WO2002046355A1 - Unite cupulaire pour detecter la chimiotaxie cellulaire et separer les cellules chimiotactiques - Google Patents

Description

明

細胞走化性検出及び走化細胞分 離装置のた めの ゥエルユエ ッ ト

技 術 分 野

本発明 は、 細胞が 自 力 で一定の方向 に移動す る か否か の判定、 細胞が 自 力 で一定の方向 に移動す る 状態の観察 糸田

或レヽ は一定の方向 に 自 力 で移動 した細胞の数を計数する た め の装置、 即 ち、 細胞走化性検出装置、 更に は、 細胞 が選択的 に 自 力で一定の方向 に移動する こ と を利用する 細胞の分離装置において用 い られる ゥエルュニ ッ ト に関 'わ る 。

背 景 技 術

細胞の走化性を in vitro で検出する装置 と してボイ ア ン チ ェ ンバーが使用 さ れて き た。 これは、 細胞が通過 でき る 大 き さ の穴 (直径 3 〜 8 μ ιη ) 力 S あレヽ て レ、 る フ ィ ル タ ー で上室 と 下室 と に 2 分 さ れた構造を有 し、 上室に 細胞浮遊液を、 下室に走化性因子 を含む検体溶液を入れ 走化性因子に向かつ て移動する 細胞がフ ィ ル タ ー を通過 し又 は フ イ ノレ タ ーの裏面に現れた数を観察する 装置であ る 。 今 日 最 も普通に使用 さ れてい る 装置であ る 力 S、 細胞 浮遊液の量 と して、 1 X 1 0 ⁶ cells / ml の濃度の浮遊 液を Z 4 m 1〜 1 / 20ml 要す る 。 こ れは、 細胞数に し て 、 少 な く と ち 5 X I 0 ⁴個 を必要 と す る こ と を意味す る 。 多量に得 ら れ る 細胞 を対象 と す る 場合は さ した る 問 題 はない が 、 例 え ば、 好酸球 は抹消血 白 血球に 占 め る 割 合が 1 〜 5 %程度、 好塩基球 は 同 じ く 1 %以下、 単球は 同 じ く 1〜 2 °/₀程度で あ り 、 こ の様 な 少量の み存在す る 細胞 を対象 と す る 場合は、 必要量を手に入れ る た め に 多 く の 労力 を要す る 。 ま た 、 マ ウ ス の よ う な小動物 を用 い る 場合、 採血可能な量は限 ら れてお り 、 一頭あ た り せい ぜぃ 1 . 0 m 1 程度 で あ る 。 更 に 、 ん細胞や組織に存在す る 細胞 に も 多量 に は入手 し に く い細胞が あ り 、 その性質 を調べ る に は使用 量が少 な い こ と が望ま れ る 。 ま た 、 ボ イ デ ンチ ェ ンバー に おい て は、 移動す る 過程に あ る 細胞 の状態の観察や数の計数をす る こ と が でき ない。

細胞の 走化性 を数個の レ ベル で観察で き る 定性用 ス ラ ィ ド グ ラ ス が 市販 さ れて い る 。 こ れは 、 2 5 X 7 5 m m 、 2 m m厚の 顕微鏡ガ ラ ス ス ラ イ ド上 に 、 1 m m幅の ブ リ ッ ジ （流路） を挟んで幅 4 m m 、 長 さ 2 5 m m、 深 さ l m m の溝 （ゥ エ ル）力^ 2 個設 け ら れて い る 。 即 ち 、 二つ の ゥ エルが流路 を挟んで連通 し た形 を有 して い る 。 一方の ゥ エルに細胞浮遊液 を入れ、 他方の ゥ エルに 走化性因 子 を 含有す る 検体溶液 を入れ、 カ バ ー グ ラ ス を被せ て 、一方 の ゥ エルか ら 流路 を越え て他方の ゥ エルへ移動する 細胞 を顕微鏡 で観察す る 。 然 し、 プ リ ッ ジが細胞の径又 は変 形能 に合わせた 空間 を形成す る こ と は想定 さ れてい な い , ま た 、 流路 に細胞が通過す る 溝 は設 け ら れて レ、 な い。 更 に 、 一個 の ゥ エ ル の容積が 1 0 0 μ 1 で あ り 、 少 な く と も 1 / 1 0 m l の細胞浮遊液 を要す る 。 ま た 、 同様 な構造の も の と し て 、 ス ラ イ ド グ ラ ス 上 に 、 同 心 円 状 に 二つ の溝 (ゥ エ ル） を設 け 、 そ の 間 を プ リ ッ ジ （流路）で隔てた ケモ タ キ シ ス チ ャ ン ノ 一 が 市販 さ れて い る ( ゥ -一バーサイ ェ ンテ ィ フ ィ ッ ク 社製 、 商品名 ダ ン ケ モ タ キ シ ス チ ヤ ンバー） 。 こ れは、 内側 の ゥ エルに細胞浮遊液 を、 外側 の ゥ エルに検体 を夫々 入れ、 カ バー グ ラ ス を被せて 、 流 路 を通過す る 細胞 を顕微鏡で観察す る も の で あ る 。 流路 は カ ノ 一グ ラ ス よ り 20 μ m低 く 設定 さ れて お り 、 細胞 はそ の隙間 を通過す る 構造で あ る 。 こ こ で 、 流路の 平面 と カ バー グ ラ ス と の 間 で形成 さ れ る 距離は細胞の径又は 変形能 と は無関係 に設定 さ れて お り 、 ま た 、 流路に は細 胞が通過す る 溝が設 け ら れてい な い。

血液 レ オ ロ ジ一の計測の た め に 、 シ リ コ ン単結晶基板 表面 に半導体作製技術を利用 し て微細な溝 を複数本設 け て な る 流路 を備 え た装置が提案 さ れて い る （ Kikuchi 他 SPIE Vol. 2978 ， 165 ― 171 ( 1997) 、 Kikuchi 他 、 Microvascuar Research Vol. 44, 226— 240 (1992)、 菊池 他、 生物物理 214 号 254— 258 ( 1997) ) 。 こ れは、 流 路 を挟んで圧力 差を与 え る こ と に よ り 血球浮遊液の流れ を 作 り 、 血流の 状況 を観察 し研究 し よ う と す る も の で、 細胞 レベル で の 挙動 を観察す る こ と を可能 と す る も の で あ る が、 血球の 自 力 に よ る 移動 を観察乃至計測する 構造 を採用す る も の ではな い。

曰 本特許 2532707 号に は、 一端部 に流入 口 を有 し、 他 端部 に流 出 口 を 有す る 大 き な溝 を並列 に配置 し、 且つ、 こ の溝を 区画す る 障壁 に、 前記流入 口 と 流 出 口 と を結ぶ 直線に対 し直交す る 方向 において、 溝相互を連通する微 小な溝を設 けて な る 血液回路が開示 さ れてい る 。 こ れは . 大 き な溝の一つに血液試料を流 し、 他方の溝に走化性因 子 を含む検体を流 してお き 、 血液試料の一部のみを微細 な溝 （流路）に導き 、 微細な溝 （流路）を通過する 細胞を検 出する こ と で、 細胞の動 き や機能をチェ ッ ク し、 或いは 遊走性を観察 ， 測定する も の であ る。 大き な溝に よ り 血 液試料及び走化性因子を含む検体が循環する 流れを作る た め、 血液試料や検体溶液を静止 した ,:状態で収納する ゥ エルを有 さ ず、 ま た、 血液試料及び検体が相 当 量必要で あ り 、 微量な試料を用レ、て細胞の 自 力に よ る 動 き を調べ る には不向 き であ る。

血液中の細胞を微細な溝を通過 さ せ、 通過 中 の血球の 態様 を観察す る た め の 血液フ ィ ルタ が知 ら れて い る （日 本特許 2 6 8 5 5 4 4 号）。 こ れは、 シ リ コ ン基板表面に微細 な溝を有 して な る 第 1 の基板 と 、 第 1 の基板の表面に接 合 さ れる 平面を有する 第 2 の基板 と か ら な り 、 両基板の 接合部に第 1 の基板の溝に よ っ て形成 ざれる 空間を血球 が通過する 構造であ る。 然 し、 血球を微細な溝を通過 さ せ る た め に加圧又は吸引 等外部か ら力 を加えて お り 、 細 胞の 自 力 に よ る 溝の通過 を観察する も の ではない。 即ち 血液試料や検体溶液を静止 した状態で収納す る ゥエルを 有 さ ない。

細胞膜の硬 さ や細胞の変形能の機能的な側面での分画 処理を行 う た め に、 分画処理すべき 細胞を多数の微細な 溝を有する 流路を通過 さ せ、 通過 し得ない細胞 と 通過す る 細胞 と を分け る 装置 も知 ら れてい る。 その 中 で、 溝の 幅が異な る 流路を 2 段に設 け、 何段階かに細胞 を分画す る こ と も 提案 さ れてい る （日 本特許 2685119 号）。 然 し、 こ れは細胞を含む液を加圧下に移動 さ せる構造であ り 、 細胞の 自 力 に よ る移動を捉え る も のではない。

微細な溝を設けた流路を有す る 基板を積重ね、 多量の 細胞懸濁液を濾過、 分画可能 と した積層マイ ク ロ チヤ ネ ノレ ア レ イ 装置 も 知 ら れて い る （ 本特許公開 165062Z 1999) 。 こ れ も 、 細胞を含む液を加圧下に移動 さ せる構 造で あ り 、 細胞の 自 力に よ る 移.動 を捉え る も の ではない 発 明 の 開 示

本発明 は、 走化性因子に よ る 細胞の走化性又は阻害剤 に よ る 細胞の走化性阻害を検出する に 当 た り 、 細胞の 自 力 に基づ く 動 き を正確に しか も 容易 に検出 し う る装置の た め の ウ エノレユニ ッ ト を提供す る こ と を 目 的 と する 。 こ こ に、 自 力 に基づ く 動き と は、 圧力等の影響を受け る こ と な く 、 細胞が 自 ら の運動に よ り 移動する 状態を意味 し 走化性因子の作用 を高い信頼度で検証 し、 確認する た め に重要な事項であ る。 かかる 細胞の 自 力 に基づ く 動 き を 正確に検出す る た め には、 ゥ エルに入れた細胞が、 走化 開始前に流路の近傍に集ま り 、 細胞の進行方向 に向 かつ て並ぶこ と が重要であ る が、 かかる 状態を微細な ゥ ェル 内 で作 り 出す こ と ができ る ゥ エルュ - ッ ト の構造は知 ら れていない。

ま た、 本発明 は、 少量の細胞試料を用いて細胞の走化 性 を検出す る こ と が で き る 装置の た め の ゥ エルユエ ッ ト を提供す る こ と を 目 的 と す る 。 加 えて 、 本発 明 は、 細胞 の 走化性物質及びそれ を 阻害す る 物質の検索 を 、 一度に 多数の検体に つ き 、 効率 よ く 行 う 装置の た め の ゥエルュ エ ツ ト の提供 を 目 的 と す る 。 更 に 、 本発 明 は、 複数種の 細胞の混合液か ら 特定の細胞 を選択的 に 分離採取す る 装 置 の た め の ゥ ェルユ ニ ッ ト を提供す る こ と も 、 その 目 的 の 一 つ と す る 。

即 ち 、 本発 明 は 、 液体試料を静止 し た状態で収納で き る ウ エ ノレ の複数個 が流路 を介 し て互い に is通 し て レヽ る こ と 流路 に は土手が設 け ら れて い る こ と 、 ウ エノレはガラ ス 基 板 と 密 す る よ う に形成 さ れて レヽ る こ と 、 土手の上部 に は細胞の径又 はそ の 変形能 口 4ンせた幅及び Z又は深 さ の 溝 を 1 乃至複数本構成す る 障壁が設 け ら れて い る か、 又 は平面 が設 け ら れてお り 、 該平面はガ ラ ス 基板 と の 間 で細胞の径又 はそ の変形能 に合わせた深 さ を形成す る べ く 設 け ら れて い る こ と を特徴 と す る 細胞走化性検出及び 細胞分離装置の た め の ゥ ェノレ ュ ッ 卜 で あ り 、 ま た 、 液 体試料を 静止 し た状態で収納で き る ク ェ ノレ の複数個 が流 路 を介 し て互い に連通 して い る こ と 、 流路 に は土手が設 け ら れて ^ヽ る こ と 、 土手の 上部 に は細胞の径又 はそ の変 形能 に合わせた 幅及びノ又 は深 さ の溝を 1 乃至複数本構 成す る 障壁が設 け ら れて い る こ と を特徴 と す る 該 ウ エノレ ュ ニ ッ ト で あ る 。 か か る 、 土手 を設 け る こ と 、 或い は土 手 に溝を構成す る 障壁 を設 け る こ と に よ り 、 ゥ エル に入 れた細胞が 、 走化開始前に流路の近傍に集ま り 、 細胞の 進行方向 に 向かっ て並ぶ と い う 状態が容易 に作 り 出 さ れ る 。 こ の効果は、 土手の上部に、 細胞をス タ ー ト ラ イ ン に並べる 際に細胞の移動 を制限す る た め の障害物を相対 す る ゥ エルに向カゝ ぅ 方向 に直交 して設け る こ と 、 或は、 土手の上部に、 細胞をス タ ー ト ラ イ ンに並べる 際に細胞 の移動を制限する た めの障害物を、 障壁の列に並行 して 設け る構造を採用する こ と に よ り 、 更に高め ら れる。

こ こ で、 複数の ゥ エルは、 流路を介 して直列 に連通 し てい る こ と カ で き 、 或い は、 1 つの ゥ エルに複数の ゥ ェ ルが流路を介 して連通 していて も よ く 、 更 に は、 1 つの ゥ エルに流路を介 して連通 してい る複数の ゥ エルの 内、 少 な く と も 2 つの ゥエルが流路を介 して更 に他の共通の ゥエル と 連通 してレヽて も よ レヽ。

上記の複数の ゥ エルは、 細胞浮遊液を収納す る ゥ エル 及び走化性因子を含有す る溶液を収納する ゥ エルであ り 或い は、 細胞浮遊液を収納する ゥエル、 走化性因子を含 有す る溶液を収納する ゥ エル及び走化性因子阻害剤 を含 有する溶液を収納する ゥ エルであ る。

本発明の ゥ エルュニ ッ ト は、 流路を介 して互いに連通 して い る ゥエルの何れか一方又は双方において、 流路の 近傍にお け る液体の量を制限する た め に、 流路に直交 し て壁を設け る こ と ができ 、 更に は、 こ の ゥ エルユニ ッ ト において、 流路に直交 して設け ら れてい る何れか一方又 は双方の壁の ま でテ ラ ス が形成 さ れていて も よ い。

本発明の ゥ エルユニ ッ ト におけ る 土手の上部の何れか の箇所に、 細胞を検出す る 画面の位置決め を行 う た めの 印 を設 け る こ と ができ 、 ま た、 流路において、 土手が多 段に形成 さ れていて も よ い。

本発明の ゥ エルュニ ッ 卜 において、 流路に設け ら れて い る 溝が、 相対する ゥエ ル に向 か う 方向 に直交する 1 乃 至複数本の溝で互い に連通 してい る こ と ができ 、 或いは 流路 において、 相対する ゥ エルに 向か う 方向の複数本の 溝の幅が、 こ れに直交する 1 乃至複数の溝を横切 る 度に 段階的 に変化す る こ と 、 更 に は、 流路において、 相対す る ウ エノレ に向 か う 方向の複数の溝が、 こ れに直交す る 1 乃至複数本の溝を横切 る 度に、 相互の位置を シ フ ト さ せ て形成 さ れてい る こ と 力 Sでき る 。

本発明の ゥエルュュ ッ ト にお け る 流路において、 細胞 の径又はそ の変形能に合わせた幅及び Z又は深 さ の溝を 1 乃至複数本構成する 障壁の一連の列の前後にテ ラ ス が 設 け、 且つ、 細胞の進行方向 にお け る テ ラ ス の長 さ が他 方のテ ラ ス の長 さ よ り 長する こ と ができ る。

本発明の ゥ エルユエ ッ ト の流路 において は、 中央にテ ラ ス を設け、 細胞の径又はそ の変形能に合わせた幅及び

/又は深 さ の溝を 1 乃至複数本構成する 障壁の列が該テ ラ ス を挟んで 2 箇所に形成 さ れてお り 、 所望に よ り 、 障 壁の列の外側に も テ ラ ス が設け られていて も よ い。

本発明に関わ る 上記の各 ゥ エ ルュ ニ ッ ト の夫々 を 1 ュ ュ ッ ト と し、 同一又は複数種のュニ ッ ト を複数個集積 し て 細胞 走化性検出及び細胞分離装置の た め の ゥ エルュ ニ ッ ト と する こ と も でき る。 図面の簡単な説明

図 1 は、 本発明 に関わ る ゥ エ ルユ ニ ッ ト の使用態様の 例を示す断面図であ る。

図 2 は、 本発明 に関わる ゥエ ルユ ニ ッ ト の一例を示す 上面図であ る。

図 3 は、 本発明 に関わ る ゥ エルュニ ッ ト の使用態様の 例を示す断面図であ る。

図 4 は、 本発明 に関わる ゥエ ルュニ ッ ト の一例を示す 上面図で あ る 。

図 5 は、 本発.明 に関わる ゥ エルュニ ッ ト の使用態様の 他の例 を示 し、 （ 1 )は装置の 断面図 で あ り 、 （ 2 )は本発 明 に'関わ る ゥエ ルュ - ッ ト の 一例を示す上面図であ る。

図 6 は、 本発明 に関わ る ゥ エルュニ ッ ト の使用態様の 他の例 を 示 し、 （1 )は装置の 断面図 で あ り 、 （ 2 )は本発 明 に関わ る ゥエ ルュニ ッ ト の一例を示す上面図であ る。

図 7 は、 本発明の ゥエルユニ ッ ト の一例で あ り 、 流路 を介 して ゥエルが直列に 3 個連通 してい る場合を示す。

図 8 は、 本発明の ゥエルュニ ッ ト の一例であ り 、 貫通 孔を有す る ゥ エルが流路を介 して直列に 3 個連通 してい る場合を示す。

図 9 は、 本発明の ゥエルユニ ッ ト の一例であ り 、 1 つ の ゥ エルに複数の ゥ エルが流路を介 して連通 してい る場 合を示す。

図 1 0 は、 本発明 の ウ エノレユ ニ ッ ト の一例 で あ り 、 1 つの ゥエルに複数の ゥエルが流路を介 して連通 してお り ゥエ ル に貫通孔が設け られてい る場合を示す。 図 1 1 は、 本発明 の ゥ エ ル ユ ニ ッ ト の一例 で あ り 、 1 つの ゥエルに複数の ゥ エルが流路を介 して連通 してお り ゥエルに貫通孔が設け ら れている場合を示す。

図 1 2 は、 本発明 の ウ エノレュュ ッ ト の一例 で あ り 、 1 つの ウエノレを 中心に して、 複数の ウエノレが流路 を介 して 連通 してい る 場合で あ っ て、 全体 と して 円形 を構成 して い る 場合を示す。 図 は貫通孔が設け られてい る 例を示す, 図 1 3 は、 本発明 の ウ エノレユニ ッ ト の一例 であ り 、 1 つ の ゥ エル を 中 心 に し て 、 複数の ゥ エルが 流 路 を介 し て連通 して い る 場合で あ っ て 、 全体 と し て 円 形を構成 している場合を示す。

図 1 4 は、 1 つの ゥ エルを 中心に して、 複数の ゥ エル が流路を介 して連通 して レ、 る と 共に、 それ ら 複数の ゥ ェ ノレ の 内、 2 つづ、つが 更 に他の共通の ゥエル と 流路を介 し て連通 してい る 場合を示す。 図 は貫通孔が設 け られてい る 例を示す。

図 1 5 は、 流路 に 直交 し て壁が設 け ら れ た ゥ エ ルュ エ ツ ト の例を示す図 であ る。

図 1 6 は、 流路 に 直交 し て壁が設 け ら れ た ゥ エ ルュ ニ ッ ト の他の例を示す図であ る。

図 1 7 は、 流路の構造の一例を示す。

図 1 8 は、 流路の構造の一例を示す。

図 1 9 は、 流路の障壁の配列例。 図 において、 矢印は 相対する ゥエルに向カゝ う 方向 を示す。

図 2 0 は、 図 1 9 の断面図 を示す。

図 2 1 は、 流路を挟んで相対する ウエノレに 向 カゝ ぅ 方向 の溝が、 これに直交する 1 本の溝で連通 して い る場合を 示す。 図 中矢印は相対する ゥエルに向か う 方向 を示す。

図 2 2 は、 流路 を挟んで相対する ゥエルに 向か う 方向 の溝が、 これに直交する 2 本の溝で連通 してい る 場合を 示す。 図中矢印は相対する ゥエルに向か う 方向を示す。

図 2 3 は、 流路を挟んで相対す る ゥエルに 向 か う 方向 の溝が、 こ れに直交する 2 本の溝で連通 してい る と 共に 相対する ゥエルに 向力 う 方向の溝の幅が直交する 溝を横 切 る ご と に段階的に変化す る 場合を示す。 図 中矢印 は相 対す る ゥ エルに向 か う 方向 を示す。 図 は、 障壁 自 体の幅 が変化する場合を示す。

図 2 4 は、 図 8 の変形例で、 障壁の大き さ は同 じであ る が、 その数が増減する 場合を示す。 図 中矢印 は相対す る ゥ エルに向カゝ ぅ 方向 を示す。

図 2 5 は、 流路を挟んで相対す る ゥエルに 向か う 方向 の溝が、 これに直交する 3 本の溝で連通 してい る と 共に 相対する ゥエルに 向カゝ ぅ 方向 の溝が、 これに直交す る 溝 を横切 る ご と に相互の位置関係を変えてい る 場合を示す 図 では、 2 分の 1 ピ ッ チ、 直行す る 方向 にシフ ト してい る 場合を示す。 図 中矢印 は相対する ゥエルに 向カゝ ぅ 方向 を示す。

図 2 6 は、 障壁が相 対す る ゥ エルに 向 か う 方 向 に 繋 が っ てい る場合を示す。

図 中矢印は相対する ゥエルに向カゝ ぅ 方向 を示す。

図 2 7 は、 土手に、 障壁の列の両側にテ ラ ス を設 け、 一方が他方よ り 長い場合を示す。 図 中矢印は相対す る ゥ ェ ノレ に 向 カゝ ぅ 方向 を示す。

図 2 8 は、 土手の 中央にテ ラ ス を設け、 テ ラ ス を は さ んで障壁の列を 2 箇所に形成 した例を示す。

図 2 9 は、 流路 に 直交 し て壁が設 け ら れた ゥ エ ルュ ニ ッ ト の流路において、 壁ま でテ ラ ス が設け ら れて'い る 例 を示す。

図 3 0 は、 流路 に 直交 し て壁が設 け ら れた ウ エ ノレ ュ ニ ッ ト の流路において、 壁ま でテ ラ ス が設け ら れている 他の例を示す。

図 3 1 は、 流路に直交 して壁が一方の ゥエ ル にの み設 け ら れた ゥ エルュニ ッ ト の流路において、 壁ま でテ ラ ス が設け ら れている例を示す。

図 3 2 は、 流路にお け る 土手が多段に形成 さ れて いる 場合を示す。

図 3 3 は、 多数ユニ ッ ト の集積例であ り 、 同一タ イ プ の ュニ ッ ト の集積例を

示す。

3 4 は、 多数ユニ ッ ト の集積例であ り 、 同一タ イ プ のュニ ッ ト の集積例を示す。

3 5 は、 多数ユニ ッ ト の集積例であ り 、 図 1 5 の ゥ ェ ルが集積配置 された例を示す。

図 3 6 は、 多数ユニ ッ ト の集積例であ り 、 円形タ イ プ の集積例 を示す。

3 7 は、 多数ュニ ッ ト の集積例であ り 、 異な っ た タ ィ プのュ - ッ ト の集積例を示す。

図 3 8 は、 流路及び ゥ エルを作製する 工程の一例 を示 す

図 3 9 は、 細胞走化性検出及び走化細胞分離装置の組 立例 を示す図 であ り 、 （ 1 )は部品毎の斜視図、 （ 2 )は対応 する 断面図であ る。

図 4 0 は、 土手に、 細胞の移動 を制限する た めの障害 物を設け る場合の例を示す。

〔符号の説明〕

： 流路

2 ： ゥ エル。 添字の A 、 B 、 B ！ _ _n , C は ゥ エルの 区別 を意味する （以下同 じ）。

3 ： 試料注入 · 採取用管。 添字の a は管 3 に対応する 貫通孔。 添字の b は管 3 の上端部。

4 ： 試料の注入 ■ 採取時におけ る 昇圧 · 減圧を回避す る た め の管。 添字の a は管 4 に対応する 貫通孔。 添字の b は管 4 の上端部。

5 ： 流路を挟んで相対する ゥエルに向か う 方向の溝 6

7 ： &板

8 ： ガ ラ ス基板

9 ： 管 を穿っ たブ ロ ッ ク

0 土手

1 1 1 — ι ~ ₄ ： テ ラ ス

2 溝 5 に直交する溝

3 検出 ^

4 流路に直交 して設け ら れた壁

5 管 3 、 4 の上端部に よ り 共有 さ れる 空間 1 6 ： ノヽ。 ッ キ ン グ

1 7 ： カ ノく一キ ャ ッ プ

1 8 ： 0 — リ ン グ

1 9 ： ガイ ド ビ ン受孔

2 0 ： ガイ ド ピ ン

2 1 ： 中間支持体

2 2 ： 底支持体

2 3 ： 画面の位置決めのた めの印

2 4 ： 障害物

発明 を実施する ため の最良 の形態 本発明 に関わ る 細胞走化性検出及び走化細胞分離装置 の た め の ゥ エルユ ニ ッ ト は、 複数の ゥエルが流路を挟ん で結合 し、 互い に連通する 構造を有する 。 こ こ で、 ゥ ェ ル と は、 細胞懸濁液又は細胞走化性因子や走化性因子阻 害剤等の検体溶液を収納する容器であ る。 流路 と は、 二 つ の ゥエルを連通 さ せてい る 部分であ っ て、 —つ の ゥェ ルか ら他方の ゥ エル に細胞が移動する と き に細胞が通過 す る 通路であ る 。 流路に は、 後述する 土手が設け ら れ、 土手に は、 細胞の径又はその変形能に合わせた幅及び / 又 は深さ の溝を 1 乃至複数本構成する 障壁が設け ら れて い る か、 又は平面が設け ら れてお り 、 該平面はガ ラ ス基 板 と の間で細胞の径又はその変形能に合わせた深 さ を形 成する べ く 設 け ら れてい る 。 なお、 細胞の変形能 と は、 細胞が弾力性を有す る も の であ る と き 、 そ の弾力性のた め に容易 に形を変え、 扁平状やひ も 状な どの形態 を と り 通常、 細胞が 自 由 空間で と る 形状 （球状） において有す る径 よ り も 狭い隙間を通 り 抜け る こ と を言 う 。

か力 る 隙間 を設け る こ と に よ り 、 細胞が隙間 と い う 障 害を越えて移動する こ と に な り 、 細胞の 自 力 に よ る 移動 に障害をカ卩 え る こ と で、 よ り 正確に細胞の走化性を判定 す る こ と が可能 と な る。 かか る 隙間 を形成す る ため に、 土手を設け る こ と 、 或いは土手に溝を構成す る 障壁 を設 け る こ と に よ り 、 ゥエルに入れた細胞が、 走化開始前に 流路の近傍に集ま り 、 細胞の進行方向に 向かっ て並ぶ と レ、 う 状態が容易 に作 り 出 さ れる 。 更に、 細胞が個体毎に 通過する 溝を設け る場合は、 細胞 を個 々 の レ ベルで観察 する こ と が可能 と な り 、 又、 細胞を所望の種類 ご と に分 離する こ と ができ る。

本発明 は、 かかる 細胞走化性検出及び走化細胞分離装 置において用い ら れる ゥ エ ル の結合様式、 ゥ エ ルの構造 及び流路の構造に関する。

図 1 は、 本発明 の ゥエルュニ ッ ト が組み込ま れた細胞 走化性検出及び細胞分離装置の一例を示 し、 図 2 は図 1 の装置で用 い ら れる ゥエ ルュ - ッ ト の上面図であ る 。 図 の例では、 ゥ エルユニ ッ ト は、 細胞浮遊液や検体溶液等 の試料を収納する ゥエル 2 A 、 2 B を有 し、 こ れ等の ゥ エ ルを隔て る 土手 1 0 の上面 に溝 5 を構成する 障壁 6 が 設 け られてい る 。 ゥ エルュ - ッ ト には光学的に透明 なガ ラ ス 基板 8 が密着 して装着 さ れ、 密閉 さ れた空間を構成 する 。 なお、 本明細書において は、 土手 1 0 と 溝 5 を構 成す る 障壁 6 を含む部分構造を流路 と 呼ぶ こ と と す る。 ゥ エ ル 2 の 一 つ （ 2 A ) に細胞浮遊液を入れた と き 、 細 胞 は、 他方の ゥ エル （ 2 B ) の検体溶液が 走化性因 子で あ る 場合は ゥ エル 2 B に 向 カゝ つ て移動 し よ う と し、 流路 を 通過す る 。 細胞 の移動 の 状態 は検 出器 1 3、 例 え ば顕 微鏡 に よ り 観察 さ れ る 。 こ の装置の他の用途 と して 、 ゥ エル 2 A に種々 の細胞の 混合懸濁液 を入れて お き 、 ゥ ェ ル 2 B に特定の走化性因 子 を入れ る こ と に よ り 、 ゥ エル 2 A カゝ ら ウ エ ノレ 2 B に移動 し た細胞 を採取す る こ と で、 走化性因 子 に反応す る 細胞 を選択的 に分離す る こ と を挙 げる こ と がで き る 。

図 3 は、 本発明 の ゥ エ ルュ ニ ッ ト が組み込ま れた細胞 走化性検 出及び細胞分離装置の他の例 を示す。 1 は流路、 2 A 、 2 B は細胞浮遊液や検体溶液等の試料を収納す る ウ エノレで あ り 、 試料はマ イ ク ロ ピぺ ッ ト 等 に よ り 管 3 A 又 は 3 B を通 じて ゥ エル 2 A 又 は 2 B に供給 さ れる 。 移 動後 の細胞 を ゥ エル 2 A又 は 2 B か ら 採取す る 場合 も 、 マ イ ク ロ ピぺ ッ ト 等 に よ り 管 3 A又 は 3 B を通 じて行わ れ る 。

試料の一つ で あ る 細胞浮遊液 を 、 マイ ク 口 ピぺ ッ ト 等 に よ り 管 3 A を通 じ て ゥ エ ル 2 A に供給す る 際、 注入す る 液圧に よ り 細胞が流路 1 を 通過 して反対側 の ゥエル 2 B に移動 し て し ま う こ と が生 じ る 。 こ れは、 細胞の移動 が検体の 有す る 走化性に よ る の か否かの判定に混乱 を与 え る 要因 と な る と と も に、 細胞の分離を 目 的 と す る 場合 は、 所望の細胞に他の細胞が混合 して し ま う こ と に な り 目 的が達せ ら れな い こ と に な る 。 同様に、 検体溶液 を、 マ イ ク ロ ピぺ ッ ト 等 に よ り 管 3 B を通 じ て ゥ エル 2 B に 供給す る 際、 注入圧 に よ り 検体溶液が流路 1 を通 っ て反 対側の ゥ エ ル 2 A に入 り 細胞浮遊液 と 混合す る 事態 が生 じ 、 細胞が そ の 走化性に よ り 流路 1 を通過す る 現象が混 乱乃至阻害 さ れ る 。

こ の 問題点 を解決す る た め に 、 管 3 と 連通す る よ う に 管 4 を設 け 、 管 3 に加わ る 注入圧 を管 4 の方向 に逃が し、 流路 1 に 向 か っ て細胞が強制 的 に流れ る こ と を防止す る 構造が採用 さ れ る 。 即 ち'、 試料 を 注入す る 管 3 に連通す る 管 4 を設 け る こ と に よ り 、 水平方向 への液圧の影響を 最小 にす る こ と が で き 、 検体溶液が細胞走化性 を有す る か否かの判定を よ り 正確に行 う こ と が で き る 。 管 4 に よ る 圧力差の緩和作用 は、 ゥ エ ルカゝ ら 細胞 な ど の試料 を採 取す る 際 の減圧 を緩和す る 上で も 有効で あ り 、 試料の採 取 を容易 にす る 。

本発 明 は、 かか る 装置に おいて も使用 で き る ゥ エ ルュ ニ ッ ト を提供す る 。 図 4 に は、 かか る 装置 に おいて使用 で き る 本発 明 の ゥ エ ルユ ニ ッ ト の一例が示 さ れて お り 、 ウ エ ノレ 2 A に は、 管 3 A、 4 A を設 け る た め の貫通孔 3 A a 、 4 A a ；^ 、 ゥ エ ル 2 B に は、 管 3 B 、 4 B を設 け る た め の貫通孔 3 B a 、 4 B a 力 S、 夫々 、 設 け ら れて い る 。

図 5 ( 1 )、 （ 2 )は、 本発 明 の ゥ エ ルユ ニ ッ ト が組み込 ま れた細胞走化性検 出及び細胞分離装置の他の例 を示す _c 図 5 の装置 に お レヽて は、 ゥ エルに試料を注入 し、 或い は ゥ エルか ら試料を採取す る 際の圧力 の影響 を少 な く す る た め に、 図 5 ( 1 )に示す よ う に 、 管 3 A、 3 B の上端部 3 A b 及び 3 B b に よ り 共有 さ れる 空間 15 が設け ら れ て レ、 る 。 ウ エ ノレ 2 A 、 2 B 、 管 3 A 、 3 B 及び空間 15 を 、 細胞等の試料に影響を与え ない液体で満たすこ と に よ り 、 全体が一定の圧力下に保たれ、 管 3 A又は 3 B か ら 試料を注入 · 採取する 際の水平方向の圧力変化が锾和 さ れる 。

本発明が提供する ゥ エルユニ ッ ト は、 かか る 装置 にお い て使用 で き る ゥエ ル ュ - ッ ト も含む。 図 5 ( 2 )に は、 かか る 装 it し おいて使用 でき る 本発明の ウ エノレュニ ッ ト の一例が示 さ れてお り 、 ウ エ ノレ 2 A に は、 管 3 A を設け る た め の貫通孔 3 A a カ 、 ゥ エル 2 B には、 管 3 B を設 け る た めの貫通孔 3 B a 力 S、 夫々 、 設け られている。

5 に示す装置の応用例 と して 図 6 ( 1 )に示す よ う に、 各 ゥ ェ ノレ 2 A、 2 B に管 3 A 3 B 、 及び連通管 4 A · 4 B を設け、 各管の上端部 に 液体を入れる た めの 空間 15 を設け る こ と がで き る 。 の場合に用 レヽ ら れる 本発明 の ウ エ ノレユニ ッ ト は、 図 6 ( 2 ) に示す よ う に、 各 ゥ ェ ゾレに二個ずつの貫通孔が設け られる 。 なお、 図 6 に は 、 流路 1 おけ る 土手 10 に障壁が設け ら れてい ない ゥ ェ /レュニ ッ ト の使用例を示 して あ る .。

本発明の ゥェルュニ ッ ト において は、 複数の ウエノレを 目 的 に応 じ て種々 の様式で結合 さ せ、 互いに連通 さ せる こ と が可能であ る。 本発明 は、 複数の ゥ エル 2 が、 種々 の様式で、 流路 1 を介 して結合 し互いに連通 した構造の ゥェノレ ュ ニ ッ ト を含む （図 7 〜図 14 参照）。

た、 本発明は、 でき る だけ少量の細胞を用いて走化 性 を調べ る こ と が で き る よ う に 、 流路 に対す る ゥ エ ル の 構造を設定す る 場合 を含む （図 1 5、 図 1 6 参照）。

流路 1 に は、 細胞の径又 はそ の 変形能に合わせた幅及 ぴ Z又 は深 さ の 溝 を 1 乃至複数本、 例 え ば、 約 2 0〜約 1 0 0 本構成す る 障壁 を設 け る こ と 好 ま し い。 かか る 溝を 設 け る こ と に よ り 、 細胞や検体の拡散状況 を調節 し 、 細 胞 の動 き を よ り 正確 に、 且つ、 個 々 の レ ベルで観察す る こ と が可能 と な る 。 更 に は、 溝 を設 け る こ と は、 細胞の ゥ エ ル内 に お け る 位置の調節 を容易 に行 う こ と を可能に す る 。 即 ち 、 ゥ エルに入れた細胞が 、 走化開始前に 流路 の近傍に集ま り 、 細胞の進行方 向 に 向 かっ て並ぶ と い う 状態が容易 に 作 り 出 さ れ る 。 本発 明 の ゥ エルュ ニ ッ ト は 目 的 に応 じ て 、 障壁の種々 の構造 を採用す る こ と が で き る （図 1 9〜図 2 5 参照）。

流路 1 に は、 テ ラ ス を設 け る こ と が で き 、 テ ラ ス の構 造 を種々 変 え る こ と に よ り 、 流路 を通過 し た細胞、 或い は通過す る 細胞の状況を観察す る こ と が容易 に な る 。 ま た 、 ゥ エ ル内 に お け る 細胞の 流路 に対す る 位置関係 を調 整す る こ と が 可能 と な る 。 本発 明 は、 かカゝ る テ ラ ス の構 造 を有す る ゥ エルユ ニ ッ ト に 関 わ る （図 2 6〜図 3 1 参照） 本発明 の ゥ エ ルュ ュ ッ ト は、 流路 を介す る ゥ エル の結 合 を一つ の ュ ニ ッ ト と す る 時、 複数の ュ ニ ッ ト を集積 さ せた場合 を含む （図 3 3〜図 3 7 参照）。 かか る 集積に よ り 一度 に多種類の細胞 ■ 検体 を処理す る こ と が可能な細胞 走化性検 出 又 は細胞分離装置 を組み立て る こ と がで き る 本発明 の ゥ エルュ ニ ッ ト を備 え た細胞走化性検出及び 細胞分離装置 に お け る 、 細胞 の移動 の観察乃至流路 を通 過 中 又は通過後 の細胞数の計数は、 図 1 、 図 3 、 図 5 或 る い は図 6 に示す よ う に、 流路 1 に検知装置、 例 え ば顕 微鏡 をセ ッ ト す る こ と に よ り 行われ る 。 ま た 、 顕微鏡一 ビデオカ メ ラ 、 或レ、 は C C D カ メ ラ を組み合わせ る こ と に よ り 、 自 動的 に細胞の移動す る 経過 を記録す る こ と が 可能 と な る 。

流路 1 を通過す る 細胞の検出 ■ 計数は、 細胞 を直接顕 微鏡で捉 え る こ と に よ り 行 う こ と も で き る が 、 常法 に従 い 、 予 め細胞 を発光 ■ 蛍光物質でマ ー キ ン グ し てお き 、 そ の発光 · 蛍光 を捕捉す る こ と に よ り 容易 に検 出 ■ 計数 す る こ と がで き る 。

本発 明 に よ れば、 後述す る よ う に 、 装置 の全体を小型 化す る こ と が 可能で あ り 、 試料の処理 を微量で行 う こ と が で き 、 し か も 各ユ ニ ッ ト を多数集積 さ せて 、 多数検体 の 処理 を 同 時 に行 う こ と が可能 と な る 。 更 に 、 液体 の吸 引 ' 注入量の プ ロ グ ラ ム制御 に よ り 自 動化 し て行 う こ と が容易 で あ る 。

装置の 自 動化 は、 ユ ニ ッ ト 単体、 同一又 は複数種の ュ ニ ッ ト を複数個集積 さ せて な る 集積ュニ ッ ト 又 は複数の 集積ュニ ッ ト ょ り な る ュ ニ ッ ト 部 と 共に、 細胞貯蔵部、 検体貯蔵部、 必要 に応 じ て ピぺ ッ ト 洗浄部及び こ れ等各 部 を移動す る 細胞や検体等の試料供給 ピぺ ッ ト を備 え、 且つ、 こ れ等 ピペ ッ ト の作動 を制御す る 機構 を備 え る こ と に よ り 、 細胞や検体等の供給 . 採取 も 含 め た装置全体 を 自 動制御す る こ と が で き る 。 更 に 、複数 の ュ - ッ ト 上 の流路におけ る細胞の状態を検出す る ため に検出器を ス キ ャ ン さ せ、 一定時間毎 に繰返 し検出 し、 細胞の動き を 経時的に ト レースす る よ う 検出器を制御す る こ と も 可能 で あ る。 これ等の制御は、 コ ン ピ ュ ータ ープロ グ ラ ム に よ り 容易 に行われる 。

本発明 に関わる ゥ エルュニ ッ ト の構造を更 に具体的に 説明すれば、 次の通 り であ る。

1 ) ゥ エルユニ ッ ト の構造

図 2 、 図 4 及び図 6 に例示する よ う に、 流路及び ゥェ ルは基板 7 上に一体的に構築 さ れる のが好ま し く 、 基板 7 に は、 必要に応 じ、 各 ゥ エルに通 じ る 管 と 連絡する 穴 (貫通孔） が設け ら れる 。 流路には土手 1 0 が設け ら れ る 。 土手の上部は、 平面で あ る か、 溝 5 を構成する 障壁 6 及び必要に応 じてテ ラ ス 1 1 が設け られる。

土手 1 0 を設け る こ と 、 或いは土手 1 0 に溝 5 を構成す る 障壁 6 を設け る こ と に よ り 、 ゥエルに入れた細胞が、 走化開始前に流路の近傍に集ま り 、 細胞の進行方向 に向 かっ て並ぶ と い う 状態が容易 に作 り 出 さ れ る 。 即 ち 、 ゥ エルの一つに細胞懸濁液を入れた後、 流路を介 して反対 側に あ る ゥエルか ら 適当 量の液体を吸引す る こ と に.よ り 細胞が流路の近傍に集め ら れ る。 こ の と き 、 土手 1 0 又 は土手 1 0 と 障壁 6 の存在 に よ り 、 細胞は進行方向 に対 して 直交する 方向 に並ぶ。 次いで、 反対側の ゥ エルに走 化性因子が注入 さ れる と 、 細胞が流路の通過 を開始する 流路の近傍に細胞が集ま っ ていない場合、 或い は、 並ん だ状態に ない と き は、 細胞の動き が不規則的に な り 、 所 謂、 細胞 の ラ ン ダム ムー ブ メ ン ト の 故に 、 走化性の検出 を 明確に行 う こ と が 困難 と な る 。 こ の ゥ エ ルュ ニ ッ ト を 用 い て、 細胞走化性検出及び細胞分離装置 を組み立 て る に は、 1 ) ゥ エ ル及び流路 を設 け た基板 7 に ガ ラ ス 基板 8 を のせ る （図 1 参照）、 或い は、 2 ) ゥ エ ル 、 流路及ぴ 貫通孔を設 け た基板 7 に 、 貫通孔 に相 当 す る 管 を穿 っ た プ ロ ッ ク 9 を 、 各管が基板上の各貫通孔 に合致する よ う に 固 着 し 、 更 に ガ ラ ス 基板 8 を密着 固 定す る （図 3 、 図 5 、 図 6 参照）。 な お、 ブ ロ ッ ク 9 、 基板 7 及 びガ ラ ス 基板 8 は O — リ ン グ で締 め付 け る 等 に よ り 圧着 · 固 定 し て も よ い （図 3 9 参照）。

2 ) ゥ エ ル

ゥ エ ル 2 は、 試科、 即 ち 、 細胞浮遊液又 は走化性因子 含有'溶液、 或い は、 同阻害剤含有溶液等の検体溶液 を静 止 し た状態で収納す る構造 を 有す る 。 こ れは、 細胞の 自 力 に よ る 動 き を正確 に検 出す る た め に必要 な構造で あ る ， 容積は、 特 に制 限は無 く 、 必要最小限の液量 を収納で き れば よ い。 例 え ば、 液量 0 . 3 μ 1 を収容す る 場合は、 深 さ 0 . 1 m m、 幅 1 . 2 m m、 長 さ 2 . 5 m m あれば よ い。

3 ) 流路 を介 した ゥ エ ル の連通様式

流路を 介 し た ゥ エルの連通様式は、 図 2 、 図 4 、 図 5 ( 2 )或い は図 6 ( 2 )に例示す る 2 連式、 図 7 、 図 8 に例 示す る 3 連式が通常用い ら れ る 。 図 2 及び図 7 は貫通孔 が設 け ら れて い ない場合で あ り 、 図 4 、 図 6 、 図 8 は貫 通孔が設 け ら れて い る 場合の例示で あ る 。 3 連式の場合 は、 例え ば、 ゥ エ ル 2 A に細胞浮遊液、 ゥ エ ル 2 B に阻 害剤含有液、 ゥ エル 2 C 走化性因子含有液 を入れ る こ と に よ り 、 複数検体につ き 3 者の 関係 を一度 に調べ る こ と が で き る 。

ゥ エルは、 必要 に応 じて更 に結合 さ せ、 連通 さ せ る こ と が で き る 。 連通 の形式 と して 、 図 7 や 図 8 の よ う な直 列型の他 に、 図 9 〜 図 11 に例示す る よ う に 、 一つ の ゥ エ ル の周 り に流路 を'介 し て複数の ゥ エ ル を連通 さ せた、 所謂 、 同 心状の 形式 を と る こ と も で き 、 更 に は 、 図 12 図 13 の如 く 、 同 心 円 状にす る こ と も で き る 。 図 12、 図 13 は、 3 連式を 同 心 円 状に した例で あ る 。

図 9 〜 図 11 の場合、 .中央の ゥ エ ル 2 A に細胞浮遊液 を 入れ、 ゥ エル 2 B i 〜 ₄ に種 々 の 検 体 を 入れ る こ と に よ り 、 複数の走化性因子の検索 を 同 時 に行 う こ と が で き る 。 更 に 、 複数種の細胞 を含む試料を ゥ エ ル 2 A に入れ る こ と .に よ り 、 細胞 を種類別 に分離す る こ と を一度 に行 う こ と が で き る ( ソ ー テ ィ ン グ） 。 例 え ば、 ゥ エル 2 B i ~ ₄ に 細胞 の 種類 に 対応 し た 走化性 因 子 を 入れ、 中 央 の ゥ エル 2 A に複数種の細胞 を含む試料、 例 え ば全血を 入れ る 。 細胞 は、 夫々 の 走化性因子の あ る 各 ゥ エ ル 2 B i 〜 ₄ に 向 か っ て 移動す る 。 一 定時 間 経過 後 に 、 各 ゥ ェ ル 2 B i 〜 ₄ カゝ ら 細胞 を採取す る 。

図 14 に は、 1 つ の ゥ エル （ 2 A )に 流路 を介 して連通 し て い る 複数 の ウ エ ノレ の 内 、 少 な く と も 2 つ の ウ エ ノレ ( 2 B i 及 び 2 B ₂ )が 相 互 に流路 を 介 し て 更 に他 の共通 の ゥ エル （ 2 C ) と 連通 してい る タ イ プ力 S例示 さ れて い る 。 こ の場合、 ウ エ ノレ 2 A に細胞浮遊液を、 ゥ エ ル 2 C に走 化性 因子 を含有す る 検体溶液 を入れ、 ゥ エ ル 2 B 及び 2 B ₂ に 夫 々 異 な っ た 阻害剤 を含む検体溶液 を 入れ る こ と に よ り 、 夫々 の 阻害剤 の性質 を 同一条件下で比較 し な 力 S ら 調ベ る こ と 力 S で き る 。

4 ) ゥ エルの構造にお け る 特定の態様

流路 を介 して互い に連通 し て い る ゥ エ ル の何れか一方 例 え ば細 ^ を収納す る ゥ エ ル 、 又は双方 に おい て 、 流路 の 近傍に お け る 液体又 は細胞懸濁液の量 を制 限す る べ く 流路 に直交 して壁 を設 け る こ と に よ り 、 ゥ エ ル内 にお け る 細胞の流路 に対す る 位置 関係 を調整す る こ と が容易 と な り 、 或い は、 検体試料の 流れ を調整す る こ と が容易 と な る （図 15)。 図 15 は、 流路 1 を介 して ゥ エル 2 A、 2 B が連通 し てお り 、 夫々 の ゥ エルに 、 流路 1 に 直交 し て 壁 14A及び 14B が設 け ら れて い る 場合 を示す。 試料注 入管 3 A か ら ゥ エ ル 2 A に 細胞'を注入す る と 、 一定量の 細胞が壁 14 A と 流路 1 の 間 に集ま る 。 壁 14 と 流路 1 と の 間隔 は任意に設定で き る が 、 通常は 50〜 300 μ m力 ら 選 ばれ る 。

図 16 は、 流路 に 直交 し て壁 を設 け た ゥ エル と 流路の 変形例 を示 し てお り 、 （ 1 )は ゥ エ ル の幅の一部 に流路が 設 け ら れて い る 場合を、 （ 2 ) は流路が 中央で二分 さ れ て お り 、 流路 を挟んで一個 の ゥ エ ル （ 2 A )に対 し二個 の ゥ エ ル （ 2 B 、 2 C )力 S設 け ら れて レヽ る と 共 に ゥ エ ル 2 A 側 に の み壁 14 A が設 け ら れ て い る 場合 を 、 （ 3 )は流路 に お い て 障壁の列が テ ラ ス 11 を挟んで二列設 け ら れて い る 場合 を、 夫々 示 し て い る 。 こ の よ う な変形 は例示 と して挙げた も の で、 これ等 に限 ら れない こ と は云 う ま で も ない。

5 ) 流路

流路 1 (図 3 、 5 、 6 、 8〜 16)の構造のー例 を図 1 ~ 6 、 図 17、 18 に よ り 説明すれば次の通 り であ る 。 流路 1 は、 両端の ゥ エル 2 A と ゥ エル 2 B を隔て る 土手 10 (基板 7 上の突出部） と ガ ラ ス 基板 8 と の間で細胞が通 過す る 空間 を形成する。 土手 10 の上部は平面であ る か (図 6 参照）、 又は、 溝 5 を構成す る 障壁 6 及び必要 に応 じ、 テ ラ ス 11 が設け ら れ る 。 なお、 図 17 は、 図 1 に示 す構造の装置におけ る 例で あ り 、 図 18 は図 3 や図 5 に 示す構造の装置におけ る例であ る。

土手 10 は、 流路 1 の両端に あ る ゥエル 2 A 、 2 B を 隔て る も の で、 そのサイ ズは、 特に限定 さ れる も の では な レ、 が 、 例 え ば、 高 さ 0.03〜 0. 1 m m程度、 相対す る ゥ エル に 向 力 う 方向 にお け る 長 さ と して 0.01〜 0. 5 mm 程： 度 あれば よ く 、 相対する ゥ エルに 向カゝ ぅ 方向 に直交する 方向 におけ る長 さ は、 ウ エノレの幅又はそれ以下で よ い。

土手の上部に溝を構成す る 障壁を設けない場合は、 土 手の 上面がガ ラ ス基板 と の 間で細胞の径又は細胞の変形 能に合わせた深 さ 乃至隙間 を形成する。 こ の場合の深さ は、 細胞の種類に合わせて 、 通常 3 〜 50 μ m カゝ ら選 ばれ る 。 好中球、 好酸球、 好塩基球、 単球 · マ ク ロ フ ァ ージ T 細胞、 B 細胞等の場合は 3 〜 10 m、 例え ば 6 、 7、 8 又 は 10 μ mか ら 選ばれ、 が ん細胞や組織に存在す る 細 胞の場合は 10〜 20 μ mの幅が選ばれる。 6 ) 流路 にお け る 障壁及び障壁に よ り 構成 さ れ る 溝 土手 1 0 の上面に は、 図 1 9 で示す よ う に、 障壁 6 を設 け る こ と 力 S で き る 。 障壁 6 に よ り 構成 さ れ る 溝 5 の 断面 は、 V字型断面、 凹型断面、 半 円 型断面等、 任意の形状 と す る こ と がで き る （図 2 0 参照）。

溝 5 の幅は、 通常は 3 〜 5 0 ^ m か ら 選ばれ、 対象 と す る 細胞が 1 個づっ通過す る だ け の幅であ る こ と が好 ま し く 、 細胞 の種類に合わせて好適 な幅が選ばれ る 。 好 中球 好酸球、 好塩基球、 単球 ' マ ク ロ フ ァ ー ジ、 T 細胞 、 B 細胞等の場合は 3 〜 1 0 μ m 、 例 え ば 6 、 7、 8 又 は 1 0 μ m か ら 選 ばれ、 が ん細胞や組織に存在す る 細胞 の場合は 1 0〜 2 0 μ mの幅が選ばれ る 。

溝 5 の深 さ （障壁 6 の 高 さ ）は、 顕微鏡の焦 点深度 に合 -わせ て適宜設定す る か、 或 い は、 細胞が 1 個づっ通過 し 得 る 深 さ と す る こ と が で き る 。 更 に は、 溝の 幅 と 溝 の高 さ の 双方 を細胞が 1 個づっ通過 し得 る 幅 と 高 さ に設 定 し て も 良い。

溝 5 の深 さ を、 細胞 の移動 を観察す る 際 の顕微鏡 の焦 点深度 内 に収 ま る 深 さ に す る 場合、 例 え ば、 1 0〜 4 0 倍 の 顕微鏡 の焦点深度 に合わせ る 場合は 4 . 5 μ m程度 が好 ま し いが 、 こ れに限定 さ れ る 必要はない。

溝 5 の数は、 流路.の幅に対す る 障壁の幅 と 溝の幅で決 定 さ れ る 。 例 え ば、 流路 の 幅 1 m m 、 障壁の 幅 1 0 m 溝の 幅 5 μ m の場合、 溝の数は最大で 6 6 本 と な る 。 検 出 · 観察 に適 し た溝 5 の数 は、 1 乃至約 1 0 0 本、 好 ま し く は好ま し く は約 1 0 乃至約 7 0 本で あ る 。 障壁 6 の長 さ は、 約 5〜約 400 mカゝ ら選ばれ、 例え は、 5、 10、 20、 30、 40、 60、 100、 200、 300 又は 400 μ m の も の が用い ら れる。 障壁 6 自 体の幅は適宜選ぶ こ と が で き る 。 後述する 図 25 に示す構造を採る 場合は縦横 の長 さ が ほぼ等 しい方が効果的であ る。

流路 1 を'形成する 溝 5 は、 図 21、 図 22 に例示す る ご と く 、 相対する ゥ エルに 向 カゝ ぅ 方向 に直交す る 1 乃至複 数本の溝 12 で互レヽに連通 していて も よ い。 力、 く す る こ と に よ り 細胞が通過する 様子 を よ り 正確に把握する こ と が で き る 。 そ の場合、 図 23、 図 24 の如 く 溝 5 の幅を . 相対する ゥ エルに 向 か う 方向 で こ れに直交す る 溝 12 を 横切 る 度 に段階的に変化 さ せて も 良い。 なお、 図 23 で は 、 障壁 6 自 体の 幅 が 変化す る 例 を示 し て い る が 、 図 24 に示す よ う に 、 同一 の大 き さ を有す る 障壁 6 の数 を 増減 さ せ る こ と に よ り 溝 5 の幅を変化 さ せる こ と も でき る 。

図 25 に例示す る 如 く 、 相対する ゥエルに 向 カゝ ぅ 方向 の複数の溝 5 が、 こ れに直交す る 溝 12 を横切 る 度 に、 相互の位置関係を シフ ト さ せて形成 さ れていて も よ い。 図 25 は、 相対す る ゥエルに 向力 う 方向の溝 5 が、 それ と 直交す る 溝 12 を横切 る 毎 に、 5 a と 5 b の よ う に、 2 分の 1 ピ ッ チづっ位置関係 を変えて形成 さ れてい る 場合 を示す。 溝 5 を こ の よ う に形成 さ せる こ と に よ り 、 走化 性因子や阻害物質を含有する 検体溶液の拡散を充分に行 わせ る こ と ができ 、 相対する 流路に向か う 方向 での検体 溶液を均一に分布 さ せる こ と ができ る と 共に、 細胞ゃ検 体の 注入 · 採取に よ る 昇圧 · 減圧 を よ り 効率 よ く 回避す る こ と が 可能 と な る 。

更 に 、 障壁 6 は、 図 2 6 に例示す る 如 く 相 対す る ゥ ェ ルに 向 カゝ ぅ 方向 に繋が っ た連続形であ っ て も 良い。

7 ) 流路にお け る 、 画像の位置決め のた め の 印

流路 を通過す る 細胞の状態 を検 出す る に 当 た り 、 検出 器 1 3 がー定時間経過毎 に所定の 流路上 に戻 り 、 繰返 し 検出 を行 う 場合が あ る 。 例 え ば、 後述す る よ う に 、 複数 の ゥ エルュ ニ ッ ト を集積 さ せた装置 におい て 、 各 ゥ エル ュ ニ ッ ト の 流路 を通過す る 細胞の状態 を検出す る た め に 検出器 1 3 を ス キ ャ ン さ せ、 経時的 に検出 を行 う 場合で あ る 。 こ の よ う な場合、 所定の流路 におい て は検出 画面 の範囲が 毎回 同 じ に な る よ う 、 画面の位置決 め を容易 に す る た め に 、 流路上の何れか の位置 に印 を設 け る と 便利 で あ る 。 印 は位置決 め を容易 にす る た め に役立て ば、 如 何 な る 形状 で も 良 い 。 ま た 、 印 を 設 け る 箇 所 は 、 土手 1 0 の 上部、 例 えば後述 の テ ラ ス 1 1 の何れか の箇所、 或 い は 、 何れかの障壁の上部で あ っ て も 良い。 ま た 、 設 け る 印 の数 は、 1 個 に 限 ら ず、 複数個 で あ っ て も 良 レヽ （図 2 7、 図 2 8 ( 1 )参照）。

8 ) 流路にお け る テ ラ ス

土手の 上面 に、 例 え ば図 1 、 図 2 において符号 1 1 で 示す平面 を設 け る と 細胞 の 通過 が観察 しやす く な る （こ の 平面 を テ ラ ス と 呼ぶ こ と にす る ）。 テ ラ ス 1 1 は必須の も の で は な いが 、 設 け る こ と が好ま しい。 図 2 に示す よ う に 、 テ ラ ス 1 1 を 障壁 6 の列 の両側に設 け る 場合、 そ の 相 対す る ゥ エルに 向 力、 う 方 向 の長 さ は約 0.03m m 乃 至約 0.4 m mか ら 適宜選 ばれ る 。 ま た、 図 27 に例示す る よ う に 、 障壁 6 の列 の 両側 に設 け ら れた テ ラ ス 11 i . 11 ₂ の 内 、 一方 （図 27 で は、 11 _ )を他方 （図 27 で は . 11_ ₂ ) よ り 長 く す る こ と も で き る 。 か力、 る 構造 と す る こ と に よ り 、 溝を通過 した後 の細胞の観察が容易 に な る 。

な お 、 図 27 に は、 土手上面 に + 印 （ 23 )が設 け ら れた 例 が示 さ れてい る が、 こ の 印 は必要に応 じ て設 け ら れれ ば よ い。

土手 の 中央にテ ラ ス を設 け 、 テ ラ ス を は さ んで 障壁 の列 を 2 箇所に形成す る こ と も で き （図 28 参照）、 かか る 構造 と す る こ と に よ り 、 溝 を通過 した後 の 細胞が 中央 の テ ラ ス 上 に存在す る 時間 が 長 く な り 、 観察 ■ 計数が容 易 に行われ る 。 なお、 中 央の テ ラ ス の大 き さ は、 顕微鏡 の視野でカ バー で き る 大 き さ で あ る こ と が望 ま しい。 図 28 に お い て、 （ 1 )は上面図 、 （ 2 )は断面図 で あ る。

図 28 に は 、 画像 の 位 置 決 め を 容易 に す る た め の 印 ( 23 )力 S 2 箇所に設 け ら れて い る 場合が例示 さ れてい る が こ の 印 は必要に応 じて設 け ら れれば良い。

図 29〜 図 31 は、 図 15、 図 16 に示す タ イ プの ゥ エル に お い て 、 流 路 に テ ラ ス を 設 け た 例 で あ る 。 な お 、 図 29〜 図 31 の （ 1 ) は上面図 、 （ 2 ) は、 （ 1 ) に お け る 破線で示 し た部分の断面 図 で あ る 。 図 29 は流路 を挟 ん で両側 に 、 流路に直交す る 壁 1 4 A、 1 4 B ま でテ ラ ス 1 1 A、 1 I B が設 け ら れ て い る 場合 を示す。 図 30 は流路 の 片側 に おい て の み、 流路 に 直交す る 壁 1 4 A ま でテ ラ ス 1 1 A が設 け ら れ、 反対側 に おいて は壁 1 4 B に達 し な いテ ラ ス 1 1 B が設 け ら れて い る 場合 を示す。 図 3 1 は、 細胞が 注入 さ れ る ゥ エル 2 A側 に の み流路に 直交す る 壁 1 4 A が設 け ら れて い る 場合 に おい て、 該壁 1 4 A ま でテ ラ ス 1 1 A が設 け ら れて レヽ る 場合であ る 。 図 1 5、 図 1 6 に示す タ イ プの ゥ エルに お い て 、 か力 る テ ラ ス を設 け る こ と に よ り 、 ゥ エル 2 B 側 に入れた走化性 因子や阻害物質が ゥ エル 2 A側へ と 溝 を通 り 抜 けた後 に それ等の 拡散が急激 に進む の を 防止す る こ と が でき る 。 かか る テ ラ ス が な い場合は、 流路の近傍の容積が大 き い た め 、 拡散が急激 に進む こ と に な る 。

な お 、 図 3 2 に例示す る よ う に 、 土手 1 0 を多段に形成 す る こ と 、 即 ち 、 土手 1 0 の テ ラ ス 1 1 を 多段式に形成す る こ と に よ り 、 一方 の ゥ エル側カゝ ら 吸 引 す る と 他方の ゥ エル に入れた 細胞が 土手 1 0 の近傍 に集ま り 易 く な る 。 例 え ば、 細胞 が好 中 球、 好酸球、 好塩基球等で あ る 場合 テ ラ ス 1 1— ₂及び 1 1— ₃ の ガ ラ ス 基板 8 力ゝ ら の 距離 （図 に おレヽ て は障壁 6 の 高 さ ） を 3 μ ηι、 テ ラ ス 1 1— 及び 1 1— ₄ の ガ ラ ス 基板 8 力 ら の 距離を と し、 ゥエル 2 A に 細胞 を入れ、 ゥ エル 2 B の側 力ゝ ら 液 を 吸 引 する と 、 細胞 はテ ラ ス 1 1— i の と こ ろ で一旦止 ま っ た後、 テ ラ ス 1 1 _ ₂ と ガ ラ ス 基板 8 と の 間 に集ま り 易 く な る 。 各 テ ラ ス 1 1 i ~ ₄ の ガ ラ ス 基板 8 力 ら の 距離は、 取扱 う 細胞 に 応 じ て適宜設定す る こ と が で き 、 概ね 3 乃至 の範 囲 で設定 さ れ得 る が 、 こ れに 限定 さ れ る わ け ではな い。 こ こ で 、 細胞 を収納す る ゥ エルの反対側 の テ ラ ス （ 1 1 _ ₃) の長 さ を 、 細胞 を 収納す る ゥ エル の側 の テ ラ ス （テ ラ ス 11— ₂) よ り 約 1.5 乃至 5 倍長 く す る と 、 溝を通 り 抜け た細胞の観察や計数を よ り 容易 に行 う こ と ができ る 9 ) 流路におけ る 障害物

走化性因子を入れ る 前に、 他方の ゥ エルにおいて細胞 が 同 じ条件で、 細胞の進行方向 に 向かっ て ス タ ー ト ラ イ ン に並ぶ よ う にす る ための構造の一つ と して、 流路に細 胞の移動を制限する た め の障害物 を設け る こ と が提案 さ れる。

こ こ に云 う 障害物 と は、 細胞の移動 を完全に は遮断す る こ と な く 、 その移動を制限する も の で、 例 えば、 一連 の突起の並び、 一連の三角柱や四角柱の並びを挙げる こ と ができ る が、 こ の 目 的 を達成 し得る な ら ば如何な る 形 状で も採用 し得る 。 障害物が設け ら れる 位置は、 土手の 上部であ る こ と が好ま しいが、 目 的 を達成す る のであれ ば、 土手の上部に限 られない。 土手の上面に障壁が設け ら れてお ら ず、 全面がテ ラ ス であ る場合はそ の一端付近 に設 け られる （図 40 (1)参照）。 土手の上面に障壁 と テ ラ ス が設け ら れてい る 場合は、 障壁の列に並行 して、 テ ラ ス の ゥ エル側に設け られる （図 40 (2)〜 （4)参照）。

なお、 図 40 において.、 （1)、 (2)及び （4)は障害物 と し て突起の並びが採用 さ れた場合の例示で あ り 、 （ 3 )は三 角柱の並びが採用 さ れた場合の例示であ る。

障害物の高 さ は、 細胞の径又は変形能に合わせた長 さ と 同等かそれの 2 分の 1 乃至 4 分の 1 あれば よ い。 障害 物の 間隔は、 通常は、 細胞の径又は変形能に合わせた長 さ と 同等 に設定 さ れる が、 高 さ が低 く 設定 さ れてい る場 合は、 それよ り 短 く 設定さ れていて も よ い。

10) 多数のユニ ッ ト の配列

流路を介 して連通 した複数の ゥ エルを 1 ュニ ッ ト と し て、 複数のユニ ッ ト を 1 枚の基板上に配置乃至集積 して 多数検体 を同時に処理す る ゥエ ルュニ ッ ト と する こ と が で き る 。 同 じ タ イ プの ユ エ ッ ト を 並列 に配置す る 場合

(例 えば図 33~ 35)、 円形に集積する場合 （例えば図 36) 異種の ュ ニ ッ ト を配列す る 場合 （例 え ば図 37 )等、 必要 に応 じて種々 の配置乃至集積をす る こ と が可能であ る。 以下に各図 に基づいて配置乃至集積の様式を説明する が も と よ り こ れ等は例示で あ り 、 こ れ等に限定 さ れる も の で は な く 、 目 的に応 じて種々 の組み合わせを採る こ と が で き る。

図 33 及び図 34 は、 図 3 に示す、 2 つ の ゥ エ ルが流路 を介 し て連通 して な る ゥ エ ルユ ニ ッ ト が、 1 辺が 16m mの正方形で あ る 一枚の基板 7 上に 12 個設 け ら れた場 合 を示す。 1 ュニ ッ ト の大 き さ は長辺が 5 .7m m、 短辺 が 1. 2 m m、 ユ ニ ッ ト の間隔は 0.8 m m で配置 さ れて い る 。 なお、 図 33 では、 基板 7 に設け ら れた貫通孔 3 a 及ぴ 4 a が 四角形であ る の に対 し、 図 34 は貫通孔が 円 形で あ る 場合を示す。

図 35 は、 図 15 に示すタ イ プのユニ ッ ト ゥエ ルを一枚 の基板 7 上に 12 個設けた場合を示す。

図 36 は、 2 連式の独立 した ゥエ ルユニ ッ ト が 円形に 集積 さ れてい る 場合を示す。 図 36 は各 ゥ エ ル が貫通孔 を有す る 場合 を示 し て い る が 、 貫通孔 を有 さ な い場合 も 有 り 得 る こ と は云 う ま で も な レ、。 大 き さ を例示す る と 、 ウ エ ノレ 2 A及び 2 B は 半径方 向 の 幅が 1 . 5 m m 、 流路 の 幅 は 0. 5 m m で あ り 、 10 μ m幅の 溝 5 力 S 設 け ら れ て い る 。 こ の場合、 ユ ニ ッ ト 全体 と し て の 円 の 半径 は 5 . O m m で あ る 。 勿論、 目 的 に応 じ て大 き さ を変 え る こ と が で き る 。

図 37 は、 図 33〜 図 36 に示 さ れ る 多数ユ ニ ッ ト の 集 積 を 更 に集積 さ せた場合 を示す。 即 ち 、 図 37 にお いて A i 〜 ₄ 、 B ₁ ^ ₄ C ！ ^ ₄ , D i ~ ₄ で表 さ れ る 四 辺 形 の 夫々 が 図 33〜 は図 36 で示 さ れ る ゥ エルュ ニ ッ ト の集積 で あ る 。 こ こ で、 A行、 B 行、 C 行及び D 行は互い に異 な っ た タ イ プの ュニ ッ ト の集積で あ る こ と が で き る 。

こ れ ら 、 多数の ユ ニ ッ ト を集積 さ せ る 場合 に おい て 、 プ ロ ッ ク 9 は全て の ュ ニ ッ ト に夫々 管 を接続す る 1 個 の も の と し て構成す る こ と が で き 、 ガ ラ ス 基板 8 も 全体で 1 枚 と す る こ と が で き る 。

11) ゥ エル と 流路の作製

基板 7 の材質 と し て は、 微細加工が容易 で、 細胞 に対 し比較的不活性な シ リ コ ン単結晶 が好ま しい。 流路 1 に お け る 障壁 6 及び溝 5 は、 こ の シ リ コ ン単結晶 に集積回 路 の製作で使用 さ れ る フ ォ ト リ ソ グ ラ フ ィ ゃエ ッ チ ン グ 例 え ば、 ゥ エ ツ ト エ ツ チ ン グ、 ド ラ イ エ ツ チ ン グ等 に よ り 工作 さ れ る 。 ゥ エル 2 及び貫通孔 3 a 、 4 a は障壁 6 や溝 5 に比べれば比較的大 き い の で様 々 な既知 の工作技 術 を適用 し て作製す る こ と が で き 、 例 え ば、 サ ン ド ト ラ ス ト 法ゃ ド ラ イ エ ッ チ ン グ法 を適用 す る こ と が で き る 。 シ リ コ ン 単結晶以外に も 、 硬質ガ ラ ス 、 硬質プ ラ ス チ ッ ク 、 金属 等 も 流路 にお け る 微細 な構造が構築可能で あれ ば使用 で き る 。 プ ラ ス チ ッ ク を使用す る 場合 は、 表面 に 親水性 を付与す る た め の処理、 例 え ば、 表面 に親水性薄 膜を形成 さ せ る 処理 を行 う こ と が好ま しい。 な お、 流路

1 と ウ エノレ 2 を夫々 別 に作製 し、 組合わせて も よ い。

ゥ エ ツ ト エ ッ チ ン グ に よ る 製作過程の一例 を 図 38 に よ り 説 明 す る と 、 ま ず 、 シ リ コ ン 単 結 晶 基 板 の 一 部 ( 1 ) に 、 （ 2 ) 及び （ 3 ) に示す如 く 、 溝 5 を形成 さ せ る 。 こ こ で 、 （ 2 ) は上面図 で あ り 、 （ 3 ) は破線部 にお け る 断面図 で あ る 。 次いで、 溝 5 及び障壁 6 を残 し て全体 を 障壁の 高 さ （例 え ば、 4. 5 μ m ) だ け掘 り 下げ る （ 4 ) 。 そ の 後、 中央に 土手 10 を残 して 、 更 に掘 り 下げて ゥ エル 2 A 、 2 B を形成 さ せ （ 5 ) 、 必要に応 じ サ ン ドプ ラ ス ト 法等 に よ り 、 ゥ エ ル の底部 に貫通孔 3 a 4 a を設 け る （ 6 ) 。 （ 7 ) は、 （ 6 ) の 上面図 で あ る 同様 に し て、 ゥ エルユニ ッ ト を集積 さ せた基板 も 製作す る こ と 力 S で き る 。

12) 細胞走化性検出及び細胞分離装置の組立て 本発明 の ゥ エ ルユ ニ ッ ト を用 い た細胞走化性検出及び 細胞分離装置 の組み立て は、 図 1 の タ イ プの装置に おい て は、 基板 7 と ガ ラ ス 基板 8 と を組合わせ る こ と に よ り 行 う こ と が で き 、 図 3 及び 5 の タ イ プの装置 に おレヽ て は 基板 7 、 ガ ラ ス 基板 8 及びブ ロ ッ ク 9 を組合わせ る こ と に よ り 行 う こ と が で き る 。 ブ ロ ッ ク 9 は図 3 、 図 5 や図 6 に例示す る よ う に 、 ゥ エルに通 じ る 管 を有す る 部分で あ る 。 物理的 に可能で あ れば、 ウ エノレの 貫通孔 3 a 或い は 4 a に管 を 直接装着 し て も よ く 、 そ の場合は、 ブ ロ ッ ク は必要で な い。 管 3 、 4 の 断面 は、 通常は 四角形又 は 円 形か ら 選ばれ る 。 管の 太 さ は、 特 に 限定 さ れ る も の で は な いが 、 四 角 形の場合 は 1 辺が 1 m m程度で よ く 、 円 形の場合は直径が 1 m m 程度 で よ い。 長 さ は、 細胞浮遊液、 検体溶液の容量 を保 持す る 上か ら 、 2 m n！ 〜 1 O m m程度は必要で あ る 。

ブ ロ ッ ク 又は管 を構成す る 材質 は、 ガ ラ ス 、 ア タ リ ノレ 等 の プ ラ ス チ ッ ク ス 又 は金属 か ら 選ぶ こ と が で き 、 ブ ロ ッ ク や管 は、 通常の工作手段、 例 え ば、 機械 に よ る 鑿 孔、 レー ザー光線に よ る 鑿孔そ の他に よ り 容易 に作製 さ れ る 。 ま た 、 光重合樹脂 に 光照射 し、 感光 し た部位 を残 し、 感光 し な い部位 を溶媒に よ り 溶解除去す る 方法 に よ り 、 工作す る こ と も で き る 。

ガ ラ ス 基板 8 は、 図 1、 図 3 、 図 5 、 図 6 に例示す る よ う に、 基板 7 に圧着 し て液体 を収納す る 空間 を構成 し 且つ流路 を通過す る 細胞の観察 を 可能 と す る も の で、 光 学的 に透明 且つ 平面性を保持 しす る も の で あ る 。 ま た、 細胞が接着す る こ と が望ま し い。 かカゝ る 目 的 に適 う も の で あ れ ば 、 ガ ラ ス 以外 に も 、 透 明 ア ク リ ル等 の プ ラ ス チ ッ ク も 使用 で き る 。 厚 さ は、 特 に 限定 さ れ る も の では なレヽ が、 1 〜 2 m m あれば充分で あ る 。

図 3 9 は、 本発 明 の ウ エノレュ ニ ッ ト を用 いて細胞走化 性検 出及び走化細胞分離装置 を組立て る 場合の一例 を示 す。 カ ノく一キ ャ ッ プ 1 7 と 中間支持体 2 1 の 間に ゥエ ルュ ニ ッ ト が形成 さ れた基板 7 、 ノ、。 ッ キ ング 1 6 と それを力 ノ 一す る 1 個の プロ ッ ク 9 をお き 、 中間支持体 2 1 と 底 支持体 2 2 の 間に 1 枚のガラ ス 基板 8 をお き 、 ネ ジで締 め付け る 。 プ ロ ッ ク 9 と 基板 7 と の位置関係は中間支持 体 2 1 で規定 さ れ、 中間支持体 2 1 に設 け ら れたガィ ド ピ ン 2 0 と ブ ロ ッ ク 9 の底面に設け ら れたガイ ド ピ ン受孔 1 9 に よ っ て 固定 さ れ る 。 な お、 基板 7 と ブ ロ ッ ク 9 と は直接圧着 さ せて も よ い。

1 3 ) 検出手段

本発明 において用 い ら れる 検出手段は、 流路を移動す る 細胞又は移動 した後の細胞 を検出する 手段で あ り 、 必 要に応 じ検出結果を記録する た め の手段を含む。 細胞を 検出 ■ 記録する た め に知 ら れてい る 手段で あれば何れも 使用可能であ り 、 例えば、 顕微鏡、 顕微鏡 と ビデオカ メ ラ の組合せ等であ る 。 対物 レ ン ズ に C C D カ メ ラ を取 り 付け た構造を採用す る こ と も で き る 。 集積ュ - ッ ト の検 出 において は、 対物 レ ン ズ が各ュニ ッ ト の流路を順次ス キ ャ ンする構造を採用する こ と が好ま しい。

検出手段は、 通常は、 図 1 、 図 3、 図 5 や図 6 に示す よ う に、 ユニ ッ ト の流路に設定 さ れる が、 多数ユニ ッ ト を集積 さ せた装置においては、 所定の位置に設置 さ れた 検出器に各ユ ニ ッ ト の列が順次移動 し、 検出 · 記録を行 う 構造を採る こ と も でき る 。 その場合、 検出 は、 直線上 に並んでい る 各ュニ ッ ト の流路を検出器がス キ ャ ンする こ と に よ り 行われる 。 その場合、 検出器が各流路を一定 時間毎 に繰返 し検出 し、 経诗的 に細胞 の動 き を捉え る こ と も 可能で あ る 。 ス キ ャ ンす る 検 出器は 1 個 で も 良い し 複数個 で も よ い。 力 く す る こ と に よ り 、 比較的少 な い数 の検出装置で多数の集積ュ - ッ ト に 対応する こ と が可能 と な る 。

流路 を通過 中 、 ま た は、 通過後 の 細胞の検出 · 計数 は 細胞 を 直接顕微鏡や C C D カ メ ラ 、 C C D ビデオ等で捉 え る こ と に よ り 行 う こ と も で き る が 、 常法に従い、 予 め 細 胞 を 発 光 ' 蛍光物 質 で マ ー キ ン グ し て お き 、 そ の 発 光 ■ 蛍光 を捕捉す る こ と に よ り 容易 に検出 · 計数す る こ と がで き る 。 産業上の利用 可能性

本発 明 の ウ エノレユ エ ッ ト を用 い る こ と に よ り 、 種々 の 目 的 に適 し た 細胞走化性検出及び細胞分離装置 を組み立 て る こ と が で き る 。 例 え ば、 試料注入時に水平方向 の圧 力 の変化 （昇圧） が生 じ に く く 、 外圧 に よ る 検体や細胞 の移動が起 こ り に く い、 細胞の 自 力 に よ る 運動 を正確に 捉 え る こ と が で き る 装置 を得 る こ と が で き 、 走化性因子 又 は阻害剤 の 作用 と 細胞の性質 を 忠実に反映 さ せた 定量 及び定性結果を得る こ と が で き る 。

ま た 、 ボイ デ ンチ ェ ン ノ 一 で は細胞 の ラ ン ダム ム ー ブ メ ン ト も 捕捉 さ れ る た め 、 走化性因 子な し のバ ッ ク ダ ラ ン ドが 高 い の に対 し、 本発明 の ゥ エルュ ニ ッ ト を用 レヽ る 装置 で はノ ッ ク グ ラ ン ドを ほ ぼゼ ロ にす る こ と が で き 、 定量性 も 高い。 本発 明 の ゥ エルュ ニ ッ ト は、 微量の試料 を取 り 扱 う こ と に適 し て い る 。 即 ち 、 使用 す る 細胞の量 を 、 従来使用 さ れて き た ボ イ デ ンチ ェ ン ノ 一 に 比 べ、 1 0 分 の 1 乃至 1 0 0 0 分 の 1 と す る こ と が 可能 で あ る 。 例 え ば、 試料 と し て全血 を使用 し た と き 、 好中 球の 走化性 を検出す る 場 合 は 0 . 1 1 の血液で よ く 、 好酸球、 単球又 は好塩基球 で は 1 μ 1 程度の血液で測定可能で あ る 。

更 に 、 本発 明 の ゥ エルュ ニ ッ ト は微小な も の と す る こ と が で き る た め 、 多数集積 さ せ る こ と が 可能で あ り 、 多 数の試料 を 同 時に処理す る 装置 を組み立て る こ と が で き 且つ 、 装置 の 自 動化が容易 に行 え る と い う メ リ ッ ト が ぁ る 。

本発 明 の ゥ ェ'ルュ - ッ ト は、 複数種の細胞 を含む細胞 浮遊液か ら 、 特定の細胞の み を移動 さ せた後、 こ れ を ゥ エル力 ら 採取す る の に適 して お り 、 目 的の細胞 を'的確に 採取す る こ と が で き る 。

本発 明 の ゥ エルュ ニ ッ ト は、 流路 1 に土手を設 け る こ と 、 更 に は、 土手 に細胞の径又 はそ の変形能 に合わせた 幅及 び Ζ又 は深 さ の溝 5 を種種の態様で設 け る こ と 、 或 い は、 土手に細胞の径又はそ の 変形能 に合わせた深 さ を 形成する 平面 を設 け る こ と に よ り 、 細胞 の個々 の動 き を よ り 容易 に捉 え る こ と が可能 と な る 。 ま た、 土手を設 け る こ と 、 或い は土手 に溝 を構成す る 障壁 を設 け る こ と に よ り 、 ゥ エルに入れた細胞が 、 走化 開始前 に流路の近傍 に集ま り 、 細胞の進行方向 に 向 か っ て並ぶ と い う 状態が 容易 に作 り 出 さ れ る 。 こ の こ と は、 細胞の 走化性 を検出 する 際の正確性を高め る。

本発 明の ゥ エルュニ ッ ト に よ れば、 複数種の細胞 を含 む試料、 例 え ば、 全血を用いて、 その 中 に含まれる 種々 の血球の一部 について、 こ れを予め分離す る こ と な く 、 走化性を調べ る こ と ができ 、 又、 走化性因子を適当 に選 ぶ こ と に よ り 、 複数種の細胞を含む試料か ら 細胞を種類 ご と に分離す る こ と ができ る。

Claims

求 の

. 液体試料 を静止 した状態で収納 で き る ゥ エルの複 数個 が流路 を介 し て互い に連通 し て レヽ る こ と 、 流路 に は 土手が設 け ら れて レヽ る こ と 、 ゥ ェルは ガ ラ ス 基板 と 密着 す る よ う に形成 さ れ言青てい る こ と 、 土手 の 上部 に は細胞の 径又 はそ の変形能 に合わせた幅及び Z又は深 さ の溝 を 1 乃至複数本構成す る 障壁が設 け ら れて い る か、 又 は平面 が設 け ら れて お り 、 該平面はガ ラ ス 基板 と の 間 で細胞の 径又 はそ の変形能 に合わせた隙間 を形成す る べ く 設 け ら れて い る こ と を 特徴 と す る 細胞走化性検出及び細胞分離 の た め の ウ エノレュ ニ ッ 卜 。

2 . 液体試料を静止 し た状態 で収納で き る ウ エ ノレ の複 数個 が流路 を介 し て 互い に連通 して レヽ る こ と 、 流路 に は 土手が設 け ら れて い る こ と 、 土手の 上部 に は細胞の径又 はそ の変形能 に合わせた幅及び Z又 は深 さ の溝 を 1 乃至 複数本構成す る 障壁が設 け ら れてい る こ と を特徴 と す る f 求項 1 記載の ウ エノレュ ニ ッ ト 。

3 . 複数 の ゥ エ ル が流路 を介 して 直列 に連通 し て い る こ と を特徴 と す る 請求項 1 記載 の ウ エ ノレュ ニ ッ ト 。

4 .. 1 つ の ウ エ ノレ に 复数の ゥ ェルが流路 を介 して連通 し て い る こ と を特徴 と す る 請求項 1 記載の ウ エ ノレュ 二 ッ 卜 。

5 . 1 つ の ゥ エル に流路 を介 して連通 し て い る 複数の ゥ ェ ル の 内、 少 な く と も 2 つ の ゥ エルが流路 を介 し て更 に他の共通 の ゥ エル と 連通 して い る こ と を 特徴 と す る 請 求項 4 記載の ウ エノレュ エ ツ ト 。

6 . 複数の ゥ エル が 、 細胞浮遊液 を収納す る ゥ エ ル及 び走化性因 子 を含有す る 溶液 を 収納す る ゥ エ ル で あ る こ と を特徴 と す る 請求項 1 記載の ゥ エルュ ニ ッ ト 。

7 . 複数の ゥ エ ル が 、 細胞浮遊液 を収納す る ゥ エ ル、 走化性因 子 を含有す る 溶液 を収納す る ゥ エ ル及び走化性 因子阻害剤 を含有す る 溶液 を収納す る ゥ エ ル で あ る こ と を特徴 と す る 請求項 1 記載の ゥ エルュニ ッ ト 。

8 . 流路 を介 して互い に連通 して い る ゥ エ ル の何れか 一方又は双方 に おい て 、 流路の近傍 に お け る 液体の量を 制限す る た め に 、 流路 に直交 し て壁 を設 け る こ と を特徴 と す る 請求項 1 記載の ゥ エ ルュニ ッ ト 。

9 . 請求項 8 記載の ゥ エ ルュ ニ ッ ト に お い て 、 流路に 直交 し て 設 け ら れて い る 何れか一方又は双方の壁の ま で テ ラ ス が形成 さ れて い る こ と を特徴 と す る ゥ エルュニ ッ 卜

1 0 . 土手の 上部の何れか の箇所に 、 細胞 を 検出す る 画 面の位置決 め を行 う た め の 印 を設 け る こ と を 特徴 と す る 請求項 1 記載の ゥ エルュニ ッ ト

1 1 . 流路 に おいて 、 土手が 多段 に形成 さ れて い る こ と を特徴 と す る 請求項 1 記載の ゥ エルュ ニ ッ ト 。

1 2 . 流路 に設 け ら れて い る 溝が 、 相対す る ゥ ェルに向 か う 方向 に 直交す る 1 乃至複数本の溝で互い に連通 して い る こ と を特徴 と す る 請求項 2 記載の ゥ エルュ - ッ ト 。

1 3 . 流路に おい て、 相対する ゥ エルに 向 力 う 方向 の複 数本の溝の幅が 、 こ れに直交す る 1 乃至複数の溝を横切

行に

る 度 に段階的 に 変化す る こ と を特徴 と す る 請求項 1 2 記 の ゥ ェルュニ ッ ト 。

1 4 . 流路 に お い て 、 相対す る ゥ ェルに 向 力、 う 方向 の複 の溝が 、 こ れ に 直交す る 1 乃至複数本の溝 を横切 る 度 、 相互の位置 を シフ ト さ せて形成 さ れて レヽ る こ と を特 徴 と す る 請求項 1 2 記載の ゥ エルュニ ッ 卜 。

1 5 . 流路 に お レヽ て 、 細胞 の径又はそ の 変形能に合わせ 幅及び Z又 は深 さ の溝 を 1 乃至複数本構成す る 障壁の 連の列の 前後 に テ ラ ス が設 け ら れて お り 、 且つ、 細胞 の進行方向 に お け る テ ラ ス の長 さ が他方の テ ラ ス の長 さ よ り 長い こ と を特徴 と す る 請求項 2 記載の ゥ エルュ ニ ッ 卜

1 6 . 流路 に お い て 、 中央 にテ ラ ス を設 け 、 細胞の径又 はそ の変形能 に合わせた幅及び /又 は深 さ の溝を 1 乃至 複数本構成す る 障壁の列が該テ ラ ス を挟んで 2 箇所に形 成 さ れて お り 、 所望に よ り 、 障壁の列の外側 に も テ ラ ス が設 け ら れて い る こ と を特徴 と す る 請求項 2 記載の ゥ ェ ルュ ニ ッ ト 。

1 7 . 土手の 上部 に 、 細胞 を ス タ ー ト ラ イ ン に並べ る 際 に細胞の移動 を制 限す る た め の 障害物 を 、 相対す る ゥ ェ ノレに 向 力 ^s う 方向 に 直交 し て設 け る こ と を特徴 と す る 請求 1 記載の ウ エノレ ュニ ッ ト 。

1 8 . 土手の 上部 に 、 細胞 を ス タ ー ト ラ イ ン に 並べ る 際 細胞の移動 を制 限す る た め の 障害物 を 、 障壁の列 に並 して設 け る こ と を特徴 と す る 請求項 2 記載の ゥ エルュ ッ 卜 。

19. 請求項 1 乃至 18 記載の ゥ エルユ ニ ッ ト の夫々 を 1 ュ ニ ッ ト と し 、 同一又 は複数種の ュ ニ ッ ト を複数個集 積 して な る こ と を特徴 と す る 細胞走化性検出及び細胞分 離装置の た め の ゥ エルュニ ッ ト 。