、 ダラ 二ユライシン培養上清を表している。 縦軸は、 コロニー数を示している。 横軸の 1は、 上述したように、 マクロファージと結核菌と培養上清を接触させた結果を 示している。 2は、 マクロファージ非存在下で、 1と同様に、 各培養上清と結核 菌を静置培養、 洗浄後、 7 H 1 1平板寒天培地で静置培養し、 結核菌のプレート における非特異的吸着の影響を確認した結果を示している。 3は、 上記のカルチ ヤープレートにおいて、 各培養上清 l mlに、 結核菌と共に、 3 7 °Cで 2時間、 静 置培養し、 これを 7 H 1 1平板寒天培地で静置培養した結果を示している。 この結果、 1 5 Kダラ二ユライシンは、 マクロファージが介在することにより、 結核菌に対する抗菌効果が認められることが明らかとなった。 マクロファージが 介在しない場合、 1 5 Kダラ-ユライシンに結核菌に対する抗菌効果は認められ なかった。
上記の試験例によって、 1 5 Kダラ二ユライシンには、 抗菌作用が認められ、 感染症治療剤の有効成分として用いることができることが明らかとなった。
1 5 Kダラ二ユライシンを、 C o s 7細胞、 H e L a、 P C I 2等の細胞にト ランスフヱタトしたところ、 培養上清中に、 1 5 Kグラニユライシンが検出され るが、 細胞にダメージは見受けられなかった。 なお、 9 Kグラニユライシンを、 1 5 Kグラニユライシンに代えて用いると、 細胞傷害活性やアポトーシスを惹き 起こすことが報告されている (Pena, S. V. et al. , J. Immunol, 158, 2680- 2688 (1997) )。 産業上の利用可能性
本発明により、 1 5 Kダラ二ユライシンを有効成分とする、 副作用が認められ ず、 かつ、 有効な感染症治療剤が提供される。

Claims

請求の範囲
1. 1 5Kダラ二ユライシンを有効成分とする、 感染症治療剤。
2. 1 5Κダラ二ユライシンが組換え蛋白質である、 請求項 1記載の感染症治療 剤。
3. 1 5 Κグラニユライシンをコードする遺伝子が組み込まれた、 1 5Kダラ二 ュライシンの体内発現べクターを有効成分とする、 感染症治療剤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8288509B2 (en) * 2002-02-22 2012-10-16 National Hospital Organization Kinki-chuo Chest Medical center Therapeutic agent for infections, and treatment method using the same

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011046832A2 (en) 2009-10-12 2011-04-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Granulysin in immunotherapy
WO2014106235A1 (en) * 2012-12-31 2014-07-03 Development Center For Biotechnology Anti-granulysin antibodies and methods of use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999022755A1 (en) * 1997-11-04 1999-05-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Use of granulysin as an antimicrobial agent

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4994369A (en) * 1987-12-15 1991-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. Univ. T-cell activation related gene
US5616558A (en) * 1992-07-13 1997-04-01 Nisshin Flour Milling Co., Ltd. Medicaments comprising glicentin as active ingredient

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999022755A1 (en) * 1997-11-04 1999-05-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Use of granulysin as an antimicrobial agent

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MA LING LING ET AL.: "Anticryptococcal activity of mitogen stimulated primary human CD8+ T cells mediated by granulysin", FASEB JOURNAL, vol. 15, no. 5, 2001, pages A1009, 774.20, 1.9-10, 15-16, XP002968884 *
PENA SUSAN V. ET AL.: "Processing, subcellular localization and function of 519(granulysin), a human late T cell activation molecule with homology to small, lytic, granule proteins", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 158, no. 6, 1997, pages 26680 - 2688, XP002920631 *
See also references of EP1484066A4 *
STENGER STEFFEN: "An antimicrobial activity of cytolytic T cells mediated by granulysin", SCIENCE, vol. 282, 1998, pages 121 - 125, XP002920630 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8288509B2 (en) * 2002-02-22 2012-10-16 National Hospital Organization Kinki-chuo Chest Medical center Therapeutic agent for infections, and treatment method using the same

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