WO2002053736A1 - Methode d'examen de la capacite a controler la plasticite des cellules nerveuses - Google Patents

Methode d'examen de la capacite a controler la plasticite des cellules nerveuses Download PDF

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    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease

Definitions

  • the present invention relates to a method for assaying the ability to control transcriptional factor-dependent neuronal plasticity, and the like.
  • Cranial nerve function is based on neural circuits made by various types of nerve cells. This complex and accurate network is formed when nerve axons are accurately guided to target cells and synapse with the correct target cells.
  • axon guidance the control of nerve axon extension (promotion, suppression, attraction, repulsion, etc.) is naturally performed.
  • EphA receptor Yuichi and Rho which are tyrosine kinase-type cell membrane receptors that are thought to regulate plasticity of nerve cells.
  • Some specific proteins ie, Rho GTPase inhibitor
  • Rho GTPase inhibitor that regulate the expression of a marker-protein gene, such as a regulator called GDP dissociat ion inhibitor (or Rho GTPase inhibitor)
  • GDP dissociat ion inhibitor or Rho GTPase inhibitor
  • a method for testing the ability to control transcriptional factor-dependent neuronal plasticity having any of the following amino acid sequences (hereinafter, also referred to as the present amino acid sequence):
  • the expression level of the marker protein gene present on the transcription regulatory factor dependent-neuronal plasticization pathway in the transformed mammalian cell or an index value having a correlation with the expression level is calculated.
  • a search method characterized by selecting a substance having the same hereinafter, also referred to as the search method of the present invention
  • Neuronal plasticity regulator (hereinafter sometimes referred to as the neuronal plasticity regulator of the present invention);
  • a marker protein gene present on the transcriptional regulator-dependent one neuronal plasticization pathway having the present amino acid sequence in the cell can be obtained.
  • transcriptional regulator having any of the following amino acid sequences refers to a basic helix, loop'helix (basic helix) involved in neuronal plasticity. -loop-helix: hereinafter referred to as bHLH.
  • a protein having a motif and a PAS domain Per-Arnt-Sim homology domain, which binds to DNA by forming a heterodimer. It functions as a transcriptional regulator.
  • it may be referred to as the present transcription regulatory factor. Details will be described later.
  • a neural cell plasticity dependent on a transcriptional regulatory factor having any one of the following amino acid sequences means a transcriptional regulatory factor having the present amino acid sequence (ie, the present transcriptional factor).
  • (Regulator) is a neuronal plasticity that is thought to result from a series of cascade reactions that begin with this transcription factor.
  • this series of cascade reactions (that is, metabolic processes or signal transduction) is described as “the above-mentioned (that is, having the present amino acid sequence) transcription factor-dependent one neuronal plasticization pathway”
  • the proteins that can be used as a measure of plasticization of nerve cells in the present invention are described as “the above-mentioned (that is, having the present amino acid sequence) transcription factor-dependent A protein that exists on the target-neuron plasticization pathway.
  • Specific examples include EphA receptor, Rho GDP dissociation inhibitor (or Rho GTPase inhibitor), and the like.
  • Eph A receptor Yuichi is a tyrosine kinase type cell membrane receptor that is widely known to be involved in the development of the brain.
  • LTP long-term enhancement of synaptic transmission efficiency
  • behavioral observations indicate that Eph A has a positive effect on Eph A activity.
  • synaptic plasticity is critical for memory and memory information storage (ie, the basis of the mechanism), it is considered that activation of Eph A has an effect of promoting neuronal plasticity. Have been.
  • Rho is an intracellular signal transduction substance and is a protein that is widely known to be involved in the control of cell proliferation, regulation of cell adhesion formation, formation of actin cytoskeleton structure, and the like.
  • a regulatory factor inhibitory protein
  • Rho GDP dissociation inhibitor or Rho GTPase inhibitor
  • Rho GDP dissociation inhibitor is thought to regulate neuronal plasticity by controlling Rho GTPase activity.
  • the “transcriptional regulator having any of the following amino acid sequences (ie, the present amino acid sequence) (ie, the present transcriptional regulator)” used in the assay method of the present invention includes: (a) any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 (B) a protein having an amino acid sequence exhibiting 90% or more amino acid identity to the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, and having a transcription regulating ability; (C) encoded by a DNA consisting of the base sequence represented by base numbers 102 to 2507 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and a DNA hybridizing under stringent conditions (D) an amino acid sequence of a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 and having transcription regulation ability; (d) a DNA consisting of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 51 to 246 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5; Stringent Article (E) an amino acid sequence of a protein having an amino acid sequence encoded by DNA
  • the transcription regulatory factor includes a protein having the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 (that is, the present amino acid sequence) (wherein the protein having the present amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes:
  • the human transcription factor is also referred to as hNXF
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a mouse transcription factor, and hereinafter referred to as mNXF
  • the protein having the present amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is a rat transcription regulatory factor derived from rat, and may hereinafter be referred to as rNXF.
  • SEQ ID NOS: 1 to 3 An amino acid having 90% or more amino acid identity to the amino acid sequence represented by any of the above
  • a protein having an acid sequence and a transcriptional regulatory ability hybridizing under stringent conditions to a DNA comprising the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 102 to 2507 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:
  • the difference from the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 observed in the amino acid sequence of the present transcription regulatory factor includes mutations such as amino acid deletion, substitution, modification, and addition. These include mutations that can be introduced artificially by site-directed mutagenesis, mutagenesis, etc., as well as naturally occurring mutations such as differences in amino acid sequences due to differences in animal strains, individuals, organs, tissues, etc. Also includes polymorphic mutations.
  • amino acid identity refers to the homology and homology of amino acid sequences between two proteins.
  • the “amino acid identity” is determined by comparing two amino acid sequences that are optimally aligned over the entire region of the amino acid sequence to be compared.
  • the protein to be compared may have an addition or a deletion (for example, a gap or the like) in the optimal alignment of the two amino acid sequences.
  • Such amino acid identity can be calculated, for example, by making an alignment using the Vector NTI and the ClustalW algorithm (Nucleic Acid Res., 22 (22): 4673-4680 (1994)).
  • the amino acid identity can be measured using sequence analysis software, specifically, Vector NTL GENETYX-MAC or an analysis tool provided in a public database.
  • the amino acid identity in the present invention is preferably, for example, 90% or more.
  • Examples of the above-mentioned "DNA that hybridizes under stringent conditions" include, for example, under a high ion concentration [for example, 6XSSC (900 mM Sodium chloride, 90 mM sodium citrate) and the like are used. ] To form a DNA-DNA hybrid by hybridization under a temperature condition of 65. For example, 0.1 X SSC (15 mM sodium chloride, 1.5 mM sodium citrate) or the like is used under a low ion concentration. Examples of the DNA include a DNA that can maintain the hybrid even after washing at a temperature of 65 for 30 minutes.
  • the transcription regulatory ability of the present transcription regulatory factor can be evaluated, for example, on the basis of an assay using a reporter gene described below.
  • a gene having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the present transcriptional regulator (hereinafter referred to as the present transcriptional regulator gene) can be obtained, for example, from the tissues of animals such as humans, mice, and rats by the method described in J. Sambrook, EF Fr. sch, T. Mani at is; Genes described in, for example, Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (published by Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). It can be obtained according to engineering methods.
  • total RNA from tissues of animals such as humans, mice, and rats is prepared.
  • brain tissue is crushed in a solution containing a protein denaturing agent such as guanidine hydrochloride or guanidine thiosinate, and the protein is denatured by adding phenol, clonal form or the like to the crushed product.
  • a protein denaturing agent such as guanidine hydrochloride or guanidine thiosinate
  • total RNA is extracted from the collected supernatant fraction by a method such as guanidine hydrochloride phenol method, SDS-phenol method, guanidine thiocyanate ZCsCl method, or the like.
  • a commercially available kit based on these methods is, for example, IS0GEN (manufactured by Nippon Gene).
  • an oligo dT primer is annealed to the poly A sequence of the RNA, and a single-stranded cDNA is synthesized using reverse transcriptase.
  • the synthesized single-stranded cDNA is converted into type I, and the RNA obtained by inserting a nick and a gap into the RNA chain using E. coli RNaseH is used as a primer to obtain a double-stranded DNA using E. coli DNA polymerase I as a primer.
  • cDNA cDNA.
  • both ends of the synthesized double-stranded cDNA are Blunt with T4 DNA polymerase.
  • the double-stranded cDNA having blunt-ended ends is purified and recovered by a conventional method such as phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • kits based on these methods include, for example, cDNA Synthesis System Plus (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) and TimeSaver cDNA Synthesis Kit (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).
  • the obtained double-stranded cDNA is ligated to a vector such as plasmid PUC118 or phage AgtlO using a ligase to prepare a cDNA library.
  • a commercially available cDNA library (GI BCO—manufactured by BRL, CI ontech, etc.) can also be used as the cDNA library.
  • Genomic DNA is prepared according to the usual method described in Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), Masataka Muramatsu, "Rapo Manual Genetic Engineering” (Maruzen 1988), and the like.
  • BCL_Buffer [ ⁇ Tris-HCl (pH7.5) ), 5 iM MgCl 2 , 0.32 M Sucrose, 1 Triton X-100] 200 "1, add Proteinase K to a final concentration of 100 1 / ml, and SDS to a final concentration of 0.5 (w / v).
  • Genomic DNA can be obtained by incubating this mixture at 70 ° C for 1 hour and then extracting with phenolic-nanoform form. If the sample is peripheral blood, DNA-Extract Genomic DNA can be obtained by treating the sample with an ion kit (manufactured by Stratagene), etc. Genomic DNA can be obtained by ligating the obtained genomic DNA with a vector such as Agt 10 using a ligase.
  • a genomic DNA library is a commercially available genomic DNA library. It is also possible to use a library one (S tratagene Corp., etc.).
  • a partial base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, 5, 6, or 33 (or 34) or a partial base sequence thereof Oligonucleotides with complementary base sequences Or a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4, 5, 6, and 33 (or 34) or a partial base sequence of the base sequence.
  • the present transcription regulatory factor gene can be obtained by a hybridization method using the DNA as a probe.
  • the primer used in the PCR is, for example, an oligonucleotide having a length of about 10 bases to about 50 bases and having a nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 5, 6, or 33 (or 34).
  • Oligonucleotides having a complementary base sequence can be mentioned.
  • examples of the forward primer include an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • examples of the reverse primer include an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 9 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 10.
  • PCR conditions include, for example, a 10-fold concentrated buffer for LA-Taq polymerase (Takara Shuzo) 5 2.5 mM dNTP mixture (2.5 mM dATP, dGTP, dCTP and dTTP) 5 l (final concentration of each dATP, dGTP, dCTP and dTTP is 0.25 mM), 20 M primers each 0 • 25 to 1.25 U (final concentration is 0.1 to 0.5 3 ⁇ 40, ⁇ cDNA is 0.1 to 0.5 / xg, LA-Taq polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) In a reaction solution having a composition containing 1.25 units, conditions are as follows: one cycle of incubation at 95 ° C.
  • Examples of the probe used in the hybridization method include, for example, a DNA consisting of the base sequence represented by base numbers 102 to 2507 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, the base sequence represented by base numbers 51 to 5 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 DNA consisting of the base sequence represented by 2456, base number 35 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 DNA consisting of the nucleotide sequence represented by 244 0, comprising the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1419 to 6 164 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 33 DNA, or their DNA And the like having a partial base sequence of Hybridization conditions include, for example, 6XSSC (0.9M sodium chloride, 0.09M sodium citrate), 5X Denhardt solution (0.1 (w / v) Ficoll 400, 0.1 (w / v) polybierpyrrolidone, 0.1 (
  • the transcription factor gene may be prepared, for example, based on the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 4, 5, 6, and 33 (or 34), for example, by the phosphite-triester method (Hunkapiller.M. Et al. , Nature, 310, 105, 1984) and the like, and can be prepared by chemically synthesizing nucleic acids.
  • the transcription factor gene thus obtained is described in, for example, Sambrook, EFF risch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Pulling Barra Polari (Cold)
  • the vector can be cloned according to the genetic engineering method described in Spring Harbor Laboratory, 1989, etc. Specifically, for example, a commercially available plasmid vector such as a TA cloning kit (Invitrogen) or pBluescriptll (Stratagene) is used.
  • the nucleotide sequence of the transcription factor gene thus obtained can be determined by the Maxam Gilbert method (for example, described in Max am, AM & W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560, 1977, etc.) Sanger method (eg, Sanger, F. & ARCoulson, J. Mol. Biol., 94, 441, 1975, Sanger, F, & Nicklen and AR Coulson., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977 etc. Can be confirmed.
  • Maxam Gilbert method for example, described in Max am, AM & W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560, 1977, etc.
  • Sanger method eg, Sanger, F. & ARCoulson, J. Mol. Biol., 94, 441, 1975, Sanger, F, & Nicklen and AR Coulson., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
  • the transcription regulator gene examples include a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 102 to 2507 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 DNA having a base sequence represented by base numbers 51 to 2456, a base sequence represented by base numbers 35 to 2440 of a base sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: DNAs having the base sequence represented by base numbers 1419 to 6164 of the base sequence represented by 33 can be given.
  • the transcription factor gene is provided as a foreign gene to a mammalian cell so as to be located at a position where it is expressed in the cell, thereby regulating the transcription in a mammalian cell. It can also be used to promote the expression of the marker-protein gene present on the factor-dependent neuronal plasticity pathway.
  • the present transcription regulatory factor gene is a vector that can be used in a host cell into which the gene is introduced (hereinafter referred to as a “basic vector”). It can be isolated and purified from host cells, and can be constructed by integrating it into a vector having a detectable marker according to ordinary genetic engineering techniques. it can.
  • plasmid pUC119 manufactured by Takara Shuzo
  • phagemid pBluescript II Stratagene And others.
  • budding yeast is used as a host cell, plasmids pGBT9, pGAD424, pACT2 (manufactured by Clontech) and the like can be mentioned.
  • plasmids such as pRc / RSV and pRc / CMV (manufactured by Invitrogen), or sipapilloma virus plasmid pBPV (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) or EB virus Plasmid pCEM (manufactured by Invitrogen) and other vectors containing an autonomous replication origin derived from a virus, and viruses such as vaccinia virus can be used.
  • baculovirus is used. And other insect viruses.
  • a transfer vector containing the sequence can be used.
  • transfer vectors include pVLl392, pVL1393 (Smith, GE, Summers MD et al .: Mol. Cell. Biol., 3, 2156-2165) available from Pharmingen. (198 3)) and pSFB5 (Funahas i, S. et al .: J. Virol., 65, 5584-5588 (1991)).
  • the transcription factor gene When the transcription factor gene is inserted into the transfer vector as described above, and the transfer vector and the virus genome are simultaneously introduced into host cells, homologous recombination between the transfer vector and the virus genome occurs. Then, a virus in which the transcription factor gene is incorporated into the genome can be obtained.
  • the virus genome genomes of Baculovirus, Adenovirus, Vaccini avirus and the like can be used.
  • the present transcription regulatory factor gene when the present transcription regulatory factor gene is incorporated into a baculovirus, the present transcription regulatory factor gene is inserted into a multicloning site of a transfer vector such as pVL1393 or pVL1392, and then the transfer vector DM and Baculov
  • the irus genome MA (Baculogold; manufactured by Pharmingen) is introduced into the insect cell line Sf21 (available from the ATCC) by the calcium phosphate method or the like, and the obtained cells are cultured.
  • Viral particles containing the genome of the virus into which the transcription regulatory gene has been introduced are recovered from the culture solution by centrifugation or the like, and the protein is treated with phenol or the like to remove the protein particles.
  • the virus genome can be obtained.
  • the virus genome is introduced into host cells capable of forming virus particles, such as the insect cell strain Sf21, by the calcium phosphate method or the like, and the resulting cells are cultured to obtain a virus containing the transcription factor gene.
  • the transcription regulatory gene can be directly integrated into a relatively small genome such as mouse leukemia retrovirus without using a transfer vector.
  • the viral vector DC00 (El Gilboa et al., BioTechniques, 4, 504-512 (1986)) and the like incorporate the gene for transcription factor into the closing site on the vector.
  • the viral vector into which the transcription factor gene has been inserted is introduced into a packaging cell such as Afflpl i-GPE (J. Virol., 66, 3755 (1992)).
  • Afflpl i-GPE J. Virol., 66, 3755 (1992)
  • a promoter operable in a host cell is operably linked to the upstream of the transcription factor gene in a operable manner, and is inserted into the above-described basic vector, whereby the transcription factor gene is expressed in the host cell. It is possible to construct a transcription factor gene vector of the present invention capable of carrying out the method.
  • the term “functionally linked” means that the present transcription regulatory factor gene and the present transcription regulatory gene are expressed in a host cell into which the present transcription regulatory factor gene is introduced under the control of the promoter.
  • Regulator means to bind to a gene.
  • Examples of a promoter that can function in a host cell include DNA that exhibits promoter activity in the host cell into which it is introduced. For example, when the host cell is Escherichia coli, the E.
  • lacP lactose operon promoter
  • ti tryptophan operon promoter
  • argP arginine operon promoter
  • lacP galP galactose operon promoter
  • the tac promoter the T7 promoter, the ⁇ 3 promoter, the ⁇ phage promoter ( ⁇ -pL, ⁇ -pR) and the like.
  • examples include the rous sarcoma virus (RSV) promoter, the cytomegalovirus (CMV) promoter, the early or late promoter of the simian virus (SV40), the mouse papilloma virus (MMTV) promoter, and the like.
  • RSV rous sarcoma virus
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 simian virus
  • MMTV mouse papilloma virus
  • the ADH1 promoter When the host cell is a budding yeast, the ADH1 promoter (the ADH1 promoter is, for example, a yeast expression vector containing the ADH1 promoter and the terminator) pMH5 [available from Washington Research Fundation, Ammerer et al. , Method in Enzymology, 101 art (p. 192-201)] can be prepared by conventional genetic engineering methods.
  • the ADH1 promoter is described in US Patent Application No. 299,733 to the Washington Research Fundation. In the case of industrial or commercial use in the United States, a license from the right holder is required.).
  • the downstream of the promoter may be used so that the promoter having the vector and the present transcriptional regulator gene are operably linked.
  • the above-mentioned plasmids pRc / RSV, pRc / CMV, etc. have a cloning site downstream of a promoter operable in animal cells, and insert the present transcriptional regulator gene into the cloning site and introduce it into animal cells. Thereby, the present transcription regulatory factor gene can be expressed.
  • the above-mentioned yeast plasmid PACT2 has an ADH1 promoter, and if the present transcriptional regulator gene is inserted downstream of the ADH1 promoter of the plasmid or its derivative, the present transcriptional regulator gene can be replaced with, for example, CG1945 (Clontech Inc.).
  • This transcription regulator gene vector that can be expressed in large quantities in budding yeast such as S. cerevisiae can be constructed.
  • a transformant can be obtained by introducing the constructed transcription factor gene vector into a host cell.
  • a method for introducing the present transcription regulatory factor gene vector into a host cell a usual introduction method suitable for the host cell can be applied.
  • Escherichia coli when Escherichia coli is used as the host cell, it is possible to use J. Sambrook, EF Frisch, T. Mani at is; Molecular Cloning, 2nd edition (Molecular Cloning 2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory (Col d Conventional methods such as a calcium chloride method and an electro-volatilization method described in Spring Harbor Laboratory, 1989 and the like can be used.
  • the above-described method may be used according to a general gene transfer method such as a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, an electoral poration method, or a lipofection method. It can be introduced into cells.
  • yeast When yeast is used as the host cell, it can be introduced using, for example, Yeast transformat ion kit (Clontech) based on the lithium method.
  • the genome of the virus can be introduced into host cells by the general gene transfer method as described above, and virus particles containing the genome of the virus into which the present transcription regulatory factor gene has been inserted. To infect host cells By doing so, the genome of the virus can be introduced into host cells.
  • a marker gene may be introduced into a host cell at the same time as the present transcription regulatory factor gene vector, and the cells may be cultured by a method according to the properties of the marker gene. For example, when the marker gene is a gene that imparts drug resistance to a selected drug that exhibits lethal activity to the host cell, the host cell into which the transcription factor gene vector has been introduced using a medium containing the drug. Should be cultured.
  • Examples of the combination of the drug resistance imparting gene and the selected drug include a combination of a neomycin resistance imparting gene and neomycin, a combination of a hygromycin resistance imparting gene and hygromycin, a blasticidin S resistance imparting gene and a blasticidin Combinations with S can be given.
  • the marker gene is a gene that complements the auxotrophy of the host cell, the cells into which the present transcription regulatory factor gene vector has been introduced are cultured in a minimal medium that does not contain the nutrient. Good.
  • a transformant in which the transcription factor gene is introduced into the chromosome of a host cell for example, digestion of the transcription factor gene vector and a vector having a marker gene with a restriction enzyme or the like can be used. After linearization, these are introduced into host cells by the method described above, and the cells are usually cultured for several weeks, and the target transformant is selected and obtained using the expression of the introduced marker gene as an index. do it.
  • the present transcription regulatory factor gene vector having a gene conferring resistance to a selective drug as described above as a marker gene is introduced into a host cell by the method described above, and the cell is added to a medium containing the selective drug.
  • the genomic DNA of the cell is prepared according to a conventional genetic engineering method, and the prepared genomic DNA is prepared.
  • the method uses PCR, which uses an oligonucleotide having a partial nucleotide sequence of the introduced transcription factor gene as a primer, and Southern hybridization, which uses the introduced transcription factor gene as a probe. do it What is necessary is just to detect the presence of the present transcription regulatory factor gene.
  • Such a transformant can be frozen and stored, and can be awakened when necessary, so that it is not necessary to prepare the transformant for each experiment. The test can be carried out using the transformant confirmed as described above.
  • the present transcription regulatory factor can be produced by culturing the transformant obtained as described above.
  • the transformant when the above-mentioned transformant is a microorganism, the transformant is cultured using various media appropriately containing a carbon source, a nitrogen source, organic or inorganic salts, etc., which are used for ordinary culture in general microorganisms. can do. Culture is carried out according to the usual method for general microorganisms, and solid culture, liquid culture (rotating shaking culture, reciprocating shaking culture)
  • the culture temperature and the pH of the medium can be appropriately selected from the range in which the microorganism grows.For example, about 15 ° C to about 4 (at a culture temperature of TC, culture at a medium pH of about 6 to about 8).
  • the cultivation time varies depending on various culturing conditions, but is usually about 1 day to about 5 days Temperature-shift type ⁇ ⁇ ⁇ Expression with inducible promoter such as IPTG-inducible In the case of using a vector, the induction time is preferably within one day, usually several hours.
  • the transformant When the transformant is an animal cell such as a mammal or an insect, the transformant can be cultured using a medium used for ordinary culture of general cultured cells. When the transformant is prepared using a selective drug, it is preferable to culture the transformant in the presence of the selective drug.
  • a final concentration of 10% (w / v) and so as with the added DMEM medium (two Ssui Ltd., etc.) FBS 37, 5% C0 2 present a few days in conditions such as lower Culture while replacing with a new culture solution every time.
  • the culture temperature is 25 ° C using an insect cell culture medium such as Grace's medium containing 10% (V / v) FBS and 2% (w / v) Yeaslate. Culture at C to 35 ° C. At this time, Petri dishes such as Sf21 cells In the case of cells that are easily detached, subculture can be performed by dispersing by pipetting without using a trypsin solution.
  • the culturing time is preferably set to be before cell death due to the appearance of a cytoplasmic effect, for example, up to 72 hours after virus infection.
  • the transcription regulatory factor produced by the above-mentioned transformant can be collected by appropriately combining ordinary isolation and purification methods.For example, after completion of the culture, the transformant cells are centrifuged or the like. After the collected cells are suspended in a normal buffer, the cells are disrupted with a polytron, sonication, dounce homogenizer, etc., and the disrupted solution is centrifuged to collect the supernatant fraction, thereby regulating the transcription. A fraction containing the factor can be obtained. Further, by subjecting the supernatant fraction to various types of chromatography such as ion exchange, hydrophobicity, gel filtration, and affinity, it is possible to recover a more purified transcription factor.
  • various types of chromatography such as ion exchange, hydrophobicity, gel filtration, and affinity
  • the transcription regulatory factor or a polypeptide having a partial amino acid sequence thereof is produced as a fusion protein with GST
  • affinity chromatography using glutathione sepharose is also available. Can be purified.
  • the transcription factor thus produced can be used, for example, as an immunizing antigen for producing an antibody that recognizes the transcription factor or a polypeptide having a partial amino acid sequence thereof. It can also be used as an assay for screening substances that bind to regulatory factors.
  • an antibody that recognizes the transcription regulatory factor or a polypeptide having a partial amino acid sequence thereof can be prepared. Specifically, for example, first, the transcription factor to be used as an antigen is mixed with complete Freunds adj uvant to form an emulsion. The obtained emulsion is subcutaneously administered to a egret. Approximately 4 weeks later, the antigen is mixed with incomplete Freunds adj uvant and administered with the antigen.
  • serum fraction having an antibody titer recognizing the present transcriptional regulatory factor or a polypeptide having a partial amino acid sequence thereof is fractionated according to an ordinary ammonium sulfate precipitation method, etc.
  • An IgG that recognizes a regulatory factor or a polypeptide having a partial amino acid sequence thereof can be obtained.
  • the polypeptide having the transcription regulatory factor or a partial amino acid sequence thereof is recognized.
  • Antibodies can also be made.
  • the amino acid sequence of the polypeptide used as the immunizing antigen may be, for example, one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3, which is homologous to the amino acid sequence of another protein and has a low homology. Select an amino acid sequence that differs greatly from the amino acid sequence of the present transcriptional regulator of the animal species of interest.
  • a polypeptide consisting of the selected amino acid sequence and having a length of about 10 to 15 amino acids is chemically synthesized according to an ordinary method, and cross-linked with a carrier protein such as hemocyanin of Limulus plyhemus using MBS or the like. Immunize animals such as egrets in the same manner as above.
  • an antibody that recognizes the transcription regulatory factor or a polypeptide having a partial amino acid sequence thereof can be prepared.
  • the transcription factor A first step of bringing a test substance into contact with a mammalian cell that expresses a regulatory factor, (2) a marker present on the transcriptional regulatory factor-dependent neuronal plasticization pathway in the mammalian cell after the first step A second step of measuring the expression level of the protein gene or an index value having a correlation with the amount, and the test substance having the test substance based on the expression level measured in the second step or the index value having a correlation with the level.
  • An assay method having a step of evaluating the ability described above ie, the assay method of the present invention can be used.
  • the expression level of the marker protein gene or the index value having a correlation with the expression level in the group in which two or more different substances as test substances are independently used (first measurement amount, second measurement amount)
  • the amount is compared to determine the difference. So
  • the ability of the test substance to control the neuronal plasticity of the test substance is evaluated based on the obtained difference (difference between the first measured amount and the second measured amount) to test the ability. Based on the nerve cell plasticity control ability evaluated in this way, it can be confirmed that the substance has the nerve cell plasticity control ability.
  • the at least one of the two or more different substances is a substance having no neuronal plasticity control ability, so that the other test substance has the neuronal plasticity control ability of the other test substance.
  • the neuronal plasticity control ability of the other test substance may be evaluated based on the neuronal plasticity control ability of at least one of the two or more different substances.
  • the present regulatory regulator is a marker protein gene present on the transcription regulatory factor-dependent neural cell plasticization pathway, which is indispensable for testing the ability of the substance to control the present neural cell plasticity.
  • the present invention can be used for a method for effectively analyzing the expression level of an enzyme or an index value having a correlation with the level.
  • the mammalian cell used in the assay method of the present invention may be a cell isolated from a tissue, a cell forming a population having the same function and morphology, or a cell in a mammal. In some cases, the cell extraction system may be used.
  • the origin of the cells includes, for example, mammals, and more specifically, humans, salmon, magpies, magpies, mice, rats, hamsters, and the like.
  • the concentration of the test substance is contacted with mammalian cells expressing the present transcription regulatory factor, usually about 0. 1 i M to about l 0 0 M Bayoku, 1 ⁇ M to 50 tM is preferred.
  • the time for bringing the mammalian cell into contact with the test substance is usually about 10 minutes to about 2 days, preferably about several hours to about 1 day.
  • the environment in which the test substance is brought into contact with the mammalian cell is preferably an environment in which the living activity of the mammalian cell is maintained.
  • an environment in which the energy source of the mammalian cell coexists is mentioned.
  • the first step is performed in a medium.
  • the first step of the assay method of the present invention comprises, for example, a transformed mammalian cell obtained by introducing a gene having a nucleotide sequence encoding the present amino acid sequence into a mammalian cell (hereinafter referred to as the transformed mammalian cell).
  • a method of contacting the test substance may be used.
  • the concentration of the test substance to be brought into contact with the transformed mammalian cell may be usually about 0.1 M to about 100 M, and preferably 1 M to 50 M.
  • the time for contacting the present transformed mammalian cells with the test substance is usually 10 minutes or more and 2 days.
  • the above-mentioned transformed mammalian cells can be prepared as follows.
  • the transcription factor gene is inserted into a vector that can be used in mammalian cells into which the transcription factor gene is to be introduced, using a conventional genetic engineering technique so that it can be expressed and connected to the motor. To produce a plasmid.
  • the promoter used here may be any promoter that can function in the mammalian cell into which the present transcriptional regulator gene is introduced.
  • SV40 virus promoter site megalovirus promoter (CMV promoter), Raus Sarcoma Virus promoter (RSV promoter), ⁇ 8 actin gene promoter and the like.
  • CMV promoter site megalovirus promoter
  • RSV promoter Raus Sarcoma Virus promoter
  • ⁇ 8 actin gene promoter ⁇ 8 actin gene promoter and the like.
  • a commercially-available vector containing such a promoter all at once upstream of the multiple cloning site may be used.
  • the plasmid is introduced into mammalian cells.
  • the method of introduction into mammalian cells include the calcium phosphate method, the electrotransfer method, the DEAE dextran method, and the micelle formation method. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10923-10927, etc. as the calcium phosphate method, and Ting, AT et al., As the electrophoresis method and the DEAE dextran method. EMBO J., 15, 6189-6196, etc., and as a micelle formation method, a method described in Hawkins, CJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13786-13790, etc. Can be listed.
  • the micelle formation method When the micelle formation method is used, commercially available reagents such as lipofectamine (manufactured by Gibco) and Fugene (manufactured by Boehringer) may be used.
  • the mammalian cells into which the plasmid has been introduced can be selected, for example, by using a selection marker gene previously contained in the vector,
  • the transformed mammalian cells can be selected by culturing the cells in a culture medium under extraction conditions. Further, the selection may be continued to obtain a transformed mammalian cell that has become a stable transformant in which the present transcription regulatory factor gene has been introduced into a chromosome.
  • Genomic DNA can be obtained by methods such as PCR using DNA having the partial base sequence of the factor gene as a primer, or Southern hybridization using DNA having the partial base sequence of the transcription regulatory factor gene as a probe. What is necessary is just to detect and confirm the presence of the present transcription regulatory factor gene.
  • the transformed mammalian cell may be prepared from a transformed non-human animal described later according to a usual method.
  • a method for measuring the expression level of a marker protein gene present on the present transcription regulatory factor-dependent neuronal plasticization pathway or an index value having a correlation with the expression level includes, for example,
  • the amount of the marker protein can be determined by a radioimmunoassay (RIA) method using an antibody that specifically recognizes the marker protein, an enzyme-labeled antibody assay (Enzyme Linked Immunosorbent Assay; ELISA), Method of measuring by Western blotting, etc.
  • RIA radioimmunoassay
  • enzyme-labeled antibody assay Enzyme Linked Immunosorbent Assay
  • the expression level of the marker protein is measured using a DNA array or a DNA chip on which an oligonucleotide for measuring the amount of mRNA of the marker protein has been hybridized with the marker protein. Method, etc.
  • At least one of the substances does not have the neural cell plasticity controlling ability (for example, even if it is a test solution such as a solvent or a pack-type solution).
  • the neuronal plasticity control ability of the other test substance may be evaluated based on the control ability.
  • the expression level of the marker protein in the present transcriptional regulatory factor or an index value having a correlation with the amount (hereinafter referred to as a measured value 1) is determined by feeding the transcriptional regulatory factor and the test substance after the test substance is not contacted.
  • the ability of the test substance to control the neural cell plasticity of the present test substance can be measured. May be evaluated.
  • the neural cell plasticity control ability may be obtained as a control rate according to the following formula using the measured values.
  • Control ratio (%) [(measured value 1-measured value 2) Z measured value 2] X 100
  • a substance having the present neural cell plasticity controlling ability may be selected based on the present neural cell plasticity controlling ability evaluated by the assay method of the present invention. Invention search method).
  • a substance showing an absolute value of a control rate indicating a neuronal plasticity control ability of a test substance in a gunometrically significant value more preferably, for example, a substance showing 30% or more, more preferably Selects a substance showing 50% or more as a substance having the ability to control neuronal plasticity.
  • the control rate is positive, the substance is selected as a substance having an accelerating ability, while if negative, it is selected as a substance having an inhibitory ability. Is pulled out.
  • the substance may be any substance such as a low molecular weight compound, a protein (including an antibody) or a peptide, as long as the substance has the ability to control neuronal plasticity.
  • the substance selected by the search method of the present invention has the ability of controlling neuronal plasticity, and is effective as a neuronal plasticity regulator (for example, a therapeutic agent such as an agent for improving cognitive dysfunction and an agent for improving mental retardation). It may be used as a component.
  • a neuronal plasticity regulator for example, a therapeutic agent such as an agent for improving cognitive dysfunction and an agent for improving mental retardation. It may be used as a component.
  • a neuronal plasticity regulator containing a substance selected by the search method of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient (namely, the neuronal plasticity regulator of the present invention) has an effective amount of orally or non-orally. It can be orally administered to mammals such as humans.
  • the neuronal plasticity-modulating agent of the present invention can be used in usual forms such as tablets, capsules, syrups, suspensions and the like.
  • the neuronal plasticity regulator of the present invention can be used in the form of ordinary liquids such as solutions, emulsions and suspensions.
  • Examples of the method for parenterally administering the neuronal plasticity-modulating agent of the present invention in the form described above include an injection method and a method for administering the rectum in the form of a suppository.
  • the above-mentioned appropriate dosage form is prepared by mixing a substance selected by the search method of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof with an acceptable usual carrier, a carrier, a binder, a binder, a stabilizer, a diluent and the like. Can be manufactured. When used in the form of an injection, an acceptable buffer, solubilizing agent, isotonic agent and the like can be added.
  • the dosage varies depending on the age, sex, weight, degree of disease, type of inhibitor of arteriosclerosis exacerbating factors, dosage form, etc., of the mammal to be administered.
  • the above-mentioned daily dose can be administered once or in several divided doses.
  • the diseases to which the neuronal plasticity regulator of the present invention can be applied include diseases such as cognitive dysfunction due to the elderly, mental retardation, and cognitive dysfunction due to Alzheimer's disease.
  • the present invention provides a mammalian cell with the present transcription regulatory factor gene as a foreign gene so as to be located at a position where it is expressed in the mammalian cell.
  • the present invention also provides a method for promoting the expression of a marker one protein gene present on a target neuron plasticization pathway.
  • mammalian cells examples include cells derived from mammals such as human, monkey, mouse, rat, and hamster.
  • the cells may be cells isolated from a tissue, cells forming a population having the same function and morphology, or cells in the body of the mammal.
  • the mammal when the mammal is a human, it means from a human to which gene therapy has been generally applied to a cell line used for various experiments, and when the mammal is a non-human animal.
  • the term refers to non-human animals to which gene therapy has been generally applied to model animals and strain cells used in various experiments. In the latter case, rats, mice and the like can be mentioned as preferred animal species.
  • the mammalian cell is a cell in the body of a mammal that can be diagnosed as suffering from a disease accompanied by mental retardation or Alzheimer's disease.
  • the method for preparing the transcription factor gene may be prepared according to a method equivalent to that described above.
  • located at the position to be expressed means that the DNA molecule directs the transcription and translation of its nucleotide sequence (that is, for example, it promotes the production of the present transcriptional regulator or its RNA molecule). A) It means that it is located adjacent to the DNA sequence.
  • the expression level of the present transcription regulatory factor gene may be an amount sufficient to promote the expression of the marker-protein gene compared to cells into which the present transcription regulatory factor gene has not been introduced.
  • the transcription factor gene Alternatively, it may be a DNA encoding a part thereof.
  • the marker protein gene may be promoted by preparing a transformed cell in which the present transcription regulatory factor gene has been integrated into the genome.
  • the gene construct used for introducing the transcription factor gene into mammalian cells (hereinafter, also referred to as the gene construct in some cases) and the gene transfer means are as follows. It is preferable to use a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector or another virus vector having an affinity for the mammalian cell to be introduced. See, e.g., Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244: 1275-1281, 1989; Edlitis and Anderson, BioTechniques 6: 608-614.
  • SV40 virus promoter cytomegalovirus promoter overnight (CMV promoter one), Raus Sarcoma Virus promoter one (RSV promoter one), i3 actin gene promoter, aP Two gene promoters are listed.
  • CMV promoter one cytomegalovirus promoter overnight
  • RSV promoter one Raus Sarcoma Virus promoter one
  • i3 actin gene promoter aP Two gene promoters are listed.
  • a commercially available vector containing such a promoter upstream of the multiple cloning site may be used.
  • the DNA may be under the control of a promoter that constitutively expresses the transcription factor gene.
  • the DNA is May be placed under the control of a promoter that regulates the expression of the gene by environmental stimulation.
  • the DNA may be expressed using a tissue-specific or cell-type-specific promoter, or a promoter activated by the introduction of a chemical signal or an exogenous signal such as a drug or a drug.
  • Non-viral approaches can also be used.
  • the present gene construct is preferably applied to a site where underexpression of the marker protein gene is expected (for example, by injection). It may be applied to a tissue in the vicinity of a site where a phenomenon such as underexpression of the marker protein is expected or a blood vessel supplied to a cell where the underexpression of the marker protein gene is expected to occur.
  • expression of the present transcriptional regulator gene can be driven by any suitable promoter (eg, human cytomegalovirus (CMV), simian virus 40 (SV40), or metamouth thionein).
  • CMV human cytomegalovirus
  • SV40 simian virus 40
  • metamouth thionein can also be regulated by any suitable mammalian regulatory element.
  • an enhancer known to preferentially direct the expression of DNA in nerve cells may be used. Including, without limitation, those whose expression is characterized to be tissue or cell specific.
  • a clone of the transcription factor gene (genome) is used as a gene construct (for example, the transcription factor gene (genome) isolated by hybridization with the transcription factor gene (cDNA) described above).
  • the above-mentioned invention When the above-mentioned invention is applied as a means of gene therapy, it is carried out by direct administration of the present transcription regulatory factor gene into cells.
  • the gene to be used may be prepared and isolated by any standard technique, but use the present transcription regulatory gene under the control of a high-efficiency promoter (for example, human cytomegalovirus promoter). It can be most easily produced by in vivo transcription.
  • the administration of the transcription factor gene into cells can be performed by any of the above-described methods for direct nucleic acid administration.
  • the invention described above can also be applied as a means of gene therapy in which normal genes are transferred to diseased cells of a patient.
  • a normal transcription factor gene is transfected into culturable cells that are either exogenous or endogenous to the patient.
  • the transfected cells are then serologically injected into the target tissue.
  • the production of the transcription factor by any gene therapy technique would reduce the intracellular level of the transcription factor gene to at least equal the normal level of the transcription factor in unaffected cells. Bring.
  • Examples of a method for introducing the present transcription regulatory factor gene in producing a transgenic mouse include a microinjection method, a method using a retrovirus, and a method using embryonic undifferentiated cells (ES cells). Of these, the microinjection method is most commonly used.
  • the microinjection method is a method of injecting a solution containing the DNA into the pronucleus of a fertilized egg under a microscope using a micromanipulator.
  • the transcription factor gene is injected into a fertilized egg.
  • the vector region used for isolation of the DNA is available. It is preferable to remove as much as possible, to remove the AU-rich region that contributes to mRNA instability, and to make it linear. It is preferable to insert an intron into the DNA in advance, and examples of the intron include i3_globin intron.
  • Fertilized eggs are collected from mice of the strain appropriate for the purpose. Inbred C57BLZ6 or C3H mice, or hybrids of C57BL / 6 mice with other strains of mice (eg, (C57BL / 6XDBAZ2) F1 etc.), outbred ICR mice Us. Fertilized eggs are usually collected from the female mice after mating a female mouse and a male mouse that have induced superovulation by intraperitoneal administration of both pregnant horse serum gonadotropin and human chorionic gonadotropin. The collected fertilized eggs can be stored in a culture drop and cultured and maintained in a C ⁇ 2 gas incubator until the DNA is injected.
  • the DNA should be injected under an inverted microscope with a micromanipulator set every night. Fertilized eggs to be used should be those that are in the developmental stage from the time when the male pronucleus becomes larger than the female pronucleus until the two pronuclei fuse.
  • a fertilized egg is fixed, and a DNA solution containing the DNA is injected into the male pronucleus of the fertilized egg.
  • the DNA solution is prepared as a complex if necessary. Examples of the substance used for complex formation include ribosome, calcium phosphate, retrovirus and the like.
  • the injection of the DNA solution can be confirmed by the expansion of the male pronucleus. Examples of the DNA injection amount include an amount containing about 200 to about 3,000 copies of the DNA.
  • the fertilized egg into which the transcription factor gene has been injected is cultured in the same manner as described above until it becomes a blastocyst, and then transplanted into the uterus of a foster parent.
  • the DNA is implanted in the oviduct of the foster mother immediately after the injection operation of the DNA.
  • a foster parent a female mouse that has been mated with a male mouse that has undergone a vasectomy procedure to be in a pseudopregnant state may be used.
  • the skin and muscle layer near the kidney on the dorsal side of the female mouse are incised, the ovaries, fallopian tubes, and uterus are pulled out, and the ovarian membrane is broken to find the fallopian tubes.
  • the fertilized eggs that survived the DNA injection procedure were then transferred from the fallopian tubes, and the ovaries, fallopian tubes, and uterus were placed intraperitoneally.
  • the muscle layer is sutured and the skin is clipped.
  • a pup is born about 20 days later.
  • a part of the body tissue of the obtained pup, for example, a part of the tail is cut out, and the presence or absence of the DNA is confirmed by Southern blotting of the DNA extracted from the site.
  • a confirmation method such as a PCR.
  • the present transcriptional regulator gene which is an active ingredient of the present transcriptional regulator gene therapeutic agent, may be prepared as described above, and may be, for example, in the form of a recombinant vector or recombinant virus containing the DNA. Sometimes used. In such a form, for example, a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated vector, a simple herpes virus vector, an SV40 vector, a poliovirus virus vector, a papilloma virus vector, a picornavirus vector And viral vectors such as vaccinia virus vector.
  • the transcription factor gene is incorporated into the multiple cloning site of Tran sfer Vector using, for example, Ad Easy Kit manufactured by QUANTUM, and the resulting recombinant vector is obtained. After linearization of the gene, the transformant is transformed into E. coli together with pAdEasyvector, and the homologous recombinant DNA is incorporated into human 293A cells to produce a recombinant virus containing the transcription factor gene. Can also be used.
  • Non-viral vectors such as plasmid DNA having a promoter region of human cytomegavirus can also be used.
  • the use of plasmid DNA is extremely useful in systems that deliver this transcription factor gene locally using a non-viral vector, such as when the transcription factor gene is directly injected into fibrotic tissue sites. It is. Any known method of introduction can be used if the expression vector is introduced into cells taken out of the body and returned into the body, that is, the ex vivo method is used.
  • Non-viral vectors can be introduced by rotoplast fusion, f) microinjection, and g) polylysine-based transformation.
  • an effective amount of the present transcription regulatory factor gene therapeutic agent can be parenterally administered to mammals such as humans.
  • parenteral administration methods include the above-mentioned injections (subcutaneous, intravenous, etc.).
  • the above-mentioned suitable dosage form is pharmaceutically acceptable.
  • the present transcriptional regulator gene vector
  • auxiliary agents such as preservatives, suspending agents and emulsifying agents may be added.
  • this transcriptional regulatory factor is intracellular in patient cells.
  • the amount of the active ingredient that produces an intracellular level of the present transcriptional regulatory factor may be administered, which is equal to the concentration level that works effectively in the above.
  • the above-mentioned daily dose can be administered once or in several divided doses.
  • Example 1 (Preparation of pGEM-mMF, a vector containing the transcription factor gene)
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequences represented by 7 agcacggag gaggaagccg ccggtgcgtc gggac) and 8 (ggagagcggc tccacgtc tt gatgacaata tgcca) was synthesized using a DNA synthesizer (Model 394, manufactured by Applied Biosystems). PCR was carried out as type I using 10 ng of a mouse Brain cDM library (# 10655-017 Gibco BRL) as type I and using the polynucleotide as a primer. A kit containing LA-Taq polymerase (Takara Shuzo) and the enzyme The buffer attached to was used. Incubation of the PCR reaction solution was performed in 35 cycles using a PCR system 9700 (manufactured by Applied Biosystems) with 95 1 minute followed by 68 ° C. for 3 minutes as one cycle.
  • a plasmid for expressing the full length of the present transcriptional regulatory factor in mammalian cells (hereinafter, also referred to as the present expression plasmid) was prepared as follows.
  • Example 1 the orientation of the inserted fragment with respect to the pGEM-mNXF multicloning site obtained in Example 1 was constructed such that the Sp6 promoter of a commercially available pGEM vector was located upstream of the initiation codon. Therefore, this pGEM-mNXF (l ⁇ ) was made into type III, and the oligonucleotides represented by SEQ ID NOS: 11 and 12 were used as primers (primer pair: forward framer 5 -gggcgc tgcagcccagccatgt accgat cca ccaaggg-3 ').
  • the start codon of the transcription regulatory factor gene can be determined.
  • the Kozak sequence 5'-CCAGCCACC-3 '
  • the PCR conditions were 35 cycles, each cycle consisting of 95 1 minute, 55 ° C 30 seconds, and 72 ° C 1 minute.
  • the amplified DNA fragment thus obtained was digested with Pstl and BssHII, and then purified and recovered by subjecting it to low melting point agarose gel electrophoresis (NusieveGTG agarose; manufactured by FMCbio). The purified and recovered DNA fragment was used as the insert fragment used below.
  • pGEM-mNXF as a vector was digested with Pstl and BssHII and then treated with BAP. The resulting fragment was subjected to low-melting point agarose gel electrophoresis (AgaroseL; manufactured by Futatsu Gene) to recover a DNA fragment.
  • the above DNA fragment (0.1 g) was ligated to the above insert fragment (0.5 / zg) with T4 Ligase to obtain a Kozak sequence (5'-CCAGCCACC-3 ') immediately before the initiation codon of the mouse-derived protein gene. PGEM-iiiMF Kozak, into which was introduced.
  • the correct nucleotide sequence of the insert fragment was confirmed using a DNA sequencer (model 3700; manufactured by PE biosystems).
  • the pGEM-mNXF Kozak was simultaneously digested with Pstl, Notl, and Seal, and then subjected to low-melting point agarose electrophoresis, whereby a DNA fragment of about 2.5 kbp mMF Kozak Pstl-Notl was obtained. Collected. The recovered DNA fragment was blunt-ended using ⁇ 4 polymerase to obtain an insert fragment.
  • the pRC / RSV manufactured by Invitorgen holding the RSV promoter overnight was cut with Hindi II, blunt-ended with T4 polymerase, treated with BAP, and used as a vector.
  • Example 2 10 g of the expression plasmid ((a) pRC / RSV-mNXFsense, or (b) pRC / RSV-mNXFantisense) prepared in Example 2 was mixed with 0.4 ml of the cell dispersion, and the mixture was added. The sample was transferred to a cuvette for electroporation, and subjected to transfer extrusion under the conditions of 200 V and 950 by an election port method using Gene Pulser (manufactured by BI0RAD). After the transfection, the medium was replaced with a DMEM medium containing 10% FBS, and the cells were further cultured in a 10 cm dish for about 24 hours.
  • RNA yield was 23 g when using the plasmid (a) (ie, RC / RSV-mNXFsense) and 26 g when using the plasmid (b) (ie, pRC / RSV_mNXFantisense). Atsuko with g.
  • RNA obtained as described above commercial kit materials, the ⁇ -Kit by specific primers and reverse transcriptase contained in the preparative Non -P 32] respectively -dATP (Cane Yamufuarumashia Co.) RNA was radioactively labeled.
  • the radiolabeled RNA hereinafter, referred to as a probe
  • the amount of the purified RNA is adjusted to 1.3 ⁇ 10 s DPM, and the following amount is prepared. Used for the hybridization reaction.
  • the hybridization reaction was performed using a commercially available kit (AUas cDNA Express on Array- Neurobiology; 7736-1 Clontech) in which various genes were plotted on a nylon membrane, and an attached hybridization buffer. was done.
  • the conditions for the hybridization reaction are as follows:
  • the hybridization signal (a) corresponding to the probe derived from the pRC / RSV-mM Fsense-introduced cell to the EphAl gene was compared with the probe derived from the RC / RSV_mNXFantisense-transduced cell (b).
  • the signal was significantly stronger than the hybridization signal on the corresponding nylon membrane.
  • the present transcription regulator has the ability to promote the expression of EphAl.
  • SK-N-MC cells ATCC ⁇ . ⁇ ; purchased from Dainippon Pharmaceutical
  • DMEM medium Nasui Pharmaceutical
  • FBS fetal bovine serum
  • C_ ⁇ 2 5% C_ ⁇ 2
  • dish manufactured by Falcon
  • the cultured cells were dispersed by trypsin treatment, washed twice with a DMEM medium containing no FBS, and then dispersed again in a DMEM medium containing no FBS so as to have a cell density of 1 ⁇ 10 7 .
  • Example 2 After mixing 0.4 g of the cell dispersion and 10 g of the expression plasmid ((a) pRC / RSV-mNXF sense, or (b) pRC / RSV-mNXFanti sense) prepared in Example 2, The mixture was transferred to an election port cuvette for electroporation, and transfection was performed at 200 V and 950 tF by an electon porting method using Gene Pulser (manufactured by BI0RAD). After the transfection, the medium was replaced with a DMEM medium containing 10% FBS, and the cells were further cultured in a 10 cm dish for about 24 hours.
  • RNA-free total RNA was purified using K1038-1 (manufactured by Clontech).
  • the RNA yield was 23 g when using the plasmid (a) (ie, pRC / RSV-mMFsense), and using the plasmid (b) (ie, pRC / RSV-mM Fant ⁇ sense). In that case, it was 26 g.
  • the commercially available kits obtained by the RNA in the material and, by a specific primer and reverse transcriptase contained in the above SL commercial kits [ ⁇ -P 32] -dATP
  • RNA radiation labeled RNA
  • the probe radiation labeled RNA
  • the amount to prepare the purified RNA to be 1.3xl0 5 DPM follows Haiburidize Used for one reaction.
  • the hybridization reaction is carried out using a commercially available kit (Atlas cDNA Expression array-Neurobiology; 7736-1 Clontech) in which various genes are plotted on a nylon membrane, and an attached hybridization buffer.
  • the conditions for the hybridization reaction were as follows: (a) Nippon membrane corresponding to the probe derived from pRC / RSV-mNXFsense-transfected cells, and (b) Niron membrane corresponding to the probe derived from pRC / RSV-mNXFantisense-transduced cells.
  • the reaction was performed for 18 hours under the exact same conditions in the same incubator. After the reaction, the nylon membrane was washed with 2XSS 1% SDS buffer (68 ° C, 30 minutes). After repeating this procedure four times, the membrane was further washed with 0.1XSS (;, 0.5% SDS buffer (68 ° C, 30 minutes).
  • the pRC / RSV- mMFsense introduced cells prepared in Example 2, in 5% C0 2 presence at 37 ° C using a D MEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical) containing 10% FBS, a diameter of about 10 cm Using a Petri dish (Falcon). The next day, the cultured cells are dispersed by trypsin treatment, washed twice with DMEM medium without FBS, and then dispersed again in DMEM medium.
  • D MEM medium manufactured by Nissui Pharmaceutical
  • the dispersed cells were added to a 6-well plate to which (a) a culture solution to which only DMS0 was added, or (b) a culture solution to which test substances dissolved at various concentrations in DMS0 were added. And seed them at a rate of 10 6 nowells. After culturing the cells in this plate at 37 ° C for about 24 hours, remove the culture solution from the plate, wash the cells with PBS (-), and use Isogen (manufactured by Nippon Gene) to collect the total RNA Using the total RNA extracted in this way as a material, oligodT
  • the PCR conditions were 95 ° C, 1 minute, and 68 ° (30 cycles with 1 minute as one cycle. In this way, the amount of EphA1 mRNA present in the total RNA was calculated.
  • the amount of EpA1 mRNA in total RNA extracted from cells cultured using culture medium supplemented with DMS0 alone and extracted from cells cultured using culture medium supplemented with various test substances The ability of the test substance to control this transcriptional regulator-dependent neural cell plasticity is assayed and evaluated by comparing the amount of EphA1 mRNA in the RNA obtained.
  • the desired substance is selected based on this.
  • PCR is performed using a combination of the following forward primer (SEQ ID NOS: 23 to 27) and the following reverse primer (SEQ ID NOs: 28 to 32).
  • the present invention it has become possible to provide a method and the like for assaying the ability to control neuronal plasticity, which is essential for searching for a substance used to control neuronal plasticity in mammalian cells.
  • Oligonucleotide primer designed to amplify the gene SEQ ID NO: 8
  • Oligonucleotide primer designed to amplify gene SEQ ID NO: 10
  • Oligonucleotide primer designed to amplify the gene SEQ ID NO: 15
  • Oligonucleotide primer designed to amplify the gene SEQ ID NO: 16
  • Oligonucleotide primers designed to amplify genes SEQ ID NO: 20
  • Oligonucleotide primers designed SEQ ID NO: 23
  • Oligonucleotide primer designed for amplifying gene SEQ ID NO: 24
  • Oligonucleotide primers designed to amplify the gene SEQ ID NO: 25 are designed to amplify the gene SEQ ID NO: 25.
  • Oligonucleotide primer designed to amplify gene SEQ ID NO: 32

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Description

神経細胞可塑性を制御する能力の検定方法 技術分野
本発明は、 転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を制御する能力の検定方法 等に関する。 背景技術
脳神経機能は多種多様な神経細胞が作る神経回路の上に成り立つている。 この 複雑かつ正確なネットワークは、 神経軸索が標的細胞へ正確に誘導され、 正しい 標的細胞とシナプス結合することにより形成されている。 この誘導 ·結合過程 （ 以下、 軸索ガイダンスと記す。 ） では、 当然ながら神経軸索の伸長の制御 （促進 、 抑制、 誘引、 反発等） が行なわれている。
最近の研究結果から、 通常の老化に伴なう認識能力低下は、 神経細胞やシナプ スが無くなるというよりもむしろ、 神経の機能不全によるものであることがわか つてきた。 このような神経の機能不全は、 神経細胞が有する 2種の突起 （神経樹 状突起と神経軸索） の構造的な可塑性 （リモデリング：以下、 神経細胞可塑性と 記すこともなる。 ） が何らかの原因により正常な状態に維持できなくなるために 神経細胞可塑性のメカニズム撹乱が生じていると考えられている。 同様に、 精神 遅延、 アルツハイマー病による認識能力不全等の疾患においても神経細胞可塑性 のメカニズム撹乱が病因の一つであると現在考えられている。
上記の考えに従えば、 神経細胞の可塑化性を適正に制御することにより、 神経 細胞可塑性のメカニズム撹乱を防ぎ、 老化による認識能力不全、 精神遅延、 アル ッハイマー病による認識能力不全等の疾患を効果的に改善することが可能となる そこで、 哺乳動物細胞における神経細胞可塑性を制御するために使われる物質 を探索するために必須となる、 神経細胞可塑性を制御する能力を検定する方法の 開発が望まれていた。 発明の開示
本発明者らは、 かかる状況のもと鋭意検討した結果、 例えば、 神経細胞の可塑 性を調節していると考えられているチロシンキナーゼ型の細胞膜レセプターであ る E p h Aレセプ夕一や Rho GDP dissociat ion inhibi tor (又は Rho GTPase i nhibi tor) と呼ばれる制御因子等の神経細胞可塑化経路上に存在しているマーカ 一蛋白質遺伝子の発現を制御している、 ある種の特異な蛋白質 （即ち、 転写調節 因子） が存在することを見出し、 そしてこれを利用することにより、 本発明を完 成するに至った。
即ち、 本発明は、
1 . 下記のいずれかのアミノ酸配列 （以下、 本アミノ酸配列と記すこともある。 ) を有する転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を制御する能力の検定方法で あって、
( 1 ) 前記転写調節因子を発現する哺乳動物細胞に被験物質を接触させる第一ェ 程、 及び
( 2 ) 前記第一工程後に、 前記哺乳動物細胞において前記転写調節因子依存的一 神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相 関関係を有する指標値を測定する第二工程、 及び
( 3 ) 第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に 基づき前記被験物質が有する前記能力を評価する工程、
を有することを特徴とする検定方法 （以下、 本発明検定方法と記すこともある。 ) 、
<アミノ酸配列群 >
( a ) 配列番号 1〜 3のいずれかで示されるアミノ酸配列、
( b ) 配列番号 1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の アミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のァ ミノ酸配列、 ( c ) 配列番号 4で示される塩基配列の塩基番号 1 0 2〜2 5 0 7で表される塩 基配列からなる D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A にコードされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸 配列、
( d ) 配列番号 5で示される塩基配列の塩基番号 5 1〜2 4 5 6で表される塩基 配列からなる D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aに コ一ドされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配 列、
( e ) 配列番号 6で示される塩基配列の塩基番号 3 5〜 2 4 4 0で表される塩基 配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aに コードされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配 列；
2 . 本アミノ酸配列を有する転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を制御する 能力の検定方法であって、
( 1 ) 本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が導入されてなる形 質転換哺乳動物細胞に被験物質を接触させる第一工程、 及び
( 2 ) 前記第一工程後に、 前記形質転換哺乳動物細胞において前記転写調節因子 依存的—神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現量又はそ の量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、 及び
( 3 ) 第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に 基づき前記被験物質が有する前記能力を評価する工程、
を有することを特徴とする検定方法；
3 . 前記マ一カー蛋白質遺伝子が、 Eph Aレセプ夕一遺伝子又は Rho GDP dissoc iat ion inhibi tor遺伝子であることを特徴とする前項 1又は 2記載の検定方法；
4. 前記マ一力一蛋白質遺伝子が、 Eph Aレセプ夕一遺伝子及び Rho GDP dissoc iat ion inhibi tor遺伝子であることを特徴とする前項 1又は 2記載の検定方法；
5 . 被験物質として異なる 2種以上の物質を各々独立して用いた区における、 マ 一力一蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を比較するこ とにより得られる差異に基づき前記被験物質が有する前記能力を評価することを 特徴とする前項 1又は 2記載の検定方法。
6 . 異なる 2種以上の物質のうち、 少なくとも一つの物質が前記能力を有さない 物質であることを特徴とする前項 1又は 2記載の検定方法；
7 . 本アミノ酸配列を有する転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を制御する 能力を有する物質の探索方法であって、 前項 1又は 2記載の検定方法により評価 された前記能力に基づき前記能力を有する物質を選抜することを特徴とする探索 方法 （以下、 本発明探索方法と記すこともある。 ） ；
8 . 前項 7記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される 塩を有効成分として含み、 該有効成分が薬学的に許容される担体に製剤化されて なることを特徴とする神経細胞可塑調節剤 （以下、 本発明神経細胞可塑調節剤と 記すこともある。 ） ；
9 . 哺乳動物細胞における神経細胞可塑性を制御するための、 本アミノ酸配列を コードする塩基配列を有する遺伝子の使用；
1 0 . 外来遺伝子が哺乳動物細胞で発現する位置に置かれるように提供すること によって前記細胞における本アミノ酸配列を有する転写調節因子依存的一神経細 胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現を促進するための、 外来 遺伝子として、 本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の使用； 等を提供するものである。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明でいう 「下記のいずれかのアミノ酸配列 （即ち、 本アミノ酸配列） を有 する転写調節因子」 とは、 神経細胞可塑性に関与する、 塩基性へリックス，ルー プ 'ヘリックス （bas ic hel ix- loop-hel ix：以下、 b H L Hと記す。 ） モチーフ と P A Sドメイン （Per- Arnt-Simホモロジ一ドメイン） とを有する蛋白質であつ て、 ヘテロ二量体を形成することにより D N Aに結合して転写調節因子として機 能するものである。 以下、 本転写調節因子と記すこともある。 詳細は後述する。 本発明でいう 「下記のいずれかのアミノ酸配列 （即ち、 本アミノ酸配列） を有 する転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性」 とは、 本アミノ酸配列を有する転 写調節因子 （即ち、 本転写調節因子） が関与する神経細胞可塑性 （plasticity) であって、 本転写調節因子から始まる一連のカスケード反応が起こる結果として 生じると考えられている神経細胞可塑性である。 この一連のカスケード反応 （即 ち、 代謝過程又は信号伝達） のことを本発明では 「前記 （即ち、 本アミノ酸配列 を有する） 転写調節因子依存的一神経細胞可塑化経路」 と記載しており、 当該経 路上に存在して発現調節を受けている蛋白質のうちで、 本発明において神経細胞 可塑化の目安として利用し得る蛋白質のことを 「前記 （即ち、 本アミノ酸配列を 有する） 転写調節因子依存的一神経細胞可塑化経路上に存在するマ一力一蛋白質 」 という。 具体的には、 例えば、 Eph Aレセプター、 Rho GDP dissociation inhibitor (又は Rho GTPase inhibitor) 等をあげることができる。
因みに、 Eph Aレセプ夕一とは、 チロシンキナ一ゼ型の細胞膜レセプター のことであり、 脳の発生に関わっていることが広く知られており、 最近、 いくつ かの研究から、 Eph Aがシナプス可塑性、 学習と記憶に関わっている証拠が 揃ってきた。 また Eph Aは、 記憶の強化にも関与していることが観察されて おり、 その電気生理学的結果 (LTP：シナプス伝達効率の長期増強） と行動観 察結果から、 Eph Aの活性ィヒには大人の脳において記憶の改善を導く認知の 変化が存在していることが示されている。 そして記憶と記憶情報蓄積にシナプス 可塑性がクリティカルなもの （即ち、 メカニズムの基本を成すもの） であること から、 Eph Aの活性化には神経細胞の可塑性を促す効果が存在していると考 えられている。
一方、 Rhoとは、 細胞内シグナル伝達物質のことであり、 細胞増殖の制御、 細胞接着の形成調節、 ァクチン細胞骨格の構造形成等に関わっていることが広く 知られている蛋白質である。 当該 Rhoの活性化を制御するために、 Rho GDP di ssociation inhibitor (又は Rho GTPase inhibitor) と呼ばれる制御因子 （抑制 的蛋白質） が存在している。 これが、 Rhoの GDP結合型と複合体を形成し、 Rhoが GTP結合型 （Rhoの活性型） になることを妨げ、 ； hoの活性化 （ Rho GTPase活性） を阻害する。 このようにして、 Rho GDP dissoc iat ion inhibi t or は、 R h oの GT P ase活性をコントロールすることにより神経細胞の可塑性 を調節していると考えられている。
本発明検定方法において用いられる 「下記のいずれかのアミノ酸配列 （即ち、 本アミノ酸配列） を有する転写調節因子 （即ち、 本転写調節因子） 」 とは、 （a ) 配列番号 1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列、 （b ) 配列番号 1〜3の いずれかで示されるアミノ酸配列に対して 9 0 %以上のアミノ酸同一性を示すァ ミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、 （c ) 配列 番号 4で示される塩基配列の塩基番号 1 0 2〜2 5 0 7で表される塩基配列から なる D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D NAにコードさ れるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、 （d ) 配列番号 5で示される塩基配列の塩基番号 5 1〜 2 4 5 6で表される塩基配列 からなる D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D NAにコ一 ドされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、 ( e ) 配列番号 6で示される塩基配列の塩基番号 3 5〜2 4 4 0で表される塩基 配列からなる D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aに コードされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配 列、 からなるアミノ酸群に含まれるいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質であ る。 このような蛋白質は、 SDS- PAGEでの分子量として、 約 8〜 1 0万程度の分子 量であることが好ましい。
本転写調節因子には、 配列番号 1〜 3のいずれかで示されるアミノ酸配列 （即 ち、 本アミノ酸配列） を有する蛋白質 （ここで、 配列番号 1で示される本ァミノ 酸配列を有する蛋白質は、 ヒト由来の本転写調節因子であり、 以下、 h N X Fと 記すこともある。 また、 配列番号 2で示される本アミノ酸配列を有する蛋白質は 、 マウス由来の本転写調節因子であり、 以下、 mN X Fと記すこともある。 また 、 配列番号 3で示される本アミノ酸配列を有する蛋白質は、 ラット由来の本転写 調節因子であり、 以下、 r NX Fと記すこともある。 ） 、 配列番号 1〜 3のいず れかで示されるアミノ酸配列に対して 9 0 %以上のアミノ酸同一性を示すアミノ 酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質、 配列番号 4で示される塩基配列 の塩基番号 1 0 2〜2 5 0 7で表される塩基配列からなる D N Aとストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする D N Aにコードされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質、 配列番号 5で示される塩基配列の塩基番号 5 1 〜2 4 5 6で表される塩基配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハ イブリダィズする D N Aにコードされるァミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を 有する蛋白質、 配列番号 6で示される塩基配列の塩基番号 3 5〜 2 4 4 0で表さ れる塩基配列からなる D NAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズする D NAにコードされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質が含 まれる。
本転写調節因子のアミノ酸配列において認められる、 配列番号 1〜 3のいずれ かで示されるアミノ酸配列との相違としては、 アミノ酸の欠失、 置換、 修飾、 付 加等の変異をあげることができる。 これらには、 部位特異的変異導入法や突然変 異処理等によって人為的に導入され得る変異に加えて、 動物の系統、 個体、 器官 、 組織等の違いによるアミノ酸配列の相違などの天然に生ずる多型変異も含まれ る。
本発明において 「アミノ酸同一性」 とは、 2つの蛋白質間のアミノ酸配列の同 一性及び相同性をいう。 前記 「アミノ酸同一性」 は、 比較対象のアミノ酸配列の 全領域にわたって、 最適な状態にァラインメントされた 2つのアミノ酸配列を比 較することにより決定される。 ここで、 比較対象の蛋白質は、 2つのアミノ酸配 列の最適なアラインメントにおいて、 付加又は欠失 （例えばギャップ等） を有し ていてもよい。 このようなアミノ酸同一性に関しては、 例えば、 Vector NTIを用 いて、 Clus talWアルゴリズム（Nuc leic Acid Res.， 22 (22) : 4673-4680 (1994)を利 用してアラインメントを作成することにより算出することができる。 尚、 ァミノ 酸同一性は、 配列解析ソフト、 具体的には Vec tor NTL GENETYX- MACや公共のデ —タベースで提供される解析ツールを用いて測定される。 前記公共データベース は、 例えば、 ホームページアドレス ht tp：〃 www. ddbj . nig. a jpにおいて、 一般 的に利用可能である。 本発明におけるアミノ酸同一性は、 例えば、 9 0 %以上であることが好ましい また、 上記の 「ストリンジェントな条件下にハイブリダィズする D NA」 として は、 例えば、 高イオン濃度下 [例えば、 6XSSC (900mM塩化ナトリウム、 90mMク ェン酸ナトリウム） などが用いられる。 ]に、 65 の温度条件でハイブリダィズ させることにより DNA-DNAハイブリッドを形成し、 低イオン濃度下 [例えば、 0. 1 X SSC (15mM塩化ナトリウム、 1. 5mMクェン酸ナトリウム） などが用いられる。 ] に、 65 の温度条件で 30分間洗浄した後でも該ハイブリツドが維持されうる D N Aをあげることができる。 本転写調節因子の転写調節能は、 例えば、 後述のレポ —タ一遺伝子を用いたアツセィ等に基づき評価することができる。
本転写調節因子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子 （以下、 本転写調節因子遺伝子と記す。 ） は、 例えば、 ヒト、 マウス、 ラットなどの動物 の組織から、 J. Sambrook，E. F. Fr i sch, T. Mani at i s著；モレキユラ一 クローニン グ第 2版 （Mol ecul ar Cl oning 2nd edi t ion) 、 コールドスプリングハーバー ラボラトリ一 (Cold Spr ing Harbor Laboratory発行、 1989年) 等に記載の遺伝 子工学的方法に準じて取得することができる。
具体的には、 まず、 ヒト、 マウス、 ラットなどの動物の組織由来の全 RNAを調 製する。 例えば、 脳の組織を塩酸グァニジンやグァニジンチオシァネート等の蛋 白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、 さらに該粉砕物にフエノール、 クロ口ホルム 等を加えることにより蛋白質を変性させる。 変性蛋白質を遠心分離等により除去 した後、 回収された上清画分から塩酸グァニジン フエノール法、 SDS—フエノ ール法、 グァニジンチオシァネート ZCsCl法等の方法により全 RNAを抽出する。 なお、 これらの方法に基づいた市販のキットとしては、 例えば IS0GEN (二ツボン ジーン製） がある。 得られた全 RNAを铸型としてオリゴ dTプライマーを RNAのポリ A配列にァニールさせ、 逆転写酵素により一本鎖 cDNAを合成する。 次いで、 合成 された一本鎖 cDNAを铸型とし、 かつ大腸菌 RNaseHを用いて RNA鎖にニックとギヤ ップを入れることにより得られる RNAをプライマーとして大腸菌の DNAポリメラー ゼ Iを用いて二本鎖の cDNAを合成する。 更に、 合成された二本鎖 cDNAの両末端を T4 DNAポリメラーゼにより平滑化する。 末端が平滑化された二本鎖 cDNAは、 フエ ノ一ルークロロホルム抽出、 エタノール沈殿等の通常の方法により精製、 回収す る。 なお、 これらの方法に基づいた市販のキットとしては、 例えば cDNA合成シス テムプラス （アマシャムフアルマシアバイオテク社製） や TimeSaver cDNA合成キ ット （アマシャムフアルマシアバイオテク社製） 等があげられる。 次に、 得られ た二本鎖 cDNAを例えば、 プラスミド PUC118やファージ AgtlOなどのベクターとリ ガーゼを用いて連結することにより cDN Aライブラリ一を作製する。 尚、 cD NAライプラリーとしては、 市販の cDNAライブラリー （GI BCO— BRL 社製や C I on t e c h社製等） を用いることも可能である。
また、 ヒト、 マウス、 ラットなどの動物の組織片から、 例えば、 J.Sambrook,E .F.Frisch，T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第 2版 (Molecular Cloni ng 2nd edition) 、 コールドスプリングハーバー ラボラトリー （Cold Spring Harbor Laboratory発行、 1989年） や、 村松正寶、 " ラポマニュアル遺伝子工学 " (丸善 1988) 等に記載される通常の方法に準じてゲノム DNAを調製する 。 例えば試料が毛髪の場合には、 毛髪 2〜 3本を滅菌水、 次いでエタノールで洗 浄した後、 2〜3腿の長さに切断し、 これに BCL_Buffer [ΙΟιΜ Tr is-HCl (pH7.5) , 5 iM MgCl2， 0.32M Sucrose, 1 Triton X - 100] 200" 1を加え、 さらに Prote inaseKを最終濃度 100 1/ml 、 SDSを最終濃度 0.5 (w/v) になるようにそ れぞれ加え混合する。 この混合物を 70°Cで 1時間保温した後、 フエノールノクロ 口ホルム抽出を行うことによりゲノム DNAを得ることができる。 また、 試料が 末梢血の場合は、 DNA-Ex tract ion kit (Stratagene社製)等を用いて該試料を処理 することによりゲノム DNAを得ることができる。 得られたゲノム DNAを Agt 10などのべクタ一とリガーゼを用いて連結することによりゲノム D N Aライブラ リーが得られる。 尚、 ゲノム DNAライブラリ一としては、 市販のゲノム DNA ライブラリ一 （S t r a t a g e n e社製等） を用いることも可能である。
上記のような cDNAライブラリーやゲノム DN Aライブラリ一から、 例えば、 配 列番号 4、 5、 6又は 33 (もしくは 34) のいずれかで示される塩基配列の部 分塩基配列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド をプライマ一として用いるポリメラ一ゼチェイン反応 （以下、 PCRと記す。 ) や、 配列番号 4、 5、 6又は 33 (もしくは 34) のいずれかで示される塩基配 列又は該塩基配列の部分塩基配列を有する DNAをプロ一ブとして用いるハイブ リダイゼ一ション法により、 本転写調節因子遺伝子を取得することができる。
PCRに用いられるプライマーとしては、 例えば、 約 10塩基から約 50塩基程度 の長さのオリゴヌクレオチドであって、 配列番号 4、 5、 6又は 33 (もしくは 34) のいずれかで示される塩基配列の 5' 非翻訳領域から選択した塩基配列を 有するオリゴヌクレオチド、 及び、 配列番号 4、 5、 6又は 33 (もしくは 34 ) のいずれかで示される塩基配列の 3' 非翻訳領域から選択した塩基配列に相補 的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。 具体的には、 フォワードプライマーとしては、 例えば、 配列番号 7で示される塩基配列からな るオリゴヌクレオチドゃ配列番号 8で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオ チドをあげることができる。 また、 リバースプライマーとしては、 例えば、 配列 番号 9で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドゃ配列番号 10で示され る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをあげることができる。 PCRの条件とし ては、 例えば、 反応液 中に、 LA- Taqポリメラ一ゼ用 10倍濃緩衝液 （宝酒造 社製） 5 2.5mM dNTP混合液 (各 2.5mMの dATP， dGTP, dCTP及び dTTPを含む。 ) 5 l (dATP，dGTP,dCTP及び dTTP各々の終濃度が 0.25mM) 、 20 Mプライマー 各 0 • 25〜1.25 U (終濃度が0.1〜0.5 ¾0 、 铸型 cDNA 0.1〜0.5/xg、 LA- Taqポリメ ラーゼ （宝酒造社製） 1.25ユニットを含む組成の反応液にて、 95°Cで 1分間次いで 68 で 3分間の保温を 1サイクルとしてこれを 35サイクル行う等の条件が挙げられる 八イブリダィゼ一シヨン法に用いられるプローブとしては、 例えば、 配列番号 4で示される塩基配列の塩基番号 102〜2507で表される塩基配列からなる DNA、 配列番号 5で示される塩基配列の塩基番号 51〜2456で表される塩 基配列からなる DNA、 配列番号 6で示される塩基配列の塩基番号 35〜244 0で表される塩基配列からなる DNA、 配列番号 33で示される塩基配列の塩基 番号 1419〜6 164で表される塩基配列からなる DNA、 又はこれら DNA の部分塩基配列を有する DNA等があげられる。 ハイブリダィゼーションの条件 としては、 例えば、 6XSSC (0.9M塩化ナトリウム、 0.09Mクェン酸ナトリウム ) 、 5Xデンハルト溶液 （0.1(w/v)フイコール 400、 0.1(w/v)ポリビエルピロリ ドン、 0.1(w/v)BSA) 、 0.5(w/v)SDS及び 100 g/ml変性サケ精子 DNA存在下に 、 65°Cで保温し、 次いで 1 XSSC (0.15M塩化ナトリウム、 0.015Mクェン酸ナトリ ゥム） 及び 0.5(w/v)SDS存在下に、 室温で 15分間の保温を 2回行い、 さらに 0.1 XSSC (0.015M塩化ナトリウム、 0.0015Mクェン酸ナトリウム） 及び 0.5(w/v) SDS存在下に、 68°Cで 30分間保温する条件等をあげることができる。 また、 例え ば、 5xSSC、 50mM HEPES pH7.0、 10xデンハルト溶液及び 20 g/ml変性サケ精子 DN A存在下に 65°Cにて保温し、 次いで 2xSSC中で室温にて 30分間の保温を行い、 さ らに 0. lxSSC中で 65 にて 40分間の保温を 2回行う条件をあげることもで さる。
尚、 本転写調節因子遺伝子は、 例えば配列番号 4、 5、 6又は 33 (もしくは 34) のいずれかで示される塩基配列に基づいて、 例えばホスファイト · トリエ ステル法 (Hunkapiller.M.et al. , Nature, 310, 105, 1984) 等の通常の方法に準じ て、 核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。
このようにして得られた本転写調節因子遺伝子は、 例えば、 〗.Sambrook，E.F.F risch，T.Maniatis著；モレキュラー クロ一ニング第 2版 （Molecular Cloning 2 nd edition) 、 コールド プリングハ一バーラポラトリ一 （Cold Spring Harbo r Laboratory) 発行、 1989年等に記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにク ローニングすることができる。 具体的には例えば、 TAクローニングキット （Invi trogen社） や pBluescriptll (Stratagene社） などの市販のプラスミドベクタ一 を用いて
クローニングすることができる。
得られた本転写調節因子遺伝子の塩基配列は、 Maxam Gilbert法 （例えば、 Max am, A.M & W.Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 74, 560， 1977等に記載される）や Sa nger法 (例えば Sanger, F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol. , 94, 441, 1975, Sanger, F， & Nicklen and A. R. Coulson. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977等に記載さ れる） 等により確認することができる。
本転写調節因子遺伝子の具体例としては、 配列番号 4で示される塩基配列の塩 基番号 1 0 2〜2 5 0 7で表される塩基配列を有する D NA、 配列番号 5で示さ れる塩基配列の塩基番号 5 1〜2 4 5 6で表される塩基配列を有する D NA、 配 列番号 6で示される塩基配列の塩基番号 3 5〜 2 4 4 0で表される塩基配列、 配 列番号 3 3で示される塩基配列の塩基番号 1 4 1 9〜6 1 6 4で表される塩基配 列を有する D N A等をあげることができる。
本転写調節因子遺伝子は、 前述及び後述の如く、 当該 D NAを外来遺伝子とし て、 哺乳動物細胞に当該細胞で発現する位置に置かれるように提供することによ つて哺乳動物細胞における本転写調節因子依存的一神経細胞可塑ィヒ経路上に存在 するマーカ一蛋白質遺伝子の発現を促進するために利用することもできる。
本転写調節因子遺伝子を、 該遺伝子が導入される宿主細胞において利用可能な ベクター （以下、 基本ベクターと記す。 ） 、 例えば、 宿主細胞中で複製可能な遺 伝情報を含み、 自立的に増殖でき、 宿主細胞からの単離、 精製が可能であり、 検 出可能なマーカ一をもつベクターに、 通常の遺伝子工学的手法に準じて組み込む ことにより本転写調節因子遺伝子べクタ一を構築することができる。
本転写調節因子遺伝子ベクターの構築に用いることができる基本べクタ一とし ては、 具体的には大腸菌を宿主細胞とする場合、 例えばプラスミド pUC119 (宝酒 造社製)や、 ファージミド pBluescript I I (Stratagene社製)等を上げることができ る。 出芽酵母を宿主細胞とする場合は、 プラスミド pGBT9、 pGAD424, pACT2 (Clon tech社製)などをあげることができる。 また、 哺乳類動物細胞を宿主細胞とする 場合は pRc/RSV、 pRc/CMV (Invi trogen社製)等のプラスミド、 ゥシパピローマウイ ルスプラスミド pBPV (アマシャムフアルマシアバイォテク社製）もしくは EBウイル スプラスミド pCEM (Invi t rogen社製)等のウイルス由来の自律複製起点を含むベ クタ一、 ワクシニアウィルス等のウィルスなどをあげることができ、 昆虫類動物 細胞を宿主細胞とする場合には、 バキュロウィルス等の昆虫ウィルスをあげるこ とができる。 バキュロウィルスやワクシニアウィルス等のウィルスに本転写調 節因子遺伝子を組み込むには、 使用しょうとするウィルスのゲノムと相同な塩基 配列を含有するトランスファ一ベクタ一を用いることができる。 このようなトラ ンスファーベクターの具体的例としては、 Pharmingen社から市販されている pVLl 392, pVL1393 (Smi th, G. E. , Summers M. D. et al.： Mol . Cel l. Biol. , 3, 2156-2165 (198 3))、 pSFB5 (Funahas i, S. et al .： J. Virol. , 65， 5584 - 5588 (1991))などのプラスミ ドをあげることができる。 本転写調節因子遺伝子を前記のようなトランスファ一 ベクタ一に挿入し、 該トランスファーベクタ一とウィルスのゲノムとを同時に宿 主細胞に導入すると、 トランスファーベクタ一とウィルスのゲノムとの間で相同 組換えが起こり、 本転写調節因子遺伝子がゲノム上にくみこまれたウィルスを得 ることができる。 ウィルスのゲノムとしては、 Baculovirus, Adenovirus, Vaccini avirusなどのゲノムを用いることができる。
より具体的には、 例えばバキュ口ウィルスに本転写調節因子遺伝子を組み込む 場合、 トランスファーベクター pVL1393, pVL1392等のマルチクローニング部位に 本転写調節因子遺伝子を揷入した後、 該トランスファ一ベクターの DMと Baculov irus genome MA(Baculogold ;Pharmingen社製）とを昆虫細胞 Sf21株 （ATCCから入 手可能） にリン酸カルシウム法等により導入し、 得られた細胞を培養する。 培養 液から遠心分離等により、 本転写調節因子遺伝子が揷入されたウィルスのゲノム を含有するウィルス粒子を回収し、 これをフエノール等で除蛋白処理することに より、 本転写調節因子遺伝子を含有するウィルスのゲノムを得ることができる。 さらに、 該ウィルズのゲノムを、 昆虫細胞 Sf21株などのウィルス粒子形成能を有 する宿主細胞にリン酸カルシウム法等により導入し、 得られる細胞を培養するこ とにより、 本転写調節因子遺伝子を含有するウィルス粒子を増やすことができる 一方、 マウス白血病レトロウイルスなどの比較的小さなゲノムへは、 トランス ファーべクタ一を利用せずに、 本転写調節因子遺伝子を直接組み込むこともでき る。 例えばウィルスベクタ- DC 00 (El i Gi lboa et al. , Bi oTechniques, 4, 504-51 2 (1986) ) などは、 該ベクター上のクロ一ニング部位に本転写調節因子遺伝子を 組み込む。 得られた本転写調節因子遺伝子の組込まれたウィルスベクターを、 例 えば Afflpl i-GPE (J. Virol. , 66, 3755 (1992) ) などのパッケージング細胞に導入す ることにより、 本転写調節因子遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含有する ウィルス粒子を得ることができる。
本転写調節因子遺伝子の上流に、 宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可 能な形で結合させ、 これを上述のような基本ベクターに組み込むことにより、 本 転写調節因子遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な本転写調節因子遺伝子 ベクターを構築することができる。 ここで、 「機能可能な形で結合させる」 とは 、 本転写調節因子遺伝子が導入される宿主細胞において、 プロモーターの制御下 に本転写調節因子遺伝子が発現されるように、 該プロモーターと本転写調節因子 遺伝子とを結合させることを意味する。 宿主細胞で機能可能なプロモータ一とし ては、 導入される宿主細胞内でプロモーター活性を示す D N Aをあげることがで きる。 例えば、 宿主細胞が大腸菌である場合には、 大腸菌のラクトースォペロン のプロモーター （l acP) 、 トリプトファンオペロンのプロモーター（t i:pP)、 アル ギニンオペロンのプロモ一ター（argP)、 ガラクトースォペロンのプロモーター（g alP)、 tacプロモーター、 T7プロモーター、 Τ3プロモーター、 λファージのプロ モーター（λ - pL、 λ - pR)等をあげることができ、 宿主細胞が動物細胞や分裂酵母 である場合には、 例えば、 ラウス肉腫ウィルス（RSV)プロモーター、 サイトメガ ロウィルス（CMV)プロモーター、 シミアンウィルス（SV40)の初期又は後期プロモ 一夕一、 マウス乳頭腫ウィルス（MMTV)プロモーター等をあげることができる。 宿 主細胞が出芽酵母である場合には ADH1プロモータ一 （尚、 ADH1プロモーターは、 例えば ADH1プロモーター及び同ターミネータ一を保持する酵母発現べク夕一 pMH 5 [Washington Research Fundat ionから入手可能、 Ammerer ら、 Method in En zymo l ogy、 101 ar t (p. 192-201) 〕 から通常の遺伝子工学的方法により調製す ることができる。 ADH1プロモーターは、 Washington Research Fundat ion の米国 特許出願第 299， 733 に含まれており、 米国において、 工業的、 商業目的で使用す る場合は、 権利者からの権利許諾を必要とする。 ) などをあげることができる。 また、 宿主細胞において機能するプロモーターをあらかじめ保有する基本べク ターを使用する場合には、 ベクタ一保有のプロモーターと本転写調節因子遺伝子 とが機能可能な形で結合するように、 該プロモーターの下流に本転写調節因子遺 伝子を挿入すればよい。 例えば、 前述のプラスミド pRc/RSV、 pRc/CMV等は、 動物 細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられており、 該 クローニング部位に本転写調節因子遺伝子を挿入し動物細胞へ導入することによ り、 本転写調節因子遺伝子を発現させることができる。 これらのプラスミドには あらかじめ SV40の自律複製起点 （or i) が組み込まれているため、 oriを欠失した SV40ゲノムで形質転換された培養細胞、 例えば COS細胞等に該プラスミドを導入 すると、 細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大し、 結果として該プラスミ ドに組み込まれた本転写調節因子遺伝子を大量発現させることもできる。 また前 述の酵母用プラスミド PACT2は ADH1プロモーターを有しており、 該プラスミド又 はその誘導体の ADH1プロモーターの下流に本転写調節因子遺伝子を挿入すれば、 本転写調節因子遺伝子を例えば CG1945 (Clontech社製)等の出芽酵母内で大量発現 させることが可能な本転写調節因子遺伝子ベクターが構築できる。
構築された本転写調節因子遺伝子ベクターを宿主細胞に導入することにより、 形質転換体を取得することができる。 本転写調節因子遺伝子ベクターを宿主細胞 へ導入する方法としては、 宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することがで きる。 例えば、 大腸菌を宿主細胞とする場合は、 J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Mani at is著；モレキュラークローニング第 2版 （Mo lecul ar Cl oning 2nd edi t i on) 、 コールドスプリングハーバーラポラトリー （Col d Spr ing Harbor Laboratory ) 発行、 1989年等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロボレ一シヨン法等 の通常の方法を用いることができる。 また、 哺乳類動物細胞又は昆虫類動物細胞 を宿主細胞とする場合は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、 エレクト口ポレーション法、 又はリポフエクション法等の一般的な遺伝子導入法 に準じて前記細胞に導入することができる。 酵母を宿主細胞とする場合は、 例え ばリチウム法を基にした Yeas t trans format i on ki t (Clontech社製)などを用いて 導入することができる。
尚、 ウィルスをベクターに用いる場合には、 上述のように一般的な遺伝子導入 法によりウィルスのゲノムを宿主細胞に導入できるほか、 本転写調節因子遺伝子 の挿入されたウィルスのゲノムを含有するウィルス粒子を、 宿主細胞へ感染させ ることによつても、 該ウィルスのゲノムを宿主細胞に導入することができる。 当該形質転換体を選抜するには、 例えば、 本転写調節因子遺伝子ベクターと同 時にマーカー遺伝子を宿主細胞へ導入し、 マーカー遺伝子の性質に応じた方法で 細胞を培養すればよい。 例えば、 マーカー遺伝子が、 宿主細胞に致死活性を示す 選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、 該薬剤を添加した 培地を用いて、 本転写調節因子遺伝子ベクターが導入された宿主細胞を培養すれ ば良い。 薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとしては、 例えば、 ネオマ ィシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、 ハイグロマイシン耐性付 与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、 ブラストサイジン S耐性付与遺伝 子とブラストサイジン Sとの組み合わせなどをあげることができる。 また、 マー カー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、 該栄養素 を含まない最少培地を用いて、 本転写調節因子遺伝子べクタ一が導入された細胞 を培養すればよい。
本転写調節因子遺伝子が宿主細胞の染色体に導入されてなる形質転換体を取得 するには、 例えば、 本転写調節因子遺伝子ベクターとマーカー遺伝子を有するベ クタ一とを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、 これらを前述の方 法で宿主細胞へ導入して該細胞を通常数週間培養し、 導入されたマーカー遺伝子 の発現を指標にして目的とする形質転換体を選抜し取得すればよい。 また、 例え ば、 上記のような選抜薬剤に対する耐性付与遺伝子をマーカー遺伝子として有す る本転写調節因子遺伝子ベクターを前述の方法で宿主細胞に導入し、 該細胞を選 抜薬剤が添加された培地で数週間以上継代培養して、 コロニー状に生き残つた選 抜薬剤耐性クローンを純化培養することにより、 本転写調節因子遺伝子が宿主細 胞の染色体に導入されてなる形質転換体を選抜し取得することもできる。 導入さ れた本転写調節因子遺伝子が宿主細胞の染色体に組み込まれたことを確認するに は、 当該細胞のゲノム D NAを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、 調製さ れたゲノム D N Aから、 導入された本転写調節因子遺伝子の部分塩基配列を有す るオリゴヌクレオチドをプライマーに用いる P C Rや、 導入された本転写調節因 子遺伝子をプローブに用いるサザンハイブリダィゼーション等の方法を利用して 、 本転写調節因子遺伝子の存在を検出すればよい。 かかる形質転換体は、 凍結保 存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、 実験毎の形質 転換体作製の手間を省くことができ、 また、 あらかじめ性質や取扱い条件の確認 された形質転換体を用レ ^て試験を実施することが可能となる。
上述のようにして得られた形質転換体を培養することにより本転写調節因子を 産生させることができる。
例えば、 上記形質転換体が微生物である場合、 該形質転換体は、 一般微生物に おける通常の培養に使用される炭素源や窒素源、 有機ないし無機塩等を適宜含む 各種の培地を用いて培養することができる。 培養は、 一般微生物における通常の 方法に準じて行い、 固体培養、 液体培養 （旋回式振とう培養、 往復式振とう培養
、 ジャーフアーメンター (JarFermenter) 培養、 タンク培養等） などが可能であ る。 培養温度及び培地の p Hは、 微生物が生育する範囲から適宜選ぶことができ 、 例えば、 約 15°C〜約 4(TCの培養温度にて、 約 6〜約 8の培地 pHで培養するのがー 般的である。 培養時間は、 種々の培養条件によって異なるが、 通常約 1日間〜約 5日間である。 温度シフト型ゃ IPTG誘導型等の誘導型のプロモー夕一を有す る発現ベクターを用いた場合には誘導時間は 1日間以内が望ましく、 通常数時間 である。
また、 上記形質転換体が哺乳類、 昆虫類等の動物細胞である場合、 該形質転換 体は一般の培養細胞における通常の培養に使用される培地を用いて培養すること ができる。 選抜薬剤を利用して当該形質転換体を作製した場合は、 該選抜薬剤の 存在下に培養するのが望ましい。 哺乳類動物細胞の場合、 例えば終濃度が 10% (w /v)となるよう FBSを添加した DMEM培地 （二ッスィ社製等） を用いて 37 、 5 %C02 存在下等の条件で数日ごとに新しい培養液に交換しながら培養する。 細胞がコン フルェントになるまで増殖したら、 例えば 0. 25 % (w/v)程度となるようトリプシ ンが添加された PBS溶液を加えて個々の細胞に分散させ、 数倍に希釈して新しい シャ一レに播種し培養を続ける。 昆虫類動物細胞の場合も同様に、 例えば 10% (V /v) FBS及び 2 % (w/v) Yeas t l ateを含む Grace' s medium等の昆虫細胞用培養液を用 いて培養温度 25°Cから 35°Cで培養すればよい。 この際、 Sf21細胞などのシャーレ からはがれやすい細胞の場合は、 トリプシン液を用いずピベッティングにより分 散させ継代培養を行なうことができる。 また、 バキュロウィルス等のウィルスべ クタ一を含む形質転換体の場合は、 培養時間は細胞質効果が現れて細胞が死滅す る前、 例えばウィルス感染後 72時間までとするのが好ましい。
上記形質転換体により産生された本転写調節因子の回収は、 適宜、 通常の単離 、 精製の方法を組み合わせて行うことができ、 例えば、 培養終了後、 形質転換体 の細胞を遠心分離等で集め、 集められた該細胞を通常のバッファーに懸濁した後 、 ポリトロン、 超音波処理、 ダウンスホモジナイザー等で破碎し、 破砕液を遠心 分離して上清画分を回収することにより、 本転写調節因子を含む画分を得ること ができる。 さらに、 前記上清画分をイオン交換、 疎水、 ゲルろ過、 ァフィ二ティ 等の各種クロマトグラフィ一に供することにより、 より精製された本転写調節因 子を回収することもできる。 また、 本転写調節因子又はその部分アミノ酸配列を 有するポリペプチドを、 G S Tとの融合蛋白質として産生させた場合には、 グル タチオンセファロース (アマシャムフアルマシア社製) を用いたァフィ二テイク 口マトグラフィ一で精製することができる。
このようにして製造された本転写調節因子は、 例えば、 本転写調節因子又はそ の部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体を作製するための免疫 抗原として用いることができ、 また、 本転写調節因子に結合する物質をスクリー ニングするためのアツセィ等に用いることもできる。
上述のように製造された本転写調節因子を免疫抗原として、 例えばマウス、 ゥ サギ、 ニヮトリ等の動物を、 Freder ick M. Ausubel et al.著； Short Protocols in Molecular Biology 3nd Edi t ion, John Wi ley&Sons, Inc 記載の免疫学的方 法に準じて免疫感作することにより、 本転写調節因子又はその部分アミノ酸配列 を有するポリペプチドを認識する抗体を作製することができる。 具体的には例え ば、 まず、 抗原として用いる本転写調節因子と完全 Freunds adj uvantとを混合し てェマルジヨン化する。 得られたェマルジヨンをゥサギに皮下投与する。 約 4週 間後に、 不完全 Freunds adj uvantと混合してェマルジヨン化した抗原を投与する 。 必要に応じて、 さらに 2週間毎に同様に投与を行なう。 採血して血清画分を調 製し、 本転写調節因子に対する抗体価を確認する。 このようにして得られた本転 写調節因子又はその部分アミノ酸配列を有するポリべプチドを認識する抗体価を 有する血清画分を通常の硫安沈殿法等に準じて分画することにより、 本転写調節 因子又はその部分アミノ酸配列を有するポリぺプチドを認識する IgGを得ること ができる。
また、 本転写調節因子の部分ァミノ酸配列を有するポリぺプチドを化学合成し 、 これを免疫抗原として動物に投与することにより、 本転写調節因子又はその部 分アミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体を作製することもできる。 免疫抗原として用いるポリペプチドのアミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号 1〜 3のいずれかで示されるアミノ酸配列の中から、 他の蛋白質のアミノ酸配列 とのホモロジ一がなるベく低くかつ免疫感作する動物種の有する本転写調節因子 のアミノ酸配列とも相違の多いアミノ酸配列を選択する。 選択されたアミノ酸配 列からなる 1 0アミノ酸から 1 5アミノ酸程度の長さのポリペプチドを、 通常の 方法に準じて化学合成し、 Limulus plyhemusの hemocyanin等のキャリアー蛋白質 と MBS等により架橋した後、 上記と同様にゥサギ等の動物に免疫する。
このようにして本転写調節因子又はその部分ァミノ酸配列を有するポリぺプチ ドを認識する抗体を作製することができる。
このようにして調製される本転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を制御す る能力 （以下、 本神経細胞可塑性制御能力と記すこともある。 ） を検定するには 、 ( 1 ) 本転写調節因子を発現する哺乳動物細胞に被験物質を接触させる第一ェ 程、 （2 ) 前記第一工程後に、 前記哺乳動物細胞において前記転写調節因子依存 的一神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量 と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、 及び、 第二工程により測定され た発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記被験物質が有する前 記能力を評価する工程を有する検定方法 （即ち、 本発明検定方法） を用いること ができる。 この際に、 被験物質として異なる 2種以上の物質を各々独立して用い た区における上記マーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する 指標値 （第一の測定量、 第二の測定量） を比較することにより差異を調べる。 そ の結果、 得られる差異 （第一の測定量と第二の測定量との差） に基づき前記被験 物質が有する本神経細胞可塑性制御能力を評価することにより当該能力の検定を 行う。 このようにして評価された本神経細胞可塑性制御能力に基づき本神経細胞 可塑性制御能力を有する物質であることを確認することができる。
上記の方法において、 前記異なる 2種以上の物質のうち、 少なくとも一つの物 質が本神経細胞可塑性制御能力を有さない物質とすることで、 他方の被験物質が 有する本神経細胞可塑性制御能力を評価してもよいし、 また前記異なる 2種以上 の物質のうち、 少なくとも一つの物質が有する本神経細胞可塑性制御能力を基準 としながら他方の被験物質が有する本神経細胞可塑性制御能力を評価してもよい このように本調節調節因子は、 物質が有する本神経細胞可塑性制御能力を検定 するために必須となる、 前記転写調節因子依存的一神経細胞可塑化経路上に存在 するマ一カー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を効果 的に分析する方法に利用できる。
本発明検定方法において用いられる哺乳動物細胞は、 組織から分離された細胞 や、 同一の機能 ·形態を持つ集団を形成している細胞や、 哺乳動物の体内にある 細胞であってもよい。 場合によっては前記細胞の抽出系でもよい。 当該細胞の由 来としては、 例えば哺乳動物等を挙げることができ、 さらに具体的にはヒト、 サ ル、 ゥシ、 ゥサギ、 マウス、 ラット、 ハムスターなどを挙げることができる。 本発明検定方法の第一工程において、 本転写調節因子を発現する哺乳動物細胞 と接触させる被験物質の濃度としては、 通常約 0 . 1 i M〜約l 0 0 Mであれ ばよく、 1 ^ M〜5 0 t Mが好ましい。 上記哺乳動物細胞と被験物質とを接触さ せる時間は、 通常 1 0分以上 2日程度であり、 好ましくは数時間〜 1日程度であ る。
上記哺乳動物細胞に被験物質を接触させる環境としては、 当該哺乳動物細胞の 生命活動を維持させるような環境が好ましく、 例えば、 当該哺乳動物細胞のエネ ルギ一源が共存するような環境をあげることができる。 具体的には、 培地中で第 一工程が行なわれることが好都合である。 さらにまた本発明検定方法の第一工程は、 例えば、 哺乳動物細胞に本アミノ酸 配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が導入されてなる形質転換哺乳動物細 胞 （以下、 本形質転換哺乳動物細胞と記すこともある。 ) に、 被験物質を接触さ せる方法でもよい。
当該工程において、 本形質転換哺乳動物細胞と接触させる被験物質の濃度は、 通常約 0. 1 M〜約 100 Mであればよく、 1 M〜50 Μが好ましい。 本形質転換哺乳動物細胞と被験物質とを接触させる時間は、 通常 10分以上 2日 前記本形質転換哺乳動物細胞は、 以下のようにして調製することができる。 本転写調節因子遺伝子を、 通常の遺伝子工学的手法を用いて、 本転写調節因子 遺伝子を導入する哺乳動物細胞において使用可能なベクターに発現可能な形でプ 口モータ一と接続されるように挿入することにより、 プラスミドを作製する。 こ こで用いられるプロモーターは、 本転写調節因子遺伝子が導入される哺乳動物細 胞で機能可能なものであればよく、 例えば、 SV40ウィルスプロモーター、 サ イトメガロウィルスプロモー夕一 （CMVプロモーター） 、 Raus Sarcoma Virus プロモーター （RSVプロモーター） 、 ι8ァクチン遺伝子プロモーター等が挙げ られる。 尚、 このようなプロモ一夕一をマルチクローニング部位の上流に含む市 販のベクターを利用してもよい。
次いで、 前記プラスミドを哺乳動物細胞へ導入する。 哺乳動物細胞への導入法 としては、 例えば、 リン酸カルシウム法、 電気導入法、 DEAEデキストラン法 、 ミセル形成法等を挙げることができる。 リン酸カルシウム法としては Grimm, S . et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10923 - 10927等に記載される方法 、 電気導入法及び DEAEデキストラン法としては Ting, A. T. et al., EMBO J ., 15, 6189- 6196等に記載される方法、 ミセル形成法としては Hawkins, C. J. e t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13786- 13790等に記載される方法を挙 げることができる。 ミセル形成法を用いる場合には、 リポフエクトァミン （ギブ コ製） やフュージーン （ベーリンガー製） 等の市販の試薬を利用するとよい。 前記プラスミドの導入処理を施した哺乳動物細胞を、 例えば、 当該ベクターに 予め含まれる選抜マーカー遺伝子を利用し、 当該選抜マ一力一遺伝子に応じた選 抜条件の培地で培養することにより、 本形質転換哺乳動物細胞を選抜することが できる。 さらに選抜を続けて、 本転写調節因子遺伝子が染色体に導入されてなる 安定形質転換体となつた本形質転換哺乳動物細胞を取得してもよい。 導入された 本転写調節因子遺伝子が哺乳動物細胞中に存在する染色体上に組込まれたことを 確認するには、 当該細胞のゲノム DNAを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製 し、 本転写調節因子遺伝子の部分塩基配列を有する DNAをプライマーとして用 いる PCRや、 本転写調節因子遺伝子の部分塩基配列を有する DNAをプローブ として用いるサザンハイブリダィゼ一ション等の方法を利用して、 ゲノム DNA 中の本転写調節因子遺伝子の存在を検出 ·確認すればよい。
また、 本形質転換哺乳動物細胞は、 後述する形質転換非ヒト動物から通常の方 法に準じて調製してもよい。
本発明検定方法において、 本転写調節因子依存的一神経細胞可塑化経路上に存 在するマーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測 定する方法としては、 例えば、
(1) 前記マーカ一蛋白質の量を、 当該マーカー蛋白質を特異的に認識する抗体 を用いるラジオィムノアッセィ （R IA) 法、 酵素標識抗体測定法 （Enzyme Lin ked Immunosorbent Assay; EL ISA) 、 ウェスタンブロッテイング等で測定する方 法、
(2) 前記マーカー蛋白質の量と相関関係を有する指標値として、 当該マーカー 蛋白質の mRNAの、 前記哺乳動物細胞内での存在量を測定する方法、
(3) 前記マーカー蛋白質とハイブリダィズして、 当該マーカー蛋白質の mRN Aの量を測定するためのオリゴヌクレオチドが固定されている D N Aアレイ又は DN Aチップを用いて、 当該マーカー蛋白質の発現量を測定する方法、 等をあげることができる。
上記 （2) における mRNAの定量には、 RT— PCR法やノザンハイブリダ ィゼーシヨン等の通常の方法 （例えば、 Sambrook J., Frisch E. F. , Maniatis T.著、 モレキユラ一クローニング第 2版 （Molecular Cloning 2nd edition) 、 コ 一ルド スプリング ハーバー ラポラトリ一発行 （Cold Spring Harbor Labo ratory press) 等に記載されている方法） を用いればよい。
上記のようにして本発明検定方法により測定された、 被験物質として異なる 2 種以上の物質を各々独立して用いた区における、 前記マーカー蛋白質遺伝子の発 現量又はその量と相関関係を有する指標値を比較することにより得られる差異に 基づき前記物質の本神経細胞可塑性制御能力を評価する。 このようにして被験物 質が有する本神経細胞可塑性制御能力の検定を行うことができる。
本発明検定方法において、 前記異なる 2種以上の物質のうち、 少なくとも一つ の物質が本神経細胞可塑性制御能力を有さない物質 （例えば、 溶媒、 パックダラ ンドとなる試験系溶液等であってもよい。 ) とすることで、 他方の被験物質が有 する本神経細胞可塑性制御能力を評価してもよいし、 また前記異なる 2種以上の 物質のうち、 少なくとも一つの物質が有する本神経細胞可塑性制御能力を基準と しながら他方の被験物質が有する本神経細胞可塑性制御能力を評価してもよい。 本転写調節因子における上記マーカー蛋白質の発現量又はその量と相関関係を 有する指標値 （以下、 測定値 1と記す。 ) を、 本転写調節因子と被験物質とを接 触させなかった後の哺乳動物細胞から分泌される上記マーカー蛋白質の発現量又 はその量と相関関係を有する指標値 （以下、 測定値 2と記す。 ） と比較すること によって、 該被験物質の本神経細胞可塑性制御能力を評価してもよい。 この場合 、 本神経細胞可塑性制御能力を、 前記測定値を用いて、 下記の式に従って制御率 として求めるとよい。
制御率 （％) = [ (測定値 1一測定値 2 ) Z測定値 2 ] X 100
本神経細胞可塑性制御能力を有する物質を探索するには、 本発明検定方法によ り評価された本神経細胞可塑性制御能力に基づき本神経細胞可塑性制御能力を有 する物質を選抜すればよい （本発明探索方法） 。
例えば、 被験物質の本神経細胞可塑性制御能力を表わす制御率の絶対値が、 銃 計学的に有意な値を示す物質、 具体的に好ましくは、 例えば、 3 0 %以上を示す 物質、 より好ましくは 5 0 %以上を示す物質を、 本神経細胞可塑性制御能力を有 する物質として選抜する。 ここで当該制御率が正の場合には、 促進的能力を有す る物質として選抜され、 一方、 負の場合には、 抑制的能力を有する物質として選 抜される。
尚、 当該物質は、 本神経細胞可塑性制御能力を有する限り、 低分子化合物、 蛋 白質 （抗体を含む） 又はペプチド等のいかなる物質であってもよい。
本発明探索方法によつて選抜された物質は本神経細胞可塑性制御能力を有して おり、 神経細胞可塑調節剤 （例えば、 認識能力不全改善剤、 精神遅延改善剤等の 治療剤等） の有効成分として使用してもよい。
本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を有効 成分とする神経細胞可塑調節剤 （即ち、 本発明神経細胞可塑調節剤） は、 その有 効量を経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。 例えば、 経口的に投与する場合には、 本発明神経細胞可塑調節剤は錠剤、 カプセ ル剤、 シロップ剤、 懸濁液等の通常の形態で使用することができる。 また、 非経 口的に投与する場合には、 本発明神経細胞可塑調節剤を溶液、 乳剤、 懸濁液等の 通常の液剤の形態で使用することができる。 前記形態の本発明神経細胞可塑調節 剤を非経口的に投与する方法としては、 例えば注射する方法、 坐剤の形で直腸に 投与する方法等を挙げることができる。
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、 陚型剤、 結合剤、 安定剤、 希 釈剤等に本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩 を配合することにより製造することができる。 また注射剤型で用いる場合には、 許容される緩衝剤、 溶解補助剤、 等張剤等を添加することもできる。
投与量は、 投与される哺乳動物の年令、 性別、 体重、 疾患の程度、 動脈硬化病 態増悪因子分泌抑制剤の種類、 投与形態等によって異なるが、 通常は経口の場合 には成人で 1日あたり有効成分量として約 l mg〜約 2 g、 好ましくは有効成分 量として約 5 m g〜約 1 gを投与すればよく、 注射の場合には成人で有効成分量 として約 0 . l m g〜約 5 0 O m gを投与すればよい。 また、 前記の 1日の投与 量を 1回または数回に分けて投与することができる。
尚、 本発明神経細胞可塑調節剤の適用可能と考えられる疾患としては、 老人に よる認識能力不全、 精神遅延、 アルツハイマー病による認識能力不全等の疾患を あげることができる。 本発明は、 前述の如く、 本転写調節因子遺伝子を外来遺伝子として、 哺乳動物 細胞に、 当該細胞で発現する位置に置かれるように提供することによつて哺乳動 物細胞における本転写調節因子依存的一神経細胞可塑化経路上に存在するマーカ 一蛋白質遺伝子の発現を促進するために利用することも提供している。
哺乳動物細胞としては、 ヒト、 サル、 マウス、 ラット、 ハムスター等の哺乳動 物由来の細胞を挙げることができる。 当該細胞は、 組織から分離された細胞や、 同一の機能 ·形態を持つ集団を形成している細胞や、 前記哺乳動物の体内にある 細胞であってもよい。
従って、 哺乳動物がヒトである場合には、 一般にいう遺伝子治療が施されたヒ トから各種実験に使用されるような株化細胞までを意味し、 また哺乳動物が非ヒ ト動物である場合には、 一般にいう遺伝子治療が施された非ヒト動物から各種実 験に使用されるようなモデル動物や株ィ匕細胞までを意味する。 後者の場合には、 ラット、 マウス等を好ましい動物種として挙げることができる。
さらに、 哺乳動物細胞が精神遅延を伴う疾患又はアルツハイマー症に羅患して いると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞である場合をより具体的な例とし てあげることができる。
本転写調節因子遺伝子の調製方法は、 前述に説明されたものと同等な方法に準 じて調製すればよい。
このように調製された D N Aを用いて後述のように形質転換細胞を調製するこ とにより、 当該 D NAが哺乳動物細胞で発現する位置に置かれるように提供され た形質転換細胞を得ることができる。
上記発明において 「発現する位置に置かれた」 とは、 D NA分子が、 その塩基 配列の転写及び翻訳を指向する （即ち、 例えば、 本転写調節因子又はその R NA 分子の産生を促進するような） D N A配列と隣接した位置に置かれていることを 意味する。
本転写調節因子遺伝子の発現レベルは、 本転写調節因子遺伝子が導入されてい ない細胞と比較して前記マーカ一蛋白質遺伝子の発現を促進するために十分であ る量であればよい。 この場合、 本転写調節因子遺伝子は、 本転写調節因子の全体 又は一部をコードする DNAであってもよい。
上記発明において、 本転写調節因子遺伝子がゲノムに組み込まれた形質転換細 胞を作製することにより前記マーカー蛋白質遺伝子を促進してもよい。
上記発明において、 本転写調節因子遺伝子を哺乳動物細胞に導入するために用 いられる遺伝子構築物 （以下、 本遺伝子構築物と記載することもある。 ） 及び遺 伝子移入到達手段としては、 当該 DNAが導入される哺乳動物細胞に対して親和 性を有する、 レトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクタ一、 アデノ関連ゥ ィルスべクタ一又はその他のウィルスベクターを用いるとよい。 例えば、 ミラ一 (Miller), Human Gene Therapy 15〜14， 1990;フリードマン（Friedman), Scienc e 244:1275〜1281， 1989；エダリテイス（Egl i t is)およびアンダーソン（Anderson) , BioTechniques 6:608〜614, 1988;トルストシェフ（Tolstoshev)およびアンダ 一ソン (Anderson) , current opinion in Biotechnology 1;55〜61， 1990;シャー 7° (Sharp), The Lancet 337:1277〜1278, 1991；コルネッタ（Cornetta)ら、 Nucle ic Acid Research and Molecular Biology 36:3U〜322， 1987;アンダーソン（An derson), Science 22 -： 〜 409， 1984;モーン（Moen), Blood Cells 17:407〜41 6, 1991;ミラー（Miller)ら、 Biotec niques 7:980〜990， 1989;Le Gai La Salle ら、 Science 259:988〜990, 1993;およぴジヨンソン（Johnson), Chest 107:77S 〜83S， 1995等に記載される公知のベクタ一をあげることができる。 ローゼンバ ーグ (Rosenberg)ら、 N. Engl. J. Med 323:370, 1990;アンダーソン (Anderson) ら、 米国特許第 5, 399, 346号等に記載されるレトロウィルスベクターは特に開発 が進んでおり、 臨床の場でもすでに使用されている。 例えば、 該細胞が動物細胞 である場合には、 SV40ウィルスプロモータ一、 サイトメガロウィルスプロモ 一夕一 （CMVプロモータ一） 、 Raus Sarcoma Virusプロモータ一 （RSVプロ モータ一） 、 i3ァクチン遺伝子プロモーター、 a P 2遺伝子プロモーター等が挙 げられる。 尚、 このようなプロモーターをマルチクローニング部位の上流に含む 市販のベクターを利用してもよい。
当該 DNAは、 本転写調節因子遺伝子を構成的に発現させるようなプロモータ 一の制御下に置かれていてもよい。 また、 当該 DNAは、 本転写調節因子遺伝子 の発現を環境剌激により調節するようなプロモーターの制御下に置かれていても よい。 例えば、 当該 D NAは、 組織特異的もしくは細胞型特異的なプロモーター 、 又は化学的信号もしくは薬物等の外来性の信号もしくは薬物の導入により活性 化されるプロモータ一を用いて発現させてもよい。
また、 非ウィルス的手法も用いることができる。 例えば、 フェルダナ一 (Feign er)ら、 Proc. Nat l . Acad. Sc i. USA 84: 7413, 1987 ;オノ（Ono)ら、 eurosc i. L et t. 117 : 259, 1990 ;ブライアム（Brigham)ら、 Am. J. Med. Sc i . 298 : 278, 1989 ；シュタウビンガー（Staubinger)ら、 Meth. Enz. 101 : 512, 1983) 、 ァシァロソ ヌコイド ·ポリリジン抱合 （ウー (Wu)ら、 J. Biol . Chem. 263 : 14621, 1988 ;ゥ — (Wu)ら、 J. Biol. Chem. 264: 16985, 1989等に記載されるリポフエクシヨン、 ゥオルフ（Wol f f)ら、 Science 247: 1465, 1990等に記載されるマイクロインジェ クシヨン、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、 エレクトロボレ一シヨン 法及びプロトプラス卜融合法、 リボソーム法等があげられれる。
上記の適用手段のいずれについても、 本遺伝子構築物は、 前記マ一カー蛋白質 遺伝子の過少発現が予想される部位に対して適用される （例えば、 注入によって ) ことがよいが、 前記マーカ一蛋白質遺伝子の過少発現等の現象が予想される部 位の近傍の組織又は前記マーカー蛋白質遺伝子の過少発現が起こると予想される 細胞に供給される血管に対してそれを適用してもよい。
本遺伝子構築物において、 本転写調節因子遺伝子 （ cDNA) の発現は、 任意の 適したプロモーターにより指向させることができ （例えば、 ヒト ·サイトメガロ ウィルス （CMV) 、 シミアンウィルス 40 (SV40) 又はメタ口チォネインのプロモ 一ター等） 、 任意の適切な哺乳動物調節要素によって調節することもできる。 例 えば、 必要に応じて、 本転写調節因子遺伝子を発現させるために、 神経細胞にお ける D N Aの発現を優先的に指向することが知られるェンハンサーを用いてもよ レ^ 当該ェンハンサ一には、 その発現が組織又は細胞に特異的であると特徴づけ られたものを無制限に含む。 また、 本転写調節因子遺伝子 （ゲノム） のクローン を遺伝子構築物として用いる場合 （例えば、 上記の本転写調節因子遺伝子 （ cDN A) とのハイブリダィゼ一シヨンにより単離された本転写調節因子遺伝子 （ゲノ ム） のクローン） には、 コグネイト調節配列、 必要に応じて、 上記の任意のプロ モーター又は調節要素を含む異種供給源に由来する調節配列を介して調節するこ ともできる。 ；
上記発明を遺伝子治療の手段として応用する場合には、 本転写調節因子遺伝子 の細胞内への直接投与によって実施される。 用いられる遺伝子は、 いかなる標準 的手法により作製及び単離されたものであってもよいが、 高効率プロモーター （ 例えば、 ヒトサイトメガロウィルスプロモータ一） の制御下にある本転写調節因 子遺伝子を用いるインビポ転写によって最も容易に産生させることができる。 本 転写調節因子遺伝子の細胞内への投与は、 上記の直接的な核酸投与の方法のいず れによっても実施することができる。
上記発明は、 患者の罹患細胞に対する正常な遺伝子の移植という遺伝子治療の 手段として応用することもできる。 当該手段では、 患者にとって外因性又は内因 性のいずれかである培養可能な細胞に対して正常な本転写調節因子遺伝子をトラ ンスフエクシヨンする。 次いで、 トランスフエクシヨンされた細胞を血清学的に 標的組織に対して注入する。
理想的には、 あらゆる遺伝子治療の手法による本転写調節因子の産生は、 少な くとも非罹患細胞における正常な本転写調節因子の細胞内レベルと等しい、 本転 写調節因子遺伝子の細胞内レベルをもたらす。
以下に、 一例として、 哺乳動物が形質転換マウスである場合の上記発明につい てより詳細に説明する。
形質転換マウスの作製における本転写調節因子遺伝子の導入法としては、 例え ば、 マイクロインジェクション法、 レトロウイルスを用いる方法、 胚性未分化細 胞 （E S細胞） を用いる方法等を挙げることができる。 このうち、 マイクロイン ジェクシヨン法が最も汎用されている。 マイクロインジェクション法とは、 マイ クロマニピュレータ一を用いて、 顕微鏡下で受精卵の前核内部に当該 D NAを含 んだ溶液を注入する方法である。
まず、 本転写調節因子遺伝子を受精卵に注入する。 その際、 当該 D NAを高い 確率で染色体へ組込むためには、 当該 D N Aの単離に用いたベクター領域を可能 な限り除去すること、 mRNAの不安定化に寄与する AUに富む領域を除くこと 、 直鎖状にすることが好ましい。 また、 当該 DN Aに対してイントロンを予め揷 入しておくことが好ましく、 当該イントロンとしては、 例えば、 i3_グロビンィ ントロン等を挙げることができる。
受精卵は、 目的に応じた系統のマウスから採取する。 近交系の C 57BLZ6 マウスや C 3 Hマウス、 あるいは C 57 BL/ 6マウスと他系統のマウスとの交 雑系 （例えば、 （C57BL/6XDBAZ2) F1等） 、 非近交系の I CRマ ウスが挙げられる。 受精卵は、 通常、 妊馬血清ゴナドトロピンとヒト絨毛性ゴナ ドトロピンとの両者の腹腔内投与により過剰排卵を誘発させた雌マウスと雄マウ スとを交尾させた後、 前記雌マウスから採取する。 尚、 採取した受精卵は培養用 ドロップに入れ、 C〇2ガスインキュベーターで培養 ·維持することにより、 当 該 DN Aの注入操作まで保管することができる。
当該 DNAの注入はマイクロマニピユレ一夕一をセットした倒立顕微鏡下で行 なう。 用いられる受精卵としては、 雄性前核が雌性前核より大きくなる頃から両 前核が融合するまでの発達段階にあるものを用いるとよい。 まず受精卵を固定し 、 当該受精卵の雄性前核内に当該 DNAを含有する DNA溶液を注入する。 当該 DNA溶液は必要に応じて複合体として調製する。 複合体形成に用いられる物質 としては、 リボソーム、 リン酸カルシウム、 レトロウイルス等を挙げることがで きる。 DNA溶液の注入は雄性前核が膨らむことにより確認できる。 DNA注入 量としては、 例えば、 約 200〜約 3， 000コピーの当該 DNAを含む量を挙 げることができる。
このようにして、 本転写調節因子遺伝子が注入された受精卵は胚盤胞になるま で前記と同様にして培養した後、 仮親の子宮に移植する。 好ましくは当該 DNA の注入操作後ただちに仮親の卵管に移植するとよい。 仮親としては、 精管切断手 術を施した雄マウスと交尾させて偽妊娠状態にした雌マウスを用いるとよい。 具 体的には、 まず当該雌マウス背側の腎臓付近の皮膚と筋層を切開して卵巣 ·卵管 •子宮を引き出し、 卵巣膜を破いて卵管口を探し出す。 次いで当該 DNAの注入 操作後に生き残った受精卵を該卵管口から移入し、 卵巣 ·卵管 ·子宮を腹腔内に 戻した後、 筋層を縫合し、 皮膚をクリップでとめる。 約 20日後に仔が生まれる 得られた仔の体組織の一部、 例えば尾の一部、 を切り取り、 当該部位から抽出 された DN Aのサザンブロッティング等により当該 DN Aの存在有無を確認する 。 このようにして、 当該 DN Aが非ヒト動物に導入されたことを確認できる。 あ るいは他の方法、 例えば P CRなどの確認方法を利用してもよい。
本転写調節因子遺伝子治療剤の有効成分となる、 本転写調節因子遺伝子は、 前 述の如く調製すればよいが、 例えば、 当該 DNAを含有する組換えべクタ一又は 組換えウィルス等の形態で使用されることもある。 このような形態では、 例えば 、 レトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクタ一、 アデノ関連性ベクター、 単純へルぺスウィルスベクター、 SV40ベクター、 ポリオ一マウィルスベクタ 一、 乳頭腫ウィルスベクタ一、 ピコルナウィルスベクタ一及びワクシニアウィル スベクター等のウィルスベクターをあげることができる。 さらに、 アデノウィル スベクターを使用する場合には、 例えば QUANTUM社製の Ad E a s y K i tを用い、 本転写調節因子遺伝子を T r an s f e r Ve c t o rのマルチ クローニングサイトに組み込み、 得られた組換えベクターを直線化した後に、 p AdEa s y v e c t o rと共に大腸菌にトランスフォームし、 相同組換え体 DNAをヒト 293A細胞に組み込むことにより、 本転写調節因子遺伝子を含有 する組換えウィルスを産生させ、 これを回収し、 使用することもできる。
また、 ヒトサイトメガウィルスのプロモーター領域を有するプラスミド DNA 等のような非ウィルス系のベクタ一を用いることもできる。 本転写調節因子遺伝 子を線維化組織部位に直接注入する場合のように、 非ウィルスベクタ一を用いて 本転写調節因子遺伝子を局所的に送達するシステムにおいては、 プラスミド DN Aの使用は極めて有益である。 体外に取り出された細胞に発現べクターを導入し て体内に戻す方法、 すなわち、 e x v i vo法を使えば、 あらゆる既知の導入 方法が利用可能である。 例えば、 a) 直接注入、 b) リボソームを介する形質導 入、 c) リン酸カルシウム法 ·エレクト口ポレーシヨン法 · DEAE—デキスト ラン法による細胞トランスフエクシヨン、 d) ポリプレンを介した送達、 e) プ ロトプラスト融合、 f ) マイクロインジェクション、 g ) ポリリシンを使った形 質導入などによって、 非ウィルスベクターを導入することができる。
本転写調節因子遺伝子治療剤は、 その有効量を非経口的にヒ卜等の哺乳動物に 対し投与することができる。 例えば、 非経口的に投与する方法としては、 例えば 、 上述のような注射 （皮下、 静脈内等） 等を挙げることができる。 前記の適当な 投与剤型は薬学的に許容される、 例えば、 水溶性溶剤、 非水溶性溶剤、 緩衝剤、 溶解補助剤、 等張剤、 安定剤等の担体に本転写調節因子遺伝子 （ベクタ一型もし くはウィルス型、 又はプラスミド型の本転写調節因子遺伝子の形態を含む） を配 合することにより製造することができる。 必要に応じて、 防腐剤、 懸濁化剤、 乳 化剤等の補助剤を添加してもよい。
投与量は、 投与される哺乳動物の年令、 性別、 体重、 疾患の程度、 脂肪蓄積抑 制剤の種類、 投与形態等によって異なるが、 通常は、 患者細胞において本転写調 節因子が細胞内で有効に働くような濃度レベルと等しい、 本転写調節因子の細胞 内レベルをもたらす有効成分量を投与すればよい。 また、 前記の 1日の投与量を 1回または数回に分けて投与することができる。 実施例
以下に本発明を実施例で説明するが、 本発明はこれらに限定されるものではな い。
実施例 1 (本転写調節因子遺伝子が含有されてなるベクターである pGEM-mMF の調製）
配歹番^ " 7 agcacggag gaggaagccg ccggtgcgtc gggac) 及び 8 (ggagagcggc tccacgtc t t gatgacaata tgcca) で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド をそれぞれ DNA合成機 （アプライドバイオシステムズ社製モデル 394) を用いて合 成した。 铸型として、 マウス Brain cDMライブラリー （# 10655— 017ギブコ BRL 社製） 10 ngを铸型として、 かつ、 前記ポリヌクレオチドをプライマーとして PCR を行った。 当該 P C Rにおいて、 反応液 5 0 1当たり上記のポリヌクレオチド lOpmolを添加し、 LA- Taqポリメラーゼ （宝酒造社製） 及び当該酵素を含むキット に添付されたバッファ一を用いた。 PCR反応液の保温は、 PCRsys tem9700 (ァプラ イドバイオシステムズ社製） を用いて、 95 1分間次いで 68°C3分間の保温を 1サ ィクルとしてこれを 35サイクルで行われた。
次いで、 PCR反応液の全量を、 低融点ァガロースゲル電気泳動 （ァガロース L： 二ツボンジーン） に供した。 約 2. 5kbの D N Aの単一バンドを確認した後、 当該！） NAを回収した。 回収された D NAの一部とダイターミネータ一シークェンスキッ ト FS (アプライドバイオシステムズ社製） とを用いてダイレクトシークェンス用 のサンプルを調製し、 これを、 オートシークェンサ一 （アプライドバイオシステ ムズ社製、 モデル 3700).を用いたダイレクト塩基配列解析に供した。
次に、 上記のようにして回収された DM i UL g ) と pGEM T easyベクター （ プロメガ社製） （10ng) とを混合し、 この混合物に T4 DNAリガ一ゼを添加して反 応させることにより、 pGEM- mNXFを得た。 得られた pGEM- mNXFの塩基配列を ABIモ デル 3700型オートシークェンサ一を用いてダイターミネータ一法で決定した。 決 定された塩基配列を、 前記のダイレクトシークェンスで得られた塩基配列と比較 して、 翻訳領域の塩基配列が完全に一致していることを確認した。 実施例 2 (pRC/RSV-mNXFsense及び pRC/RSV- mNXFant i senseの調製）
次に、 哺乳動物細胞内において本転写調節因子の全長を発現させるためのブラ スミド （以下、 本発現プラスミドと記すこともある。 ） は、 以下のようにして作 製した。
まず、 実施例 1で得られた pGEM- mNXFのマルチクローニングサイトに対する挿 入断片の方向性は、 開始コドンの上流に市販の pGEMベクタ一の Sp6プロモータ一 が位置するように構築されていた。 そこでこの pGEM-mNXF (l ^ ) を铸型にして 、 かつ、 配列番号 1 1及び 1 2で示されるオリゴヌクレオチドをプライマ一 （プ ライマ一対：フォワードフライマー 5 -gggcgc tgcagcccagccaccatgt accgat cca ccaaggg- 3 '、 リバースプライマー 5 ' - aat c tcggcgt tgat c tggt-3 ' ) として、 K ODp l usポリメラ一ゼ （T0Y0B0社製） を用いた PCR反応を行うことにより、本転写調 節因子遺伝子の開始コドンの直前にコザック配列 （5' -CCAGCCACC- 3' ) とその上 流に Pstl制限酵素部位とが導入された本転写調節因子遺伝子の部分 DNA断片を 得た。
尚、 PCR反応条件は、 95 1分、 55°C30秒、 72°C 1分を 1サイクルとして 35サ ィクルであった。
このようにして得られた増幅 DNA断片を、 Pstlと BssHIIとで切断した後、 低 融点ァガロースゲル電気泳動 （NusieveGTGァガロース； FMCbio社製） に供するこ とにより精製 ·回収した。 精製 ·回収された DNA断片を下記で用いるインサー ト断片とした。 次に、 ベクターとして pGEM- mNXFを Pstlと BssHIIとで切断した後 B AP処理したものを低融点ァガロースゲル電気泳動 （AgaroseL；二ツボンジーン社 製） に供することにより、 DN A断片を回収した。 回収された DNA断片 （0.1 g) に上記のインサート断片 （0.5/zg) を T4 Ligaseで結合させることにより、 マウス由来の本蛋白質遺伝子の開始コドン直前にコザック配列 （5' - CCAGCCACC - 3 ') が導入されている pGEM- iiiMFコザックを作製した。 インサート断片の塩基配列 が正しいことを DNAシークェンサ一 （モデル 3700 ; PE biosystems社製） を用いて 確認した。
次に、 この pGEM-mNXFコザックを Pstl、 Notl及び Sealの 3者で同時に切断した 後、 これを低融点ァガロース電気泳動に供することにより、 約 2.5kbpの mMFコザ ック Pstl- Notlの DNA断片を回収した。 そして、 回収された DNA断片が Τ4ポ リメラーゼを用いて平滑末端化されたものをインサート断片とした。 RSVプロモ 一夕一を保有する pRC/RSV (Invitorgen社製） を Hindi IIで切断した後 T4ポリメラ —ゼで平滑末端化したものを BAP処理し、 これをべクタ一とした。 このべクタ一 (0. l^g) に前記インサート断片 （0.5/zg) を T4 Ligaseで結合させることによ り、 （a) RSVプロモ一夕一の制御下に mNXFコザックのセンス鎖が発現するブラ スミドである pRC/RSV- mNXFsense、 及び （2) RSVプロモーターの制御下に mNXFコ ザックのアンチセンス鎖が発現するプラスミドである pRC/RSV- mNXFan ti s ens eを 作製した。 尚、 作製されたプラスミドが所望のプラスミドであることを、 ベクタ 一と挿入断片との境界の塩基配列を調べることにより確認した。 実施例 3 (本転写調節因子による EphAlの発現促進）
まず、 約 1 X 1 07の SK- N-MC細胞 （ATCC Νο.ΗΤΒΙΟ；大日本製薬より購入した ) を、 10%FBSを含む DMEM培地 （日水製薬製） を用いて 37 にて 5% C〇2存在下に、 直径約 10 cmのシャーレ （ファルコン社製） を用いて培養し た。 翌日、 培養された細胞をトリプシン処理により分散し、 FBSを含まない DMEM 培地で 2回洗浄した後、再度 1 X 107に細胞密度がなるように FBSを含まない DM EM培地に分散した。 この細胞分散液 0.4mlに、 実施例 2で作製された本発現プ ラスミド （ （a) pRC/RSV-mNXFsense, 又は （b) pRC/RSV-mNXFanti sense) 10 gを混合した後、 この混合物をエレクトロボレ一シヨン用キュベットに移し、 Ge neパルサ一 （BI0RAD社製） を用いたエレクト口ポレーシヨン法により 200V、 950 の条件でトランスフエクシヨンを行った。 トランスフエクシヨン後、 培地を 10 %FB Sを含む DMEM培地に置換してさらに 10cmシャーレ内で約 24時間 培養した。 培養後、 シャーレ 5枚の細胞を材料にして、 市販の RNA精製及び放射能 ラベル用市販キットである、 Atlas Pure Total RNA Labeling system (K1038-1 ；クロンテック社製） を用いて DNAfreeの totalRNAを精製した。 RNA収量は、 （a ) のプラスミド （即ち、 RC/RSV-mNXFsense) を用いた場合には 23 gであり、 また （b) のプラスミド （即ち、 pRC/RSV_mNXFanti sense) を用いた場合には 26 gであつすこ。 次に、 上記市販キットと得られた RNAとを材料にして、上記巿販キ ットに含まれる特異的プライマー及び逆転写酵素により [ひ -P32] -dATP (アマシ ャムフアルマシア社製） でそれぞれの RNAを放射能ラベルした。 次に、 放射ラベ ルされた RNA (以下、 プローブと記す。 ） を上記市販キットを用いて精製した 後、 この精製された RN Aを 1.3x10s DPMになるように量を調製し、 以下のハイ ブリダィゼ一シヨン反応に使用した。 ハイブリダィゼーシヨン反応は、 種々の遺 伝子がナイロン膜上にプロットされている市販のキット （AUas cDNA Express i on array- Neurobiology ； 7736-1 クロンテック社製） 及び付属ハイブリダィゼ ーションバッファーを用いて行われた。 ハイブリダイゼーション反応の条件は、
(a) pRC/RSV- mNXFsense導入細胞由来のプローブに対応するナイロン膜、 及び、
( b ) pRC/RSV-mNXFan t i s ens e導入細胞由来のプローブに対応するナイ口ン膜、 をそれぞれ同じィンキュベータ内で全く同一条件のもとでの 18時間反応であつ た。 反応後、 ナイロン膜を 2XSSC、 1%SDSバッファーで洗浄 （68°C、 30分） した 。 これを 4回繰り返した後、 更に 0.1XSS 0.5%SDSバッファーで洗浄 （68 、 30 分） した。 それぞれのナイロン膜をプラスチックラップに包み、 IPプレート （富 士フィルム社製） に 7日間感光させたのち、ィメ一ジングアナライザ一 （BASstati on ;富士フィルム社製） でナイロン膜上の種々の遺伝子に対応するプローブノ、ィ プリダイゼーションシグナルの強度の定量と比較を行った。
その結果、 EphAl遺伝子に対して、 （a) pRC/RSV- mMFsense導入細胞由来のプ ローブに対応するナイ口ン膜上のハイプリダイゼ一ションシグナルが、 （b) RC /RSV_mNXFantisense導入細胞由来のプローブに対応するナイロン膜上のハイブリ ダイゼーシヨンシグナルよりも有意に強いシグナルを示した。 このように本転写 調節因子には、 EphAlの発現を促進する能力が存在することが確認できた。 実施例 4 (本転写調節因子による Rho GDP dissociation inhibitorの発現抑制 )
まず、 約 1 X 107の SK-N- MC細胞 （ATCC Νο.ΗΤΒΙΟ；大日本製薬より購入した ) を、 10%FBSを含む DMEM培地 （日水製薬製） を用いて 37°Cにて 5% C〇2存在下に、 直径約 10 cmのシャーレ （ファルコン社製） を用いて培養し た。 翌日、 培養された細胞をトリプシン処理により分散し、 FBSを含まない DMEM 培地で 2回洗浄した後、再度 1 X 107に細胞密度がなるように FBSを含まない DM EM培地に分散した。 この細胞分散液 0.4m Uこ、 実施例 2で作製された本発現プ ラスミド （ （a) pRC/RSV-mNXF sense, 又は （b) pRC/RSV-mNXFanti sense) 10 gを混合した後、 この混合物をエレクト口ポレーシヨン用キュベットに移し、 Ge neパルサ一 （BI0RAD社製） を用いたエレクト口ポレーシヨン法により 200V、 950 t Fの条件でトランスフエクションを行つた。 トランスフエクシヨン後、 培地を 10 %FB Sを含む DMEM培地に交換してさらに 10 cmシャーレ内で約 24時間 培養した。 培養後、 シャーレ 5枚の細胞をそれぞれ材料にして、 市販の RNA精製及 び放射能ラベル用巿販キットである、 Atlas Pure Total RNA Labeling system ( K1038- 1；クロンテック社製） を用いて DNAfreeの totalRNAを精製した。 RNA収量 は、 （a) のプラスミド （即ち、 pRC/RSV-mMFsense) を用いた場合には 23 g であり、 また （b) のプラスミド （即ち、 pRC/RSV- mMF ant ί sense) を用いた場 合には 26 gであった。 次に、 上記市販キットと得られた RNAとを材料にして、上 記市販キットに含まれる特異的プライマー及び逆転写酵素により [α-P32] -dATP
(アマシャムフアルマシア社製） でそれぞれの RMを放射能ラベルした。 次に、 放射ラベルされた RNA (以下、 プローブと記す。 ） を上記市販キットを用いて 精製した後、 この精製された RNAを 1.3xl05 DPMになるように量を調製し、 以 下のハイブリダィゼ一シヨン反応に使用した。 ハイブリダィゼーシヨン反応は、 種々の遺伝子がナイロン膜上にプロットされている市販のキット （Atlas cDNA Expression array- Neurobiology ； 7736-1 クロンテック社製） 及び付属ハイブ リダィゼ一ションバッファーを用いて行われた。 ハイブリダィゼーション反応の 条件は、 （a) pRC/RSV-mNXFsense導入細胞由来のプローブに対応するナイ口ン 膜、 及び、 （b) pRC/RSV- mNXFantisense導入細胞由来のプローブに対応するナイ ロン膜、 をそれぞれ同じインキュベータ内で全く同一条件のもとでの 18時間反 応であった。 反応後、 ナイロン膜を 2XSS 1%SDSバッファーで洗浄 （68°C、 30 分） した。 これを 4回繰り返した後、 更に 0.1XSS (；、 0.5%SDSバッファ一で洗浄 ( 68°C、 30分） した。 それぞれのナイロン膜をプラスチックラップに包み、 IPプレ —ト （富士フィルム社製） に 7日間感光させたのち、イメージングアナライザー （ BASstation；富士フィルム社製） でナイロン膜上の種々の遺伝子に対応するプロ ーブハイプリダイゼーションシグナルの強度の定量と比較を行った。
その結果、 Rho GDP dissociation inhibitor遺伝子に対して、 (a) pRC/RSV- mMFsense導入細胞由来のプローブに対応するナイロン膜上のハイプリダイゼー ションシグナルが、 (b) pRC/RSV_mNXFanti sense導入細胞由来のプローブに対応 するナイロン膜上のハイブリダィゼーシヨンシグナルよりも有意に弱いシグナル を示した。 このように本転写調節因子には、 Rho GDP dissociation inhibitorの 発現を抑制する能力が存在することが確認できた。 実施例 5 (本発明検定方法）
実施例 2で調製された pRC/RSV- mMFsense導入細胞を、 10 % F B Sを含む D MEM培地 （日水製薬製） を用いて 37°Cにて 5%C02存在下に、 直径約 10 cmのシャーレ （ファルコン社製） を用いて培養した。 翌日、 培養された細胞を トリプシン処理により分散し、 FBSを含まない D M E M培地で 2回洗浄した後、 再度 DMEM培地に分散する。
次に、 分散させた細胞を、 （a) DMS0のみを添加した培養液、 又は （b) DMS0 で種々の濃度に溶解した被験物質を添加した培養液、 を予め加えておいた 6穴プ レートに 106個ノウエルの割合で播種する。 このプレート内で当該細胞を 37 °Cで約 24時間培養した後、 プレートから培養液を除き PBS (-)で細胞を洗浄し、 Isogen (二ツボンジーン社製） を用いてそれぞれの穴から total RNAを抽出する このようにして抽出された total RNAを材料にして、 oligodT
ルマシア社製） 及び Reverse transcriptase (ス一パ一スクリプト II、 ギブコ社 製等） を用いて一本鎖 cDNAを作製する。 次にこの一本鎖 cDMを铸型として LA-Taq (夕カラ社製） 、 並びに、 下記のフアワードプライマ一 （配列番号 13〜17) と下記のリバースプライマー （配列番号 18〜22) との組み合わせにより PCR を行なう。
<フォワードプライマー例 >
b -agtgaacagcaacagatact-3' (配列番号 13 )
b -gcttcccgcgtccacgtgga-3' (配列番号 14)
b -gatgtgggcat tcagctccg-3 (配列番号 1 5)
5' -cagagc t tcaccat t cgaga-3' (配列番号 16)
5' -gtggccctggigtctgtccg-3' (配列番号 17)
<リバースプライマー例 >
b -ctggcccgcgcgtggggcaa-3' (配列番号 18) 5' -acacatgcttcgccactgcc-3' (配列番号 19)
5' -taatggccgctctcacaggt-3' (配列番号 20)
5' -age tgagt ccc tgaggc ga-3' (配列番号 21)
5' -tgtgctgtgccctgacactg-3' (配列番号 22)
PCRの条件は、 95°C、 1分、 68° (：、 1分を 1サイクルとして 30サイク ルである。 このようにして total RNA中に存在する E p h A 1の mRNAの量 を算出し、 DMS0のみを添加した培養液を用いて培養された細胞から抽出された to talRNA中の E p A 1の mRNAの量と種々の被験物質を添加した培養液 を用いて培養された細胞から抽出される RNA中の E p h A 1の mRNAの量 とを比較することにより、 被験物質が有する、 本転写調節因子に依存的な神経細 胞可塑性を制御する能力を検定 ·評価する。 その結果に基づき所望の物質を選抜 する。
同様にして、 下記のフアワードプライマ一 （配列番号 23〜27) と下記のリ バースプライマ一 （配列番号 28〜32) との組み合わせにより PCRを行う。
<フォワードプライマー例 >
¾ -t tgcagcggagaacgaggag-3' (配列番号 23)
b -ga t gage actcggtcaacta-3 (配列番号 24)
5' -gc a t c c aggaga t c c aggag-3 ' (配列番号 25)
5' -ctggacaaggacgacgagag-3' (配列番号 26)
5' -cc tgcgaaagt acaaggagg-3' (配列番号 27)
<リバースプライマー例 >
¾ -cctaccatgtagtcagtctt-3 (配列番号 28)
¾ -ggtcaggaactcgtactcct-3 (配列番号 29)
b -ttgggtgcctcctccacggg-3' (配列番号 30)
5' -gcgggacttgatgctgtagc-3' (配列番号 31) 5'-gtcttgtcgtcgtctgtgaa-3' (配列番号 32) このようにして、 total RNA中の Rho GDP dissociation inhibitorの mRNA の量を算出し、 DMSOのみを添加した培養液を用いて培養された細胞から抽出され た totalRNA中の Rho GDP dissociation inhibitorの mRNAの量と、 種々の 被験物質を添加した培養液を用いて培養された細胞から抽出された totalRNA 中の Rho GDP dissociation inhibitorの mRNAの量とを比較することにより、 被験物質が有する、 本転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を制御する能力を 検定 ·評価する。 その結果に基づき所望の物質を選抜する。 産業上の利用可能性
本発明により、 哺乳動物細胞における神経細胞可塑性を制御するために使われ る物質を探索するために必須となる、 神経細胞可塑性を制御する能力を検定する 方法等が提供可能となった。
[配列表フリーテキスト]
配列番号 7
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 配列番号 8
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 9
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 配列番号 10
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 11
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 12
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 13
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 14
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 配列番号 15
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 配列番号 16
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 17
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 18
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 19
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 20 遺伝子を増幅するために設計:されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 21
遺伝子を増幅するために設 H計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 22
遺伝子を増幅するために設計:されたォリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 23
遺伝子を増幅するために設 H計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 配列番号 24
遺伝子を増幅するために設 Ϊ殳計されたォリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 25
遺伝子を増幅するために設 I計Iされたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 26
遺伝子を増幅するために設 ： H計されたォリゴヌクレオチドプライマ一 配列番号 27
遺伝子を増幅するために設設 I計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 28
遺伝子を増幅するために設設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 29
遺伝子を増幅するために設計:されたォリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 30
遺伝子を増幅するために設 H計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 31
遺伝子を増幅するために設殳 Ϊ計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 配列番号 32
遺伝子を増幅するために設 ϋ計されたオリゴヌクレオチドプライマ一

Claims

請求の範囲
1 . 下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子に依存 的な神経細胞可塑性を制御する能力の検定方法であって、
( 1 ) 前記転写調節因子を発現する哺乳動物細胞に被験物質を接触させる第一ェ 程、 及び
( 2 ) 前記第一工程後に、 前記哺乳動物細胞において前記転写調節因子依存的一 神経細胞可塑化経路上に存在するマーカ一蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相 関関係を有する指標値を測定する第二工程、 及び
( 3 ) 第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に 基づき前記被験物質が有する前記能力を評価する工程、
を有することを特徴とする検定方法。
<アミノ酸配列群 >
( a ) 配列番号 1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列、
( b ) 配列番号 1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の アミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のァ ミノ酸配列、
( c ) 配列番号 4で示される塩基配列の塩基番号 1 0 2〜2 5 0 7で表される塩 基配列からなる D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A にコードされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸 配列、
( d ) 配列番号 5で示される塩基配列の塩基番号 5 1〜2 4 5 6で表される塩基 配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aに コードされるアミノ酸配列を有し、 力つ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配 列、
( e ) 配列番号 6で示される塩基配列の塩基番号 3 5〜 2 4 4 0で表される塩基 配列からなる D NAとストリンジェントな条件下で八ィブリダイズする D N Aに コードされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配 列
2 . 下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子に依存 的な神経細胞可塑性を制御する能力の検定方法であつて、
( 1 ) 前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が導入されてなる 形質転換哺乳動物細胞に被験物質を接触させる第一工程、 及び
( 2 ) 前記第一工程後に、 前記形質転換哺乳動物細胞において前記転写調節因子 依存的一神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現量又はそ の量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、 及び
( 3 ) 第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に 基づき前記被験物質が有する前記能力を評価する工程、
を有することを特徴とする検定方法。
<アミノ酸配列群 >
( a ) 配列番号 1〜 3のいずれかで示されるアミノ酸配列、
( b ) 配列番号 1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の アミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のァ ミノ酸配列、
( c ) 配列番号 4で示される塩基配列の塩基番号 1 0 2〜2 5 0 7で表される塩 基配列からなる D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A にコ一ドされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸 配列、
( d ) 配列番号 5で示される塩基配列の塩基番号 5 1〜2 4 5 6で表される塩基 配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハイプリダイズする D N Aに コ一ドされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配 列。 ·
( e ) 配列番号 6で示される塩基配列の塩基番号 3 5〜 2 4 4 0で表される塩基 配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aに コードされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配 列
3 . 前記マーカー蛋白質遺伝子が、 Eph Aレセプ夕一遺伝子又は R ho GDP di ssociat ion inhibi tor遺伝子であることを特徴とする請求項 1又は 2 記載の検定方法。
4. 前記マー'カー蛋白質遺伝子が、 Eph Aレセプター遺伝子及び R ho GDP dissoc iat ion inhibi tor遺伝子であることを特徴とする請求項 1又は 2 記載'の検定方法。
5 . 被験物質として異なる 2種以上の物質を各々独立して用いた 区における、 マ一カー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標 値を比較することにより得られる差異に基づき前記被験物質が有する前記能力を 評価することを特徴とする請求項 1又は 2記載の検定方法。
6 . 異なる 2種以上の物質のうち、 少なくとも一つの物質が前記 能力を有さない物質であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の検定方法。
7 . 下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子に依存 的な神経細胞可塑性を制御する能力を有する物質の探索方法であって、 請求項 1 又は 2記載の検定方法により評価された前記能力に基づき前記能力を有する物質 を選抜することを特徴とする探索方法。
<アミノ酸配列群 >
( a ) 配列番号 1〜 3のいずれかで示されるァミノ酸配列、
( b ) 配列番号 1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の アミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のァ ミノ酸配列、
( c ) 配列番号 4で示される塩基配列の塩基番号 1 0 2〜2 5 0 7で表される塩 基配列からなる D NAとストリンジエンドな条件下でハイブリダイズする D N A にコードされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸 配列、
( d) 配列番号 5で示される塩基配列の塩基番号 5 1〜2 4 5 6で表される塩基 配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aに コードされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配 列。
( e ) 配列番号 6で示される塩基配列の塩基番号 3 5〜2 4 4 0で表される塩基 配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aに コ一ドされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配 列
8 . 請求項 7記載の探索方法により選抜された物質またはその薬 学的に許容される塩を有効成分として含み、 該有効成分が薬学的に許容される担 体に製剤化されてなることを特徴とする神経細胞可塑調節剤。
9 . 哺乳動物細胞における神経細胞可塑性を制御するための、 下 記のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の使用。 <アミノ酸配列群 >
( a ) 配列番号；！〜 3のいずれかで示されるァミノ酸配列、
( b ) 配列番号 1〜 3のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の アミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のァ ミノ酸配列、
( c ) 配列番号 4で示される塩基配列の塩基番号 1 0 2〜2 5 0 7で表される塩 基配列からなる D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A にコ一ドされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸 配列、
( d ) 配列番号 5で示される塩基配列の塩基番号 5 1〜2 4 5 6で表される塩基 配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aに コードされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配 列、
( e ) 配列番号 6で示される塩基配列の塩基番号 3 5〜2 4 4 0で表される塩基 配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aに コードされるアミノ酸配列を有し、 力、つ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配 列
1 0 . 外来遺伝子が哺乳動物細胞で発現する位置に置かれるよう に提供することによって前記細胞における下記のいずれかのアミノ酸配列を有す る転写調節因子依存的一神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子 の発現を促進するための、 外来遺伝子として、 下記のいずれかのアミノ酸配列を コ一ドする塩基配列を有する遺伝子の使用。
<アミノ酸配列群 >
( a ) 配列番号 1〜 3のいずれかで示されるァミノ酸配列、
( b ) 配列番号 1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の アミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のァ ミノ酸配列、
( c ) 配列番号 4で示される塩基配列の塩基番号 1 0 2〜2 5 0 7で表される塩 基配列からなる D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A にコードされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸 配列、
( d ) 配列番号 5で示される塩基配列の塩基番号 5 1〜2 4 5 6で表される塩基 配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aに コードされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配 列、
( e ) 配列番号 6で示される塩基配列の塩基番号 3 5〜2 4 4 0で表される塩基 配列からなる D NAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズする D N Aに コ一ドされるアミノ酸配列を有し、 かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配 列
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