CN117534727A - 一种食源性降压肽的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食源性降压肽的制备方法和应用，本发明以食源性新型降压肽为研究目标，采用固相合成方法合成高纯度及高产率的多肽化合物，通过一系列表征分析方法描述了降压肽的化学结构、理化性质及纳米构象。应用LC‑MS/MS分析技术开发了一种灵敏性高且重现性好ACE（血管紧张素转化酶）活性检测方法。根据降压肽的特点，分别考察了降压肽在胃蛋白酶、胰蛋白酶及血液中的稳定性。优化了生物样品前处理方法，建立了高灵敏度、高特异性的LC‑MS/MS生物样品分析方法，同时考察了静脉注射和灌胃两种给药方式，系统研究了降压肽在SD大鼠体内的药代动力学特征。全面评估了降压肽在细胞水平及组织水平的生物毒性，为新型降压药物的开发及成药性评价奠定研究基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽的制备方法和应用，尤其涉及一种食源性降压肽的制备方法和应用，属于化合物合成技术领域。
背景技术
心血管疾病的发病率与死亡率多年来一直居高不下，如何有效地预防和治疗该类疾病，已成为临床心脑血管疾病治疗的关键和新药研发人员关注的重点。高血压是诱发心脑血管疾病的主要因素，以动脉血压持续升高为特征。2023《中国高血压防治指南》确定高血压诊断界值仍为 140/90mmHg。高血压常伴有心脏、血管、脑和肾等器官功能性或器质性改变，具有发病率高、致残率高等特征，严重威胁着人们的健康和生活质量。其危害性仅次于肿瘤，被国际上称为“无声杀手”，是诱发心脑血管疾病的主要因素之一。高血压疾病常常采用抗高血压药物来控制主要包括ACE（血管紧素张转化酶）抑制剂、利尿剂、钙通道阻滞剂等。血管紧张素转化酶-I（ACE（血管紧张素转化酶））是调节机体血压的重要水解酶，它可以催化非活性血管紧张素I（Ang I）转化为一种有效的血管收缩剂血管紧张素II（Ang II），同时灭活血管扩张剂缓激肽，从而引起血压升高。抑制血管紧张素转化酶I可以抑制血管紧张素II的生成同时提高缓激肽的活性，从而起到舒张血管的作用，长期服用ACE（血管紧张素转化酶） 抑制剂，能有效降低高血压病人机体血压，减少相关疾病的发生。因此，ACE（血管紧张素转化酶） 是治疗高血压病及其并发症重要药物靶标。
与合成的药物相比，食品中提取出来的多肽更为安全，目前已经有多种具有抗高血压的多肽被成功的分离、鉴定和表征。藜麦是一种全谷全营养完全蛋白碱性食物，蛋白质含量高达16%-22%。富含多种氨基酸，其中有人体必需的全部9种必需氦基酸，比例适当且易于吸收。藜麦蛋白中富含植物中缺乏的赖氨酸、不饱和脂肪酸、类黄酮、B族维生素、维生素E、胆碱、β-葡聚糖等多种有益化合物。藜麦被国际营养学家们称为丢失的远古“营养黄金”“超级谷物”“未来食品”，还被素食爱好者奉为“素食之王”备受爱戴，是未来最具潜力的食品之一。研究发现藜麦蛋白提取物具有抗氧化、降血糖、免疫调节活性、降低高血压等一系列的生物活性。
常用的口服降血压药卡托普利、依那普利和赖诺普利等，尽管这些降压药物的降压效果明显，但存在降压过度、泌尿系统病变、皮疹、持续性咳嗽和血管神经性水肿等一系列副反应。因此，寻找安全高效的新型抗血压的药物，已经成为高血压及心血管疾病治疗领域亟待解决的关键问题。大多数抗高血压多肽类药物仍处于体外和动物实验阶段，需进一步开展药学研究和安全性评价，深入探讨作用机制，完善药学及药理学相关研究数据，为新型降压药物的开发及成药性评价奠定研究基础。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种食源性降压肽的制备方法；本发明的另一目的是提供一种血管紧张素转化酶活性检测方法。
技术方案：本发明的一种食源性降压肽，所述食源性降压肽具有如下化学结构：
。
另一方面，本发明提供一种上述的食源性降压肽的制备方法，包括以下步骤：
2-氯三苯甲基氯树脂加入固相合成管中，活化之后连接Fmoc-Arg-OH；封闭活化位点，得到化合物1；
脱去化合物1中的保护基团Fmoc，连接Fmoc-Pro- OH，得到化合物2；
脱去化合物2中的保护基团Fmoc，连接Fmoc-Phe- OH，得到化合物3；
脱去化合物3中的保护基团Fmoc，连接Fmoc-Pro- OH，得到化合物4；
脱去化合物4中的保护基团Fmoc，连接Fmoc-His- OH，得到化合物5；
脱去化合物5中的保护基团Fmoc，连接Fmoc-Phe- OH，得到化合物6；
脱去化合物6中的保护基团Fmoc和树脂，得到目标产物FR6。
优选2-氯三苯甲基氯树脂1g～1.5g，活性位点多，产率高，副产物少。
优选地，2-氯三苯甲基氯树脂活化所使用的试剂为二氯甲烷。
优选地，2-氯三苯甲基氯树脂活化时间为30min～45min。
优选地，封闭活化位点所使用的试剂为二氯甲烷、甲醇和N,N-二异丙基乙胺的混合溶液。
优选地，封闭活性位点的混合溶液分两次加入，每次反应15 min～20min。
优选地，脱去各化合物中的保护基团Fmoc所使用的溶剂为哌啶和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液。
优选地，脱去各化合物中的保护基团Fmoc所用的混合溶液分两次加入，第一次需时间 5min～10min，第二次30 min～45min。
优选地，连接Fmoc-Arg- OH的反应溶剂为N,N-二异丙基乙胺溶液。
优选地，连接Fmoc-Pro- OH的反应溶剂为O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基乙胺的混合溶液。
优选地，监测连接是否完全采用茚三酮试剂。
优选地，化合物全部连接后，裂解液选用三氟乙酸溶液，产物与三氟乙酸溶液比例1g:100ml。
优选地，冰浴后（0～4摄氏度）的无水乙醚作为萃取溶液。
优选地，产物在冰浴的无水乙醚中超声10 min～15min，静止1h～2h。
优选地，向沉淀产物加入无菌二次蒸馏水，冻干得白色粉末FR6。
另一方面，本发明提供一种利用上述的食源性降压肽的血管紧张转化酶活性检测方法，所述血管紧张转化酶活性检测方法包括以下步骤：
将食源性降压肽溶于缓冲溶液中，得到食源性降压肽溶液；上述食源性降压肽溶液与HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）溶液孵育一段时间，然后再加入ACE（血管紧张素转化酶）溶液，继续孵育一段时间；加入HCl终止反应，取上清液，通过LC-MS/MS方法测定上清液中马尿酸的生成峰面积；其中，缓冲溶液作为空白对照组；
通过以下公式计算血管紧张素转化酶活性抑制率Inhibition ratio：
Inhibition ratio（%）= 1 - A1/ A2* 100%
其中，A1为样品反应生成HA峰面积，A2为对照组生成HA峰面积。
优选地，血管紧张素转化酶溶液的浓度为125mU/mL；马尿酰-组氨酰-亮氨酸溶液的浓度为4.15mmol/L。
优选地，加入ACE（血管紧张素转化酶）溶液继续孵育的时间为60min~80min。
作为一个优选地实施例，提供一种食源性降压肽的制备方法，包括以下步骤：
称取适量2-氯三苯甲基氯树脂（1.0~1.2 mmol/g）加入固相合成管中，活化之后依次连接所有氨基酸序列，至Fmoc-Phe-OH连接成功并脱去Fmoc，加入99% TFA（三氟乙酸）搅拌切去树脂过滤留取滤液，加入0℃乙醚分散得固体沉淀物加入适量重蒸水，冷冻干燥获得FR6产物，产率约98.7%。
作为一个优选地实施例，提供一种体外验证降压肽FR6对血管紧张素转化酶抑制作用方案，该方案作用原理为：血管紧张素转化酶在37℃、PH8.3的条件下催化分解血管紧张素I的模拟物马尿酰-组氨酰-亮氨酸（HHL）产生马尿酸（HA）。当加入血管紧张素转化酶抑制剂时，血管紧张素转化酶对马尿酰-组氨酰-亮氨酸的催化分解作用受到抑制，马尿酸的生成量减少。通过对加入ACEI（血管紧张素转化酶抑制剂）前后所生成马尿酸紫外吸收的大小差别即可算出抑制活性的大小。
目前的测定方法主要包括紫外分光光度法与高效液相色谱法。马尿酸的最大紫外吸收波长为228nm，研究中发现马尿酸、血管紧张素转化酶以及FR6在228nm处均有紫外吸收，并且血管紧张素转化酶（3.23min）与马尿酸（3.21min）的出峰时间基本一致，很难通过调整色谱条件对二者进行很好的分离。由于紫外分光光度法与高效液相色谱法对马尿酸含量变化的测定特异性与专一性较差，本发明选择了专属性较强的HPLC-MS/MS法对马尿酸进行分析。采用多反应监测（MRM）模式进行定量分析，马尿酸监测的离子对为m/z 180→105，在10~6000ng/mL范围内线性良好（R2= 0.9995）。本发明对反应中所使用的血管紧张素转化酶和马尿酰-组氨酰-亮氨酸的用量以及反应时间进行了考察，确定了血管紧张素转化酶和马尿酰-组氨酰-亮氨酸的使用量分别为：40μL血管紧张素转化酶（125mU/mL）及75µL马尿酰-组氨酰-亮氨酸（4.15mmol/L）。最终，本发明得到了一种专属性和准确度均较好的分析方法。
本发明的技术关键点在于：
以食源性降压肽FR6为研究目标，应用LC-MS/MS分析技术开发了一种灵敏性高且重现性好血管紧张素转化酶活性检测方法，对降压肽的理化性质、胃肠稳定性及血液稳定性进行了考察。优化了生物样品前处理方法，分别考察了尾静脉注射或灌胃两种给药方式后，研究降压肽FR6在SD大鼠体内的药代动力学特征，同时评估了降压肽在细胞及组织水平的生物毒性。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明使用固相多肽合成技术制备了高纯度和高产率的食源性降压肽，通过理化性质表征、血管紧张素转化酶活性检测方法的开发与应用、细胞及组织生物毒性以及药代动力学研究的考察，系统评估了降压肽的药学性质。结果表明，降压肽FR6对胰蛋白酶和胃蛋白酶稳定，在血液中降解快，适合口服给药。并且，降压肽在细胞水平及组织水平的几乎没有生物毒性，本工作为新型降压药物的开发及成药性评价奠定研究基础。
附图说明
图1为降压肽FR6作用机制图；
图2为本发明的降压肽FR6的[M+H]+图；
图3为FR6的核磁图；
图4为FR6表征图；其中（A）为降压肽FR6紫外图谱、（B）为圆二色谱、（C）为XRD晶型衍射图谱；
图5为血管紧张素转化酶与马尿酰-组氨酰-亮氨酸反应条件的考察；其中（A）为产物马尿酸的标准曲线；(B) 为HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）量为622.5nmol时ACE（血管紧张转化酶）用量对马尿酸生成量的影响；（C）为ACE（血管紧张转化酶）用量为5mU时HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）用量对马尿酸生成量的影响；（D）为孵育时间对马尿酸生成的影响；
图6为降压肽FR6对血管紧张素转化酶的抑制作用及生物特性；其中（A）为降压肽对血管紧张素转化酶的抑制活性；（B）为降压肽对ACE（血管紧张转化酶）抑制作用Lineweaver-Burk双倒数图；（C）为HUVEC与降压肽共孵育24h后细胞存活率; （D）为FR6在SD大鼠血浆中的血浆稳定性（n=3, Mean±SD）；
图7为FR6经灌胃和尾静脉注射后SD大鼠体内药代动力学及生物毒性研究；其中（A）为SD大鼠尾静脉注射10mg/kg的平均血药浓度-时间曲线（n=5，Mean±SD）；（B）为灌胃50mg/kg的平均血药浓度-时间曲线（n=5，Mean±SD）；（C）为FR6分别经尾静脉（iv）、灌胃（io） 后SD大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏组织HE染色结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
如图1所示，本发明实施例以食源性新型降压肽为研究目标，采用固相合成方法合成高纯度及高产率的多肽化合物，通过一系列表征分析方法描述了降压肽的化学结构、理化性质及纳米构象。应用LC-MS/MS分析技术开发了一种灵敏性高且重现性好ACE（血管紧张素转化酶）活性检测方法。根据降压肽的特点，分别考察了降压肽在胃蛋白酶、胰蛋白酶及血液中的稳定性。优化了生物样品前处理方法，建立了高灵敏度、高特异性的LC-MS/MS生物样品分析方法，同时考察了静脉注射和灌胃两种给药方式，系统研究了降压肽在SD大鼠体内的药代动力学特征。全面评估了降压肽在细胞水平及组织水平的生物毒性，为新型降压药物的开发及成药性评价奠定研究基础。
实施例 1
FR6的合成：称取约1g 2-氯三苯甲基氯树脂（1.0~1.2 mmol/g）加入固相合成管中，加入20mL DCM（二氯甲烷），活化30min后过滤，DCM（二氯甲烷）洗涤3次，每次摇摆2min。向上述固相合成管中加入Fmoc-Arg-OH、DIPEA（N,N-二异丙基乙胺）和20mL DCM（二氯甲烷），摇摆2h抽干， DCM（二氯甲烷）洗涤3次，每次约2min，得化合物1。
加入DCM（二氯甲烷）/MeOH（甲醇）/DIPEA（N,N-二异丙基乙胺）（80:15:5）混合液15mL封闭树脂活化位点，摇摆15min后抽干，再加入上述混合液15mL，摇摆15min后抽干，用DMF（N,N-二甲基甲酰胺）洗涤5次，每次摇摆约2min。 加入20% 哌啶/DMF（N,N-二甲基甲酰胺）（V/V）溶液20mL摇摆5min抽干后， 再加入该溶液20mL摇摆30min，洗涤5次，每次摇摆约2min；加入适量的Fmoc-Pro-OH、TBTU（O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯）、HOBT（羟基苯并三唑） 和DIPEA（N,N-二异丙基乙胺），用10mL DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解后，加至上述固相合成管中，再加入10mL DMF（N,N-二甲基甲酰胺），摇摆3小时后，分别用DCM（二氯甲烷）和DMF（N,N-二甲基甲酰胺）洗涤5次，每次摇摆2min，得化合物2。
加入20% 哌啶/DMF（N,N-二甲基甲酰胺）（V/V）溶液20mL摇摆5min抽干后， 再加入该溶液20mL摇摆30min，洗涤5次，每次摇摆约2min；加入适量的Fmoc-Phe-OH、TBTU（O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯）、HOBT（羟基苯并三唑） 和DIPEA（N,N-二异丙基乙胺），用10mL DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解后，加至上述固相合成管中，再加入10mL DMF（N,N-二甲基甲酰胺），摇摆3小时后，分别用DCM（二氯甲烷）和DMF（N,N-二甲基甲酰胺）洗涤5次，每次摇摆2min，得化合物3。
加入20% 哌啶/DMF（N,N-二甲基甲酰胺）（V/V）溶液20mL摇摆5min抽干后， 再加入该溶液20mL摇摆30min，洗涤5次，每次摇摆约2min；加入适量的Fmoc-Pro-OH、TBTU（O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯）、HOBT（羟基苯并三唑） 和DIPEA（N,N-二异丙基乙胺），用10mL DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解后，加至上述固相合成管中，再加入10mL DMF（N,N-二甲基甲酰胺），摇摆3小时后，分别用DCM（二氯甲烷）和DMF（N,N-二甲基甲酰胺）洗涤5次，每次摇摆2min，得化合物4。
加入20% 哌啶/DMF（N,N-二甲基甲酰胺）（V/V）溶液20mL摇摆5min抽干后， 再加入该溶液20mL摇摆30min，洗涤5次，每次摇摆约2min；加入适量的Fmoc-His-OH、TBTU（O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯）、HOBT（羟基苯并三唑） 和DIPEA（N,N-二异丙基乙胺），用10mL DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解后，加至上述固相合成管中，再加入10mL DMF（N,N-二甲基甲酰胺），摇摆3小时后，分别用DCM（二氯甲烷）和DMF（N,N-二甲基甲酰胺）洗涤5次，每次摇摆2min，得化合物5。
加入20% 哌啶/DMF（N,N-二甲基甲酰胺）（V/V）溶液20mL摇摆5min抽干后， 再加入该溶液20mL摇摆30min，洗涤5次，每次摇摆约2min；加入适量的Fmoc-Phe-OH、TBTU（O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯）、HOBT（羟基苯并三唑） 和DIPEA（N,N-二异丙基乙胺），用10mL DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解后，加至上述固相合成管中，再加入10mL DMF（N,N-二甲基甲酰胺），摇摆3小时后，分别用DCM（二氯甲烷）和DMF（N,N-二甲基甲酰胺）洗涤5次，每次摇摆2min，得化合物6。
加入20% 哌啶/DMF（N,N-二甲基甲酰胺）（V/V）溶液20mL摇摆5min抽干后，再加入该溶液20mL摇摆30min，洗涤5次，每次摇摆约2min，脱去Fmoc加入99% TFA（三氟乙酸）搅拌2-3小时脱去树脂，过滤留取滤液，再用新鲜的TFA（三氟乙酸）冲洗树脂2-3次，收集滤液旋蒸浓缩。加入0℃乙醚分散得固体，超声15min后静置2h。 过滤得固体，乙醚淋洗3次后，沉淀物加入适量重蒸水，冷冻干燥获得FR6产物，产率约98.7%。
上述制备方法中，做以下更改：将2-氯三苯甲基氯树脂的加入量为1.5g；2-氯三苯甲基氯树脂活化时间改为45min；封闭活性位点的混合液分两次加入，每次反应20min；脱去各化合物中的保护基团Fmoc所用的混合溶剂分两次加入，第一次需时间 10min，第二次45min；产物在冰浴的无水乙醚中超声10 min，静止1h。其余步骤不变，最终制得FR6产物。
图2 ESI-MS: C40H53N11O7, calc.MW = 799.9, Exact Mass=799.4, obsvd. [M+H]+=400.6，1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)（图3）.
FR6的水溶液（2mg/mL）在255nm波长处具有明显的紫外吸收(图4A)。采用CD光谱研究了FR6在纯水中的空间构象，实验结果显示，降压肽在190-194nm显示正吸光值，表现为α-螺旋的结构特征。在195-214nm显示负吸光值，而在215nm-231nm范围内有更强的正吸光值。无规则卷曲的结构特征表现为：在198nm有一个较强的负峰，在220nm处表现为小而宽的正峰。CD光谱中处于230-270nm范围内表现为色氨酸（Typ）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）的特征吸收峰，FR6在230-250nm范围内显示负吸收值，此负吸收峰表现为多肽序列中Phe的特征吸收。综上所述，FR6在纯水中的结构为α-螺旋和较多的无规则卷曲，并在230-250nm范围内表现为Phe的特征吸收（图4B）。取FR6适量，平铺于石英槽轻轻压平，以Cu靶为发射器，在电压40kV， 电流50mA， 步距0.02 °， 衍射角度3 ~ 40 °的条件下进行分析。Ｘ射线衍射法常 用用于鉴定晶体化合物 ，XRD晶型衍射表明FR6没有衍射峰，即无定形状态（图4C）。
实施例 2
马尿酸（HA）HPLC-MS/MS分析方法：多肽与ACE（血管紧张转化酶）反应后生成底物马尿酸，本实验通过开发LC-MS/MS方法对马尿酸生成量进行测定。高效液相色谱（HPLC,Agilent1260, 美国）配置高压双泵（G1312B）、真空脱气器（G4225A）、自动进样器（G1367E）、柱温控制单元（G1330B）。色谱分离采用ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1mm×150mm, 3.5μm），柱温35℃。流动相由含有0.1%甲酸的水溶液（A）和含有0.1%甲酸的甲醇溶液（B）组成。采用等度梯度洗脱的程序：95% B保持4min，流速为0.3 mL/min，自动进样温度设置为4℃，进样量1μL。API 4000质谱仪（Applied Biosystems, Sciex, 美国)）配备了三重四极质谱仪、ESI源正离子模式和Analyst 1.6.2数据采集系统，采用多反应监测（MRM）模式进行定量分析，监测的离子对为m/z 180→105（马尿酸），停留时间设置为300ms。辅助加热温度（TEM）为550℃，离子喷射电压（IS）为5500 v。碰撞气体（CAD）、气帘气体（CUR）、离子源气体1（GS1）、气体2 （GS2） 等源气参数分别为6psi、35 psi、35 psi、40 psi。马尿酸的去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）、入口电压（EP）和出口电压（CXP）等电参数分别为30V、10V、10V和10V。
考察ACE（血管紧张转化酶）与底物HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）最佳用量及孵育时间：为确定酶与底物的最佳比例，取75μL HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸） （8.3mmol/L）和30μL硼酸盐缓冲液（PH=8.3，0.1mol/L硼酸盐缓冲液，含有0.3mol/LNaCl），在37℃下孵育10min。分别加入40μL不同浓度ACE（血管紧张转化酶）溶液，ACE（血管紧张转化酶）最终用量分别为0.625 、1.25 、2.5 、5 、7.5 、10 、12.5 、15、20mU（n=3）。37℃孵育40min，加入155μLHCl （1mol/L）停止反应，冷却至室温，离心10min，取上清液过0.22μm滤膜。取20μL样品加入180μL甲醇，涡旋5min ，13000g离心5min，取150μL上清进样。相同实验条件下，将ACE（血管紧张转化酶）用量定为5mU，分别加入不同浓度HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）（9.7、19.5、38.9、77.8、155.6、311.2、622.5nmol，n=3），确定HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）最佳用量。
采取以下操作探究时间对实验结果的影响：取30μL硼酸盐缓冲液和75μL HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）（4.15mmol/L） 37℃下孵育10min，加入40μLACE（血管紧张转化酶）（125mU/mL），37℃孵育分别孵育20min、40min、60min、80min（n=3），加入155μLHCl（1mol/L）停止反应，冷却至室温，离心10min，取上清液过0.22μm滤膜。取20μL样品加入180μL甲醇，涡旋5min ，13000g离心5min，取150μL上清进样。实验结果表明，马尿酸线性方程为：y = 906x + 1.62e+004 (R2= 0.9999)（图5A）， HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）用量确定的情况下随着ACE（血管紧张转化酶）量不断增加，生成的产物马尿酸（HA）含量不断增加（图5B）。由于HA（马尿酸）的生成量并未随着ACE（血管紧张转化酶）含量的改变而达到平台期，需进一步对HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）的量进行研究。确定ACE（血管紧张转化酶）含量为5mU后，分别加入不同浓度的HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）孵育40min后对HA（马尿酸）的生成量进行考察。结果表明，在HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）用量为311.2nmol时，HA（马尿酸）的生成量达到平台期（图5C），ACE（血管紧张转化酶）和HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）的最终使用量分别为：40μLACE（血管紧张转化酶）（125mU/mL）及75µL HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）（4.15mmol/L）。ACE（血管紧张转化酶）和HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）分别孵育60min与80min后（图5D），HA的生成量无明显差异（P>0.5），之后所有相关实验的孵育时间均设置为60min。
实施例 3
体外验证降压肽FR6对血管紧张素转化酶抑制作用：经过实施例2的研究，最终确定测定ACE（血管紧张转化酶）抑制活性的操作步骤如下：将食源性降压肽溶于硼酸盐缓冲液（PH=8.3，0.1mol/L硼酸盐缓冲液，含有0.3mol/L NaCl）分别配制成1.25、6.25、12.51、25.02、50.04、100.08、250.19μmol/L 的溶液。取30μL多肽溶液和75μL HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）（4.15mmol/L） 37℃下孵育10min，加入40μLACE（血管紧张转化酶）（125mU/mL），37℃孵育60min，加入155μLHCl（1mol/L）停止反应，冷却至室温，离心10min，取上清液过0.22μm滤膜。取20μL样品加入180μL甲醇，涡旋5min ，13000g离心5min，取150μL上清进样。硼酸盐缓冲液作为空白对照，按照公式1计算抑制率。以生成物马尿酸（HA）浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，马尿酸浓度分别为5、20、50、100、500、1000ng/mL。通过Lineweaver-Burk图探索降压肽的ACE（血管紧张转化酶）抑制模式。HHL（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）浓度分别设为0.2594、0.519、1.038、2.08mM，多肽浓度分别设为0（对照）、10、50、100µg/mL。以底物浓度倒数（1/S）为横坐标，以反应速率倒数（1/V）为纵坐标，利用米氏方程（Michaelis-Menten equation）（公式2）求出Vmax和Km，纵截距表示1/Vmax，横截距表示1/Km。
Inhibition ratio（%）= 1 - A1/ A2* 100% （公式1）
A1为样品反应生成HA峰面积，A2为对照组生成HA峰面积
（公式2）
FR6对ACE（血管紧张转化酶）的抑制活性如图6A所示，结果表明，FR6对血管紧张素转换酶具有一定抑制能力，抑制率随浓度增加而逐渐增加，并呈量效关系，在多肽浓度为250.2μmol/L时，抑制率达到82.02±1.02%。其半数抑制浓度IC50为45.20μmol/L。马尿酸线性方程为：y = 906 x + 1.62e+004 (R2= 0.9999)，FR6对ACE（血管紧张转化酶）抑制作用Lineweaver-Burk图（图6B）所示，抑制动力学参数如表1所示，随着降压肽浓度的增加，酶促反应最大反应速率Vmax减小，米氏常数Km不变。因此，降压肽对ACE（血管紧张转化酶）的抑制作用类型为非竞争性抑制。
表1 FR6对ACE（血管紧张转化酶）抑制动力学参数
实施例 4
细胞生物毒性与稳定性：采用噻唑蓝法研究了降压肽对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的生物毒性。将HUVEC以1x105个/孔的密度接种于96孔板，并置于培养箱中过夜。将100uL含有不同浓度的多肽溶液加入到孔内，在培养箱中孵育过夜后，将培养基吸掉，重新加入100 μl新鲜的培养基继续培养24h。弃去培养液，向每孔中加入100 µL 噻唑蓝溶液（0.5 mg/mL）并置于培养箱再孵育4h,使其充分与活细胞作用形成甲躜结晶。最后，小心地将含有噻唑蓝的培养基吸走，并向每孔中加入150 μL DMSO（二甲基亚砜）溶液，震荡15min使甲躜结晶充分溶解。使用酶标仪测量每孔在490 nm或570 nm处的吸光度,并且以PBS孵育的细胞为空白对照（存活率为100%）。实验平行进行5组，最终结果取平均值，并通过下列公式计算细胞存活率。合成肽（1mg/mL）依次经过胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解，考察其稳定性。胃肠道稳定性：按照酶和底物（1：50，w/w）加入适量胃蛋白酶，用1mol/L盐酸调节pH至2.0，在37℃下水解90min。然后按照酶和底物（1：50，w/w）加入适量胰蛋白酶，用NaOH（1mol/L）调节pH至7.0，在37℃下水解4h。水解结束后，将混合物体系煮沸10min，使酶失活。水解液冷却至室温后，10000g离心10min，取上清液200ul加入800ul甲醇，涡旋，10000g离心10min，取上清液进样。样品采用LC-MS/MS分析法进行检测。对照组样品处理时需要提前将酶煮沸失活，其余步骤和上述保持一致。血浆稳定性：清洁级雄性SD大鼠，180g～220g，购于杭州医学院（合格证号:SCXK（浙）2019-0002）。在持续温度(24 ± 1°C)、相对湿度(50 ± 10%)和12 h昼夜周期下，每天给予充足的食物和水。动物实验按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》(NIH出版物第8023号，1978年修订)的指导方针进行，并得到中国药科大学动物伦理委员会的批准（批准号：2023-11-001）。SD大鼠眼眶后静脉丛采集新鲜血液，加到1.5%肝素钠抗凝的离心管中，814g离心10min，取血浆备用。配制含有FR6浓度为500ng/mL的血浆样品，按照0、15min、30min、45min、60min、120min、240min在室温放置不同时间来评估大鼠血浆中的稳定性（每个时间点n=3）。孵育相应时间后立即按“2.6.2血浆样品处理”进行生物样本的处理，进行LC-MS/MS分析。
Cell viability （%） = OD sample / OD control × 100% （公式3）
应用SPSS19.0进行分析，正态计量数据采用“x ± s”表示，p<0.05为差异有统计学意义。
Stability% = A1 / A2 （公式4）
A1为样品酶解之后峰面积，A2为对照组峰面积
噻唑蓝FR6是否对HUVEC产生细胞毒性，结果如图6C所示。在FR6与HUVEC细胞共同孵育24h后发现，随着FR6浓度的不断增加，细胞活力未受到影响。FR6浓度达到375.28µmol/L时，细胞存活率仍然保持在100%。结果表明，FR6对细胞无毒性。FR6经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，稳定性表现为95.94%±3.01%，具有较好的稳定性，表明多肽FR6通过胃肠道时可以避免被胃蛋白酶和胰蛋白酶降解。对FR6在SD大鼠空白血浆中室温放置3h稳定性的考察结果如图6D所示，FR6在SD大鼠空白血浆中室温放置15min后，浓度降低到314.33±31.18ng/mL（初始浓度500 ng/mL）。结果表明，FR6在SD大鼠血浆中稳定性较差，容易被血浆中各种酶代谢降解。为提高其在血浆中的稳定性，实验过程中曾尝试在全血中提前加10%H2SO4，混匀后离心取血浆再进行后续的实验。结果发现，加入适量酸虽然可以提高稳定性，但是酸容易破坏血液中的红细胞，影响抗凝效果并导致溶血。因此，为了降低降压肽被血浆中酶解，在样品处理过程中需要注意处理的时间。在大鼠药代动实验中获得血样后需立即离心获得血浆，并立即加入内标进行生物样本的处理。同时为了降低血浆中酶对FR6的影响，本研究对样品配制过程中的加样顺序进行了调整，加样顺序依次为降压肽、内标、蛋白沉淀剂（甲醇），最后加入血浆。
实施例 5
药代动力学研究：色谱分离采用Wondasil C18 Superb（4.6 mm×150mm, 5μm），柱温35℃。流动相由含有0.1%甲酸的水溶液（A）和含有0.1%甲酸的甲醇溶液（B）组成。采用梯度洗脱的程序：0～1min, 30% B, 1～9 min, 70% B, 9.1～12min, 30% B。流速为0.5 mL/min，自动进样温度设置为4℃，进样量5μL。采用多反应监测（MRM）模式进行定量分析，监测的FR6离子对为m/z 400.7→285.1，辅助加热温度（TEM）为550℃，离子喷射电压（IS）为5500v。碰撞气体（CAD）、气帘气体（CUR）、离子源气体1（GS1）、气体2 （GS2） 等源气参数分别为6psi、35 psi、35 psi、40 psi。去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）、入口电压（EP）和出口电压（CXP）等电参数分别为40V、21V、10V和19V。内标采用同位素内标F（13C9,15N）HPFPR，离子对为m/z 406.1→295.1， DP、CE、EP、CXP等电参数分别为32V、20V、9V和7V。精密量取100μL含药血浆至1.5 mL的离心管中，加入10μL内标工作溶液，加入300μL甲醇涡旋5min，15300g离心10min，取上清液300μL氮吹吹干，加入100μL流动相（0.125%FA-2mM NH4FA甲醇：0.1%FA水= 7：3, V / V）复溶，涡旋离心取80μL上清液用LC-MS/MS的方法进行检测。取大鼠10只，分为尾静脉组（IV）与灌胃组（Oral），每组5只。尾静脉注射（10mg/kg）给药后0min、2min、5min、10min、15min、30min、45min、60min、90min、120min 眼眶静脉丛采血0. 30 mL，采集的血液加入到提前用50.0µL 1.5%肝素钠浸润后的EP管中，814g离心8 min分离血浆。灌胃（50mg/kg）给药后0min、5min、15min、30min、45min、60min、90min、120min、150min眼眶静脉丛采血0. 30 mL，采集的血液加入到提前用50µL 1.5%肝素钠浸润后的EP管中，814g离心8 min分离血浆。获得的血浆按照“血浆样品处理”进行生物样本的处理，用 DAS（ 2. 0）软件计算其药代动力学参数。在尾静脉给药120min后和灌胃150min后颈部脱臼处死各组大鼠，取心 、肝 、脾 、肺、肾等脏器组织分别进行组织分布与组织切片。将各组织用生理盐水洗干净后置于4%多聚甲醛中固定12h，HE染色观察各脏器结构。
表2 药代动力学参数
SD大鼠尾静脉注射FR6（10mg/kg）与灌胃（50mg/kg）平均血药浓度-时间曲线见图7A和图7B，主要药代动力学参数见表2。由表2可知，本试验中，尾静脉给药2min（Tmax）后，大鼠体内FR6血浆浓度达到Cmax（95.82±14.49 ng/mL）, 药物半衰期t1/2为6.77±2.65min，120min内血药浓度-时间曲线下面积AUC0-120为1351.94±384.14 μg/min·L，AUC0-∞为1352.36±384.93 μg/min·L。灌胃给药5min（Tmax）后，大鼠体内FR6血浆浓度达到Cmax（125.36±32.19ng/mL），药物半衰期t1/2为33.66±18.68min，150min内血药浓度-时间曲线下面积AUC0-150为5646.22±1852.98μg/min·L，AUC0-∞为5963.46±1731.73 μg/min·L。FR6绝对生物利用度为88.19%。而且由于多肽在体内最终代谢产物为氨基酸，代谢速度快，在体内不易产生蓄积。由于多肽药物进入胃肠道时易被酶解，多数已上市的多肽药物以注射方式进行给药，例如胰岛素。但相比注射方式给药，口服给药方便又安全，成为了蛋白多肽类药物给药方式的首选。据FR6药代动力学参数分析可得绝对生物利用度为88.19%，这表明FR6可能更适合灌胃或口服给药。
各脏器经HE染色后观察可得（图7C），空白对照组（Blank）、尾静脉（iv）以及灌胃（io）组各脏器结构均无明显毒性：心肌组织内心肌纤维排列尚规则，未见明显变性及坏死间质未见明确炎症细胞浸润；肝脏组织内肝细胞以中央静脉为中心呈条索状排列，未见明确水肿、脂肪变性及坏死，肝窦未见明显扩张；脾脏组织被膜未见明显增厚，红白髓结构尚清，白髓未见明显萎缩；肺组织种肺泡结构清晰，肺泡腔内未见炎性渗出物，支气管上皮细胞未见明确变性、脱落。肾脏组织皮髓质分界尚清，其内肾小球及肾小管分布尚正常，肾小球未见明显病变，肾小管上皮细胞未见明确变性、坏死，管腔未见明显扩张/萎缩，未见管型，间质未见明确炎症细胞浸润。上述结果表明，降压肽给药后没有对各体内脏器产生毒副作用。
Claims (10)
1.一种食源性降压肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2-氯三苯甲基氯树脂加入固相合成管中，活化之后连接Fmoc-Arg-OH；封闭活化位点，得到化合物1；
脱去化合物1中的保护基团Fmoc，连接Fmoc-Pro- OH，得到化合物2；
脱去化合物2中的保护基团Fmoc，连接Fmoc-Phe- OH，得到化合物3；
脱去化合物3中的保护基团Fmoc，连接Fmoc-Pro- OH，得到化合物4；
脱去化合物4中的保护基团Fmoc，连接Fmoc-His- OH，得到化合物5；
脱去化合物5中的保护基团Fmoc，连接Fmoc-Phe- OH，得到化合物6；
脱去化合物6中的保护基团Fmoc，得到目标产物FR6。
2.根据权利要求1所述的食源性降压肽的制备方法，其特征在于，2-氯三苯甲基氯树脂为1g～1.5g，2-氯三苯甲基氯树脂活化时间为30min～45min。
3.根据权利要求1所述的食源性降压肽的制备方法，其特征在于，2-氯三苯甲基氯树脂活化所使用的试剂为二氯甲烷。
4.根据权利要求1所述的食源性降压肽的制备方法，其特征在于，封闭活化位点所使用的试剂为二氯甲烷、甲醇和N,N-二异丙基乙胺的混合溶液。
5. 根据权利要求4所述的食源性降压肽的制备方法，其特征在于，封闭活性位点的混合溶液分两次加入，每次反应15 min～20min。
6.根据权利要求1所述的食源性降压肽的制备方法，其特征在于，脱去各化合物中的保护基团Fmoc所使用的溶剂为哌啶和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液。
7. 根据权利要求6所述的食源性降压肽的制备方法，其特征在于，脱去各化合物中的保护基团Fmoc所用的混合溶液分两次加入，第一次需时间 5min～10min，第二次30 min～45min。
8. 根据权利要求1所述的食源性降压肽的制备方法，其特征在于，连接Fmoc-Arg- OH的反应溶剂为N,N-二异丙基乙胺和二氯甲烷的混合溶液。
9. 根据权利要求1所述的食源性降压肽的制备方法，其特征在于，连接Fmoc-Pro- OH的反应溶剂为O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基乙胺的混合溶液。
10.一种利用根据权利要求1-9中任一所述的制备方法制备所得的食源性降压肽的血管紧张素转化酶活性检测方法，其特征在于，所述血管紧张素转化酶活性检测方法包括以下步骤：
将食源性降压肽溶于缓冲溶液中，得到食源性降压肽溶液；上述食源性降压肽溶液与马尿酰-组氨酰-亮氨酸溶液孵育一段时间，然后再加入血管紧张素转化酶溶液，继续孵育一段时间；加入HCl终止反应，取上清液，通过LC-MS/MS方法测定上清液中马尿酸的生成峰面积；其中，缓冲溶液作为空白对照组；
通过以下公式计算血管紧张素转化酶活性抑制率Inhibition ratio：
Inhibition ratio（%）= 1 - A1 / A2 * 100%
其中，A1为样品反应生成HA峰面积，A2为对照组生成HA峰面积。
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