WO2003000285A1

WO2003000285A1 - Tissue-specific transporter inhibitor

Info

Publication number: WO2003000285A1
Application number: PCT/JP2002/006104
Authority: WO
Inventors: Akira Tsuji; Ikumi Tamai; Yoshimichi Sai; Noubuhiko Yui; Toru Oya; Ken-Ichi Miyamoto
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2001-06-21
Filing date: 2002-06-19
Publication date: 2003-01-03
Also published as: US7420029B2; EP1405644A1; EP1405644A4; US20040191211A1; AU2002313242B2; JP2003002843A; JP3942846B2; CA2451433A1; CA2451433C

Description

明細書組織特異的トランスポーター阻害剤技術分野

本発明は、組織特異的トランスポーターが認識するリガンド構造と、膜組織を透過できない高分子分子構造とをもつ組織特異的トランスポー夕一機能阻害剤、及びかかる組織特異的トランスポ一ター機能阻害剤を有効成分とする組織機能不全疾患治療薬又は慢性腎不全進行抑制治療薬等に関する。背景技術

現在、透析患者は増加傾向にあり、将来、糖尿病から透析療法に移行する患者の数を合わせると莫大な数にのぼることが予想されており、透析療法にかかる医療費は 1兆円を遙かに越えることが推定されている。これらのことから、腎疾患を発症させない予防医学及び腎不全を透析に至らせない保存期治療が重要とされている。慢性腎不全患者における腎障害の有効な治療法は確立しておらず、現在までのところ、低タンパク食事療法や A C E阻害薬のような抗高血圧薬の投与が行われている（Am. J. Cardiol. 59, 66A-71A, 1987、 Am. J. Kidney. 20, 443-57, 1992、 BMJ 304, .216-20, 1992、 Ann. Intern. Med. 124, 627-32, 1996) 。上記低タンパク食療法は慢性腎不全の進行を抑制するための有効な手段とされ、現在広く実施されているが、食事制限は患者の quality of life (Q O L) やコンプライアンスの問題を抱えているため、タンパク質の経口吸収を抑制する等の新しい治療戦略が求められている。最近、高脂血症治療の新しい戦略として、小腸に存在する胆汁酸トランスポーターを阻害することによってコレステロ一ルの生合成を抑制するということが報告され注目を集めている（J. Pharmacol. Exp. Ther. 293, 315-20, 2000) 。これと同様に、タンパク質の消化管吸収を特異的な阻害剤によつて抑制することが可能であると期待される。

本発明者らは、以前、摂取されたタンパク質が、消化管内でアミノ酸とオリゴペプチドにまで分解し、小腸から吸収されることや、かかる吸収が小腸上皮細胞刷子縁膜に存在する特異的なトランスポーターによつて行われることを報告している（Pharm. Res. 13, 963-77, 1996) 。上記分解されたアミノ酸は複数のトランスポーターによって輸送されるが. オリゴぺプチドは P E P T 1等のオリゴぺプチドトランスポ一夕一によつて輸送され、ジペプチド又はトリペプチド特異的に吸収される（J. Biol. Chem. 270, 6456-63, 1995) 。小腸におけるタンパク質の消化産物の吸収は、アミノ酸よりもペプチドの方が高いことが知られている (Gastroenterology 113， 332-40, 1997) 。以上のことから、 P E P T 1阻害剤は、食餌中のタンパク質の吸収を抑制することができ、食事療法によって Q O Lが低下している患者にとって有用であると考えられる, 1 9 9 4年以降、ゥサギ、ヒト及びラットの小腸から P E P T 1遺伝子がクローニングされ（J. Biol. Chem. 270, 6456-63, 1995、 Nature 368， 563-6, 1994, J. Pharma. Exp. Ther. 275, 1631-7, 1995、 Bi och im. Biophys. Acta, 1305, 34-8, 1996) 、 P E P T 1を介した輸送研究が急速に発展してきた。上記ラット小腸由来の P E P T 1遺伝子は本発明者らが初めてクローニングし（Biochim. Biophys. Acta, 1305, 34-8, 1996) 、免疫組織化学的手法により小腸上皮細胞刷子縁膜側に局在していることを明らかにしている（FEBS Lett. 392, 25-9, 1996) 。また、 P E P T 1 は、 3—ラクタム系抗生物質などのペプチド類似構造を有する化合物のみならず（Pharm. Res. 13, 963-77, 1996) 、分子内にペプチド結合を持たない抗ウィルス薬バラシク口ビル（valacyclovir) などの化合物も認識し、輸送することが報告されている（Biochem. Biophys. Res. Commun. 250, 246-51, 1998、 J. Clin. Invest. 101, 2761-7, 1998、 J. Biol. Chem. 273, 20-2, 1998) 。以上のように P E P T 1は幅広い基質認識性を示すが、その分子認識性については未だ解明されておらず、現在のところ、 P E P T 1の基質認識には部分的構造のみならず分子全体の認識が関与しているのではないかと考えられている。一方、腎臓からクローニングされた P E P T 2 (Biochim. Biophys. Acta, 1235, 461-6, 1995,Biochim. Biophys. Acta, 1280, 173-7, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 284-9, 1996) は、腎臓の近位尿細管上皮細胞刷子縁膜側に局在しているが、 P E P T 1と類似した基質認識性を有しており、オリゴペプチドやべプチド様化合物の再吸収に働いている。また、寄与は小さいが上記 P E P T 1は腎臓においても発現していることが知られている（Am. J. Physiol. 276, F658-65, 1999) が、 P E P T 2の小腸における発現は認められていない。

ヒトにおいて、 3—ラクタム系抗生物質であり、 P E P T 1の基質である cefadroxil (CD X) のバイオアベイラビリティ一（BA) が、同様に P E P T 1 によって認識される；3—ラクタム系抗生物質である cephalexin (C EX) の同時投与によって低下するということが報告されている（Eur. J. Clin. Pharmacol. 41， 179-83, 1991) 。バイオアベイラピリティ一の指標としての A U C ( Area Under the plasma concentration Curve) が C E Xによって低下したメカニズムには C D X の小腸での吸収と腎臓での再吸収阻害の両方が含まれる。腎臓からの再吸収は、主にオリゴペプチドトランスポ一ター（P E P T 2 ) を介して行われ、両化合物とも P E P T 2 の基質になることが知られている (Biochim. Biophys. Acta, 1235, 461-6, 1995) 。従って、 C E Xによつて引き起こされた C D Xの B Aの低下は、 P E P T 1及び P E P T 2 を介した C D Xの輸送を C E Xが阻害したことによるものであることが説明できる。腎臓に存在する P E P T 2の阻害が生体にどのような影響を及ぼすかは明らかにされていないが、慢性腎不全の食事療法という観点からは P E P T 1を介した直接の吸収阻害に限定したほうが望ましいと考えられる。しかし、 P E P T 1及び P E P T 2は、非常に類似した基質認識性を示すため、 P E P T 1を特異的に認識するような阻害剤の開発は困難であるとされていた。

腎不全による透析患者は増加傾向にあり、また糖尿病から透析療法に移行する患者数を合わせると膨大な数となり、それにかかる医療費は将来 1兆円を超えることが推測される。このような状況下では、腎疾患を発症させない予防医学及び腎不全を透析に至らせない保存期治療が重要である。本発明の課題は、患者の食事療法による Q〇L低下を防ぐことができる、消化管において非吸収性の組織特異的トランスポー夕一阻害剤や、かかる阻害剤を有効成分とする組織機能不全疾患治療薬及び慢性腎不全進行抑制治療薬を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するためには、 P E P T 2への認識を回避することができる、消化管非吸収性 P E P T 1阻害剤の使用が有効であると考え、また、高分子化合物は、一般的に消化管から吸収されないことから、 P E P T 1認識性を有する高分子化合物を設計することにより、 P E P T 1を選択的に阻害することが可能になるのではないかと考えた。そこで、構造的修飾を施した活性残基が膜貫通型トランスポー夕一との相互作用に優れていると期待される、超分子構造ポリ口タキサン ( P R X ) に着目し、上記 P E P T 1のリガンドであるジペプチド（V a 1 - L y s ) を超分子構造 P R Xに導入した化合物を作製し、鋭意研究した結果、上記化合物によりタンパク質の吸収を抑制し、さらにタンパク質摂取制限が必要となる慢性腎不全の進行を抑制することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。発明の開示

すなわち本発明は、組織特異的トランスポーターが認識するリガンド構造と、膜組織を透過できない高分子分子構造とをもつことからなることを特徴とする組織特異的トランスポー夕一機能阻害剤（請求項 1 )や、膜組織を透過できない高分子分子構造が、超分子構造であることを特徴とする請求項 1記載の組織特異的トランスポ一ター機能阻害剤（請求項 2 ) や、超分子構造が、多数の環状分子に線状分子が貫通し、該線状分子の両末端を嵩高い置換基でキヤップした口タキサン化合物であることを特徴とする請求項 2記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤 (請求項 3 ) や、環状分子が、シクロデキストリンであることを特徴とする請求項 3記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項 4 ) や、線状分子が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項 3又は 4記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項 5 ) や、嵩高い置換基が、 N—ベンジルォキシカルポ二ルー L一フエニルァラニンであることを特徴とする請求項 3〜 5のいずれか記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項 6 ) や、膜組織を透過できない高分子分子構造が、 α —シクロデキストリン構造であることを特徴とする請求項 1記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項 7 ) や、組織特異的トランスポーターが認識するリガンドが、有機ァニオン性物質、有機カチオン性物質、又はペプチド性物質であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の組織特異的トランスポー夕一機能阻害剤（請求項 8 ) や、組織特異的トランスポーターが、小腸特異的トランスポ一夕一であることを特徴とする請求項 1〜 8のいずれか記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項 9) や、小腸特異的トランスポー夕一が、オリゴペプチドトランスポー夕一 1 (P E P T 1 ) であることを特徴とする請求項 9記載の組織特異的トランスポ一夕一機能阻害剤（請求項 1 0 ) や、オリゴペプチドトランスポーター 1 (P E P T 1 ) が認識するペプチド性物質が、バリルリジン（V a l — L y s ) であることを特徴とする請求項 1 0記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項 1 1 ) に関する。

また本発明は、請求項 1〜 1 1のいずれか記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤を有効成分とすることを特徴とする組織機能不全疾患治療薬（請求項 1 2 ) や、請求項 1〜 1 1のいずれか記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤が夕ンパク質の吸収抑制剤であって、該抑制剤を有効成分とすることを特徴とする慢性腎不全進行抑制治療薬 (請求項 1 3) に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、ポリ口タキサンの合成手順を示す図である。

第 2図は、ぺプチドトランスポ一ターに認識されるバリルリジン誘導体の合成手順を示す図である。

第 3図は、本発明の組織特異的トランスポーター阻害剤である V a 1 _L y s —ポリ口タキサン結合体の合成手順を示す図である。

第 4図は、 H e L a— h P E P T l細胞による [³H] G l y— S a r の取り込みに対する V a 1 — L y s _ポリ口タキサンの阻害効果を示す図である。

第 5図は、 H e L a— h P E P T l細胞による [³H] G l y— S a r の取り込みに対する V a l _L y s—ポリ口タキサン又は V a 1 — L y s— 一サイクロデキストリンの前投与に対する効果を示す図である。第 6図は、ラットへのセフアキシレンの投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。

第 7図は、ラットへの V a l _L y s—ポリ口タキサン（N o . 2 ) の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。

第 8図は、ラッ卜への V a 1 — L y s —ポリ口タキサン（N o . 7 ) の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。

第 9図は、ラットに CDXと、セファレキシン又は V a l — L y s— ポリ口タキサン（N o . 2 ) とを投与したときの血漿中におけるセファドロキシルの濃度経時変化の結果を示す図である。

第 1 0図は、ラットへの V a l _L y s _ポリ口タキサン（N o . 7 ) の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。

第 1 1図は、ラットへの V a l — L y s—ポリ口タキサン（N o. 7 ) の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。

第 1 2図は、ラットへの V a l — L y s—ポリ口タキサン（N o. 7 ) の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。

第 1 3図は、ラットに CD Xを瞬間静注し、それと同時に V a l — L y s—ポリ口タキサン（No. 7 ) を経口投与した時の血漿中におけるセファドロキシルの濃度経時変化の結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明の組繳特異的トランスポーター機能阻害剤としては、組織特異的トランスポ一夕一が認識するリガンド構造と、膜組織を透過できない高分子分子構造とをもち、上記組織特異的トランスポーターの機能を阻害するものであればどのようなものでもよいが、生理的に安定した構造をとるものが好ましい。組織としては、小腸、腎臓、脳、肝臓、胎盤、滕臓、肺、胃、卵巣、精巣、脾臓、大腸、骨格筋、気道、骨髄、前立腺、心臓、子宮、脊髄、副腎、甲状腺等の組織を例示することができ、また、かかる組織において特異的に発現するトランスポ一夕一としては、表 1 〜 3に示されるトランスポー夕一を具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではない。

CO

o

≠2

^3 上記膜組織を透過できない高分子分子構造としては、小腸、腎臓、脳、肝臓、胎盤、塍臓、肺、胃、卵巣、精巣、脾臓、大腸、骨格筋、気道、骨髄、前立腺、心臓、子宮、脊髄、副腎、甲状腺等の生体膜組織から、透過できない又は透過しにくい高分子構造をとるものであればどのようなものでもよく、例えば、多数の環状分子に線状分子が貫通し、該線状分子の両末端を嵩高い置換基でキヤップしたポリ口タキサン化合物等の超分子構造や、ひ一シクロデキストリンを含む誘導体若しくは包接構造などを具体的に挙げることができる。上記環状分子としては、例えば、シクロデキストリン、 α , β , 又はアーシクロデキストリン、クラウンエーテル、サイクロフラクタン等の分子を具体的に挙げることができるがこれらに特に限定されるものではない。また、線状分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレンダリコール、若しくはポリェチレンダリコールとポリプロピレンダリコールとの共重合体、ポリアミノ酸、多糖類等の分子を例示することができるが、嵩高い置換基の導入が行えるポリエチレングリコールなどが好ましい。嵩高い置換基としては、上記環状分子の脱離を防止するものであればどのようなものでもよく、例えば、 Ν _ベンジルォキシカルポニル— L一フエ二ルァラニン、ァラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチォニン、プロリン、フエ二ルァラニン、トリブトファン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、ダリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システィン、リシン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかの単位若しくはこれらの誘導体、複数の単位からなるオリゴぺプチド等を具体的に挙げることができるが特に制限されるものではない。

本発明において組織特異的トランスポーターに認識されるリガンドとしては、有機ァニオン性物質、有機カチオン性物質、ペプチド性物質、アミノ基を有する物質等の物質を具体的に挙げることができ、例えば、

2 小腸に特異的に発現するトランスポーターであるオリゴペプチドトランスポーター 1 ( P E P T 1 ) に認識されるリガンドとしては、ジぺプチド、トリペプチド等のオリゴペプチドや、その構成アミノ酸残基に修飾を施した誘導体、セファドロキシル、セフチブテン等の i3—ラク夕ム抗生物質、カプトプリル等の A C E阻害剤、抗がん剤のべス夕チン、抗ゥィルス薬のバラシク口ビルなどを具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

本発明により提供される、組織機能不全疾患治療薬としては前記組織特異的トランスポーター機能阻害剤を、慢性腎不全進行抑制治療薬としてはタンパク質の吸収を抑制する組織特異的トランスポーター機能阻害剤を有効成分として含有するものを挙げることができ、これら治療薬は、経口、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内等により投与することができる形状のものが好ましい。投与すべき有効量は、治療薬の種類 ·組成、投与方法、患者の年齢や体重等を考慮して適宜決定することができ、これらを 1 日あたり 1〜数回投与することが好ましい。また、経口投与する場合、通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。この際、製剤に用いることができる担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明の組織特異的トランスポーター機能阻害剤と反応しない物質が用いられる。経口投与の仕方は、食事と同時に、或いは食事の前に予め投与しておくことができる。

また、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等を具体的に例示することができ、これらの製剤は常法に従って調製され、特に液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形態とすることもできる。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーテイングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチド修飾高分子を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。またこれらの製剤は、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。本発明の組織特異的トランスポーター機能阻害剤は、組織機能不全疾患又は慢性腎不全の症状改善用食品素材として、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン ·菓子類や、うどん、そば等の麵類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ゥ一ロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、みそ、しょう油、ドレツシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜へ配合し、機能性食品として摂取することもできる。

本発明の好適な実施例について以下に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

実施例 1 [ポリ口タキサン（P RX) の合成；図 1参照]

1 - 1 (ポリエチレングリコ一ルとーシクロデキストリンからなる擬ポリ口タキサンの調製）

α—シクロデキストリン（ a— C D) 飽和水溶液（ 1 0 0 gZ6 0 0 m l ) に超音波をかけながら、両末端をァミノ化したポリエチレンダリコール（P E G— BA， M n = 4 0 0 0 ) の水溶液（ 9. 1 4 g / 8 5 m 1 ) を滴下した。約 1時間超音波にあてながら撹拌後、一晩放置した。その後、遠心分離により沈殿物を回収し、 6 0 °C減圧下にて乾燥し、シクロデキストリンにポリエチレングリコール（P E G) が貫通した線状分子である擬ポリロタキサン 7 8. 1 3 gを調製した。

1一 2 (末端キャップ剤の調製）

4 ひ — C Dの脱離を防止する嵩高い置換基として N—ベンジルォキシカルポ二ルー L—フエ二ルァラニン（Z— L— P h e、 Zはべンジルォキシカルポ二ル基を表す）を導入するために、 Z— L— P h eのカルボキシル基の活性化を行った。 N—ヒドロキシスクシンイミド（HO S u) 3 8. 4 6 g ( 0. 3 3mo l ) 、及び Z— L— P h e l O O g ( 0. 3 3 m o 1 ) を、ジォキサン 8 5 0 m 1 中に溶解させた。次に、氷冷下にて N, N ' ージシクロへキシルカルポジイミド（D C C) 6 8. 9 0 g ( 0. 3 3 mo 1 ) を加え約一時間撹拌した。その後、冷蔵庫にー晚放置した。生じた沈殿物を除去後、上澄み液を減圧濃縮し、得られた濃縮液をジェチルエーテル中で再沈殿した。生じた沈殿物を常温で減圧乾燥後回収し、ジクロロメタンおよび石油ェ一テルを用いて再結晶した後、試料をろ過して減圧乾燥し、白色針状結晶の Z— L— P h eのスクシンィミドエステル（Z— L _ P h e—〇 S u) 1 0 5. 8 4 g ( 0. 2 6 mo 1 ) を得た。

1 — 3 (Z— L— P h e _〇 S uを用いたポリ口タキサンの合成）実施例 1 _ 1で得られた擬ポリロタキサン 2 4. 3 g ( 0. 6 8mm o 1 ) 、及び実施例 1 — 2で得られた Z— L— P h e—〇 S u 2 8. 8 g ( 7 2 mm o 1 ) を、ジメチルスルフォキシド 3 0 m 1 に加え、不均一状態で約 4. 5 日間撹拌した。なお、 Z— L— P h e— O S u (— O S u) と擬ポリ口タキサン末端アミノ基（― NH₂) とのモル比は、 5 0 ： 1の割合で行った。反応後、大量のエーテル中に投じ、生じた白色沈殿を減圧乾燥後回収した。未反応の Z— L— P h e _ 0 S u、 a - C D、及び P E G— B Aを取り除くため、アセトンおよび水によりそれぞれ 3回ずつ洗浄操作を行った。最終的に得られた試料を 6 0 °C減圧下にて乾燥し、擬ポリロタキサンの両末端を嵩高い置換基でキャップしたポリロタキサン（白色粉末） 1 3 gを得た。なお、合成したポリ口夕キサ

5 ンの構造解析は¹ HNMRスペクトル測定（Varian社製； 3 0 0 MH z F T-NMR) により行った。

実施例 2 [ペプチドトランスポーターに認識されるジペプチドの合成] ぺプチドトランスポーターに認識されるジぺプチドアナログの一つであるバリルリジン（ V a 1 - L y s ： V K ) 誘導体を A b e らの手法 (Bioconjugate Chem. 10, 24-31, 1999) に従い合成した（図 2参照）。 2 - 1 (B o c -V a 1 -L y s (C b z ) — O t _ B uの合成）第 3ブチルォキシカルポニル（B o c ) - V a 1 ( 2. 1 7 g , 1 0 mm ο 1 ) 、 ε —ベンジルォキシカルボ二ルリジン _ t e r t —プチルエステル塩酸塩 [L y s— (C b z ) — O t — B u ' HC L ( 3. 3 7 g， 1 0 mm o 1 ) ] 、 1—ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル（HOB t ) ( 4. 1 3 g , 2 0 mm ο 1 ) 、及びジメチルアミノビリジン（DMA P) ( 1. 9 3 g, 1 0 mm o 1 ) を、それぞれ 8 0m 1 の N， N—ジメチルホルムアミド（DMF) 中に溶解させ、 0 °Cにて 3 0分撹拌を行つた。その後、水溶性カルポジイミド塩酸塩（WS C · H C 1 ) ( 1. 9 3 g , l Ommo l ) を加えて更に 0 °Cで 2時間撹拌した後、室温にて 4時間撹拌して酢酸ェチルで希釈した。酢酸ェチルで希釈した溶液を、 0. 6 M クェン酸水溶液（ 1 0 0m l ) 、水（ 1 0 0m l ) 、飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液（ 1 0 0m l ) 、水（ 1 0 0 m l ) 、 1 0 % 食塩水（ 1 0 0 m l ) にて順次洗浄を行った。その結果、得られた油層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮後、カラムクロマトグラフィー (S i 0₂, 7 5 : 1のクロ口ホルム—メタノール）で精製した。溶出ピークを薄層クロマトグラフィーより確認し、得られた最初の画分を減圧濃縮 ·減圧乾燥して非結晶白色粉末の B o c -V a 1 - L y s (C b z ) - O t - B uを得た（ 3. 6 g，収率： 6 6 %) 。

2 - 2 (B o c— V a 1 — L y s— O t — B u · H C 1 の合成）実施例 2— 1で得られた B o c _V a l — L y s (C b z ) — O t — B uの C b z基を接触還元法で脱保護した。 H₂ガス存在下で、酢酸 1 5 0111 1 中に8 0 ( _¥ & 1 — 1^ 3 (C b z ) — O t _ B uを溶解した後、パラジウムカーボン（ 3 0 Omg) を加え 3日間撹拌した。パラジゥムカーボンをろ過にて取り除き、溶液を減圧濃縮し、濃縮液をィォン交換ク口マトグラフィ一にかけた。イオン交換体として DiaionWA- 30 (HC 1 f o r m) を使用し、展開溶媒はメタノール一水（ 1 0 ： 1 ) で行った。溶液を減圧濃縮した後、トルエンを用いて共沸し、白色固体の B o c— V a l — L y s— O t _B u · H C 1 を得た（ 2. 2 g , 収率： 5 1 %) 。

実施例 3 [V a l _ L y s—ポリ口タキサン結合体の合成；図 3参照] 3 - 1 (N, N—ジカルポ二ルイミダゾ一ルによるポリ口タキサン中の水酸基の活性化）

実施例 1で得られたポリ口タキサン 2 0 Omg (- OH： 3 mm o 1 ) を窒素雰囲気下、ジメチルスルフォキシド（DMS〇） 1 0 m l に溶解させた。完全に溶解後、 N， N—ジカルポ二ルイミダゾール (C D I ) を l O O Omg (6. 2 mm o 1 ) 投じ、撹拌を続けた。 3時間後、ェ —テル中での再沈殿より未反応の CD I を除去し、 CD I活性化ポリ口タキサン (CD I — P RX) 3 7 4mgを得た。なお、全水酸基全てに導入した場合を 1 0 0 %として、上記 C D I — P R Xの活性化率は 3 0 %であった。

3 - 2 (ポリ口タキサンへの V a 1 — L y sの導入）

上記 CD I — P RX 2 0 0mg (- OH ： 1. 8 mm o 1 ) を窒素雰囲気下にて DM S O 2 m 1 に溶解させ、実施例 2で得られた B o c— V a l — L y s—O t — B u . HC l 3 0 0mg ( 3. 3 mm o 1 ) と、 N, N一ジィソプロピルェチルアミン（D I P E A) を 7 0 0 1 (ぐ Z3. 5mmo 1 ) 加えて 2 4時間撹拌した。その後、ヒドロキエチル刀ス o

力ルバモイル（HE C) 基をポリ口タキサンへ導入し、水に対する溶解性を向上させるため、アミノエタノール (AME t ) を 2 m l ( 3 3 m mo 1 ) 加え、 24時間攪拌した。撹拌後、分画分子量 1 0 0 0の透析膜を用い、水中にて透析を行った。透析終了後、凍結乾燥を行い B o c - V a 1 - L y s -O t -B uを導入したポリ口タキサン（P RX) を回収した。この回収物を氷冷下、ジクロロメタン（D CM) 7 m l及びトリフルォロ酢酸（TF A) 3m 1 の混合溶液中に溶解し、 1時間撹拌して B o c基および 0 t _ B u基を除去した。その後、エーテル中での再沈殿を繰り返してサンプルを洗浄し、減圧乾燥して白色固体の V a 1 - L y s—ポリ口タキサン結合体（ 1 1 3mg) を得た。また、上記と同様の方法により、表 4及び表 5に示す量の各試薬を用いて、他の 6種類の V a l _L y s _ポリ口タキサン結合体（VK—P RX :ィ匕 1) と 2種類の V a 1 — L y s— ひ一 C D (VK— ひ一 CD) を合成した。

(表 4)

CDI-PRXに

おける OH Val-Lys DIPEA AMEt DMSO 合成量

、mmol) kmmol) (mmol) (ml) (mg)

(mmol)

1 3.17 3.21 3.5 2 198

2 3.02 6.31 7.2 2 195

3 3.20 0.69 6.9 33 2 93

4 3.29 6.55 3.5 33 2 95

5 3.29 6.54 5.0 33 2 80

6 3.07 6.21 7.5 33 2 37

7 1.76 3.25 3.5 33 2 113

8 (表 5)

CDI-PRXに

VK-a-CD Va卜し ys DIPEA AMEt DMSO 合成量おける OH基

No. (mmol) (mmol) (mmol) (ml) (mg)

(mmol)

1 5.56 0.62 2.68 5 297

2 5.56 0.62 2.68 5.6 5 338

(化学式 1 )

実施例 4 [V a l — L y s —ポリ口タキサン結合体のキャラクタリゼ一シヨン] -

4 - 1 (V a l — L y s—ポリ口タキサン結合体中の α - C D貫通数およびヒドロキエチルカルバモイル基導入数の算出）

上記 7種類の VK— P RX中の α— C D貫通数 (a— CD/P R X) を¹ HNMRスぺクトルの積分値から算出した。その結果を表 6に示す。 (表 6)

V -PRX α-CD/PRX Val-Lys/PRX AMEt/PRX No.

25,300 21

2 19,900 14

3 30,560 22 71 4 34,600 25 2 86 5 24,100 16 2 57 6 18,240 9 11 36

43,200 21 46 98

4 - 2 (アミノ酸分析法による VK— P RX及び VK 一 CD中の V a 1 -L y s導入数の定量）

実施例 3により得られた 7種類の VK— P RX及び 2種類の VK— — CDをそれぞれ、 6 N HC 1 に少量（ 1〜 2mg) 溶解させ、 N₂置換を行った。次に 1 1 0°Cにて約 2 2時間加熱分解させた。 HC 1 を完全に除去後、 0. 0 2 N HC 1 ( 2〜 4 m 1 ) にて希釈しサンプルとした。この作製したサンプルをアミノ酸分析計（日立アミノ酸分析形； L - 8 5 0 0 A) により定量した。かかるアミノ酸分析法により得られた VK— P R X又は VK— a;— C Dの両末端における P h e残基と V a 1 残基との組成から、 VK— P RX又は VK— K _ C Dの 1分子あたりの V a 1 一 L y s数（V a 1 — L y s /VK— P RX又は V a 1 - L y s /VK— ひ一 C D) を以下の 2つの式を用いて算出した（表 6及び表 7 ) < なお、かかる 2つの式は次のように導いた。また、表 6中の AME t Z P RXと表 7中の AM E t Za— CDは、 V X— P R X又は VK— a— CD中に導入されたアミノエタノール（AME t ) 分子数を、プロトン核磁気共鳴 H— NMR) スペクトル上に観察されるアミノエ夕ノール由来のメチレンピークとひ一 C D中のァノマ一位のメチンピークとの積分値の比から算出した。

(表 7)

V -a-CD

No. IV Val-Lys/a-CD A Et/a-CD

1 1,220 1

2 1,400 1 3

V a 1 — L y s — AME t— RXは、一分子あたり P h e残基を二分子有するので、測定するサンプル中に存在する V a 1 — L y s—ポリ口タキサン結合体のモル数（n_RX) は、サンプル中の P h e残基のモル数を n_{P h}。とすると式（ 1 ) となる。を n _{P h e}とすると式（ 1 ) となる。

(数式 1 ) n_RX=¾^ (1) また、 V a l — L y s —ポリ口タキサン結合体一分子あたりの V a 1 - L y s導入数（N_{V a l}— _{L y s}) は、 V a 1残基のモル数を n _Va ,とし、 V a 1 - L y s —ポリ口タキサン結合体のモル数を n _{R X}とすると式

( 2 ) となる。

(数式 2)

¹ Va l—Lys 、乙ノ

Π RX

実施例 5 [H e L a - h P E P T l細胞を用いた高分子 P E P T 1阻害剤に対する基質認識性の検討]

実施例 4で得られた VK_ P R X, 及びその構成成分である VK— a — CDの P E P T lへの認識性の検討を目的として、 h P E P T 1安定発現 H e L a (H e L a - h P E P T l ) 細胞を用いて [³H] G 1 y - S a rの取り込みに対する阻害効果を検討した。文献（Int. J. Cancer. 88, 274-80, 2000) 記載の方法で作製した H e L a _ h P E P T l細胞、又は H e L a— p c DNA (M o c k)細胞を、マルチディッシュ（Nunc 社製）に 1 0⁶細胞 Zゥエルで細胞を播種し、 3 7 °Cで 5 % C〇₂下ィンキュベ一ター（ヒラサヮ社製）で 4日間培養した。培養液は 1 0 % F C S (Gibco Laboratories 社製）、 2 mM L—グルタミン、及び 1 m g Zm 1 G 4 1 8 を含む D M E M (Dulbecco' s modified Eagle' s medium ; Gibco Laboratories社製）を用いた。培養後、培養液を吸引し、各細胞を 3 7 °Cの Hanks' balanced salt solution (H B S S ； 0. 9

2 5 2 mM C a C l ₂、 5. 3 6 mM KC 1 、ひ. 44 1 mM KH ₂ P 0₄、 0. 8 1 2mM Mg S 0₄、 1 3 6. 7mM N a C l、 0. 3 8 5 mM N a ₂HP 0₄、 2 5 mM D—グルコース、 l O mM ME S : p H 6. 0 ) 1 m lで 3回洗浄後、 5分間プレインキュベーションした。その後、図 4及び表 8に示す濃度の各阻害剤と、 [³H (G) ] G l y— S a r ( 4 7 6 n M) とを含む H B S Sを 2 5 1加え、 3 7 °Cで取り込み反応を開始させた。阻害剤 VK— P RX (N o. ：!〜 6) の濃度は最大溶解濃度を 5 0 0 以下で調製し、フィルターを用いて濾過したものを用いて取り込み反応を行った。なお、開始時に各ディッシュ内から反応溶液を 1 0 t 1のミニバイアルに分取し、液体シンチレーションカクテル（Clear-sol I、 Nacalai tesque 社製）を 4m l加えて液体シンチレ一シヨンカウンタ一（LSC- 5100、 Aloka Co. Ltd.社製）にて反応溶液中の放射活性を測定した。反応開始から 2分後に各ディッシュ中の反応溶液を吸引して取り除き、細胞を氷冷 HB S S (HE P E S ： p H 7. 4) l m 1で 3回洗うことにより反応を停止させた。その後、各ディッシュに 5 N N a OHを 2 5 0 1加えて細胞を可溶化させ（ 2時間以上）、 5 N HC 1 を 2 5 0 1加えて中和させた後、全量をミニバィアルに入れ液体シンチレ一シヨンカクテル（Clear- sol I、 Nacalai tesque社製）を 4m 1加えて細胞に取り込まれた放射活性を測定した。また、上記培養後における細胞タンパク質量を測定するために、培養後の細胞を可溶化後、 Bio- Rad Protein Assay 試薬（Bio_Rad Co.社製）を加えた後、 5 9 5 nmの吸光度を測定した。なお、標準物質としては B S A (bovine serum albumin) を用いた。以上の結果から、細胞内への [³H]G l y _ S a rの取り込み量 [eel 1/medium ratio( x 1 / g · p r o t e i n) ] を式（ 3 ) により求めた。その結果を図 4及び表 8 に示す。なお、図 4中のコントロールの値は、阻害剤非存在下で取り込み反応を行った結果を示す。これらのことから、 VK— P RX (N o. 1 , 2， 4, 6 ) により [³H]G 1 y— S a rの取り込みが有意に減少することがわかった。また、 VK— P RX (N o . 7 ) 及び VK—《— CDを用いた場合においても、濃度依存的に [³H]G 1 y— S a rの取り込みが阻害されることがわかった。しかし、 ¥ & 1 — 3が結合していない α— CDでは、有意な阻害効果は認められなかった。

(数式 3)

cell/medium ratio (細胞対培地薬液濃度比）（μし/ mg protein)

細胞に取り込まれた放射活性（dpm/well)

(3) 薬液中の放射活性濃度（dpm/mL) X蛋白質量（m_g protein/well)

(表 8)

コン卜ロールに対する阻害剤 (mM) 【3H】Gly_Sarの取リ込み量％

Gly-Sar 10 12.93 ± 2.45

Val-Lys 3 21.13 ± 1.80

VK-Qf-CD (No.1) 3 37.05 ± 1.52

VK-a-CD(No.2) 3 77.09 ± 5.67 or -CD 3 125.87 ±23^4

VK-PRX(No.l) <0.5 37.95 ± 1.82

VK-PRX (No.2) <0.5 76.68 ± 4.62

VK-PRX (No.3) <0.5 131.12 ± 3.75

VK-PRX (No.4) <0.5 67·32 ± 8.57

VK-PRX (No.5) <0.5 94.04 ± 4.21

VK-PRX (No.6) <0.5 7720 ± 3.12

VK-PRX (No.7) 1 52.93 ± 3.69

VK-PRX (No.7) 0.5 76.08 ± 5.82

VK-PRX (No.7) 0,3 83.95 ±10.78

VK-PRX (No.7) 0.1 104.43 ± 8.70 セフアド口キシル 10 27.69 ± 1.44 セファレキシン 10 70.12 ± 1.45

Gly 10 97.71 ± 7.10 実施例 6 [高分子 P E P T 1阻害剤のプレインキュベーションの効果]

VK— a— CDをポリ口タキサン化したときの P E P T 1への認識性の変化を検討することを目的として、 VK— P R X (N o . 7 ) 及び V K— Q!— CD (N o . 2 ) で細胞をあらかじめプレインキュベーションしたときの [³H] G l y— S a rの取り込みへの影響を h P E P T 1安定発現 H e L a細胞（H e L a— h P E P T l ) を用いて検討した。図 5に示す濃度の各阻害剤存在下又は非存在下で 3 0分間プレインキュべ —シヨンし（白いボックス）、反応溶液を除去した後、同じ濃度の阻害剤と [³H] G 1 y— S a r ( 4 7 6 n M) とを含む H B S S中で取り込み反応を行う以外は、実施例 5の方法と同様に行い [³H] G 1 y— S a rの取り込みに対する阻害効果を測定した（黒いボックス）。その結果を図 5に示す。なお、図中の M o c kは H e L a _ p c D N A 3細胞による取り込みを示す。このことから、 VK— P RX (N o . 7 ) 又は V K- α - C D (N o . 2 )のプレインキュベーションの有無によって、 [³ H] G 1 y - S a rの取り込みに変化がみられた。 VK— P RX (N o . 7 ) では有意な取り込みの減少が認められたのに対して、 VK— a;— C D (N o . 2) では有意な取り込みの増加が認められた。また、 VK— ひ — CD (N o . 2 ) を超分子化した VK— P R X (N o . 7) の方がより強い阻害効果がみられたが、 V a 1 — L y sが結合していない α— C Dによる阻害効果は認められなかった。

実施例 7 [セフアド口キシル（CDX) の体内動態変動による VK— P RXの吸収抑制効果の評価]

最近、腎臓のグルコーストランスポ一夕一阻害剤である T一 1 0 9 5 が、 S T Zラッ卜（Streptozotocin - induced diabetic rats) における高血糖状態を改善することが報告されている（Metabolism, 49, 990-5, 2000) 。このことは、トランスポーター機能を抑制し生理活性物質の移行を制御することによって、病態を改善することが可能となることを示唆するものであり、新たなドラッグターゲットとしても期待されている。また、ヒトにおいて、 P E P T 1の基質である、 0—ラクタム系抗生物質であるセフアド口キシル [ C D X ： cefadroxil (化 2 ) ] のバイオアペイラピリティ一が、一ラクタム系抗生物質であるセファレキシン [C ΕΧ ： cephalexin (化 3) ] の同時投与によって低下することが報告されている（Eur. J. Clin. Phar 1, 179-83, 1991) 。この報告は, P E P T 1を介した CD Xの消化管吸収を、同じく P E P T 1の基質である C E Xが抑制したことを示すものである。そこで、ラットを用いて P E P T 1阻害剤による C D Xの吸収抑制効果を検討した。

(化学式 2)

(化学式 3)

― H 7〜 8週齢の S D (Sprague-Dawley) 系ラット（雄性；日本 S L C社製）に 5 Omg/k gのネンブタール（ダイナポット（株）社製）を腹腔内投与して麻酔し、背位固定後、頸静脈及び大腿静脈（瞬時静注時のみ）に力二ユレ一シヨン [シリコンチューブ内径 X外径（ 0. 5 X 1 ) ] を施し、さらに、その先端を皮下に通し類背部から貫通後、切開部を鏠合した。その後、かかる動物を一晩（約 1 8時間）絶食させ、各薬剤を経口ゾンデ針により経口投与、あるいは、大腿静脈投与した。各薬剤投与後、経時的にカニュレーションチューブから血液 40 0 1 を採取し、以下の方法で血漿中における CD X濃度を測定し、式（4) 又は式（ 5) ，式（ 6 )、式（ 7 )及び式（ 8 )により、各パラメータ一を算出して WinNonlin (Scientific Consulting Inc.社製）のコンパートメントモデル解析法により解析した（辻彰編集、わかりやすい生物薬剤学，廣川書店， 1 7 8— 1 8 8， 1 9 9 6) 。

上記採取した血液 40 0 ^ 1 を同量の生理食塩水で置換し、 1. 5 m 1 のマイク口チューブに分注して遠心分離（ 1 2 0 0 0 r pm、 5分間、 4 ) を行い血漿を取り出した。血漿 1 5 0 1 を 1. 5m lのマイク口チューブに移し、さらに同量のァセトニトリルを加え除蛋白処理し、遠心（ 1 2 0 0 0 r pm、 5分間、 4 °C) 後、上清 2 5 0 1 を 1. 5 m 1 のマイクロチューブに移し蒸発乾固し、以下の H P L C条件にて再構築した。カラムは TSKgel ODS-80TS (東洋ソーダ社製）を、ポンプ、紫外 · 可視光検出器、インテリジェントオートサンプラー、及びカラムオーブンは 880- PU、 875-UV, AS- 1555-10、及び Co- 1565 (全て日本分光 (株）社製）を、インテグレ一タ一は Chromatopac C-R3A (島津製作所 (株）社製）を使用した。また、カラム温度 3 5°Cで、移動相に 7 %のァセトニトリル（0. 1 Mの酢酸緩衝液（ p H 3. 0 ) 及び 0. 0 1 M の 1—ペンタンスルホン酸ナトリウムを含む）を用いて、流速 0. 9m 1 /m i nで分離溶出し、波長 2 4 0 n mで検出し、血漿中における C D X濃度を求めた。

(数式 4 )

ka■ F · D{exp(-ke - t)-exp(-ka - 1)} . .

" Vd(ka-ke) 、 ) なお、式中の Cは血漿中における C D Xの濃度を、 Fは吸収率を、 D は投与量を、 k aは吸収速度定数を、 k eは消失速度定数を、 V dは分布容積を、 tは薬剤投与してから血液を採取した時間をそれぞれ表す。

(数式 5 )

C = A-exp (- -t) + B-exp( - j8 -t) (5)

ただし、 A = D ( k _{2 1}—ひ） /V _x ( β - a )

B = D ( k _{2 1} - β ) /V , ( a - β )

なお、式中のひは分布相の傾きを、 /3は消失相の傾きを、は中枢コンパ一トメントの分布容積をそれぞれ表す。

(数式 6 )

AUC₀__∞ =AUC₀_₆ + C₆/ke (6)

なお、式中の AU Cは血漿中薬物濃度一時間曲線下面積を、 C ₆は薬物投与 6時間後の血漿中濃度をそれぞれ表す。

(数式 7 )

CL = DoseZAUC。―_∞ (7)

なお、式中の C Lは全身クリアランスを、 D o s eは薬物投与量をそれぞれ表す。

(数式 8 )

Vd = CLZke (8)

7 - 1 (ラットを用いた C D Xの P E P T 1を介した輸送に対する C E Xの阻害効果）ヒトにおいて、 P E P T lの基質である C D Xのバイオアベイラピリティーが、 βーラクタム系抗生物質である C Ε Xの同時投与によって低下するということが報告されている（Eur. J. Clin. Pharmacol. , 1, 179-83, 1991) 。 V K— P R Xの P E P T 1阻害効果を明らかにすることを目的とし、薬剤として 2. 5 mgZk gの C DX (〇）、 5 mg/ k gの CDX (參）、又は、 2. 5 m g / k gの C D X及び 4 5 m g / k gの C E X (▲) をそれぞれ前記ラットに経口投与し、実施例 7記載の方法によりラットにおける C D Xの吸収を C E Xが抑制するかどうかを検討した。なお、 2. 5 m g Z k gの C D X及び 4 5 m g / k gの C E X (A) においては、 CDXの投与 3 0分前に C E Xをラットに経口投与した。上記各ラットにおける体内動態の各パラメ一夕一は、 CDX の血中濃度推移をもとに式（4) 、式（ 6) 、式（ 7 ) 及び式（ 8 ) を用いて算出し、評価した。その結果を図 6及び表 9に示す。なお、図及び表に示す値は、 3〜 4回の個別の実験により求められた平均値土 S . E . M. を表す。 CD Xを 2. 5 mgZk g又は 5 mgZk gで経口投与したときの結果から、 AU C。__∞及び Cm a に飽和現象が認められた。さらに、 CDXを 2. 5 mg/k g投与したときの吸収率が 8 6 % と十分なものであった。 C D Xは生体内で安定であることを含めて、 P E P T 1を介した吸収活性を評価するマ一力一化合物として C D Xが適切であるということが示された。また、 C E X (4 5 mg/k g) の前投与後に CDX ( 2. 5 mg/k g) を投与したとき、 C D X単独投与時と比較して血漿中濃度—時間曲線下面積（AU C。―_∞) は約 3 0 %減少し、吸収速度定数（k a) は 2. 4 2から 1. 5 3 h r— ¹に、最高血漿中濃度（Cm a x) は 0. 8から 0. 5 ^ g Zm 1 にそれぞれ有意に減少した。以上の結果から、ヒトにおいての報告がラットで再現された。 (表 9 ) 投与量（mg/kg) 2.5 5 2.5 + 45 ka (hr-1) 2.42 ± 0.08 2.09 ± 0.23 1.53 ±0.27* ke (hr-1) 0.33 ± 0.02 0.31 + 0.03 0.37 ± 0.03 Tmax (hr) 0.95 ± 0.03 1.09 ±0.08 1.25 ±0.13 Cmax (yg/mし) 0.80 ± 0.03 0.56 ± 0.07 0.50 ± 0.04 AUC₀.oo (Mg^emin/mL) 198 ±4.82 162 ±13.3 144 + 5.21

7 - 2 (VK_ P R Xタイプによる吸収抑制効果の変化）

次に、薬剤として 5 mg/k gの CD Xのみ（〇）、又は、 1 Omg Zk gの VK— P RK [0. 1 %のポリアクリル酸ナトリウム（PAN A) 塩水に懸濁した VK— P RK] 及び 5 mg/k gの CD X (秦）を用いて、前記ラットに経口投与し、実施例 7記載の方法によりラットにおける C D Xの吸収を V K— P R Xが抑制するかどうかを検討した。なお、上記 VK— P RKは、 5mgZk gの CDX (秦）を投与する 3 0 分前に投与した。その際、 CDXの血中濃度推移をもとに式（4) 、式 (6) 、式（ 7) 及び式（ 8) を用いて体内動態の各パラメ一夕ーを算出し、評価した。 VK— P RK (N o. 2 ) を用いた場合の結果を図 7 及び表 1 0に、 VK— P RK (N o. 7 ) を用いた場合の結果を図 8及び表 1 1に示す。なお、図に示す値は 2〜 4回の個別の実験により求められた平均値士 S . E. M. を、表に示す値は 3回の個別の実験により求められた平均値土 S . E. M. を表す。 VK— P RK (N o. 2 ) あるいは VK— P RK (N o . 7 ) を CDXと同時投与したが、どちらも CDX単独投与時と比較して AUC。―_∞に有意な差は認められなかった < また、その他のパラメ一夕一についても同様に有意な差は認められなか' つた。これらは、上記 CDX ( 5 mg/k g) の投与量では、既に消化管吸収に飽和が生じているため VK— P RX (N o 2) の効果が検出しにくい条件であったことが考えられる。

(表 1 0) パラメーター CDX CDX + VK-RX (2) ka (hr¹) 1.50 ±0.24 3.21 ±0.18 ke (hr¹) 0.54 ±0.06 0.49 ±0.10

Tmax (hr) 1.13±0.11 0.70 ± 0.02

Cmax ( g/m ) 1.22 + 0.08 1.17 ±0.28

AUC₀.∞(Mg*min/mL) 272 ± 9.27 244 ± 93.4

1 1 )

パラメータ一 CDX CDX + VK-RX (7) ka (hH) 1.50 + 0.24 3.33 ± 0.00 ke (hr-" 0.54 ±0.06 0.63 ± 0.25

Tmax (hr) 1.13±0.11 0.64 ±0.10

Cmax ( g/mL) 1.22 ±0.08 1.04±0.11

AUC₀._∞(yg'min/mL) 272 ± 9.27 220 ± 20.2

7— 3 (VK— P RX投与量とその効果）

実施例 7記載の方法と同様に、 5mg/k gの CDXのみ（〇）、 1 Omg/k gの CEX及び 5mgZk gの CDX (▲) 、又は、 5. 7 mgZk gの VK— P RK (N o . 2 ) 及び 5mgZk gの CDX (秦）を同時にラッ卜に経口投与し、体内動態の各パラメ一夕一を算出し、評価した。その結果を図 9及び表 1 2に示す。なお、図及び表に示す値は 2〜 4回の個別の実験により求められた平均値土 S . E. M. を表す。

1 OmgZk gの VK— P RX (N o. 2 ) を CDXと同時に投与した場合（図 7及び表 1 0) と同様に、 5. 7mg/k gの VK— P RX (N o . 2 ) を C DXと同時投与しても、 CD X単独投与時と比較して AU C。-_∞に有意な差は認められなかった。また、その他のパラメーターについても同様に有意な差は認められなかった。

(表 1 2)

ペラメータ- CDX CDX + CEX CDX + VK-PRX 12) ka (hr-1) 1.50 ± 0.24 2.41 ± 0.49 1.37 ± 0.73 ke (hr-1) 0.54 ±0.06 0.68 + 0.19 0.49 ±0.13

Tmax (hr) 1.13 ±0.11 0.79 ± 0.07 1.32 ±0.29 Cmax ( g/mL) 1.22 ± 0.08 1.29 ± 0.21 1.32 ± 0.08

272 ± 9.27 247 + 23.6 337 + 29.9

7 - 4 (懸濁化剤による VK— P RX効果の影響）

次に各薬剤を懸濁化剤である 0. 1 %のポリアクリル酸ナトリウム（P ANA) 塩水に懸濁した場合（図 1 0 ) と、懸濁しない場合（図 1 1 ) との VK— P の効果の違いを調べるために、 1 O mgZk gの VK — P RK (N o. 7 ) 及び 2. 5 mgZk gの CDX (·) 、又は、 2. 5 mgZk gの CDXのみを経口投与し、各ラッ卜における体内動態の各パラメータ一を実施例 7記載の方法と同様に算出し、評価した。なお、 VK_ P の経口投与は CDX投与 3 0分前に行った。 PANAに懸濁した場合の結果を図 1 0及び表 1 3に、懸濁していない場合を図 1 1 及び表 1 4に示す。なお、図 1 0、図 1 1及び表 1 4に示す値は 4回の、表 1 3に示す値は 3回の個別の実験により求められた平均値土 S . E. M. を表す。これらの結果から、 VK— P RK (N o . 7 ) を懸濁化剤に溶解させ C DXと同時投与しても、 CDX単独投与時と比較して AU < ₀—_∞に有意な差が認められず、その他のパラメータ一についても同様に有意な差が認められなかった。一方、 P ANAに懸濁させずに同じ条件で VK— P RKを投与したとき AUC。__∞は有意に減少することがわかった。さらに、 VK— P RKの同時投与によって k aは 2. 4 2から 1. 7 5 h r— ¹に、 Cma xは 0. 8から 0. 6 4 ^ g/m l にそれぞれ有意に減少し、 Tma xは 0. 9 5から 1. 1 8 h rに有意に延長していた。しかし、消失速度定数（k e ) については有意な差は認められなかった。

(表 1 3)

パラメ一ター CDX CDX + VK-RX (7) ka (hr¹) 2.12 ± 0.45 1.88 ±0.03

ke (h「 0.37 ± 0.02 0.33 + 0.02

Tmax (hr) 1.04 ±0.12 1.13 + 0.04

Cma ( g/mL) 0.76 ± 0.04 0.69 ± 0.02

AUC₀-oo(pg*min/mL) 186 ± 9.15 188 ±7.42

4)

パラメ一タ一 CDX CDX + VK-RX (7) ka (hr¹) 2.42 ± 0.08 1.75 ± 0.19

ke (hr^-1) 0.33 ± 0.02 0.34 ±0.03

Tmax (hr) 0.95 ±0.03 1.18 + 0.05

Cmax ( g/mL) 0.80 ±0.03 0.64 ±0.05

AUCQ.OO (yg*min/mL) 198 ±4.82 175 + 6.26

7 - 5 (VK— P R Xの前投与の有効性）

また、 VK— P RXの前投与の有効性についても調べてみた。 2. 5 mg/k gの CDXと 1 Omg/k g VK— P RX (N o . 7 ) とを同時に経口投与した場合（書）、又は、 2. 5 mgZk gの CDXのみを経口投与した場合（〇）の体内動態の各パラメーターを、実施例 7記載の方法と同様に算出し、評価した。その結果を図 1 2及び表 1 5に示す。なお、図に示す値は 3回の、表に示す値は 4回の個別の実験により求められた平均値土 S . E. M. を表す。その結果、 CDXと同時に VK— P RX (N o. 7 ) を投与したものは、 CDX単独投与時のものと比較して AUC。__∞に有意な差は認められなかった。しかしながら、 VK— P RX (N o. 7 ) を前投与し、 3 0分後に CDXを投与した場合（図 1 1及び表 1 4) では、 AU C _Q__∞に有意な減少が認められ、また、前投与の有無に関わらず k aの有意な減少が認められた。

(表 1 5)

パラメータ一 CDX CDX + VK-RX (7) ka (hr¹) 2.42 ± 0.08 1.29 + 0.28

ke (hr -¹) 0.33 + 0.02 0.57 + 0.13

Tmax (h ) 0.95 + 0.03 1.18 + 0.08

Cmax ( g/mL) 0.80 + 0.03 0.78 ± 0.08

AUCQ.OO (Mg*min/mL) 198 + 4.82 175 + 9.98 実施例 8 [VK— P RXの静注後の CDX体内動態への影響]

VK- P RXは高分子化合物であることから、消化管吸収を受けないものと考えられる。しかし、経口投与した C EXが CDXの排泄を促進することも知られており、 VK— P RXが CDXの AUC。―_∞を低下させた作用が必ずしも吸収性低下のみでは説明できない。一方、 CDXは腎臓からの再吸収に非線形性があることが知られている（Drug Metab. Dispos. 21, 215-7, 1993、 Drug Metab. Dispos. 22, 447-50, 1994) 。また、その再吸収にはオリゴペプチドトタンスポーターが関与している。ぞこで、 2. 5mg/k gの CDXを瞬間静注し、同時に l OmgZk gの VK— P RX (N o . 7 ) [生理食塩水に溶解した VK— P R K] を経口投与したラット（〇）における C DXのクリアランス（C L ：腎排泄）に対する影響を、 2. 5mg/k gの CDXを瞬間静注したラット（拿）と比較するため、実施例 7記載の方法で体内動態の各パラメ一夕一を算出し、評価した（図 1 3及び表 1 6) 。なお、図及び表に示す値は 3回の個別の実験により求められた平均値土 S . E. M. を表す。その結果、 VK— P RXの投与によって CD Xの血漿中濃度推移は変化せず、前記 AUC。―_∞変化は腎の排泄 ·再吸収過程ではなく、消化管吸収への影響であることが明らかとなった。また、既に P RXに担持されたべプチドの物理的安定性が向上することが明らかにされており（Pharm. Res. 16， 1331-1343, 1999) 、得られた結果は V K— P R Xが消化管吸収を受けないかあるいは吸収されにくい化合物であることを支持するものである。以上の結果から、高分子 P E P T 1阻害剤が非吸収性化合物として P E P T 1を介した吸収を阻害することが明らかとなった。この結果は、 P E P T 1を介した蛋白質の吸収抑制へと繋がるものである。

(表 1 6)

' ラメ一タ- CDX CDX + VK-RX (7)

AUC₀.∞( g*min/mL) 229 ± 8.41 222 ± 5.09

Vdss (mL) 162 ±8.99 134+ 10.3

CLtot (mlJmin) 11.0 ±0.41 11.3 + 0.26

ke (hr¹) 4.10 + 0.28 5.12 ±0.46 産業上の利用可能性 ' 本発明の組織特異的トランスポーター阻害剤は、小腸から吸収されない、又は吸収されにくいため、小腸からの栄養物の吸収を特異的に低下させることにより組織機能不全疾患又は腎不全の患者の食事療法による QOL低下を防ぐことができる。また、かかる組織特異的トランスポー夕一阻害剤は、腎疾患等の組織疾患を発症させない予防医学及び腎不全を透析に至らせない保存期治療に有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 組織特異的トランスポーターが認識するリガンド構造と、膜組織を透過できない高分子分子構造とをもつことからなることを特徴とする組織特異的トランスポーター機能阻害剤。

2 . 膜組織を透過できない高分子分子構造が、超分子構造であることを特徴とする請求項 1記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤。

3 . 超分子構造が、多数の環状分子に線状分子が貫通し、該線状分子の両末端を嵩高い置換基でキヤップした口タキサン化合物であることを特徴とする請求項 2記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤。

4 . 環状分子が、シクロデキストリンであることを特徴とする請求項 3 記載の組織特異的トランスポ一夕一機能阻害剤。

5 . 線状分子が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項 3又は 4記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤。

6 . 嵩高い置換基が、 N _ベンジルォキシカルポニル _ L一フエニルァラニンであることを特徴とする請求項 3〜 5のいずれか記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤。

7 . 膜組織を透過できない高分子分子構造が、 a一シクロデキストリン構造であることを特徴とする請求項 1記載の組織特異的トランスポー夕一機能阻害剤。

8 . 組織特異的トランスポーターが認識するリガンドが、有機ァニオン性物質、有機カチオン性物質、又はペプチド性物質であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の組織特異的トランスポー夕一機能阻害剤。

9 . 組織特異的トランスポーターが、小腸特異的トランスポーターであることを特徴とする請求項 1〜 8のいずれか記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤。

1 0. 小腸特異的トランスポ一ターが、オリゴペプチドトランスポ一タ一 1 (P E P T 1 ) であることを特徴とする請求項 9記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤。

1 1. オリゴペプチドトランスポーター 1 (P E P T 1 ) が認識するべプチド性物質が、バリルリジン（V a 1 — L y s ) であることを特徴とする請求項 1 0記載の組織特異的卜ランスポーター機能阻害剤。

1 2. 請求項 1〜1 1のいずれか記載の組織特異的トランスポー夕一機能阻害剤を有効成分とすることを特徴とする組織機能不全疾患治療薬。

1 3. 請求項 1〜1 1のいずれか記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤がタンパク質の吸収抑制剤であって、該抑制剤を有効成分とすることを特徴とする慢性腎不全進行抑制治療薬。