JP3942846B2 - 組織特異的トランスポーター阻害剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組織特異的トランスポーターが認識するリガンド構造と、膜組織を透過できない高分子分子構造とをもつ組織特異的トランスポーター機能阻害剤、及びかかる組織特異的トランスポーター機能阻害剤を有効成分とする組織機能不全疾患治療薬又は慢性腎不全進行抑制治療薬等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、透析患者は増加傾向にあり、将来、糖尿病から透析療法に移行する患者の数を合わせると莫大な数にのぼることが予想されており、透析療法にかかる医療費は１兆円を遙かに越えることが推定されている。これらのことから、腎疾患を発症させない予防医学及び腎不全を透析に至らせない保存期治療が重要とされている。慢性腎不全患者における腎障害の有効な治療法は確立しておらず、現在までのところ、低タンパク食事療法やＡＣＥ阻害薬のような抗高血圧薬の投与が行われている（Am. J. Cardiol. 59, 66A-71A, 1987、Am. J. Kidney. 20, 443-57, 1992、BMJ 304, 216-20, 1992、Ann. Intern. Med. 124, 627-32, 1996）。上記低タンパク食療法は慢性腎不全の進行を抑制するための有効な手段とされ、現在広く実施されているが、食事制限は患者のquality of life（ＱＯＬ）やコンプライアンスの問題を抱えているため、タンパク質の経口吸収を抑制する等の新しい治療戦略が求められている。最近、高脂血症治療の新しい戦略として、小腸に存在する胆汁酸トランスポーターを阻害することによってコレステロールの生合成を抑制するということが報告され注目を集めている（J. Pharmacol. Exp. Ther. 293, 315-20, 2000）。これと同様に、タンパク質の消化管吸収を特異的な阻害剤によって抑制することが可能であると期待される。
【０００３】
本発明者らは、以前、摂取されたタンパク質が、消化管内でアミノ酸とオリゴペプチドにまで分解し、小腸から吸収されることや、かかる吸収が小腸上皮細胞刷子縁膜に存在する特異的なトランスポーターによって行われることを報告している（Pharm. Res. 13, 963-77, 1996）。上記分解されたアミノ酸は複数のトランスポーターによって輸送されるが、オリゴペプチドはＰＥＰＴ１等のオリゴペプチドトランスポーターによって輸送され、ジペプチド又はトリペプチド特異的に吸収される（J. Biol. Chem. 270, 6456-63, 1995）。小腸におけるタンパク質の消化産物の吸収は、アミノ酸よりもペプチドの方が高いことが知られている（Gastroenterology 113, 332-40, 1997）。以上のことから、ＰＥＰＴ１阻害剤は、食餌中のタンパク質の吸収を抑制することができ、食事療法によってＱＯＬが低下している患者にとって有用であると考えられる。
【０００４】
１９９４年以降、ウサギ、ヒト及びラットの小腸からＰＥＰＴ１遺伝子がクローニングされ（J. Biol. Chem. 270, 6456-63, 1995、Nature 368, 563-6, 1994、J. Pharma. Exp. Ther. 275, 1631-7, 1995、Biochim. Biophys. Acta, 1305, 34-8, 1996）、ＰＥＰＴ１を介した輸送研究が急速に発展してきた。上記ラット小腸由来のＰＥＰＴ１遺伝子は本発明者らが初めてクローニングし（Biochim. Biophys. Acta, 1305, 34-8, 1996）、免疫組織化学的手法により小腸上皮細胞刷子縁膜側に局在していることを明らかにしている（FEBS Lett. 392, 25-9, 1996）。また、ＰＥＰＴ１は、β−ラクタム系抗生物質などのペプチド類似構造を有する化合物のみならず（Pharm. Res. 13, 963-77, 1996）、分子内にペプチド結合を持たない抗ウイルス薬バラシクロビル（valacyclovir） などの化合物も認識し、輸送することが報告されている（Biochem. Biophys. Res. Commun. 250, 246-51, 1998、J. Clin. Invest. 101, 2761-7, 1998、J. Biol. Chem. 273, 20-2, 1998）。以上のようにＰＥＰＴ１は幅広い基質認識性を示すが、その分子認識性については未だ解明されておらず、現在のところ、ＰＥＰＴ１の基質認識には部分的構造のみならず分子全体の認識が関与しているのではないかと考えられている。一方、腎臓からクローニングされたＰＥＰＴ２（Biochim. Biophys. Acta, 1235, 461-6, 1995、Biochim. Biophys. Acta, 1280, 173-7, 1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 284-9, 1996）は、腎臓の近位尿細管上皮細胞刷子縁膜側に局在しているが、ＰＥＰＴ１と類似した基質認識性を有しており、オリゴペプチドやペプチド様化合物の再吸収に働いている。また、寄与は小さいが上記ＰＥＰＴ１は腎臓においても発現していることが知られている（Am. J. Physiol. 276, F658-65, 1999）が、ＰＥＰＴ２の小腸における発現は認められていない。
【０００５】
ヒトにおいて、β−ラクタム系抗生物質であり、ＰＥＰＴ１の基質であるcefadroxil（ＣＤＸ）のバイオアベイラビリティー（ＢＡ）が、同様にＰＥＰＴ１によって認識されるβ−ラクタム系抗生物質であるcephalexin（ＣＥＸ）の同時投与によって低下するということが報告されている（Eur. J. Clin. Pharmacol. 41, 179-83, 1991）。バイオアベイラビリティーの指標としてのＡＵＣ（Area Under the plasma concentration Curve）がＣＥＸによって低下したメカニズムにはＣＤＸの小腸での吸収と腎臓での再吸収阻害の両方が含まれる。腎臓からの再吸収は、主にオリゴペプチドトランスポーター（ＰＥＰＴ２）を介して行われ、両化合物ともＰＥＰＴ２の基質になることが知られている（Biochim. Biophys. Acta, 1235, 461-6, 1995）。従って、ＣＥＸによって引き起こされたＣＤＸのＢＡの低下は、ＰＥＰＴ１及びＰＥＰＴ２を介したＣＤＸの輸送をＣＥＸが阻害したことによるものであることが説明できる。腎臓に存在するＰＥＰＴ２の阻害が生体にどのような影響を及ぼすかは明らかにされていないが、慢性腎不全の食事療法という観点からはＰＥＰＴ１を介した直接の吸収阻害に限定したほうが望ましいと考えられる。しかし、ＰＥＰＴ１及びＰＥＰＴ２は、非常に類似した基質認識性を示すため、ＰＥＰＴ１を特異的に認識するような阻害剤の開発は困難であるとされていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
腎不全による透析患者は増加傾向にあり、また糖尿病から透析療法に移行する患者数を合わせると膨大な数となり、それにかかる医療費は将来１兆円を超えることが推測される。このような状況下では、腎疾患を発症させない予防医学及び腎不全を透析に至らせない保存期治療が重要である。本発明の課題は、患者の食事療法によるＱＯＬ低下を防ぐことができる、消化管において非吸収性の組織特異的トランスポーター阻害剤や、かかる阻害剤を有効成分とする組織機能不全疾患治療薬及び慢性腎不全進行抑制治療薬を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するためには、ＰＥＰＴ２への認識を回避することができる、消化管非吸収性ＰＥＰＴ１阻害剤の使用が有効であると考え、また、高分子化合物は、一般的に消化管から吸収されないことから、ＰＥＰＴ１認識性を有する高分子化合物を設計することにより、ＰＥＰＴ１を選択的に阻害することが可能になるのではないかと考えた。そこで、構造的修飾を施した活性残基が膜貫通型トランスポーターとの相互作用に優れていると期待される、超分子構造ポリロタキサン（ＰＲＸ）に着目し、上記ＰＥＰＴ１のリガンドであるジペプチド（Ｖａｌ−Ｌｙｓ）を超分子構造ＰＲＸに導入した化合物を作製し、鋭意研究した結果、上記化合物によりタンパク質の吸収を抑制し、さらにタンパク質摂取制限が必要となる慢性腎不全の進行を抑制することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、オリゴペプチドトランスポーター１（ＰＥＰＴ１）が認識するジペプチド又はトリペプチドと、膜組織を透過できない高分子分子構造とをもち、前記高分子分子構造が、多数のシクロデキストリンに線状分子が貫通し、該線状分子の両末端を嵩高い置換基でキャップしたロタキサン化合物構造であることを特徴とする組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項１）や、線状分子が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項２）や、嵩高い置換基が、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンであることを特徴とする請求項１又は２記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項３）や、オリゴペプチドトランスポーター１（ＰＥＰＴ１）が認識するジペプチド又はトリペプチドが、バリルリジン（Ｖａｌ−Ｌｙｓ）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項４）に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の組織特異的トランスポーター機能阻害剤としては、組織特異的トランスポーターが認識するリガンド構造と、膜組織を透過できない高分子分子構造とをもち、上記組織特異的トランスポーターの機能を阻害するものであればどのようなものでもよいが、生理的に安定した構造をとるものが好ましい。組織としては、小腸、腎臓、脳、肝臓、胎盤、膵臓、肺、胃、卵巣、精巣、脾臓、大腸、骨格筋、気道、骨髄、前立腺、心臓、子宮、脊髄、副腎、甲状腺等の組織を例示することができ、また、かかる組織において特異的に発現するトランスポーターとしては、表１〜３に示されるトランスポーターを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１１】
【表１】
【表２】
【表３】
【００１２】
上記膜組織を透過できない高分子分子構造としては、小腸、腎臓、脳、肝臓、胎盤、膵臓、肺、胃、卵巣、精巣、脾臓、大腸、骨格筋、気道、骨髄、前立腺、心臓、子宮、脊髄、副腎、甲状腺等の生体膜組織から、透過できない又は透過しにくい高分子構造をとるものであればどのようなものでもよく、例えば、多数の環状分子に線状分子が貫通し、該線状分子の両末端を嵩高い置換基でキャップしたポリロタキサン化合物等の超分子構造や、α−シクロデキストリンを含む誘導体若しくは包接構造などを具体的に挙げることができる。上記環状分子としては、例えば、シクロデキストリン、α，β，又はγ−シクロデキストリン、クラウンエーテル、サイクロフラクタン等の分子を具体的に挙げることができるがこれらに特に限定されるものではない。また、線状分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、若しくはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、ポリアミノ酸、多糖類等の分子を例示することができるが、嵩高い置換基の導入が行えるポリエチレングリコールなどが好ましい。嵩高い置換基としては、上記環状分子の脱離を防止するものであればどのようなものでもよく、例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リシン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかの単位若しくはこれらの誘導体、複数の単位からなるオリゴペプチド等を具体的に挙げることができるが特に制限されるものではない。
【００１３】
本発明において組織特異的トランスポーターに認識されるリガンドとしては、有機アニオン性物質、有機カチオン性物質、ペプチド性物質、アミノ基を有する物質等の物質を具体的に挙げることができ、例えば、小腸に特異的に発現するトランスポーターであるオリゴペプチドトランスポーター１（ＰＥＰＴ１）に認識されるリガンドとしては、ジペプチド、トリペプチド等のオリゴペプチドや、その構成アミノ酸残基に修飾を施した誘導体、セファドロキシル、セフチブテン等のβ−ラクタム抗生物質、カプトプリル等のＡＣＥ阻害剤、抗がん剤のベスタチン、抗ウイルス薬のバラシクロビルなどを具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
本発明により提供される、組織機能不全疾患治療薬としては前記組織特異的トランスポーター機能阻害剤を、慢性腎不全進行抑制治療薬としてはタンパク質の吸収を抑制する組織特異的トランスポーター機能阻害剤を有効成分として含有するものを挙げることができ、これら治療薬は、経口、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内等により投与することができる形状のものが好ましい。投与すべき有効量は、治療薬の種類・組成、投与方法、患者の年齢や体重等を考慮して適宜決定することができ、これらを１日あたり１〜数回投与することが好ましい。また、経口投与する場合、通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。この際、製剤に用いることができる担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明の組織特異的トランスポーター機能阻害剤と反応しない物質が用いられる。経口投与の仕方は、食事と同時に、或いは食事の前に予め投与しておくことができる。
【００１５】
また、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等を具体的に例示することができ、これらの製剤は常法に従って調製され、特に液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形態とすることもできる。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチド修飾高分子を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。またこれらの製剤は、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００１６】
本発明の組織特異的トランスポーター機能阻害剤は、組織機能不全疾患又は慢性腎不全の症状改善用食品素材として、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜へ配合し、機能性食品として摂取することもできる。
【００１７】
【実施例】
本発明の好適な実施例について以下に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例１［ポリロタキサン（ＰＲＸ）の合成；図１参照］
１−１（ポリエチレングリコールとα−シクロデキストリンからなる擬ポリロタキサンの調製）
α−シクロデキストリン（α−ＣＤ）飽和水溶液（１００ｇ／６００ｍｌ）に超音波をかけながら、両末端をアミノ化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＢＡ，Ｍｎ＝４０００）の水溶液（９．１４ｇ／８５ｍｌ）を滴下した。約１時間超音波にあてながら撹拌後、一晩放置した。その後、遠心分離により沈殿物を回収し、６０℃減圧下にて乾燥し、シクロデキストリンにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が貫通した線状分子である擬ポリロタキサン７８．１３ｇを調製した。
【００１８】
１−２（末端キャップ剤の調製）
α−ＣＤの脱離を防止する嵩高い置換基としてＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｚはベンジルオキシカルボニル基を表す）を導入するために、Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅのカルボキシル基の活性化を行った。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）３８．４６ｇ（０．３３ｍｏｌ）、及びＺ−Ｌ−Ｐｈｅ１００ｇ（０．３３ｍｏｌ）を、ジオキサン８５０ｍｌ中に溶解させた。次に、氷冷下にてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）６８．９０ｇ（０．３３ｍｏｌ）を加え約一時間撹拌した。その後、冷蔵庫に一晩放置した。生じた沈殿物を除去後、上澄み液を減圧濃縮し、得られた濃縮液をジエチルエーテル中で再沈殿した。生じた沈殿物を常温で減圧乾燥後回収し、ジクロロメタンおよび石油エーテルを用いて再結晶した後、試料をろ過して減圧乾燥し、白色針状結晶のＺ−Ｌ−Ｐｈｅのスクシンイミドエステル（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ）１０５．８４ｇ（０．２６ｍｏｌ）を得た。
【００１９】
１−３（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕを用いたポリロタキサンの合成）
実施例１−１で得られた擬ポリロタキサン２４．３ｇ（０．６８ｍｍｏｌ）、及び実施例１−２で得られたＺ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ２８．８ｇ（７２ｍｍｏｌ）を、ジメチルスルフォキシド３０ｍｌに加え、不均一状態で約４．５日間撹拌した。なお、Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ（−ＯＳｕ）と擬ポリロタキサン末端アミノ基（−ＮＨ2）とのモル比は、５０：１の割合で行った。反応後、大量のエーテル中に投じ、生じた白色沈殿を減圧乾燥後回収した。未反応のＺ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ、α−ＣＤ、及びＰＥＧ−ＢＡを取り除くため、アセトンおよび水によりそれぞれ３回ずつ洗浄操作を行った。最終的に得られた試料を６０℃減圧下にて乾燥し、擬ポリロタキサンの両末端を嵩高い置換基でキャップしたポリロタキサン（白色粉末）１３ｇを得た。なお、合成したポリロタキサンの構造解析は1ＨＮＭＲスペクトル測定（Varian社製；３００ＭＨｚ ＦＴ−ＮＭＲ）により行った。
【００２０】
実施例２［ペプチドトランスポーターに認識されるジペプチドの合成］
ペプチドトランスポーターに認識されるジペプチドアナログの一つであるバリルリジン（Ｖａｌ−Ｌｙｓ：ＶＫ）誘導体をＡｂｅらの手法（Bioconjugate Chem. 10, 24-31, 1999）に従い合成した（図２参照）。
【００２１】
２−１（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−Ｏｔ−Ｂｕの合成）
第３ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ（２．１７ｇ，１０ｍｍｏｌ）、ε−ベンジルオキシカルボニルリジン−ｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩［Ｌｙｓ−（Ｃｂｚ）−Ｏｔ−Ｂｕ・ＨＣＬ（３．３７ｇ，１０ｍｍｏｌ）］、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（４．１３ｇ，２０ｍｍｏｌ）、及びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１．９３ｇ，１０ｍｍｏｌ）を、それぞれ８０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解させ、０℃にて３０分撹拌を行った。その後、水溶性カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）（１．９３ｇ，１０ｍｍｏｌ）を加えて更に０℃で２時間撹拌した後、室温にて４時間撹拌して酢酸エチルで希釈した。酢酸エチルで希釈した溶液を、０．６Ｍ クエン酸水溶液（１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）、１０％ 食塩水（１００ｍｌ）にて順次洗浄を行った。その結果、得られた油層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮後、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2，７５：１のクロロホルム−メタノール）で精製した。溶出ピークを薄層クロマトグラフィーより確認し、得られた最初の画分を減圧濃縮・減圧乾燥して非結晶白色粉末のＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−Ｏｔ−Ｂｕを得た（３．６ｇ，収率：６６％）。
【００２２】
２−２（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｏｔ−Ｂｕ・ＨＣｌの合成）
実施例２−１で得られたＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−Ｏｔ−ＢｕのＣｂｚ基を接触還元法で脱保護した。Ｈ2ガス存在下で、酢酸１５０ｍｌ中にＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−Ｏｔ−Ｂｕを溶解した後、パラジウムカーボン（３００ｍｇ）を加え３日間撹拌した。パラジウムカーボンをろ過にて取り除き、溶液を減圧濃縮し、濃縮液をイオン交換クロマトグラフィーにかけた。イオン交換体としてDiaion WA-30（ＨＣｌ ｆｏｒｍ）を使用し、展開溶媒はメタノール−水（１０：１）で行った。溶液を減圧濃縮した後、トルエンを用いて共沸し、白色固体のＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｏｔ−Ｂｕ・ＨＣｌを得た（２．２ｇ，収率：５１％）。
【００２３】
実施例３［Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体の合成；図３参照］
３−１（Ｎ，Ｎ−ジカルボニルイミダゾールによるポリロタキサン中の水酸基の活性化）
実施例１で得られたポリロタキサン２００ｍｇ（−ＯＨ：３ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）１０ｍｌに溶解させた。完全に溶解後、Ｎ，Ｎ−ジカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ）を１０００ｍｇ（６．２ｍｍｏｌ）投じ、撹拌を続けた。３時間後、エーテル中での再沈殿より未反応のＣＤＩを除去し、ＣＤＩ活性化ポリロタキサン（ＣＤＩ−ＰＲＸ）３７４ｍｇを得た。なお、全水酸基全てに導入した場合を１００％として、上記ＣＤＩ−ＰＲＸの活性化率は３０％であった。
【００２４】
３−２（ポリロタキサンへのＶａｌ−Ｌｙｓの導入）
上記ＣＤＩ−ＰＲＸ２００ｍｇ（−ＯＨ：１．８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下にてＤＭＳＯ２ｍｌに溶解させ、実施例２で得られたＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｏｔ−Ｂｕ・ＨＣｌを１３００ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ）と、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を７００μｌ（３．５ｍｍｏｌ）加えて２４時間撹拌した。その後、ヒドロキエチルカルバモイル（ＨＥＣ）基をポリロタキサンへ導入し、水に対する溶解性を向上させるため、アミノエタノール（ＡＭＥｔ）を２ｍｌ（３３ｍｍｏｌ）加え、２４時間攪拌した。撹拌後、分画分子量１０００の透析膜を用い、水中にて透析を行った。透析終了後、凍結乾燥を行いＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｏｔ−Ｂｕを導入したポリロタキサン（ＰＲＸ）を回収した。この回収物を氷冷下、ジクロロメタン（ＤＣＭ）７ｍｌ及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）３ｍｌの混合溶液中に溶解し、１時間撹拌してＢｏｃ基およびＯｔ−Ｂｕ基を除去した。その後、エーテル中での再沈殿を繰り返してサンプルを洗浄し、減圧乾燥して白色固体のＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体（１１３ｍｇ）を得た。また、上記と同様の方法により、表４及び表５に示す量の各試薬を用いて、他の６種類のＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体（ＶＫ−ＰＲＸ：化１）と２種類のＶａｌ−Ｌｙｓ−α−ＣＤ（ＶＫ−α−ＣＤ）を合成した。
【００２５】
【表４】
【表５】
【００２６】
【化１】
【００２７】
実施例４［Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体のキャラクタリゼーション］４−１（Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体中のα−ＣＤ貫通数およびヒドロキエチルカルバモイル基導入数の算出）
上記７種類のＶＫ−ＰＲＸ中のα−ＣＤ貫通数（α−ＣＤ／ＰＲＸ）を1ＨＮＭＲスペクトルの積分値から算出した。その結果を表６に示す。
【００２８】
【表６】
【００２９】
４−２（アミノ酸分析法によるＶＫ−ＰＲＸ及びＶＫ−α−ＣＤ中のＶａｌ−Ｌｙｓ導入数の定量）
実施例３により得られた７種類のＶＫ−ＰＲＸ及び２種類のＶＫ−α−ＣＤをそれぞれ、６Ｎ ＨＣｌに少量（１〜２ｍｇ）溶解させ、Ｎ2置換を行った。次に１１０℃にて約２２時間加熱分解させた。ＨＣｌを完全に除去後、０．０２Ｎ ＨＣｌ（２〜４ｍｌ）にて希釈しサンプルとした。この作製したサンプルをアミノ酸分析計（日立アミノ酸分析形；Ｌ−８５００Ａ）により定量した。かかるアミノ酸分析法により得られたＶＫ−ＰＲＸ又はＶＫ−α−ＣＤの両末端におけるＰｈｅ残基とＶａｌ残基との組成から、ＶＫ−ＰＲＸ又はＶＫ−α−ＣＤの１分子あたりのＶａｌ−Ｌｙｓ数（Ｖａｌ−Ｌｙｓ／ＶＫ−ＰＲＸ又はＶａｌ−Ｌｙｓ／ＶＫ−α−ＣＤ）を以下の２つの式を用いて算出した（表６及び表７）。なお、かかる２つの式は次のように導いた。また、表６中のＡＭＥｔ／ＰＲＸと表７中のＡＭＥｔ／α−ＣＤは、ＶＸ−ＰＲＸ又はＶＫ−α−ＣＤ中に導入されたアミノエタノール（ＡＭＥｔ）分子数を、プロトン核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル上に観察されるアミノエタノール由来のメチレンピークとα−ＣＤ中のアノマー位のメチンピークとの積分値の比から算出した。
【００３０】
【表７】
【００３１】
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＡＭＥｔ−ＲＸは、一分子あたりＰｈｅ残基を二分子有するので、測定するサンプル中に存在するＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体のモル数（ｎRX）は、サンプル中のＰｈｅ残基のモル数をｎPheとすると式（１）となる。
【数１】
また、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体一分子あたりのＶａｌ−Ｌｙｓ導入数（ＮVal-Lys）は、Ｖａｌ残基のモル数をｎValとし、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体のモル数をｎRXとすると式（２）となる。
【数２】
【００３２】
実施例５［ＨｅＬａ−ｈＰＥＰＴ１細胞を用いた高分子ＰＥＰＴ１阻害剤に対する基質認識性の検討］
実施例４で得られたＶＫ−ＰＲＸ、及びその構成成分であるＶＫ−α−ＣＤのＰＥＰＴ１への認識性の検討を目的として、ｈＰＥＰＴ１安定発現ＨｅＬａ（ＨｅＬａ−ｈＰＥＰＴ１）細胞を用いて[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みに対する阻害効果を検討した。文献（Int. J. Cancer. 88, 274-80, 2000）記載の方法で作製したＨｅＬａ−ｈＰＥＰＴ１細胞、又はＨｅＬａ−ｐｃＤＮＡ（Ｍｏｃｋ）細胞を、マルチディッシュ（Nunc社製）に１０6細胞／ウエルで細胞を播種し、３７℃で５％ ＣＯ2下インキュベーター（ヒラサワ社製）で４日間培養した。培養液は１０％ ＦＣＳ（Gibco Laboratories社製）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium；Gibco Laboratories社製）を用いた。培養後、培養液を吸引し、各細胞を３７℃のHanks' balanced salt solution（ＨＢＳＳ；０．９５２ｍＭ ＣａＣｌ2、５．３６ｍＭ ＫＣｌ、０．４４１ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、０．８１２ｍＭ ＭｇＳＯ4、１３６．７ｍＭ ＮａＣｌ、０．３８５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、２５ｍＭ Ｄ−グルコース、１０ｍＭ ＭＥＳ：ｐＨ６．０）１ｍｌで３回洗浄後、５分間プレインキュベーションした。その後、図４及び表８に示す濃度の各阻害剤と、[3Ｈ（Ｇ）]Ｇｌｙ−Ｓａｒ（４７６ｎＭ）とを含むＨＢＳＳを２５０μｌ加え、３７℃で取り込み反応を開始させた。阻害剤ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．１〜６）の濃度は最大溶解濃度を５００μＭ以下で調製し、フィルターを用いて濾過したものを用いて取り込み反応を行った。なお、開始時に各ディッシュ内から反応溶液を１０μｌのミニバイアルに分取し、液体シンチレーションカクテル（Clear-solＩ、Nacalai tesque社製）を４ｍｌ加えて液体シンチレーションカウンター（LSC-5100、Aloka Co. Ltd.社製）にて反応溶液中の放射活性を測定した。反応開始から２分後に各ディッシュ中の反応溶液を吸引して取り除き、細胞を氷冷ＨＢＳＳ（ＨＥＰＥＳ：ｐＨ７．４）１ｍｌで３回洗うことにより反応を停止させた。その後、各ディッシュに５Ｎ ＮａＯＨを２５０μｌ加えて細胞を可溶化させ(２時間以上)、５Ｎ ＨＣｌを２５０μｌ加えて中和させた後、全量をミニバイアルに入れ液体シンチレーションカクテル（Clear-solＩ、Nacalai tesque社製）を４ｍｌ加えて細胞に取り込まれた放射活性を測定した。
【００３３】
また、上記培養後における細胞タンパク質量を測定するために、培養後の細胞を可溶化後、Bio-Rad Protein Assay試薬（Bio-Rad Co.社製）を加えた後、５９５ｎｍの吸光度を測定した。なお、標準物質としてはＢＳＡ（bovine serum albumin）を用いた。以上の結果から、細胞内への[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込み量［cell/medium ratio（μｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ）］を式（３）により求めた。その結果を図４及び表８に示す。なお、図４中のコントロールの値は、阻害剤非存在下で取り込み反応を行った結果を示す。これらのことから、ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．１，２，４，６）により[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みが有意に減少することがわかった。また、ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）及びＶＫ−α−ＣＤを用いた場合においても、濃度依存的に[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みが阻害されることがわかった。しかし、Ｖａｌ−Ｌｙｓが結合していないα−ＣＤでは、有意な阻害効果は認められなかった。
【００３４】
【数３】
【００３５】
【表８】
【００３６】
実施例６［高分子ＰＥＰＴ１阻害剤のプレインキュベーションの効果］
ＶＫ−α−ＣＤをポリロタキサン化したときのＰＥＰＴ１への認識性の変化を検討することを目的として、ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）及びＶＫ−α−ＣＤ（Ｎｏ．２）で細胞をあらかじめプレインキュベーションしたときの[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みへの影響をｈＰＥＰＴ１安定発現ＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ−ｈＰＥＰＴ１）を用いて検討した。図５に示す濃度の各阻害剤存在下又は非存在下で３０分間プレインキュベーションし（白いボックス）、反応溶液を除去した後、同じ濃度の阻害剤と[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒ（４７６ｎＭ）とを含むＨＢＳＳ中で取り込み反応を行う以外は、実施例５の方法と同様に行い[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みに対する阻害効果を測定した（黒いボックス）。その結果を図５に示す。なお、図中のＭｏｃｋはＨｅＬａ−ｐｃＤＮＡ３細胞による取り込みを示す。このことから、ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）又はＶＫ−α−ＣＤ（Ｎｏ．２）のプレインキュベーションの有無によって、[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みに変化がみられた。ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）では有意な取り込みの減少が認められたのに対して、ＶＫ−α−ＣＤ（Ｎｏ．２）では有意な取り込みの増加が認められた。また、ＶＫ−α−ＣＤ（Ｎｏ．２）を超分子化したＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）の方がより強い阻害効果がみられたが、Ｖａｌ−Ｌｙｓが結合していないα−ＣＤによる阻害効果は認められなかった。
【００３７】
実施例７［セファドロキシル（ＣＤＸ）の体内動態変動によるＶＫ−ＰＲＸの吸収抑制効果の評価］
最近、腎臓のグルコーストランスポーター阻害剤であるＴ−１０９５が、ＳＴＺラット（Streptozotocin-induced diabetic rats）における高血糖状態を改善することが報告されている（Metabolism, 49, 990-5, 2000）。このことは、トランスポーター機能を抑制し生理活性物質の移行を制御することによって、病態を改善することが可能となることを示唆するものであり、新たなドラッグターゲットとしても期待されている。また、ヒトにおいて、ＰＥＰＴ１の基質である、β−ラクタム系抗生物質であるセファドロキシル［ＣＤＸ：cefadroxil（化２）］のバイオアベイラビリティーが、β−ラクタム系抗生物質であるセファレキシン［ＣＥＸ：cephalexin（化３）］の同時投与によって低下することが報告されている（Eur. J. Clin. Pharmacol. 41, 179-83, 1991）。この報告は、ＰＥＰＴ１を介したＣＤＸの消化管吸収を、同じくＰＥＰＴ１の基質であるＣＥＸが抑制したことを示すものである。そこで、ラットを用いてＰＥＰＴ１阻害剤によるＣＤＸの吸収抑制効果を検討した。
【００３８】
【化２】
【００３９】
【化３】
【００４０】
７〜８週齢のＳＤ（Sprague-Dawley）系ラット （雄性；日本ＳＬＣ社製）に５０ｍｇ／ｋｇのネンブタール（ダイナボット（株）社製）を腹腔内投与して麻酔し、背位固定後、頸静脈及び大腿静脈（瞬時静注時のみ）にカニュレーション［シリコンチューブ 内径×外径（０．５×１）］を施し、さらに、その先端を皮下に通し頚背部から貫通後、切開部を縫合した。その後、かかる動物を一晩（約１８時間）絶食させ、各薬剤を経口ゾンデ針により経口投与、あるいは、大腿静脈投与した。各薬剤投与後、経時的にカニュレーションチューブから血液４００μｌを採取し、以下の方法で血漿中におけるＣＤＸ濃度を測定し、式（４）又は式（５）、式（６）、式（７）及び式（８）により、各パラメーターを算出してWinNonlin（Scientific Consulting Inc.社製）のコンパートメントモデル解析法により解析した（辻 彰 編集、わかりやすい生物薬剤学，廣川書店，１７８−１８８，１９９６）。
【００４１】
上記採取した血液４００μｌを同量の生理食塩水で置換し、１．５ｍｌのマイクロチューブに分注して遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）を行い血漿を取り出した。血漿１５０μｌを１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、さらに同量のアセトニトリルを加え除蛋白処理し、遠心（１２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）後、上清２５０μｌを１．５ｍｌのマイクロチューブに移し蒸発乾固し、以下のＨＰＬＣ条件にて再構築した。カラムはTSKgel ODS-80Ts（東洋ソーダ社製）を、ポンプ、紫外・可視光検出器、インテリジェントオートサンプラー、及びカラムオーブンは880-PU、875-UV、AS-1555-10、及びCo-1565（全て日本分光（株）社製）を、インテグレーターはChromatopac C-R3A（島津製作所（株）社製）を使用した。また、カラム温度３５℃で、移動相に７％のアセトニトリル（０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）及び０．０１Ｍの１−ペンタンスルホン酸ナトリウムを含む）を用いて、流速０．９ｍｌ／ｍｉｎで分離溶出し、波長２４０ｎｍで検出し、血漿中におけるＣＤＸ濃度を求めた。
【００４２】
【数４】
なお、式中のＣは血漿中におけるＣＤＸの濃度を、Ｆは吸収率を、Ｄは投与量を、ｋａは吸収速度定数を、ｋｅは消失速度定数を、Ｖｄは分布容積を、ｔは薬剤投与してから血液を採取した時間をそれぞれ表す。
【００４３】
【数５】
なお、式中のαは分布相の傾きを、βは消失相の傾きを、Ｖ1は中枢コンパートメントの分布容積をそれぞれ表す。
【００４４】
【数６】
なお、式中のＡＵＣは血漿中薬物濃度−時間曲線下面積を、Ｃ6は薬物投与６時間後の血漿中濃度をそれぞれ表す。
【００４５】
【数７】
なお、式中のＣＬは全身クリアランスを、Ｄｏｓｅは薬物投与量をそれぞれ表す。
【００４６】
【数８】
【００４７】
７−１（ラットを用いたＣＤＸのＰＥＰＴ１を介した輸送に対するＣＥＸの阻害効果）
ヒトにおいて、ＰＥＰＴ１の基質であるＣＤＸのバイオアベイラビリティーが、β−ラクタム系抗生物質であるＣＥＸの同時投与によって低下するということが報告されている（Eur. J. Clin. Pharmacol., 41, 179-83, 1991）。ＶＫ−ＰＲＸのＰＥＰＴ１阻害効果を明らかにすることを目的とし、薬剤として２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（○）、５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（●）、又は、２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ及び４５ｍｇ／ｋｇのＣＥＸ（▲）をそれぞれ前記ラットに経口投与し、実施例７記載の方法によりラットにおけるＣＤＸの吸収をＣＥＸが抑制するかどうかを検討した。なお、２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ及び４５ｍｇ／ｋｇのＣＥＸ（▲）においては、ＣＤＸの投与３０分前にＣＥＸをラットに経口投与した。上記各ラットにおける体内動態の各パラメーターは、ＣＤＸの血中濃度推移をもとに式（４）、式（６）、式（７）及び式（８）を用いて算出し、評価した。その結果を図６及び表９に示す。なお、図及び表に示す値は、３〜４回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ＣＤＸを２．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇで経口投与したときの結果から、ＡＵＣ0- ∞及びＣｍａｘに飽和現象が認められた。さらに、ＣＤＸを２．５ｍｇ／ｋｇ投与したときの吸収率が８６％と十分なものであった。ＣＤＸは生体内で安定であることを含めて、ＰＥＰＴ１を介した吸収活性を評価するマーカー化合物としてＣＤＸが適切であるということが示された。また、ＣＥＸ（４５ｍｇ／ｋｇ）の前投与後にＣＤＸ（２．５ｍｇ／ｋｇ）を投与したとき、ＣＤＸ単独投与時と比較して血漿中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ0- ∞）は約３０％減少し、吸収速度定数（ｋａ）は２．４２から１．５３ｈｒ-1に、最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）は０．８から０．５μｇ／ｍｌにそれぞれ有意に減少した。以上の結果から、ヒトにおいての報告がラットで再現された。
【００４８】
【表９】
【００４９】
７−２（ＶＫ−ＰＲＸタイプによる吸収抑制効果の変化）
次に、薬剤として５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸのみ（○）、又は、１０ｍｇ／ｋｇのＶＫ−ＰＲＫ［０．１％のポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＮＡ）塩水に懸濁したＶＫ−ＰＲＫ］及び５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（●）を用いて、前記ラットに経口投与し、実施例７記載の方法によりラットにおけるＣＤＸの吸収をＶＫ−ＰＲＸが抑制するかどうかを検討した。なお、上記ＶＫ−ＰＲＫは、５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（●）を投与する３０分前に投与した。その際、ＣＤＸの血中濃度推移をもとに式（４）、式（６）、式（７）及び式（８）を用いて体内動態の各パラメーターを算出し、評価した。ＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．２）を用いた場合の結果を図７及び表１０に、ＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．７）を用いた場合の結果を図８及び表１１に示す。なお、図に示す値は２〜４回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を、表に示す値は３回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．２）あるいはＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．７）をＣＤＸと同時投与したが、どちらもＣＤＸ単独投与時と比較してＡＵＣ0-∞に有意な差は認められなかった。また、その他のパラメーターについても同様に有意な差は認められなかった。これらは、上記ＣＤＸ（５ｍｇ／ｋｇ）の投与量では、既に消化管吸収に飽和が生じているためＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．２）の効果が検出しにくい条件であったことが考えられる。
【００５０】
【表１０】
【００５１】
【表１１】
【００５２】
７−３（ＶＫ−ＰＲＸ投与量とその効果）
実施例７記載の方法と同様に、５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸのみ（○）、１０ｍｇ／ｋｇのＣＥＸ及び５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（▲）、又は、５．７ｍｇ／ｋｇのＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．２）及び５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（●）を同時にラットに経口投与し、体内動態の各パラメーターを算出し、評価した。その結果を図９及び表１２に示す。なお、図及び表に示す値は２〜４回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。１０ｍｇ／ｋｇのＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．２）をＣＤＸと同時に投与した場合（図７及び表１０）と同様に、５．７ｍｇ／ｋｇのＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．２）をＣＤＸと同時投与しても、ＣＤＸ単独投与時と比較してＡＵＣ0- ∞に有意な差は認められなかった。また、その他のパラメーターについても同様に有意な差は認められなかった。
【００５３】
【表１２】
【００５４】
７−４（懸濁化剤によるＶＫ−ＰＲＸ効果の影響）
次に各薬剤を懸濁化剤である０．１％のポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＮＡ）塩水に懸濁した場合（図１０）と、懸濁しない場合（図１１）とのＶＫ−ＰＲＸの効果の違いを調べるために、１０ｍｇ／ｋｇのＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．７）及び２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（●）、又は、２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸのみを経口投与し、各ラットにおける体内動態の各パラメーターを実施例７記載の方法と同様に算出し、評価した。なお、ＶＫ−ＰＲＫの経口投与はＣＤＸ投与３０分前に行った。ＰＡＮＡに懸濁した場合の結果を図１０及び表１３に、懸濁していない場合を図１１及び表１４に示す。なお、図１０、図１１及び表１４に示す値は４回の、表１３に示す値は３回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。これらの結果から、ＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．７）を懸濁化剤に溶解させＣＤＸと同時投与しても、ＣＤＸ単独投与時と比較してＡＵＣ0- ∞に有意な差が認められず、その他のパラメーターについても同様に有意な差が認められなかった。一方、ＰＡＮＡに懸濁させずに同じ条件でＶＫ−ＰＲＫを投与したときＡＵＣ0-∞は有意に減少することがわかった。さらに、ＶＫ−ＰＲＫの同時投与によってｋａは２．４２から１．７５ｈｒ-1に、Ｃｍａｘは０．８から０．６４μｇ／ｍｌにそれぞれ有意に減少し、Ｔｍａｘは０．９５から１．１８ｈｒに有意に延長していた。しかし、消失速度定数（ｋｅ）については有意な差は認められなかった。
【００５５】
【表１３】
【００５６】
【表１４】
【００５７】
７−５（ＶＫ−ＰＲＸの前投与の有効性）
また、ＶＫ−ＰＲＸの前投与の有効性についても調べてみた。２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸと１０ｍｇ／ｋｇＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）とを同時に経口投与した場合（●）、又は、２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸのみを経口投与した場合（○）の体内動態の各パラメーターを、実施例７記載の方法と同様に算出し、評価した。その結果を図１２及び表１５に示す。なお、図に示す値は３回の、表に示す値は４回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。その結果、ＣＤＸと同時にＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）を投与したものは、ＣＤＸ単独投与時のものと比較してＡＵＣ0- ∞に有意な差は認められなかった。しかしながら、ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）を前投与し、３０分後にＣＤＸを投与した場合（図１１及び表１４）では、ＡＵＣ0- ∞に有意な減少が認められ、また、前投与の有無に関わらずｋａの有意な減少が認められた。
【００５８】
【表１５】
【００５９】
実施例８［ＶＫ−ＰＲＸの静注後のＣＤＸ体内動態への影響］
ＶＫ−ＰＲＸは高分子化合物であることから、消化管吸収を受けないものと考えられる。しかし、経口投与したＣＥＸがＣＤＸの排泄を促進することも知られており、ＶＫ−ＰＲＸがＣＤＸのＡＵＣ0- ∞を低下させた作用が必ずしも吸収性低下のみでは説明できない。一方、ＣＤＸは腎臓からの再吸収に非線形性があることが知られている（Drug Metab. Dispos. 21, 215-7, 1993、Drug Metab. Dispos. 22, 447-50, 1994）。また、その再吸収にはオリゴペプチドトタンスポーターが関与している。そこで、２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸを瞬間静注し、同時に１０ｍｇ／ｋｇのＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）［生理食塩水に溶解したＶＫ−ＰＲＫ］を経口投与したラット（○）におけるＣＤＸのクリアランス（ＣＬ：腎排泄）に対する影響を、２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸを瞬間静注したラット（●）と比較するため、実施例７記載の方法で体内動態の各パラメーターを算出し、評価した（図１３及び表１６）。なお、図及び表に示す値は３回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。その結果、ＶＫ−ＰＲＸの投与によってＣＤＸの血漿中濃度推移は変化せず、前記ＡＵＣ0- ∞変化は腎の排泄・再吸収過程ではなく、消化管吸収への影響であることが明らかとなった。また、既にＰＲＸに担持されたペプチドの物理的安定性が向上することが明らかにされており（Pharm. Res. 16, 1331-1343, 1999）、得られた結果はＶＫ−ＰＲＸが消化管吸収を受けないかあるいは吸収されにくい化合物であることを支持するものである。以上の結果から、高分子ＰＥＰＴ１阻害剤が非吸収性化合物としてＰＥＰＴ１を介した吸収を阻害することが明らかとなった。この結果は、ＰＥＰＴ１を介した蛋白質の吸収抑制へと繋がるものである。
【００６０】
【表１６】
【００６１】
【発明の効果】
本発明の組織特異的トランスポーター阻害剤は、小腸から吸収されない、又は吸収されにくいため、小腸からの栄養物の吸収を特異的に低下させることにより組織機能不全疾患又は腎不全の患者の食事療法によるＱＯＬ低下を防ぐことができる。また、かかる組織特異的トランスポーター阻害剤は、腎疾患等の組織疾患を発症させない予防医学及び腎不全を透析に至らせない保存期治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ポリロタキサンの合成手順を示す図である。
【図２】ペプチドトランスポーターに認識されるバリルリジン誘導体の合成手順を示す図である。
【図３】本発明の組織特異的トランスポーター阻害剤であるＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体の合成手順を示す図である。
【図４】ＨｅＬａ−ｈＰＥＰＴ１細胞による[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みに対するＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサンの阻害効果を示す図である。
【図５】ＨｅＬａ−ｈＰＥＰＴ１細胞による[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みに対するＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン又はＶａｌ−Ｌｙｓ−α−サイクロデキストリンの前投与に対する効果を示す図である。
【図６】ラットへのセファキシレンの投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。
【図７】ラットへのＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．２）の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。
【図８】ラットへのＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．７）の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。
【図９】ラットにＣＤＸと、セファレキシン又はＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．２）とを投与したときの血漿中におけるセファドロキシルの濃度経時変化の結果を示す図である。
【図１０】ラットへのＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．７）の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。
【図１１】ラットへのＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．７）の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。
【図１２】ラットへのＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．７）の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。
【図１３】ラットにＣＤＸを瞬間静注し、それと同時にＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．７）を経口投与した時の血漿中におけるセファドロキシルの濃度経時変化の結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、組織特異的トランスポーターが認識するリガンド構造と、膜組織を透過できない高分子分子構造とをもつ組織特異的トランスポーター機能阻害剤、及びかかる組織特異的トランスポーター機能阻害剤を有効成分とする組織機能不全疾患治療薬又は慢性腎不全進行抑制治療薬等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、透析患者は増加傾向にあり、将来、糖尿病から透析療法に移行する患者の数を合わせると莫大な数にのぼることが予想されており、透析療法にかかる医療費は１兆円を遙かに越えることが推定されている。これらのことから、腎疾患を発症させない予防医学及び腎不全を透析に至らせない保存期治療が重要とされている。慢性腎不全患者における腎障害の有効な治療法は確立しておらず、現在までのところ、低タンパク食事療法やＡＣＥ阻害薬のような抗高血圧薬の投与が行われている（Am. J. Cardiol. 59, 66A-71A, 1987、Am. J. Kidney. 20, 443-57, 1992、BMJ 304, 216-20, 1992、Ann. Intern. Med. 124, 627-32, 1996）。上記低タンパク食療法は慢性腎不全の進行を抑制するための有効な手段とされ、現在広く実施されているが、食事制限は患者のquality of life（ＱＯＬ）やコンプライアンスの問題を抱えているため、タンパク質の経口吸収を抑制する等の新しい治療戦略が求められている。最近、高脂血症治療の新しい戦略として、小腸に存在する胆汁酸トランスポーターを阻害することによってコレステロールの生合成を抑制するということが報告され注目を集めている（J. Pharmacol. Exp. Ther. 293, 315-20, 2000）。これと同様に、タンパク質の消化管吸収を特異的な阻害剤によって抑制することが可能であると期待される。
【０００３】
本発明者らは、以前、摂取されたタンパク質が、消化管内でアミノ酸とオリゴペプチドにまで分解し、小腸から吸収されることや、かかる吸収が小腸上皮細胞刷子縁膜に存在する特異的なトランスポーターによって行われることを報告している（Pharm. Res. 13, 963-77, 1996）。上記分解されたアミノ酸は複数のトランスポーターによって輸送されるが、オリゴペプチドはＰＥＰＴ１等のオリゴペプチドトランスポーターによって輸送され、ジペプチド又はトリペプチド特異的に吸収される（J. Biol. Chem. 270, 6456-63, 1995）。小腸におけるタンパク質の消化産物の吸収は、アミノ酸よりもペプチドの方が高いことが知られている（Gastroenterology 113, 332-40, 1997）。以上のことから、ＰＥＰＴ１阻害剤は、食餌中のタンパク質の吸収を抑制することができ、食事療法によってＱＯＬが低下している患者にとって有用であると考えられる。
【０００４】
１９９４年以降、ウサギ、ヒト及びラットの小腸からＰＥＰＴ１遺伝子がクローニングされ（J. Biol. Chem. 270, 6456-63, 1995、Nature 368, 563-6, 1994、J. Pharma. Exp. Ther. 275, 1631-7, 1995、Biochim. Biophys. Acta, 1305, 34-8, 1996）、ＰＥＰＴ１を介した輸送研究が急速に発展してきた。上記ラット小腸由来のＰＥＰＴ１遺伝子は本発明者らが初めてクローニングし（Biochim. Biophys. Acta, 1305, 34-8, 1996）、免疫組織化学的手法により小腸上皮細胞刷子縁膜側に局在していることを明らかにしている（FEBS Lett. 392, 25-9, 1996）。また、ＰＥＰＴ１は、β−ラクタム系抗生物質などのペプチド類似構造を有する化合物のみならず（Pharm. Res. 13, 963-77, 1996）、分子内にペプチド結合を持たない抗ウイルス薬バラシクロビル（valacyclovir） などの化合物も認識し、輸送することが報告されている（Biochem. Biophys. Res. Commun. 250, 246-51, 1998、J. Clin. Invest. 101, 2761-7, 1998、J. Biol. Chem. 273, 20-2, 1998）。以上のようにＰＥＰＴ１は幅広い基質認識性を示すが、その分子認識性については未だ解明されておらず、現在のところ、ＰＥＰＴ１の基質認識には部分的構造のみならず分子全体の認識が関与しているのではないかと考えられている。一方、腎臓からクローニングされたＰＥＰＴ２（Biochim. Biophys. Acta, 1235, 461-6, 1995、Biochim. Biophys. Acta, 1280, 173-7, 1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 284-9, 1996）は、腎臓の近位尿細管上皮細胞刷子縁膜側に局在しているが、ＰＥＰＴ１と類似した基質認識性を有しており、オリゴペプチドやペプチド様化合物の再吸収に働いている。また、寄与は小さいが上記ＰＥＰＴ１は腎臓においても発現していることが知られている（Am. J. Physiol. 276, F658-65, 1999）が、ＰＥＰＴ２の小腸における発現は認められていない。
【０００５】
ヒトにおいて、β−ラクタム系抗生物質であり、ＰＥＰＴ１の基質であるcefadroxil（ＣＤＸ）のバイオアベイラビリティー（ＢＡ）が、同様にＰＥＰＴ１によって認識されるβ−ラクタム系抗生物質であるcephalexin（ＣＥＸ）の同時投与によって低下するということが報告されている（Eur. J. Clin. Pharmacol. 41, 179-83, 1991）。バイオアベイラビリティーの指標としてのＡＵＣ（Area Under the plasma concentration Curve）がＣＥＸによって低下したメカニズムにはＣＤＸの小腸での吸収と腎臓での再吸収阻害の両方が含まれる。腎臓からの再吸収は、主にオリゴペプチドトランスポーター（ＰＥＰＴ２）を介して行われ、両化合物ともＰＥＰＴ２の基質になることが知られている（Biochim. Biophys. Acta, 1235, 461-6, 1995）。従って、ＣＥＸによって引き起こされたＣＤＸのＢＡの低下は、ＰＥＰＴ１及びＰＥＰＴ２を介したＣＤＸの輸送をＣＥＸが阻害したことによるものであることが説明できる。腎臓に存在するＰＥＰＴ２の阻害が生体にどのような影響を及ぼすかは明らかにされていないが、慢性腎不全の食事療法という観点からはＰＥＰＴ１を介した直接の吸収阻害に限定したほうが望ましいと考えられる。しかし、ＰＥＰＴ１及びＰＥＰＴ２は、非常に類似した基質認識性を示すため、ＰＥＰＴ１を特異的に認識するような阻害剤の開発は困難であるとされていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
腎不全による透析患者は増加傾向にあり、また糖尿病から透析療法に移行する患者数を合わせると膨大な数となり、それにかかる医療費は将来１兆円を超えることが推測される。このような状況下では、腎疾患を発症させない予防医学及び腎不全を透析に至らせない保存期治療が重要である。本発明の課題は、患者の食事療法によるＱＯＬ低下を防ぐことができる、消化管において非吸収性の組織特異的トランスポーター阻害剤や、かかる阻害剤を有効成分とする組織機能不全疾患治療薬及び慢性腎不全進行抑制治療薬を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するためには、ＰＥＰＴ２への認識を回避することができる、消化管非吸収性ＰＥＰＴ１阻害剤の使用が有効であると考え、また、高分子化合物は、一般的に消化管から吸収されないことから、ＰＥＰＴ１認識性を有する高分子化合物を設計することにより、ＰＥＰＴ１を選択的に阻害することが可能になるのではないかと考えた。そこで、構造的修飾を施した活性残基が膜貫通型トランスポーターとの相互作用に優れていると期待される、超分子構造ポリロタキサン（ＰＲＸ）に着目し、上記ＰＥＰＴ１のリガンドであるジペプチド（Ｖａｌ−Ｌｙｓ）を超分子構造ＰＲＸに導入した化合物を作製し、鋭意研究した結果、上記化合物によりタンパク質の吸収を抑制し、さらにタンパク質摂取制限が必要となる慢性腎不全の進行を抑制することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、オリゴペプチドトランスポーター１（ＰＥＰＴ１）が認識するジペプチド又はトリペプチドと、膜組織を透過できない高分子分子構造とをもち、前記高分子分子構造が、多数のシクロデキストリンに線状分子が貫通し、該線状分子の両末端を嵩高い置換基でキャップしたロタキサン化合物構造であることを特徴とする組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項１）や、線状分子が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項２）や、嵩高い置換基が、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンであることを特徴とする請求項１又は２記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項３）や、オリゴペプチドトランスポーター１（ＰＥＰＴ１）が認識するジペプチド又はトリペプチドが、バリルリジン（Ｖａｌ−Ｌｙｓ）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤（請求項４）に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の組織特異的トランスポーター機能阻害剤としては、組織特異的トランスポーターが認識するリガンド構造と、膜組織を透過できない高分子分子構造とをもち、上記組織特異的トランスポーターの機能を阻害するものであればどのようなものでもよいが、生理的に安定した構造をとるものが好ましい。組織としては、小腸、腎臓、脳、肝臓、胎盤、膵臓、肺、胃、卵巣、精巣、脾臓、大腸、骨格筋、気道、骨髄、前立腺、心臓、子宮、脊髄、副腎、甲状腺等の組織を例示することができ、また、かかる組織において特異的に発現するトランスポーターとしては、表１〜３に示されるトランスポーターを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１１】
【表１】
上記膜組織を透過できない高分子分子構造としては、小腸、腎臓、脳、肝臓、胎盤、膵臓、肺、胃、卵巣、精巣、脾臓、大腸、骨格筋、気道、骨髄、前立腺、心臓、子宮、脊髄、副腎、甲状腺等の生体膜組織から、透過できない又は透過しにくい高分子構造をとるものであればどのようなものでもよく、例えば、多数の環状分子に線状分子が貫通し、該線状分子の両末端を嵩高い置換基でキャップしたポリロタキサン化合物等の超分子構造や、α−シクロデキストリンを含む誘導体若しくは包接構造などを具体的に挙げることができる。上記環状分子としては、例えば、シクロデキストリン、α，β，又はγ−シクロデキストリン、クラウンエーテル、サイクロフラクタン等の分子を具体的に挙げることができるがこれらに特に限定されるものではない。また、線状分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、若しくはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、ポリアミノ酸、多糖類等の分子を例示することができるが、嵩高い置換基の導入が行えるポリエチレングリコールなどが好ましい。嵩高い置換基としては、上記環状分子の脱離を防止するものであればどのようなものでもよく、例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リシン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかの単位若しくはこれらの誘導体、複数の単位からなるオリゴペプチド等を具体的に挙げることができるが特に制限されるものではない。
【００１３】
本発明において組織特異的トランスポーターに認識されるリガンドとしては、有機アニオン性物質、有機カチオン性物質、ペプチド性物質、アミノ基を有する物質等の物質を具体的に挙げることができ、例えば、小腸に特異的に発現するトランスポーターであるオリゴペプチドトランスポーター１（ＰＥＰＴ１）に認識されるリガンドとしては、ジペプチド、トリペプチド等のオリゴペプチドや、その構成アミノ酸残基に修飾を施した誘導体、セファドロキシル、セフチブテン等のβ−ラクタム抗生物質、カプトプリル等のＡＣＥ阻害剤、抗がん剤のベスタチン、抗ウイルス薬のバラシクロビルなどを具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
本発明により提供される、組織機能不全疾患治療薬としては前記組織特異的トランスポーター機能阻害剤を、慢性腎不全進行抑制治療薬としてはタンパク質の吸収を抑制する組織特異的トランスポーター機能阻害剤を有効成分として含有するものを挙げることができ、これら治療薬は、経口、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内等により投与することができる形状のものが好ましい。投与すべき有効量は、治療薬の種類・組成、投与方法、患者の年齢や体重等を考慮して適宜決定することができ、これらを１日あたり１〜数回投与することが好ましい。また、経口投与する場合、通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。この際、製剤に用いることができる担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明の組織特異的トランスポーター機能阻害剤と反応しない物質が用いられる。経口投与の仕方は、食事と同時に、或いは食事の前に予め投与しておくことができる。
【００１５】
また、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等を具体的に例示することができ、これらの製剤は常法に従って調製され、特に液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形態とすることもできる。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチド修飾高分子を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。またこれらの製剤は、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００１６】
本発明の組織特異的トランスポーター機能阻害剤は、組織機能不全疾患又は慢性腎不全の症状改善用食品素材として、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜へ配合し、機能性食品として摂取することもできる。
【００１７】
【実施例】
本発明の好適な実施例について以下に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例１［ポリロタキサン（ＰＲＸ）の合成；図１参照］
１−１（ポリエチレングリコールとα−シクロデキストリンからなる擬ポリロタキサンの調製）
α−シクロデキストリン（α−ＣＤ）飽和水溶液（１００ｇ／６００ｍｌ）に超音波をかけながら、両末端をアミノ化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＢＡ，Ｍｎ＝４０００）の水溶液（９．１４ｇ／８５ｍｌ）を滴下した。約１時間超音波にあてながら撹拌後、一晩放置した。その後、遠心分離により沈殿物を回収し、６０℃減圧下にて乾燥し、シクロデキストリンにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が貫通した線状分子である擬ポリロタキサン７８．１３ｇを調製した。
【００１８】
１−２（末端キャップ剤の調製）
α−ＣＤの脱離を防止する嵩高い置換基としてＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｚはベンジルオキシカルボニル基を表す）を導入するために、Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅのカルボキシル基の活性化を行った。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）３８．４６ｇ（０．３３ｍｏｌ）、及びＺ−Ｌ−Ｐｈｅ１００ｇ（０．３３ｍｏｌ）を、ジオキサン８５０ｍｌ中に溶解させた。次に、氷冷下にてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）６８．９０ｇ（０．３３ｍｏｌ）を加え約一時間撹拌した。その後、冷蔵庫に一晩放置した。生じた沈殿物を除去後、上澄み液を減圧濃縮し、得られた濃縮液をジエチルエーテル中で再沈殿した。生じた沈殿物を常温で減圧乾燥後回収し、ジクロロメタンおよび石油エーテルを用いて再結晶した後、試料をろ過して減圧乾燥し、白色針状結晶のＺ−Ｌ−Ｐｈｅのスクシンイミドエステル（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ）１０５．８４ｇ（０．２６ｍｏｌ）を得た。
【００１９】
１−３（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕを用いたポリロタキサンの合成）
実施例１−１で得られた擬ポリロタキサン２４．３ｇ（０．６８ｍｍｏｌ）、及び実施例１−２で得られたＺ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ２８．８ｇ（７２ｍｍｏｌ）を、ジメチルスルフォキシド３０ｍｌに加え、不均一状態で約４．５日間撹拌した。なお、Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ（−ＯＳｕ）と擬ポリロタキサン末端アミノ基（−ＮＨ2）とのモル比は、５０：１の割合で行った。反応後、大量のエーテル中に投じ、生じた白色沈殿を減圧乾燥後回収した。未反応のＺ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ、α−ＣＤ、及びＰＥＧ−ＢＡを取り除くため、アセトンおよび水によりそれぞれ３回ずつ洗浄操作を行った。最終的に得られた試料を６０℃減圧下にて乾燥し、擬ポリロタキサンの両末端を嵩高い置換基でキャップしたポリロタキサン（白色粉末）１３ｇを得た。なお、合成したポリロタキサンの構造解析は1ＨＮＭＲスペクトル測定（Varian社製；３００ＭＨｚ ＦＴ−ＮＭＲ）により行った。
【００２０】
実施例２［ペプチドトランスポーターに認識されるジペプチドの合成］
ペプチドトランスポーターに認識されるジペプチドアナログの一つであるバリルリジン（Ｖａｌ−Ｌｙｓ：ＶＫ）誘導体をＡｂｅらの手法（Bioconjugate Chem. 10, 24-31, 1999）に従い合成した（図２参照）。
【００２１】
２−１（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−Ｏｔ−Ｂｕの合成）
第３ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ（２．１７ｇ，１０ｍｍｏｌ）、ε−ベンジルオキシカルボニルリジン−ｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩［Ｌｙｓ−（Ｃｂｚ）−Ｏｔ−Ｂｕ・ＨＣＬ（３．３７ｇ，１０ｍｍｏｌ）］、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（４．１３ｇ，２０ｍｍｏｌ）、及びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１．９３ｇ，１０ｍｍｏｌ）を、それぞれ８０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解させ、０℃にて３０分撹拌を行った。その後、水溶性カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）（１．９３ｇ，１０ｍｍｏｌ）を加えて更に０℃で２時間撹拌した後、室温にて４時間撹拌して酢酸エチルで希釈した。酢酸エチルで希釈した溶液を、０．６Ｍ クエン酸水溶液（１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）、１０％ 食塩水（１００ｍｌ）にて順次洗浄を行った。その結果、得られた油層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮後、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2，７５：１のクロロホルム−メタノール）で精製した。溶出ピークを薄層クロマトグラフィーより確認し、得られた最初の画分を減圧濃縮・減圧乾燥して非結晶白色粉末のＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−Ｏｔ−Ｂｕを得た（３．６ｇ，収率：６６％）。
【００２２】
２−２（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｏｔ−Ｂｕ・ＨＣｌの合成）
実施例２−１で得られたＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−Ｏｔ−ＢｕのＣｂｚ基を接触還元法で脱保護した。Ｈ2ガス存在下で、酢酸１５０ｍｌ中にＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−Ｏｔ−Ｂｕを溶解した後、パラジウムカーボン（３００ｍｇ）を加え３日間撹拌した。パラジウムカーボンをろ過にて取り除き、溶液を減圧濃縮し、濃縮液をイオン交換クロマトグラフィーにかけた。イオン交換体としてDiaion WA-30（ＨＣｌ ｆｏｒｍ）を使用し、展開溶媒はメタノール−水（１０：１）で行った。溶液を減圧濃縮した後、トルエンを用いて共沸し、白色固体のＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｏｔ−Ｂｕ・ＨＣｌを得た（２．２ｇ，収率：５１％）。
【００２３】
実施例３［Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体の合成；図３参照］
３−１（Ｎ，Ｎ−ジカルボニルイミダゾールによるポリロタキサン中の水酸基の活性化）
実施例１で得られたポリロタキサン２００ｍｇ（−ＯＨ：３ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）１０ｍｌに溶解させた。完全に溶解後、Ｎ，Ｎ−ジカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ）を１０００ｍｇ（６．２ｍｍｏｌ）投じ、撹拌を続けた。３時間後、エーテル中での再沈殿より未反応のＣＤＩを除去し、ＣＤＩ活性化ポリロタキサン（ＣＤＩ−ＰＲＸ）３７４ｍｇを得た。なお、全水酸基全てに導入した場合を１００％として、上記ＣＤＩ−ＰＲＸの活性化率は３０％であった。
【００２４】
３−２（ポリロタキサンへのＶａｌ−Ｌｙｓの導入）
上記ＣＤＩ−ＰＲＸ２００ｍｇ（−ＯＨ：１．８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下にてＤＭＳＯ２ｍｌに溶解させ、実施例２で得られたＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｏｔ−Ｂｕ・ＨＣｌを１３００ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ）と、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を７００μｌ（３．５ｍｍｏｌ）加えて２４時間撹拌した。その後、ヒドロキエチルカルバモイル（ＨＥＣ）基をポリロタキサンへ導入し、水に対する溶解性を向上させるため、アミノエタノール（ＡＭＥｔ）を２ｍｌ（３３ｍｍｏｌ）加え、２４時間攪拌した。撹拌後、分画分子量１０００の透析膜を用い、水中にて透析を行った。透析終了後、凍結乾燥を行いＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｏｔ−Ｂｕを導入したポリロタキサン（ＰＲＸ）を回収した。この回収物を氷冷下、ジクロロメタン（ＤＣＭ）７ｍｌ及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）３ｍｌの混合溶液中に溶解し、１時間撹拌してＢｏｃ基およびＯｔ−Ｂｕ基を除去した。その後、エーテル中での再沈殿を繰り返してサンプルを洗浄し、減圧乾燥して白色固体のＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体（１１３ｍｇ）を得た。また、上記と同様の方法により、表４及び表５に示す量の各試薬を用いて、他の６種類のＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体（ＶＫ−ＰＲＸ：化１）と２種類のＶａｌ−Ｌｙｓ−α−ＣＤ（ＶＫ−α−ＣＤ）を合成した。
【００２５】
【表４】
【化１】
実施例４［Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体のキャラクタリゼーション］４−１（Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体中のα−ＣＤ貫通数およびヒドロキエチルカルバモイル基導入数の算出）
上記７種類のＶＫ−ＰＲＸ中のα−ＣＤ貫通数（α−ＣＤ／ＰＲＸ）を1ＨＮＭＲスペクトルの積分値から算出した。その結果を表６に示す。
【００２８】
【表６】
４−２（アミノ酸分析法によるＶＫ−ＰＲＸ及びＶＫ−α−ＣＤ中のＶａｌ−Ｌｙｓ導入数の定量）
実施例３により得られた７種類のＶＫ−ＰＲＸ及び２種類のＶＫ−α−ＣＤをそれぞれ、６Ｎ ＨＣｌに少量（１〜２ｍｇ）溶解させ、Ｎ2置換を行った。次に１１０℃にて約２２時間加熱分解させた。ＨＣｌを完全に除去後、０．０２Ｎ ＨＣｌ（２〜４ｍｌ）にて希釈しサンプルとした。この作製したサンプルをアミノ酸分析計（日立アミノ酸分析形；Ｌ−８５００Ａ）により定量した。かかるアミノ酸分析法により得られたＶＫ−ＰＲＸ又はＶＫ−α−ＣＤの両末端におけるＰｈｅ残基とＶａｌ残基との組成から、ＶＫ−ＰＲＸ又はＶＫ−α−ＣＤの１分子あたりのＶａｌ−Ｌｙｓ数（Ｖａｌ−Ｌｙｓ／ＶＫ−ＰＲＸ又はＶａｌ−Ｌｙｓ／ＶＫ−α−ＣＤ）を以下の２つの式を用いて算出した（表６及び表７）。なお、かかる２つの式は次のように導いた。また、表６中のＡＭＥｔ／ＰＲＸと表７中のＡＭＥｔ／α−ＣＤは、ＶＸ−ＰＲＸ又はＶＫ−α−ＣＤ中に導入されたアミノエタノール（ＡＭＥｔ）分子数を、プロトン核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル上に観察されるアミノエタノール由来のメチレンピークとα−ＣＤ中のアノマー位のメチンピークとの積分値の比から算出した。
【００３０】
【表７】
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＡＭＥｔ−ＲＸは、一分子あたりＰｈｅ残基を二分子有するので、測定するサンプル中に存在するＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体のモル数（ｎRX）は、サンプル中のＰｈｅ残基のモル数をｎPheとすると式（１）となる。
【数１】
【数２】
実施例５［ＨｅＬａ−ｈＰＥＰＴ１細胞を用いた高分子ＰＥＰＴ１阻害剤に対する基質認識性の検討］
実施例４で得られたＶＫ−ＰＲＸ、及びその構成成分であるＶＫ−α−ＣＤのＰＥＰＴ１への認識性の検討を目的として、ｈＰＥＰＴ１安定発現ＨｅＬａ（ＨｅＬａ−ｈＰＥＰＴ１）細胞を用いて[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みに対する阻害効果を検討した。文献（Int. J. Cancer. 88, 274-80, 2000）記載の方法で作製したＨｅＬａ−ｈＰＥＰＴ１細胞、又はＨｅＬａ−ｐｃＤＮＡ（Ｍｏｃｋ）細胞を、マルチディッシュ（Nunc社製）に１０6細胞／ウエルで細胞を播種し、３７℃で５％ ＣＯ2下インキュベーター（ヒラサワ社製）で４日間培養した。培養液は１０％ ＦＣＳ（Gibco Laboratories社製）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium；Gibco Laboratories社製）を用いた。培養後、培養液を吸引し、各細胞を３７℃のHanks' balanced salt solution（ＨＢＳＳ；０．９５２ｍＭ ＣａＣｌ2、５．３６ｍＭ ＫＣｌ、０．４４１ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、０．８１２ｍＭ ＭｇＳＯ4、１３６．７ｍＭ ＮａＣｌ、０．３８５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、２５ｍＭ Ｄ−グルコース、１０ｍＭ ＭＥＳ：ｐＨ６．０）１ｍｌで３回洗浄後、５分間プレインキュベーションした。その後、図４及び表８に示す濃度の各阻害剤と、[3Ｈ（Ｇ）]Ｇｌｙ−Ｓａｒ（４７６ｎＭ）とを含むＨＢＳＳを２５０μｌ加え、３７℃で取り込み反応を開始させた。阻害剤ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．１〜６）の濃度は最大溶解濃度を５００μＭ以下で調製し、フィルターを用いて濾過したものを用いて取り込み反応を行った。なお、開始時に各ディッシュ内から反応溶液を１０μｌのミニバイアルに分取し、液体シンチレーションカクテル（Clear-solＩ、Nacalai tesque社製）を４ｍｌ加えて液体シンチレーションカウンター（LSC-5100、Aloka Co. Ltd.社製）にて反応溶液中の放射活性を測定した。反応開始から２分後に各ディッシュ中の反応溶液を吸引して取り除き、細胞を氷冷ＨＢＳＳ（ＨＥＰＥＳ：ｐＨ７．４）１ｍｌで３回洗うことにより反応を停止させた。その後、各ディッシュに５Ｎ ＮａＯＨを２５０μｌ加えて細胞を可溶化させ(２時間以上)、５Ｎ ＨＣｌを２５０μｌ加えて中和させた後、全量をミニバイアルに入れ液体シンチレーションカクテル（Clear-solＩ、Nacalai tesque社製）を４ｍｌ加えて細胞に取り込まれた放射活性を測定した。
【００３３】
また、上記培養後における細胞タンパク質量を測定するために、培養後の細胞を可溶化後、Bio-Rad Protein Assay試薬（Bio-Rad Co.社製）を加えた後、５９５ｎｍの吸光度を測定した。なお、標準物質としてはＢＳＡ（bovine serum albumin）を用いた。以上の結果から、細胞内への[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込み量［cell/medium ratio（μｌ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎ）］を式（３）により求めた。その結果を図４及び表８に示す。なお、図４中のコントロールの値は、阻害剤非存在下で取り込み反応を行った結果を示す。これらのことから、ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．１，２，４，６）により[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みが有意に減少することがわかった。また、ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）及びＶＫ−α−ＣＤを用いた場合においても、濃度依存的に[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みが阻害されることがわかった。しかし、Ｖａｌ−Ｌｙｓが結合していないα−ＣＤでは、有意な阻害効果は認められなかった。
【００３４】
【数３】
【表８】
実施例６［高分子ＰＥＰＴ１阻害剤のプレインキュベーションの効果］
ＶＫ−α−ＣＤをポリロタキサン化したときのＰＥＰＴ１への認識性の変化を検討することを目的として、ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）及びＶＫ−α−ＣＤ（Ｎｏ．２）で細胞をあらかじめプレインキュベーションしたときの[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みへの影響をｈＰＥＰＴ１安定発現ＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ−ｈＰＥＰＴ１）を用いて検討した。図５に示す濃度の各阻害剤存在下又は非存在下で３０分間プレインキュベーションし（白いボックス）、反応溶液を除去した後、同じ濃度の阻害剤と[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒ（４７６ｎＭ）とを含むＨＢＳＳ中で取り込み反応を行う以外は、実施例５の方法と同様に行い[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みに対する阻害効果を測定した（黒いボックス）。その結果を図５に示す。なお、図中のＭｏｃｋはＨｅＬａ−ｐｃＤＮＡ３細胞による取り込みを示す。このことから、ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）又はＶＫ−α−ＣＤ（Ｎｏ．２）のプレインキュベーションの有無によって、[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みに変化がみられた。ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）では有意な取り込みの減少が認められたのに対して、ＶＫ−α−ＣＤ（Ｎｏ．２）では有意な取り込みの増加が認められた。また、ＶＫ−α−ＣＤ（Ｎｏ．２）を超分子化したＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）の方がより強い阻害効果がみられたが、Ｖａｌ−Ｌｙｓが結合していないα−ＣＤによる阻害効果は認められなかった。
【００３７】
実施例７［セファドロキシル（ＣＤＸ）の体内動態変動によるＶＫ−ＰＲＸの吸収抑制効果の評価］
最近、腎臓のグルコーストランスポーター阻害剤であるＴ−１０９５が、ＳＴＺラット（Streptozotocin-induced diabetic rats）における高血糖状態を改善することが報告されている（Metabolism, 49, 990-5, 2000）。このことは、トランスポーター機能を抑制し生理活性物質の移行を制御することによって、病態を改善することが可能となることを示唆するものであり、新たなドラッグターゲットとしても期待されている。また、ヒトにおいて、ＰＥＰＴ１の基質である、β−ラクタム系抗生物質であるセファドロキシル［ＣＤＸ：cefadroxil（化２）］のバイオアベイラビリティーが、β−ラクタム系抗生物質であるセファレキシン［ＣＥＸ：cephalexin（化３）］の同時投与によって低下することが報告されている（Eur. J. Clin. Pharmacol. 41, 179-83, 1991）。この報告は、ＰＥＰＴ１を介したＣＤＸの消化管吸収を、同じくＰＥＰＴ１の基質であるＣＥＸが抑制したことを示すものである。そこで、ラットを用いてＰＥＰＴ１阻害剤によるＣＤＸの吸収抑制効果を検討した。
【００３８】
【化２】
【化３】
７〜８週齢のＳＤ（Sprague-Dawley）系ラット （雄性；日本ＳＬＣ社製）に５０ｍｇ／ｋｇのネンブタール（ダイナボット（株）社製）を腹腔内投与して麻酔し、背位固定後、頸静脈及び大腿静脈（瞬時静注時のみ）にカニュレーション［シリコンチューブ 内径×外径（０．５×１）］を施し、さらに、その先端を皮下に通し頚背部から貫通後、切開部を縫合した。その後、かかる動物を一晩（約１８時間）絶食させ、各薬剤を経口ゾンデ針により経口投与、あるいは、大腿静脈投与した。各薬剤投与後、経時的にカニュレーションチューブから血液４００μｌを採取し、以下の方法で血漿中におけるＣＤＸ濃度を測定し、式（４）又は式（５）、式（６）、式（７）及び式（８）により、各パラメーターを算出してWinNonlin（Scientific Consulting Inc.社製）のコンパートメントモデル解析法により解析した（辻 彰 編集、わかりやすい生物薬剤学，廣川書店，１７８−１８８，１９９６）。
【００４１】
上記採取した血液４００μｌを同量の生理食塩水で置換し、１．５ｍｌのマイクロチューブに分注して遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）を行い血漿を取り出した。血漿１５０μｌを１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、さらに同量のアセトニトリルを加え除蛋白処理し、遠心（１２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）後、上清２５０μｌを１．５ｍｌのマイクロチューブに移し蒸発乾固し、以下のＨＰＬＣ条件にて再構築した。カラムはTSKgel ODS-80Ts（東洋ソーダ社製）を、ポンプ、紫外・可視光検出器、インテリジェントオートサンプラー、及びカラムオーブンは880-PU、875-UV、AS-1555-10、及びCo-1565（全て日本分光（株）社製）を、インテグレーターはChromatopac C-R3A（島津製作所（株）社製）を使用した。また、カラム温度３５℃で、移動相に７％のアセトニトリル（０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）及び０．０１Ｍの１−ペンタンスルホン酸ナトリウムを含む）を用いて、流速０．９ｍｌ／ｍｉｎで分離溶出し、波長２４０ｎｍで検出し、血漿中におけるＣＤＸ濃度を求めた。
【００４２】
【数４】
【００４３】
【数５】
【００４４】
【数６】
【００４５】
【数７】
【００４６】
【数８】
７−１（ラットを用いたＣＤＸのＰＥＰＴ１を介した輸送に対するＣＥＸの阻害効果）
ヒトにおいて、ＰＥＰＴ１の基質であるＣＤＸのバイオアベイラビリティーが、β−ラクタム系抗生物質であるＣＥＸの同時投与によって低下するということが報告されている（Eur. J. Clin. Pharmacol., 41, 179-83, 1991）。ＶＫ−ＰＲＸのＰＥＰＴ１阻害効果を明らかにすることを目的とし、薬剤として２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（○）、５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（●）、又は、２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ及び４５ｍｇ／ｋｇのＣＥＸ（▲）をそれぞれ前記ラットに経口投与し、実施例７記載の方法によりラットにおけるＣＤＸの吸収をＣＥＸが抑制するかどうかを検討した。なお、２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ及び４５ｍｇ／ｋｇのＣＥＸ（▲）においては、ＣＤＸの投与３０分前にＣＥＸをラットに経口投与した。上記各ラットにおける体内動態の各パラメーターは、ＣＤＸの血中濃度推移をもとに式（４）、式（６）、式（７）及び式（８）を用いて算出し、評価した。その結果を図６及び表９に示す。なお、図及び表に示す値は、３〜４回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ＣＤＸを２．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇで経口投与したときの結果から、ＡＵＣ0- ∞及びＣｍａｘに飽和現象が認められた。さらに、ＣＤＸを２．５ｍｇ／ｋｇ投与したときの吸収率が８６％と十分なものであった。ＣＤＸは生体内で安定であることを含めて、ＰＥＰＴ１を介した吸収活性を評価するマーカー化合物としてＣＤＸが適切であるということが示された。また、ＣＥＸ（４５ｍｇ／ｋｇ）の前投与後にＣＤＸ（２．５ｍｇ／ｋｇ）を投与したとき、ＣＤＸ単独投与時と比較して血漿中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ0- ∞）は約３０％減少し、吸収速度定数（ｋａ）は２．４２から１．５３ｈｒ-1に、最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）は０．８から０．５μｇ／ｍｌにそれぞれ有意に減少した。以上の結果から、ヒトにおいての報告がラットで再現された。
【００４８】
【表９】
７−２（ＶＫ−ＰＲＸタイプによる吸収抑制効果の変化）
次に、薬剤として５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸのみ（○）、又は、１０ｍｇ／ｋｇのＶＫ−ＰＲＫ［０．１％のポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＮＡ）塩水に懸濁したＶＫ−ＰＲＫ］及び５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（●）を用いて、前記ラットに経口投与し、実施例７記載の方法によりラットにおけるＣＤＸの吸収をＶＫ−ＰＲＸが抑制するかどうかを検討した。なお、上記ＶＫ−ＰＲＫは、５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（●）を投与する３０分前に投与した。その際、ＣＤＸの血中濃度推移をもとに式（４）、式（６）、式（７）及び式（８）を用いて体内動態の各パラメーターを算出し、評価した。ＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．２）を用いた場合の結果を図７及び表１０に、ＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．７）を用いた場合の結果を図８及び表１１に示す。なお、図に示す値は２〜４回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を、表に示す値は３回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．２）あるいはＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．７）をＣＤＸと同時投与したが、どちらもＣＤＸ単独投与時と比較してＡＵＣ0-∞に有意な差は認められなかった。また、その他のパラメーターについても同様に有意な差は認められなかった。これらは、上記ＣＤＸ（５ｍｇ／ｋｇ）の投与量では、既に消化管吸収に飽和が生じているためＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．２）の効果が検出しにくい条件であったことが考えられる。
【００５０】
【表１０】
【表１１】
７−３（ＶＫ−ＰＲＸ投与量とその効果）
実施例７記載の方法と同様に、５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸのみ（○）、１０ｍｇ／ｋｇのＣＥＸ及び５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（▲）、又は、５．７ｍｇ／ｋｇのＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．２）及び５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（●）を同時にラットに経口投与し、体内動態の各パラメーターを算出し、評価した。その結果を図９及び表１２に示す。なお、図及び表に示す値は２〜４回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。１０ｍｇ／ｋｇのＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．２）をＣＤＸと同時に投与した場合（図７及び表１０）と同様に、５．７ｍｇ／ｋｇのＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．２）をＣＤＸと同時投与しても、ＣＤＸ単独投与時と比較してＡＵＣ0- ∞に有意な差は認められなかった。また、その他のパラメーターについても同様に有意な差は認められなかった。
【００５３】
【表１２】
７−４（懸濁化剤によるＶＫ−ＰＲＸ効果の影響）
次に各薬剤を懸濁化剤である０．１％のポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＮＡ）塩水に懸濁した場合（図１０）と、懸濁しない場合（図１１）とのＶＫ−ＰＲＸの効果の違いを調べるために、１０ｍｇ／ｋｇのＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．７）及び２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸ（●）、又は、２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸのみを経口投与し、各ラットにおける体内動態の各パラメーターを実施例７記載の方法と同様に算出し、評価した。なお、ＶＫ−ＰＲＫの経口投与はＣＤＸ投与３０分前に行った。ＰＡＮＡに懸濁した場合の結果を図１０及び表１３に、懸濁していない場合を図１１及び表１４に示す。なお、図１０、図１１及び表１４に示す値は４回の、表１３に示す値は３回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。これらの結果から、ＶＫ−ＰＲＫ（Ｎｏ．７）を懸濁化剤に溶解させＣＤＸと同時投与しても、ＣＤＸ単独投与時と比較してＡＵＣ0- ∞に有意な差が認められず、その他のパラメーターについても同様に有意な差が認められなかった。一方、ＰＡＮＡに懸濁させずに同じ条件でＶＫ−ＰＲＫを投与したときＡＵＣ0-∞は有意に減少することがわかった。さらに、ＶＫ−ＰＲＫの同時投与によってｋａは２．４２から１．７５ｈｒ-1に、Ｃｍａｘは０．８から０．６４μｇ／ｍｌにそれぞれ有意に減少し、Ｔｍａｘは０．９５から１．１８ｈｒに有意に延長していた。しかし、消失速度定数（ｋｅ）については有意な差は認められなかった。
【００５５】
【表１３】
【表１４】
７−５（ＶＫ−ＰＲＸの前投与の有効性）
また、ＶＫ−ＰＲＸの前投与の有効性についても調べてみた。２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸと１０ｍｇ／ｋｇＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）とを同時に経口投与した場合（●）、又は、２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸのみを経口投与した場合（○）の体内動態の各パラメーターを、実施例７記載の方法と同様に算出し、評価した。その結果を図１２及び表１５に示す。なお、図に示す値は３回の、表に示す値は４回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。その結果、ＣＤＸと同時にＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）を投与したものは、ＣＤＸ単独投与時のものと比較してＡＵＣ0- ∞に有意な差は認められなかった。しかしながら、ＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）を前投与し、３０分後にＣＤＸを投与した場合（図１１及び表１４）では、ＡＵＣ0- ∞に有意な減少が認められ、また、前投与の有無に関わらずｋａの有意な減少が認められた。
【００５８】
【表１５】
実施例８［ＶＫ−ＰＲＸの静注後のＣＤＸ体内動態への影響］
ＶＫ−ＰＲＸは高分子化合物であることから、消化管吸収を受けないものと考えられる。しかし、経口投与したＣＥＸがＣＤＸの排泄を促進することも知られており、ＶＫ−ＰＲＸがＣＤＸのＡＵＣ0- ∞を低下させた作用が必ずしも吸収性低下のみでは説明できない。一方、ＣＤＸは腎臓からの再吸収に非線形性があることが知られている（Drug Metab. Dispos. 21, 215-7, 1993、Drug Metab. Dispos. 22, 447-50, 1994）。また、その再吸収にはオリゴペプチドトタンスポーターが関与している。そこで、２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸを瞬間静注し、同時に１０ｍｇ／ｋｇのＶＫ−ＰＲＸ（Ｎｏ．７）［生理食塩水に溶解したＶＫ−ＰＲＫ］を経口投与したラット（○）におけるＣＤＸのクリアランス（ＣＬ：腎排泄）に対する影響を、２．５ｍｇ／ｋｇのＣＤＸを瞬間静注したラット（●）と比較するため、実施例７記載の方法で体内動態の各パラメーターを算出し、評価した（図１３及び表１６）。なお、図及び表に示す値は３回の個別の実験により求められた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。その結果、ＶＫ−ＰＲＸの投与によってＣＤＸの血漿中濃度推移は変化せず、前記ＡＵＣ0- ∞変化は腎の排泄・再吸収過程ではなく、消化管吸収への影響であることが明らかとなった。また、既にＰＲＸに担持されたペプチドの物理的安定性が向上することが明らかにされており（Pharm. Res. 16, 1331-1343, 1999）、得られた結果はＶＫ−ＰＲＸが消化管吸収を受けないかあるいは吸収されにくい化合物であることを支持するものである。以上の結果から、高分子ＰＥＰＴ１阻害剤が非吸収性化合物としてＰＥＰＴ１を介した吸収を阻害することが明らかとなった。この結果は、ＰＥＰＴ１を介した蛋白質の吸収抑制へと繋がるものである。
【００６０】
【表１６】
【発明の効果】
本発明の組織特異的トランスポーター阻害剤は、小腸から吸収されない、又は吸収されにくいため、小腸からの栄養物の吸収を特異的に低下させることにより組織機能不全疾患又は腎不全の患者の食事療法によるＱＯＬ低下を防ぐことができる。また、かかる組織特異的トランスポーター阻害剤は、腎疾患等の組織疾患を発症させない予防医学及び腎不全を透析に至らせない保存期治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ポリロタキサンの合成手順を示す図である。
【図２】ペプチドトランスポーターに認識されるバリルリジン誘導体の合成手順を示す図である。
【図３】本発明の組織特異的トランスポーター阻害剤であるＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン結合体の合成手順を示す図である。
【図４】ＨｅＬａ−ｈＰＥＰＴ１細胞による[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みに対するＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサンの阻害効果を示す図である。
【図５】ＨｅＬａ−ｈＰＥＰＴ１細胞による[3Ｈ]Ｇｌｙ−Ｓａｒの取り込みに対するＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン又はＶａｌ−Ｌｙｓ−α−サイクロデキストリンの前投与に対する効果を示す図である。
【図６】ラットへのセファキシレンの投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。
【図７】ラットへのＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．２）の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。
【図８】ラットへのＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．７）の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。
【図９】ラットにＣＤＸと、セファレキシン又はＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．２）とを投与したときの血漿中におけるセファドロキシルの濃度経時変化の結果を示す図である。
【図１０】ラットへのＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．７）の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。
【図１１】ラットへのＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．７）の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。
【図１２】ラットへのＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．７）の投与又は非投与後におけるセファドロキシルの血漿中濃度経時変化の結果を示す図である。
【図１３】ラットにＣＤＸを瞬間静注し、それと同時にＶａｌ−Ｌｙｓ−ポリロタキサン（Ｎｏ．７）を経口投与した時の血漿中におけるセファドロキシルの濃度経時変化の結果を示す図である。
Claims (4)
- オリゴペプチドトランスポーター１（ＰＥＰＴ１）が認識するジペプチド又はトリペプチドと、膜組織を透過できない高分子分子構造とをもち、前記高分子分子構造が、多数のシクロデキストリンに線状分子が貫通し、該線状分子の両末端を嵩高い置換基でキャップしたロタキサン化合物構造であることを特徴とする組織特異的トランスポーター機能阻害剤。
- 線状分子が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤。
- 嵩高い置換基が、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンであることを特徴とする請求項１又は２記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤。
- オリゴペプチドトランスポーター１（ＰＥＰＴ１）が認識するジペプチド又はトリペプチドが、バリルリジン（Ｖａｌ−Ｌｙｓ）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の組織特異的トランスポーター機能阻害剤。
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