CN1398296A - 检测细胞趋化性及趋化细胞分离装置的单元孔 - Google Patents

检测细胞趋化性及趋化细胞分离装置的单元孔 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种单元孔，其使用于检测因趋化性因子的细胞趋化性，或因抑制剂的细胞趋化性阻碍时，可正确且容易地检测出细胞自身的动作的装置的制造。因此，本发明提供一种用于检测细胞趋化性及细胞分离装置的单元孔，其特征为多个可容纳静置状态下的液体试样的孔经通道互相连通，通道上设有斜坡，斜坡上部设有构成一或多个具有配合细胞直径或其变形性能的宽和/或深度的孔的屏障，或设有平面，该平面与玻璃基板之间形成配合细胞直径或其变形性能的间隙。

Description

检测细胞趋化性及趋化细胞 分离装置的单元孔
技术领域
本发明设计一种用于判定细胞自身是否会朝向一定方向移动、观察自身朝一定方向移动的细胞的状态或计算自身朝一定方向移动的细胞的数目的装置(即细胞趋化性检测装置)，和用于根据细胞自身的选择性朝向一定方向移动来分离细胞的装置中的孔单元。
发明背景
已知有作为检测体外细胞趋化性的装置的Boyden室。该装置具有这样的结构，它被具有可通过细胞的孔(直径3-8微米)的滤器分隔成上室和下室。将细胞悬浮液装入上室，而将包含趋化性因素的标本溶液装入下室。然后计算通过滤器朝向趋化性因素移动或出现在滤器背面的细胞数。在当今最普遍使用的该装置中，需要使用1/4到1/20毫升的具有1×106细胞/毫升，即相当于至少5×104细胞浓度的细胞旋液。尽管在分析可大量获取的细胞的情况下很少出现问题，然而在诸如占周围白细胞数大约1-5％的嗜酸粒细胞、大约占1％或更少的嗜碱粒细胞，或站大约1-2％的单核细胞这些存在量很少的细胞的情况下，要获得必需量的细胞就很费力。在利用小动物，例如小鼠时，因为可采集的血量有限，即每只动物最大量约1.0。且存在组织中的于癌细胞或一些细胞也难以大量获得，故仅能以微量来研究其性质。另外，Boyden室遇到的另一个问题是，不能够观察到移动过程中的细胞状态或计算其数目。
市售的用于定量分析的载玻片，通过它可以在数个单个细胞的水平上观察细胞的趋化性。在这种载玻片上，在显微镜玻片(25×75mm、2mm厚)上的宽1mm的桥(bridge)(通道)上的两面设有两个宽4mm、长25mm、深度1mm的槽(孔)。即具有两个孔借通道互相连通。一个孔内放入细胞悬浮液，另一个孔则放入含有趋化性因子的标本溶液。放上盖玻片后，观察由其中一孔经由通道移动至另一孔的细胞。但是，在这种情况下，不能设想桥形成了适合细胞直径或变形性能的间隙。同样，在通道上并无设置可通过细胞的孔。另外，每个孔的容积为100μl。这就是说，每孔至少需要1/10ml的细胞悬浮液。同样，市面上还销售另一种具有相似结构的趋化室，其中在载玻片上设置有同心圆的两个槽(孔)，其间以桥梁(通道)相连(由Waber Scientific制造，商品名Dun ChemotaxisChamber)。在这种情况下，内孔放入细胞悬浮液，外孔放入标本，放上盖玻片后，用显微镜观察通过通道的细胞。通道设定的低于盖玻片20μm，细胞可通过它们之间的此间隙。通道平面与盖玻片之间的距离的设定没有考虑细胞直径或变形性能，并且通道中也没有设置通过细胞的孔。
测定血液流动时，Kikuchi等推荐使用具有通道的装置，其中的通道配置了在硅单晶基板表面上应用半导体制作技术，形成的多个微槽(Kikuchi等，SPIE Vol.2978，165-171(1997)；Kikuchi等，MicrovascuarResearch Vol.，44，226-240(1992)；Kikuchi等，Seibutsu Butsuri(Biophysics)，vol.214，254-258(1997))。在该装置中，意图通过在通道的两面所产生的压差而使血细胞悬浮液流动，进而可观察和研究血液流动。尽管可在细胞水平下观察细胞的活动，但在该设想中没有应用可观察或测定血细胞自身移动的结构。
日本专利2532707号公开了一种血循环，其中一端具有流入口，另一端具有流出口的大槽并列配置，并且在分隔此槽的屏障上配置有微槽，通过这些微槽使大槽互相连通，这些微槽与连接流入口与流出口的直线呈直交方向。在这个环路中，血样流入大槽之一，而另一槽中流入含有趋化性因子的标本。然后一部分血样导入微槽(通道)中，并检测通过微槽(通道)的细胞，从而检测细胞的活动和机能，或观察和测定其游走性。由于较大槽中含有血样及包含趋化性因子的标本形成循环流动，在该环路中不具有可容纳静止状态的血样或标本溶液的孔。另外，血样及含趋化因子的标本都必须为有很大量。故此装置不适合使用微量试样来研究细胞自身的活动。
已知有一种血液过滤器，其中血液中的细胞通过微槽，并由此观察通过期间的血细胞的状态(日本专利2685544号)。这种过滤器由在其表面具有微孔的硅基板所构成的第一基板，和具有与第一基板的表面相连的平面的第二基板所构成。血细胞通过两基板的界面处由第一基板的槽形成的空间。为了使微槽中的血细胞流动，必须通过加压、抽吸等施加外部压力。因此，用该装置不能观察到细胞自身的流动。即，该装置不具有可容纳静置状态下的血样或标本溶液的孔。
还已知一种装置，它准备根据诸如细胞膜硬度或细胞变形性能这些功能特性来划分细胞，它是通过使准备区分的细胞通过具有许多微槽的通道，从而将细胞分成可通过的与不可通过的细胞的装置。例如，日本专利2685119号提出了一种装置，其中配置有不同宽度的槽的通道形成于用来进行多级细胞划分的两个台阶处。然而，含有细胞的液体于加压下移动，因此不能观察到细胞自身的移动。
另外，已知一种分层的微通道阵列的装置，其中具有配置了微槽的通道的基板彼此堆叠，从而过滤和划分大量的细胞悬浮液(日本专利公开165062/1999)。然而，此亦为含有细胞的液体于加压下移动的装置，因此不能观察到细胞自身的移动。
发明的详细描述
本发明的目的是提供一种在检测因趋化性因子而出现的细胞趋化性、或因抑制剂而抑制细胞趋化性的情况下，能正确且容易地检测出以自身的作用力而移动的细胞的装置的单元孔。这里所用的术语“基于自身的活动”意思是指没有受到诸如压力等的影响，而是由细胞自身而进行的运动。为了高精确度地检测这种细胞自身的运动，极需要在启动细胞移动前将细胞吸引到通道附近，并排列于细胞进行方向。然而，目前还没有已知的可以在微孔中建立上述情况的单元孔结构。
本发明还一个目的在于提供一种将用于使用微量的细胞试样可检测出细胞趋化性的装置中的单元孔。另外，本发明致力于提供一种用于通过一次性使用大量的标本而有效地搜索细胞趋化性物质及其抑制剂的装置的单元孔。本发明进一步提供一种用于从包含多种类型细胞的混合液中分离和收集特定细胞的装置中的单元孔。
因此，本发明涉及一种将用于检测细胞趋化性及细胞分离的装置中的单元孔，其特征在于多个可容纳静止状态下的液体试样的孔，经通道互相连通，通道上设有斜坡，将这些孔与玻璃基板紧密结合，在斜坡的上部设有构成一至数条配合细胞直径或其变形性能的宽度和/或深度的槽的屏障，或设有平面，使得该平面与玻璃基板间的间隙必须具有配合细胞直径或其变形性能的深度。另外，还涉及一种如上所述的单元孔，其特征在于多个可容纳静止状态下的液体试样的孔，经通道互相连通，通道上设有斜坡，并且在斜坡的上部设有构成一至数条配合细胞直径或其变形性能的宽度和/或深度的槽的屏障。通过斜坡的设置，或斜坡上构成槽的屏障，很容易使孔内的细胞在启动移动前聚集于通道的附近，并在细胞进行方向排列。此效果可通过以下结构而进一步增强：其中使用于在细胞沿起始线排列的步骤中限制细胞移动的屏障垂直形成于朝向相对孔的方向，或者使用于在细胞沿起始线排列的步骤中限制细胞移动的屏障并行于这些屏障的阵列而形成。
在这个单元孔中，多个孔可经通道连成一串。或多个孔可以经通道与一个孔相连。或者，在多个经通道与单一孔相连的孔中，至少两个孔都经通道与另一个共通的孔连接。
上述多个孔是用于容纳细胞悬浮液的孔以及容纳含有趋化性因子的溶液的孔。或这些孔是容纳细胞悬浮液的孔，容纳含有趋化性因子的溶液的孔或容纳含有趋化性因子抑制剂的溶液的孔。
在根据本发明的单元孔中，为了限定通道附近的液体量，对于经通道互相连通的孔之一或者两个孔都设置与通道直交的壁。另外，在这个单元孔中，在与通道直交形成的壁之一或两者上可以形成平台。
本发明的单元孔的斜坡上部的任一处，可设置用于检测细胞的筛选定位标记。另外，在通道上可形成多级斜坡。
在本发明的单元孔中，设置于通道中的槽可以通过垂直于朝向相对孔方向的一至数条槽而互相连通。或通道中朝向对孔方向的多个孔的宽度，可以在每次这些槽与一个或多个与其相垂直的槽相交的时候逐级变化，或者，通道中朝向对孔方向的多个孔的宽度，可以在每次这些槽与一个或多个与其相垂直的槽相交的时候通过改变彼此的位置而形成。
在本发明的单元孔的通道中，也可以在通道中构成一或数条配合细胞直径或其变形性能的宽度和/或深度的槽的屏障阵列的前和后设置平台，因此在细胞流动方向的平台长度可比其他平台长。
在本发明的单元孔的通道中，在通道的中央可设置平台，构成一或多个配合细胞直径或其变形性能的宽度和/或深度的槽的壁的阵列可以形成在该平台的两侧的两个位置，并且如果需要，可在屏障阵列的外侧设置平台。
也可能参考上述各单元孔作为单一单元，并集合一种或多种类型的的单元作为用于检测细胞趋化性及细胞分离装置的单元孔。
附图简述
图1是显示使用本发明的单元孔的模式的例子的截面图。
图2是显示本发明的单元孔的一个示例的顶视图。
图3是显示根据本发明的单元孔的使用模式的示例的截面图。
图4是显示根据本发明的单元孔的示例的顶视图。
图5显示根据本发明的单元孔的使用模式的其他例子，其中(1)为装置的截面图，(2)为根据本发明的单元孔的示例的顶视图。
图6显示根据本发明的单元孔的使用模式的其他例子，其中(1)为装置的截面图，(2)为根据本发明的单元孔的示例的顶视图。
图7显示根据本发明的单元孔的示例，其中显示经通道使三个孔成直列连通的状况。
图8显示根据本发明的单元孔的示例，其中显示具有贯通孔的三个孔经通道连成一串的状况。
图9显示根据本发明的单元孔的示例，其中显示多个孔经通道与一个孔连通的状况。
图10显示根据本发明的单元孔的示例，其中显示多个孔经通道与一个孔连通，且这些孔中设置有贯通孔的状况。
图11显示根据本发明的单元孔的示例，其中显示具有贯通孔的多个孔经通道与一个孔连通的状况。
图12显示根据本发明的单元孔的示例，其中显示一个孔作为中心，多个孔经通道连通，从而形成作为整体的环状结构的状况。在该图中，这些孔都设有贯通孔。
图13显示根据本发明的单元孔的示例，其中显示一个孔作为中心，多个孔经通道连通，从而形成作为整体的环状结构的状况。
图14显示以一个孔作为中心，多个孔经通道而连通的同时，这些孔中，每两个孔经通道与另一个共用孔相通，此图中的孔设有贯通孔。
图15显示设有与通道垂直的壁的单元孔的例子。
图16显示设有与通道垂直的壁的另一个单元孔的例子。
图17显示通道的结构的示例。
图18显示通道的结构的另一个示例。
图19显示通道的屏障的布局图，图中箭头显示朝向对孔方向。
图20显示图19的屏障布局的截面图。
图21显示穿过通道的朝向对孔方向的槽经另一条垂直于它的槽而彼此连通的状况。图中每个箭头显示朝向对孔方向。
图22显示穿过通道的朝向对孔方向的槽经垂直于它的槽而彼此连通的状况。图中箭头显示朝向对孔方向。
图23显示穿过通道的朝向对孔方向的槽经两条垂直于它的槽而彼此连通的状况。并且这些槽的宽度在朝向对孔的方向，在每次与垂直于它的槽相交时发生逐级变化。图中箭头显示朝向对孔方向。
图24显示图8的单元孔的改进的例子，其中的屏障尺寸相同，但其数目发生变化。图中箭头显示朝向对孔方向。
图25显示穿过通道的朝向对孔方向的槽经三条垂直于它的槽而彼此连通的状况，并且朝向对孔方向的槽通过在每次与垂直于它的槽相交时互换彼此的位置而形成的状况。图中槽朝向垂直方向位移1/2间距。图中箭头显示朝向对孔方向。
图26显示屏障在朝向对孔方向连接的状况。图中每个箭头显示朝向对孔方向。
图27显示在屏障阵列的两侧设有平台，其中一个平台较另一个长的状况。图中箭头显示朝向对孔方向。
图28显示在斜坡的中央设有平台，在平台的两边形成了两处屏障阵列的示例。
图29显示设有与通道垂直的壁的孔单元，其中通道中设有一直达到壁的平台的示例。
图30显示设有与通道垂直的壁的孔单元，其中通道中设有一直达到壁的平台的另一示例。
图31显示仅在其中一个孔中设置了壁，其中其通道上设有一直到达壁的平台的示例。
图32显示在通道中斜坡可形成多级式的状况。
图33显示多个单元集成的例子，其中的单元为同一类型。
图34显示多个单元集成的例子，其中的单元为同一类型。
图35显示多个单元集成的例子，其中图15的单元集合在一起。
图36显示多个单元集成的例子，其中的单元环形集合。
图37显示多个单元集成的例子，其中的单元为不同类型。
图38显示制作通道及孔的步骤的示例。
图39显示检测细胞趋化性及趋化细胞的分离装置的结构图例，其中(1)为各零件的透视图，(2)为其对应部分的截面图。
图40显示于斜坡上设置控制细胞移动的障碍物的例子。符号说明
1：通道
2：孔。附加的A、B、B1-n、C表示孔的区分(以下相同)。
3；注入/收集试样的管。附加的a为对应管3的贯通孔。附加的b为管3的顶端。
4：避免于注入/采样时发生升压、减压用的管子。附加的a为对应管4的贯通孔。附加的b为管4的顶端。
5；穿过通道朝着相对孔的方向的槽。
6：屏障
7；基板
8：玻璃基板
9：安装有管的板块
10：斜坡
11：111-n：平台
12：与槽5垂直的槽
13：检测器
14：垂直形成于通道的壁
15：由管3、4的顶端所成的共同空间
16：垫圈
17：盖帽
18；O字环
19：导销孔
20：导销
21：中间支撑体
22：底部支撑体
23：筛选定位的标记
24：障碍物
实施发明的最佳状态
根据本发明的细胞趋化性检测及趋化细胞分离装置的单元孔，具有多个孔穿过通道做结合，互相连通的结构。其中所谓孔系为可容纳细胞悬浮液或细胞趋化性因子或趋化性因子阴天蛴等的标本溶液的容器。所谓通道，系为连通两个孔的部分，细胞由一个孔移动另一孔时的细胞所通过的通咯。
通道中设有如后所述的斜坡，斜坡上设有构成一或多个配合细胞直径或其变形性能的宽和/或深度的槽的屏障，或设有平面，该平面与玻璃基板之间的间隙设置成配合细胞直径或其变形性能的深度。术语“变形性能”是指对于有弹力的细胞而言，细胞因其弹性而容易变形(例如成为扁平状或带状的细胞)，因此可以通过比细胞于自由空间时其形状所固有的细胞直径狭窄的间隙。
通过形成上述间隙，细胞在障碍物之外(即间隙)移动。这就是说，细胞自身的移动被干扰，从而可更准确地判断细胞的趋化性。这种间隙的形成可经由设置斜坡，或在斜坡上设有构成槽的屏障来完成。因此，很容易形成这样一种状态，其中使放入孔内的细胞在趋化开始前聚集于通道的附近，朝着细胞进行方向排列。在形成单个细胞通过的槽的情况下，可观察到各个细胞，因此可根据所需的种类来区分细胞。
本发明涉及用于细胞趋化性检测及趋化细胞分离装置的孔的连通方式、孔的结构及通道的结构。
图1表示具有根据本发明的单元孔的细胞趋化性检测及细胞分离装置的示例。图2表示使用于图2装置的单元孔的顶视图。在这些图中所示的实施例中，单元孔为具有容纳细胞悬浮液或标本溶液等试样的孔2A、2B。在分隔这些孔的斜坡10的上部，设有构成槽5的屏障6。单元孔由光学透明玻璃基板8紧密地盖着，形成密封的空间。在本发明的说明书中含有斜坡10与构成槽5的屏障6的部分结构称为通道。当在孔2的之一(2A)中放入细胞悬浮液时，如果另一孔(2B)的标本溶液含有趋化性因子时，细胞会往孔2B方向移动并通过通道。细胞的移动状态可由检测器13，例如显微镜观察出。在利用此装置的另一实施例中，孔2A中放入各种细胞的混合悬浮液，孔2B则放入特定趋化性因子。收集由孔2A移动至孔2B的细胞。因此，可选择性地分离与趋化性因子反应的细胞。
图3显示利用本发明的单元孔的细胞趋化性检测及细胞分离装置的另一实施例。单元孔具有通道1，孔2A、2B表示可容纳细胞悬浮液或标本溶液等试样的孔。将试样使用微量吸液管等通过管3A或3B提供到孔2A或2B。移动后的细胞亦使用微量吸液管的管3A或3B从孔2A或2B收集。
当细胞悬浮液(即样本之一)使用微量吸液管等的管3A提供到孔2A时，由于注入液体的压力会出现使细胞通过通道1移至孔2B的情况。这造成细胞移动是否与标本的趋化性有关的判断混乱。另外，在准备分离细胞的情况下，所需的细胞被其他细胞污染，因此无法达到发明的目的。同样地，当标本溶液以微量吸液管等由管3B提供到孔2B时，因注入液体的压力使标本溶液会通过通道1而进入孔2A，从而无然细胞悬浮液。造成细胞因趋化性而通过通道1的现象被干扰或抑制。
为了解决此问题，提供与管3分别相通的管4。在这种结构中，施加到管3的注入压力朝管4方向释放，从而防止细胞被强制流入通道1的方向。通过设置连通注入试样的管3的管4，使水平方向的液体压的影响力减至最小，从而可正确地判断标本溶液是否具有细胞趋化性。藉由管4的压差缓和作用，也对于由孔中取例如细胞等的试样的步骤中的压力下降产生有效缓和。使试样的收集更为容易。
本发明提供一种可用于这种装置的单元孔。图4表示可用于这种装置的本发明的单元孔的实施例。孔2A中设有分别放置管3A和4A的贯通孔3Aa和4Aa，孔2B中设有分别放置管3B、4B的贯通孔3Ba、4Ba。
图5(1)和(2)表示利用本发明的单元孔的检测细胞趋化性及细胞分离装置的其他实施例。如图5(1)所示，在图5的装置中，管3A、3B的顶端设有由3Ab及3Bb共有的空间15，用以在孔中注入试样或由孔中取出试样时使压力的影响减少。孔2A、2B、管3A、3B及空间15因装满对诸如细胞等试样不会造成影响的液体，使整个单元保持在一定的压力下。因此，在由管3A或3B注入或采样试样时，可缓和水平方向的压力变化。
本发明所提供的单元孔含有用于这种装置的单元孔。图5(2)表示用于这种装置的本发明的单元孔的示例。孔2A中设置有放置管3A的贯通孔3Aa，孔2B中设置有放置管3B的贯通孔3Ba。
在图5所示装置的应用实施例中，如图6(1)所示，孔2A和2B中设有管3A和3B以及连通管4A和4B，并且在各管顶端设有容纳液体的空间15。如图6(2)所示，在用于这种情况下的本发明的每个孔单元中各设有两个贯通孔。图6表示通道1的斜坡10未设置屏障的单元孔的实施例。
在本发明的单元孔中，根据所需多个孔可按照各种方式彼此结合或连通。本发明含有多个孔2以各种方式经通道1结合而互相连通的结构的单元孔(参照图7-图14)。
另外，本发明中也可以设计具有通道的孔结构，所以可以以尽可能少的细胞试样进行细胞趋化性检测(参考图15和图16)。
通道1中，优选设置构成一或多个配合细胞直径或其变形性能的宽度和/或深度(例如20-约100)的槽的屏障。经由设置这些槽，有可能控制细胞或标本的扩散状况，可更准确地以单个细胞水平观察细胞活动。另外，这些槽的设置可更容易调整细胞在孔内的位置。即，更容易获得将放入孔内的细胞于趋化开始前聚集于通道的附近，在细胞进行方向排列的状况。在本发明的单元孔中可根据所需目的采用各种屏障结构(参照图19-图25)。
通道1中可设置平台。经由平台结构的各种变化，可很容易地观察到通过通道的细胞或正在通过的细胞的状况。另外，还可控制孔内通道中的细胞的位置。本发明涉及具有这些平台结构的单元孔(参照图26-图31)。
本发明的单元孔包括经通道结合为单一单元的多个孔的集成情况(参照图33-图37)。孔的集成使得可以制造用于一次性处理多种类型的细胞或标本的检测细胞趋化性或细胞分离的装置。
在具备本发明的单元孔的检测细胞趋化性及细胞分离装置中，可以通过例如图1、图3、图5或图6所示的在通道1上装上检测装置，例如显微镜而进行观察细胞的移动，或计数通过通道的细胞或通过后的细胞的数目。另外，可藉由组合显微镜、录影机，或CCD照相机，可自动记录到细胞的移动过程。
尽管可以直接由显微镜下观察细胞来检测和计数通过通道1的细胞，亦可依据一般方法，预先将细胞以发光，荧光物质做标识，然后以常规方式捕捉此发光、荧光物。
如后面将要描述的本发明使得可以小型化整个装置，从而可以微量进行试样处理。另外，也可集成多个单元从而同时可进行多个标本的处理。另外，因程序控制液体的吸收和注入因此很容易进行自动化。
装置的自动化，藉由将单一单元、多个相同或不同的单元所组成的一个集成单元或多个集成单元所组成的单元系统，与细胞贮藏部，标本贮藏部，必要时还有吸液管洗净部，及在这些部分上移动的用于供应细胞或标本等试样的吸液管组合，且配置控制这些吸液管操作的机构，可使包括用于细胞或标本等的供给，采样等单元的整个装置自动化。另外，也可以控制检测器，从而扫描多个单元中的通道，同时通过检测器以一定间隔时间作重复检测，从而检测细胞的状态和实时地跟踪细胞的移动。这些控制操作可由电脑程序很容易地进行。
下面，将详细说明根据本发明的单元孔的结构。1)单元孔的结构
如图2、图4及图6所示，优选通道及孔在基板7上构成一体。如果需要，基板7上可设有用于放置与各孔相通的管的孔(贯通孔)。通道上设有斜坡10。斜坡上部为平面，或配置构成槽5的屏障6，如果需要可设置平台11。
设有斜坡10，或斜坡10上设置构成槽5的屏障6，可很容易地建立使放入孔的细胞在趋化开始前聚集于通道附近，并朝细胞流动方向排列的状态。即，其中一孔中放入细胞悬浮液后，从由通道相连的相对孔中吸出适当量液体，使细胞聚集于通道的附近。由于斜坡10或斜坡10与屏障6的存在，使细胞排列在与流动方向呈直交的方向。接着，与相对孔里注入趋化性因子，细胞开始经由通道移动。如果细胞没有聚集于通道的附近或没有排列的情况下，细胞的活动不规则，由于产生所谓的细胞随机移动，所以难以明确地检测出趋化性。通过使用此单元孔，可以通过如下方式制造检测细胞趋化性或细胞分离的装置：1)将玻璃基板7放置于基板7上(具有孔和固定于板块9上的通道，其中的板块9上具有通过贯通孔到达基板7的管)(参照图1)，或2)，基板7以这种方式设置有孔和通道，即管各自通向贯通孔然后再贴在和固定于玻璃基板上(参照图3、图5、图6)。另外，板块9、基板7及玻璃基板8以0型环缔结使其紧贴并固定(参照图39)。2)孔
孔2为具有于静置状态下容纳试样，即细胞悬浮液或含有趋化性因子的溶液或含有趋化性因子抑制剂的溶液等标本溶液的结构。这个结构是正确检测细胞自身移动的必要结构。孔的容积无特别限制，只要可容纳最小必要量液体即可。例如容纳0.3ul的液体量时，孔的深度为0.1mm、宽为1.2mm，长度为2.5mm即可。3)经由通道的孔的连通方式
为了经由通道连接孔，一般使用如图2、图4、图5(2)或图6(2)所示的二连式，图7、图8所示的三连式系统。图2及图7为未设置贯通孔的状况，图4、图6、图8为设有贯通孔的状况的例子。三连式的情况，例如孔2A中放入细胞悬浮液体，孔2B中放入含有抑制剂的液体、孔2C中放入含有趋化性因子的液体，可一次检测三种物质的关系。
如果需要，孔可互相结合或连通。作为连通形式，可使用如图9-11或图8所示的同心圆形式，其中一个孔的周围经通道连通多个孔，可形成所谓的通心圆状。同样也可如图12、13等形成同心圆状。图12、图13为三连式的同心圆状的实施例。
在图9-图11的例子中，中央孔2A中放入细胞悬浮液，孔2B1-4中放入各种标本。因此可同时检测多个趋化性因子。另外，通过将含有多种类型细胞的试样放入孔2A中，可根据细胞种类一次进行分离(分类)。例如，孔2B1-4中放入对应细胞种类的趋化性因子，中央的孔2A中放入含有多种细胞的试样，例如放入全血。细胞往各个有趋化性因子的各孔2B1-4移动。经过一定时间后，由各孔2B1-4收集细胞。
图14表示一个实施例，其中多个孔各经围绕位于中央的一个孔(2A)的通道相连通，在这些孔中，至少两个孔(2B1及2B2)互相经通道再与其他共通的孔(2C)连通。在这种情况下，孔2A中放入细胞悬浮液，孔2C中放入含有趋化因子的标本溶体，孔2B1及2B2分别放入含有不同抑制剂的标本溶液。因此可比较和检测各个抑制剂性质于同一条件下的特性。4)孔的结构的特定模式
经通道互相连通的孔的任一方(例如容纳细胞的孔)或双方配置有限制通道附近的液体或细胞悬浮液的量的与通道垂直的壁，可容易调整细胞在通道内的相关位置，或容易调整标本试样的流向(图15)。图15表示经通道1连通的孔2A和2B，并且各个孔上设有与通道直交的壁14A及14B的实施例。由试样注入管3A注入细胞至孔2A时一定量的细胞聚集于壁14A与通道1之间。壁14与通道1的间隔可任意设定，但一般在50～300μm范围。
图16表示设有与通道垂直的壁的孔单元的变形例子。即，图16(1)显示了其中在孔宽的部分设有通道的实施例。(2)显示通道于中央分为两部分，在一个孔(2A)的两侧经通道配置有二个孔(2B、2C)，同时仅孔2A面设有壁14A的例子；(3)为在通道中两列屏障阵列形成于平台11的两侧的状况。自然，这种变形例子仅为举例说明，本发明不限定于此。5)通道
通道1(图3、5、6、8～16)的实施例将参考图1～6、图17、18说明如下。通道1上，在分隔两端孔2A与孔2B的斜坡10(基板7上突出部)与玻璃基板8之间设有一个通过细胞的空间。斜坡10的上部为平面(参照图6)，或配置有构成槽5的屏障6，及如果必要设置平台11。另外，图17为图1所示装置结构的例子，图18表示图3或图5所示装置的结构的例子。
隔开通道1的两端的孔2A和孔2B的斜坡10的尺寸无特别限定。例如斜坡10的高度可以在0.03～0.1mm范围，在朝向相对孔方向的长度为0.01～0.5mm范围，与朝向对孔方向呈直交方向的长度，可以与孔的宽相同或较小。
斜坡的上部未设构成槽的屏障的情况下，斜坡的上面与玻璃基板之间设置配合细胞直径或细胞变形性能的间隙与深度空间。在这种情况下的深度根据细胞种类，一般在3～50μm范围。这就是说，中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等的情况下为3～10μm(例如6、7、8或10μm)，在癌细胞或存在于组织中的细胞的情况下为10～20μm。6)屏障及由通道的屏障构成的槽
如图19所示，斜坡10的上面可设有屏障6。由屏障6构成的槽5截面图可以是例如V字型截面图、凸型截面图或半圆型截面图等任意形状(参照图20)。
槽5的宽度一般为3～50μm范围。优选该宽度允许一个一个通过目标细胞。因此根据细胞种类选择适当的宽度。中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等的情况下为3～10μm(例如6、7、8或10μm)，在癌细胞或存在于组织中的细胞情况下为10～20μm。
槽5的深度(即屏障6的高度)可根据显微镜的焦深适当设定。或者使得仅可以一个个细胞通过来设定深度。也可以分别调整槽的宽度与高度，使得仅可以一个个细胞通过。
在调整槽5的深度于观察细胞移动时所用的显微镜的焦深内的情况下，例如配合10～40倍的显微镜焦深时优选大约4.5μm的深度，但本发明并不限定于此。
槽5的数目由与通道的宽度和槽的宽度相关的屏障的宽度来决定。例如，在通道宽度为1mm、屏障宽度为10μm、槽的宽度为5μm的情况下，槽的数目最大为66条。为了顺利进行检测和观察，槽的数目优选为1至大约100条，更优选为约10至70条。
屏障6的长度为约5～400μm范围。例如可使用5、10、20、30、40、60、100、200、300或400μm。屏障6自身的宽度可适宜地确定。在采用如后述图25所示的结构时，长宽几乎相等时较能发挥功效。
如图21、22所示，形成通道1的槽5可以经由垂直于朝向相对孔方向的一或多个槽12互相连通。由于这种结构，可正确地理解细胞通过的情况。在这种情况下，如图23、图24所示，槽5的宽度在每次与垂直于朝向相对孔方向的槽12相交时发生逐级变化。另外，图23显示屏障6自身的宽度变化的例子。如图24所示，经由增减具有同一尺寸的屏障6的数目来改变槽5的宽度。
如图25所示，朝向相对孔方向的槽5可通过每次与垂直于它的槽12直交时改变相互间位置关系而形成。图25表示朝向相对孔方向的槽5在每次与垂直于它的槽12直交时，改变各1/2的间距的位置关系而形成的状况，如5a与5b所示。当按照如上方式形成槽5时，含有趋化性因子或抑制物质的标本溶液可以充分扩散。结果，标本溶液在朝性相对通道的方向可以均匀分布，同时可有效地避免在细胞或标本的注入/采样时发生的压力升高/降低。
另外，如图26所示，屏障6在朝向相对孔方向可以连接在一起。7)通道中的定位标识
为了检测通过通道的细胞的状态，检测器13于一定间隔后会回到一定的通道上，如此在某些情况下可重复进行检测。例如后面将要描述的一样，检测器13同时扫描各个孔单元中的通道，以便实时检测通过各单元孔的通道的细胞状态。在这种情况下，于通道某位置上设有筛选定位标识较为方便，从而在每次筛选期间可以监测相同范围。标识可以是任何形状，只要有利于定位即可。另外，如后面将要描述的，标识所设置的位置可以为例如斜坡10的上部，平台11的任意位置，或任意屏障的上部等任何位置。另外，所设的标识的数目可为一个或多个(参考图27、图28(1))。8)通道中的平台
如图1、图2所示，通过在斜坡的上面设置平面11，可以很容易地观察细胞的通过。(此平面亦称为平台)。平台11虽然不是必需的，但优选设置平台。如图2所示，在平台11设于屏障6阵列的两侧时，在朝向相对孔方向的长度可是当地在约0.03mm至0.4mm范围。另外，如图27所示，设于屏障6阵列的两侧的平台11-1和11-2之一(图27中为11-1)可比另一平台(图27中为11-2)长。藉由此结构可容易地观察通过通道的细胞。
另外，图27显示了在斜坡上面设有(+)标识(23)的例子，但此标识可任意提供。
也可以在斜坡中央设有平台，并且在平台的两边可设置屏障的两个阵列(参考图28)。藉由此结构可延长通过通道的细胞在平台上的时间，这利于观察和计数细胞。需要位于中央的平台具有包括在显微镜的视野中的区域。图28(1)为顶视图，图28(2)为截面图。
图28中，尽管显示了在两个位置设置了标识(23)的状况，但这些标识可任意设置。
图29～图31为对图15、图16所示类型的孔中的通道上设有平台的例子。另外，图29～图31的(1)为顶视图，(2)为(1)中虚线所示部分的截面图。图29显示在通道的两侧设有到达垂直于通道的壁14A、14B的平台11A、11B的例子。图30中仅通道的一边设有到达垂直于通道的壁14A、14B的平台11A、11B，而另一边则无延伸到壁14B的平台11B的例子。图31表示仅在注入细胞的孔2A上设有与通道直交的壁14A的情况下，设置到达该壁14A的平台11A。通过在图15、图16所示形态的孔上设有这种平台，可以避免放入孔2B的趋化性因子或抑制物质经通道朝孔2A方向的快速扩散。在没有设置这样的平台的情况下，由于在通道附近大的体积因此扩散很迅速。
另外，如图32所示，因斜坡10为多段式(即形成斜坡10的多级平台11)，由一边放入孔内的细胞在从另一边抽吸时容易被聚集于斜坡10的附近。例如，当细胞为中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞等的情况下，自平台11-2及11-3与玻璃基板8之间的距离(即图中为屏障6的高度)设置为3μm，平台11-1及11-4与玻璃基板8之间的距离设置为4.5μm。然后在孔2A中放入细胞，在另一孔2B侧抽吸出液体。在这种情况下，细胞暂时在平台11-1处停留。接着，细胞较易聚集于平台11-2与玻璃基板8之间。平台11-1-4与玻璃基板8之间的距离可根据要处理的细胞而适当确定。尽管这些距离通常大约在3至5μm的范围内，但本发明不限定于此。当设置容纳细胞的孔的相对侧的平台(11-3)的长度，比容纳细胞的孔一侧的平台(平台11-2)长约1.5至5倍时，可更容易观察和计数通过孔的细胞。9)通道中的障碍物
放入在一个实施例的结构中，其中在放入趋化性因子前，于相同的细胞条件下，细胞排列在朝细胞进行方向的另一边的孔的起始线上，建议设置一个障碍物以控制通道中细胞的移动。
这里所用的“障碍物”无须完全阻挡细胞的移动，仅限制其移动。尽管可举出一连串突起阵列，一连串三角柱或四角柱的阵列，但它们可以是任意形状，只要可达到目的即可。较好的是将障碍物的位置设置在斜坡上部，单本发明并不仅限于此，只要可达到目的即可。在没有设置屏障的情况下，整个斜坡的上面作为平台，障碍物可设定于靠近其一端(图40(1))。在斜坡的上面设置屏障与平台时，障碍物可设定成与屏障阵列并行且于孔的一边(图40(2)～(4))。
在图40中(1)、(2)及(4)中采用突起阵列作为障碍物。在图40(3)中采用三角棱柱阵列作为障碍物。
障碍物的高度可以与细胞直径或变形性能的长度相同，或相当于其21/4到1/2。障碍物的间隔，可以与细胞直径或变形性能的长度相等。在障碍物设定的较低的情况下，其间隔可以缩短。10)多个单元的配置
通过参考经由通道而连通的多个孔作为一单元，可以将多个单元配置或集成。因此，可获得同时处理多个标本的单元孔。可根据需要进行各种类型的配置和集成(例如图33～35)，或圆形(例如图36)、或配置不同类型的单元(例如图37)。下面，将参考各图说明配置或集成的方式。但本发明不限定于此，因此可根据需要应用各种组合。
图33及图34为各具有经图3所示的通道连接的一对孔的12孔单元安装于基板7(16mm×16mm)上的实例。该单元的尺寸主边长5.7mm，短边长1.2mm，单元间隔为0.8mm。在图33的实施例中，在基板7上设置正方形贯通孔3a及4a，而图34上贯通孔为圆形。
图35显示其中图15所示类型的12孔单元安装在基板7上的实施例。
图36表示二连式的独立单元孔以圆形方式集成的状况。尽管图36所示的各孔都具有贯通孔，当然也可以为不具有贯通孔的状况。关于尺寸，例如，孔2A及2B在径向的宽度为1.5mm，通道宽度为0.5mm，槽的宽度为10μm。在这种情况下，整个单元的半径是5.0mm。当然，可根据需要改变尺寸。
图37表示包括图33至图36所示的多个单元的集成的进一步集成。在图37中，由A1-4、B1-4、C1-4、C1-4所表示的四边形分别为图33至图36所示的单元孔的集成。在这种情况下，A行、B行、C行及D行为彼此不同类型的单元的集成。
在集成多个单元的情况下，可配置单一板块9从而将管连接于所有单元中。同样，单一玻璃基板8可作为一个整体。11)孔与通道的制造孔与通道的构造
做为基板7的材料，优选使用单晶硅，因其容易进行微细加工，且对于细胞来说比较惰性。通道1的屏障6及槽5可采用集成电路制作上所使用的光蚀刻技术或蚀刻技术(例如湿式蚀刻或干式蚀刻等)加工单晶硅而构建。孔2及贯穿孔3a、4a(这些孔比屏障6或槽5大)可通过各种已知的工程技术例如喷砂法，干式蚀刻法等来构造。除了单晶硅外，硬质玻璃，硬质塑料，金属等只要可以构筑通道上的微细结构的材料均可以使用。在使用塑料的情况下，优选对表面赋予亲水性的处理，例如在表面形成亲水性薄膜的处理。也可以分别制造通道1及孔2之后将它们予以组合。
现在将参考图38对湿蚀刻制造步骤的例子进行说明。首先，在单晶硅基板的一部分(1)中，如(2)及(3)所示，形成槽5。其中(2)为顶视图，(3)为沿虚线所取的截面图。然后，除槽5及屏障6留下外全体结构往下切割屏障高度(例如4.5μm)，如图(4)所示。其后，中央留下斜坡10再往下挖形成孔2A、2B，如图(5)所示。如果需要，通过喷砂等方法在孔底部设置贯通孔3a、4a，如图(6)所示。(7)为结构(6)的顶视图。可以同样方式构建具有集成的单元孔的基板。12)检测细胞趋化性及细胞分离装置的制造
制造使用本发明的单元孔的检测细胞趋化性及细胞分离的装置可如下制造。如图1所示的装置，可通过组合基板7与玻璃基板8来制造；对图3及图5的装置而言，可通过组合基板7、玻璃基板8及板块9来制造。
如图3、图5或图6所示，板块9为具有与孔相通的管的元件。如果物理学上可行可于孔的贯通孔3a或4a上直接安装管。在这种情况下并不需要板块。管3和4通常具有正方形或圆形截面。尽管管的大小没有严格限定，但通常在正方形管的情况下边长为1mm，圆形的情况下则直径为1mm。为了容纳所需体积的细胞悬浮液或标本溶液，需要这些管具有2mm～10mm的长度。
构成板块或管的材质，可选自玻璃、丙烯酸树脂等的塑料或金属。板块或管子以一般的方法，例如机械性的凿孔或激光凿孔等工程技术很容易制作。另外，通过用光照射光聚合树脂，然后留下经感光的部位，未感光的部位则由溶剂溶解而除去可产生板块和管。
如图1、图3、图5和图6所示，玻璃基板8仅仅压在基板7上，以提供可容纳液体的空间，从而可观察到通过通道的细胞。因此，玻璃基板8应该保持光学上透明且是平面。另外，可粘著细胞者为佳。可使用玻璃和例如透明丙烯基等塑料，只要能够满足上述目标即可。本发明中虽然对厚度无特别限定，但1～2mm则足够。
图39为使用本发明的单元孔制造检测趋化性及趋化细胞分离装置的实施例。盖帽17与中间支持体21之间放置设有单元孔的基板7，填充物16与覆盖其上的一个板块9。中间支持体21与底支持体22之间放置玻璃基板8，以螺丝钉拴紧。板块9与基板7的位置由中间支持体21所决定，并由设于板块的底面的导销孔19而固定。或者，基板7可直接压紧并固定在板块9上。13)检测方法
本发明所使用的检测元件为可检测在通道中移动的细胞或移动后的细胞的元件。如果需要，它包括记录检测数据的元件。任何可检测和记录细胞的已知元件皆可使用，例如可任意与录像机等组合的显微镜。也可采用物镜上配置有CCD照相机的结构。对于集成单元的检测，优选采用物镜对各单元的通道做顺序扫描的结构。
如图1、图3、图5和图6所示，检测元件配置在单元的通道中。但对于集成多个单元的装置而言，可采用一个系统，其中检测器在单元的阵列上顺序移动以进行检测和记录。在这种情况下，用检测器扫描排列的各单元的通道。因此，可以对各通道作一定时间间隔的反复检测，并可实时地监测细胞的活动。可以使用一个或多个扫描检测器。由于此结构，向对少的检测装置就足以检测多个集成单元。
可使用显微镜、CCD照相机或CCD摄影机等进行直接观察来检测和计数通过通道中，或通过后的细胞。通过将细胞预先以发光或荧光物质做标识，然后以常规方法，捕捉发光团或荧光团而很容易检测和计数。
工业利用性
使用本发明的单元孔，可依各种目制造适当的检测细胞趋化性及细胞分离的装置。例如可得到注入试样时不易产生水平方向的压力变化(升压)，从而很少引起因外压而致的标本或细胞的移动。通过使用这种装置，可正确判断细胞自身的运动，并可得到确实反映趋化性因子或抑制剂作用和细胞性质的定量及定性数据。
另外，在Boyden室中，因可捕捉细胞的随机运动，因此无趋化性因子的背景变高。相反，在使用本发明的单元孔的装置中其背景可几乎达到零，因此可得到高准确率的定量。
本发明的单元孔适用于处理微量试样。即，与通常所用的Boyden室相比，所使用的细胞量可为1/10至1/1000。例如检测中性粒细胞的趋化性时使用以0.1μl全血；而嗜酸粒细胞、单核细胞或嗜碱粒细胞时用1μl的血液。
另外，本发明的单元孔可为微小型，故可集成多个单元，其优点是可制造同时处理多个试样的装置。
本发明的单元孔适于从包含多种类型细胞的细胞悬浮液中仅移动特定细胞，然后从此孔中可收集特定细胞。如此，可准确收集目标细胞。
在根据本发明的单元孔中，通过在通道1上设有斜坡，并在斜坡上设置配合细胞直径或其变形性能的宽和/或深度的各种模式的槽5，或在斜坡上设置平面以提供配合细胞直径或其变形性能的间隙，可容易捕捉到各个细胞的活动。另外，因设有斜坡或斜坡上设有构成槽的屏障，使放入孔的细胞于趋化开始前聚集于通道的附近，并排列在细胞进行方向，如此可高正确度地检测出细胞的趋化性。
本发明的单元孔中，可以不需预先分离而从包含各种类型细胞(粒如全血)的试样中检测血细胞的一部分的趋化性。另外，通过选择适当的趋化性因子，可由含有多种细胞的试样中根据细胞种类分离细胞。

Claims (19)

1.一种用于检测细胞趋化性及细胞分离装置中的单元孔，其特征为多个可容纳静置状态下的液体试样的孔，经由通道而互相连通；通道上设有斜坡，设置孔与玻璃基板紧密贴合，并在斜坡的上部设有构成一或多个具有配合细胞直径或其变形性能的宽和/或深度的槽的屏障；或设有平面，该平面与玻璃基板之间的间隙适合细胞直径或其变形性能。
2.如权利要求1的单元孔，其特征在于多个可容纳静置状态下的液体试样的孔，经由通道互相连通，通道上设有斜坡，斜坡的上部设有构成一或多个具有配合细胞直径或其变形性能的宽和/或深度的槽的屏障。
3.如权利要求1的单元孔，其特征在于多个孔经由通道彼此串联。
4.如权利要求1的单元孔，其特征在于多个孔与一个孔经由通道连通。
5.如权利要求4的单元孔，其特征在于在经由通道而连通到一个孔上的多个孔中至少有两个孔经由通道而与其他共用的孔连通。
6.如权利要求1的单元孔，其特征在于多个孔为可容纳细胞悬浮液及含有趋化性因子的溶液的孔。
7.如权利要求1的单元孔，其特征在于多个孔为可容纳细胞悬浮液的孔、容纳含有趋化性因子的溶液的孔和容纳含有趋化性因子抑制剂的溶液的孔。
8.如权利要求1的单元孔，其特征在于在经由通道互相连通的孔的任意一方或两方中设有与通道直交的壁，以限制通道附近的液体量。
9.如权利要求8的单元孔，其特征为形成延伸到垂直于通道的璧的一或两边的平台。
10.如权利要求1的单元孔，其特征在于在斜坡上部的任意处，设有用于检测细胞的筛选定位标识。
11.如权利要求1的单元孔，其特征在于在通道上的可设有多阶式斜坡。
12.如权利要求2的单元孔，其特征在于设于通道中的槽经由垂直于相对孔方向的一个或多个槽而互相连通。
13.如权利要求12的单元孔，其特征在于在通道中，朝向相对孔方向的多个槽的宽度在每次与垂直于它的一个或多个槽相交时逐级变化。
14.如权利要求12所述的单元孔，其特征在于通道中，朝向相对孔方向的多个槽在每次与垂直于它的一个或多个槽相交时通过互相移动其位置而形成。
15.如权利要求2的单元孔，其特征在于通道中，在构成一或多个配合细胞直径或其变形性能的宽和/或深度的槽的屏障阵列的前和后设置平台，且在细胞流动方向的平台长度比其他平台长。
16.如权利要求2的单元孔，其特征在于通道的中央设置平台，构成一或多个配合细胞直径或其变形性能的宽和/或深度的槽的屏障阵列在该平台两侧的两处形成，如果需要的话，屏障阵列的外边亦设有平台。
17.如权利要求1的单元孔，其特征在于在垂直于相对孔的方向设有在细胞排列于起始线的步骤中欲限制细胞移动的障碍物。
18.如权利要求2的单元孔，其特征在于在细胞排列于起始线时欲限制细胞移动的障碍物与屏障阵列并行设置。
19.一种用于检测细胞趋化性及细胞分离装置的单元孔，其特征为如权利要求1至18项中任意一项所述的单元孔被称为一个单元孔，和一或多种类型的多个单元集成在一起。
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