KR100795292B1 - 세포 주화성 검출장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 미량의 세포를 사용해서, 세포의 주입 및 위치의 조정에 있어서의 제어가 보다 간단하게 행해지며, 또한, 웰(well) 내에 있어서 소정의 위치에 설정된 세포나 주입된 검체 시료의 예측할 수 없는 이동을 확실하게 방지하는 것을 목적으로 한 세포 주화성 검출장치로서, 두 개의 웰이 세포의 통과에 대하여 저항성을 갖는 유로를 통해서 상호 연통(連通)하고 있으며, 각각의 웰에는 세포 또는 검체 시료를 주입하기 위한 개구부가 형성되어 있고, (1)액체를 이동시키는 수단 및 액체의 주입 또는 흡인 배출 후에 그 이동을 정지시키는 수단을 구비하고 있는 것, 및 (2)세포 주입측 및 검체 시료 주입측 중 어느 한쪽 또는 양쪽의 개구부를 폐색(閉塞)하는 수단을 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 세포 주화성 검출장치에 관한 것이다.

기판, 제방, 세포 수납 웰, 검체 시료 수납 웰, 주입 펌프, 시린지

Description

세포 주화성 검출장치{Apparatus for detecting cell chemotaxis}

본 발명은 세포 주화성 검출장치에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 미량의 세포를 사용해서 세포의 주화성을 검출할 수 있는 장치로서, 미소한 웰(well)의 내부에서 세포의 위치의 설정을 용이하게 조절할 수 있으며, 또한, 주화성 인자 등의 검체 시료가 유로에 있어서 형성하는 농도구배를 안정적으로 유지할 수 있는 구조를 구비한 세포 주화성 검출장치에 관한 것이다.

본 발명자들은, 미량의 세포를 사용해서 세포의 주화성을 검출할 수 있는 장치로서, 웰의 하나에 세포 현탁액을, 다른쪽 웰에 검체 시료를 각각 넣고, 웰 사이에 형성한 유로를 통해서, 세포가 검체 시료가 수납되어 있는 웰을 향하여 이동하는지의 여부를 검출하는 세포 주화성 검출장치에 대해서, 후술하는 바와 같은 몇 가지 제안을 해 왔다. 세포의 주화성을 검출하기 위한 장치가, 1개씩의 세포의 레벨로 관찰 내지 검출할 수 있는 스케일의 것이며, 10 내지 100개 정도의 수로 세포의 측정이 가능하다면, 희소한 세포의 검사도 용이하게 행할 수 있음과 아울러, 세포의 반응을 정량적으로 분석해서 검토하는 것도 가능해진다고 하는 이점이 있다. 그러나, 유로를 통해서 상호 연통(連通)하는 웰의 각각에 세포 주입구나 검체 시료 주입구가 형성되어 있는 구조에 있어서는, 유로를 통하여 웰이 상호 연통관(連通 管)을 형성하기 때문에, 특히 유로에 있어서의 액(液)의 이동이 일어나기 쉽다. 즉, 세포 등의 시료를 웰에 주입할 때에, 주입에 의한 승압의 영향이 발생하기 쉽고, 그 때문에 세포나 검체 시료가 예측할 수 없는 이동을 일으키기 쉽다. 또한, 주입 후에 있어서 웰이 완전히 수평으로 유지되어 있지 않은 경우나 진동 등에 의해 액면(液面)에 미세한 움직임이 발생한 경우도, 유로에 있어서의 액체의 이동이 증폭되어, 세포나 검체 시료의 이동이 일어나기 쉽다. 세포나 검체 시료의 예측할 수 없는 이동은, 검체가 주화성 인자인지의 여부의 판정을 혼란시키는 원인이 된다. 따라서, 세포가 검체 시료의 확산 농도구배를 감지해서 검체 시료를 수납하는 웰을 향하여 이동하는 것을 정확하게 검출하기 위해서는, 유로를 포함시켜, 웰 내의 액의 예측할 수 없는 이동을 엄밀하게 방지하는 것이 필요하다. 또한, 세포의 주화성을 보다 정확하게 파악하기 위해서는, 웰 내의 세포가 스타트시에 유로에 대하여 동일한 상태, 즉, 일렬로 늘어서 있는 것이 바람직하다.

본 발명자들은 앞서, 마이크로 피펫(micropipette) 등에 의해 세포나 주화성 인자 등의 시료를 주입하거나 또는 흡출하기 위한 관을 구비하고 있는 웰에 시료를 주입하거나 또는 흡출할 때에 있어서, 웰 내에 있어서의 압력의 급격한 변화를 완화시키고, 웰 내에 있어서의 시료의 예측할 수 없는 이동을 방지하기 위해서, 시료를 주입하거나 또는 흡출하기 위한 관과 연통하는 관계에 있는 관을 구비하는 것을 제안하였다(일본국 특허공개 2002-159287호). 이것은, 연통관을 통하여, 시료를 주입하거나 또는 흡출할 때의 압력을 분산시키는 구조를 채용하고 있다.

또한 본 발명자들은, 복수의 웰이 유체에 대해서 저항성을 갖는 부분을 통하 여 상호 연통하고 있으며, 또한 각각의 웰이 시료를 주입·흡출하기 위한 관 및, 필요에 따라서, 주입·흡출시의 압력의 변화를 완화하기 위한 관을 구비하고 있는 구조에 있어서, 그들 복수의 관이 상단부에 있어서 액체를 수납할 수 있는 공간을 공유하고 있는 미량 시료 처리장치, 예를 들면 세포 주화성 검출장치를 제안하였다(WO 02/46356). 각 웰에 형성되어 있는 모든 관의 상단부가 액체를 수납할 수 있는 공간을 공유하는 구조를 채용함으로써, 시료 주입시나 그 후의 액의 이동을 방지하는 것을 가능하게 하는 것이다. 또한, 이 장치에서는, 주입된 세포의 웰 내에 있어서의 위치를 이동시켜서, 세포를 유로의 일단(一端)의 스타트 라인에 일렬로 늘어놓는 것도 가능하며, 그를 위하여, 웰 내의 액체의 주입·배출을 정밀하게 제어하는 수단을 구비하고 있다.

그러나, 웰 내에 주입한 세포를 유로의 일단의 스타트 라인에 일렬로 늘어놓기 위해서는 웰 내의 액체를 이동시킬 필요가 있는데, 그를 위하여 미묘한 컨트롤이 필요하고, 또한, 그 후의 유로에 있어서의 액의 이동을 방지하기 위해서, 다시 액을 관의 상단부의 공간으로 되돌릴 필요가 있는 등, 복잡하고 엄밀하게 제어된 조작이 필요하였다.

본 발명자들의 상기 제안 이외에도, 세포나 검체를 수납하는 웰을 유로로 연결하고, 웰에 형성되어 있는 세포나 검체의 주입구를 필요에 따라서 폐색(閉塞)시키는 수단을 구비한 세포 주화성 검출장치가 알려져 있다(USP5744366). 그러나, 이것은 웰 내에 있어서 세포의 위치를 조절할 수 없기 때문에, 스타트시에 있어서의 세포의 조건을 조정할 수 없다.

본 발명은, 이러한 장치를 더욱 개량해서, 미량의 세포를 사용하여, 그 주화성을 보다 정확하게 검출하기 위한 구조를 제공하는 것을 목적으로 하는 것으로, 세포나 검체의 주입을 용이하게 행할 수 있으며, 주입 후의 세포 위치의 조정을 위한 제어가 보다 간단하게 행해지고, 또한, 웰 내에 있어서 소정의 위치에 설정된 세포나 주입된 검체 시료의 예측할 수 없는 이동이 확실하게 방지되기 때문에 시료 검체의 확산에 의한 농도구배가 안정적으로 유지되며, 또한, 조작·제어의 자동화에 한층 적합한 세포 주화성 검출장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

[관련 문헌]

1. 일본국 특허공개 2002-159287호

2. WO 02/46356

3. USP5744366

본 발명은, (1)두 개의 웰(well)이 유로를 통해서 상호 연통(連通)하고 있으며, 각각의 웰에는 세포 또는 검체 시료를 주입하기 위한 개구부가 형성되어 있는 구조에 있어서, 웰 내에서 부유세포의 위치를 조절하기 위하여 액체를 이동시키는 수단 및 액체의 주입 또는 흡인 배출 후에 그 이동을 정지시키는 수단을 구비하고 있고, 또한, 세포 주입측 및 검체 시료 주입측 중 어느 한쪽 또는 양쪽의 개구부를 폐색(閉塞)하는 수단을 구비하고 있는 세포 주화성 검출장치이다.

여기에서, (2)액체를 이동시키는 수단 및 액체의 주입 또는 흡인 배출 후에 그 이동을 정지시키는 수단을 함께 구비하고 있는 장치의 바람직한 예로서는, 맥동 펌프 또는 시린지(syringe)를 들 수 있다.

또한, (3)상기 개구부를 폐색하는 수단의 바람직한 예로서는, 유연한 마개, 슬라이드식 개폐장치, 탭(tap), 밸브 중 어느 하나 또는 그들의 조합을 들 수 있다.

본 발명의 한 형태로서, 두 개의 웰이 제방(bank)을 통하여 형성되어 있는 기판과 그것에 밀착하는 유리 기판으로 구성되며, 제방이 유리 기판과의 사이에서, 부유세포의 통과에 대하여 저항성을 갖는 유로를 형성하는 세포 주화성 검출장치를 들 수 있다. 여기에서, 상기 기판 또는 상기 기판과 상기 유리 기판 사이에 액체를 이동시키기 위한 개구부가 형성되어 있고, 상기 개구부에, 액체를 주입 또는 흡인 배출함으로써 이동시키며, 그 후 액체의 이동을 정지시키는 수단/장치가 형성되고, 또한, 기판에 형성된 웰 중 어느 한쪽에 세포 주입구를, 다른쪽 웰에 검체 시료 주입구가 형성되며, 그들 주입구 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 폐쇄하는 수단/장치가 형성되어 있다.

여기에서, 기판에 형성된 제방은 유리 기판과의 사이에서 부유세포의 통과에 대하여 저항성을 갖는 유로를 형성하고, 제방의 상부에 테라스(terrace)를 형성할 수 있으며, 상기 테라스와 유리 기판 사이에서 세포의 직경 또는 그 변형능(變形能)에 맞춘 틈새를 형성시킬 수 있다. 혹은, 유로에 있어서, 제방의 상부의 테라스에 세포의 직경 또는 그 변형능에 맞춘 폭의 홈을 1 내지 복수개 구성하는 장벽을 형성하고, 필요에 따라서, 상기 장벽도 유리 기판과의 사이에서 세포의 직경 또는 그 변형능에 맞춘 틈새를 형성할 수 있다. 또한, 유로에 있어서, 홈을 구성하는 장벽의 열이 테라스상의 2부위에 형성되어 있어도 된다. 또한, 유로에 형성된 제방에, 유리 기판과의 사이에서 다른 깊이의 틈새를 형성하기 위해서, 테라스가 다단으로 형성되어 있어도 된다.

본 발명의 다른 형태로서, 기판 및 유리 기판이 일체인 것으로서 구성되어 있으며, 적어도 한쪽의 한 면이 투명한 구조를 들 수 있다.

본 발명은, 상기한 세포 주화성 검출장치를 단위 유닛으로 해서, 그 동일 또는 복수종의 유닛을 복수개 집적시켜서 이루어지는 집적 유닛으로 구성되는 집적형 세포 주화성 검출장치를 포함하며, 또한, 상기 집적 유닛을 단위 유닛으로 해서, 그 동일 또는 복수종의 유닛을 복수개 집적시켜서 이루어지는 집적형 세포 주화성 검출장치를 포함한다.

도 1은 세포 주입구측으로부터의 액체의 수송에 의해 세포를 제방 단(端)에 모으는 타입의 세포 주화성 검출장치의 일례를 나타내는 개념도이다. 화살표는 장치를 채우는 액체의 이동하는 방향을 나타낸다.

도 2는 도 1의 맥동 펌프를 대신해서, 시린지(syringe)를 사용하는 경우의 개념도이다.

도 3은 폐색(閉塞) 수단으로서 밸브를 채용한 경우의 예를 나타내는 개념도이다. 화살표는 장치를 채우는 액체의 이동하는 방향을 나타낸다.

도 4는 폐색 수단으로서 슬라이드식 개폐장치를 채용한 경우의 개념도이다.

도 5는 도 4의 구조에 더해서, 검체 시료 주입구의 개폐도 행하는 구조의 개 념도이다.

도 6은 폐색 수단으로서 유연한 마개를 채용한 경우의 개념도이다.

도 7은 검체 시료 주입구측으로부터의 액체의 흡인 배출에 의해 세포를 제방 단에 모으는 타입의 세포 주화성 검출장치의 일례를 나타내는 개념도이다. 화살표는 장치를 채우는 액체의 이동하는 방향을 나타낸다.

도 8은 도 7의 타입에 있어서, 액체를 순환시키는 구조의 개념도이다. 화살표는 장치를 채우는 액체의 이동하는 방향을 나타낸다.

도 9는 도 8의 타입에 있어서, 세포 주입구를 폐색하는 구조의 개념도이다. (1) 및 (3)은 단면도이고, (2) 및 (4)는 각각의 상면도이다. 화살표는 장치를 채우는 액체의 이동하는 방향을 나타낸다.

도 10은 세포 주입구 및 검체 시료 주입구의 양방을 폐색하는 구조의 개념도이다.

도 11은 도 6의 타입의 단위 유닛을 복수 집적시킨 경우의 개념도이다.

도 12는 도 10의 타입의 단위 유닛을 복수 집적시킨 경우의 개념도이다.

도 13은 제방 및 유로의 구조의 일례를 나타내는 단면도이다.

도 14는 유로에 장벽과 홈을 형성한 경우의 일례를 나타낸다.

도 15는 제방에 형성된 테라스의 양측에 장벽의 열을 2부위에 형성한 예를 나타낸다. (1)은 상면도, (2)는 단면도이다.

<부호의 설명>

1 : 기판 2 : 제방

3 : 세포 수납 웰 4 : 검체 시료 수납 웰

5 : 세포 주입구 6 : 검체 시료 주입구

7 : 맥동 펌프 8 : 주입 파이프

9 : 세포의 통과에 대하여 저항성을 갖는 유로

10 : 유리 기판 11 : 검출기

12 : 세포 13 : 시린지

14 : 액체 주입 수단 15 : 세포 현탁액 저장탱크

16 : 밸브 17 : 슬라이드식 개폐장치

18 : 액체 주입구 19 : 유연한 마개

20 : 세포 주입기 21 : 흡인 배출 파이프

22 : 검체 시료 주입기 23 : 테라스

24 : 장벽

25 : 유로를 사이에 두고 상대하는 웰을 향하는 방향의 홈

26 : 화면의 위치 결정을 위한 표시

본 발명에 따른 세포 주화성 검출장치는, 두 개의 웰(well)이 세포의 통과에 대하여 저항성을 갖는 유로로 상호 연통(連通)하고 있으며, 웰의 하나에 세포 현탁액을 넣은 후, 세포를 유로의 일단(一端)에 일렬로 늘어놓고, 다른쪽 웰에 검체 시료를 넣어, 검체 시료의 농도구배를 검지한 세포가 검체 시료가 수납되어 있는 웰을 향해서 유로를 통과하는 상태를 관찰하거나, 혹은 통과중 또는 통과한 세포수를 계수할 수 있는 장치이다.

상기에서 말하는, 세포의 통과에 대하여 저항성을 갖는 유로란, 비흡착 상태에서 세포가 취할 수 있는 형태(통상은 구형(球形))에서는 통과할 수 없으나, 세포가 갖는 변형능에 의해 형태를 편평하게 변화했을 때에 통과할 수 있는 틈새를 갖는 세포의 통로이다. 여기에서, 세포의 변형능이란, 세포가 탄력성을 갖는 것일 때, 그 탄력성으로 인해 용이하게 형태를 변화시켜서, 편평형상이나 끈형상 등의 형태를 취하여, 통상, 세포가 자유 공간에서 취하는 형태(구형)에 있어서 갖는 직경보다도 좁은 간격의 홈이나 틈새를 빠져나가는 것을 말한다.

본 발명에 따른 세포 주화성 검출장치의 특징으로 하는 점은, 상기의 기본적 구조에 더해서, 웰 내에 있어서 세포의 위치를 조절하기 위하여 액체를 주입 또는 흡인 배출하는 수단 및 액체의 주입 또는 흡인 배출 후에 액체의 이동을 정지시키는 수단을 구비하고, 또한, 웰 내로의 세포 주입 후, 세포 주입측 및 검체 시료 주입측 중 어느 한쪽 또는 양쪽의 개구부를 폐색하는 수단을 구비하고 있는 것이다. 액체를 주입 또는 흡인 배출함으로써 세포를 이동시키는 수단을 구비하는 것에 의해, 세포를 유로의 일단의 스타트 라인에 일렬로 늘어놓는 것이 용이해진다. 또한, 세포 주입측 및 검체 시료 주입측 중 어느 한쪽 또는 양쪽의 개구부를 폐색함으로써, 유로를 통하여 연통관을 구성하는 웰의 액면(液面)의 이동은 없어지며, 유로에 있어서의 액의 이동도 없어진다. 즉, 장치에 진동이 가해지더라도 세포의 예측할 수 없는 이동이나 유로에 형성되는 검체 시료의 농도구배가 변동하는 것이 억제된다. 액체의 주입 또는 흡인 배출 후에 그 이동을 정지시키는 수단은 개구부의 폐색을 완전히 행하기 위해서 필요하다.

이 구조를, 도 1(1) 및 (2)의 개념도에 의해 설명하면, 기판(1)에는 돌기형상의 제방(bank;2)이 형성되어 있고, 제방(2)과 유리 기판(10) 사이에서 세포의 통과에 대하여 저항성을 갖는 유로(9)가 형성되어 있다. 우선, 세포 현탁액은 액체 주입 수단(도 1에서는, 7로 나타내는 맥동 펌프)에 의해 주입 파이프(8)를 지나 세포 주입구(5)로부터 세포 수납 웰(3)에 보내진다. 세포는, 액체의 흐름에 의해 세포의 통과에 대하여 저항성을 갖는 유로(9)의 단(端)에 모이고, 여분의 액체는 검체 시료 주입구(6)로부터 배출된다((2)의 12참조). 유로(9)의 단에 온 세포는 액의 흐름을 차단하기 때문에, 흐름은 세포가 없는 부위를 통과한다. 그 결과, 다른 세포가 이 공간을 메우게 되고, 이렇게 해서 세포는 유로(9)의 단에 열을 이루어 늘어서게 된다. 세포 현탁액의 주입 속도는, 특히 엄밀하게 설정할 필요는 없지만, 예를 들면, 호중구(好中球)나 호산구(好酸球)의 경우는 유로의 틈새가 5㎛인 경우, 30∼40㎛/초 정도의 이동 속도가 바람직하다. 이어서, 맥동 펌프(7)에 의한 액체의 수송을 정지함과 아울러 주입 파이프(8)를 폐색시킴으로써, 세포 주입구가 폐색되게 된다. 그 후, 검체 시료 주입구(6)로부터 주화성 인자를 주입한다. 이 때, 세포주입구가 폐색되어 있기 때문에, 액체의 역류가 방지되고, 유로(9)의 단에 모여 있는 세포의 줄이 흩뜨려지는 일이 없으며, 또한, 유로에 있어서의 액의 예측할 수 없는 이동이 일어나는 일도 없다. 이렇게 해서, 세포는, 유로(9)에 안정적으로 형성된 주화성 인자 등의 검체 시료의 농도구배를 감지하여, 검체 시료 수납 웰측으로 이동하기 위해서, 변형하여 유로(9)를 통과한다. 그 통과 상태를 유리 기판(10) 을 통하여 검출기(11)로 관찰한다.

액체 주입 수단으로서 사용하는 맥동 펌프의 일례로서는, 공기압을 변화시키는 것에 의한 맥동을 이용해서, 액체 수송 파이프를 통하여 소량의 액체를 수송하는 장치를 들 수 있다. 이것은, 1㎕ 내지 10분의 1㎕의 오더(order)로 액체를 정량적으로 수송하는 것이 가능하며, 또한, 수송 파이프를 폐색할 수 있다. 예를 들면, Fluidigm Corporation(South San Francisco, CA)제의 MSL Active Microfluidic Chip Control Hardware(상품명)가 알려져 있다. 이 외에도, 맥동을 이용하는 액체 수송 수단으로서, 상기 외에, 압전소자의 진동을 이용하는 장치도 알려져 있다. 본 발명의 액체 주입 수단으로서는, 이들 중 어떠한 것도 사용할 수 있다. 한편, 압전소자의 진동을 이용하는 장치는 유체 수송 후, 파이프를 폐색할 수 없기 때문에, 폐색 수단을 별도로 형성하는 것이 필요하다.

액체 주입 수단으로서, 맥동 펌프 이외에도 여러 가지 수단을 채용할 수 있고, 예를 들면, 도 2의 13에 나타내는 바와 같은 시린지(syringe)를 채용할 수도 있다. 시린지는, 스테핑 모터(stepping motor)(펄스 모터(pulse motor)라고도 불린다)로 구동시킴으로써, 정량적으로 액체를 수송할 수 있다. 또한, 시린지를 사용하면, 액체의 수송 정지가 그대로 주입구(5)의 폐색이 되어, 액체의 역류를 발생시키지 않기 때문에, 바람직한 수단이라고 말할 수 있다.

예를 들면, 도 3(1), (2)에 나타내는 바와 같이, 주입구의 폐색을 밸브로 행할 수도 있다. (1)에서는, 주입 파이프(8)에 밸브(16)를 형성한 경우의 예시이고, (2)는 세포 현탁액 저장탱크(15)와 주입 파이프(8) 사이에 밸브(16)를 형성한 경우 의 예시이다. 한편, 도 3에 있어서의 14는, 맥동 펌프, 시린지 등의 액체 주입 수단이다. 밸브(16) 대신에, 밸브와 동일한 기능을 갖는 것을 사용할 수도 있으며, 예를 들면, 유연하고 탄력성이 있는 재질로 만들어진 파이프를 압력으로 찌그러트림으로써 액체를 정지시켜도 된다.

기판에 형성된 세포 주입구 또는 검체 시료 주입구를 폐색하는 수단은 여러 가지 있다. 예를 들면, 도 4의 17에 나타내는 바와 같은 슬라이드식 개폐장치를 채용할 수도 있다. (1)은 세포를 주입하기 위하여 세포 주입구(5)가 열려 있는 상태를 나타낸다. 세포 주입구(5)로부터 세포를 주입 후, (2)에 나타내는 바와 같이, 슬라이드식 개폐장치(17)를 슬라이드시켜서 세포 주입구(5)를 폐색한다. 이어서, 주입된 세포는 액체 주입 수단(14)에 의해 주입 파이프(8)를 통하여 수송되는 액체(예를 들면, 완충액)의 흐름에 실려 유로(9)의 단까지 운반된다. 세포의 이동 후에 주입 파이프(8)의 폐색을 행하는데, 그 수단은 상기한 수단에서 적절히 선택해서 채용된다. 슬라이드식 개폐장치(17)의 개폐 조작은, 예를 들면 회전수를 제어할 수 있는 스테핑 모터 등에 의해 용이하게 행할 수 있다.

도 5는 도 4의 구조의 변형예로서, 슬라이드식 개폐장치(17)가, 세포 주입구(5)를 연 상태에 있을 때는 검체 시료 주입구(6)를 닫고 있고(1), 세포 주입구(5)를 닫았을 때 검체 시료 주입구(6)가 열린(2) 구조의 예를 나타내고 있다.

도 6은 세포 주입구(5)의 폐색을 유연한 마개(19)로 행하는 경우의 예시이다. 예를 들면, 탄력성이 풍부한 막(膜)형상의 실리콘 고무, 폴리우레탄, 폴리에틸렌, 생고무 등으로 세포 주입구(5)를 막는다(도 6(1)). 세포의 주입은, 마개(19)를 관통하는 세포 주입기(20)로 행한다(도 6(2)). 세포 주입 후, 주입기(20)를 뽑아내면 마개(19)는 그 탄력성에 의해 관통구가 폐색되고, 세포(12)는 액체 주입구(18)로부터 수송되는 액체에 의해 유로(9)의 단(端)에 모인다(도 6(3)). 한편, 마개 대신에, 통상은 가볍게 닫고 있으나, 주입기가 용이하게 관통할 수 있는 탭(tap) 등도 채용할 수 있다.

도 1∼6의 구조를 대신해서, 예를 들면 도 7에 나타내는 바와 같이, 제방(2)을 사이에 두고 세포 수납 웰(3)과 반대 위치에 있는 검체 시료 수납 웰(4) 쪽으로부터 액체를 흡인 배출함으로써 세포(12)를 세포 수납 웰(3)의 유로(9)의 단에 모으는 구조로 할 수도 있다. 한편, 도 7에서는 액체의 흡인을 시린지(13)로 행하는 경우를 나타내고 있으나, 동일한 기능을 갖는 다른 수단, 예를 들면 맥동 펌프 등으로 치환할 수도 있다.

본 발명의 장치는 액체(세포 현탁액의 매체)를 순환시키는 타입으로 할 수도 있다. 도 8(1)∼(4)에 그 개념도를 나타낸다. 도 8(1)은, 세포 수납 웰(3)에 주입관(8)이, 검체 시료 수납 웰(4)에 흡인 배출 파이프(21)가 각각 형성되고, 검체 시료 주입구(6)가 유연한 마개(19)로 폐색되어 있는 경우를 나타내고 있다. 액체의 순환은 (4)에 나타내는 바와 같이, 액체를 한 방향으로 이동시키는 수단, 예를 들면 맥동 펌프(7)로 행해진다. (1) 및 (2)는 세포 주입구(5)로부터 세포를 주입한 상태를 나타내고 있으며, (3) 및 (4)는 액체를 화살표 방향으로 이동시키고, 그 결과, 세포가 유로(9)의 단에 모이는 상태를 나타내고 있다. 이 경우, 인자는, 검체 시료 주입구(6)로부터, 마개(19)를 관통해서 주입된다. 한편, 검체 시료 주입구(6) 의 폐색은, 마개 이외의 수단, 예를 들면 슬라이드식 개폐장치, 밸브, 탭 등으로 행할 수도 있다.

도 9는 도 8의 구조를 대신해서, 세포 주입구(5)를 폐색시키는 경우를 예시하고 있다. 세포 주입구(5)의 폐색은, 도 9에 나타내는 바와 같이 유연한 마개(19)로 행할 수도 있으나, 슬라이드식 개폐장치, 밸브, 탭 등으로 행할 수도 있다.

도 10은 본 발명의 장치 외의 변형예를 나타내는 것으로, 세포 주입구(5) 및 검체 시료 주입구(6)의 양방이 폐색되어 있는 경우의 개념도이다. 도 10에서는, 각각의 주입구(5, 6)는 유연한 마개(19)로 폐색되어 있는 경우를 예시하고 있으며, 세포 및 인자는 각 마개를 관통해서 주입된다. 세포를 유로(9)의 단에 모으기 위해서는, 예를 들면, 도시하는 바와 같이, 세포 수납 웰(3)측 및 검체 시료 수납 웰(4)측의 양방에 예를 들면 시린지(13)와 같은, 액체 수송 후에 액체의 이동을 정지시키는 수단을 구비하고 있는 액체 수송 수단을 형성하고, 그들의 연동에 의해 액체를 세포 수납 웰(3)측으로부터 검체 시료 수납 웰(4)측으로 이동시킨다. 주입구의 폐색 수단으로서, 마개 이외의 수단, 예를 들면 슬라이드식 개폐장치 등을 채용할 수 있는 것은 말할 것도 없다.

이상 서술해 온 본 발명의 장치에 있어서, 기판과 유리 기판을 일체화한 것으로서 구성할 수 있으며, 적어도 한쪽의 한 면이 광투과성, 즉, 투명한 구조를 취할 수 있다.

본 발명은, 이상 설명한 장치를 단위 유닛으로 해서, 그들의 복수를 집적시킨 장치도 포함한다. 예를 들면, 도 11에 그 개념도를 나타내는 바와 같이, 세포 주입구(5)를 폐색시킨 유닛을 주입 파이프(8)로 연결하고, 세포 수납 웰에 존재하는 세포를 동시에 제방 단에 모으는 장치를 조립할 수 있다. 도 11의 경우, 세포 주입구(5)측의 폐색을 확실하게 행하기 위해서 각각의 유닛마다 주입 파이프(8)를 밸브(16) 등에 의해 폐색하는 것이 바람직하다. 검체 시료 주입구 및 파이프의 폐색 수단은, 지금까지 서술해 온 바와 같이, 여러 가지 수단에서 적절히 선택해서 채용할 수 있다.

도 12는, 도 10의 타입의 유닛을 집적시킨 경우의 개념도이다. 도면의 마개(19)는 다른 수단으로 치환할 수 있다. 이 장치에 의해, 한 종류의 세포에 대하여, 여러 가지 검체 시료의 영향을 한번에 조사할 수 있다. 한편, 도 12의 장치에 있어서, 세포 주입구(5)와 검체 시료 주입구(6)의 위치를 반대로 해도 된다. 이렇게 함으로써, 한 종류의 검체 시료에 대하여 여러 가지 세포의 반응을 한번에 조사할 수 있다.

또한 본 발명은, 복수의 집적 유닛을 집적시킨 타입, 복수종의 집적 유닛을 집적시킨 타입의 장치도 포함한다.

본 발명에 따르면, 이러한 장치의 전체를 소형화하는 것이 가능하고, 시료의 처리를 미량으로 행할 수 있으며, 게다가 각 유닛을 다수 집적시킴으로써, 다수 검체의 처리를 동시에 행하는 것이 가능해진다. 또한, 액체의 흡인·주입량의 프로그램 제어가 용이하고, 자동화 장치의 조립에 적합하다.

이하에, 본 발명의 장치의 부분에 대해서 구체예를 들어 설명하지만, 이들은 설명을 위한 예시이고, 본 발명의 기술사상에 기초해서 적절히 변경하는 것은 가능 하며, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

(1)유닛의 구조

도 1 그 외의 도면에 예시하는 바와 같이, 제방(bank;2) 및 웰(well;3, 4)은 기판(1)상에 일체적으로 구축되는 것이 바람직하다. 기판(1)의 하면에는 광학 연마한 유리 기판(10)을 압착시킨다. 한편, 기판(1)과 유리 기판(10)은 열처리에 의해 접합해도 된다.

(2)웰

웰(3, 4)은, 세포 현탁액 또는 주화성 인자 함유 용액, 동(同) 저해제 함유용액 등의 검체 시료를 수납하는 것으로, 용적은, 특별히 제한은 없고, 필요 최소한의 액량(液量)을 수납할 수 있으면 된다. 예를 들면, 깊이 0.05∼0.1mm 정도, 폭, 길이 각 1.2mm 정도이면 충분하다.

(3)유로

유로(9)(도 1참조)의 구조의 일례를 도 13에 의해 설명하면 다음과 같다. 유로(9)는, 양단의 웰(3)과 웰(4)을 사이에 두고 제방(2)(기판(1)에 있어서의 돌출부) 및 유리 기판(10)에 의해 구성된다. 제방의 하면에, 평면인 테라스(23)가 형성된다. 제방(2)의 사이즈는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 높이, 즉 유리 기판(10)으로부터 테라스(23)까지의 거리는 0.003∼0.03mm 정도, 상대하는 웰을 향하는 방향에 있어서의 길이로서 0.1∼0.5mm 정도, 상대하는 웰을 향하는 방향에 직교하는 방향에 있어서의 길이로서 1.2mm 정도이면 된다. 한편, 이들의 사이즈가, 대상으로 하는 세포의 차이 등, 목적에 따라서 적절히 변경할 수 있는 것은 말 할 것도 없다.

한편, 테라스(23)와 유리 기판(10)과의 거리는, 취급하는 세포에 따라서 적절히 설정할 수 있으며, 통상 3∼30㎛에서 선택된다. 호중구, 호산구, 호염기구, 단구(單球), 매크로파지(macrophage), T세포, B세포 등의 경우는 3∼8㎛, 예를 들면 4, 5, 또는 8㎛에서 선택되고, 암세포나 조직에 의존하는 세포의 경우는 6∼20㎛에서 선택된다.

여기에서, 세포가 유로(9)의 단에 모이기 쉽게 하기 위해서, 테라스(23)를 다단식으로 형성할 수도 있다.

바람직한 형태의 하나로서, 제방(2)의 하면(테라스(23))에, 도 14(1), (2)에 예시되는 바와 같은 복수의 장벽(24)을 형성하고, 세포가 통과하는 홈(25)을 형성시킨다. 여기에서, (1)은 장벽(24)을 형성한 제방(2)의 단면도이고, (2)는 테라스(23)와 장벽(24) 및 홈(25)을 나타내는 상면도이다.

테라스(23)에 장벽(24)을 형성하는 경우, 장벽(24)에 의해 구성되는 홈(25)의 단면은, V자형 단면, 오목형 단면, 반원형 단면 등, 임의의 형상으로 할 수 있다. 홈(25)의 폭 및 깊이는, 세포의 직경 또는 그 변형능에 맞춘 폭이도록 설정된다. 한편, 도 14(3)은 홈(25)이 V자형을 하고 있는 경우를 나타내는 단면도이다.

홈(25)의 폭은 통상 3∼50㎛에서 선택되며, 세포의 종류에 맞춰서 적당한 폭이 선택된다. 호중구, 호산구, 호염기구, 단구·매크로파지, T세포, B세포 등의 경우는 3∼20㎛, 예를 들면 4, 8 또는 10㎛에서 선택되며, 암세포나 조직에 의존하는 세포의 경우는 8∼20㎛의 폭이 선택된다. 홈(25)의 수는, 유로(9)의 폭에 대한 장 벽(24)의 폭과 홈(25)의 폭으로 결정된다. 예를 들면, 유로(9)의 폭 1mm, 장벽(24)의 폭 10㎛, 홈(25)의 폭 5㎛의 경우, 홈(25)의 수는 최대로 66개가 된다.

제방(2)에 형성된 테라스(23)의 양측에, 장벽(24)의 열을 2부위에 형성할 수도 있고(도 15(1), (2)참조), 이러한 구조로 함으로써, 홈을 통과한 후의 세포의 관찰·계수가 용이하게 행해진다. 또한, 중앙의 테라스(23)의 적당한 부위에 마크(mark;26)를 형성함으로써, 카메라나 현미경의 위치 결정이 용이해진다(도 15에 있어서의 26). 한편, 중앙의 테라스의 크기는, 현미경의 시야로 커버할 수 있는 크기인 것이 바람직하다. 도 15에 있어서, (1)은 상면도, (2)는 단면도이다.

(4)웰과 유로의 제작

기판(1)의 재질로서는, 미세 가공이 용이하고, 세포에 대하여 비교적 불활성의 재질인 것이 바람직하며, 예를 들면, 실리콘 단결정을 들 수 있다. 장벽(24) 및 홈(25)은, 이 실리콘 단결정에 집적회로의 제작에서 사용되는 포토리소그래피나 에칭, 예를 들면 웨트 에칭(wet etching)이나 드라이 에칭(dry etching) 등을 적용함으로써 용이하게 공작된다. 웰(3, 4)은 장벽(24)이나 홈(25)에 비하면 비교적 크므로 여러 가지 기지의 공작 기술을 적용해서 제작할 수 있다. 예를 들면, 샌드블러스트(sand blasting)법이나 드라이 에칭법을 적용할 수 있다.

실리콘 단결정 이외에도, 경질 유리, 경질 플라스틱, 금속 등도 유로에 있어서의 미세한 구조가 구축 가능하다면 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리디메틸실록산(PDMS)은 미세 구조의 형성에 적합한 플라스틱의 예이다. 플라스틱을 사용하는 경우는, 표면에 친수성을 부여하기 위한 처리, 예를 들면, 표면에 친수성 박막을 형성시키는 처리를 행하는 것이 바람직하고, 또한, 세포의 관찰을 용이하게 하기 위해서, 적어도 테라스(23)를 포함하는 표면에 은 증착 등에 의한 경면 가공을 행하는 것이 바람직하다. 한편, 제방(2)과 웰(3, 4)을 각각 따로따로 제작해서, 조합해도 된다.

(5)유리 기판

유리 기판(10)은, 도 1 외에 예시하는 바와 같이, 기판(1)에 압착해서 액체를 수납하는 공간을 구성하고, 또한 유로를 통과하는 세포의 관찰을 가능하게 하는 것으로, 광학적으로 투명하고 또한 평면성을 유지하며, 세포가 접착하는 면을 제공하는 것이다. 이러한 목적에 적합한 것이라면, 유리 이외에도, 투명 아크릴 등의 플라스틱도 사용할 수 있다. 두께는, 기판에 압착시킬 때에 일그러짐이 발생하지 않는 한 특별히 한정되는 것은 아니지만, 0.1∼2mm이면 충분하다. 한편, 세포의 구성 요소를 형광 표식해서 관찰하는 경우는, 유리 기판(10)이 얇은 편이 바람직하다.

기판(1)이 실리콘 웨이퍼로 구성되어 있는 경우, 그 유리 기판(10)과의 압착에 의해 일체화할 수 있는데, 양자는 200∼400℃의 열처리에 의해 접합 일체화할 수 있다. 단, 그 경우, 기판(1)과 유리 기판(10)의 열팽창률 및 열수축률이 일치하도록 재질을 선택하는 것이 필요하다.

(6)파이프

주입 파이프(8), 흡인 배출 파이프(21)는, 일반적으로는 유연한 재질인 것이 바람직하고, 특히 맥동 펌프(7)를 사용하는 경우는 미세한 움직임에 대응할 수 있 는 것인 것이 필요하다. 예를 들면, PDMS, 폴리에틸렌, 염화비닐 등을 들 수 있다.

(7)다수의 유닛의 배열

유로를 통하여 연통한 두 개의 웰을 1유닛으로 해서, 복수의 유닛을 1장의 기판상에 배치 내지 집적해서 다수 검체를 동시에 처리하는 장치로 할 수 있다. 동일한 타입의 유닛을 병렬로 배치하거나, 또는, 이종(異種)의 유닛을 배열하는 것도 가능하다. 배열은, 목적에 따라서 여러 가지 조합을 채택할 수 있다. 예를 들면, 두 개의 웰이 유로를 통하여 연통해서 이루어지는 유닛의 1유닛의 크기를 긴 변이 2.9mm, 짧은 변이 1.2mm라고 할 때, 폭이 16mm, 길이가 10mm의 직사각형인 한 장의 기판(1)상에, 0.8mm의 간격으로 7열×2행의 합계 14개를 배치할 수 있다.

또한, 상기의 다수 유닛의 집적을 더 집적시킬 수도 있으며, 서로 다른 타입의 유닛의 집적일 수도 있다.

이들, 다수의 유닛을 집적시키는 경우에 있어서, 유리 기판(10)은, 유닛 전체를 커버하도록 1개 또는 1장으로 할 수 있다.

(8)검출 수단

본 발명에 있어서 사용되는 검출 수단은, 유로(9)를 이동하는 세포 또는 이동한 후의 세포를 검출할 수 있는 수단이면 되고, 필요에 따라서 검출 결과를 기록하기 위한 수단을 포함한다. 세포를 검출·기록하기 위하여 알려져 있는 수단이면 어떠한 것도 사용 가능하고, 예를 들면, 현미경, 현미경과 비디오 카메라의 조합 등이다. 대물렌즈에 CCD 카메라를 부착한 구조를 채용할 수도 있다. 집적 유닛의 검출에 있어서는, 대물렌즈가 각 유닛의 유로를 순차 스캔하는 구조를 채용하는 것 이 바람직하다.

검출 수단은, 통상은, 도 1 외에 나타내는 바와 같이, 유닛의 유로(9)의 하방에 설정되지만, 다수 유닛을 집적시킨 자동장치에 있어서는, 소정의 위치에 설치된 검출부에 각 유닛의 열이 순차 이동하여, 검출·기록을 행하는 구조를 채용할 수도 있다. 검출은, 직선상에 늘어서 있는 각 유닛의 유로를 검출기가 스캔함으로써 행해진다. 스캔하는 검출기(11)는 1개여도 되고, 복수개여도 된다. 이렇게 함으로써, 비교적 적은 수의 검출장치로 다수의 집적 유닛에 대응하는 것이 가능해진다.

유로(9)를 통과하는 세포의 검출·계수는, 세포를 직접 현미경으로 포착함으로써 행할 수 있으나, 통상적인 방법에 따라서, 미리 세포를 발광·현광 물질로 마킹해 두고, 그 발광·형광을 포착함으로써 용이하게 검출·계수할 수도 있다.

(9)자동 제어 기구

본 발명의 장치는, 용이하게 자동 제어로 할 수 있다. 예를 들면, 세포, 인자 등의 검체 시료의 주입에는 이동 및 액체의 배출을 컴퓨터로 제어할 수 있는 오토 피펫을, 액체 수송 수단에 맥동 펌프나 스테핑 모터로 구동되는 시린지를, 주입구의 개폐에 슬라이드식 개폐장치를 각각 사용해서, 그들의 작동 순서 및 작동량을 컴퓨터 프로그램으로 제어한다. 주입구의 개폐에 슬라이드식 개폐장치 대신에 마개를 사용하는 경우는, 개폐 조작의 제어는 필요 없게 된다.

집적형 장치에 있어서 사용되는 피펫은, 멀티채널 시린지를 갖는 타입의 것이 바람직하다.

본 발명의 구조에 따르면, 주입된 세포의 웰(well) 내에 있어서의 위치를 조정해서 세포를 유로의 일단(一端)에 모아 일렬로 늘어서게 함과 아울러, 그 상태를 유지할 수 있으며, 또한, 유로에 있어서의 주화성 인자 등의 검체 시료의 확산에 의한 농도구배를 안정적으로 유지할 수 있기 때문에, 주화성 인자 또는 저해제의 작용과 세포의 성질을 충실히 반영시킨, 정량적인 결과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 구조를 채용함으로써, 장치에 예측할 수 없는 진동이 가해졌을 때라도, 세포의 열 및 검체 시료의 농도구배의 흐트러짐을 억제하여, 세포의 운동을 정확하게 포착할 수 있다.

본 발명의 구조에 따르면, 장치의 소형화를 도모할 수 있고, 세포 주화성 검출 또는 주화 세포 분리장치에 적용하면, 사용하는 세포의 양을, 종래 사용되어 온 보이든 챔버(boyden chamber)에 비해서, 500분의 1 내지 1000분의 1로 하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명의 장치에 있어서는, 시료로서 전혈(全血;whole blood)과 같은 생체 시료 자체를 사용할 수 있으며, 이렇게 해서 전혈을 시료로 했을 때, 호중구의 주화성을 검출하는 경우는 0.1㎕ 이하의 혈액으로 충분하고, 호산구, 단구 또는 호염기구에서는 1㎕ 정도의 혈액으로 측정 가능하다.

본 발명의 구조에 따르면, 세포의 웰 내에 있어서의 위치의 조절시에, 미묘한 조정이 가능하기 때문에 장치의 자동화를 용이하게 행할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에 따른 장치의 단위 유닛은 미소한 것으로 할 수 있기 때문에, 다수 의 유닛을 집적시키는 것이 용이하고, 다수 검체의 동시 처리가 가능한 장치를 조립할 수 있다. 또한, 그 경우, 액체의 주입 및 검출이 자동화된 장치로 하는 것이 용이하다.

다수의 유닛을 집적시킬 때에, 다른 타입의 유닛을 조합해서 집적시킴으로써, 목적을 달리하는 검출·분리를 동시에 행할 수 있으며, 처리의 효율을 올리는 것이 가능해진다. 예를 들면, 세포 주화성 검출장치의 경우, 동일종의 세포에 대하여 여러 가지 주화성 인자 또는 그 저해제의 검색을 행할 때, 혹은, 동일한 주화성 인자에 대하여 다른 세포의 주화성을 조사할 때 등에 있어서 그 검색을 한번에 행하는 것이 가능해진다.

Claims (3)

1. 두 개의 웰(well)이 구형(球形) 세포는 통과할 수 없지만 세포가 갖는 변형능에 의해 형태를 편평하게 변화했을 때에는 통과할 수 있는 틈새를 가지는 유로를 통해서 상호 연통(連通)하고 있으며, 각각의 웰에는 세포 또는 검체 시료를 주입하기 위한 개구부가 형성되어 있는 구조를 가지는 세포 주화성 검출장치로서,

   (1) 액체를 이동시키는 수단 및 액체의 주입 또는 흡인 배출 후에 그 이동을 정지시키는 수단을 구비하고 있는 것; 및 (2) 세포 주입측 및 검체 시료 주입측 중 어느 한쪽 또는 양쪽의 개구부를 폐색(閉塞)하는 수단을 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 세포 주화성 검출장치.
2. 제 1 항에 있어서, 액체의 이동 및 이동을 정지시키는 수단이, 맥동 펌프 또는 시린지(syringe)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 주화성 검출장치.
3. 제 1 항에 있어서, 개구부를 폐색하는 수단이, 유연한 마개, 슬라이드식 개폐장치, 탭(tap), 밸브로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 그들의 조합에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 세포 주화성 검출장치.

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