CN103361263B - 一种细胞趋化分析芯片、装置、使用方法和制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物学技术领域，特别涉及一种细胞趋化分析芯片，包括进液腔室、趋化通道、栅栏通道和吸液腔室；进液腔室设有用于加入细胞溶液的进液口；进液腔室用于容纳细胞溶液；趋化通道的一端与进液腔室相连通，趋化通道的另一端与栅栏通道的一端相连通，趋化通道的内径大于细胞溶液中所含细胞的直径；栅栏通道的内径小于细胞溶液中所含细胞的直径；栅栏通道的另一端与吸液腔室相连通；吸液腔室用于吸收细胞溶液中的溶液。本发明还涉及该细胞趋化分析芯片的使用方法和制作方法。本发明可以非常方便的定量观测到细胞在特定浓度梯度下的趋化过程，排除流动对此过程的影响，为细胞趋化行为的研究提供了方便。

Description

一种细胞趋化分析芯片、装置、使用方法和制作方法

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，特别涉及一种细胞趋化分析芯片、装置、使用方法和制作方法。

背景技术

化学趋向性行为是一个基本的生命过程，对其研究不但有利于理解生物信号传导响应机制，而且相关的生物传感器开发也具有非常高的实用价值。然而当下研究手段依然比较落后，对于细胞的趋化研究手段，目前的实验操作的难度较大，运用起来并不方便。

微流控技术是近几年飞速发展的前沿学科，凭借其多元化、分析快、用量少、高通量和实时观测等优点，现已成为生物细胞分析领域中一个强有力的研究手段。近来，微流控装置（Erwin Berthier,JillSurfus,James Verbsky,Anna Huttenlocher and David Beebe,An arrayedhigh-content chemotaxis assay for patient diagnosis,Integrative Biology,2010,2,630-638.）也被广泛用来研究动物细胞的趋化性，总体来说实验操作难度也较大，而且也较难控制流体流动对趋化性行为本身的影响。

为了解决以上问题，本发明做了有益改进。

发明内容

（一）要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种易于对细胞趋化进行观测和分析的细胞趋化分析芯片。

本发明的另一个要解决的技术问题是提供一种包括有多个所述细胞趋化分析芯片的细胞趋化分析装置。

本发明的另一个要解决的技术问题是提供一种所述细胞趋化分析芯片的使用方法。

本发明的另一个要解决的技术问题是提供一种所述细胞趋化分析芯片的制作方法。

（二）技术方案

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种细胞趋化分析芯片，包括进液腔室、趋化通道、栅栏通道和吸液腔室；

所述进液腔室设有进液口，所述进液口用于加入细胞溶液；所述进液腔室用于容纳加入的所述细胞溶液；

所述趋化通道的一端与所述进液腔室相连通，所述趋化通道的另一端与所述栅栏通道的一端相连通，所述趋化通道的内径大于所述细胞溶液中所含细胞的直径；

所述栅栏通道的内径小于所述细胞溶液中所含细胞的直径；所述栅栏通道的另一端与所述吸液腔室相连通；

所述吸液腔室用于吸收所述细胞溶液中的溶液。

进一步，所述趋化通道为多条。

进一步，所述每条趋化通道的内径大于等于10微米小于等于100微米。

进一步，所述栅栏通道为多条。

进一步，所述每条栅栏通道的内径大于等于0.1微米小于等于10微米。

对于细胞趋化分析装置这一技术主题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种细胞趋化分析装置，其上设有多个所述的细胞趋化分析芯片。

对于细胞趋化分析芯片的使用方法这一技术主题，本发明是通过以下技术方案实现的：

包括：

步骤A1，将所述细胞趋化分析芯片的内部抽成真空；

步骤A2，从所述进液口向所述细胞趋化分析芯片加入细胞溶液；所述细胞溶液在所述细胞趋化分析芯片内部的真空负压作用下流入所述吸液腔室，所述细胞溶液中的细胞被所述栅栏通道挡在所述趋化通道内；

步骤A3，除去所述进液腔室内的细胞溶液；

步骤A4，从所述进液口加入趋化因子溶液；

步骤A5，将所述细胞趋化分析芯片放在显微镜下观测。

进一步，所述步骤A4具体包括：

步骤A41，从进液口加入培养液；

步骤A42，将所述进液口覆盖；

步骤A43，待细胞贴壁后，将所述进液口打开并加入趋化因子溶液。

对于细胞趋化分析芯片的制作方法这一技术主题，本发明是通过以下技术方案实现的：

步骤M1，在曝光掩膜上制出所述细胞趋化分析芯片形状的透光部分；

步骤M2，将所述曝光掩膜覆盖在涂有光刻胶的硅片上；

步骤M3，将所述硅片曝光，所述曝光掩膜的透光部分所对的光刻胶发生曝光反应并形成凸起；

步骤M4，去除所述涂有光刻胶的硅片上与所述曝光掩膜的不透光部分相对的未形成凸起的部分，得到用于制作所述细胞趋化分析芯片的阳模；

步骤M5，将用于制作所述细胞趋化分析芯片的浇铸料浇铸在所述阳模上；

步骤M6，将所述阳膜中的浇铸料固化；

步骤M7，将固化后得到的产品贴合在衬底上，得到所述细胞趋化分析芯片。

（三）有益效果

与现有技术和产品相比，本发明有如下优点：

利用本发明的结构，可以非常方便的定量观测到细胞在特定浓度梯度下的趋化过程，并排除了流动对此过程的影响，为细胞趋化行为的研究提供了方便。

对于本发明细胞趋化分析芯片的使用方法，步骤简便，利用其可以方便快捷的进行细胞趋化分析试验。

对于本发明细胞趋化分析芯片的使用方法，步骤简便，易于制作该芯片。

附图说明

图1是本发明的俯视示意图。

附图中，各标号所代表的部件列表如下：

1、进液腔室，1a、进液口，2、趋化通道，3、栅栏通道，4、吸液腔室。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。

(一)下面先来介绍本发明的细胞趋化分析芯片的结构，

如图1所示，包括进液腔室1、趋化通道2、栅栏通道3和吸液腔室4；从图中可以看出，进液腔室1、趋化通道2、栅栏通道3和吸液腔室4之间是依次连通的；

进液腔室1设有用于加入细胞溶液的进液口1a；进液腔室1用于容纳细胞溶液；也就是说，进液腔室1为向趋化通道2输送液体提供了一个容纳空间，以保证从进液腔室1向吸液腔室4流动的细胞溶液是源源不断的；

趋化通道2的一端与进液腔室1相连通，趋化通道2的另一端与栅栏通道3的一端相连通，趋化通道2的内径大于细胞溶液中所含细胞的直径；也就是说，细胞溶液中的细胞可以进入趋化通道2内。趋化通道2可以是一条，这里优选下面的情况：趋化通道2为多条，这些趋化通道如图1所示在一个平面内呈彼此相平行排布，每条趋化通道的内径均大于所述细胞溶液中所含细胞的直径；

栅栏通道3的内径小于细胞溶液中所含细胞的直径；栅栏通道3的另一端与吸液腔室4相连通；也就是说，细胞溶液中的细胞会被栅栏通道3挡住，只有细胞溶液中的溶液才能通过栅栏通道3并被吸入吸液腔室4；栅栏通道3可以是一条，这里优选下面的情况：栅栏通道3为多条，这些栅栏通道如图1所示在一个平面内呈彼此相平行排布，每条栅栏通道的内径小于细胞溶液中所含细胞的直径；

吸液腔室4用于吸收细胞溶液中的溶液。

本发明特别适用于人体细胞和动物细胞的观测和研究，动物细胞的线度一般在10^-4-10^-5m，下面以此为例给出一组参考尺寸：

趋化通道2和吸液腔室4的高度可以选择为30μm，由于图1为俯视图，这里提到的高度即为垂直纸面向外的高度，位于二者之间的栅栏通道3的高度为5μm。趋化通道2为4条，长度为600μm，宽度为30μm，这里所说的长度是指图1中的上下方向，宽度是指图1中的左右方向。进液口1a可以选择制成直径为5mm的孔，吸液腔室4的截面大小可制成600×600μm的正方形。栅栏通道3为20条，长度为200μm且宽度、高度均为5μm。

一般来说，每条趋化通道的内径大于等于10微米小于等于100微米；每条栅栏通道的内径大于等于0.1微米小于等于10微米。当然，本领域技术人员还可以根据待观测的不同细胞的大小，合理进一步设置和调整进液口1a、趋化通道2、栅栏通道3的尺寸大小，间距等参数。

(二)接下来，结合上述细胞趋化分析芯片的结构给出其几种使用方法；

实施例1：

步骤1，在图1中圆形的进液腔室上用打孔器打孔贯穿得到用于进液的毫米级进液口1a,；

步骤2，将细胞趋化分析芯片固定于细胞培养装置上，使细胞趋化分析芯片处于真空状态；

本领域较常采用PDMS预塑体(两种不同化学官能团的硅氧烷，A:B=10:1)这种材料来制作细胞趋化分析芯片，主要原因是具有较好的透光性和透气性，透光性使得实验人员便于用显微镜观察其内部情况，透气性使得其便于形成真空状态，以利于后面的负压操作，例如可将细胞趋化分析芯片整体投入真空泵，以利用其自身的透气性，将细胞趋化分析芯片内部抽成真空；优选抽成5-100Pa即可。而且PDMS无毒，采用该材料进行实验也比较安全。当然在本领域技术人员所知范围内，当然也可以采用其他透气性和透光性好的材料来制作芯片，如果所选其他材料的透气性较差，那么也可以选择从进液口1a对细胞趋化分析芯片内部抽真空。

PDMS预塑体可购自RTV615(GE Toshiba Silicones Co.Ltd，Shizuoka,Japan)；

真空泵可采用TS2-60(Longer-Pump Company，Baoding,Hebei,China)。

步骤3，抽气后，马上将细胞溶液，即含有细胞的溶液从进液口1a加入，由于真空负压的作用，液体会被自动吸入细胞趋化分析芯片内部的所有腔室；

细胞溶液中的溶液通过趋化通道2和栅栏通道3吸入吸液腔室4，由于栅栏通道3的阻拦作用，细胞只被留在趋化通道2。

步骤4，当趋化通道2和吸液腔室4都被液体填充完成，整个流速降为零。当含有细胞的溶液进入细胞趋化分析芯片内部后，将细胞趋化分析芯片外部残留的含有细胞的溶液吸走，例如可以用培养液洗掉残留的细胞后再加入培养液，出于方便起见，这里的培养液，可以使用原细胞溶液中的溶液部分。

步骤5，将细胞培养装置覆盖上透明的上盖，可以防止液体蒸发，并在细胞培养环境下进行显微观测。在细胞培养环境下，待其贴壁。

步骤6，将进液口1a中的液体更替为含有30-100μL相同或不同趋化因子的细胞培养液，趋化因子例如可采用蛋白小分子、有机分子、离子等。通道内液体无流动的同时，趋化因子可以通过扩散作用在趋化通道2中完成浓度梯度的建立，然后用显微观测。

实施例2：分析同种细胞对不同趋化因子溶液的相应。

步骤1，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞用含有10%血清（胎牛血清，FBS）和1%盘尼西林-链霉素的DMEM培养液(含各种氨基酸和葡萄糖的培养液，Gibco），这里提到的10%和1%为体积分数，下同，在37℃和5%CO₂培养箱中培养。解离细胞使用0.25%的Trypsin-EDTA(胰酶细胞消化液)溶液处理3-4分钟，再加入含有10%FBS的DMEM培养液中和，3000rpm离心，弃去上清液。使用2%血清培养液洗涤细胞，离心后重悬，获得含有细胞的悬浊液。

步骤2，取两个细胞趋化分析芯片，用真空压力泵（型号可采用Millipore-WP6122050，厂家北京敏泰元科技有限公司）对两个细胞趋化分析芯片抽气10分钟后，向两个细胞趋化分析芯片中加入细胞悬浊液，由于负压的作用，约1分钟内液体会被吸入所有腔室，由于栅栏通道的尺寸小于细胞的尺寸，于是细胞被吸入并停留在栅栏通道外。

步骤3，通过移液枪将这两个细胞趋化分析芯片周围多余的细胞溶液除去，洗掉残余的细胞，并为这两个细胞趋化分析芯片加入培养液，这里培养液可采用2%的血清培养液。盖上细胞培养皿上盖防止液体蒸发，并在细胞培养环境下进行显微观测。

步骤4，将这两个细胞趋化分析芯片放在37℃和5%CO₂培养箱中培养2-3小时，待细胞贴壁后从进液口将其中一个细胞趋化分析芯片的液体吸走并换成趋化因子溶液，这里趋化因子溶液可采用10%血清培养液，利用10%血清培养液与之前加入的2%血清培养液的浓度差，建立趋化梯度；再将另一个细胞趋化分析芯片从进液口加入另一种趋化因子溶液，例如含有1.5ug/mlEGF引诱剂的2%血清培养液，建立趋化梯度。这里用到的EGF引诱剂是Epidermal Growth Factor的缩写，即表皮细胞生长因子。

步骤5，将细胞放在37℃和5%CO₂培养箱中培养，并实时拍照记录MDA-MB-231对10%血清培养液的趋化行为和MDA-MB-231对EGF引诱剂的趋化行为，并进行对比。

实施例3：分析不同细胞对同种趋化因子溶液的响应。

步骤1，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞和人乳腺癌细胞系MCF-7细胞分别用含有10%血清(胎牛血清，FBS)和1%盘尼西林-链霉素的DMEM培养液(含各种氨基酸和葡萄糖的培养液，Gibco），在37℃和5%CO₂培养箱中培养。解离细胞使用0.25%的Trypsin-EDTA(胰酶细胞消化液)溶液处理3-4分钟，再加入含有10%FBS的DMEM培养液中和，3000rpm离心，弃去上清液。使用2%血清培养液洗涤细胞，离心后重悬，获得两种含有细胞的悬浊液。

步骤2，取两个细胞趋化分析芯片，并用真空压力泵抽气10min后，将两种细胞悬浊液分别加入到两个细胞趋化分析芯片中，由于负压的作用，1分钟内液体会被吸入所有腔室。栅栏通道的尺寸小于细胞的尺寸，于是细胞被吸入并停留在栅栏通道外。

步骤3，通过移液枪去除两个细胞趋化分析芯片周围多余的细胞溶液，并为这两个细胞趋化分析芯片加入不含趋化因子的培养液，例如2%血清培养液，盖上细胞培养皿上盖防止液体蒸发，并在细胞培养环境下进行显微观测。

步骤4，将两个细胞趋化分析芯片放在37℃和5%CO₂培养箱中培养2-3小时，待细胞贴壁后将进液小孔中的液体分别吸走，并都换成含有1.5ug/ml EGF引诱剂的2%血清培养液。

步骤5，将细胞放在37℃和5%CO₂培养箱中培养，并实时拍照记录MDA-MB-231细胞对1.5ug/ml EGF引诱剂的趋化行为和MCF-7细胞对1.5ug/ml EGF引诱剂的趋化行为，并进行对比。

(三)最后，给出一种细胞趋化分析芯片的制备方法；

可采用下面方法来刻制本发明的细胞趋化分析芯片：

步骤1，打印如图1所示的芯片图形的光学掩膜或塑料胶片覆盖在涂有光刻胶的硅片上；

制作图形时可采用L-Edit工具绘图，做出如图1的图形，将其打印在曝光掩膜上，曝光掩膜可采用塑料胶片或光学掩膜；由于光学掩膜成本略高，可将制作精度要求较高的栅栏通道3打印在光学掩膜上，将吸液腔室4、趋化通道2和进液腔室1打印在塑料胶片上。

步骤2，采用紫外线照射，该光学掩膜或塑料胶片的透明部分接受紫外线照射发生交联反应而聚合，未经紫外线照射的部分则可以被显影液溶解，之后硅片及其表面剩下的凸起的光刻胶成为制作芯片的阳模。也就是说，利用得到的掩模图形，通过多层对位套刻在硅片上制备得到光刻胶模具。曝光能量优选为10mJ/cm²-500mJ/cm²，例如可以优选在照射强度为1mW/cm²-10mW/cm²的紫外线下照射一段时间，例如10-80秒，来实现。

步骤3，将PDMS预塑体浇铸在阳模上，加热固化，然后在紫外灯下照射过夜，这里紫外照射的目的是用于灭菌。

例如，在步骤2的光刻胶模具制备完成后，使用5mm厚度的PDMS（A:B=10:1）复制图形，优选在20℃-120℃加热固化20分钟至72小时，进一步的优选是在75℃固化60分钟，然后切下带有图形的PDMS，并与衬底材料粘合，衬底材料一般使用的是玻璃，以便于显微观察，例如与培养皿自然粘附，还可以是与培养皿自然粘附，得到所述细胞趋化分析芯片。然后将其置于紫外灯下照射过夜，紫外灯照射的目的是为芯片除菌，即可得到备用的细胞趋化分析芯片。

本发明的细胞趋化分析芯片能够方便快捷地分析细胞趋化性，可以将吸液腔室4预制成固定大小，这样可以进一步定量控制吸入微流通道的液体的体积，在吸液腔室4吸液的同时将细胞定位于阻挡细胞通过的栅栏通道前，然后在进液口分别加入不同的具有趋化效应的小蛋白，封闭通道内液体无流动的同时，蛋白小分子可以通过扩散作用在趋化通道2中完成浓度梯度的建立，这样可以非常方便的定量观测到观察到细胞在特定浓度梯度下的趋化过程，而排除流动对此过程的影响。

将上述多个所述细胞趋化分析芯片合在一起，可以得到细胞趋化分析装置，例如，将32个独立的细胞趋化分析芯片分成4排，每排平行并排布置8个，形成了一个细胞趋化分析装置。各细胞趋化分析芯片的尺寸相同，这样就可以用8眼排枪为一排的8个细胞趋化分析芯片同时加入细胞溶液，提高了实验效率；当然，还可以在一排8个芯片中加入不同浓度的信号分子，或不同细胞溶液，这样可以方便对比观察同种细胞对不同趋化因子溶液的响应情况，例如前面使用方法中的实施例2，或者是不同细胞对相同的趋化因子溶液响应情况，例如前面使用方法中的实施例3，上述每一项实验都可以用多个细胞趋化分析芯片来进行试验和观察对比，以减小单个实验可能存在的误差。也就是说，使用本细胞趋化分析装置更加便于进行多组实验同时进行观测对比。从而为细胞趋化性行为的研究将提供了一种更为方便快捷的工具。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (9)

1.一种细胞趋化分析芯片，其特征在于：包括进液腔室、趋化通道、栅栏通道和吸液腔室；

所述进液腔室设有进液口，所述进液口用于加入细胞溶液；所述进液腔室用于容纳加入的所述细胞溶液；

所述趋化通道的一端与所述进液腔室相连通，所述趋化通道的另一端与所述栅栏通道的一端相连通，所述趋化通道的内径大于所述细胞溶液中所含细胞的直径；

所述栅栏通道的内径小于所述细胞溶液中所含细胞的直径；所述栅栏通道的另一端与所述吸液腔室相连通；

所述吸液腔室用于吸收所述细胞溶液中的溶液。

2.根据权利要求1所述的细胞趋化分析芯片，其特征在于：所述趋化通道为多条。

3.根据权利要求1或2所述的细胞趋化分析芯片，其特征在于：所述趋化通道的内径大于等于10微米小于等于100微米。

4.根据权利要求1所述的细胞趋化分析芯片，其特征在于：所述栅栏通道为多条。

5.根据权利要求1或4所述的细胞趋化分析芯片，其特征在于：所述栅栏通道的内径大于等于0.1微米小于等于10微米。

6.一种细胞趋化分析装置，其特征在于：其上设有多个如权利要求1至5任一所述的细胞趋化分析芯片。

7.一种如权利要求1至5任一所述的细胞趋化分析芯片的使用方法，其特征在于，包括：

步骤A1，将所述细胞趋化分析芯片的内部抽成真空；

步骤A2，从所述进液口向所述细胞趋化分析芯片加入细胞溶液；所述细胞溶液在所述细胞趋化分析芯片内部的真空负压作用下流入所述吸液腔室，所述细胞溶液中的细胞被所述栅栏通道挡在所述趋化通道内；

步骤A3，除去所述进液腔室内的细胞溶液；

步骤A4，从所述进液口加入趋化因子溶液；

步骤A5，将所述细胞趋化分析芯片放在显微镜下观测。

8.根据权利要求7所述的细胞趋化分析芯片的使用方法，其特征在于，所述步骤A4具体包括：

步骤A41，从进液口加入培养液；

步骤A42，将所述进液口覆盖；

步骤A43，待细胞贴壁后，将所述进液口打开并加入趋化因子溶液。

9.一种如权利要求1至5任一所述的细胞趋化分析芯片的制作方法，其特征在于，包括：

步骤M1，在曝光掩膜上制出所述细胞趋化分析芯片形状的透光部分；

步骤M2，将所述曝光掩膜覆盖在涂有光刻胶的硅片上；

步骤M3，将所述硅片曝光，所述曝光掩膜的透光部分所对的光刻胶发生曝光反应并形成凸起；

步骤M4，去除所述涂有光刻胶的硅片上与所述曝光掩膜的不透光部分相对的未形成凸起的部分，得到用于制作所述细胞趋化分析芯片的阳模；

步骤M5，将用于制作所述细胞趋化分析芯片的浇铸料浇铸在所述阳模上；

步骤M6，将所述阳膜中的浇铸料固化；

步骤M7，将固化后得到的产品贴合在衬底上，得到所述细胞趋化分析芯片。