WO2002071069A1

WO2002071069A1 - Procede d'analyse d'eprouvettes par une liaison specifique

Info

Publication number: WO2002071069A1
Application number: PCT/JP2002/001920
Authority: WO
Inventors: Yasushi Okumura
Original assignee: Asahi Food & Healthcare Ltd.
Priority date: 2001-03-07
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2002-09-12
Also published as: JP2002267670A

Description

明細書

特異的結合を利用する検体分析方法発明の背景

本発明は、特異的結合を伴う分析方法、特に免疫化学分析方法に関する。より具体的には、本発明は、使用者が即時に分析結果を判別することができ、分析に際して使用者の熟練ならびに手間や特別な操作を必要としない、特異的結合を伴う分析方法、特に免疫化学分析方法に関する。

免疫化学的分析方法のような特異結合分析方法において検出試薬を含浸させた多孔質キヤリアの様な試験片を使用することが報告されている。そのような方法は、例えば、特許第 2132903号、第 2705767号、第 2705768号、第 2919392号（いずれもュ二リーバ ·ナ一ムローゼ ·ベンノートシャープ社) に言己載されている。このような従来技術によれば、検出用試薬が装置内に乾燥状態で設置されており、そこへ液体の測定試料が到達することによって、初めて検出用試薬が可溶化され、その後試料中の検体と結合する。従って、測定対象となる試料は、尿や血液、あるいは試料を適当な緩衝液等に溶解した液体に限られていた。加えて、同時に一つの測定装置によつて複数の測定対象を分析する場合には、例えば前述の特許第 2919392号に記載されているように、複数の標識検出試薬をキヤリァの同一箇所に塗布する必要があり、その際、先に塗布した検出試薬が再溶解することを防ぐために各塗布工程の間で乾燥工程をいれるなど煩雑な操作が必要であつた。従って、より簡便に固体および液体試料を正確に分析できる方法が望まれていた。発明の開示

本発明は、熟練者でなくても簡便に使用でき、結果を正確に判断できる簡便な分析方法を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、ダニアレルゲンを、熟練者でなくても簡便かつ正確に検出 '分析できる方法を提供することを目的とする。

本発明の別の目的は、試料が固体試料および液体試料の何れであっても、それらの分析を同じ操作手順で行うことができ、かつ、複数の検体の分析を同時に行うことができる方法を提供することである。

本発明者らは、試料を可溶化および/または展開するための液体に予め試料中に予測される検体に対する特異結合試薬を含ませることによって、上記の課題を解決し得ることを見出し、本発明を為すに至った。

すなわち、本発明は、以下の工程を含む、特異的結合を伴う分析方法である： i ) 検出装置の一部を構成する多孔質キヤリァに検体を含むと思われる固体試料が適用される工程、

ii) 前記多孔質キャリアに適用された前記固体試料が、前記検体に特異的に結合する標識された第 1の検出試薬群を含む展開液で、前記検体が存在する場合には前記検体と前記標識された第 1の検出試薬群に属する少なくとも 1つの標識された第 1の検出試薬とが特異的結合をして複合体を形成する条件下で可溶ィ匕されるェ程、

i i i )前記複合体および/または前記複合体を形成しなかつた前記第 1の標識試薬群が前記検出装置の一部を構成する多孔質キヤリア中を移動し、または前記試料が適用された多孔質キヤリアに接続された、前記検出装置の一部を構成する他の多孔質キヤリァへ移動したのち、前記複合体が存在する場合は前記多孔質キヤリァまたは前記他の多孔質キヤリァに固定化された、前記検体に対して特異的結合をする第 2の検出試薬群に属する少なくとも 1つの第 2の検出試薬によって前記複合体が捕捉される工程、

iv)前記複合体の捕捉が前記標識された第 1の検出試薬群の標識に由来するシグナルによって確認された場合に、前記標識された第 1の検出試薬群に属する第 1の検出試薬の少なくとも 1つに対応する検体が試料中に存在していたと判断されるェ程、

を含む、特異結合分析方法である。

また、本発明は、

i ) 検出装置の一部を構成する多孔質キヤリァに検体を含む液体試料が適用される工程、

ii)前記前記液体試料が適用された前記多孔質キヤリァに、前記検体に特異的に結合する標識された第 1の検出試薬群を含む、前記試料とは別個に調製された展開液が、前記検体が存在する場合には前記検体と前記標識された第 1の検出試薬群に属する少なくとも 1つの検出試薬とが特異的結合をして複合体を形成する条件下で適用される工程、

iii) 前記複合体および/または前記複合体を形成しなかった前記第 1の標識試薬群が前記検出装置の一部を構成する多孔質キヤリア中を自由に移動し、または前記多孔質キヤリァに接続された、前記装置の一部を構成する他の多孔質キヤリァへ移動したのち、前記複合体が存在する場合は前記多孔質キヤリアまたは前記他の多孔質キヤリァに固定ィ匕された前記検体に対して特異的結合をする第 2の検出試薬群に属する少なくとも 1つの第 2の検出試薬によって前記複合体が捕捉される工程、

iv)前記複合体の捕捉が前記標識された第 1の検出試薬群の標識に由来するシグナルによって確認された場合に、前記標識された第 1の検出試薬群に属する第 1の検出試薬の少なくとも 1つに対応する検体が試料中に存在していたと判断する工程、を含む、特異結合分析方法である。

また、本発明は、更に、

v)前記検出部において、固定ィ匕された第 2の検出試薬群の位置に対して、下流に固定ィ匕された、第 1の検出試薬群に特異的に結合する第 3の検出試薬群によって、工程 iii)において検体と結合しなかった第 1の検出試薬群が捕捉される工程、 vi) 前記第 1の検出検出試薬群の標識に由来するシグナルによって、第 2の試薬群による前記複合体の捕捉、および、第 3の検出試薬群による前記複合体およびノまたは標識された第 1の検出試薬群の捕捉が確認された場合にのみ、試料中に前記標識された第 1の検出試薬群に属する少なくとも 1つの検出試薬に対応する検体が存在していたと判断される工程、

を含む、特異的結合分析方法でもある。

より具体的には、本発明は、検体に特異的に結合する標識された第 1の検出試薬が直接標識試薬である上記分析方法、なかでも、検体に特異的に結合する標識された第 1の検出試薬が検体に対する直接標識抗体（直接標識一次抗体）であり、第 2及び第 3の検出試薬がそれぞれ、検体に対する一次抗体、前記一次抗体に対する二次抗体である、免疫化学分析方法である。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の方法を実施するために適した装置の断面図である。

1 ：試料の適用部位/標識された第 1の検出試薬の反応部位、 2：余分な液体試料および検出試薬の液だめ、 3 ：装置カバー、 4 ：輸送ゾーン、 5 ：検体検出部位、 6 ：吸収ゾーン、 7 ：第 2の検出試薬固定化帯域 A (テストライン A)、 8 ：別の第 2の検出試薬固定化帯域 B (テストライン B )、 9 ：第 3の検出試薬固定化帯域、 1 0 ：測定窓

図 2は、本発明の方法を実施するために適した装置の平面図である。図に付した番号の意味は図 1に同じ。発明を実施するための最良の形態

本発明は、'検体と検出用試薬の特異的結合を利用した分析方法である。特に、本発明の方法は、免疫クロマトグラフィーの原理に基づいた、改良された検体分析方法であり、試料が液体試料であっても固体試料であっても使用可能な分析方法である。また、本発明は、同一の検出装置内で試料の適用から検体の検出までを行う場合に特に適した分析方法である。

本発明の方法においては、試料は検出装置の一部を構成する多孔質キヤリァ (試料受容部）に適用（塗布、滴下等）され、次にその検体に特異的に結合する標識された第 1の検出試薬を含む液体（展開液）が適用される。これによつて、固体試料であれば可溶化され、同時に、試料中に検体が存在すればその検体は標識された第 1の検出試薬と結合する。展開液の組成および適用の条件は、前述の試料受容部において検体と、検体に特異的に結合する標識された第 1の検出試薬とが特異的結合をし得るものであることが必要である。この場合、後に述べるように標識された第 1の検出試薬は予想される検体量に対して過剰量含まれていることが好ましい。

液体試料であれば可溶化は不要であるが、第 1の検出試薬と検体とが結合する条件で展開液が適用されれば、やはり特異的結合による複合体が形成される。ここで、本発明の方法においては、展開液は前記試料とは別個に調製される。本発明においては、このように展開液が試料とは別に調製されるため、液体試料はごく少量でもよく、また測定用試料の前処理などは不要である。

本発明においては、試料が固体試料であっても液体試料であっても実際の操作は全く同じであり、従って、本方法によれば同一の手順で分析を進めることができることが理解されるであろう。

なお、本明細書において、「検体」とは、検出対象とする 1以上の物質を意味し、「試料」とは、測定にかけるための材料をいう。従って、「試料」は「検体」を含むこともあれば、含まないこともあり、通常は固体夾雑物やその他の 1以上の非検出対象物質を含んでいる。

本発明においては、標識された第 1の検出試薬が展開液中に含まれているため、検体と標識された第 1の検出試薬群と結合が簡便な操作において短時間に確実に行われる。また、固体試料の場合は、可溶化と特異的結合が同時に行われるため特に簡便性の点で非常に有利である。更に、展開液中に複数の検出試窠を容易に含ませることもできるため、同時に複数の検体を検出しょうとする場合も展開液中の検出試薬の種類を増やすだけで足りるため、標識検出試薬の調製が容易である。ここで、標識された第 1の検出試薬は、展開液に含まれ、試料中に検体が含まれる場合にこれと結合し得る 1以上の試薬を言い、必ずしも 1種類であることを意味しない。従って、前述のように、展開液中に複数の「標識された第 1の検出試薬」が含まれていてもよい。特に、本明細書において 1以上の標識された第 1の検出試薬を総称して「標識された第 1の検出試薬群」ということもある。以下では、特に言及する場合を除いて、説明の簡匕のため第 1の検出試薬が 1種類であるかのように本発明を説明するが、 2以上存在する場合も同じ原理に基づき、同様な操作によって、本発明が同等の効果を奏することは当業者には明らかであろう。第 2、第 3の検出試薬についても同様である。

標識された第 1の検出試薬は、測定対象である検体と特異的な結合をし、標識が何らかの手段で検出可能であればどのような試薬も使用できる。例えば、検体に対する抗体が存在する場合は、それらの抗体を使用するのが特異性、操作性、感度および安全性の点で特に有利である。しかしながら、本発明の目的のためには、標識された第 1の検出試薬に由来するシグナル強度を簡便に測定しえることが好ましく、更に、そのシグナル強度が標識された第 1の検出試薬の量と正の相関関係にあることがより好ましい。従って、本発明に使用する標識としては、煩雑な追加の処理、例えば、ある種の化学反応による後処理を必要としない標識が使用され、それらの標識は安全かつ簡便に取り扱えるものである。このような観点から、標識としては、例えば、粒状直接標識または蛍光標識が好ましい。粒状直接標識としては、染料ゾルまたは金ゾルが好ましい。

例えば、抗体をこのような染料ゾルまたは金ゾルで標識する方法は当該技術分野で一般的に知られた方法によって調製することができる。簡単に言えば、以下のようにして調製することができる。まず、抗体と金コロイドを混合して、約 10% の BSAを加えた適当なバヅファー、例えばリン酸バッファ一 pH7.0~8.0、リン酸緩衝生理食塩水 PH7.0〜8.0または炭酸ノッファ一 pH7.0〜8.0中に懸濁し、室温にて 1〜 5分間程度ィンキュベ一シヨンする。次にこの懸濁液を冷却下で室温にて低速遠心（例えば 3000rap、 5〜10分間）により大きな粒子を除去し、続いて、室温にて高速遠心（例えば、 12000rmp、 10〜30分間）することにより標識抗体を回収することができる。得られた標識抗体は、後述するような展開液中に再懸濁し、使用時まで保存することができる。

このように調製した金コロイド標識抗体を標識された第 1の検出試薬として使用する場合、これらの標識抗体が検体と複合体を形成して第 2の検出試薬に捕捉されれば、その位置で金コロイドによる赤褐色のバンドとして複合体の捕捉、従つて、検体の検出を肉眼で直接確認することができる。

一方、蛍光標識を用いる場合は、蛍光物質としては、例えば、 3-ヒドロキシピコリン酸等を利用することができる。この物質は比較的安全な 365皿の紫外線により強い蛍光を発するので、簡便に検出することができる。このような蛍光物質で抗体を標識する方法も当業者にはよく知られたものである。

標識された第 1の検出試薬が 2以上存在する場合、標識は全て異なっていても、一部のみ異なっていても、全てが同一であってもよい。前述のテス卜ラインを検出対象の各検体について別個に設置すれば、標識は第 1の標識試薬群に属する全ての標識試薬について同一であってもよい。標識された第 1の検出試薬を含む展開液は、標識された第 1の検出試薬を安定に保存することができ、予想される検体を可溶化することができ、かつ、その予想される検体を分解しない液体であればどの様な液体でも使用できる。安全性、簡便性をも考慮すれば、一般には、中性付近のリン酸緩衝、例えば PH7.5のリン酸緩衝液 (50mM)、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、トリス塩酸緩衝液（50m )、ホウ酸緩衝液（50m )等が好ましく、少量の Tween20等の界面活性剤を含むことがより好ましい。標識された第 1の検出試薬として抗体を使用する場合は、多孔質キヤリァへの非特異的結合を防止するため、更に 1〜 5 %程度のブロッキング剤、例えばゥシ血清アルブミン（BSA) 、馬血清、カゼイン等を使用することが好ましい。本発明の一つの実施態様では、検出はダニアレルゲングループ 1および Zまたはダニアレルゲングループ 2である。この実施態様においては、標識された第 1の検出試薬として、例えば、金コロイドで標識した抗ダニアルレゲンモノクローナル抗体 2E1 (抗グループ 1抗体、和光純薬工業力夕口グ番号 303-04961 )または 13A4(抗グループ 2抗体、和光純薬工業カタログ番号 307- 04981)を使用することができる。第 2の検出試薬としては、例えば、抗グループ 1モノクローナル抗体 6G1 (和光純薬カタログ番号 300- 04971) または抗グループ 2モノクローナル抗体 15ΕΠ (和光純薬工業カタログ 304-04991) を使用することができる。検体と結合しなかった、第 1の検出試薬を捕捉するための第 3の検出試薬としては、抗マウス IgG抗体、例えば、和光純薬工業カタログ番号 565-70071、を用いることができる。

このような標識された第 1の検出試薬と検体との特異的反応によって生じた、検体—標識された第 1の検出試薬複合体は多孔質キヤリァ中を移動し、更にその多孔質キャリア上の検体検出部を構成する領域に、または、試料が適用された多孔質キヤリアとは異なるが、やはり同一の検出装置の一部であって検体検出部を構成する多孔質中へ移動する。検#¾出部分を構成する多孔質には、第 2の検出試薬が固定されて検出帯域（テストライン）を構成しており、この第 2の検出試薬は試料中に含まれるかもしれない体と特異的に結合することができる。ここで、第 2の検出試薬の検体への結合が、第 1の検出試薬が検体に結合することによって妨害されないように、第 1の検出試薬と第 2の検出試薬の組を選択する。

試料（および、存在する場合には検体）は多孔質キャリア中を展開液と共にこのテストラインを越えて移動する。この際、検体が存在すれば、テストラインによって捕捉される。従って、テストラインに捕捉された第 1の検出試薬の量は、元の試料中に含まれる検体量と正の相関をする。

ここで、「第 2の検出試薬」が必ずしも 1種類の検出試薬を意味しないのは、第 1の検出試薬の場合と同様である。従って、 1以上の第 2の検出試薬を総称して「第 2の検出試薬群」と呼ぶことがある。例えば、第 1の検出試薬が複数存在する場合は、それぞれの検出試薬が検出しょうとする検体に対して、それぞれの検体に特異的に結合する複数の第 2の検出試薬（これらは第 2の検出試薬群を構成する）をそれぞれ固定ィ匕した複数のテストラインを使用するのが好ましい。

更に、本発明の方法においては、検出部分を構成する多孔質キャリアに第 3の検出試薬を固定ィ匕して、対照帯域（コントロールラインとも称する）として利用してもよい。第 3の検出試薬は検体とは結合せず、標識された第 1の検出試薬と特異的に結合するものが選ばれる。第 3の検出試薬は単一でも複数でもよヽが、複数の第 3の検出試薬を使用する場合は、それぞれに対応して複数のコント口一ルラインを使用する。

展開液および展開液中に含まれる物質は前述のテス卜ランを越えて多孔質キヤリア中を移動し、コントロールラインに達し、更にこれを越えて移動することができる。この際、検体と結合しなかった標識された第 1の検出試薬がコントロールラインに捕捉される。したがって、コントロールラインにおける標識された第 1 の検出試薬の捕捉は、本発明の方法がその目的を果たしているか否かの指標として利用し得る。即ち、コントロールラインにおける標識された第 1の検出試薬の標識に由来するシグナル検出できない場合は、本発明の方法による分析が正常に機能しなかったことを意味する。試料中に検体が存在すれば、テストラインとコントロールラインの双方において標識された第 1の検出試薬が捕捉され、その標識に由来するシグナルが検出できるはずである。一方、コントロールラインのみにおいて標識された第 1の検出試薬に由来するシグナルが検出された場合は、試料中にその第 1の検出試薬に対応する検体が存在しなかったことを意味する。

また、本発明の方法において、検出対象の検:体の標準品が調製できる場合は、予め第 1の検出試薬の標識に由来するシグナル強度と検体量との関係を表す標準曲線を作成しておけば、試料中の検体量を定量することも可能である。例えば、標識として金コロイドによる直接標識を使用する場合は、各検体量に対応した色見本を作成しておけばよい。

本発明の方法を実施するために適した装置において、試料が適用される多孔質キャリアは、細孔さえ有していれば、いかなるものでも使用することができるが、

10 m〜100 zmの細孔を有することが好ましく、材質は焼結ポリエチレン等が好ましい。また、本発明の方法において、検体検出部を構成する多孔質キャリアは二トロセルロース膜、例えば気孔の大きさが 1〜 5 mの商業的に入手可能な二ト口セルロース膜を利用することができる。検体検出部が存在する多孔質キヤリァはどのような形状であつても本発明の方法が使用できるが、ストリヅプ、キヤビラリ状であることが好ましい。この場合、ストリップの幅、キヤビラリの太さは特に限定されない。

本発明を実施するために適した装置を参照して、本発明の方法を更に説明する。本発明の方法を実施するために適した装置を図 1および図 2に示した。図中 1で示す部分は試料が適用される部分であり、同時に、試料中に含まれるかもしれない検体と特異的に結合する第 1の検出試薬が反応する部位であり、かつ、検体および特異的に結合する第 1の検出試薬および/または第 1の検出試薬と検体との複合体が展開液と共に通過する部分である。この部分は、一般には 10 /n！〜 100 zmの細孔を有していることが好ましく、材質は焼結ポリエチレン等が好ましい。図中 2 で示した部分は液体試料あるいは余分な展開液の液だめである。図中 3は、装置全体を覆うカバ一であり、主として装置の取り扱いを容易とする役割を果たす。図中 4は、検体と第 1の検出試薬および/または両者の複合体を検^出部へ移動させるための輸送ゾーンである。輸送ゾーンの材質は水の浸透性があり、前述の複合体が容易に移動できる細孔を有するものであればいかなるものも使用できる図中 5は、検体検出部分を構成する多孔質キャリアである。本図では、 2種の検体を検出する場合の例を示してある。すなわち、図中、 7および 8は第 2の検出試薬が固定化された帯域（テストライン）である。図中 9は、第 3の検出試薬が固定ィ匕された帯域（コントロールライン）である。本図では、 1種類の第 3の検出試薬が使用されている。

使用の際には、受容部 1に固体または液体試料を適用し、次に、標識された第 1 の検出試薬を含む展開液を受容部 1に滴下する。余分の液体試料および展開液は液だめ 2に貯留され、周囲の汚染が回避される。検体、標識された第 1の検出試薬および/またはこれらの複合体を含む展開液が、輸送ゾーン 4、続いて延滞検出部 5へ移動し、テストライン 7、 8を越え、コントロールライン 9を越えて 6に至る。試料中に検体が存在すれば、テストライン 7および/または 8に標識された第 1の検出試薬に由来するシグナル、例えば、金コロイド標識抗体の場合は、金コロイドによる着色が観察される。同時に、試料中の検体の有無に関わりなく、コントロールライン 9にも標識された第 1の検出試薬に由来するシグナルが発生する。これらのシグナルはいずれも測定窓 1 0を通して確認することができる。以上の説明から、本発明の方法はこのような装置を使用して行えば容易に実施し得ることがよりょく理解されるであろうが、本発明は図に示した装置を使用する場合に限定されないことは言うまでもない。実施例

実施例 1 . 装置

本発明の方法による分析に適した装置を以下のように作製した。

プラスチヅク製外装ケースに焼結ポリエチレン製ピン（細孔径 10〃m、直径 4纖、長さ 7誦）を図中 1で示したように装着した。ピンの下部に密着するように（図中 4 ) Tween20で処理したポリプロピレン製パヅド（ミリポア社力夕口グ番号 QR6 1)を装着した。そのパヅドにポリエステルで裏打ちされたニトロセルロース（ミリポア社カタログ番号 SPHFP40)を挟み込む（図中 5 ) 。ニトロセルロース上に適当な間隔をあけて抗ダニァレルゲングループ 1モノクローナル抗体 6G1、抗ダニァレルゲングループ 2モノクロ一ナル抗体 15E11並びに抗マウス IgG抗体（それぞれ、和光純薬工業カタログ番号 300- 04971、同 304-04991、同 565-70071)を固定化した。固定化は以下のように行った。すなわち、各抗体を 1 %ショ糖を含有するリン酸緩衝液（pH7.4、 50mM)に lmg/mlとなるように溶解し、その溶液を 6〜7顏間隔でニトロセルロースストリヅプ上に細く（線幅約 0.5翻）塗布した。次に、このストリヅプを 35°Cで 1時間乾燥させた後に残りのストリヅプ部分を 10%ポリビニルアルコ一ル溶液でブロヅキングした。

さらに、ニトロセルロース片のもう一方の側（図中 6 ) に、余分の試料と第 1 の検出試薬を吸収するパヅドを密着させた。最後に図中 1 0で示す観察窓部分を透明のプラスチックフィルムで覆い本装置を完成させた。実施例 2 . 金コロイド標識抗体の作製

1 %塩化金酸および 1 %クェン酸ナトリゥムを 100mlの沸騰水にそれぞれ l ml、 1.5ml加え、約 5分間加熱後、 200IDM炭酸力リゥムで pH 7.6に調整した。 530nmの吸光度と 570nmの吸光度の比は 1.4前後であつた。調製した金コロイド溶液 lmlに抗ダ二アレルゲングループ 1モノクローナル抗体（和光純薬工業力夕口グ番号 303-04 961)を 10〃g加え、室温で 2分間インキュベーションし、続いて 10%BSAでプロヅキングした後、 25°Cにて 3000rpm、 5分間遠心分離して上清を回収した。上清を 2 5°Cで 1000rpm、 20分間遠心分離して沈殿を得た。沈殿を 2 %BSA含有 PBS (0.9%食塩含有 50mMリン酸緩衝液、 pH7.4) に懸濁し、使用時まで保存した。実施例 3 . 固体試料の分析

図中 1の部分にダニアレルゲンを含むと思われるハウスダストを適量のせた。次に、実施例 1の方法に従って金コロイド標識した、抗ダニアレルゲングループ 1 モノクロ一ナル抗体 2E1および抗ダニアレルゲング.ループ 2モノクローナル抗体 1 3A4をそれぞれ 4 gおよび 2〃g含む PBS溶液 0.15mlをハウスダストの上から図中 1に滴下した。約 1 0分後に、図中の 7および 8の位置（テストライン）に出現した着色帯の色の濃さを図中 9の位置（コントロールライン）の着色帯の色の濃さと比較してハウスダスト中に存在したダニアレルゲングループ 1およびダニァレルゲングル一プ 2の量を判定した。

ダニアレルゲン量は、ダニアレルゲン標準品（和光純薬工業株式会社カタログ番号 306- 05051および 303- 05061) を用いて発色させたときの色の濃さから判定表を作成し、テストラインの色の濃さを判定表と対比させて決定した。実施例 4 . 液体試料の分析

適当量のハウスダストから Tween20 (濃度 0.05%) を含む PBS (約 200〃1) で抽出を行い、液体試料を調製した。この液体試料 50 / 1を図中 1の部分にのせた。次に実施例 1で用いた金コロイド標識抗ダニアレルゲンモノクローナル抗体 2種を 0. 1ml滴下した。約 10分後に図中 7および 8に出現する色の濃さを図中 9の色の濃さと比較し、試料中に含まれていたダニアレルゲン量を判別した。本発明により、熟練者でなくても容易に分析操作を行うことができ、簡便かつ正確に結果を判断できるようになる。特に、近年問題となっているダニアレルゲンも家庭で簡便かつ正確に検出 ·分析することが可能となる。

また、本発明により、固体試料および液体試料の何れであってもそれらの分析を同じ手順で、同一構成の装置で行うことができ、かつ、同時に複数の検体の検出 ·分析も簡便かつ正確に行うことが可能となる。

4

Claims

請求の範囲

1 . i )検出装置の一部を構成する多孔質キャリアに検体を含むと思われる固体試料が適用される工程、

ii) 前記多孔質キャリアに適用された前記固体試料が、前記検体に特異的に結合する標識された第 1の検出試薬群を含む展開液で、前記検体が存在する場合には前記検体と前記標識された第 1の検出試薬群に属する少なくとも 1つの標識された第 1の検出試薬とが特異的結合をして複合体を形成する条件下で可溶化されるェ程、

iii)前記複合体および/または前記複合体を形成しなかった前記第 1の標識試薬群が前記検出装置の一部を構成する多孔質キヤリア中を移動し、または前記試料が適用された多孔質キヤリアに接続された、前記検出装置の一部を構成する他の多孔質キヤリアへ移動したのち、前記複合体が存在する場合は前記多孔質キヤリァまたは前記他の多孔質キヤリァに固定化された、前記検体に対して特異的結合をする第 2の検出試薬群に属する少なくとも 1つの第 2の検出試薬によって前記複合体が捕捉される工程、

iv)前記複合体の捕捉が前記標識された第 1の検出試桀群の標識に由来するシグナルによって確認された場合に、前記標識された第 1の検出試薬群に属する第 1の検出試薬の少なくとも 1つに対応する検体が試料中に存在していたと判断されるェ程、

を含む、特異結合分析方法。

2 . i ) 検出装置の一部を構成する多孔質キヤリァに検体を含む液体試料が適用される工程、

iii)前記複合体および Zまたは前記複合体を形成しなかつた前記第 1の標識試薬群が前記検出装置の一部を構成する多孔質キヤリア中を自由に移動し、または前記多孔質キヤリァに接続された、前記装置の一部を構成する他の多孔質キヤリァへ移動したのち、前記複合体が存在する場合は前記多孔質キヤリアまたは前記他の多孔質キヤリァに固定化された前記検体に対して特異的結合をする第 2の検出試薬群に属する少なくとも 1つの第 2の検出試薬によって前記複合体が捕捉される工程、

iv)前記複合体の捕捉が前記標識された第 1の検出試薬群の標識に由来するシグナルによって確認された場合に、前記標識された第 1の検出試薬群に属する第 1の検出試薬の少なくとも 1つに対応する検体が試料中に存在していたと判断する工程、を含む、特異結合分析方法。

3 . 更に、

v)前記検出部において、固定化された第 2の検出試薬群の位置に対して、下流に固定化された、第 1の検出試薬群に特異的に結合する第 3の検出試薬群によって、工程 iii)において検体と結合しなかった第 1の検出試薬群が捕捉される工程、 vi) 前記第 1の検出検出試薬群の標識に由来するシグナルによって、第 2の試薬群による前記複合体の捕捉、および、第 3の検出試薬群による前記複合体および /または標識された第 1の検出試薬群の捕捉が確認された場合にのみ、試料中に前記標識された第 1の検出試薬群に属する少なくとも 1つの検出試薬に対応する検体が存在していたと判断される工程、

を含む、請求項 1または 2に記載の分析方法。

4 . 第 2の検出試薬が固定化された多孔質キャリアが、ストリップまたはキヤビラリ内に充填された形状を有することを特徴とする、請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の分析方法。

5 . 第 1、第 2、第 3の検出試薬が抗体であることを特徴とする、請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の分析方法。

6 . 標識が染料ゾルまたは金ゾルであることを特徴とする、請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の分析方法。

7 . 標識が蛍光標識であることを特徴とする、請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の分析方法。

8 . 検体がアレルゲンであることを特徴とする、請求項 1〜7のいずれか 1項に記載の分析方法。