WO2003044044A1 - Nouveau peptide exerçant un effet inhibiteur d'angiotensine convertase - Google Patents

Nouveau peptide exerçant un effet inhibiteur d'angiotensine convertase Download PDF

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WO2003044044A1
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peptide
converting enzyme
pro
present
angiotensin converting
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Yoshitaka Tamura
Hiroshi Miyakawa
Akio Yamada
Hitoshi Saito
Yasushi Kawaguchi
Hiroshi Ochi
Tomoko Ide
Eri Inoue
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Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide and an angiotensin converting enzyme inhibitor containing the same peptide.
  • the angiotensin converting enzyme inhibitor can be used as food, feed, and medicine.
  • angiotensin converting enzyme It is an enzyme that acts on angiotensin I generated from sinogen and releases two C-terminal amino acids to convert it to angiotensin II.
  • the angiotensin converting enzyme not only generates angiotensin II having a strong pressurizing action but also has an action of inactivating bradykinin having a hypotensive action. Due to these effects, angiotensin converting enzyme inhibitors have been used as therapeutic agents for hypertension, and power putryl (Sankyo), Renibes (Wanyu Pharmaceutical) and others are known as over-the-counter drugs. I have.
  • Angiotensin converting enzyme inhibitors are also known to have a cardiac hypertrophy regression effect.
  • peptides having angiotensin converting enzyme inhibitory activity are present in natural products or in animal proteins such as casein and gelatin, plant proteins such as wheat, rice and corn, and enzymes such as fish proteins such as sardines. It has been found from degradation products.
  • peptides found in natural products include teprotide (nonapeptide,
  • the peptide described in JP-A-7-101982 (hereinafter referred to as “Reference Document 4”) has the highest angiotensin converting enzyme inhibitory activity and is relatively simple as tribeptide. It has a structure. Disclosure of the invention
  • angiotensin converting enzyme inhibiting peptides are known, but these peptides still have insufficient angiotensin converting enzyme inhibiting activity as a function in foods. Therefore, it is desired to obtain a peptide derived from a natural product, which has a higher angiotensin converting enzyme inhibitory activity and has a simple structure, and to apply the peptide to food or medicine.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, a novel enzyme having high angiotensin converting enzyme inhibitory activity in a hydrolyzate by hydrolyzing casein with a specific enzyme.
  • the present inventors found that a peptide was present, and that the peptide was a peptide having a sequence represented by Met-Lys-Pro, thereby completing the present invention.
  • the present invention relates to a peptide comprising Met-Lys-Pro (hereinafter, also referred to as "peptide of the present invention").
  • angiotensin converting enzyme inhibitor comprising a peptide consisting of Met-Lys-Pro as an active ingredient.
  • Met Lipentiol
  • Lys A hypotensive agent containing a peptide consisting of Pro as an active ingredient.
  • the peptide of the present invention has a sequence represented by Met-Lys-Pro. Further, the peptide of the present invention may be salts of this peptide.
  • Met is an L-methionine residue
  • Lys is an L-lysine residue
  • 1 "0 indicates a siproline residue.
  • the peptide of the present invention can be produced, for example, by hydrolyzing a protein such as casein with a suitable hydrolase.
  • a method of hydrolyzing a protein with a hydrolytic enzyme will be exemplified.
  • the procedure for hydrolyzing proteins with enzymes differs depending on the properties of the proteins. If the protein is soluble, disperse and dissolve the raw protein in water or hot water. If it is hardly soluble, mix the protein with hot water and homogenize with vigorous stirring.
  • the protein is not particularly limited as long as it contains a sequence represented by Met-Lys-Pro and produces the peptide of the present invention when digested with an appropriate hydrolase. Those derived from the like are optionally used. A particularly preferred protein is casein, which is available in large quantities.
  • the alkali agent or acid agent used in the method of the present invention may be any alkali agent or acid agent as long as it is acceptable for foods or pharmaceuticals.
  • examples of the alkaline agent include sodium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate and the like
  • examples of the acid agent include hydrochloric acid, citric acid, phosphoric acid, acetic acid and the like.
  • a predetermined amount of hydrolase is added to the protein solution, and the reaction is carried out at a temperature of about 10 to 85 ° C for 0.1 to 48 hours.
  • the hydrolase is not particularly limited as long as it can hydrolyze a protein to produce the peptide of the present invention, but is preferably an endopeptidase.
  • the endopeptidase include a protease derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus and a protease derived from an animal tent. These enzymes are commercially available.
  • Bacillus-derived proteases include bioprose s ⁇ -20 (manufactured by Nagase Seikagaku Corporation) and Protease N (manufactured by Amano Enzym), and the like.
  • preferred proteases include PTN 6. OS (manufactured by Novozyms Japan) and the like.
  • Bacillus-derived protease is preferably added at a ratio of 100 to 500 active units per lg of protein. Also, It is desirable to add the protease derived from animal monkey at a ratio of 300 to 800 active units per lg of protein.
  • the hydrolase used in the present invention may be one kind or two or more kinds. When two or more enzymes are used, each enzyme reaction may be performed simultaneously or separately. In the present invention, it is particularly preferable to use a mixture of bioprolase sp-20, protease N, and PTN6.0S.
  • the solution to which the enzyme has been added is kept at an appropriate temperature depending on the type of the enzyme, for example, at 30 to 60 ° C, preferably at 45 to 55 ° C, to initiate hydrolysis of the protein.
  • the hydrolysis reaction time is monitored while monitoring the degradation rate of the enzymatic reaction until the desired degradation rate is reached.
  • the decomposition rate is preferably from 20 to 30%.
  • the enzyme reaction is stopped by, for example, deactivating the enzyme in the hydrolyzed solution, and by performing a heat deactivation treatment by a conventional method. Can be implemented.
  • the heating temperature and the holding time of the heat inactivation treatment can be set as appropriate under conditions that allow sufficient inactivation in consideration of the thermal stability of the enzyme used.For example, a temperature of 80 to 13 Ot It can be performed with a retention time of 30 minutes to 2 seconds in the range.
  • the peptide of the present invention is preferably isolated and purified from the hydrolyzate. Purification of the peptide is usually performed using the same techniques as those used for oligopeptide purification, such as ion exchange chromatography, adsorption chromatography, reverse phase chromatography, partition chromatography, gel filtration chromatography, etc. It can be carried out by appropriately combining various methods such as liquid chromatography, solvent precipitation, salting out, and partitioning between two liquid phases.
  • Fractions containing the target substance can be determined using angiotensin converting enzyme inhibitory activity described later as an index, and the active components of those fractions can be identified by mass spectrometry.
  • the peptide of the present invention can also be produced by chemical synthesis.
  • the chemical synthesis of the peptide of the present invention can be carried out by a liquid phase method or a solid phase method usually used for the synthesis of oligopeptides.
  • the synthesized peptide is deprotected as necessary to remove unreacted reagents, by-products, and the like.
  • Such a peptide can be synthesized using a commercially available peptide synthesizer. Obtaining the desired peptide can be confirmed using the inhibitory effect of angiotensin converting enzyme as an index.
  • the peptide of the present invention can be used as an active ingredient of an angiotensin converting enzyme inhibitor.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The peptide of the present invention has an angiotensin converting enzyme inhibitory effect and a bradykinin inactivation suppressing effect, and has a blood pressure lowering effect. Therefore, it can be used as a prophylactic or therapeutic agent for various diseases derived from hypertension, such as cerebral hemorrhage, cerebral infarction, angina pectoris, myocardial infarction, renal failure, etc., specifically as a hypotensive agent and the like.
  • Angiotensin converting enzyme inhibitors are also known to be effective for essential hypertension of unknown origin, and the peptides of the present invention are also expected to show a therapeutic or preventive effect on essential hypertension. .
  • it can be used as a therapeutic or prophylactic agent for diseases such as cardiac hypertrophy and angina which are known to be effective for angiotensin converting enzyme inhibitors.
  • the angiotensin converting enzyme inhibitor of the present invention may be administered by oral administration or parenteral administration, but oral administration is preferred.
  • Parenteral administration includes intravenous injection, rectal administration, inhalation and the like.
  • Oral dosage forms include tablets, capsules, troches, syrups, granules, powders, ointments and the like.
  • components such as excipients, pH adjusters, coloring agents, and flavoring agents that are usually used in formulating can be used.
  • a drug having a known or future inhibitory action on angiotensin converting enzyme can be used in combination.
  • the peptide of the present invention is contained in a food as an active ingredient,
  • a food as an active ingredient
  • the enzyme-converting enzyme inhibitor it can be processed as a food having angiotensin-converting enzyme inhibitory action.
  • Such foods include tablet, confectionery, liquid food, feed (including pet food) etc., in any form such as liquid, paste, solid, powder, etc., as well as bread, macaroni, spaghetti, noodles, Wheat flour products such as cake mix, fried flour, bread crumbs, etc .; instant noodles, cup noodles, retort 'cooked food, canned food, microwave food, instant soup' stew, instant miso soup 'soup, canned soup, freeze-dried food And other ready-to-eat foods such as ready-to-eat foods; agricultural canned products, canned fruits, jam and marmalades, pickles, boiled beans, agricultural dried products, serials (processed cereals), and other processed agricultural products; canned seafood, fish ham Processed fishery products such as sausages, fish paste products, fish delic
  • Milk and dairy products Butter, margarine And fats such as vegetable oils; soy sauce, miso, sauces, tomato processing seasonings, mirin, vinegar, etc .; basic seasonings; cooking mix, curry ingredients, sauces, dressings, noodle soups, spices And other complex seasonings such as complex seasonings ⁇ Foods; frozen foods such as frozen foods, semi-cooked frozen foods, and cooked frozen foods; caramels, candy, chewing gum, chocolate, cookies, biscuits, cakes , Pie, snacks, crackers, Japanese confectionery, rice confectionery, rice confectionery, bean confectionery, dessert confectionery, other confectionery, etc .; carbonated beverages, natural juices, juice beverages Soft drinks with fruit juice, pulp drinks, fruit drinks with berries, vegetable drinks, soy milk, soy milk drinks, coffee drinks, tea drinks, powdered drinks, concentrated drinks, sports drinks, nutritional drinks, alcoholic drinks, other favorite drinks And other commercially available foods such as baby foods, sprinkles, and ochazuke seaweed.
  • the amount of the peptide of the present invention is preferably at least 0.001% by weight based on the final composition of the angiotensin converting enzyme inhibitor.
  • the dosage of the angiotensin converting enzyme inhibitor of the present invention varies depending on age, symptoms, etc., but is usually 0.001 SOOO mg / 7 days, preferably 0.01 to 3 O mg / day. It may be administered once to three times a day.
  • FIG. 1 shows the results of MS / MS analysis of the peptides of the present invention.
  • Example 1 Production of peptide by enzymatic degradation of casein
  • casein New Zealand Daily Board
  • sodium hydroxide is added to adjust the solution pH to 7.0
  • casein is completely dissolved, and the concentration is about 10%.
  • % Casein aqueous solution was prepared.
  • the casein aqueous solution was sterilized by heating at 85 ° C for 10 minutes, the temperature was adjusted to 50 ⁇ , the pH was adjusted to 9.5 by adding sodium hydroxide, and then bioprose sp_20 (Nagase Bio 100,800 active units (1,200 active units per lg of protein), protease N (manufactured by Amano Enzym) 168,000 active units (2,000 active units per gram of protein), and PTN 6.
  • OS manufactured by Novozyms Japan
  • 588,000 activity units 7,000 activity units per gram of protein
  • the hydrolyzed solution was ultrafiltered through an ultrafiltration membrane with a cut-off molecular weight of 3,000 (manufactured by Asahi Kasei Corporation), concentrated and freeze-dried to obtain 85 g of a freeze-dried product.
  • HPLC condition 1 The above casein hydrolyzate was separated using reversed-phase HPLC.
  • HPLC conditions of the above are shown in the following HPLC condition 1.
  • the compound having the above-mentioned activity peak was identified using Applied Biosystem's Protein 'sequencer (Model-473A). As a result, it turned out to have a new structure called Met-Lys-Pro.
  • One or two 10-week-old SHR / Hos male rats purchased from Nippon S.L.I.C. were bred for 1 week in advance, and the blood pressure of the rats was monitored using a small animal non-invasive automatic sphygmomanometer (MK-2000, Muromachi Kikai Co., Ltd.) was measured using the following method.
  • the animals were divided into two groups, each with 6 animals per group, so that the average systolic blood pressure before administration for each group was almost the same, and then fasted for about 16 hours.
  • the enzymatically degraded casein obtained in ⁇ 1> of Example 1 was dissolved in water for injection. Oral administration of 10 mL / kg body weight (100 mg / kg body weight as casein enzymatically decomposed product and 0.05 mg / kg body weight as the peptide of the present invention (Met-Lys_Pro)) was performed orally for 2 hours. Later, the blood pressure of the rats was measured.
  • the same volume of water for injection was orally administered in place of the aqueous solution of the enzyme hydrolyzate of casein, and 2 hours after the administration, the blood pressure of the rat was measured.
  • Table 2 shows the results. As is clear from Table 2, a decrease in blood pressure was observed in the test group, but not in the control group. Therefore, it was found that the enzymatically degraded casein containing the peptide of the present invention (Met-Lys-Pro) has a blood pressure lowering effect on animals. Table 2 Systolic blood pressure before administration 2 hours after administration Systolic blood pressure
  • Example 1 As a test sample, 3 g of the enzymatically degraded casein obtained in 1> of Example 1 (containing 1.5 mg as the peptide of the present invention (Met-Lys-Pro)) and 3 g of dextrin as a control Ingested once daily. Blood pressure measurement (0-3 weeks) is measured at about the same time Specified.
  • Tables 3 and 4 show the obtained values (systolic blood pressure).
  • the present invention provides a novel peptide useful as an angiotensin converting enzyme inhibitor. Since the peptide of the present invention is derived from a natural product, has low toxicity and high safety, the peptide of the present invention is contained in a food as an active ingredient, and as an embodiment of a blood pressure lowering agent, a food having a hypotensive action is provided. Processing is also possible.

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Description

明細書
'変換酵素阻害作用を有する新規 技術分野
本発明は、 新規なぺプチド及び同ペプチドを含有するアンジォテンシン変換酵 素阻害剤に関する。 アンジォテンシン変換酵素阻害剤は、 食品、 飼料、 及び医薬 として利用することができる。 背景技術
'変換酵素 （ACE) は、 レニンによる切断により
シノ一ゲンから生じるアンジォテンシン Iに働き、 C末端の 2個のアミノ酸を遊 離させて、 アンジォテンシン I Iに変換する酵素である。 アンジォテンシン変換酵 素は強い昇圧作用を有するアンジォテンシン I Iを生成させるとともに、 降圧作用 を有するブラジキニンを不活性化する作用も有している。 このような作用から、 アンジォテンシン変換酵素阻害剤は、 高血圧の治療薬として使用されており、 力 プ卜プリル （三共） 、 レニべ一ス （萬有製薬） などが市販薬として知られている。 また、 アンジォテンシン変換酵素阻害剤は、 心肥大退縮効果があることも知られ ている。
一方、 アンジォテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドが、 天然物中に、 又はカゼイン、 ゼラチン等の動物性蛋白質、 コムギ、 コメ、 トウモロコシ等の植 物性蛋白質、 及び、 イワシ等の魚類蛋白質等の酵素分解物から見出されている。 例えば、 天然物中に見出されるペプチドとして、 テプロタイド （ノナペプチド，
S Q 2 0 8 8 1 ) 等や、 ストレブトミセス属に属する放線菌の代謝産物 I S 8 3 (特開昭 5 8— 1 7 7 9 2 0号公報） が知られている。 また、 酵素分解物として は、 カゼインをトリプシンにより分解して得たペプチド類 （特開昭 58- 109425号、 同 59-44323号、 同 59- 44324号、 同 61- 36226号、 同 61- 36227号） 、 カゼインをサー モライシンにより分解して得たペプチド類 （特開平 6- 277090号、 同 6- 277091号、 同 6- 279491号、 同 7- 101982号、 同 7- 101985号） 、 カゼイン等を乳酸菌あるいは、 プロティナ一ゼとぺプチダーゼの組み合わせにより分解して得たぺプチド類 （特 開平 6-197786号、 同 6-40944号、 特開 2001- 136995号。 以下、 それぞれ 「参考文献 1〜3」 という。 ） 等が知られている。 参考文献 1〜3のペプチド類は、 血圧降 下作用を有する特定保健用食品として利用されている。
上記のペプチド類の中で、 前記特開平 7-101982号公報 （以下、 「参考文献 4」 という） 記載のペプチドが、 最もアンジォテンシン変換酵素阻害活性が高く、 か つトリベプチドという比較的単純な構造を有している。 発明の開示
上記のように、 種々のアンジォテンシン変換酵素阻害ペプチドが知られている が、 これらのペプチド類では、 未だ食品中の機能として、 アンジォテンシン変換 酵素阻害活性は不十分である。 よって、 天然物由来で、 一層高いアンジォテンシ ン変換酵素阻害活性を有し、 かつ単純な構造を有するペプチドの取得と、 その食 品又は医薬等への応用が望まれているところである。
本発明者らは、 前記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、 カゼインを 特定の酵素で加水分解することにより、 加水分解物中に高いアンジォテンシン変 換酵素阻害活性を有する新規なペプチドが存在し、 さらに同ペプチドが M e t - L y s— P r oで表される配列を有するペプチドであることを見出し、 本発明を 完成するに至った。
すなわち本発明は、 M e t — L y s— P r oからなるペプチド （以下、 「本発 明のペプチド」 ともいう） である。
また本発明は、 M e t— L y s— P r oからなるペプチドを有効成分として含 有するアンジォテンシン変換酵素阻害剤を提供する。
M e t— L y s — P r oからなるペプチドを有効成分として含有する血圧降下 剤。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明のペプチドは、 M e t— L y s— P r oで表される配列を有する。 また、 本発明のペプチドは、 このペプチドの塩類であってもよい。 本発明において、 M e tは L一メチォニン残基、 L y sは L—リジン残基、 ？ 1" 0はしープロリン残 基を示す。 本発明のペプチドは、 例えば、 カゼイン等の蛋白質を適当な加水分解酵素で加 水分解することによって、 製造することができる。 以下に、 蛋白質を加水分解酵 素で加水分解する方法を例示する。
蛋白質を酵素で加水分解するには、 蛋白質の性状により処法は異なるが、 可溶 性の場合には、 原料蛋白質を水又は温湯に分散し、 溶解する。 難溶性の場合には 熱水に蛋白質を混合し、 強力な撹拌でホモジナイズする。
蛋白質としては、 M e t—L y s— P r oで表される配列を含み、 適当な加水 分解酵素で消化したときに本発明のペプチドが生成するものであれば特に制限さ れず、 動物由来や微生物由来のもの等が任意に用いられる。 特に好適な蛋白質は、 大量に入手可能なカゼィンである。
前記蛋白質を含有する溶液を 7 0〜9 0 °Cで 1 5秒間〜 1 0分間程度加熱殺菌 することが、 雑菌汚染による変敗防止の点から望ましい。
次いで、 前記蛋白質を含有する溶液にアルカリ剤又は酸剤を添加し、 P Hを使 用する加水分解酵素の至適 p H又はその付近に調整することが好ましい。 本発明 の方法に使用するアルカリ剤又は酸剤は、 食品又は医薬品に許容されるものであ れば如何なるアルカリ剤又は酸剤であってもよい。 具体的には、 アルカリ剤とし ては、 水酸化ナトリウム、 水酸化カリウム、 炭酸カリウム等を、 酸剤としては、 塩酸、 クェン酸、 リン酸、 酢酸等を例示することができる。
次に、 蛋白質溶液に所定量の加水分解酵素を加え、 温度 1 0〜8 5 °C程度で 0 . 1〜4 8時間反応を行う。
加水分解酵素としては、 蛋白質を加水分解し、 本発明のペプチドを生成させ得 るするものであれば特に制限されないが、 エンドべプチダーゼであることが好ま しい。 エンドべプチダ一ゼとしては、 バチルス （Bac i l lus) 属細菌由来のプロテ ァーゼ及び動物滕臓由来のプロテア一ゼ等が挙げられる。 これらの酵素は市販さ れており、 バチルス属細菌由来のプロテアーゼとしてはビオプラ一ゼ s ρ— 2 0 (長瀬生化学工業社製） 、 プロテアーゼ N (天野ェンザィム社製） 等が、 動物塍 臓由来のプロテアーゼとしては P T N 6 . O S (ノボザィムズ ·ジャパン社製） 等が好ましいものとして例示できる。 バチルス属細菌由来のプロテア一ゼは、 蛋 白質 l g当たり 1 0 0〜 5 0 0 0活性単位の割合で添加するのが望ましい。 また、 動物塍臓由来のプロテア一ゼは、 蛋白質 l g当たり 3 0 0 0 〜8 0 0 0活性単 位の割合で添加するのが望ましい。
本発明において用いる加水分解酵素は 1種でもよく、 2種以上用いてもよい。 2種以上の酵素を用いる場合は、 それぞれの酵素反応は同時に行ってもよく、 別 々に行ってもよい。 本発明においては、 ビオプラーゼ s p— 2 0、 プロテア一ゼ N、 及び P T N 6 . 0 Sを混合して使用することが特に好ましい。
酵素を添加した溶液を、 酵素の種類に応じて適当な温度、 例えば 3 0〜6 0 °C、 望ましくは 4 5〜5 5 °Cに保持して蛋白質の加水分解を開始する。 加水分解反応 時間は、 酵素反応の分解率をモニタ一しながら、 好ましい分解率に達するまで反 応を続ける。 本発明のペプチドを得るためには、 分解率は 2 0〜3 0 %が望まし い。
尚、 蛋白質の分解率の算出方法は、 ケルダ一ル法 （日本食品工業学会編、 「食 品分析法」 、 第 1 0 2頁、 株式会社光琳、 昭和 5 9年） により試料の全窒素量を 測定し、 ホルモール滴定法 （満田他編、 「食品工学実験書」 、 上巻、 第 5 4 7ぺ ージ、 養賢堂、 1 9 7 0年） により試料のホルモール態窒素量を測定し、 これら の測定値から分解率を次式により算出する。 分解率 （％) = (ホルモール態窒素量/全窒素量） X 1 0 0 酵素反応の停止は、 例えば、 加水分解液中の酵素の失活により行われ、 常法に よる加熱失活処理により実施することができる。 加熱失活処理の加熱温度と保持 時間は、 使用した酵素の熱安定性を考慮し、 十分に失活できる条件を適宜設定す ることができるが、 例えば、 8 0〜1 3 O tの温度範囲で 3 0分間〜 2秒間の保 持時間で行うことができる。
上記加水分解液物から、 好ましくは本発明のペプチドを単離、 精製する。 ぺプ チドの精製は、 通常、 オリゴペプチドの精製に用いられているのと同様の手法、 例えばイオン交換クロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー、 逆相クロマト グラフィ一、 分配クロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマトグラフィー等の各種ク 口マトグラフィ一、 溶媒沈殿、 塩析、 2種の液相間での分配等の方法を適宜組み 合わせることによって、 行うことができる。 本発明のペプチドの精製に際しては、 目的物質を含む画分は、 後述するアンジォテンシン変換酵素阻害作用を指標とし て決定することができ、 それらの画分の活性成分は質量分析法により同定するこ とができる。
また、 本発明のペプチドは、 化学合成によっても製造することができる。 本発 明のぺプチドの化学合成は、 オリゴペプチドの合成に通常用いられている液相法 または固相法によって行うことができる。 合成されたペプチドは、 必要に応じて 脱保護され、 未反応試薬、 副生物等を除去する。 このようなペプチドの合成は、 市販のペプチド合成装置を用いて行うことができる。 目的とするペプチドが得ら れたことは、 アンジォテンシン変換酵素阻害作用を指標として確認することがで さる
本発明のペプチドは、 アンジォテンシン変換酵素阻害剤の有効成分として使用 することができる。 本発明のペプチドは、 アンジォテンシン変換酵素阻害作用及 びブラジキニン不活性化抑制作用を有し、 血圧降下作用を示す。 したがって、 高 血圧に由来する種々の疾患、 例えば脳出血、 脳梗塞、 狭心症、 心筋梗塞、 腎不全 等に対する予防剤又は治療剤、 具体的には血圧降下剤等として使用することがで きる。 また、 アンジォテンシン変換酵素阻害剤は、 原因不明の本態性高血圧にも 効果があることが知られており、 本発明のぺプチドも本態性高血圧に対する治療 又は予防効果を示すことが期待される。 その他、 アンジォテンシン変換酵素阻害 剤が有効であることが知られている心肥大、 狭心病等の疾患に対しても、 治療、 予防薬として使用することができる。
本発明のアンジォテンシン変換酵素阻害剤は、 経口投与、 非経口投与のいずれ によって投与されてもよいが、 経口投与が好ましい。 非経口投与としては、 静注、 直腸投与、 吸入等が挙げられる。 経口投与の剤型としては、 錠剤、 カプセル剤、 トローチ剤、 シロップ剤、 顆粒剤、 散剤、 軟膏等が挙げられる。 製剤化に際して、 乳清蛋白加水分解物の他に、 通常製剤化に用いられている賦形剤、 P H調整剤、 着色剤、 矯味剤等の成分を用いることができる。 また、 公知の、 もしくは将来的 に見出されるアンジォテンシン変換酵素阻害作用を有する薬剤を併用することも できる。
また、 本発明のペプチドを有効成分として食品中に含有させ、 アンジォテンシ ン変換酵素阻害剤の一態様として、 アンジォテンシン変換酵素阻害作用を有する 食品として加工することも可能である。 このような食品としては、 液状、 ペース 卜状、 固体、 粉末等の形態を問わず、 錠菓、 流動食、 飼料 （ペット用を含む） 等 のほか、 例えば、 パン、 マカロニ、 スパゲッティ、 めん類、 ケーキミックス、 か ら揚げ粉、 パン粉等の小麦粉製品；即席めん、 カップめん、 レトルト '調理食品、 調理缶詰め、 電子レンジ食品、 即席スープ 'シチュー、 即席みそ汁 '吸い物、 ス —プ缶詰め、 フリーズ · ドライ食品、 その他の即席食品等の即席食品類； 農産 缶詰め、 果実缶詰め、 ジャム ·マーマレード類、 漬物、 煮豆類、 農産乾物類、 シ リアル （穀物加工品） 等の農産加工品； 水産缶詰め、 魚肉ハム · ソーセージ、 水産練り製品、 水産珍味類、 つくだ煮類等の水産加工品；畜産缶詰め ·ペースト 類、 畜肉ハム · ソーセージ等の畜産加工品；加工乳、 乳飲料、 ヨーグルト類、 乳 酸菌飲料類、 チーズ、 アイスクリーム類、 調製粉乳類、 クリーム、 その他の乳製 品等の乳 ·乳製品；バタ一、 マ一ガリン類、 植物油等の油脂類； しょうゆ、 みそ、 ソース類、 トマト加工調味料、 みりん類、 食酢類等の基礎調味料；調理ミックス、 カレ一の素類、 たれ類、 ドレッシング類、 めんつゆ類、 スパイス類、 その他の複 合調味料等の複合調味料 ·食品類；素材冷凍食品、 半調理冷凍食品、 調理済冷凍 食品等の冷凍食品；キャラメル、 キャンディ一、 チューインガム、 チョコレート、 クッキ一、 ビスケット、 ケーキ、 パイ、 スナック、 クラッカー、 和菓子、 米菓子、 豆菓子、 デザート菓子、 その他の菓子などの菓子類；炭酸飲料、 天然果汁、 果汁 飲料、 果汁入り清涼飲料、 果肉飲料、 果粒入り果実飲料、 野菜系飲料、 豆乳、 豆 乳飲料、 コーヒー飲料、 お茶飲料、 粉末飲料、 濃縮飲料、 スポーツ飲料、 栄養飲 料、 アルコール飲料、 その他の嗜好飲料等の嗜好飲料類、 ベビーフード、 ふりか け、 お茶漬けのり等のその他の市販食品等が挙げられる。
本発明のアンジォテンシン変換酵素阻害剤において、 本発明のぺプチドの配合 量は、 アンジォテンシン変換酵素阻害剤の最終組成物に対し少なくとも 0 . 0 0 1重量％であることが好ましい。
本発明のアンジォテンシン変換酵素阻害剤の投与量は、 年齢、 症状等により異 なるが、 通常、 0 . O O l S O O O m g /7日、 好ましくは 0 . 0 1〜3 O m g /日であり、 1日 1回から 3回に分けて投与してもよい。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明のぺプチドの MS/MS分析の結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
次に、 実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。 実施例 1 カゼインの酵素分解によるペプチドの製造
<1〉カゼインの酵素分解
市販のカゼイン （ニュージーランドデーリーボード製） 1 008に水900 ^ を加え、 よく分散させ、 水酸化ナトリウムを添加して溶液の pHを 7. 0に調整 し、 カゼインを完全に溶解し、 濃度約 10%のカゼイン水溶液を調製した。 該カ ゼイン水溶液を 85 °Cで 1 0分間加熱殺菌し、 50^に温度調整し、 水酸化ナト リウムを添加して pHを 9. 5に調整した後、 ビオプラ一ゼ s p_ 20 (長瀬生 化学工業社製） 1 00， 800活性単位 （蛋白質 l g当り 1， 200活性単位） 、 プロテアーゼ N (天野ェンザィム社製） 1 68， 000活性単位 （蛋白質 1 g当 り 2, 000活性単位） 、 及び PTN 6. O S (ノボザィムズ ·ジャパン社製） 588, 000活性単位 （蛋白質 1 g当り 7, 000活性単位） を添加して、 加 水分解反応を開始した。 カゼインの分解率が 24. 1 %に達した時点で、 80°C で 6分間加熱して酵素を失活させて酵素反応を停止し、 10°Cに冷却した。 この 加水分解液を分画分子量 3, 000の限外ろ過膜 （旭化成社製） で限外ろ過し、 濃縮後凍結乾燥し、 凍結乾燥品 85 gを得た。
<2>HP L Cによるべプチドの分離
逆相 HP L Cで上記カゼィン加水分解物の分離を行った。 の HP L C条件は 下記 H PL C条件 1に示した。
〔HP L C条件 1〕
カラム ：カプセルパック C 18 (UG 120、 5 m)
20 mm I . D. X 250 mm (資生堂）
検 出 ： UV 21 5 nm
流 速 ： 1 6 m 1 Z分 溶離液 A : 0. 05 % TF Aを含む 1 %ァセトニトリル水溶液 溶離液 B ： 0. 05 % TF Aを含む 25 %ァセトニトリル水溶液 溶離液 A 100 %から、 40分後に溶離液 B 1 00 %になるような直線ダラ ジェント条件で、 加水分解物を分離した。 溶出画分について、 後述する方法でァ ンギオテンシン変換酵素阻害能を測定したところ、 アンジォテンシン変換酵素阻 害能を持つペプチドは、 リテンションタイム 22分に溶出された。 さらに、 この ペプチドを精製するため、 さらに HPLCで精製した。 このときの条件を下記 HP L C条件 2に示した。
〔HP L C条件 2〕
カラム ：カプセルパック C 18 (UG 300、 5 m)
2.0 mm I . D. X 250 mm (資生堂）
検 出 UV 2 1 5 nm
流 速 0. 2m l /分
溶離液 A 0. 05 % TF Aを含む 1 %ァセトニトリル水溶液
溶離液 B 0. 05 % TF Aを含む 1 0 %ァセトニトリル水溶液 溶離液 A 1 00 %から 1 5分後に溶離液 B 1 00 %になるような直線グラジ ェント条件で、 リテンションタイム 1 3分のピークに強いアンジォテンシン変換 酵素阻害能が認められた。 このピークのアンジォテンシン I変換酵素阻害能は、 I C 50 [アンジォテンシン変換酵素の活性を 50%阻害するために必要な試料濃度（ g/ml)] =0.18 g/mlであった。
上記活性ピークの化合物を、 Applied Biosystem社のプロテイン ' シーケンサ ― (Model-473A) で同定した。 その結果、 Met— Lys— Proという新規な構造をも つことがわかった。 更に、 サーモクエスト社製質量分析計 LCQにより、 分子量 (M) は、 374.2、 m/z=375.2 (MH+)を親イオンとする MS/MS分析により、 図 1に示 す通り、 m/z=260, 215, 129等の娘イオンが検出された。
こうして、 アンジォテンシン変換酵素阻害能を有するペプチドの構造は、 H - Me t_Lys - Pro- OHであることが明らかとなった。 尚、 上記凍結乾燥品 8 5 g中に、 ト リぺプチド Met— Lys— Proは、 42.5mg含まれていた。 実施例 2 ペプチドの化学合成
ペプチドシンセサイザー （Model 433A型、 アプライドバイオシステムズ社） を 使用し、 Fmoc- L-Met (アプライドバイオシステムズ社） 、 Fmoc- Lys (Boc) (ァプ ライ ドバイオシステムズ社） 、 Fmoc- Pro_TrtA- PEG Resin (渡辺化学工業 (株） ） を原料に用いて、 固相合成法によりトリペプチド Met— Lys— Proを合成 した。 操作はアプライドバイオシステムズ社のマニュアルに従って行った後、 脱 保護した。 このペプチドは、 上記 HP LC条件 1で精製した。 この物質を用いて アンジォテンシン変換酵素阻害能を測定した結果、 実施例 1で得られたカゼィン 分解物から抽出したものとほぼ同じ値 （IC50=0.19 g/ml) が得られた。
得られたトリペプチドは、 質量分析により分子量 （M) は 374.2と測定され、 m/ z=375.2 (MH+)を親イオンとする MS/MS分析により、 図 1と同様のスぺクトルが得 られた。 実施例 3 ペプチドのアンジォテンシン変換酵素阻害作用
アンジォテンシン変換酵素阻害の測定は、 カツシュマンらの方法 〔パイオケミ カル 'ファーマコロジー 2 0巻、 1 6 3 7〜 1 648頁 （1 9 7 1) 〕 に準じて 行った。
試料として、 実施例 1及び実施例 2で得られたペプチド （Met- Lys- Pro) 、 参 考文献 1〜 3に記載のペプチド （Va卜 Pro- Pro、 lie- Pro-Pro) 、 及び参考文献 4 に記載のペプチド （Leu- Leu- Trp) を用いた。 これらのペプチドは、 いずれも実 施例 2と同様にして化学合成したものである。
試料を 0.1Mホウ酸緩衝液 （0.3M NaClを含む、 pH8.3) に溶解し、 試験管に 0.08 ml入れた後、 0.1Mホウ酸緩衝液 （0.3M NaClを含む、 pH8.3) で 5mMに調整した酵 素基質 （ヒプリルヒスチジルロイシン、 シグマ社製） 0.2mlを添加し、 37°Cで 3 分間保温した。 次いで、 蒸留水を添加して 0.1U/mlになるように調整したゥサギ 肺のアンジォテンシン変換酵素 （シグマ社製） 0.02mlを添加し、 37°Cで 30分間反 応させた。 その後、 IN塩酸 0. 25mlを添加して反応を終了した後、 1 . 7mlの酢酸ェチルを加 え、 20秒間激しく撹件し、 3000rpmで 10分間遠心分離して、 酢酸ェチル層を 1. 4ml 採取した。 得られた酢酸ェチル層を加熱して溶媒を除去した後、 蒸留水を 1. 0ml 添加し、 抽出したヒプリル酸の吸収 （228 の吸光度） を測定して、 これを酵素 活性とした。
次の式から、 阻害活性を求め、 IC50 [アンジォテンシン変換酵素の活性を 50% 阻害するために必要な試料濃度（ g/ml、 又は M) ] を決定した。 結果を表 1に 示す。 阻害率 = (A-B) / (A-C) X 100
A：試料（ぺプチド）を含まない場合の酵素活性（228nmの吸光度）
B：試料添加の場合の酵素活性（228nmの吸光度）
C：酵素および試料を添加しない場合の酵素活性（228nmの吸光度）
I C50 ( M) 実施例 2のペプチド （Me t- Lys_Pro) 0 . 5
Va卜 Pro-Pro 6
I l e-Pro-Pro 4
Leu-Leu-Trp 2 . 2
実施例 4 ペプチドの動物における血圧降下作用
< 1 >試験方法
10週齢の SHR/Hos雄性ラット 1 2匹 （日本エスエルシ一株式会社より購入） を， 1週間の予備飼育行い、 ラットの血圧を小動物非観血式自動血圧計 （MK- 2000， 室町機械㈱社製） を用いて測定した。
収縮期血圧を指標とし、 群毎の投与前の平均収縮期血圧がほぼ同じ値になるよ うに、 1群あたり 6匹となるように 2群に分けた後、 約 16時間絶食し、 試験群に は実施例 1の < 1 >項で得られたカゼィンの酵素分解物を注射用水に溶解し、 ラ ットに 10mL/体重 kg (カゼインの酵素分解物として lOOmg/体重 kg、 本発明のぺプ チド （Met— Lys_Pro) として 0. 05mg/体重 kg。 ） の割合で経口投与し、 投与 2時 間後に、 ラットの血圧を測定した。 対照群には、 前記カゼインの酵素分解物水溶 液の代わりに注射用水を同容量経口投与し、 投与 2時間後に、 ラットの血圧を測 定した。
<2>試験結果
結果を、 表 2に示す。 表 2から明らかなとおり、 試験群において血圧降下が認 められたものの、 対照群では認められなかった。 従って、 本発明のペプチド （Me t-Lys-Pro) を含むカゼインの酵素分解物に、 動物に対する血圧降下作用があ ることが判明した。 表 2 投与前収縮期血圧 投与後 2時間経過時収縮期血圧
(mmHg) ^m Hg) 式験群 1 82 140
対照群 1 84 1 7 7
実施例 5 ペプチドのヒトにおける血圧降下作用
< 1 >試験方法
30才以上 58才未満の男性志願者であって、 摂取開始 3週前のスクリーニング検 査 （医師による診察） 時に収縮期血圧が 140〜165imnHgを示す軽症高血圧者で、 か つ降圧薬による治療を受けていない 9名を被験者とした。
スクリーニング検査時に測定した血圧値、 喫煙の有無、 及び年齢を考慮して、 群間の平均化を図り、 試験サンプル摂取群 5名、 対照群 4名に割り振った。
試験サンプルとして、 実施例 1のぐ 1 >項で得られたカゼィンの酵素分解物 3 g (本発明のペプチド （Met— Lys— Pro) として 1. 5mg含有） を、 対照としてデ キストリン 3gを 1日 1回摂取させた。 血圧測定 （0〜3週） はほぼ同時刻に測 定した。
得られた数値 （収縮期血圧） を表 3及び表 4に示す。
得られた数値 （収縮期血圧） を、 統計解析ソフトウェア SPSS (エス · ピー ·ェ ス，エス株式会社製） を使用して、 有意差を危険率 5%で一元配置分散分析法 （例 えば、 巿原清志著， 「バイオサイエンスの統計学」 ， 第 5刷， 株式会社南江堂， 1991年 11月 20日， p. 150— 151参照） により分析し、 有意差のあったものについ ては、 Dunnettの多重比較法 （例えば、 竹内啓、 外 1 3名編集， 「統計学辞典」 ， 東洋経済新報社， 1989年 12月 4日， p. 399参照） により平均値の比較を行った。 表 3 試験サンプル摂取群結果 （収縮期血圧単位 mmHg)
N o . 投与前 1週目 2週目 3週目
(0週目)
1 162 150 149 145
2 163 160 152 160
3 157 153 136 142
4 145 137 147 137
5 145 133 139 127
表 4 対照群結果 （収縮期血圧単位 mmHg)
N o . 投与前 1週目 2週目 3週目
(0週目)
1 150 145 139 144
2 153 145 136 156
3 149 137 134 135
4 146 143 148 137
<2>試験結果
統計解析ソフトウェア SPSSの分析結果として、 対照群では、 摂取前 （0週） に 対して、 投与 1、 2及び 3週後すべてで有意差は認められなかったが、 試験サン プル摂取群では、 2週及び 3週後で有意な差がありとの結果が示された。 従って、 本発明のペプチド （Me t— Lys— P ro) を含むカゼインの酵素分解物に、 ヒトに対 する血圧降下作用があることが判明した。 産業上の利用の可能性
本発明により、 アンジォテンシン変換酵素阻害剤として有用な新規ペプチドが 提供される。 本発明のペプチドは、 天然物由来で、 低毒性で安全性が高いことか ら、 本発明のペプチドを有効成分として食品中に含有させ、 血圧降下剤の一態様 として血圧降下作用を有する食品として加工することも可能である。

Claims

請求の範囲
1. Me t— Ly s— P r oからなるぺプチド。
2. Me t -Ly s -P r oからなるペプチドを有効成分として含有するァ ンジォテンシン変換酵素阻害剤。
3. Me t— Ly s— P r oからなるペプチドを有効成分として含有する血 圧降下剤。
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