CN109706076A - 观察细胞迁移极化分子分布的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种观察细胞迁移极化分子分布的方法，细胞可在特定趋化物的作用下定向运动，可用于对不同细胞在特定趋化物作用下的趋化运动观察，并基于此对细胞迁移极化中的特定子分布进行观察；另外，本发明中细胞迁移过程排除自身重力因素影响，可对细胞迁移极化过程及相关极化分子进行观察。
Description
技术领域：本发明涉及一种细胞实验用装置，特别是一种观察细胞迁移极化分子分布的方法。
背景技术：细胞迁移是细胞在接收到迁移信号，通过一系列的粘附去粘附的过程，在基质表面产生的细胞位移，是细胞运动的重要现象。细胞迁移过程中涉及到细胞骨架和其结合蛋白及细胞外基质蛋白的变化，在迁移信号浓度及细胞外基质密度的刺激下，细胞内外的信号分子和细胞骨架调节分子产生不对称的分布和/或激活，导致细胞骨架的形态、分布和细胞器的定位在即将发生迁移的方向上表现出前后不对称型，这一过程被称作迁移细胞的极性化。在极化过程中涉及多个信号通路和分子，而不同信号通路及分子的相互作用保证了细胞极化及迁移过程的正确完成。在细胞迁移极化过程中，这些细胞分子分布状态的改变，在细胞迁移过程中发挥了重要的作用。
目前在细胞实验中，用于细胞运动迁移观察和测定的方法如细胞伤口愈合、Boyden小室、Transwell小室等模型已在细胞迁移研究中取得了显著的成果，然而，对于细胞运动迁移极化的观察，这些模型还存在其局限性。细胞伤口愈合类细胞迁移运动，现有的技术中通常采用物理划痕方式，对于细胞的迁移运动缺乏方向性，多为随机运动，不便于细胞极化观察研究；Boyden小室、Transwell小室则为细胞在趋化物作用下由上室穿膜向下室的迁移，结果受自身重力因素影响，缺乏细胞迁移极化过程。以上方法均不能对细胞迁移极化过程进行观察，并基于此进一步对分子分布进行研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种观察细胞迁移极化过程中分子分布的装置和方法。
本发明的一个目的是提供一种观察细胞迁移极化的装置，
如图1至2所示，其特征为在圆形培养皿2中装有3ml琼脂糖1，在琼脂糖中有两个圆孔3，4，即为细胞用孔和趋化物用孔，在连接圆孔3，4之间的区域为观察细胞迁移的区域5。
所述趋化物为一种可以诱导细胞由低浓度趋化物区域向高浓度趋化物区域迁移的物质，包括但不限于补体类趋化物、CC类趋化物、CXC类趋化物、CX3C类趋化物、甲酰化肽类趋化物（如fMLP）等。
所述细胞，包括但不限于中性粒细胞，巨噬细胞，单核细胞，淋巴细胞，内皮细胞，网柄菌等。
所述细胞用孔、趋化物用孔为直径为3.5mm、深为3.2mm的圆孔，圆孔间距离为2.4mm。
本发明的另一目的提供一种观察细胞迁移极化过程中分子分布的装置的制备方法，其特征在于：
（1）玻璃组织培养片的准备：利用100%甲醇清洗玻片并晾干，将干燥后的玻片放置于培养皿中，加入10%的胎牛血清（FBS）并于室温静置30分钟；去除FBS，使用PBS洗涤两遍。
（2）配置A液：在50ml离心管内依次加入RPMI1640培养液18ml、胎牛血清2ml、10*HBSS（含钙镁）2ml、无菌双蒸水8ml，充分混匀，置于68水浴箱中，水浴35分钟。
（3）配置B液：50ml离心管称取0.48g低熔点超纯去热源琼脂糖，加入10ml无菌双蒸水，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀。
（4）配置A, B混合液：使用微波炉加热至B液沸腾，将A液移至B液中，充分混匀A、B液。
（5）制作琼脂糖凝胶：吸取AB混合液3ml加入至培养皿（含上述处理过的玻片）中，室温冷却1小时，再放置于4冰箱中冷却1小时，即为琼脂糖凝胶。
（6）制作细胞及趋化用孔：在培养皿的琼脂糖凝胶上制作孔间距为2.4mm，孔径大小为3.5mm的小孔，使用负压吸引器吸除小孔内的凝胶室温静置30分钟，再次使用负压吸引器吸除小孔内的液体。两个小孔，左侧为细胞用孔，右侧为趋化物用孔。
（7）加入细胞、趋化物：在右侧趋化物用孔中加入10ul的趋化物，浓度为0.1-1uM，左侧的细胞用孔中加入10ul的细胞悬液，细胞浓度为1*107个/ml。将培养皿置于孵育箱中培养2-3小时。趋化物可在琼脂糖凝胶下扩散形成浓度梯度，细胞可在趋化物的作用下发生定向迁移。
本发明的另一目的提供一种观察细胞迁移极化过程中分子分布的方法，其特征在于：
（1）固定：细胞迁移结束后，使用预冷的1%的多聚甲醛（5ml/皿）固定细胞10分钟，轻轻的去除琼脂糖凝胶，使用预冷的PBS洗涤细胞两次（5ml/皿）；
（2）通透：观察细胞内的分子改变，需要使用预冷的通透液冰上通透细胞5分钟，而观察细胞表面分子则不需要进行细胞通透；
（3）封闭：使用1%BSA封闭液（5ml/皿）封闭细胞30分钟，移液器吸除封闭液，无需洗涤；
（4）染色：培养皿中加入稀释好的一抗室温孵育1-4小时，PBS洗2遍，接着加入稀释好的二抗室温孵育1小时，PBS 洗涤2遍；使用DAPI复染细胞核，PBS洗涤2遍；
（5）封片观察：取出玻片，置于载玻片上，封片并使用激光共聚焦观察迁移极化细胞分子分布情况。本发明具有如下有益效果：
(1)细胞伤口愈合类细胞迁移运动，现有的技术中通常采用物理划痕方式，对于细胞的迁移运动缺乏方向性，多为随机运动, 本发明中细胞可在特定趋化物的作用下定向运动，可用于对不同细胞在特定趋化物作用下的趋化运动观察，并基于此对细胞迁移极化中的特定子分布进行观察。
(2)Boyden小室、Transwell小室则为细胞在趋化物作用下由上室穿膜向下室的迁移，结果受自身重力因素影响，缺乏细胞迁移极化过程, 与之相比，本发明中细胞迁移过程排除自身重力因素影响，可对细胞迁移极化过程及相关极化分子进行观察。
附图说明
图1为观察细胞迁移极化过程中分子分布的装置示意图
图2为观察细胞迁移极化过程中分子分布的装置剖面结构示意图
图3为中性粒细胞迁移极化过程中F-actin分子分布的影响。
具体实施方式
为了详细说明本发明的技术手段、实施方式、解决的技术问题及获得什么样的技术效果，下面结合附图对本发明涉及的观察细胞迁移极化过程中分子分布装置进一步说明。
观察细胞迁移极化装置过程的步骤如下：
（1）玻璃组织培养片的准备：利用100%甲醇清洗玻片并晾干，将干燥后的玻片放置于培养皿中，加入10%的胎牛血清（FBS）并于室温静置30分钟；去除FBS，使用PBS洗涤两遍。
（2）配置A液：在50ml离心管内依次加入RPMI1640培养液18ml、胎牛血清2ml、10*HBSS（含钙镁）2ml、无菌双蒸水8ml，充分混匀，置于68水浴箱中，水浴35分钟。
（3）配置B液：50ml离心管称取0.48g低熔点超纯去热源琼脂糖，加入10ml无菌双蒸水，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀。
（4）配置A, B混合液：使用微波炉加热至B液沸腾，将A液移至B液中，充分混匀A、B液。
（5）制作琼脂糖凝胶：吸取AB混合液3ml加入至培养皿（含上述处理过的玻片）中，室温冷却1小时，再放置于4冰箱中冷却1小时，即为琼脂糖凝胶。
（6）制作细胞及趋化用孔：在培养皿的琼脂糖凝胶上制作孔间距为2.4mm，孔径大小为3.5mm的小孔，使用负压吸引器吸除小孔内的凝胶室温静置30分钟，再次使用负压吸引器吸除小孔内的液体。两个小孔，左侧为细胞用孔，右侧为趋化物用孔。
（7）
观察细胞迁移极化分子分布的步骤如下：
（1） 加入细胞、趋化物：在右侧趋化物用孔中加入10ul的趋化物，浓度为0.1-1uM，左侧的细胞用孔中加入10ul的细胞悬液，细胞浓度为1*107个/ml。将培养皿置于孵育箱中培养2-3小时。趋化物可在琼脂糖凝胶下扩散形成浓度梯度，细胞可在趋化物的作用下发生定向迁移。
（2）固定：细胞迁移结束后，使用预冷的1%的多聚甲醛（5ml/皿）固定细胞10分钟，轻轻的去除琼脂糖凝胶，使用预冷的PBS洗涤细胞两次（5ml/皿）；
（3）通透：观察细胞内的分子改变，需要使用预冷的通透液冰上通透细胞5分钟，而观察细胞表面分子则不需要进行细胞通透；
（4）封闭：使用1%BSA封闭液（5ml/皿）封闭细胞30分钟，移液器吸除封闭液，无需洗涤；
（5）染色：培养皿中加入稀释好的一抗室温孵育1-4小时，PBS洗2遍，接着加入稀释好的二抗室温孵育1小时，PBS 洗涤2遍；使用DAPI复染细胞核，PBS洗涤2遍；
（6）封片观察：取出玻片，置于载玻片上，封片并使用激光共聚焦观察迁移极化细胞分子分布情况。
下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明。
实施例1：比较同一种细胞迁移极化过程中细胞表面F-actin分布的影响，具体为中性粒细胞迁移前后F-actin分子分布的影响。
1.2 主要仪器设备
1.3 琼脂糖凝胶的制备
（1）玻璃组织培养片的准备：利用100%甲醇清洗玻片并晾干，将干燥后的玻片放置于培养皿中，加入10%的胎牛血清（FBS）并于室温静置30分钟；去除FBS，使用PBS洗涤两遍。
（2）配置A液：在50ml离心管内依次加入RPMI1640培养液18ml、胎牛血清2ml、10*HBSS（含钙镁）2ml、无菌双蒸水8ml，充分混匀，置于68水浴箱中，水浴35分钟。
（3）配置B液：50ml离心管称取0.48g低熔点超纯去热源琼脂糖，加入10ml无菌双蒸水，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀。
（4）配置A, B混合液：使用微波炉加热至B液沸腾，将A液移至B液中，充分混匀A、B液。
（5）制作琼脂糖凝胶：吸取AB混合液3ml加入至培养皿（含上述处理过的玻片）中，室温冷却1小时，再放置于4冰箱中冷却1小时，即为琼脂糖凝胶。
（6）制作细胞及趋化用孔：在培养皿的琼脂糖凝胶上制作孔间距为2.4mm，孔径大小为3.5mm的小孔，使用负压吸引器吸除小孔内的凝胶室温静置30分钟，再次使用负压吸引器吸除小孔内的液体。两个小孔，左侧为细胞用孔，右侧为趋化物用孔。
1.4中性粒细胞的提取
（1）枸橼酸钠抗凝管采集健康成人外周静脉血4ml
（2）在采血管中加入等量的3%右旋糖酐，混匀并于室温静置20分钟，用于红细胞的沉降
（3）收集上清400g 10离心10分钟，弃上清，使用3ml1*HBSS（无钙镁）重悬细胞
（4）将重悬的细胞悬液轻轻加入置于3mlFicoll上方，400g 20离心35分钟
（5）弃上清，收集离心管底端细胞并使用红细胞裂解液裂解红细胞，400g 10离心7分钟即可得到中性粒细胞。
1.5 趋化物的配置
趋化物（FMLP）的配置按照使用说明书进行，并使用RPMI 1640培养液稀释至FMLP0.1uM用于后续实验。
1.6 细胞和趋化物加入及细胞迁移培养左侧细胞孔中加入细胞，右侧趋化物孔中加入趋化物（FMLP），置于孵育箱中培养2小时。
1.7 观察细胞迁移极化分子分布情况
（1）固定：细胞迁移结束后，使用预冷的1%的多聚甲醛（5ml/皿）固定细胞10分钟，轻轻的去除琼脂糖凝胶，使用预冷的PBS洗涤细胞两次（5ml/皿）；
（2）通透：使用预冷的通透液冰上通透细胞5分钟；
（3）封闭：使用1%BSA封闭液（5ml/皿）封闭细胞30分钟，移液器吸除封闭液，无需洗涤；
（4）染色：培养皿中加入稀释好的一抗室温孵育1-4小时，PBS洗2遍，接着加入稀释好的二抗室温孵育1小时，PBS 洗涤2遍；使用DAPI复染细胞核，PBS洗涤2遍；
（5）封片观察：取出玻片，置于载玻片上，封片并使用激光共聚焦观察迁移极化细胞分子分布情况。
1.8 实验结果
如图3所示，中性粒细迁移极化分子分布：中性粒细胞未极化状态时，细胞呈圆形，细胞F-actin分子均匀分布于细胞膜及胞内；而中性粒细胞极化状态时，细胞伸出伪足，细胞F-actin分子分布趋于细胞一端。结果提示，中性粒细胞在迁移过程中细胞形态发生极性化改变，并且相关分子的分布在细胞迁移极化过程中也发生了相应的改变。
综上所述，本发明利用琼脂糖建立细胞迁移趋化平台，并在此基础上观察细胞迁移极化过程中相关分子的分布改变，以便为研究细胞在不同干预情况下对迁移趋化过程相关分子分布的影响。
以上仅为本发明的相关实施例之一，并不用于限于本发明。
Claims (5)
1.一种观察细胞迁移极化过程中分子分布的方法，其特征在于：
所述观察细胞迁移极化过程中分子分布的装置，包括：
在圆形培养皿2中装有3ml琼脂糖1，在琼脂糖中有两个圆孔3，4，即为细胞用孔和趋化物用孔，在连接圆孔3，4之间的区域为观察细胞迁移的区域5；
所述的观察细胞迁移极化过程中分子分布装置的制备方法，包括：
（1）玻璃组织培养片的准备：利用100%甲醇清洗玻片并晾干，将干燥后的玻片放置于培养皿中，加入10%的胎牛血清FBS并于室温静置30分钟；去除FBS，使用PBS洗涤两遍；
（2）配置A液：在50ml离心管内依次加入RPMI1640培养液18ml、胎牛血清2ml、含钙镁的10*HBSS2ml、无菌双蒸水8ml，充分混匀，置于68℃水浴箱中，水浴35分钟；
（3）配置B液：50ml离心管称取0.48g低熔点超纯去热源琼脂糖，加入10ml无菌双蒸水，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀；
（4）配置A, B混合液：使用微波炉加热至B液沸腾，将A液移至B液中，充分混匀A、B液；
（5）制作琼脂糖凝胶：吸取AB混合液3ml加入至含步骤（1）所述玻片的培养皿中，室温冷却1小时，再放置于4冰箱中冷却1小时，即为琼脂糖凝胶；
（6）制作细胞及趋化用孔：在培养皿的琼脂糖凝胶上制作孔间距为2.4mm，孔径大小为3.5mm的小孔，使用负压吸引器吸除小孔内的凝胶室温静置30分钟，再次使用负压吸引器吸除小孔内的液体；两个小孔，左侧为细胞用孔，右侧为趋化物用孔；
所述观察方法包括：
（1）向上述制备的观察细胞迁移极化过程中分子分布的装置中分别加入细胞、趋化物：在右侧趋化物用孔中加入10ul的趋化物，浓度为0.1-1uM，左侧的细胞用孔中加入10ul的细胞悬液，细胞浓度为1*107个/ml；将培养皿置于孵育箱中培养2-3小时；趋化物可在琼脂糖凝胶下扩散形成浓度梯度，细胞可在趋化物的作用下发生定向迁移；
（2）固定：细胞迁移结束后，使用添加量为5ml/皿的预冷的1%的多聚甲醛固定细胞10分钟，轻轻的去除琼脂糖凝胶，使用5ml/皿的预冷的PBS洗涤细胞两次；
（3）通透：观察细胞内的分子改变，需要使用预冷的通透液冰上通透细胞5分钟，而观察细胞表面分子则不需要进行细胞通透；
（4）封闭：使用5ml/皿的1%BSA封闭液封闭细胞30分钟，移液器吸除封闭液，无需洗涤；
（5）染色：培养皿中加入稀释好的一抗室温孵育1-4小时，PBS洗2遍，接着加入稀释好的二抗室温孵育1小时，PBS 洗涤2遍；使用DAPI复染细胞核，PBS洗涤2遍；
（6）封片观察：取出玻片，置于载玻片上，封片并使用激光共聚焦观察迁移极化细胞分子分布情况。
2.根据权利要求1所述的一种观察细胞迁移极化过程中分子分布的方法，其特征在于：所述细胞选自中性粒细胞，巨噬细胞，单核细胞，淋巴细胞，或内皮细胞。
3.根据权利要求1所述的一种观察细胞迁移极化过程中分子分布的方法，其特征在于：所述趋化物选自补体类趋化物、CC类趋化物、CXC类趋化物、CX3C类趋化物或甲酰化肽类趋化物。
4.根据权利要求3所述的一种观察细胞迁移极化过程中分子分布的方法，所述甲酰化肽类趋化物为FMLP。
5.根据权利要求1所述的一种观察细胞迁移极化过程中分子分布的方法，其特征在于：所述细胞用孔、趋化物用孔为直径为3.5mm、深为3.2mm的圆孔，圆孔间距离为2.4mm。
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