CN112294972A - Psma激活式抗肿瘤前药cpt-y及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一类具有结构通式1或结构通式2的化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明中将前列膜抗原(PSMA)特异性靶向多肽与喜树碱，通过化学键进行连接，构建两亲性的PSMA激活前药CPT‑Y(CPT‑Wn和CPT‑Hn)。两亲性化合物的构建可提高喜树碱的水溶性、稳定性和半衰期，从而提高生物利用度。同时本发明物CPT‑Y通过PSMA介导的主动靶向作用可以将喜树碱定向转运至肿瘤部位释放，从而降低其对健康细胞和正常组织的杀伤力，改善耐药性的同时，提升抗肿瘤效应。
Figure DDA0002089285740000011

Description

PSMA激活式抗肿瘤前药CPT-Y及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种化合物及其制备方法和应用，具体一种具有靶向抗肿瘤活性的化合物及其制备方法和应用，属于药物化学领域。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康和生命的重大疾病之一，其致病因素复杂、发病率和死亡率高。化疗仍是目前临床治疗恶性肿瘤的主要手段之一。常规的化疗药大多存在靶向性差、毒副作用大、生物利用度低和耐药性的缺陷，从而导致临床疗效不佳且患者生存质量差。因此寻找新型靶向抗肿瘤药物具有非常大的临床价值和意义。
喜树碱(Camptothecin，CPT)是从中药喜树(Camptotheca acuminata.)中分离得到的一种天然抗肿瘤药物，其在体内外对胃癌、结直肠癌和膀胱癌等多种恶性肿瘤均表现出较好的抗肿瘤效果，其作用机制独特，通过选择性抑制拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)，阻止DNA复制及RNA合成，为细胞周期S期特异性药物。以喜树碱为母体开发了多种临床应用广泛的广谱抗癌药物，如伊立替康和拓扑替康等，广泛用于结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤的治疗。但该类药物靶向性差，在临床上常引起呕吐、腹泻、骨髓抑制以及出血性膀胱炎等一系列毒副反应，此外该类药物还存在水溶性差和稳定性差的缺陷。这些缺陷限制了其进一步的开发和临床应用，因此开发新一代高效低毒水溶性好的喜树碱衍生物意义重大。
前列腺膜抗原(Prostate specific membrane antigen，PSMA)是位于前列腺上皮细胞表面的II型跨膜糖蛋白。研究表明其在前列腺组织和多种非前列腺实体瘤的血管内皮细胞特异性表达，在正常组织中不表达。此外PSMA还具有叶酸水解酶(FOLH)、谷氨酸羧肽酶II(GCPII)及N-乙酰基化α-连接的酸性二肽酶(NAALA-Dase)等多种蛋白酶的活性，PSMA是目前肿瘤诊断和肿瘤抗血管治疗的良好靶点和研究热点。
本发明在前药原理的指导下，首次以PSMA的特异性水解寡肽底物Y(Asp-Glu*Glu*Glu*Glu和Asp-Glu*Glu*Asp-Glu)作为肿瘤靶向配体，设计并合成一系列肿瘤靶向喜树碱前药CPT-Y(CPT-Wn和CPT-Hn)；对该类化合物的活性评价主要围绕抗肿瘤方面展开，分别测试了类似物对PSMA阳性表达(PSMA+)肿瘤细胞系LNCaP-FGC，PSMA阴性表达(PSMA-)肿瘤细胞系HepG2,Hela,MCF-7,DU145,PC-3和人肝正常细胞LO2的细胞毒选择性和PSMA靶向性；利用重组人PSMA和人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠移植瘤模型，采用高效液相色谱法和小动物活体成像系统，评价前药的体外靶向释放和体内靶向分布特性；采用BALB/c小鼠评价前药在小鼠体内的药代动力学特性；采用人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠移植瘤模型评价前药的体内抗肿瘤活性和安全性。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有结构通式1或通式2的化合物及其制备方法。
本发明的目的之二是提供通式1或通式2化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的之三是提供一种具有抗肿瘤作用的药物组合物。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
具有通式1或通式2结构的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure BDA0002089285720000021
L为-[Cm(O)(Z)n(NH)q]-，其中m,q分别为0或1，n为0～11，p为0～8；其中Z可为烷烃(-CH2-)；可为烯烃(-CH＝CH-)；可为氨基酸或者多肽；可为腙(-NH-N＝C-)；可为醚(-CH2-O-CH2-),可为单个或多个醚，且可在Z中任意位置；可为二硫醚(-S-S-),可为单个或多个二硫醚，且可在Z中任意位置；还可为烷烃(-CH2-)和烯烃(-CH＝CH-)的任意组合；还可为烷烃(-CH2-)和氨基酸或者多肽的任意组合；还可为烯烃(-CH＝CH-)和氨基酸或者多肽的任意组合；还可为烷烃(-CH2-)和腙(-NH-N＝C-)的任意组合；还可为烷烃(-CH2-)和醚(-CH2-O-CH2-)的任意组合；还可为或烷烃(-CH2-)和二硫醚(-S-S-)的任意组合；还可为烯烃(-CH＝CH-)和二硫醚(-S-S-)的任意组合；还可为或烷烃(-CH2-)、烯烃(-CH＝CH-)、二硫醚(-S-S-)和二硫醚(-S-S-)的任意组合。
R1选自氢、羟基，氨基，烯基、炔基，烷氧基，烷胺基，烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、杂环基烷；
R2选自氢、羟基，氨基，烯基、炔基，烷氧基，烷胺基，烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、杂环基烷；
R3选自氢、羟基，氨基，烯基、炔基，烷氧基，烷胺基，烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、杂环基烷；
R4选自氢、羟基，氨基，烯基、炔基，烷氧基，烷胺基，烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、杂环基烷；
R5选自氢、羟基，氨基，烯基、炔基，烷氧基，烷胺基，烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、杂环基烷。
进一步，本发明化合物编号及结构式如下:
Figure BDA0002089285720000031
Figure BDA0002089285720000041
Figure BDA0002089285720000051
Figure BDA0002089285720000061
Figure BDA0002089285720000071
进一步，所述化合物可加入制剂领域常规辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、注射剂等常规剂型。
本发明所述化合物的制备方法包括如下步骤：
本发明化合物按如下方法制备：
化合物CPT-A2的制备方法：将喜树碱溶于有机溶剂，与Boc-L-甘氨酸在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-A2；
化合物CPT-A4的制备方法：将喜树碱溶于有机溶剂，与N-Boc-γ-氨基丁酸在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-A4；
化合物CPT-A6的制备方法：将喜树碱溶于有机溶剂，与叔丁氧羰酰基6-氨基己酸在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-A6；
化合物CPT-A12的制备方法：将喜树碱溶于有机溶剂，与12-(Boc-氨基)十二烷酸在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-A12；
化合物CPT-B2的制备方法：将CPT-A2溶于有机溶剂，在TFA作用下生成CPT-B2；
化合物CPT-B4的制备方法：将CPT-A4溶于有机溶剂，在TFA作用下生成CPT-B4；
化合物CPT-B6的制备方法：将CPT-A6溶于有机溶剂，在TFA作用下生成CPT-B6；
化合物CPT-B12的制备方法：将CPT-A12溶于有机溶剂，在TFA作用下生成CPT-B12；
化合物CPT-PW2的制备方法：将CPT-B2溶于有机溶剂，与WT-H在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-PW2；
化合物CPT-PW4的制备方法：将CPT-B4溶于有机溶剂，与WT-H在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-PW4；
化合物CPT-PW6的制备方法：将CPT-B6溶于有机溶剂，与WT-H在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-PW6；
化合物CPT-PW12的制备方法：将CPT-B12溶于有机溶剂，与WT-H在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-PW12；
化合物CPT-W2的制备方法：将CPT-PW2溶于有机溶剂，在TFA:Thioanisole:H2O＝95％:2.5％:2.5％作用下生成CPT-W2；
化合物CPT-W4的制备方法：将CPT-PW4溶于有机溶剂，在TFA:Thioanisole:H2O＝95％:2.5％:2.5％作用下生成CPT-W4；
化合物CPT-W6的制备方法：将CPT-PW6溶于有机溶剂，在TFA:Thioanisole:H2O＝95％:2.5％:2.5％作用下生成CPT-W6；
化合物CPT-W12的制备方法：将CPT-PW12溶于有机溶剂，在TFA:Thioanisole:H2O＝95％:2.5％:2.5％作用下生成CPT-W12；
化合物CPT-PH2的制备方法：将CPT-B2溶于有机溶剂，与HT-H在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-PH2；
化合物CPT-PH4的制备方法：将CPT-B4溶于有机溶剂，与HT-H在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-PH4；
化合物CPT-PH6的制备方法：将CPT-B6溶于有机溶剂，与HT-H在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-PH6；
化合物CPT-PH12的制备方法：将CPT-B12溶于有机溶剂，与HT-H在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-PH12；
化合物CPT-H2的制备方法：将CPT-PH2溶于有机溶剂，在TFA:Thioanisole:H2O＝95％:2.5％:2.5％作用下生成CPT-H2；
化合物CPT-H4的制备方法：将CPT-PH4溶于有机溶剂，在TFA:Thioanisole:H2O＝95％:2.5％:2.5％作用下生成CPT-H4；
化合物CPT-H6的制备方法：将CPT-PH6溶于有机溶剂，在TFA:Thioanisole:H2O＝95％:2.5％:2.5％作用下生成CPT-H6；
化合物CPT-H12的制备方法：将CPT-PH12溶于有机溶剂，在TFA:Thioanisole:H2O＝95％:2.5％:2.5％作用下生成CPT-H12；
化合物CPT-D2的制备方法：将CPT-B2溶于有机溶剂，与N-苄氧羰基-L-天冬氨酸1-苄酯在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-D2；
化合物CPT-D4的制备方法：将CPT-B4溶于有机溶剂，与N-苄氧羰基-L-天冬氨酸1-苄酯在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-D4；
化合物CPT-D6的制备方法：将CPT-B6溶于有机溶剂，与N-苄氧羰基-L-天冬氨酸1-苄酯在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-D6；
化合物CPT-D12的制备方法：将CPT-B12溶于有机溶剂，与N-苄氧羰基-L-天冬氨酸1-苄酯在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-D12；
化合物CPT-MD2的制备方法：将CPT-D2溶于有机溶剂，在脱保护剂作用下生成CPT-MD2；
化合物CPT-MD4的制备方法：将CPT-D4溶于有机溶剂，在脱保护剂作用下生成CPT-MD4；
化合物CPT-MD6的制备方法：将CPT-D6溶于有机溶剂，在脱保护剂作用下生成CPT-MD6；
化合物CPT-MD12的制备方法：将CPT-D12溶于有机溶剂，在脱保护剂作用下生成CPT-MD12；
其中，上述反应在-20℃至250℃下进行；所述有机溶剂是含有1-20个碳原子的醚、醇、烷烃、芳香烃、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；所述催化剂为4-二甲氨基吡啶(DMAP)；所述缩合剂为1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)；所用的脱保护剂为三氟乙酸(TFA)、钯碳(Pd/C)、氢氧化钯碳(Pd(OH)2/C)、哌啶(Piperidine)和四丁基氟化铵(TBAF)；此外，所用碱中，无机碱为碳酸钾。
进一步，上述制备方法中，相应的原料与WT-H或者HT-H的摩尔比为1:0.1～1:10；相应的原料与缩合剂的摩尔比为1:0.1～1:10；相应的原料与催化剂的摩尔比为1:0.1～1:10。
本发明反应路线：
路线1中间体WT-H的合成
Figure BDA0002089285720000091
反应条件和试剂：(a)EDCI,HOBt,DIPEA,DCM,25℃,4h；(b)Piperidine,DMF,0.5h；(c)Wet Pd/C(5％),MeOH,12h。
路线2中间体HT-H的合成
Figure BDA0002089285720000101
反应条件和试剂：(a)EDCI,HOBt,DIPEA,DCM,25℃,4h；(b)Piperidine,DMF,0.5h；(c)Wet Pd/C(5％),MeOH,12h。
路线3、PSMA激活前药CPT-Wn的合成
Figure BDA0002089285720000102
反应条件和试剂：(d)EDCI,DMAP,DCM,25℃,12h；(e)TFA,DCM,25℃,1h；(f)EDCI,HOBt,DIPEA,DCM,25℃,4h；(g)TFA:Thioanisole:H2O＝95:2.5:2.5,25℃,3h；
路线4、PSMA激活前药CPT-Hn的合成
Figure BDA0002089285720000111
反应条件和试剂：(d)EDCI,DMAP,DCM,25℃,12h；(e)TFA,DCM,25℃,1h；(f)EDCI,HOBt,DIPEA,DCM,25℃,4h；(g)TFA:Thioanisole:H2O＝95:2.5:2.5,25℃,3h；
路线5、PSMA代谢产物CPT-MDn的合成
Figure BDA0002089285720000112
反应条件和试剂:(a)EDCI,HOBt,DIPEA,DCM,25℃,12h；(b)Wet Pd/C(5％),MeOH,12h.
本发明还提供式1化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步，所述肿瘤为肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌细胞系。
本发明还提供一种药物组合物，该组合物包含以治疗有效量存在的式1化合物或其药学可接受的盐与至少一种药学可接受的赋形剂的混合物。
进一步，所述组合物还包含至少一种常规抗癌药。
更进一步，所述抗癌药选自环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、阿霉素、依托泊苷、伊立替康、奥沙利铂、顺铂或健择。
本发明还提供治疗癌症的方法，包括给予患者给药有效量的式1化合物或其药学上可接受的盐。
为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的赋形剂，例如填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂等，填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等，崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等，润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等，助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等，粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等，甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等，矫味剂包括：甜味剂及各种香精，防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等。
本发明所述“药学可接受的”表示化合物或组合物必须在化学上和/或毒理学上与制剂中包含的其他成分相容。
所述“治疗有效量”表示本发明化合物治疗或预防特定疾病或症状；减弱、改善或消除特定疾病的一种或多种症状；或预防或延迟特定疾病或症状的发作的量。
本发明PSMA激活前药CPT-Wn和CPT-Hn对各种肿瘤细胞均表现出一定的抑制增殖的作用，但这种抗肿瘤活性显著低于母体药物CPT；大部分前药CPT-Wn和CPT-Hn对人前列腺癌细胞LNCaP-FGC(PSMA+)的增殖抑制活性显著强于PSMA阴性表达的肿瘤细胞PC-3、DU145、HepG2、Hela和MCF-7，但对人正常肝细胞LO2的毒性较低(IC50>40μM)，表现出较强的细胞毒选择性和PSMA靶向性；其中前药CPT-W12的PSMA靶向性最强。CPT-W12对LNCaP-FGC(PSMA+)(IC50＝1.12±0.62μM)的细胞毒活性分别是HepG2(IC50＝36.02±4.46μM)、Hela(IC50＝13.47±2.00μM)、MCF-7(IC50＝7.23±1.23μM)、DU145(IC50＝6.87±1.31μM)和PC-3(IC50＝11.84±2.14μM)的35倍、13倍、7倍、6倍和10倍，但其对人正常肝细胞LO2毒性较低(IC50>40μM)，表现出很强的细胞毒选择性和PSMA靶向能力；同时本发明物CPT-W12在人乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤模型上表现出优异的体内抗肿瘤活性，中剂量CPT-W12组(30mg/kg)的抗肿瘤效果与阳性药伊立替康组(10mg/kg)相当且没有明显的毒副作用。
附图说明
图1前药CPT-W12在PBS和RPMI 1640的稳定性。
图2前药CPT-W12的体外靶向释放特性。
图3尾静脉注射CPT-W12(30mg/kg)在小鼠体内的平均血药浓度-时间曲线。
图4尾静脉注射DiR和负载DiR的CPT-W12后荷瘤裸鼠的小动物荧光成像图。(A)尾静脉注射DiR(0.25mg·mL-1，100.0μL)和负载DiR的CPT-W12(0.25mg·mL-1，100.0μL)后荷瘤裸鼠的小动物荧光成像图；(B)裸鼠尾静脉注射负载DiR的CPT-W12后各个时间点的肿瘤部位荧光强度图；(C)尾静脉注射负载DiR的CPT-W12 48h后心肝脾肺肾器官和肿瘤组织的荧光成像图；(D)尾静脉注射负载DiR的CPT-W12 48h后心肝脾肺肾器官和肿瘤组织的荧光强度图。
图5CPT-W12显著抑制人乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤模型的肿瘤的增殖同时表现出较低
的副作用。
图6实验结束后各组肿瘤和主要器官(心肝脾肺肾)的HE染色分析。
图7血液生化分析检测药物对裸鼠肝肾功能的影响。
实验例1MTT法观察本发明组合物CPT-X对PSMA阳性和阴性表达的肿瘤细胞增殖影响
1仪器与材料
Thermo 3111型CO2培养箱；HFsafe生物安全柜；Multiskan GO酶标仪；京立牌LD5-2B型台式低速离心机；Olympus IX71倒置荧光显微镜改良型RPMI-1640培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶溶液、噻唑蓝、磷酸盐缓冲液(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)；
人肝癌细胞系HepG2；人宫颈癌细胞系Hela；人乳腺癌细胞系MCF-7；人前列腺癌细胞系DU145；人前列腺细胞系PC-3；人前列腺细胞系LNCaP-FGC；肝正常细胞LO2。
实验药物：本发明化合物CPT-Y(分别按实施例17-45制备)；阳性药物喜树碱(上海毕得医药科技有限公司)；
2方法
2.1不同细胞株的培养
DU145、HepG2、MCF-7和LNCaP-FGC细胞培养在1640完全培养基中(10％FBS、89％1640培养液和1％双抗)；LO2、PC-3和Hela细胞培养在DMEM完全培养基(10％FBS、89％DMEM培养液和1％双抗)中，细胞日常置于5％的CO2培养箱于37℃培养，待细胞密度长至培养瓶的80％左右时，用胰酶消化传代，除LNCaP-FGC细胞生长较慢一周传一次代以外，其他细胞约3天传代一次。
2.2细胞抑制作用
取对数生长期的DU145、HepG2、MCF-7、LNCaP-FGC、PC-3、Hela和LO2细胞，胰酶消化收集细胞并调整细胞浓度至4×104个/mL，然后将其接种至96孔培养板中，每孔100μL细胞悬液；随后将细胞置于5％CO2培养箱于37℃继续培养24h使细胞贴壁。随后进行加药操作，设置空白对照组(不接种细胞)、细胞对照组(接种细胞)和给药组；给药组每孔分别加入含100μL梯度浓度的待测化合物，每个浓度设置3个复孔；空白对照组和细胞对照组每孔加入100μL细胞培养基。将培养板置于CO2培养箱中继续培养72h后，每孔加20μL浓度为5mg·mL-1的MTT溶液，继续孵育4h后弃去上层细胞培养基，每孔采用排枪加入150μL DMSO，然后置于振荡器上振荡10min使蓝紫色结晶物充分溶解，随后利用酶标仪在490nm波长测定各孔的吸光度值OD490，计算细胞增殖抑制率，并采用软件Graph Pad Prism 5.01计算药物的IC50。
3结果
3.1前药CPT-Y和PSMA代谢产物CPT-MDn对肿瘤细胞(DU145、HepG2、MCF-7、LNCaP-FGC、PC-3、Hela)和正常细胞LO2的IC50值(n＝3)如表1所示
表1前药CPT-Y和PSMA代谢产物CPT-MDn对肿瘤细胞(DU145、HepG2、MCF-7、LNCaP-FGC、PC-3、Hela)和正常细胞LO2的IC50值(n＝3)
Figure BDA0002089285720000141
Figure BDA0002089285720000151
由表1可以看出(1)大部分本发明物CPT-Wn和CPT-Hn对各种肿瘤细胞均表现出一定的抑制增殖的作用，但抑制作用显著低于原药CPT；(2)大部分前药CPT-Wn和CPT-Hn对人前列腺癌细胞LNCaP-FGC(PSMA+)的增殖抑制活性显著强于PSMA阴性表达的肿瘤细胞PC-3、DU145、HepG2、Hela和MCF-7，但对人正常肝细胞LO2的毒性较低(IC50>40μM)，表现出较强的细胞毒选择性和PSMA靶向性；其中前药CPT-W12的PSMA靶向性最强。CPT-W12对LNCaP-FGC(PSMA+)(IC50＝1.12±0.62μM)的细胞毒活性分别是HepG2(IC50＝36.02±4.46μM)、Hela(IC50＝13.47±2.00μM)、MCF-7(IC50＝7.23±1.23μM)、DU145(IC50＝6.87±1.31μM)和PC-3(IC50＝11.84±2.14μM)的35倍、13倍、7倍、6倍和10倍，但其对人正常肝细胞LO2毒性较低(IC50>40μM)，表现出很强的细胞毒选择性和PSMA靶向能力；(3)大部分前药CPT-Wn和CPT-Hn对五种PSMA阴性表达肿瘤细胞(PC-3、DU145、HepG2、Hela和MCF-7)也表现出不同的细胞敏感性，其对MCF-7、PC-3和DU145的增殖抑制活性显著优于HepG2和Hela细胞；构效关系分析表明，连接子的长短也会影响其抗肿瘤活性，随着碳链的延长其抗肿瘤活性降低，如对MCF-7和PC-3的细胞毒活性：CPT-W2>CPT-W4>CPT-W6>CPT-W12；CPT-H2>CPT-H4>CPT-H6>CPT-H12；(4)大部分PSMA代谢产物CPT-MX对肿瘤细胞和正常细胞均表现出较强的增值抑制活性，无细胞毒选择性，其对MCF-7、PC-3和DU145的活性较好，而对Hela和HepG2增值抑制活性较差；构效关系分析同样表明连接子的长短会影响其抗肿瘤活性，随着碳链的延长抗肿瘤活性降低；例如对MCF-7和PC-3细胞的细胞毒活性：CPT-MD2、CPT-MD4>CPT-MD6、CPT-MD12。
4结论
MTT实验结果显示与原药喜树碱相比，本发明物PSMA激活前药CPT-Wn和CPT-Hn的细胞毒活性显著降低；本发明物CPT-Wn和CPT-Hn对PSMA过表达LNCaP-FGC细胞的增殖抑制活性显著强于PSMA阴性表达肿瘤细胞(HepG2、MCF-7、Hela、DU145和PC-3)，同时对人正常肝细胞LO2毒性较低，呈现出较好的细胞毒选择性和PSMA靶向性，该类化合物可用于抗肿瘤药物的研究。
实验例2 HPLC法观察本发明组合物CPT-W12体外靶向释放特性和稳定性研究
1仪器与材料
4-羟乙基哌嗪乙磺酸(上海阿达玛斯试剂有限公司)；氯化钠(北京化工有限公司)；重组人源PSMA/FOLH1/NAALADase I(4234-ZN,美国bio-techne公司)；色谱甲醇(美国Fisher有限公司)，Agilent 1260高效液相色谱仪；Thermo 3111型CO2培养箱；RPMI-1640培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲液(美国康宁有限公司)；
2方法
2.1 CPT-W12体外稳定性研究
(1)称取适量的CPT-W12分别用PBS缓冲盐溶液(pH 7.4)和RPMI 1640培养基稀释至0.1mg·mL-1，然后置于37℃共孵育24h，过0.22μm微孔滤膜后置于高效液相上按下述液相条件分析。
(2)高效液相色谱条件：Waters XBridge C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：A为0.2％冰醋酸的水，B为含0.2％冰醋酸的乙腈；梯度洗脱液相条件：0～5.0min，10％B～60％B；5.0～15.0min，60％B～80％B；15.0～17.0min，保持80％B；17.0～17.1min,80％B～10％B；17.1～23.0min，保持10％B；流速：1mL·min-1；柱温：25℃；进样量：25.0μL；检测波长365nm。
2.2 CPT-W12体外靶向释放特性研究
(1)将重组人PSMA(rh PSMA)采用50mM HEPS缓冲溶液稀释至1.0μg·mL-1。
(2)称取适量的CPT-W12用50mM HEPS缓冲溶液稀释至0.1mg·mL-1。
(3)实验组每孔加入125μL的浓度为1.0μg·mL-1rh PSMA和125μL浓度为0.1mg·mL-1的样品CPT-W12；对照组加入125μL在95℃加热5分钟失活的1.0μg·mL-1rh PSMA和125μL浓度为0.1mg·mL-1的样品CPT-W12。
(4)将实验组和对照组样品置于37℃恒温培养箱中孵育1h，2h，4h，8h，12h和24h，孵育完成后在95℃加热5min使酶失活，然后冷却至室温，过0.22μm微孔滤膜后置于高效液相色谱仪上按下述液相条件分析。
(5)高效液相色谱条件：Waters XBridge C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：A为含0.2％冰醋酸的水，B为含0.2％冰醋酸的乙腈；梯度洗脱液相条件：0～5.0min，10％B～60％B；5.0～15.0min，60％B～80％B；15.0～17.0min，保持80％B；17.0～17.1min，80％B～10％B；17.1～23.0min，保持10％B；流速：1mL·min-1；柱温：25℃；进样量：25.0μL；检测波长365nm。
3结果
3.1如图1所示，CPT-W12在PBS缓冲盐溶液(pH 7.4)和RPMI 1640培养基孵育24h能稳定存在，CPT-W12未发生水解。
3.2如图2所示，CPT-W12与高温灭活的rh PSMA共孵育时能稳定存在不被水解，而CPT-W12与未灭活的rh PSMA孵育时可以被特异性水解；当CPT-W12与rh PSMA共孵育1h后发现CPT-W12峰高显著降低，同时有多种极性小于CPT-W12的代谢产物生成；随着孵育时间的延长，CPT-W12色谱峰减少越多，在孵育4h的时候，CPT-W12峰完全消失，此外随着时间的延长代谢产物种类逐渐减少，由4种逐渐变成2种，这与文献报道的PSMA水解寡肽底物的过程一致；以上结果表明了CPT-W12具有较强的PSMA敏感性，能够被PSMA特异性水解。
实验例3 HPLC法评价本发明组合物CPT-W12在小鼠体内药代动力学特性
1实验动物、试剂和仪器
60只BALB/c小鼠(雌雄各半)，体重为21.0±2.0g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。所有动物均在温度20-22℃，相对湿度45％-65％，光照/黑暗12h/12h条件下饲养，自由饮食饮水，适应性饲养一周后开始实验。
2实验方法
2.1羟基喜树碱的内标溶液的配制
精密称取HCPT对照品10.0mg至10.0mL容量瓶中，先加入2mL的DMSO超声、涡旋使HCPT溶解，随后DMSO定容至刻度线，然后用乙腈(含0.2％冰醋酸)稀释得到10.0μg·mL-1的内标工作液，然后置于4℃冰箱中保存。
2.2小鼠给药制剂的配制
精密称取CPT-W12 90.0mg，加入2.0mL的PBS(pH 7.4)溶液混匀后，超声至全部溶解，再加入28.0mL生理盐水并振摇混合均匀，即得浓度为3.0mg·mL-1的给药溶液，然后过0.22μm的微孔滤膜待用。
2.3血浆样品采集
取健康BALB/c小鼠(雌雄各半)60只，按30.0mg·kg-1CPT-W12的给药剂量单次尾静脉注射给药，分别在给药后5.0min、15.0min、30.0min、1h、2h、3h、4h、8h、12h和24h取血，每个时间点取6只小鼠摘眼球取血，每只小鼠取0.6mL血置于肝素化的1.5mL离心管中，然后4℃下12000r·min-1离心10min分离血浆，分离得到的血浆置于-20℃保存待测。
2.4血浆样品处理
精密吸取待测小鼠血浆150.0μL，置1.5mL离心管中，加入20.0μL的10μg·mL-1羟基喜树碱内标溶液，涡旋混合1min后，加入1000μL乙腈(0.2％乙酸)，涡旋振荡2min进行蛋白沉淀处理，于12000r·min-1高速离心10min，取有机相1000μL；再次加入1000μL乙腈，涡旋1min，12000r·min-1离心10min，取有机相1000μL，合并提取液后37℃氮气吹干，200μL乙腈和100μL甲醇溶解，按实验例2中所述的高效液相的条件进样20μL分析。
3实验结果
本次实验中采用了单次尾静脉注射的给药方式，给药后在设定的时间摘眼球取血。按照实验室前期建立的此类前药血浆样品处理方法处理样品，然后采用高效液相测定各个时间点的血药浓度，随后用药代动力学分析软件DAS 2.0处理数据，结果发现CPT-W12在小鼠体内的代谢行为符合二室模型(权重系数:1/cc)，具体药代动力学参数见表2，药时曲线见图3。
表2前药CPT-W12在BALB/c小鼠体内的药代动力学参数(n＝6)
Figure BDA0002089285720000181
AUC：曲线下面积；MRT：平均滞留时间；t1/2：半衰期；CL：清除；V：表观分布容积；Cmax：最大药物浓度。
CPT-W12在小鼠体内最大血药浓度达到59.0mg·L-1，同时半衰期t1/2较长，达到了10.9h，显著延长了喜树碱的半衰期(t1/2＝0.165±0.134h)，其在体内滞留时间较长。
实验例5本发明组合物CPT-W12在人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠移植瘤体内靶向性
1.实验动物、试剂和仪器
10只雌性BALB/c nude裸鼠，体重为21.0±2.0g，由维通利华供应(合格证号：SCXK(京)2006.0009)。动物自由取食饮水。适应性饲养一周后开始实验。
2实验方法
2.1荷MCF-7乳腺癌移植瘤模型的建立
选取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞(密度约在80％～90％)，用胰酶消化后，1000rpm离心5min收集细胞，收集后的细胞用PBS溶液离心(1000rpm，5min)清洗两次，随后用PBS重悬细胞调整细胞浓度为l×l07个/mL，然后迅速将细胞悬液置于冰盒中带至动物房，经紫外线灭菌后，在无菌条件下，用一次性吸管将肿瘤细胞悬液混匀后，用1mL注射器将人乳腺癌细胞MCF-7接种于裸小鼠右前肢腋下皮下，接种量为0.1mL/只。接种3天后发现在接种部位出现小的突起，质硬，并逐渐增大。每周测量两次体重和肿瘤体积，待瘤体积达到100～200mm3且状态较稳定时，模型即制作成功。
2.2负载DiR的CPT-W12的药物的制备
虽然前药CPT-W12自身具有蓝色荧光，但是由于喜树碱荧光的发射波长太短，不能有效地穿透组织和器官。细胞膜荧光探针DiR是一种亲脂性羰花青染料，其所发射的红外光可以高效地穿过细胞和组织，可用于活体小动物成像。研究中我们发现CPT-W12自身具有两亲性，其在PBS等缓冲盐溶液中可以自组装形成纳米胶束，因此本研究中利用CPT-W12自组装的特性来制备负载DiR的CPT-W12样品，用于CPT-W12体内靶向性研究。称取10.0mg CPT-W12溶于10.0mL的PBS(pH 7.4)缓冲盐溶液中，制成1.0mg·mL-1的CPT-W12溶液；然后将1mL浓度为2.0mg·mL-1的DiR二氯甲烷溶液用注射器逐滴滴加至上述CPT-W12溶液中，随即采用高速组织匀浆机混匀0.5h，可见溶液不分层。随后先将该溶液用-80℃冰箱冻上后置于冷冻干燥机上冻干。冻干后的粉末即为负载DiR的CPT-W12样品。
2.3 DIR染料溶液和负载DiR的CPT-W12溶液的制备
2.3.1实验用DiR溶液的配置
称取2.0mg的DiR，用2.0mL的无水乙醇溶解，配成浓度为1.0mg·mL-1的DiR母液备用；为防止DiR在PBS溶液中析出，实验用0.25mg·mL-1的DiR溶液现配现用，在注射前用PBS溶液(pH 7.4)将1.0mg·mL-1的DiR母液稀释至0.25mg·mL-1待用。
2.3.2实验用负载DiR的CPT-W12溶液的配置
称取适量制备的负载DiR的CPT-W12样品用PBS(pH 7.4)溶解配成0.25mg·mL-1(DiR的浓度)负载DiR的CPT-W12溶液。
2.4小动物活体成像
2.4.1动物分组给药：将6只接种成功的裸鼠随机分为2组，每组3只，分别为DiR染料组和负载DiR的CPT-W12组；DiR染料组每只裸鼠尾静脉注射100.0μL浓度为0.25mg·mL-1的DiR溶液；负载DiR的CPT-W12组每只裸鼠尾静脉注射100.0μL浓度为0.25mg·mL-1(DiR的浓度)负载DiR的CPT-W12溶液。
2.4.2给药后荧光成像：取一只未给药的人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠移植瘤模型裸鼠，采用小动物活体成像系统进行成像作为本底，用于背景的扣除；然后将给药后的裸鼠分别在注射药物后的0.5h、2h、4h、6h、8h、24h、32h和48h用气体麻醉剂麻醉后进行实时荧光成像；在48h成像结束后，将裸鼠脱颈椎后进行解剖，然后分离肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏进行荧光成像，根据荧光信号的强弱评估前药CPT-W12在体内的分布情况。
3实验结果
3.1小动物活体成像
为了验证前药CPT-W12的靶向性，我们将负载DiR的CPT-W12溶液经尾静脉注射到荷瘤裸鼠体内，采用小动物活体成像系统在设定的时间点观察负载DiR的CPT-W12在裸鼠体内的分布情况，考察前药CPT-W12是否具有肿瘤靶向性。如下图4所示尾静脉注射荧光染料DiR组，荧光信号主要集中在肝，在肿瘤部位没有观察到荧光信号；尾静脉注射负载DiR的CPT-W12组在给药0.5h后在全身观察到荧光信号，表明了负载DiR的CPT-W12在体内分布较快；在给药2h后可以在肿瘤部位发现明显的荧光信号；随着时间的延长，肿瘤部位平均荧光强度逐渐增强，在给药24h达到最大，这表明了CPT-W12可以避免被网状内皮系统快速清除，同时通过EPR效应和PSMA介导的主动靶向作用有效地在肿瘤部位聚集；在给药48h后，将裸鼠安乐死之后解剖，分离心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肿瘤组织进行离体荧光成像，发现负载DiR的CPT-W12组荧光信号主要分布在肿瘤、脾脏和肝脏。由于在肝脏和脾脏是主要的代谢器官，药物主要在这两个器官被巨噬细胞清除，因此在该器官有相对强的荧光信号是一种正常的现象；同时肿瘤部位的平均荧光强度是肝脏的1.32倍。这说明前药CPT-W12可以有效地在肿瘤组织聚集，具有良好的肿瘤靶向性。
实验例6本发明组合物CPT-W12在人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠移植瘤体内抗肿瘤活性评价
1实验动物、试剂和仪器
SPF级BALB/c nude裸小鼠(6周龄)：雌性，体重为21±2g，由维通利华供应，动物合格证号(SCXK(京)2006.0009)。动物饲养于SPF级动物中心IVC动物房，动物饲养笼具、饮水、饲料、垫料均经高压蒸汽灭菌处理，自由饮食饮水，保证动物营养。实验温度恒温约20℃，相对湿度约50％，光照周期昼夜各12h。实验中所有操作均在无菌环境下进行。
2实验方法
2.1人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠移植瘤模型的建立
人乳腺癌细胞MCF-7移植瘤模型的建立方法与第四章第四节2.1所述相同。
2.2前药CPT-W12的给药方案
(1)动物分组给药：将接种成功的模型裸鼠随机分成5组，每组6只，分别为(I)PBS模型组；(II)CPT-W12低剂量组(10mg·kg-1)；(III)CPT-W12中剂量组(30mg·kg-1)；(IV)CPT-W12高剂量组(60mg·kg-1)；(IV)阳性药伊立替康组(10mg·kg-1)；隔天尾静脉注射给药一次，共计给药16天(8次)。
2.3前药CPT-W12给药后小鼠行为学和药效学评价
(1)裸鼠一般情况观察：每天观察药物对裸鼠皮毛、精神状况和饮食饮水等情况的影响，同时每两天用电子天平测量并记录裸鼠体重的变化。
(2)肿瘤变化情况观察：当肿瘤结节形成后，每两天采用游标卡尺测定肿瘤的最长直径(a)及垂直方向最大横径(b)，计算肿瘤的体积并绘制肿瘤生长曲线。
肿瘤体积V(mm3)＝a×b2/2
(3)抑瘤率的计算：治疗结束后脱颈椎处死裸鼠，完整剖出肿瘤并用分析天平称量瘤重。抑瘤率(IR)：IR(％)＝(1-给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100％
2.4治疗结束后实验动物的处理
在末次用药结束后(第16天)将裸鼠禁食(不禁水)8小时，随后将裸鼠转移至解剖间，在脱颈椎处死之前摘除眼球取血，取400μL血置于1.5mL离心管中待用；取血完成后将裸鼠脱颈椎处死并解剖取下裸鼠腋下肿瘤和心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺等脏器，观察各组心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺有无异常以及各组裸鼠肿瘤组织的大小，并采用分析天平对各组肿瘤组织进行称重、记录和拍照。随后将各组的部分肿瘤组织和心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏单独固定在10％福尔马林固定液中，确保各组织能够完全被固定液浸泡；部分肿瘤组织和心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏包装标号后保存在液氮中备用。
2.5小鼠血液生化和血常规检查
将所取的未经抗凝处理的血样室温放置1h后，离心10000rpm×10min，收集血清进行血液生化分析，测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)等指标。
3实验结果
3.1裸鼠的一般情况观察
40只BALB/c nude裸鼠在皮下接种人乳腺癌细胞MCF-7后，在接种部位可见小的皮丘，接种1天后随着PBS被吸收，皮丘消失；裸鼠在皮下接种MCF-7细胞3后，在接种部位可见绿豆大小质地较硬的突起，在接种13天时，80％的裸鼠的肿瘤体积达到100-200mm3且状态较稳定，造模成功，将造模成功的裸鼠随机分组并给予不同的药物处理；在造模后前三周，裸小鼠运动敏捷、反应灵活，体重均匀增长；随着肿瘤的不断增长，在造模后第四周，特别是模型组裸鼠逐渐出现状态欠佳，活动减少；此外在阳性药伊立替康组，可能由于药物的毒副作用的影响裸鼠也出现了状态欠佳，体重下降的现象，但从造模开始到实验结束，无一例裸鼠死亡。
3.2前药CPT-W12药效学评价
3.2.1裸鼠的体重变化
通过比较CPT-W12给药组、PBS模型组和阳性药伊立替康组的裸鼠体重变化，可间接反映前药CPT-W12和阳性药的毒性。给药期间，每两天称量、记录裸鼠体重并绘制体重变化曲线，各组裸鼠体重变化如表3和图5A所示。
表3治疗期间裸鼠体重(g)(X±SD)
Figure BDA0002089285720000221
Figure BDA0002089285720000231
同PBS模型组相比，*p<0.05。
由从表3、图5A中可发现，在治疗结束后(D16)，阳性药伊立替康组的裸鼠的体重为(15.75±1.47)g，与模型组(17.07±0.99)g相比显著减少，且具有统计学意义(p<0.05)，表现出一定的毒性；但是CPT-W12低剂量组(10mg·kg-1)、中剂量组(30mg·kg-1)的体重分别为(17.33±1.46)g和(17.40±0.98)g，与模型组相比体重略微增加，但差异不具有统计学意义(p>0.05)；在给药12天后，CPT-W12高剂量组裸鼠体重开始下降，提示CPT-W12可能具有蓄积的毒性，但具体结果依赖于后期的病理学观察和血液生化分析。
3.2.2裸鼠移植瘤体积的变化比较
在给药后，每两天用游标卡尺测量、记录各组裸鼠体积并绘制各组移植瘤的生长曲线，各组裸鼠肿瘤体积的变化如表4所示和图5B所示(给药首天为D0)。
表4治疗期间各组裸鼠肿瘤体积变化比较(mm3)(X±SD)
Figure BDA0002089285720000232
从表4和图5B可以看出在给药第一天，模型组的肿瘤体积为(214.9±55.9)mm3，阳性药伊立替康组为(151.5±61.6)mm3，低剂量CPT-W12、中剂量CPT-W12和高剂量CPT-W12组肿瘤体积分别为(106.3±25.1)mm3、(98.9±16.3)mm3和(165.5±56.6)mm3。模型组肿瘤体积随着时间进展显著增大；虽然CPT-W12给药组和阳性对照组肿瘤体积也随着时间变大，但肿瘤的生长被显著抑制；在给药16天后CPT-W12给药组和阳性药伊立替康组的肿瘤体积要显著小于模型组，差异具有统计学意义(p<0.05)；CPT-W12低剂量组(10mg·kg-1)的肿瘤体积和阳性药伊立替康组(10mg·kg-1)相当，CPT-W12高剂量组肿瘤体积小于阳性药伊立替康组。
3.2.3各组药物对人乳腺癌细胞MCF-7荷瘤模型的瘤重和肿瘤体积的影响
在给药结束后，将裸鼠脱颈椎处死，解剖后剥离出肿瘤，测定并记录肿瘤的精确肿瘤体积和精确肿瘤重量，结果如表5和图5C-5E所示。
由表5、图5C-5E可以看出，阳性药伊立替康组、低剂量CPT-W12、中剂量CPT-W12和高剂量CPT-W12组肿瘤体积分别为(504.8±144.0)mm3、(625.1±234.3)mm3、(527.4±276.9)mm3、(442.7±261.1)mm3，其均显著低于模型组(1689.0±533.6)mm3，且差异具有统计学意义(p<0.05)；阳性药伊立替康组、低剂量CPT-W12、中剂量CPT-W12和高剂量CPT-W12组肿瘤重量分别为(0.74±0.27)g、(0.87±0.39)g、(0.76±0.38)g、(0.63±0.27)g，均显著低于模型组(1.80±0.53)g，且差异具有统计学意义(p<0.05)；中剂量CPT-W12给药组肿瘤抑制率57.78％，和阳性药伊立替康组相当；高剂量CPT-W12给药组肿瘤抑制率65.00％，高于阳性药伊立替康。
表5前药CPT-W12对人乳腺癌细胞MCF-7荷瘤小鼠的抑制作用(x±s)
Figure BDA0002089285720000241
同PBS模型组相比，*p<0.05；
肿瘤组织形态的变化如下图6所示。HE染色后镜下观察发现模型组肿瘤细胞排列紧密，肿瘤细胞体积较大，肿瘤细胞生长活跃，核分裂相多见，同时有明显的细胞异型性，可见巨型细胞(图6A)；阳性药组的肿瘤组织中可见大片坏死区域，肿瘤细胞显著减少，肿瘤细胞形态模糊，细胞核破碎和细胞核溶解(图6A)。在CPT-W12低剂量组可见大片坏死区域，细胞核裂解和破碎，仅在靠近血管的部分可见少量完整的肿瘤细胞；CPT-W12中剂量组可以看到更大范围的坏死，基本没有完整的细胞形态，肿瘤细胞核破碎裂解；CPT-W12高剂量组和阳性药伊立替康组类似，肿瘤细胞核基本破碎和溶解。
3.3前药CPT-W12初步毒性评价
3.3.1 HE染色观察给药后主要器官的形态变化
由图6B可以看出CPT-W12组的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏切片均未表现出明显的异常；阳性药伊立替康组的肾组织切片可见明显的炎性细胞浸润，而炎性细胞浸润是肾损伤的典型特征，从而证明了CPT-W12具有较强的抗肿瘤作用而没有明显的系统毒性。
3.3.2小鼠血液生化检查
如图7所示，在肝功能检测中，正常组、模型组、CPT-W12(10mg·kg-1)组、CPT-W12(30mg·kg-1)组、CPT-W12(60mg·kg-1)组和阳性药伊立替康(10mg·kg-1)组血清中谷丙转氨酶(ALT)含量分别为(43.5±2.0)U·L-1、(47.8±8.7)U·L-1、(50.1±10.0)U·L-1、(52.0±10.0)U·L-1、(59.6±8.0)U·L-1和(46.0±7.4)U·L-1，各组之间无统计学差异(p>0.05)；血清中谷草转氨酶(AST)水平在正常组(158.2±23.5)U·L-1、模型组(359.2±89.6)U·L-1、CPT-W12(10mg·kg-1)组(325.7±55.5)U·L-1、CPT-W12(30mg·kg-1)组(302.1±42.6)U·L-1、CPT-W12(60mg·kg-1)组(273.3±50.8)U·L-1和阳性药伊立替康组(300.7±27.2)U·L-1；模型组、CPT-W12给药组和伊立替康组血清中的AST水平与正常组相比显著升高(p<0.001)。
在肾功检测中，正常组、模型组、CPT-W12(10mg·kg-1)组、CPT-W12(30mg·kg-1)组、CPT-W12(60mg·kg-1)组和阳性药伊立替康(10mg·kg-1)组血清中血尿素氮(BUN)含量分别为(6.9±0.5)mmol·L-1、(7.2±1.4)mmol·L-1、(7.5±0.9)mmol·L-1、(7.1±0.9)mmol·L-1、(6.7±0.7)mmol·L-1和(7.9±1.4)mmol·L-1，CPT-W12给药组血清中BUN水平与正常组之间无统计学差异(p>0.05)，阳性药伊立替康组血清中BUN水平与正常组相比显著升高(p<0.05)；此外血清中肌酐(CRE)水平在正常组(7.9±0.7)mmol·L-1、模型组(7.1±1.6)mmol·L-1、CPT-W12(10mg·kg-1)组(6.9±1.1)mmol·L-1、CPT-W12(30mg·kg-1)组(7.2±0.7)mmol·L-1、CPT-W12(60mg·kg-1)组(7.3±0.8)mmol·L-1和阳性药伊立替康组(10.6±1.7)mmol·L-1，CPT-W12给药组血清中CRE水平与正常组之间无统计学差异(p>0.05)，阳性药伊立替康组血清中CRE水平与正常组和模型组相比显著升高(p<0.05)。
综上所述CPT-W12给药组的谷丙转氨酶(ALT)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)等指标与模型组和正常组相比没有显著差异(p>0.05)；模型组、CPT-W12和伊立替康组的AST水平与正常组相比显著升高(p<0.001)；阳性药伊立替康组的BUN和CRE与正常组相比显著升高，表现出一定的肝肾毒性。
具体实施方式
实施例1中间体WT-A的制备
依次称取500mg(1.18mmol)芴甲氧羰基-L-谷氨酸1-叔丁酯、338mg(1.76mmol)EDCI和238mg(1.76mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入382mg(1.29mmol)L-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐和380mg(2.94mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝2：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL 1M的盐酸溶液洗涤三次，再用25mL的饱和碳酸氢钠溶液洗涤，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(PE/EA＝10/1至3/1)，得到678mg白色固体WT-A。Yield:86.5％；m.p.:104.7-105.5℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.45(m,27H,9×-CH3),1.92(m,2H),2.29(m,6H),4.22(t,J＝7.0Hz,2H),4.39(d,J＝7.0Hz,2H),4.48(m,1H),5.60(d,J＝7.7Hz,1H),6.39(d,J＝7.3Hz,1H),7.32(t,J＝7.3Hz,2H),7.40(t,J＝7.3Hz,2H),7.61(d,J＝7.3Hz,2H),7.75(d,J＝7.3Hz,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ27.8,28.1,28.2,28.9,31.7,32.5,47.3,52.5,54.1,67.1,80.8,82.4,82.6,120.1,125.3,127.2,127.8,141.4,143.9,144.1,156.3,171.2,171.8,172.4；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C37H51N2O9,667.3595；found,667.3584。
实施例2中间体WT-B的制备
称取600mg(0.90mmol)WT-A置于50mL单口瓶中，加入20mL无水DMF超声使其溶解，随后加入229mg(2.70mmol)哌啶，室温下搅拌反应0.5h，TLC[V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝2：1]监测反应完全，反应液直接隔膜泵旋干，随后加入50mL乙酸乙酯溶解，有机层每次用30mL蒸馏水洗涤3次，饱和食盐水脱水，无水硫酸钠干燥，过滤，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(PE/EA＝3/1至0/1)，得到340mg无色油状物WT-B。Yield:85.0％；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.40(d,27H,9×-CH3),1.79(m,2H),2.03(m,2H),2.19(m,2H),2.32(m,2H),3.29(m,1H),4.42(m,1H),6.62(d,J＝7.3Hz,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ27.8,28.0,28.1,30.3,31.6,32.9,52.3,54.5,80.7,81.3,82.2,171.3,172.3,175.0；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd forC22H41N2O7,445.2914；found,445.2919。
实施例3中间体WT-C的制备
依次称取200mg(0.47mmol)芴甲氧羰基-L-谷氨酸1-叔丁酯、135mg(0.71mmol)EDCI和95mg(0.71mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入10mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入230mg(0.52mmol)WT-B和152mg(1.18mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝1：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL 1M的盐酸溶液洗涤三次，再用25mL的饱和碳酸氢钠溶液洗涤，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(PE/EA＝5/1至2/1)，得到360mg白色固体WT-C。Yield:90.2％；m.p.:63.0-63.5℃；1HNMR(500MHz,CDCl3):δ1.46(m,36H,12×-CH3),1.88(m,4H),2.08(m,1H),2.28(m,8H),4.22(m,2H),4.45(m,4H),5.57(d,J＝7.5Hz,1H),6.56(d,J＝7.2Hz,1H),6.71(d,J＝7.1Hz,1H),7.32(t,J＝7.4Hz,2H),7.40(t,J＝7.4Hz,2H),7.62(brs,2H),7.76(d,J＝7.4Hz,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ27.8,28.1,28.2,28.8,31.7,32.1,32.5,47.4,52.4,52.5,53.9,67.1,80.8,82.3,82.5,82.6,120.1,125.3,125.4,127.2,127.8,141.5,143.9,156.5,171.2,171.4,172.0,172.2,172.3；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd forC46H66N3O12852.4646；found,852.4642。
实施例4中间体WT-D的制备
称取350mg(0.41mmol)WT-C置于50mL单口瓶中，加入20mL无水DMF超声使其溶解，随后加入105mg(1.23mmol)哌啶，室温下搅拌反应0.5h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液直接隔膜泵旋干，随后加入50mL乙酸乙酯溶解，有机层每次用30mL蒸馏水洗涤3次，饱和食盐水脱水，无水硫酸钠干燥，过滤，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至20/1)，得到235mg无色油状物WT-D。Yield:91.0％；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.43(m,36H,12×-CH3),1.79(m,1H),1.90(m,2H),2.07(m,4H),2.30(m,4H),2.38(m,2H),3.36(m,1H),4.42(m,2H),5.28(m,1H),6.70(d,J＝7.5Hz,1H),6.93(d,J＝7.6Hz,1H)；13CNMR(125MHz,CDCl3):δ27.7,28.1,28.2,28.5,30.2,31.7,32.6,32.9,52.5,53.5,54.5,80.8,81.5,82.4,171.2,171.3,172.1,172.4,172.7,174.7；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcdfor C31H55N3O10,630.3966；found,630.3970。
实施例5中间体WT-E的制备
依次称取138mg(0.33mmol)芴甲氧羰基-L-谷氨酸1-叔丁酯、93mg(0.49mmol)EDCI和66mg(0.49mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入10mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入225mg(0.36mmol)WT-D和84mg(0.65mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL1M的盐酸溶液洗涤三次，再用25mL的饱和碳酸氢钠溶液洗涤，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至30/1)，得到295mg白色固体WT-E。Yield:87.5％；m.p.:119.6-120.4℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.44(m,45H,15×-CH3),1.89(m,4H),2.08(m,1H),2.29(m,10H),2.38(m,2H),4.23(m,2H),4.46(m,5H),5.63(d,J＝7.2Hz,1H),6.52(d,J＝6.9Hz,1H),6.88(d,J＝5.9Hz,1H),6.98(d,J＝5.6Hz,1H),7.32(t,J＝7.4Hz,2H),7.40(t,J＝7.4Hz,2H),7.62(d,J＝7.4Hz,2H),7.76(d,J＝7.4Hz,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ28.1,28.2,28.8,31.7,47.4,51.1,52.4,57.5,67.2,120.1,125.3,127.2,127.9,141.5,171.4,172.2；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C55H81N4O15,1037.5698；found,1037.5691。
实施例6中间体WT-F的制备
称取280mg(0.27mmol)WT-E置于50mL单口瓶中，加入20mL无水DMF超声使其溶解，随后加入69.0mg(0.81mmol)哌啶，室温下搅拌反应0.5h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝10：1]监测反应完全，反应液直接隔膜泵旋干，随后加入50mL乙酸乙酯溶解，有机层每次用30mL蒸馏水洗涤3次，饱和食盐水脱水，无水硫酸钠干燥，过滤，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至20/1)，得到200mg无色油状物WT-F。Yield:90.9％；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.44(m,45H,15×-CH3),1.85(m,4H),2.32(m,12H),2.38(m,2H),3.40(m,1H),4.43(m,3H),6.97(m,1H),7.11(m,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ27.7,27.8,28.1,28.2,28.5,28.7,29.8,30.1,31.7,32.2,32.5,32.9,52.2,52.3,52.4,52.5,81.6,81.8,82.1,82.2,82.5,171.2,171.3,171.4,172.2,172.3,172.4,172.9,173.0；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcdfor C40H71N4O13,815.5018；found,815.5006。
实施例7中间体WT-G的制备
依次称取70mg(0.22mmol)N-(叔丁氧羰基)-L-天冬氨酸-4-苄酯、63mg(0.33mmol)EDCI和44mg(0.33mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入10mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入195mg(0.24mmol)WT-F和84mg(0.65mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL 1M的盐酸溶液洗涤三次，再用25mL的饱和碳酸氢钠溶液洗涤，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至30/1)，得到170mg白色固体WT-G。Yield:80.0％；m.p.:77.2-78.0℃；1HNMR(500MHz,CDCl3):δ1.43(m,54H,18×-CH3),1.74(m,2H),1.86(m,2H),2.07(m,2H),2.29(m,10H),2.38(m,2H),2.79(m,1H),3.16(m,1H),4.47(m,4H),4.56(s,1H),5.11(d,J＝12.3Hz,1H),5.18(d,J＝12.3Hz,1H),5.79(d,J＝7.7Hz,1H),6.54(d,J＝6.7Hz,1H),7.04(m,2H),7.24(m,1H),7.33(s,5H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ27.9,28.1,28.2,28.4,28.6,29.0,29.3,29.8,31.5,31.7,32.0,32.5,36.2,51.1,51.8,51.9,52.3,67.1,80.6,80.8,81.9,82.2,82.3,82.7,128.3,128.5,128.7,135.4,155.7,170.9,171.2,171.4,172.0,172.1,172.2,172.3,172.4；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C56H90N5O18,1120.6281；found,1120.6281。
实施例8中间体WT-H的制备
称取150mg(0.13mmol)WT-G置于50mL单口瓶中，先加入20mL无水甲醇溶解后，随后加入5mg 10％湿Pd/C，氢气催化下室温下搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝10：1]监测反应完全，反应液过滤除去Pd/C，滤液减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝40/1至20/1)，得到128mg白色固体WT-H。Yield:92.7％；m.p.:82.9-83.5℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.43(s,9H,3×-CH3),1.44(s,18H,6×-CH3),1.45(s,9H,3×-CH3),1.47(s,9H,3×-CH3),1.87(m,2H),1.98(m,2H),2.12(m,4H),2.30(m,8H),2.65(dd,J＝17.8Hz,4.3Hz,1H),3.29(d,J＝17.8Hz,1H),4.35(m,2H),4.42(m,1H),4.51(m,2H),5.78(d,J＝9.1Hz,1H),6.79(m,2H),7.10(d,J＝8.1Hz,1H),7.44(d,J＝7.1Hz,1H)；13CNMR(125MHz,CDCl3):δ27.6,27.7,28.1,28.2,28.4,29.0,31.4,31.6,32.3,36.3,50.9,51.9,52.5,52.9,81.0,82.3,82.5,82.6,82.7,155.7,170.6,171.1,171.2,171.5,172.5,172.7,173.7,174.8；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C49H84N5O18,1130.5811；found,1030.5803。
实施例9化合物HT-A的制备
依次称取500mg(1.22mmol)Fmoc-L-天冬氨酸-4-叔丁酯、349mg(1.82mmol)EDCI和246mg(1.82mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入395mg(1.34mmol)L-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐和392mg(3.04mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝2：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL 1M的盐酸溶液洗涤三次，再用25mL的饱和碳酸氢钠溶液洗涤，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(PE/EA＝10/1至3/1)，得到680mg白色固体HT-A。Yield:85.8％；m.p.:116.6-116.9℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.44(m,27H,9×-CH3),1.90(m,1H),2.16(m,1H),2.31(m,2H),2.60(m,1H),2.99(m,1H),4.24(t,J＝7.1Hz,1H),4.42(m,2H),4.45(m,1H),4.56(m,1H),5.99(d,J＝8.5Hz,1H),7.14(d,J＝7.5Hz,1H),7.32(t,J＝7.5Hz,2H),7.40(t,J＝7.5Hz,2H),7.60(m,2H),7.76(d,J＝7.5Hz,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ27.8,28.1,28.2,31.4,37.7,47.2,51.2,52.6,67.4,80.7,82.0,82.4,120.1,125.2,127.2,127.9,141.4,144.0,156.1,170.4,170.6,171.5,172.3；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd forC36H49N2O9,653.3438；found,653.3429。
实施例10化合物HT-B的制备
称取588mg(0.90mmol)HT-A置于50mL单口瓶中，加入20mL无水DMF超声使其溶解，随后加入229mg(2.70mmol)哌啶，室温下搅拌反应0.5h，TLC[V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝2：1]监测反应完全，反应液直接隔膜泵旋干，随后加入50mL乙酸乙酯溶解，有机层每次用30mL蒸馏水洗涤3次，饱和食盐水脱水，无水硫酸钠干燥，过滤，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(PE/EA＝3/1至0/1)，得到340mg无色油状物HT-B。Yield:87.9％；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.43(s,9H,3×-CH3),1.44(s,9H,3×-CH3),1.46(s,9H,3×-CH3),1.89(m,2H),2.29(m,2H),2.58(dd,J＝16.7,8.0Hz,1H),2.79(dd,J＝16.7,3.7Hz,1H),3.66(dd,J＝8.0,3.7Hz,1H),4.45(m,1H),7.89(d,J＝8.3Hz,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ28.1,28.2,28.3,29.8,31.6,40.6,52.1,52.2,80.7,81.4,82.3,171.2,171.3,172.3,173.5；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C21H39N2O7,431.2757；found,431.2751。
实施例11化合物HT-C的制备
依次称取255mg(0.60mmol)芴甲氧羰基-L-谷氨酸1-叔丁酯、172mg(0.90mmol)EDCI和122mg(0.90mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入10mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入284mg(0.66mmol)HT-B和194mg(1.50mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝1：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL 1M的盐酸溶液洗涤三次，再用25mL的饱和碳酸氢钠溶液洗涤，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(PE/EA＝5/1至2/1)，得到450mg白色固体HT-C。Yield:88.1％；m.p.:106.3-107.3℃；1HNMR(500MHz,CDCl3):δ1.41(s,9H,3×-CH3),1.42(s,9H,3×-CH3),1.43(s,9H,3×-CH3),1.47(s,9H,3×-CH3),1.91(m,3H),2.12(m,1H),2.28(m,5H),2.60(dd,J＝17.1,6.3Hz,1H),2.91(dd,J＝17.2,3.8Hz,1H),4.22(dd,1H),4.40(m,3H),4.78(brs,1H),5.63(d,J＝7.7Hz,1H),6.94(d,J＝7.4Hz,1H),7.17(d,J＝7.7Hz,1H),7.31(t,J＝7.3Hz,2H),7.39(t,J＝7.3Hz,2H),7.61(d,J＝7.3Hz,2H),7.75(d,J＝7.4Hz,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ27.7,28.1,28.2,28.8,31.5,32.4,37.2,47.3,49.4,52.5,53.9,67.1,80.7,81.9,82.3,82.6,120.1,125.3,127.2,127.8,141.4,143.9,144.0,156.3,170.5,171.2,171.6,171.9,172.2；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C45H64N3O12,838.4490；found,838.4485。
实施例12化合物HT-D的制备
称取427mg(0.50mmol)HT-C置于50mL单口瓶中，加入20mL无水DMF超声使其溶解，随后加入127.7mg(1.50mmol)哌啶，室温下搅拌反应0.5h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液直接隔膜泵旋干，随后加入50mL乙酸乙酯溶解，有机层每次用30mL蒸馏水洗涤3次，饱和食盐水脱水，无水硫酸钠干燥，过滤，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至20/1)，得到285mg无色油状物HT-D。Yield:90.4％；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.43(d,36H,12×-CH3),1.82(m,2H),1.91(m,2H),2.08(m,2H),2.28(m,2H),2.42(m,1H),2.51(m,1H),2.98(m,1H),3.30(m,1H),4.44(brs,1H),4.80(brs,1H),7.06(d,J＝8.5Hz,1H),7.49(d,J＝8.0Hz,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ28.0,28.1,28.2,29.7,29.8,31.5,33.9,37.1,49.1,52.4,55.4,80.6,81.4,81.8,82.2,170.7,170.8,171.8,172.3,172.7,174.9；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C30H54N3O10,616.3809；found,616.3830。
实施例13化合物HT-E的制备
依次称取170mg(0.40mmol)芴甲氧羰基-L-谷氨酸1-叔丁酯、115mg(0.60mmol)EDCI和81mg(0.60mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入10mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入278mg(0.44mmol)HT-D和129mg(1.00mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝1：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL 1M的盐酸溶液洗涤三次，再用25mL的饱和碳酸氢钠溶液洗涤，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至30/1)，得到360mg白色固体HT-E。Yield:86.7％；m.p.:91.6-92.2℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.40(s,9H,3×-CH3),1.41(s,9H,3×-CH3),1.43(s,9H,3×-CH3),1.45(s,9H,3×-CH3),1.46(s,9H,3×-CH3),1.89(m,4H),2.25(m,10H),2.62(dd,J＝17.2,6.8Hz,1H),2.84(dd,J＝17.2,4.7Hz,1H),4.23(m,1H),4.40(m,2H),4.48(m,1H),4.76(m,1H),5.62(d,J＝8.2Hz,1H),6.58(d,J＝7.6Hz,1H),7.13(d,J＝7.7Hz,1H),7.18(d,J＝7.7Hz,1H),7.30(t,J＝7.4Hz,2H),7.38(t,J＝7.4Hz,2H),7.62(d,J＝7.4Hz,2H),7.75(d,J＝7.4Hz,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ27.7,28.0,28.1,28.2,28.6,28.8,31.5,32.1,32.3,37.2,42.1,47.3,49.5,52.3,52.5,53.9,67.1,80.7,81.8,82.2,82.5,82.6,120.1,125.3,127.2,127.8,141.4,141.5,143.8,144.1,156.5,170.5,170.6,171.2,171.3,172.0,172.2；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C54H79N4O15,1023.5542；found,1023.5533。
实施例14化合物HT-F的制备
称取350mg(0.34mmol)HT-E置于50mL单口瓶中，加入20mL无水DMF超声使其溶解，随后加入86mg(1.01mmol)哌啶，室温下搅拌反应0.5h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液直接隔膜泵旋干，随后加入50mL乙酸乙酯溶解，有机层每次用30mL蒸馏水洗涤3次，饱和食盐水脱水，无水硫酸钠干燥，过滤，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至20/1)，得到240mg无色油状物HT-F。Yield:87.3％；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.41(s,9H,3×-CH3),1.42(s,9H,3×-CH3),1.43(s,9H,3×-CH3),1.44(s,9H,3×-CH3),1.45(s,9H,3×-CH3),1.89(m,4H),2.09(m,2H),2.22(m,2H),2.31(t,J＝7.0Hz,2H),2.38(t,J＝7.0Hz,2H),2.61(m,1H),2.86(m,1H),3.36(m,1H),4.42(m,2H),4.76(m,1H),6.89(d,J＝7.6Hz,1H),7.13(d,J＝7.8Hz,1H),7.22(d,J＝7.8Hz,1H)；13CNMR(125MHz,CDCl3):δ27.7,28.1,28.2,28.5,30.2,31.5,32.5,32.9,37.2,49.5,52.3,52.5,54.5,80.7,81.5,81.8,82.3,82.4,170.5,170.6,171.2,171.4,172.2,172.3,172.8,174.8；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C39H69N4O13,801.4861；found,801.4883。
实施例15化合物HT-G的制备
依次称取80mg(0.25mmol)N-(叔丁氧羰基)-L-天冬氨酸-4-苄酯、71mg(0.371mmol)EDCI和50mg(0.37mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入10mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入223mg(0.27mmol)HT-F和80mg(0.62mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL 1M的盐酸溶液洗涤三次，再用25mL的饱和碳酸氢钠溶液洗涤，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至30/1)，得到240mg白色固体HT-G。Yield:87.6％；m.p.:80.3-80.9℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.41(s,9H,3×-CH3),1.42(s,9H,3×-CH3),1.43(s,9H,3×-CH3),1.44(s,9H,3×-CH3),1.45(s,18H,6×-CH3),1.85(m,2H),1.96(s,2H),2.25(m,8H),2.62(m,1H),2.80(m,2H),3.17(m,1H),4.39(m,1H),4.49(m,2H),4.58(s,1H),4.77(m,1H),5.12(d,J＝12.3Hz,1H),5.21(d,J＝12.3Hz,1H),5.83(d,J＝8.5Hz,1H),6.59(d,J＝7.5Hz,1H),7.05(d,J＝8.5Hz,1H),7.18(d,J＝7.5Hz,1H),7.33(brs,4H),7.34(brs,1H),7.46(d,J＝7.5Hz,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ27.9,28.1,28.2,28.8,29.1,31.5,32.2,36.4,37.5,49.4,51.0,51.9,52.1,52.5,67.1,80.6,80.7,81.7,82.2,82.4,82.6,128.3,128.5,128.7,135.5,155.7,170.6,170.8,171.2,171.3,171.8,172.2,172.4；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C55H88N5O18,1106.6124；found,1106.6114。
实施例16化合物HT-H的制备
称取230mg(0.21mmol)HT-G置于50mL单口瓶中，加入20mL无水甲醇溶解后，加入5mg 10％湿Pd/C，氢气催化下室温下搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝10：1]监测反应完全，反应液过滤除去Pd/C，滤液减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝40/1至20/1)，得到200mg白色固体HT-H。Yield:92.6％；m.p.:81.5-82.2℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.42(s,18H,6×-CH3),1.43(s,9H,3×-CH3),1.44(s,18H,6×-CH3),1.45(s,9H,3×-CH3),1.89(m,2H),2.09(m,2H),2.22(m,2H),2.30(m,8H),2.62(m,1H),2.65(m,1H),2.79(m,2H),3.29(m,1H),4.38(m,2H),4.50(m,2H),5.78(m,1H),6.75(m,1H),7.08(m,1H),7.30(m,1H),7.46(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ27.2,27.5,28.1,28.2,28.4,31.6,32.5,32.7,36.3,37.4,49.5,51.9,52.4,52.5,52.7,81.0,82.1,82.4,82.5,82.7,82.9,155.7,170.4,170.7,171.2,171.4,171.6,172.2,172.5,173.4,173.8,174.8；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C48H82N5O18,1016.5655；found,1016.5638。
实施例17化合物CPT-A2的制备
依次称取2.0g(5.60mmol)Camptothecin、1.2g(6.72mmol)N-Boc-甘氨酸、1.6g(8.40mmol)EDCI和70mg(0.56mmol)DMAP置于100mL单口瓶中，加入50mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至150mL，每次用50mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至30/1)，得到1.84g淡黄色固体CPT-A2。Yield:65.0％；m.p.:>220℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.98(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.42(s,9H,3×-CH3),2.16(m,2H),4.06(dd,J＝18.0,5.0Hz,1H),4.21(dd,J＝18.0,5.0Hz,1H),5.07(s,1H),5.25(m,2H),5.38(d,J＝17.1Hz,1H),5.67(d,J＝17.1Hz,1H),7.30(s,1H),7.65(t,J＝7.5Hz,1H),7.81(t,J＝7.5Hz,1H),7.91(d,J＝8.1Hz,1H),8.23(d,J＝8.1Hz,1H),8.37(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,28.4,31.8,42.5,50.1,67.2,80.3,96.5,120.2,128.2,128.3,128.5,129.8,130.8,131.3,145.7,146.5,148.9,152.3,155.7,157.4,167.3,169.7；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcdforC27H28N3O7,506.1927；found,506.1917。
实施例18化合物CPT-B2的制备
称取1.8g(3.64mmol)CPT-A2置于100mL单口瓶中，加入30mL无水二氯甲烷使其溶解，冰浴下加入9mL TFA，室温下继续搅拌1小时，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝10：1]监测反应完全，反应液在低温下采用隔膜泵旋干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝20/1至8/1)，得到0.9g淡黄色固体CPT-B2。Yield:61.2％；m.p.:194.8-195.2℃；1H NMR(500MHz,CD3OD):δ1.08(t,J＝7.5Hz,3H,-CH3),2.27(m,2H),4.18(m,1H),4.29(m,1H),5.35(m,2H),5.50(d,J＝16.7Hz,1H),5.64(d,J＝16.7Hz,1H),7.44(s,1H),7.71(t,J＝7.5Hz,1H),7.88(t,J＝7.5Hz,1H),8.07(d,J＝8.1Hz,1H),8.15(d,J＝8.1Hz,1H),8.64(s,1H)；13C NMR(125MHz,CD3OD):δ8.0,31.9,41.0,51.6,67.7,79.6,97.7,120.6,129.3,129.8,130.0,130.9,132.1,133.1,133.5,147.4,147.9,149.6,153.4,159.0,168.1,168.6；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd forC22H20N3O5,406.1403；found,406.1397。
实施例19化合物CPT-PW2的制备
依次称取618mg(0.60mmol)WT-H、159mg(0.83mmol)EDCI和112mg(0.83mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入223mg(0.55mmol)CPT-B2和178.0mg(1.38mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至50/1)，得到170mg淡黄色固体CPT-PW2。Yield:21.8％；m.p.:131.1-132.0℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.96(t,3H,-CH3),1.24(m,1H),1.39(s,9H,3×-CH3),1.41(s,18H,6×-CH3),1.42(s,9H,3×-CH3),1.43(s,18H,6×-CH3),1.86(m,4H),2.28(m,12H),2.54(m,3H),3.11(m,1H),4.44(m,6H),5.28(s,2H),5.38(d,J＝17.2Hz,1H),5.65(d,J＝17.2Hz,1H),6.15(d,J＝7.2Hz,1H),6.65(d,J＝8.0Hz,1H),6.81(s,1H),6.93(d,J＝7.2Hz,1H),7.12(s,1H),7.20(s,1H),7.40(d,J＝8.0Hz,1H),7.66(t,J＝7.5Hz,1H),7.83(t,J＝7.5Hz,1H),7.93(d,J＝8.2Hz,1H),8.21(d,J＝8.2Hz,1H),8.40(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,24.4,27.7,28.1,28.2,28.3,28.4,28.6,28.7,29.1,31.0,31.3,31.7,31.9,32.1,32.6,37.1,38.7,50.1,51.5,51.9,52.4,67.3,76.1,80.6,80.7,82.0,82.1,82.3,82.5,96.1,120.3,128.2,128.3,128.4,128.6,129.6,130.9,131.5,145.9,146.3,148.8,152.4,155.9,157.4,167.8,170.9,171.2,171.4,171.5,171.9,172.0,172.3,172.8；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C71H101N8O22,1417.7030；found,1417.7029。
实施例20化合物CPT-W2的制备
称取150mg(0.11mmol)CPT-PW2置于50mL单口瓶中，加入10mL水解液(TFA:Thioanisole:H2O＝95％:2.5％:2.5％)，室温下搅拌反应3h，反应液在低温下减压蒸干，然后加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀，继续加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀即得CPT-PW2粗品，粗品加适量甲醇溶解后，制备液相分离，冷冻干燥后得40mg CPT-W2。Yield:25.0％；m.p.:154.2-154.9℃；1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ0.93(t,3H,-CH3),1.75(s,4H),1.95(s,4H),2.22(s,8H),2.61(m,1H),2.76(m,1H),3.57(s,2H),3.61(s,4H),4.14(s,2H),4.19(m,2H),4.27(s,1H),5.30(s,2H),5.51(m,2H),7.19(s,1H),7.73(t,J＝7.0Hz,1H),7.87(t,J＝7.0Hz,1H),8.14(m,2H),8.18(m,1H),8.27(s,1H),8.71(s,1H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ7.6,26.0,26.3,26.8,27.0,29.6,29.8,30.1,30.4,31.3,35.7,40.3,49.1,50.3,51.1,51.4,51.6,51.9,66.4,76.5,95.2,119.1,127.8,128.1,128.6,128.9,129.8,130.6,131.7,145.0,146.1,147.9,152.4,156.6,167.1,169.0,169.1,171.4,171.6,171.7,172.3,172.5,172.8,173.3,173.5,173.8；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd forC46H52N8O20,1037.3376；found,1037.3396。
实施例21化合物CPT-PH2的制备
依次称取610mg(0.60mmol)HT-H、159mg(0.83mmol)EDCI和112mg(0.83mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入223mg(0.55mmol)CPT-B2和178mg(1.38mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至50/1)，得到340mg淡黄色固体CPT-PH2。Yield:43.2％；m.p.:187.4-188.0℃；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.98(t,3H,-CH3),1.37(s,9H,3×-CH3),1.40(s,27H,9×-CH3),1.42(s,9H,3×-CH3),1.46(s,9H,3×-CH3),2.06(m,4H),2.21(m,10H),2.65(m,3H),3.18(m,1H),4.13(m,1H),4.33(m,2H),4.45(m,3H),4.74(m,1H),5.31(s,2H),5.39(d,J＝17.0Hz,1H),5.67(d,J＝17.0Hz,1H),6.24(s,1H),6.51(d,J＝7.8Hz,1H),6.93(d,J＝9.1Hz,1H),7.13(d,J＝7.4Hz,1H),7.35(s,1H),7.50(m,1H),7.68(t,J＝7.1Hz,1H),7.76(d,J＝7.4Hz,1H),7.86(t,J＝7.1Hz,1H),7.95(d,J＝8.0Hz,1H),8.30(d,J＝8.0Hz,1H),8.40(s,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ7.7,27.6,28.1,28.2,28.4,30.8,31.5,31.8,32.4,36.6,37.5,41.4,49.5,50.1,51.2,52.0,52.6,67.2,77.3,80.5,80.9,81.7,82.1,82.3,97.0,120.6,128.3,128.4,128.8,129.5,131.2,145.5,146.0,146.9,152.1,157.4,167.1,169.1,170.6,170.7,171.0,171.2,171.5,171.7,172.4,173.0；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C70H99N8O22,1403.6874；found,1403.6858。
实施例22化合物CPT-H2的制备
称取300mg(0.21mmol)CPT-PH2置于50mL单口瓶中，加入10mL水解液(TFA：Thioanisole：H2O＝95％：2.5％：2.5％)，室温下搅拌反应3h，反应液在低温下减压蒸干，然后加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀，继续加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀即得CPT-H2粗品，粗品加适量甲醇溶解后，制备液相分离，冷冻干燥后得56mg CPT-H2。Yield:25.5％；m.p.:154.2-154.9℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.94(t,J＝7.4Hz,3H),1.39(s,4H),1.46(s,3H),1.56(s,3H),1.80(s,2H),1.96(s,2H),2.19(m,2H),2.33(m,2H),4.16(m,2H),4.25(m,4H),5.33(s,2H),5.52(s,2H),7.20(s,2H),7.75(t,J＝7.4Hz,2H),7.89(t,J＝7.4Hz,2H),8.18(m,4H),8.70(m,1H),8.73(s,1H),8.79(s,2H)；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcdforC45H51N8O20,1023.3220；found,1023.3214。
实施例23化合物CPT-A4的制备
依次称取2.0g(5.60mmol)Camptothecin、1.4g(6.72mmol)N-(叔丁氧羰基)-4-氨基丁酸、1.6g(8.40mmol)EDCI和68mg(0.56mmol)DMAP置于100mL单口瓶中，加入50mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至150mL，每次用50mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至30/1)，得到1.4g淡黄色固体CPT-A4。Yield:46.0％；m.p.:167.8-170.2℃；1HNMR(500MHz,CDCl3):δ0.98(t,J＝7.5Hz,3H,-CH3),1.42(s,9H,3×-CH3),1.86(m,2H),2.14(m,2H),2.54(m,2H),3.14(m,2H),5.28(m,1H),5.38(m,1H),5.66(m,1H),7.23(m,1H),7.66(m,1H),7.82(m,1H),7.93(m,1H),8.25(m,1H),8.40(m,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,25.1,28.5,31.1,31.8,39.6,50.1,67.2,76.0,79.3,96.1,120.3,128.2,128.3,128.6,129.6,130.9,131.5,146.1,146.3,148.8,152.3,156.2,157.5,167.7,172.3；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C29H32N3O7,534.2240；found,534.2231。
实施例24化合物CPT-B4的制备
称取1.3g(2.44mmol)CPT-A4置于100mL单口瓶中，加入30mL无水二氯甲烷使其溶解，冰浴下加入9mL TFA，室温下继续搅拌1h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝10：1]监测反应完全，反应液在低温下采用隔膜泵旋干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝20/1至8/1)，得到0.7g淡黄色固体CPT-B4。Yield:65.3％；m.p.:>220℃；1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ0.93(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.84(m,2H),2.16(m,2H),2.70(m,2H),2.83(m,2H),5.28(s,2H),5.53(s,2H),7.06(s,1H),7.71(t,J＝7.0Hz,1H),7.86(d,J＝7.0Hz,1H),8.13(d,J＝8.0Hz,1H),8.16(d,J＝8.0Hz,1H),8.69(s,1H)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):δ7.7,22.5,30.3,38.0,50.3,66.4,76.1,94.8,118.9,127.8,128.1,128.7,129.0,129.9,130.5,131.7,145.4,146.2,148.0,152.4,156.6,167.4,171.6；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd forC24H24N3O5,434.1716；found,434.1715。
实施例25化合物CPT-PW4的制备
依次称取618mg(0.60mmol)WT-H、159mg(0.83mmol)EDCI和112mg(0.83mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入238mg(0.55mmol)CPT-B4和178mg(1.38mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至50/1)，得到400mg淡黄色固体CPT-PW4。Yield:50.4％；m.p.:170.1-170.7℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.97(t,3H,-CH3),1.38(s,18H,6×-CH3),1.40(s,9H,3×-CH3),1.42(s,9H,3×-CH3),1.43(s,9H,3×-CH3),1.45(s,9H,3×-CH3),1.86(m,2H),2.10(m,6H),2.28(m,12H),2.64(m,1H),3.10(m,1H),4.23(m,2H),4.43(m,4H),5.29(s,2H),5.38(d,J＝17.0Hz,1H),5.66(d,J＝17.0Hz,1H),6.19(s,1H),6.60(d,J＝8.2Hz,1H),6.87(d,J＝7.0Hz,1H),7.00(d,J＝8.0Hz,1H),7.15(m,1H),7.28(s,1H),7.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.66(t,J＝7.2Hz,1H),7.84(t,J＝7.2Hz,1H),7.93(d,J＝8.0Hz,1H),8.25(d,J＝8.0Hz,1H),8.40(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,27.7,28.1,28.2,28.4,28.5,28.7,29.0,31.1,31.7,32.2,32.5,36.8,41.4,50.2,51.5,52.0,52.4,67.2,80.6,80.7,82.1,82.3,82.4,96.5,120.4,128.3,128.7,129.6,131.0,131.5,145.4,146.4,148.8,152.3,155.9,157.4,167.2,169.1,170.9,171.2,171.4,171.7,171.8,172.0,172.1,172.3,172.8；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C73H105N8O22,1445.7343；found,1445.7358。
实施例26化合物CPT-W4的制备
称取350mg(0.24mmol)CPT-PW4置于50mL单口瓶中，加入10mL水解液(TFA：Thioanisole：H2O＝95％：2.5％：2.5％)，室温下搅拌反应3h，反应液在低温下减压蒸干，然后加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀，继续加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀即得CPT-W4粗品，粗品加适量甲醇溶解后，制备液相分离，冷冻干燥后得70mg CPT-W4。Yield:27.2％；m.p.:169.1-169.6℃；1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ0.93(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.72(m,6H),1.95(s,4H),2.19(m,8H),2.35(s,1H),2.59(m,2H),2.73(m,1H),3.17(s,2H),3.57(s,1H),3.61(s,2H),4.17(m,4H),5.31(m,2H),5.50(m,2H),7.07(s,1H),7.73(t,J＝7.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.4Hz,1H),8.15(m,4H),8.26(s,1H),8.30(s,1H),8.71(s,2H),8.83(s,1H)；13CNMR(125MHz,DMSO-d6):δ7.6,24.4,26.3,26.8,27.0,27.6,29.8,30.1,30.3,30.8,31.3,31.5,35.7,38.0,49.1,50.3,51.1,51.4,51.5,51.8,66.4,75.8,94.7,118.9,127.8,128.1,128.4,128.6,128.9,129.9,130.5,131.7,145.4,146.1,147.9,152.4,156.6,167.4,168.4,171.4,171.5,171.7,171.9,172.5,172.7,173.3,173.5,173.7,173.8；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C48H57N8O20,1065.3689；found,1065.3718。
实施例27化合物CPT-PH4的制备
依次称取610mg(0.60mmol)HT-H、159mg(0.83mmol)EDCI和112mg(0.83mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入238mg(0.55mmol)CPT-B4和178mg(1.38mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至50/1)，得到340mg淡黄色固体CPT-PH4。Yield:43.2％；m.p.:129.5-130.0℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.96(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.40(s,9H,3×-CH3),1.41(s,18H,6×-CH3),1.43(s,9H,3×-CH3),1.44(s,18H,6×-CH3),1.64(m,2H),1.85(m,4H),2.11(m,2H),2.27(m,8H),2.54(m,3H),2.68(m,1H),3.07(m,2H),3.47(m,1H),4.35(m,1H),4.48(m,4H),4.75(m,1H),5.31(s,2H),5.40(d,J＝17.0Hz,1H),5.66(d,J＝17.0Hz,1H),6.06(s,1H),6.58(d,J＝8.0Hz,1H),6.99(s,1H),7.13(m,1H),7.30(s,1H),7.69(t,J＝7.5Hz,1H),7.86(t,J＝7.5Hz,1H),7.96(d,J＝8.0Hz,1H),8.27(d,J＝8.0Hz,1H),8.44(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,24.6,27.6,27.8,28.1,28.2,28.5,28.8,29.8,29.9,31.2,31.4,31.6,31.8,32.0,32.4,32.6,36.8,37.4,38.8,49.5,50.1,51.3,51.9,52.6,67.2,81.0,82.1,82.4,96.7,120.7,128.4,128.8,129.3,131.2,146.0,157.4,167.6,170.5,170.7,171.0,171.3,171.6,172.0,172.3,172.4,173.1；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C72H103N8O22,1431.7187；found,1431.7183。
实施例28化合物CPT-H4的制备
称取300mg(0.21mmol)CPT-PH4置于50mL单口瓶中，加入10mL水解液(TFA：Thioanisole：H2O＝95％：2.5％：2.5％)，室温下搅拌反应3h，反应液在低温下减压蒸干，然后加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀，继续加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀即得CPT-H4粗品，粗品加适量甲醇溶解后，制备液相分离，冷冻干燥后得56mg淡黄色固体CPT-H4。Yield:25.5％；m.p.:156.2-156.9℃；1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ0.92(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.74(m,6H),1.96(m,3H),2.20(m,8H),2.37(m,2H),2.58(m,2H),2.70(m,1H),3.15(m,2H),3.87(m,1H),4.16(m,3H),4.56(m,1H),5.30(s,2H),5.50(s,2H),7.07(s,1H),7.72(t,J＝7.5Hz,1H),7.87(t,J＝7.5Hz,1H),7.98(m,1H),8.09(m,1H),8.15(m,4H),8.28(m,1H),8.68(s,1H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ7.6,17.9,24.1,25.7,26.0,26.3,26.7,27.0,27.6,28.6,29.6,29.8,30.1,30.3,31.2,31.3,33.1,35.6,36.8,38.5,49.1,50.3,51.0,51.1,51.4,51.5,51.8,52.1,66.3,75.7,94.7,118.9,127.8,128.1,128.6,129.0,129.9,130.5,131.7,145.4,146.0,147.9,156.6,167.3,168.2,168.3,171.3,171.5,171.7,172.0,172.7,173.4,173.7；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C47H55N8O20,1051.3533；found,1051.3536。
实施例29化合物CPT-A6的制备
依次称取2.0g(5.60mmol)Camptothecin、1.6g(6.72mmol)叔丁氧羰酰基6-氨基己酸、1.6g(8.40mmol)EDCI和70mg(0.56mmol)DMAP置于100mL单口瓶中，加入50mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至150mL，每次用50mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至30/1)，得到1.73g淡黄色固体CPT-A6。Yield:55.0％；m.p.:152.0-152.5℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.97(t,J＝7.5Hz,3H,-CH3),1.39(s,9H,3×-CH3),1.50(m,2H),1.66(m,4H),2.14(m,2H),2.49(m,2H),3.07(m,2H),5.29(s,2H),5.39(d,J＝17.0Hz,1H),5.67(d,J＝17.0Hz,1H),7.23(s,1H),7.67(t,J＝7.4Hz,1H),7.83(t,J＝7.4Hz,1H),7.94(d,J＝8.0Hz,1H),8.22(d,J＝8.0Hz,1H),8.40(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,24.4,26.2,28.5,29.9,32.0,33.8,40.4,50.1,67.2,75.9,96.3,120.5,128.2,128.3,128.4,128.6,129.6,130.9,131.5,146.2,146.2,148.9,152.4,157.5,167.7,172.7；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C31H36N3O7,562.2553；found,562.2548。
实施例30化合物CPT-B6的制备
称取1.7g(3.03mmol)CPT-A6置于100mL单口瓶中，加入30mL无水二氯甲烷使其溶解，冰浴下加入9mL TFA，室温下继续搅拌1h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝10：1]监测反应完全，反应液在低温下采用隔膜泵旋干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝20/1至8/1)，得到0.9g淡黄色固体CPT-B6。Yield:65.0％；m.p.:207.5-208.0℃；1H NMR(500MHz,CD3OD):δ1.05(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.48(m,2H),1.70(m,4H),2.23(m,2H),2.62(m,2H),2.91(m,2H),5.27(s,2H),5.47(d,J＝16.8Hz,1H),5.61(d,J＝16.8Hz,1H),7.35(s,1H),7.70(t,J＝7.0Hz,1H),7.87(t,J＝7.0Hz,1H),8.04(d,J＝8.0Hz,1H),8.15(d,J＝8.0Hz,1H),8.60(s,1H)；13C NMR(125MHz,CD3OD):δ8.1,25.1,26.6,28.2,32.1,34.2,40.5,51.5,67.7,77.5,97.8,120.6,129.2,129.7,130.0,130.9,132.0,133.4,147.5,148.4,149.5,153.4,159.0,169.6,173.9；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C26H28N3O5,462.2029；found,462.2030。
实施例31化合物CPT-PW6的制备
依次称取618mg(0.60mmol)WT-H、159mg(0.83mmol)EDCI和112mg(0.83mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入254mg(0.55mmol)CPT-B6和178mg(1.38mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至50/1)，得到410mg淡黄色固体CPT-PW6。Yield:50.6％；m.p.:212.0-212.7℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.97(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.24(m,1H),1.38(s,27H,9×-CH3),1.40(s,9H,3×-CH3),1.42(s,9H,3×-CH3),1.43(s,9H,3×-CH3),1.45(s,9H,3×-CH3),1.47(m,2H),1.69(m,1H),1.86(m,2H),2.10(m,5H),2.28(m,12H),2.64(m,1H),3.10(m,1H),4.23(m,2H),4.43(m,5H),5.29(s,2H),5.38(d,J＝17.0Hz,1H),5.66(d,J＝17.0Hz,1H),6.19(s,1H),6.60(d,J＝8.5Hz,1H),6.87(d,J＝7.5Hz,1H),7.00(d,J＝8.5Hz,1H),7.15(s,1H),7.28(s,1H),7.32(d,J＝7.5Hz,1H),7.66(t,J＝7.2Hz,1H),7.84(t,J＝7.2Hz,1H),7.93(d,J＝8.0Hz,1H),8.25(d,J＝8.0Hz,1H),8.40(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,27.7,28.1,28.2,28.4,28.5,28.7,29.0,31.1,31.7,32.2,32.5,36.8,41.4,50.2,51.5,52.0,52.4,67.2,77.1,80.6,80.7,82.1,82.3,82.4,96.5,120.4,128.3,128.7,129.6,131.0,131.5,145.4,146.4,148.8,152.3,155.9,157.4,167.2,169.1,170.9,171.2,171.4,171.7,171.8,172.0,172.1,172.3,172.8；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C75H109N8O22,1473,7656；found,1473.7646。
实施例32化合物CPT-W6的制备
称取350mg(0.24mmol)CPT-PW6置于50mL单口瓶中，加入10mL水解液(TFA：Thioanisole：H2O＝95％：2.5％：2.5％)，室温下搅拌反应3h，反应液在低温下减压蒸干，然后加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀，继续加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀即得CPT-W6粗品，粗品加适量甲醇溶解后，制备液相分离，冷冻干燥后得50mgCPT-W6。Yield:19.4％；m.p.:204.1-204.7℃；1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ0.92(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.33(m,2H),1.44(m,2H),1.57(m,2H),1.79(m,4H),1.96(m,4H),2.19(m,8H),2.37(s,1H),2.70(m,1H),3.01(m,1H),3.10(m,1H),3.58(s,2H),3.61(s,1H),4.18(m,4H),5.31(m,2H),5.49(m,2H),7.04(s,1H),7.72(m,1H),7.87(m,1H),8.14(m,4H),8.20(m,1H),8.70(s,1H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ7.6,24.4,26.3,26.8,27.0,27.6,29.8,30.1,30.3,30.8,31.3,31.5,35.7,38.0,49.1,50.3,51.1,51.4,51.5,51.8,66.4,75.8,94.7,118.9,127.8,128.1,128.4,128.6,128.9,129.9,130.5,131.7,145.4,146.1,147.9,152.4,156.6,167.4,171.4,171.5,171.7,171.9,172.5,172.7,173.3,173.5,173.7,173.8；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C50H61N8O20,1093.4002；found,1093.4036。
实施例33化合物CPT-PH6的制备
依次称取610mg(0.60mmol)HT-H、159mg(0.83mmol)EDCI和112mg(0.83mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入254mg(0.55mmol)CPT-B6和178mg(1.38mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至50/1)，得到420mg淡黄色固体CPT-PH6。Yield:52.3％；m.p.:132.5-133.0℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.96(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.40(s,9H,3×-CH3),1.41(s,18H,6×-CH3),1.43(s,9H,3×-CH3),1.44(s,9H,3×-CH3),1.45(s,9H,3×-CH3),1.64(m,4H),2.09(m,2H),2.27(m,8H),2.45(m,4H),2.67(m,2H),2.94(s,1H),3.06(s,1H),3.38(m,1H),4.43(m,4H),4.75(m,1H),5.29(s,2H),5.40(d,J＝17.2Hz,1H),5.66(d,J＝17.2Hz,1H),6.54(d,J＝8.4Hz,1H),6.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.01(s,1H),7.13(m,1H),7.22(s,1H),7.67(t,J＝7.1Hz,1H),7.84(t,J＝7.1Hz,1H),7.94(d,J＝8.0Hz,1H),8.22(d,J＝8.0Hz,1H),8.40(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,24.4,26.3,27.5,27.7,28.1,28.2,28.4,28.8,29.1,29.2,29.9,31.1,31.5,31.8,32.0,32.4,33.8,36.8,39.5,49.4,50.1,51.2,51.5,51.9,52.2,52.7,67.2,75.8,80.6,80.7,80.9,81.7,82.1,82.4,96.2,120.5,128.2,128.3,128.4,128.7,129.6,130.9,131.5,146.0,146.2,148.8,152.4,157.5,167.7,170.5,170.7,171.0,171.2,171.3,171.5,172.0,172.4,172.6,173.1；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C74H107N8O22,1459.7500；found,1459.7490。
实施例34化合物CPT-H6的制备
称取380mg(0.26mmol)CPT-PH6置于50mL单口瓶中，加入10mL水解液(TFA：Thioanisole：H2O＝95％：2.5％：2.5％)，室温下搅拌反应3h，反应液在低温下减压蒸干，然后加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀，继续加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀即得CPT-H6粗品，粗品加适量甲醇溶解后，制备液相分离，冷冻干燥后得50mgCPT-H6。Yield:17.9％；m.p.:167.9-168.5℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.92(t,J＝7.4Hz,3H),1.35(m,2H),1.42(m,2H),1.55(m,2H),1.78(m,3H),1.96(m,3H),2.15(m,4H),2.25(m,4H),2.68(m,2H),3.05(m,2H),3.43(s,4H),4.17(m,4H),4.58(m,1H),5.31(brs,2H),5.49(brs,2H),7.04(s,1H),7.72(t,J＝7.6Hz,1H),7.87(t,J＝7.6Hz,1H),8.12(m,5H),8.20(m,1H),8.70(s,1H),8.72(s,1H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ7.6,17.0,24.0,25.7,26.2,27.0,28.6,29.9,30.3,31.2,33.1,35.6,36.2,36.5,38.5,49.1,49.2,50.3,51.3,51.5,51.8,66.3,75.7,94.7,118.9,127.8,128.0,128.6,128.9,129.8,130.5,131.7,145.4,146.0,147.9,152.3,156.6,167.3,168.1,168.3,171.0,171.3,171.4,171.7,172.0,172.7,173.0,173.4,173.7,173.8；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcdfor C49H59N8O20,1079.3846；found,1079.3843。
实施例35化合物CPT-A12的制备
依次称取2g(5.60mmol)Camptothecin、2.2g(6.72mmol)12-(Boc-氨基)十二烷酸、1.6g(8.40mmol)EDCI和68mg(0.56mmol)DMAP置于100mL单口瓶中，加入50mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至150mL，每次用50mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至30/1)，得到2.42g淡黄色固体CPT-A12。Yield:67.0％；m.p.:134.6-140.0℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.96(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.15(m,8H),1.26(m,6H),1.42(s,9H,3×-CH3),1.62(m,2H),2.16(m,1H),2.27(m,1H),2.47(m,2H),3.06(s,2H),5.26(m,2H),5.40(d,J＝17.1Hz,1H),5.66(d,J＝17.1Hz,1H),7.22(s,1H),7.66(t,J＝7.3Hz,1H),7.82(t,J＝7.3Hz,1H),7.93(d,J＝8.1Hz,1H),8.20(d,J＝8.1Hz,1H),8.39(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,24.7,26.9,28.5,29.1,29.3,29.5,30.1,32.0,33.9,40.7,50.0,67.2,75.7,79.1,96.2,120.5,128.2,128.3,128.6,129.6,130.8,131.4,146.1,146.2,148.9,152.4,156.1,157.5,167.7,172.9；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C37H48N3O7,646.3492；found,646.3484。
实施例36化合物CPT-B12的制备
取2.2g(3.41mmol)CPT-A12置于100mL单口瓶中，加入30mL无水二氯甲烷使其溶解，冰浴下加入9mL TFA，室温下继续搅拌1小时，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝10：1]监测反应完全，反应液在低温下采用隔膜泵旋干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝20/1至8/1)，得到1.34g淡黄色固体CPT-B12。Yield:72.0％；m.p.:215.5-216.0℃；1H NMR(500MHz,CD3OD):δ1.04(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.23(m,8H),1.33(m,6H),1.63(m,4H),2.23(m,2H),2.54(m,2H),2.89(m,2H),5.27(s,2H),5.47(d,J＝16.8Hz,1H),5.60(d,J＝16.8Hz,1H),7.35(s,1H),7.69(t,J＝7.3Hz,1H),7.86(t,J＝7.3Hz,1H),8.04(d,J＝8.2Hz,1H),8.14(d,J＝8.2Hz,1H),8.58(s,1H)；13C NMR(125MHz,CD3OD):δ8.0,25.8,27.4,28.6,30.0,30.1,30.3,30.4,30.5,32.2,34.6,40.8,51.5,67.7,77.3,97.9,120.7,129.2,129.7,129.8,130.0,130.8,131.9,133.3,147.5,148.4,149.6,153.4,159.0,169.6,174.1；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd forC32H40N3O5,546.2968；found,546.2972。
实施例37化合物CPT-PW12的制备
依次称取618mg(0.60mmol)WT-H、159mg(0.83mmol)EDCI和112mg(0.83mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入300mg(0.55mmol)CPT-B12和178mg(1.38mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至50/1)，得到380mg淡黄色固体CPT-PW12。Yield:44.4％；m.p.:131.1-132.0℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.95(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.18(m,12H),1.30(m,4H),1.41(s,27H,9×-CH3),1.42(s,27H,9×-CH3),1.61(m,4H),1.87(m,2H),2.08(m,1H),2.14(m,2H),2.32(m,10H),2.48(m,4H),2.94(m,1H),3.05(m,1H),3.32(m,1H),4.42(m,2H),4.48(m,3H),5.27(m,2H),5.39(d,J＝17.2Hz,1H),5.65(d,J＝17.2Hz,1H),6.20(brs,1H),6.54(d,J＝8.0Hz,1H),6.61(s,1H),6.82(brs,1H),7.07(brs,1H),7.21(s,1H),7.47(d,J＝8.0Hz,1H),7.65(t,J＝7.1Hz,1H),7.81(t,J＝7.1Hz,1H),7.93(d,J＝8.0Hz,1H),8.19(d,J＝8.0Hz,1H),8.40(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,24.7,26.8,27.0,27.8,28.1,28.2,28.4,28.6,29.1,29.4,29.5,29.6,31.2,31.7,31.9,32.2,32.6,33.9,36.9,39.9,50.0,51.4,51.5,51.8,52.3,52.4,67.2,75.7,80.6,80.7,82.1,82.3,82.5,96.2,120.5,128.2,128.3,128.4,128.6,129.6,130.8,131.4,146.1,146.2,148.8,152.4,155.9,157.5,167.7,170.9,171.2,171.3,171.4,171.7,171.9,172.0,172.3,172.9；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C81H121N8O22,1557.8595；found,1557.8596。
实施例38化合物CPT-W12的制备
称取350mg(0.23mmol)CPT-PW12置于50mL单口瓶中，加入10mL水解液(TFA:Thioanisole:H2O＝95％：2.5％：2.5％)，室温下搅拌反应3h，反应液在低温下减压蒸干，然后加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀，继续加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀即得CPT-W12粗品，粗品加适量甲醇溶解后，制备液相分离，冷冻干燥后得80mg CPT-W12。Yield:30.3％；m.p.:154.0-154.9℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.92(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.10(m,10H),1.30(m,8H),1.56(m,2H),1.78(m,4H),1.96(m,4H),2.20(m,9H),2.35(m,1H),2.72(m,1H),3.58(s,2H),3.61(s,2H),3.64(s,1H),4.20(m,4H),5.30(brs,2H),5.49(brs,2H),7.04(s,1H),7.72(t,J＝7.4Hz,1H),7.86(t,J＝7.4Hz,1H),8.15(m,8H),8.27(m,1H),8.69(s,1H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ7.6,24.5,26.4,27.0,28.4,28.7,28.8,29.0,29.8,30.3,31.3,31.5,33.2,35.6,38.8,49.2,50.3,51.0,51.2,51.4,51.8,66.3,75.6,94.7,119.0,127.8,128.1,128.6,129.0,129.8,130.4,131.6,145.4,146.0,147.9,152.3,156.6,167.3,168.2,168.3,171.4,171.5,172.1,172.5,172.7,173.3,173.4,173.7；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C56H73N8O20,1177.4941；found,1177.4957。
实施例39化合物CPT-PH12的制备
依次称取610mg(0.60mmol)HT-H、159mg(0.83mmol)EDCI和112mg(0.83mmol)HOBt置于50mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应0.5h，继续加入300mg(0.55mmol)CPT-B12和178mg(1.38mmol)DIPEA，室温搅拌反应4h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至50mL，每次用25mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至50/1)，得到330mg淡黄色固体CPT-PH12。Yield:38.9％；m.p.:163.1-163.7℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.95(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.15(m,10H),1.30(m,4H),1.41(s,12H,4×-CH3),1.43(s,27H,9×-CH3),1.44(s,15H,5×-CH3),1.58(m,3H),1.83(m,1H),2.07(m,3H),2.26(m,6H),2.47(m,4H),2.66(s,1H),2.90(s,1H),3.10(s,1H),3.36(s,1H),4.42(m,1H),4.52(s,2H),4.76(s,1H),5.28(m,2H),5.40(d,J＝17.0Hz,1H),5.66(d,J＝17.0Hz,1H),5.87(d,1H),6.31(d,1H),7.23(s,1H),7.67(d,J＝7.0Hz,1H),7.83(d,J＝7.0Hz,1H),7.95(brs,1H),8.21(brs,1H),8.41(s,1H)；13CNMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,24.7,27.1,27.4,27.7,28.1,28.2,28.4,29.1,29.4,29.5,29.6,29.7,29.8,30.0,31.0,31.5,31.8,32.0,32.4,32.5,33.9,36.7,37.4,39.8,49.4,50.0,51.2,51.5,51.9,52.2,52.7,67.2,75.7,76.9,77.2,77.4,80.6,80.8,80.9,81.7,82.0,82.4,96.3,120.6,128.2,128.3,128.4,128.6,129.6,130.9,131.5,146.1,146.1,148.8,152.4,157.5,167.7,170.4,170.7,171.1,171.2,171.3,171.4,171.9,172.0,172.3,172.9,173.1,173.2；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C80H119N8O22,1543.8439；found,1543.8440。
实施例40化合物CPT-H12的制备
称取300mg(0.19mmol)CPT-PH12置于50mL单口瓶中，加入10mL水解液(TFA：Thioanisole：H2O＝95％：2.5％：2.5％)，室温下搅拌反应3h，反应液在低温下减压蒸干，然后加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀，继续加入10mL冰乙醚沉淀，离心收集沉淀即得CPT-H12粗品，粗品加适量甲醇溶解后，制备液相分离，冷冻干燥后得79mg CPT-H12。Yield:35.0％；m.p.:147.8-148.0℃；1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ0.92(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.10(m,10H),1.30(m,8H),1.56(m,2H),1.78(m,4H),1.96(m,4H),2.20(m,9H),2.35(m,1H),2.72(m,1H),3.58(s,2H),3.61(s,2H),3.64(s,1H),4.20(m,4H),5.30(brs,2H),5.49(brs,2H),7.04(s,1H),7.72(t,J＝7.5Hz,1H),7.86(t,J＝7.5Hz,1H),8.15(m,8H),8.27(m,1H),8.71(s,1H)；13CNMR(125MHz,DMSO-d6):δ7.6,24.5,26.4,27.0,28.4,28.7,28.8,29.0,29.8,30.3,31.3,31.5,33.2,35.6,38.8,49.2,50.3,51.0,51.2,51.4,51.8,66.3,75.6,94.7,119.0,127.8,128.1,128.6,129.0,129.8,130.4,131.6,145.4,146.0,147.9,152.3,156.6,167.3,168.2,168.3,171.4,171.5,172.1,172.5,172.7,173.3,173.4,173.7；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C55H71N8O20,1163.4785；found,1163.4800。
实施例41化合物CPT-D2的制备
依次称取214mg(0.60mmol)N-苄氧羰基-L-天冬氨酸1-苄酯、159mg(0.83mmol)EDCI和112mg(0.83mmol)HOBt置于100mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应10min，继续加入223mg(0.55mmol)CPT-B2和178mg(1.38mmol)DIPEA，室温下搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至100mL，每次用50mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至30/1)，得到286mg淡黄色固体CPT-D2。Yield:63.9％；m.p.:181.3-181.8℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.89(t,J＝7.4Hz,3H),2.11(m,4H),2.22(m,1H),2.77(m,1H),3.07(m,1H),4.39(s,1H),4.42(s,2H),5.00(d,J＝12.1Hz,2H),5.15(d,J＝18.9Hz,2H),5.28(d,J＝17.2Hz,2H),5.54(d,J＝17.2Hz,1H),5.86(s,1H),7.21(brs,8H),7.58(t,J＝7.4Hz,1H),7.73(t,J＝7.4Hz,1H),7.84(d,J＝8.2Hz,1H),8.18(d,J＝8.2Hz,1H),8.27(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.5,31.0,31.8,35.8,39.6,50.0,50.4,67.1,67.4,96.3,120.3,128.1,128.2,128.3,128.5,128.6,129.6,130.7,131.3,135.7,145.0,146.4,148.7,152.1,155.9,157.2,165.9,166.6,172.8,174.5；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C41H37N4O10,745.2510；found,745.2510。
实施例42化合物CPT-MD2的制备
称取250mg(0.34mmol)CPT-D2置于100mL单口瓶中，先加入50mL无水甲醇使其溶解，随后加入适量5％的Pd/C，在氢气保护下室温搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液过滤，滤液减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝30/1至10/1)，得到40mg淡黄色固体CPT-MD2。Yield:22.8％；m.p.:125.3-125.8℃；1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ0.92(t,J＝7.4Hz,3H),2.16(m,2H),2.42(m,1H),2.82(d,J＝16.1Hz,1H),3.47(brs,1H),4.08(d,J＝17.3Hz,1H),4.19(d,J＝17.3Hz,1H),5.27(brs,2H),5.50(brs,2H),7.19(s,1H),7.71(t,J＝6.7Hz,1H),7.85(d,J＝6.7Hz,1H),8.11(d,J＝8.1Hz,1H),8.20(d,J＝8.1Hz,1H),8.67(s,1H),9.02(s,1H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ8.0,28.0,30.8,36.4,40.9,50.7,51.2,66.8,76.7,95.9,119.4,128.2,128.4,129.0,129.5,130.2,130.9,132.1,145.6,146.4,148.4,152.8,157.0,167.6,169.4,171.7；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C26H25N4O8,521.1672；found,521.1659。
实施例43化合物CPT-D4的制备
依次称取214mg(0.60mmol)N-苄氧羰基-L-天冬氨酸1-苄酯、159mg(0.83mmol)EDCI和112mg(0.83mmol)HOBt置于100mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应10min，继续加入238mg(0.55mmol)CPT-B4和178mg(1.38mmol)DIPEA，室温下搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至100mL，每次用50mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至30/1)，得到240mg淡黄色固体CPT-D4。Yield:56.5％；m.p.:102.0-102.9℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.97(t,J＝7.5Hz,3H,-CH3),1.82(m,2H),2.11(m,1H),2.25(m,1H),2.50(m,2H),2.71(m,1H),2.89(m,1H),3.23(m,2H),4.59(m,1H),5.08(s,2H),5.13(m,2H),5.26(m,2H),5.39(d,J＝17.2Hz,1H),5.68(d,J＝17.2Hz,1H),6.03(s,1H),6.09(m,1H),7.23(s,1H),7.29(brs,5H),7.30(brs,5H),7.67(t,J＝7.6Hz,1H),7.83(t,J＝7.6Hz,1H),7.94(d,J＝8.2Hz,1H),8.23(d,J＝8.2Hz,1H),8.38(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,24.2,31.3,31.9,37.7,38.6,50.1,51.1,67.0,67.3,67.4,76.2,96.2,120.2,128.0,128.2,128.3,128.4,128.6,129.5,131.0,131.6,135.6,136.5,146.0,146.3,148.7,152.3,156.3,157.4,168.0,170.1,171.2,172.4；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C43H41N4O10,773.2823；found,773.2811。
实施例44化合物CPT-MD4的制备
称取200mg(0.26mmol)CPT-D4置于100mL单口瓶中，先加入50mL无水甲醇使其溶解，随后加入适量5％的Pd/C，在氢气保护下室温搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液过滤，滤液减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝30/1至10/1)，得到56mg淡黄色固体CPT-MD4。Yield:39.4％；m.p.:199.0-200.0℃；1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ0.97(t,J＝7.5Hz,3H,-CH3),2.15(m,2H),2.37(m,2H),2.57(m,2H),2.74(m,2H),3.11(m,2H),4.10(m,1H),5.28(brs,2H),5.44(s,1H),5.49(brs,2H),7.07(s,1H),7.32(m,1H),7.72(t,J＝7.5Hz,1H),7.87(t,J＝7.5Hz,1H),8.13(d,J＝8.1Hz,1H),8.15(d,J＝8.1Hz,1H),8.34(s,2H),8.70(s,1H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ7.6,24.4,30.3,30.8,31.9,36.1,37.8,50.9,66.3,75.7,94.7,119.8,127.0,127.6,127.7,128.0,128.5,129.8,130.5,131.6,145.3,146.0,147.9,152.3,156.5,167.3,169.1,170.4,171.4,171.9；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C28H29N4O8,549.1985；found,549.1985。
实施例45化合物CPT-D6的制备
依次称取214mg(0.60mmol)N-苄氧羰基-L-天冬氨酸1-苄酯、159mg(0.83mmol)EDCI和112mg(0.83mmol)HOBt置于100mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应10min，继续加入254mg(0.55mmol)CPT-B6和178mg(1.38mmol)DIPEA，室温下搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至100mL，每次用50mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至30/1)，得到280mg淡黄色固体CPT-D6。Yield:63.6％；m.p.:105.0-105.7℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.96(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.37(m,2H),1.44(m,2H),1.65(m,2H),2.13(m,1H),2.26(m,1H),2.44(m,1H),2.52(m,1H),2.64(m,1H),2.87(m,1H),3.16(m,2H),4.57(m,1H),5.07(s,2H),5.15(brs,2H),5.27(brs,2H),5.39(d,J＝17.2Hz,1H),5.67(d,J＝17.2Hz,1H),6.03(brs,1H),6.08(brs,1H),7.22(s,1H),7.29(m,10H),7.66(t,J＝7.5Hz,1H),7.83(t,J＝7.5Hz,1H),7.94(d,J＝8.1Hz,1H),8.21(d,J＝8.1Hz,1H),8.39(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,24.2,25.8,28.8,32.0,33.7,37.7,39.1,50.1,51.1,67.0,67.3,67.4,76.0,76.9,77.2,77.4,96.2,120.4,128.0,128.2,128.3,128.4,128.6,128.7,129.4,131.0,131.6,135.6,136.5,146.0,146.2,148.8,152.4,156.3,157.4,168.0,169.7,171.2,172.8；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C45H45N4O10,801.3136；found,801.3123。
实施例46化合物CPT-MD6的制备
称取250mg(0.31mmol)CPT-D6置于100mL单口瓶中，先加入50mL无水甲醇使其溶解，随后加入适量5％的Pd/C，在氢气保护下室温搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液过滤，滤液减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝30/1至10/1)，得到60mg淡黄色固体CPT-MD6。Yield:33.3％；m.p.:114.5-115.2℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.92(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.27(m,4H),1.42(m,2H),1.56(m,2H),2.15(m,2H),2.32(m,1H),2.71(d,J＝16.2Hz,1H),3.02(m,3H),5.30(brs,2H),5.49(brs,2H),7.05(s,1H),7.34(m,1H),7.72(t,J＝7.3Hz,1H),7.88(t,J＝7.3Hz,1H),8.15(m,2H),8.25(brs,1H),8.68(s,1H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ8.0,24.9,26.0,29.0,30.7,31.2,33.5,38.7,53.5,56.2,66.7,76.1,95.1,119.3,127.8,128.2,128.5,129.8,130.2,130.9,132.0,145.8,146.4,148.3,152.7,157.0,167.7,173.8,177.4,177.8；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C30H33N4O8,577.2298；found,577.2288。
实施例47化合物CPT-D12的制备
依次称取214mg(0.60mmol)N-苄氧羰基-L-天冬氨酸1-苄酯、159mg(0.83mmol)EDCI和112mg(0.83mmol)HOBt置于100mL单口瓶中，加入20mL无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌反应10min，继续加入300mg(0.55mmol)CPT-B12和178mg(1.38mmol)DIPEA，室温下搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液用二氯甲烷稀释至100mL，每次用50mL蒸馏水洗涤三次，随后用饱和食盐水脱水，收集有机层，有机层适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝1/0至30/1)，得到250mg淡黄色固体CPT-D12。Yield:51.4％；m.p.:90.0-90.7℃；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ0.97(t,J＝7.4Hz,3H,-CH3),1.16(brs,10H),1.25(s,2H),1.31(m,2H),1.36(m,2H),1.62(m,2H),2.15(m,1H),2.28(m,1H),2.47(m,2H),2.69(d,J＝12.8Hz,1H),2.89(d,J＝12.8Hz,1H),3.12(m,2H),4.60(s,1H),5.09(s,2H),5.17(m,2H),5.26(s,2H),5.40(d,J＝17.1Hz,1H),5.66(d,J＝17.1Hz,1H),6.13(d,J＝7.1Hz,1H),7.22(s,1H),7.31(s,10H),7.66(t,J＝7.3Hz,1H),7.83(t,J＝7.3Hz,1H),7.94(d,J＝8.3Hz,1H),8.21(d,J＝8.3Hz,1H),8.38(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ7.7,24.7,26.9,29.1,29.3,29.4,29.5,29.6,32.0,33.9,37.8,39.7,50.0,51.1,67.0,67.2,67.5,75.7,96.3,120.5,128.0,128.2,128.3,128.4,128.6,129.6,130.8,131.4,135.5,136.4,146.1,146.2,148.8,152.4,156.3,157.5,167.7,169.5,171.1,172.9；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C51H57N4O10,885.4075；found,885.4074。
实施例48化合物CPT-MD12的制备
称取200mg(0.23mmol)CPT-D12置于100mL单口瓶中，先加入50mL无水甲醇使其溶解，随后加入适量5％的Pd/C，在氢气保护下室温搅拌反应12h，TLC[V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝20：1]监测反应完全，反应液过滤，滤液减压蒸干，硅胶拌样，Flash硅胶柱层析(DCM/MeOH＝30/1至10/1)，得到60mg淡黄色固体CPT-MD12。Yield：33.3％；m.p.:181.0-181.2℃；1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ0.89(t,J＝7.5Hz,3H,-CH3),1.06(m,8H),1.28(m,8H),1.54(m,2H),2.13(m,2H),2.41(m,1H),2.72(m,1H),2.99(m,2H),3.45(brs,2H),4.07(m,1H),4.34(m,1H),5.30(m,1H),5.48(m,1H),7.04(s,1H),7.32(m,1H),7.72(m,1H),7.86(m,1H),8.14(d,J＝8.6Hz,1H),8.26(brs,1H),8.71(s,1H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ7.5,24.4,26.4,28.4,28.7,28.8,28.9,30.2,33.1,35.9,38.6,50.3,51.0,58.9,66.3,75.6,94.7,119.0,127.7,128.0,128.6,128.9,129.8,130.4,131.6,142.7,145.4,146.0,147.9,152.2,156.6,167.3,172.1；HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C36H45N4O8,661.3237；found,661.3231。
实施例49
取实施例17～48任一制备的化合物10g，加入注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)适当辅料，按注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)工艺制备成抗肿瘤药注射剂。
实施例50
取实施例17～48任一制备的化合物10g，加入片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)适当辅料，按片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)工艺制备成抗肿瘤药片剂。
实施例51
取实施例17～48任一制备的化合物10g，加入胶囊剂适当辅料，按胶囊剂工艺制备成抗肿瘤药胶囊剂。
实施例52
取实施例17～48任一制备的化合物10g，加入乳剂(包括微乳、纳米乳等)适当辅料，按乳剂(包括微乳、纳米乳等)工艺制备成抗肿瘤药乳剂。
实施例53
取实施例17～48任一制备的化合物10g，加入颗粒剂适当辅料，按颗粒剂工艺制备成抗肿瘤药颗粒剂。
实施例54
取实施例17～48任一制备的化合物10g，加入缓释控释剂适当辅料，按缓释控释剂工艺制成抗肿瘤药缓释控释剂。
实施例55
取实施例17～48任一制备的化合物10g，加入口服液适当辅料，按口服液工艺制备成抗肿瘤药口服液。
实施例56
取实施例17～48任一制备的化合物10g，加入脂质体剂型适当辅料，按脂质体工艺制备成抗肿瘤药脂质体剂型。

Claims (10)

1.具有抗肿瘤作用的通式1或者通式2化合物,
Figure FDA0002089285710000011
L为-[Cm(O)(Z)n(NH)q]-，其中m,q分别为0或1，n为0～11，p为0～8；其中Z可为烷烃(-CH2-)；可为烯烃(-CH＝CH-)；可为氨基酸或者多肽；可为腙(-NH-N＝C-)；可为醚(-CH2-O-CH2-),可为单个或多个醚，且可在Z中任意位置；可为二硫醚(-S-S-),可为单个或多个二硫醚，且可在Z中任意位置；还可为烷烃(-CH2-)和烯烃(-CH＝CH-)的任意组合；还可为烷烃(-CH2-)和氨基酸或者多肽的任意组合；还可为烯烃(-CH＝CH-)和氨基酸或者多肽的任意组合；还可为烷烃(-CH2-)和腙(-NH-N＝C-)的任意组合；还可为烷烃(-CH2-)和醚(-CH2-O-CH2-)的任意组合；还可为或烷烃(-CH2-)和二硫醚(-S-S-)的任意组合；还可为烯烃(-CH＝CH-)和二硫醚(-S-S-)的任意组合；还可为或烷烃(-CH2-)、烯烃(-CH＝CH-)、二硫醚(-S-S-)和二硫醚(-S-S-)的任意组合；
R1选自氢、羟基，氨基，烯基、炔基，烷氧基，烷胺基，烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、杂环基烷；
R2选自氢、羟基，氨基，烯基、炔基，烷氧基，烷胺基，烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、杂环基烷；
R3选自氢、羟基，氨基，烯基、炔基，烷氧基，烷胺基，烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、杂环基烷；
R4选自氢、羟基，氨基，烯基、炔基，烷氧基，烷胺基，烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、杂环基烷；
R5选自氢、羟基，氨基，烯基、炔基，烷氧基，烷胺基，烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、杂环基烷。
2.具有抗肿瘤作用的化合物CPT-W12
Figure FDA0002089285710000021
3.如权利要求2所述的所述化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，加入制剂领域常规辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、注射剂等常规剂型。
4.如权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于，该方法为：
包括如下步骤：
步骤1，将喜树碱溶于有机溶剂，与12-(Boc-氨基)十二烷酸在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-A12；
步骤2，化合物CPT-B12的制备方法：将CPT-A12溶于有机溶剂，在TFA作用下生成CPT-B12；
步骤3，化合物CPT-PW12的制备方法：将CPT-B12溶于有机溶剂，与HT-J在缩合剂、催化剂作用下生成CPT-PW12；
步骤4，化合物CPT-W12的制备方法：将CPT-PW12溶于有机溶剂，在TFA:Thioanisole:H2O＝95％:2.5％:2.5％作用下生成CPT-W12。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，反应在-20℃至250℃下进行；其中，所述有机溶剂为含有1-20个碳原子的醚、醇、烷烃、芳香烃、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者其混合物；所述催化剂为4-二甲氨基吡啶(DMAP)；所述缩合剂为1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)；所用的脱保护剂为三氟乙酸(TFA)、钯碳(Pd/C)、氢氧化钯碳(Pd(OH)2/C)、哌啶(Piperidine)和四丁基氟化铵(TBAF)；此外，所用碱中，无机碱为碳酸钾。
6.如权利要求1、2任一所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗癌药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述癌症为乳腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌或胃癌。
8.药物组合物，其特征在于，所述组合物包含以治疗有效量存在的权利要求1和2化合物或其药学可接受的盐与至少一种药学可接受的赋形剂的混合物。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含至少一种常规抗癌药。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述抗癌药选自环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、阿霉素、依托泊苷、伊立替康、奥沙利铂、顺铂或健择。
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