CN103959037A - 从血液或其他介质中过滤颗粒 - Google Patents

Abstract

公开了一种过滤器元件(200)和方法，以用于保留介质的颗粒，例如保留血液的(稀少)细胞。所述过滤器元件(200)包括至少一个开口(220)，所述开口(220)(i)具有细长横截面，和/或(ii)具有沿流动方向(x)减小的横截面，和/或(iii)以透明壁为边界。优选地，所述过滤器元件(100、200、300)被提供有横截面逐步减小的多个细长开口(220)，所述多个细长开口被布置在公共透明载片上。因此能够在整个过滤过程中实现高流率，并且所保留的颗粒立即准备好用于视觉检查，而无需进一步转移。

Description

从血液或其他介质中过滤颗粒

技术领域

本发明涉及方法、过滤器元件、和过滤器系统，以用于保留介质的颗粒，具体而言用于从诸如血液或其他体液的生物流体中保留细胞。

背景技术

稀少细胞隔离是在其中从介质(血液)中过滤颗粒(稀少细胞)的应用的重要范例。在用于此目的的常规过滤器中，多个孔被布置在垂直于所过滤的介质的流动方向而延伸的层中。这种过滤器的缺点在于，所保留的细胞常常因高压梯度而受损。此外，如果应进一步分析细胞，则需要转移细胞，这意味着针对细胞的额外应力。

发明内容

本发明的目的是提供这样的手段，其允许改进地从介质中过滤颗粒，尤其允许从诸如血液或其他体液(例如抽取液)的生物流体中过滤(稀少)细胞。

该目的是通过根据权利要求1、2、3和5的过滤器元件，通过根据权利要求4、6和15的方法，以及通过根据权利要求12和13的过滤器系统得以实现的。在从属权利要求中公开优选的实施例。

根据本发明的第一方面的过滤器元件用于保留介质的颗粒，所述介质沿流动方向流动通过所述过滤器元件的至少一个开口。

在该背景中，术语“颗粒”应指代所述介质所包含的材料的任意连接的块，例如(大)分子、一块固体、生物细胞、微生物，、或它们的一部分。感兴趣的颗粒的直径将通常为约1μm或更大。此外，所述“流动方向”按照定义应在所述开口内被确定，具体而言在所述开口的几何中心处和/或为在整个开口上的平均(如果其在整个开口上不是恒定的)。

根据本发明的第一方面的所述过滤器元件应具有至少一个开口，所述开口具有细长横截面，其中，所述横截面的最大直径与最小直径之间的比率优选地大于2:1，更优选地大于5:1。所述“横截面”按照定义是垂直于所述流动方向而测量的。如果所述开口在所述流动方向的不同位置具有不同横截面，则所有这些遇到的横截面都应为细长的。此外，所述横截面能够大体上具有任何任意(连接的)形状；通常，形状无论如何都将是凸形的(例如椭圆形或多边形)。

作为如“过滤器元件”指示的功能，所述过滤器元件的所述开口应为所述介质的流动路径中的某种瓶颈，即所述流动路径应在这样的开口前方并且通常也在其后方更宽。因此，感兴趣颗粒将被保留在所述过滤器元件的所述开口中，并且不在别的地方。具体而言，横截面或间隙在从样品入口到所述开口的流动路径中应比在所述开口内更大。此外，优选地，在每个开口前面有分配腔，样品介质从所述分配腔被引导到所述开口中。类似地，每个开口后面可以有收集腔，其在所述样品介质通过所述开口之后接收它，其中，所述分配腔和收集腔具有比所述开口更大的间隙。在绝对数字中，所述开口的间隙(即，适合通过所述开口的球体的最大直径)通常在约1μm到约50μm间的范围中。间隙的选择取决于即将发生的应用。在血液过滤的情况中，间隙应例如允许红细胞的自由通行。

涉及本发明的第一方面的方法用于通过将颗粒保留在至少一个开口中而从介质中过滤出所述颗粒，所述介质沿流动方向经过所述至少一个开口。该方法的特征在于：所保留的颗粒被保持在相对的区域(或点)之间，在那里它们接触所述开口，其中，所述介质继续沿所述区域外部的所述颗粒流动，通过所述开口的剩余部分。尤其能够利用上述过滤器元件的细长开口实现对颗粒的这种保留，在上述过滤器元件中，颗粒被卡在所述开口的相对的窄壁之间。

根据本发明的第一方面的所述过滤器元件和所述方法具有以下优点：由于所述颗粒没有完全阻塞所述过滤器开口，对所保留的颗粒的机械应力得以最小化。相反，将总留有所述介质能够继续流动通过的空间，这防止在所述颗粒的后侧与前侧之间过度的压力梯度。此外，由于没有完全阻塞开口，通过所述过滤器元件的流动能够以高速率继续。

根据第二方面，本发明涉及一种过滤器元件，以用于保留沿流动方向流动通过至少一个开口的介质的颗粒，其中，所述开口具有沿流动方向减小(变窄)的横截面。优选地，该减小量大于约20％，即在所述开口的出口处的横截面的最小直径为在所述开口的入口处的横截面的最小直径的至多80％。还要更优选地，该减小大于约50％。

涉及本发明的第二方面的方法用于通过将颗粒保留在至少一个开口中而从介质中过滤出所述颗粒，所述介质沿流动方向通过所述至少一个开口。该方法的特征在于：所述颗粒被保留在(沿流动方向见到的)不同位置处，所述不同位置对应于所述颗粒的(与通行相关的)性质。所述性质通常包括大小、硬度和/或所述颗粒的表面官能度(其能够引起颗粒在特定位置的捕获)。所述方法尤其能够利用前文提及的过滤器元件执行，因为所述开口的渐减横截面将不同大小的颗粒保留在不同位置处。

根据本发明的第二方面的所述过滤器元件和所述方法具有以下优点：它们“自动地”以对应于颗粒大小的空间顺序布置所保留的颗粒。由于不同类型的生物细胞通常具有不同的大小和刚度(顺应性)，因此能够在空间上分离细胞成分，这对于进一步的分析步骤是有利的。

为了实现不同颗粒的显著空间分布，所述开口可以优选地具有的(沿流动方向测量的)长度大于所有横截面的最小直径中的最小者大约五倍。

根据第三方面，本发明涉及一种用于保留介质的颗粒的过滤器元件，所述介质沿流动方向流动通过至少一个开口，其中，所述开口以透明壁为边界。所述透明壁通常平行于所述流动方向延伸，并且形成材料的至少一部分，在该部分中形成所述开口。

涉及本发明的第三方面的方法用于通过将颗粒保留在至少一个开口中而从介质中过滤出所述颗粒，所述介质沿流动方向经过所述至少一个开口。该方法的特征在于：所述颗粒从倾斜于(优选地基本上垂直于)所述介质的所述流动方向的方向上被光学检查。所述方法尤其能够在前文提及的过滤器元件中得以执行，在所述过滤器元件中，所述透明壁允许对所述开口的内部进行视觉检查。如果所述开口具有细长横截面，则光学检查也有利地可以倾斜于(例如基本上垂直于)所述开口的大维度。

根据本发明的第三方面的所述过滤器元件和所述方法具有以下优点：能够直接观察被保留在所述开口中的所述颗粒。因此，不需要在这种观察之前，将这些颗粒从所述过滤器元件转移到另一位置。这简化了工作流程，并且最重要的是，意味着对所述颗粒的更小的应力。

应注意，由于根据本发明的各方面的所述过滤器元件与所述方法之间的相关性，针对这些实施例之一所提供的解释和定义对其他实施例也有效。

可以优选地以任意组合应用上文定义的所述过滤器元件和/或所述方法的特征。具体而言，优选地用于保留介质的颗粒的过滤器元件具有至少一个开口，所述至少一个开口具有沿流动方向减小的细长横截面，其中，所述开口以透明壁为边界。

类似地，以下方法是优选的：在该方法中，通过将颗粒保留在至少一个开口中，实现从介质中过滤出所述颗粒，其中，所述颗粒被保留在对应于它们的大小的不同位置处，其中，所保留的颗粒被保持在相对的区域之间，同时所述介质继续沿它们流动，并且其中，所述开口被视觉检查。

下文中，将描述本发明的各个优选实施例，它们能够与上文描述的任何过滤器元件和方法一起应用。

能够由(如由能够经过横截面的最大球体的直径定义的)最小直径和(如由横截面边界上的任意两个点之间的最大距离定义的)最大直径表征开口的细长横截面。在本发明的具体实施例中，所述横截面的最大直径与最小直径之间的比率大于2:1，优选地大于10:1，并且最优选地大于100:1。由于被保留的颗粒通常(大体上)为球形，因此所述横截面的最小直径将确定被保留的颗粒的大小。因此，前文提及的最大直径与最小直径之间的大比率确保了所述开口的大部分将保持打开，即使是在颗粒被保留时。以此方式，能够在整个过滤过程中实现通过所述过滤器元件的高通量。

为了达到通过过滤器元件的足够高的流率，能够使用多个(相似设计的)开口，所述介质并行流动通过所述多个开口。在细长开口(尤其是具有最大直径与最小直径之间的前文提及比率的开口)的情况中，优选地，这些开口中的几个(至少两个，优选地至少十个，最优选地至少100个)空间上被平行布置，以实现对可用区域的最佳利用。此外，所述开口可以被布置为使得它们的大维度基本上共面。在这种平行开口的布置中，优选地从阵列的一侧提供所述介质，并从相对侧撤出，并且所述开口共享共用的透明壁。

在根据本发明的第二方面的过滤器元件中，所述至少一个开口的横截面可以沿流动方向连续减小(所述开口例如可以具有漏斗形或楔形的三维形状)。在优选实施例中，所述横截面则是以离散级减小。所保留的颗粒之后将被自动地被分类成几个大小(或类型)类别。

本发明还涉及一种过滤器系统，包括根据本申请中描述的任意实施例的过滤器元件，以及用于与所述过滤器元件和/或其内介质相互作用的额外部件。

所述过滤器系统例如可以包括毗邻所述开口的所述透明壁的(显微镜)物镜，以用于对所述开口的视觉检查，尤其用于由人类观察者对所保留的颗粒进行视觉探查。额外地或备选地，图像传感器可以被提供为毗邻所述透明壁，以生成所述开口的图像。之后可以由人类观察者和/或由通过合适的软件实现的自动图像处理例程来评价所生成的(通常为数字的)图像。如果所述开口具有细长横截面，则所述物镜和/或图像传感器优选地被设置为毗邻其大维度。

根据另一实施例，至少一个标记被提供在所述过滤器元件上的相对于所述开口的已知位置处。按照定义，所述“标记”应被设计为使得其能够被容易地检测到，例如在由前文提及的图像传感器生成的图像上自动地被检测到。所述标记因此允许推断所述开口的位置(其可能是不可见的或难以看到的)以及因此允许对过滤程序的正确评价。

在另一优选实施例中，至少一个阀元件被提供用于选择性地转运已经过所述开口的介质。取决于该阀的设置，所述介质能够被引导到不同目的地。因此，例如能够在正常过滤过程期间，将离开所述开口的所述介质传送到废液池中。过滤之后，可以改变所述阀元件的设置，以允许对所保留的颗粒进行分析。所保留的细胞例如可以被破坏，并之后被冲洗到特定的反应腔中，在那里能够完成诸如PCR的进一步分析。在该阶段中也能够例如通过将所述过滤器元件引入到合适的热控制器中，来完成热循环。所述反应腔优选地在被实现在与(一个或多个)过滤器开口相同的载体上，由此允许利用一个相同的设备执行过滤和分析。

(微)流体系统可以任选地被提供用于供应试剂，所述试剂应在所述过滤过程期间与所述介质混合和/或所述试剂对于在过滤后对保留的颗粒的进一步处理是所需要的。如果生物细胞被保留，则所述试剂例如可以对于这些细胞的冲洗、固定和/或染色是所需要的。本发明尤其有利的是：这种处理能够无需首先将保留的细胞转移到另一位置而完成。所述流体系统可以尤其包括针对所需要的介质的贮存器和/或用于控制其流动的控制元件(阀、泵等)。

许多化验都利用磁性颗粒，例如作为针对所述介质的目标组分的标签，其中，术语“磁性颗粒”应包括永磁颗粒以及可磁化颗粒(例如超顺磁珠)两者。为了允许对这种磁性颗粒的致动，根据本发明的过滤器系统可以包括磁体。

前文提及的磁体尤其可以用于独立于所述开口的作用，通过磁力将磁性颗粒(以及与其结合的组分)保留在所述过滤器元件内。此外，磁性颗粒(通常附接有细胞)能够被吸引到所述过滤器元件的壁，以增强或使能过滤行为。该吸引可以在过滤程序期间是永久的，或者是短暂的，例如随后释放磁力以用于进一步的冲洗。磁性致动还能够用于将磁性颗粒(细胞)带向表面，以通过捕获被固定在所述表面上的分子，增强与该表面的特异性结合。一旦被结合，可以去除磁力并且可以冲洗掉未结合的元素。可以液力地(使用冲洗流体)和/或通过将磁性颗粒从所述过滤器元件拉开的另一磁力而磁性地完成磁性颗粒的“冲洗”。

所述介质通过的所述开口、该开口的一部分、和/或被连接到所述开口的流动通道内的部分可以优选地包括针对所述介质的组分(例如，颗粒)的结合部位。额外地或备选地，前文提及的磁性颗粒可以在它们的表面上包括这种结合部位。所述结合部位例如可以为特异性结合到生物流体的靶细胞的抗体。因此能够特异性地保留和/或捕获组分，即使它们太小而不能被所述开口保留。

已表明，为了实现足够高的流率，可以提供多个开口。优选地，这些开口被连接到所述介质的公共入口和/或被连接到公共出口，所述公共出口在所述介质通过所述开口之后收集所述介质。

被保留在单个开口中的颗粒的数目取决于颗粒与开口的相对大小，取决于所述介质中颗粒的密度，并且取决于已被过滤的介质的总体积。优选地，调节这些和/或其他相关参数，使得平均上每个开口保留一个颗粒。这确保了每个颗粒均能够随后被独立地分析。此外，在细长开口的情况中，因此确保了通过所述开口的流率将因颗粒的保留而仅略微减小。

本发明还涉及一种用于在上文描述的这种过滤器元件中过滤介质的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使所述介质沿流动方向经过所述至少一个开口，使得所述介质的颗粒被保留在所述开口中。

b)使制备介质经过所述至少一个开口，以处理所保留的颗粒。该处理例如可以包括对保留的细胞的染色或溶解。

c)作为任选的步骤，所处理的颗粒可以被成像(在它们在所述开口中的位置处)和/或它们可以被移动到隔室中用于进一步分析。

此外，本发明涉及上文描述的这种过滤器元件的用于基于细胞的诊断和/或用于感兴趣细胞从基质(例如从血液或另一体液)隔离的用途。细胞的隔离可以为诊断程序的一部分，或者其可以用于其他目的(例如治疗)。最优选地，隔离是特异性的(选择性的)，即，仅特定类型的和/或具有特定特性(大小、刚度/顺应性等)的细胞被隔离，而其他细胞/组分不被隔离。所隔离的细胞尤其可以为稀少细胞，例如循环肿瘤细胞。因此，本发明的典型且重要的应用领域为肿瘤学中的诊断。

附图说明

本发明的这些以及其他方面将从后文描述的实施例变得显而易见，并参考后文描述的实施例得以阐明。

在附图中：

图1示意性地示出根据本发明的第一实施例的过滤器元件的俯视图；

图2示出沿x方向通过图1的过滤器元件的开口的截面，所述过滤器元件为过滤器系统的一部分；

图3示出过滤器元件的第二实施例的俯视图，所述过滤器元件包括多个反应腔，以对保留的颗粒进行进一步分析；

图4示出在利用聚苯乙烯珠和THP1细胞过滤介质15分钟之后，过滤器元件的照片。

相同的附图标记或相差100的整数倍的附图标记在图中指代相同或相似的部件。

具体实施方式

稀少细胞隔离对于例如基于循环肿瘤细胞(CTC)的癌症诊断而言越来越重要。这种隔离的挑战在于需要检测这些细胞在大量血细胞(红细胞和白细胞)中低至每7.5ml中1个细胞的极低浓度。

循环肿瘤细胞能够在它们的大小和硬度以及上皮细胞表面标记(EPCAM)的存在方面不同于白细胞。能够基于利用抗体官能化的磁珠对EPCAM阳性细胞的特异性免疫捕获来隔离CTC。不表达该标记的CTC因此未被捕获。

已有一些作者提出了在轴向过滤器系统中的基于大小选择的细胞隔离，所述轴向过滤器系统即其中流体流实质上垂直于过滤器表面的过滤器(参见G.Vona等人的“Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells”，AmericanJournal of Pathology，第156卷，第57-63页，2000年1月)。由于小的孔大小，过滤器容易堵塞。为了高通量，孔径必须高，这使得过滤器脆弱和/或造价昂贵。跨过滤器的压降对细胞施加剪切应力，这能够导致损坏和损失。

过滤器还能够用于除去过量的磁珠，所述磁珠用于免疫捕获并且以其他方式干扰成像。

通常需要通过染色和成像识别被捕获的细胞。复杂的过滤器结构干扰光学成像。因此，细胞需要被转移，这是不方便的。

针对分子分析，人们可能想要通过溶解并且通过基于微阵列或测序的RNA表达或DNA重排分析，独立地调查个体细胞。现在还没有这么做的实际解决方案。

总之，以上途径具有以下缺陷和问题：

-因良好定义的孔大小的过滤器的受限通量。

-不表达EPCAM的细胞的损失。

-过滤器结构对光学成像的干扰。

-不可能在捕获之后个体地分析细胞。

-需要在捕获之后对细胞进行操纵以进一步识别/分析。

-因压力梯度造成的细胞损伤/破裂。

为了解决这些问题，下文将描述一种针对细胞捕获盒的设计，其基于具有(任选地多级)大小选择和标记特异性捕获的平面内过滤。捕获的细胞被保持在单独的通道中，以实现在通过成像的识别之后对个体细胞的单独分子分析。不要求细胞转移。

图1和图2分别以俯视图和剖面图示出了该想法的示范性实施例。所述附图示出了过滤器元件100(或盒)，其具有多个(这里是七个相同的)细长开口120(下文中也称作“间隔”)，介质能够沿x方向(图1中的水平箭头)流动通过开口120。每个开口120都具有在垂直于流动方向的y，z平面延伸的细长、矩形横截面。这些横截面的最大直径(图1中的b)与最小直径(图2中的h)之间的比率，即b:h，优选地在约100:1至约1000:1的范围中。

图2示出图1的过滤器元件100，作为包括额外部件1、2、3的过滤器系统10的一部分，额外部件1、2、3对于所述过滤器元件中的样品介质的操纵和/或观察是所需要的。如从通过一个开口120的轴向截面可见，前文提及的开口的横截面(其垂直于图2中的绘图平面)大小沿流动方向x减小。在所示的实施例中，该减小是由开口的高度h的降低引起的，其中，还在图2中指示了最小高度h_min。此外，在所示范例中，高度的减小是不连续地分(三)级发生的，将所述开口分区成具有不同横截面的三个隔室122、123和124。因此，较大细胞C1将被保留在第一(最大)隔室122中，而较小细胞C2也设法进入随后的较小隔室123或124，直到它们被卡住。

为了实现不同细胞沿x方向的显著空间铺展，开口120的(沿流动方向测量的)长度L优选地大于整体最小直径h_min，例如L≥5·h_min或者甚至L≥10·h_min。

尽管所述附图示出开口120的逐步缩窄，该缩窄也能够是连续的(对应于图2中的楔形轴向截面)。

为了实现通过过滤器元件100的足够高的流率，多个开口120在功能上被平行连接。为了实现紧凑布置，这些细长开口120也在空间上被平行布置，如在图1中所示。待过滤的介质通过公共入口通道110被提供到开口120，公共入口通道110始于能够在此将介质引入过滤器元件100的入口端口111。此外，分配通道121被顺序连接到公共入口通道110，其中，每个分配通道121垂直于公共入口通道110延伸，并将所述介质分配到开口120中的一个。在从样品入口111到开口120的流动路径中，横截面(即，间隙)的最小直径应大于开口内的间隙，使得任意感兴趣颗粒都将被保留在开口中而不会更早被保留。

每个开口120结束于关联的收集通道125，其中，所有这些收集通道125均通向公共出口通道131。该公共出口通道131垂直于收集通道125延伸，并终止于出口端口132，介质能够在这里从过滤器元件100撤出。所有通道因此都能够被连接到单个废液腔。同样，开口120后方的流动路径的间隙应大于开口内的。因此，开口构成整体流动路径中的瓶颈。

利用所描述的重复交错的阶梯状通道结构，实现过滤器元件100的非常紧凑的设计。为了低阻力，开口120中具有狭窄间隔的流动路径(“分析区域”)短，并且适合在每个通道中捕获仅小数目的细胞。

如从图2可见，过滤器元件100是由被平面顶部元件101覆盖的结构化底部元件102构建的。这些元件中的至少一个，优选地两者，是由诸如玻璃或塑料的透明材料制成的，以允许对开口120的内部进行视觉检查。在所示的范例中，假设顶盖101为透明的，使得能够经由毗邻的显微镜物镜1视觉检查开口120的内部。显微镜物镜1可以在图像传感器2上生成图像，能够任选地通过计算机(未示出)中的数字图像分析程序评价所述图像。

所述开口的设计优选地为使得血液样品的全部红细胞和绝大多数的白细胞经过。因此，仅需要很小的表面区域以用于收集靶细胞。通过创建具有渐减间隔高度的平行部分的横向台阶，小于毗邻间隙的细胞将移动到下一部分，直到它们被(基于它们的大小和柔性)它们不能进入的间隔挡住。以此方式，总能创建细胞的单层，并且细胞累积在近端间隔的边缘处。通过具有平行布置，细胞的阻塞不影响整体流动，直到所述边缘在整个长度上都被细胞覆盖。

所述边缘的长度b能够被选为非常大，以具有低的流动阻力，并避免开口的阻塞。基于阳性细胞的期望的小数目，选择开口(通道)的数目，使得平均上在每个开口120中将仅捕获1个细胞。此外，能够定义下游部分中在(结构化)表面处包含例如抗-EPCAM捕获探针的区域，以还捕获小的EPCAM阳性细胞。图2示出在开口120的最小隔室124中的这种捕获覆层126。甚至也因此能够捕获等于和/或小于白细胞的细胞，如果它们为EPCAM阳性的话。

开口120的高度被选择为匹配细胞尺寸，以创建单层，所述单层使得能够原位进行成像分析(病理学)，即，无需细胞或过滤器操纵。能够通过与样品相同的通道系统(即经由入口端口111等)，引入所述冲洗、固定和染色溶液。平面内布置允许非常有效的图像分析(病理学)。能够通过相同的进入端口引入染色，从而以相同的方式染色所有捕获的细胞。

与具有离散的孔的轴向过滤器相反，因流动阻力造成的压降没有被局部化在细胞表面处，因为在间隔中存在围绕细胞的连续液体接触。因此，从该途径能够预期有较少的细胞损伤。

成像光学器件1能够识别出分析区域的取向，并使用该取向作为用于分析期间对分级与成像途径的控制。能够向将分析区域分开的壁添加特征，或者，特征能够存在于分析区域的内部，以提供有关分析区域相对于整体过滤器元件100(盒)的位置的信息。该特征能够为标记，例如通过图像分析软件解读的代码或符号。

开口120的壁和级为基底102的内部部分，其能够通过从具有相反结构的模板在塑料中进行复制，或者通过蚀刻玻璃而产生。盒的盖101由平坦的塑料或玻璃薄片制成，该薄片内表面上能够涂覆有试剂。所述基底和盖例如通过激光或热粘合而被连结。得到的过滤器元件100能够具有显微镜载片尺寸。入口端口111和出口端口132能够被集成，以耦合到用于流体处理的系统。额外地或备选地，能够将储液器112集成在所述设备中，其任选地具有板载试剂。

为了使所述系统与使用官能化磁珠的途径相容，能够附接磁体3。当在注射之前将样品与磁珠混合时，具有附接珠的细胞将被拉到通道壁或开口的底部，并且停留在那里，只要磁场开启着。这允许额外的方式以收集已经验证的细胞。能够在相同的盒中并在单次扫描中原位地将该捕获的结果与在阶梯通道中基于大小的捕获以及通过被固定在通道表面上的抗体的捕获(如果包括)进行比较。

前文提及的对磁性颗粒(以及被附接到其的细胞)的吸引可以任选地跟随有磁力的释放，以用于进一步冲洗的目的。此外，磁力可以用于在评价化验之前，主动地从结合表面去除掉未结合的珠。

另一实施例能够利用生物素化的捕获探针，其结合于细胞并之后由盒中的链霉亲和素官能化的表面捕获。

为了能够针对被捕获细胞的分子特性分析被捕获的细胞，可以在开口的出口侧上包括阀，其允许关闭公共废液入口，而是打开通向分析腔的个体出口，可以在所述分析腔中执行例如微阵列杂交和/或PCR反应。

图3示出了根据前文提及的实施例的过滤器元件200。不需要再次解释与第一实施例(图1、图2)的那些相似或相同的部件。过滤器元件200的新颖特征为出口结构230的设计：

开口220的收集通道225被连接到公共出口通道231，其通向出口端口232。然而现在每个收集通道225均还被连接到关联的反应腔236。这些反应腔236的出口被连接到公共废液收集通道234，公共废液收集通道234结束于出口端口232。

此外，能够看出，阀机构被提供用于控制通过前文提及的通道的流动。第一阀系统237控制收集通道225与反应腔236之间的连接。第二阀系统238控制反应腔236与公共废液收集通道234之间的连接。第三阀239控制公共出口通道231与出口端口232之间的连接。阀系统237、238和239例如能够由充当相关联的流体通道的阀的气动控制线路来实现。

通过适当地致动(即，打开和关闭)阀系统237、238和239，离开开口220的介质能够选择性地被直接转运到出口端口232(第三阀239打开并且第一阀237关闭)，或者被转运到个体反应腔236(第三阀239关闭并且第一阀237打开)。尽管优选地在过滤过程期间使用第一种选择，但在过滤之后使用后者，以对反应腔236中所保留的颗粒进行分析。

由于开口220的数目被选择为匹配捕获的细胞的最大数目，事实上，能够无需进一步操纵而确定每个细胞的分子(遗传)性质。反应腔236能够包含微阵列，以对RNA或DNA进行特异性杂交。能够在将RCR混合物引入到细胞的粗杂溶解产物之后，执行扩增反应。显然，下游部分的设计能够被修改为适应必要的反应步骤。能够通过将盒引入到合适的热控制器中，来完成热循环以用于扩增。所述基底与荧光检测相容，以用于读取微阵列并监测qPCR。

还能够基于对所捕获细胞的病理学分析，选择在反应腔中汇集或排除细胞，这允许对假阳性细胞的解读与识别，并允许病理学与遗传学的直接耦合。

能够针对不同的诊断应用调节过滤器元件的尺寸。例如针对小细胞肺癌，已知CTC非常大。针对其中要求细胞大小更接近的其他应用，则要求间隔高度的更接近的间距。能够在诊断应用中使用之前，以实验方式确定理想的间隔高度。在最小的情境中，过滤器将仅用于在免疫捕获之后，从捕获的细胞分离游离磁珠，而没有对所述细胞的进一步特异性分离，以及额外的创建单层以利用于染色和病理学调查进行识别的益处。

关于所述设计的标度，要考虑的第一个参数为与流率有关的流动阻力。流率是从样品体积和期望的分析时间导出的。在间隔中，压降Δp_v如下地定标(其中η为粘度并且V为介质的速度)：

${\mathrm{\Δp}}_v=\frac{12\mathrm{\ηLV}}{h^2}$

可能想要将高度h保持为尽可能地大，但其是由需要被捕获的细胞的大小给出的。因此，仅能够尝试尽可能地多地减小长度L并类似地增加宽度，这并不包括在以上等式中，因为其对于无限宽的通道是有效的。体积流率Q为V·A，其中A为通道的横截面(＝b·h)。

针对总宽度b＝10mm的通道中的16分钟内10ml的体积流速Q(Q＝10μl/s)，间隔中的剪切速率将变成10⁴s^-1并且压降为10⁷Pa/m。这带来细胞可能被损坏的风险。因此，优选的是进一步增大通道宽度。这通过创建如在图1中图示的具有横向流的多个通道而实现。以此方式，能够在显微镜载片表面上实现1cm的n倍的通道宽度。n能够从10增大到几百，流速和压降随之成比例减小。

因强压力梯度造成的细胞损伤是常规过滤器中的担忧问题。本发明提供了间隔，使得总是保持流体的连续性，直到间隔被完全阻塞。

在常规过滤器中，捕获的细胞将完全封闭孔，从而所述孔内侧的压力将低于其顶上的(压力差是由压降造成的，压降是由相邻的仍打开的孔中的流动造成的)。一旦所有的孔均被填满，则压降将等于在入口处施加的压力。该压力差将出现在非常小的区域中，在该区域中，细胞膜接触过滤器的孔。该局部梯度能够使细胞膜破裂。

在所提出的过滤器系统中，细长开口没有被细胞封闭，使得压降保持为适度的并且在细胞膜上为连续的。其因流动而等于在较宽通道中的压降。

对于所提出的过滤器元件的制作，能够通过粘合技术，例如激光焊接或其他，永久连结盖101与基底102，或者盖101与基底102仅彼此接触而不永久粘合。接触区域可以被预处理，以增强盖与基底的粘附。

用于填充血液的入口区域能够被设计为使得能够实现方便的填充，例如通过提供通孔(入口端口)并且任选地提供可以在填充之后关闭的盖。能够在入口区域中提供干燥形式的试剂。在排放通道的末端能够包括废液池，以避免过量的样品(例如血液)可能的溢出。

能够通过注塑或其他复制技术制作结构化基底102。能够在光刻和/或蚀刻的辅助下，生产需要作为模具的模板结构。一种可能的途径要求两个光刻掩模。第一个包含分析区域(即，开口120、220)。在第二个步骤中，使用表示通道结构的掩模，以便创建抗蚀图，所述抗蚀图用于对基底(例如硅石)进行选择性蚀刻。在蚀刻之后，清除抗蚀剂，并且分析区域上的光敏聚合物保留在基底上。以此方式，在基底上创建三个水平。该基底之后能够以例如在光盘制作中完善确立的方式，通过电镀被复制到Ni垫片中。Ni垫片之后用作模具中的嵌件，以通过模塑在塑料中进行复制。

或者，玻璃的蚀刻能够用于创建具有精确定义的间隔的逐级通道。

在过滤器结构的入口与出口处，能够附接或集成储液器，所述储液器允许与流体管路或注射器或流体处理站的互连，并且用于存储试剂和废液。能够通过外部泵、气动接口或其他集成泵，实现对试剂的泵送。

实验

根据图4，在阶梯式过滤器元件300(类似于图1和图2中所示的设计，但仅有两个台阶322、323)中过滤测试介质。将浓度为1.6·10⁵珠/ml PBS的15μm聚苯乙烯珠(Phosphorex)与浓度为1.2·10⁶细胞/ml PBS的THP1细胞混合。得到的介质每ml PBS包含8·10⁴个珠和6·10⁵个THP1细胞。以0.2ml/min引导该介质通过该阶梯式过滤器。

在FACS(荧光辅助细胞分类)机器中分析结果，以调查在过滤过程之后存在的珠和THP1的相对量。数据显示，过滤器没有让任何珠通过。

图4示出过滤器元件300的照片。能够看出，一些细胞被卡在最窄的狭缝323中，或者被有效形成具有小孔尺寸的过滤器的珠B捕捉。对设备的预处理可以减小细胞的粘附。

总之，设计了一种新的过滤器结构，以从诸如血液的复杂基质中有效隔离出稀少细胞。其允许高通量(大体积)并提供在光学基底上的单一平面中的细胞以用于直接检查(病理学)以及用于对个体细胞进行进一步分子诊断，而无需处理。所述设备利用缩窄的(例如，阶梯状)平行通道结构，其能够通过注塑或玻璃蚀刻容易地制作。其与用于病理学(例如用于对图像进行数字化)的扫描器相容。隔离能够是基于大小和基于表面标记的。压力梯度比在常规过滤器中的更小，以避免细胞损伤。所述过滤器结构能够应用于基于细胞的诊断，作为最重要的范例，尤其是具有循环肿瘤细胞的血液中的稀少细胞。

尽管已经在附图和前文的描述中详细说明并描述了本发明，但这样的说明和描述被认为是说明性或示范性的，而非限制性的；本发明不限于所公开的实施例。通过研究附图、说明书和权利要求书，本领域技术人员在实施要求保护的本发明时，能够理解并实现对所公开实施例的其他变型。在权利要求书中，词语“包括”不排除其他元件或步骤，并且量词“一”或“一个”不排除多个。互不相同的从属权利要求中记载了特定措施并不指示不能有利地使用这些措施的组合。权利要求书中的任何附图标记不得被解释为对范围的限制。

Claims (16)

1.一种用于保留介质的组分(B、C1、C2)的过滤器元件(100、200、300)，所述介质沿流动方向(x)流动通过至少一个开口(120、220、320)，

其中，所述开口具有沿流动方向(x)减小的细长横截面，并且其中，所述开口(120、220、320)以透明壁(101)为边界。

2.一种用于保留介质的颗粒(B、C1、C2)的过滤器元件(100、200、300)，所述介质沿流动方向(x)流动通过至少一个开口(120、220、320)，

其中，所述开口具有细长横截面，其中，所述横截面的最大直径(b)与最小直径(h_min)之间的比率大于2:1，优选地大于10:1，最优选地大于100:1。

3.一种用于保留介质的颗粒(B、C1、C2)的过滤器元件(100、200、300)，所述介质沿流动方向(x)流动通过至少一个开口(120、220、320)，尤其为根据权利要求1或2的过滤器元件，

其中，所述开口(120、220、320)具有横截面，所述横截面具有沿流动方向(x)减小超过约20％的最小直径，优选具有沿流动方向(x)减小超过50％的最小直径。

4.一种用于通过将颗粒(B、C1、C2)保留在至少一个开口(120、220、320)中而从介质中过滤出所述颗粒的方法，所述介质沿流动方向(x)经过所述至少一个开口(120、220、320)，

其中，所述颗粒(B、C1、C2)被保留在沿流动方向(x)的不同位置处，所述不同位置对应于所述颗粒(B、C1、C2)的性质。

5.一种用于保留介质的颗粒(B、C1、C2)的过滤器元件(100、200、300)，所述介质沿流动方向(x)流动通过至少一个开口(120、220、320)，尤其为根据权利要求1、2或3的过滤器元件，

其中，所述开口(120、220、320)以至少一个透明壁(101)为边界。

6.一种用于通过将颗粒(B、C1、C2)保留在至少一个开口(120、220、320)中而从介质中过滤出所述颗粒的方法，所述介质沿流动方向(x)经过所述至少一个开口(120、220、320)，尤其为根据权利要求4的方法，

其中，所述开口(120、220、320)从基本上垂直于所述介质的所述流动方向(x)的方向上被光学检查。

7.根据权利要求1、2、3或5所述的过滤器元件(100、200、300)，或者根据权利要求4或6所述的方法，

其特征在于，至少两个，优选地至少十个细长开口(120、220、320)被平行布置，优选地具有基本上共面的大维度。

8.根据权利要求1、2、3或5所述的过滤器元件(100、200、300)，或者根据权利要求4或6所述的方法，

其特征在于，所述开口(120、220、320)的所述横截面的最小直径以至少一级减小。

9.根据权利要求1、2、3或5所述的过滤器元件(100、200、300)，或者根据权利要求4或6所述的方法，

其特征在于，至少一个阀(237、238、239)被提供用于选择性地将离开所述开口(120、220、320)的所述介质转运到不同目的地(232、236)。

10.根据权利要求1、2、3或5所述的过滤器元件(100、200、300)，或者根据权利要求4或6所述的方法，

其特征在于，流体系统(112、212)被提供用于供应试剂，所述试剂与所述介质混合和/或所述试剂对于所保留的颗粒(C1、C2)的进一步处理是所需要的，尤其对于冲洗、固定和/或染色程序是所需要的。

11.一种过滤器系统(10)，包括根据权利要求1、2、3或5所述的过滤器元件(100、200、300)，或者根据权利要求4或6所述的方法，

其特征在于，物镜(1)和/或图像传感器(2)被提供为毗邻所述过滤器元件(100、200、300)的所述开口(120、220、320)。

12.一种过滤器系统(10)，包括根据权利要求1、2、3或5所述的过滤器元件(100、200、300)，或者根据权利要求4或6所述的方法，

其特征在于，磁体(3)被提供用于在所述过滤器元件(100、200、300)中致动所述介质的磁性颗粒(B、C1、C2)。

13.根据权利要求12所述的过滤器系统(10)或所述方法，

其特征在于，磁体(3)用于将所述介质的磁性颗粒(B、C1、C2)至少短暂地吸引至所述开口(120、220、320)的壁。

14.根据权利要求1、2、3或5所述的过滤器元件(100、200、300)，或者根据权利要求4或6所述的方法，

其特征在于，所述开口(120、220、320)或其一部分，或关联的流动通道(110、121、125、130、210、221、225、230、321、325)内的一部分，或所述介质的至少一种磁性颗粒(B、C1、C2)包括针对所述介质的组分(C1、C2)的特异性结合部位(126)。

15.一种用于在根据权利要求1、2、3或5所述的过滤器元件(100、200、300)中过滤介质的方法，其特征在于，

a)使所述介质沿流动方向(x)经过所述至少一个开口(120、220、320)，使得所述介质的颗粒(B、C1、C2)被保留在所述开口中；

b)使制备介质经过所述至少一个开口(120、220、320)，以用于处理所保留的颗粒(B、C1、C2)；

c)所处理的颗粒优选地被成像和/或优选地被移动到单独的隔室(236)中以用于进一步分析。

16.根据权利要求1、2、3、5或7-14所述的过滤器元件(100、200、300)的用于基于细胞的诊断和/或用于细胞的隔离，最优选地用于稀少细胞的隔离的用途。