CN108165491A - 一种动态观察细胞迁移的装置及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种可以动态观察细胞迁移运动的装置及其方法，通过凝胶样琼脂糖形成稳定的趋化物浓度梯度，并在活细胞工作站中动态观察细胞的迁移功能，CellSense软件实时测量细胞的迁移距离(Migration distence)、迁移速度(Migration speed)、迁移数量(Migration number)、迁移轨迹(Migration track)、迁移极性化(Migration polarization)等指标，以实现动态评价细胞迁移的多项迁移功能指标。

Description

一种动态观察细胞迁移的装置及其方法
技术领域：
本发明属于一种细胞实验用装置及其方法，特别是一种动态观察细胞迁移的装置及其方法。
背景技术
细胞的迁移是在多种理化因素的共同作用下的动态复杂过程，在感染、肿瘤、自身免疫性疾病等病理环境中均发挥了至关重要的重要作用。传统方法如划痕实验、Boyden小室/Transwell小室已在细胞迁移生物学行为的研究中取得了显著成果，然而，这两种方法也存在明显缺陷：1)、划痕实验中不能使用细胞特异性的趋化物，细胞的迁移多为随机运动所致，不具有方向性；2)、Boyden小室/Transwell小室虽使用了趋化物，但细胞的迁移只需要从上至下单一方向穿过一层厚10μm孔径3-8μm的聚酯膜，属1D的细胞迁移模型，且可能受操作者熟练程度、聚酯膜质量等因素影响，研究结果不够稳定，并且对迁移结果的观察需要在趋化实验结束之后借助荧光染色、同位素标记等手段进行定量分析，其过程中可能丢失部分细胞，造成结果难以重复；3)这两种方法均不能对细胞的迁移进行动态观察，不能动态评价细胞迁移时迁移距离(Migrationdistence)、迁移速度
(Migrationspeed)、迁移数量(Migrationnumber)、迁移轨迹(Migrationtrack)、迁移极性化(Migrationpolarization)等迁移功能相关指标，导致其运用范围较为局限。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，研究并设计一种可以动态观察细胞迁移运动的装置及其方法，以实现动态评价细胞迁移的多项迁移功能指标。
本发明的一个目的是提供一种动态观察细胞迁移的装置，如图1至图2所示，其特征是由装有凝胶状琼脂糖1的圆形培养皿2，培养皿中凝胶状琼脂糖围成的细胞用孔3，培养皿中凝胶状琼脂糖围成的且与细胞用孔间隔距离的趋化物用孔4，培养皿中连通细胞孔与趋化物用孔的凝胶状琼脂糖下细胞迁移观察区域5。
所述趋化物，是指一类能诱导细胞从低浓度化学吸引物区域迁移至高浓度化学吸引物区域的物质，可选用的趋化物包括但不限于甲酰化肽类趋化物(如fMLP)、补体类趋化物(如C5a)、CC类趋化物(如CCL10)、CXC类趋化物(如CXCL1)、CX3C类趋化物(如CX3CL1)等。
所述细胞，包括但不限于肿瘤细胞、血管内皮细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等。
所述细胞用孔、趋化物用孔直径均为3.5mm、深度均为3.2mm、间隔距离为2.4mm。
趋化物孔内的趋化物在凝胶状琼脂糖下缓慢向四周弥散，与细胞孔之间形成稳定的趋化物浓度差，孔内的细胞识别趋化物浓度差后发生定向趋化，在凝胶状琼脂糖下发生迁移，向趋化物孔方向趋化，细胞孔与趋化物孔之间的区域即为细胞迁移观察区域，可采用倒置显微镜观察细胞的趋化运动。
本发明的另一个目的提供一种动态观察细胞迁移装置的制备方法，其特征在于：
(1)配置A液：在50mL离心管内依次加入18mLRPMI 1640培养液、2mL澳洲胎牛血清、2mL 10×含钙镁HBSS、8mL滤菌双蒸水，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀液体。
(2)配置B液：在50mL离心管内依次加入10mL滤菌双蒸水、0.48g低熔点超纯去热源琼脂糖，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀液体。
(3)配置A、B混合液：将A液放入68℃水浴箱中，水浴35分钟，将B液用微波炉加热至沸腾。使用移液器将A液吸至B液离心管内，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，使A、B液充分混匀。
(4)制作凝脂状琼脂糖：移液器吸取A、B混合液3mL至培养皿中，室温下冷却1小时，再放入4℃冰箱冷却1小时，即可形成凝脂状琼脂糖。
(5)制作细胞用孔、趋化物用孔：培养皿中的凝脂状琼脂糖上分别制作直径为3.5mm、孔间距为2.4mm的两个小孔，负压吸引器吸除孔内的凝胶状琼脂糖后室温静置30分钟，再次用负压吸引器吸除孔内析出的液体，左侧小孔即为细胞用孔，右侧小孔即为趋化物用孔。
本发明的又一个目的是提供一种动态观察细胞迁移的方法，其特征在于：
(1)向本发明前述定义的动态观察细胞迁移装置中分别加入细胞、趋化物：左侧细胞用孔内小心加入10μL细胞悬液，细胞总量105个，右侧趋化物用孔内小心加入10μL趋化物，浓度为0.1-1μmol/L。趋化物在凝胶状琼脂糖下扩散并能形成稳定的浓度梯度，距趋化物用孔越近趋化物浓度越高，细胞用孔内的细胞则可感受到外界趋化物的浓度变化，并发生定向迁移。
(2)设置活细胞工作站细胞相关参数：打开活细胞工作站细胞培养装置，温度设置为37.2℃，二氧化碳浓度设置为5％，湿度95％，平衡30分钟。根据不同细胞种类设置拍摄参数，如快速迁移细胞(如中性粒细胞)设置拍摄总时长为1小时，拍摄间隔为5秒；慢速迁移细胞(如血管内皮细胞)设置拍摄总时长为10小时，摄间隔为50秒。
(3)动态观察细胞迁移：将加入细胞、趋化物的观察细胞迁移装置放入活细胞工作站中的培养室内，调整显微镜物镜至观察区域中迁移的细胞，CellSense软件中观察并记录细胞的动态迁移过程，软件实时动态检测细胞的迁移距离(Migration distence)、迁移速度(Migration speed)、迁移数量(Migration number)、迁移轨迹(Migration track)、迁移极性化(Migration polarization)等指标，用以对比不同刺激及干预情况下细胞迁移功能的变化。
本发明具有如下有益效果：
(1)传统的划痕实验观察的细胞迁移多为随机运动所致，与之相比，本发明中细胞是在趋化物引导下产生的具有有方向性的运动，可用于精确评价不同趋化物对相同细胞的趋化作用以及相同趋化物对不同细胞的趋化作用。
(2)Boyden小室/Transwell小室受操作者熟练程度、聚酯膜质量等因素影响，并且对迁移结果的观察需要在趋化实验结束之后借助荧光染色、同位素标记等手段进行定量分析，其过程中可能丢失部分细胞，造成结果难以重复。与之相比，本发明对细胞迁移进行实时观察，不需要荧光染色、同位素标记等二次操作，实验的可重复性强，多次实验时数据稳定可控。
(3)划痕实验及Boyden小室/Transwell小室均不能对细胞的迁移进行动态观察，与之相比，本发明可对细胞的迁移过程进行动态观察，并且可动态评价细胞迁移时迁移距离(Migration distence)、迁移速度(Migration speed)、迁移数量(Migration number)、迁移轨迹(Migration track)、迁移极性化(Migration polarization)等迁移功能相关指标，对细胞迁移功能的评估更加全面。
附图说明
图1为本发明动态观察细胞迁移装置示意图。
图2为本发明动态观察细胞迁移的装置剖面结构示意图。
图3为中性粒细胞在不同趋化物作用下对其迁移距离、迁移速度、迁移数量的影响。
图4为细菌内毒素对细胞迁移轨迹、迁移极性化的影响。
具体实施方式：
为了详细说明本发明的技术手段、实施方式、解决的技术问题及获得什么样的功效，下面结合附图对本发明涉及的动态观察细胞迁移的装置进一步说明。
如图1至图2所示，一种动态观察细胞迁移的装置，其特征是由装有凝胶状琼脂糖1的圆形培养皿2，培养皿中凝胶状琼脂糖围成的细胞用孔3，培养皿中凝胶状琼脂糖围成的且与细胞用孔间隔距离的趋化物用孔4，培养皿中连通细胞孔与趋化物用孔的凝胶状琼脂糖下细胞迁移观察区域5。
制作图1及图2所示的动态观察细胞迁移装置过程的步骤如下：
(1)配置A液：在50mL离心管内依次加入18mLRPMI 1640培养液、2mL澳洲胎牛血清、2mL 10×含钙镁HBSS、8mL滤菌双蒸水，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀液体。
(2)配置B液：在50mL离心管内依次加入10mL滤菌双蒸水、0.48g低熔点超纯去热源琼脂糖，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀液体。
(3)配置A、B混合液：将A液放入68℃水浴箱中，水浴35分钟，将B液用微波炉加热至沸腾。使用移液器将A液吸至B液离心管内，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，使A、B液充分混匀。
(4)制作凝脂状琼脂糖：移液器吸取A、B混合液3mL至培养皿中，室温下冷却1小时，再放入4℃冰箱冷却1小时，即可形成凝脂状琼脂糖。
(5)制作细胞用孔、趋化物用孔：培养皿中的凝脂状琼脂糖上分别制作直径为3.5mm、孔间距为2.4mm的两个小孔，负压吸引器吸除孔内的凝胶状琼脂糖后室温静置30分钟，再次用负压吸引器吸除孔内析出的液体，左侧小孔即为细胞用孔，右侧小孔即为趋化物用孔。
(6)加入细胞、趋化物：左侧细胞用孔内小心加入10μL细胞悬液，细胞总量105个，右侧趋化物用孔内小心加入10μL趋化物，浓度为0.1-1μmol/L。趋化物在凝胶状琼脂糖下扩散并能形成稳定的浓度梯度，距趋化物用孔越近趋化物浓度越高，细胞用孔内的细胞则可感受到外界趋化物的浓度变化，并发生定向迁移。
(7)设置活细胞工作站细胞相关参数：打开活细胞工作站细胞培养装置，温度设置为37.2℃，二氧化碳浓度设置为5％，湿度95％，平衡30分钟。根据不同细胞种类设置拍摄参数，如快速迁移细胞(如中性粒细胞)设置拍摄总时长为1小时，拍摄间隔为5秒；慢速迁移细胞(如血管内皮细胞)设置拍摄总时长为10小时，摄间隔为50秒。
(8)动态观察细胞迁移：将加入细胞、趋化物的培养皿放入活细胞工作站中的培养室内，调整显微镜物镜至观察区域中迁移的细胞，CellSense软件中观察并记录细胞的动态迁移过程，软件实时动态检测细胞的迁移距离(Migration distence)、迁移速度(Migration speed)、迁移数量(Migration number)、迁移轨迹(Migration track)、迁移极性化(Migration polarization)等指标，用以对比不同刺激及干预情况下细胞迁移功能的变化。
下面通过本申请人以本发明实施得到的动态观察细胞迁移装置为实验装置进行的动态观察细胞迁移实验实例，进一步说明本发明的使用实况和显示有益效果。
实施例1：比较不同趋化物对同一种细胞的迁移距离、迁移速度、迁移数量的影响，具体为分别使用1μmol/L浓度的fMLP和1μmol/L浓度的IL-8对中性粒细胞迁移距离、迁移速度、迁移数量的影响。
1、材料与方法。
1.1、实验装置及材料(见下表)。
1.2、主要仪器设备(见下表)。
序号 仪器设备名称 制造厂商
1 洁净工作台 苏州英文净化科技，中国
2 移液器 Eppendorf，德国
3 涡旋振荡器 其林贝尔，中国
4 微波炉 美的，中国
5 活细胞工作站 Olympus，日本
1.3.1、凝胶状琼脂糖的制备
(1)配置A液：在50mL离心管内依次加入18mLRPMI 1640培养液、2mL澳洲胎牛血清、2mL 10×含钙镁HBSS、8mL滤菌双蒸水，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀液体。
(2)配置B液：在50mL离心管内依次加入10mL滤菌双蒸水、0.48g低熔点超纯去热源琼脂糖，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀液体。
(3)配置A、B混合液：将A液放入68℃水浴箱中，水浴35分钟，将B液用微波炉加热至沸腾。使用移液器将A液吸至B液离心管内，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，使A、B液充分混匀。
(4)制作凝脂状琼脂糖：移液器吸取A、B混合液3mL至培养皿中，室温下冷却1小时，再放入4℃冰箱冷却1小时，即可形成凝脂状琼脂糖。
(5)制作细胞用孔、趋化物用孔：培养皿中的凝脂状琼脂糖上分别制作直径为3.5mm、孔间距为2.4mm的两个小孔，负压吸引器吸除孔内的凝胶状琼脂糖后室温静置30分钟，再次用负压吸引器吸除孔内析出的液体，
左侧小孔即为细胞用孔，右侧小孔即为趋化物用孔。
1.3.2、中性粒细胞的提取
(1)采集健康成人志愿者静脉血6mL。
(2)静脉血与3％右旋糖酐1:1混匀，室温静置20分钟，使红细胞沉降。
(3)收集上层白细胞10℃400g离心7分钟，弃上清，3mL 1×无钙镁HBSS重悬细胞。
(4)取3mLFicoll加至细胞悬液下方，可见两种液体之间呈一清晰的分界线。
(5)20℃400g离心35分钟后弃上清，红细胞裂解液裂解红细胞后即可得高纯度中性粒细胞。
1.3.3、趋化物的配置
趋化物fMLP、IL-8按照说明书溶解配置母液，并用RPMI 1640稀释成1μmol/L的浓度用于实验。
1.3.4、细胞和趋化物的加入及动态观察。
(1)该部分实验分为3组，分别为对照组、fMLP组、IL-8组，分别在右侧趋化物用孔内加入10μL RPMI 1640、fMLP(1μmol/L)、IL-8(1μmol/L)，左侧细胞用孔内小心加入10μL中性粒细胞悬液。
(2)设置活细胞工作站细胞相关参数：打开活细胞工作站细胞培养装置，温度设置为37.2℃，二氧化碳浓度设置为5％，湿度95％，平衡30分钟。设置拍摄总时长为1小时，拍摄间隔为5秒。
(3)动态观察并记录中性粒细胞迁移。
2、实验结果。
如图3所示，中性粒细胞迁移距离：对照组0μm，fMLP组1208μm，IL-8组942μm；中性粒细胞迁移速度：对照组0μm/min，fMLP组20.1μm/min，IL-8组15.7μm/min；中性粒细胞迁移数量：对照组0μm，fMLP组196个，IL-8组143个。fMLP和IL-8均可显著引起中性粒细胞趋化，fMLP比IL-8具有更强的趋化效应。
实施例2：比较细菌内毒素对同一种细胞迁移轨迹、迁移极性化的影响，具体为使用1μg/mL细菌内毒素刺激中性粒细胞后观察中性粒细胞迁移轨迹、迁移极性化。
1、材料与方法。
1.1、实验装置及材料(见下表)。
1.2、主要仪器设备(见下表)。
序号 仪器设备名称 制造厂商
1 洁净工作台 苏州英文净化科技，中国
2 移液器 Eppendorf，德国
3 涡旋振荡器 其林贝尔，中国
4 微波炉 美的，中国
5 活细胞工作站 Olympus，日本
1.3.1、凝胶状琼脂糖的制备
(1)配置A液：在50mL离心管内依次加入18mLRPMI 1640培养液、2mL澳洲胎牛血清、2mL 10×含钙镁HBSS、8mL滤菌双蒸水，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀液体。
(2)配置B液：在50mL离心管内依次加入10mL滤菌双蒸水、0.48g低熔点超纯去热源琼脂糖，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀液体。
(3)配置A、B混合液：将A液放入68℃水浴箱中，水浴35分钟，将B液用微波炉加热至沸腾。使用移液器将A液吸至B液离心管内，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，使A、B液充分混匀。
(4)制作凝脂状琼脂糖：移液器吸取A、B混合液3mL至培养皿中，室温下冷却1小时，再放入4℃冰箱冷却1小时，即可形成凝脂状琼脂糖。
(5)制作细胞用孔、趋化物用孔：培养皿中的凝脂状琼脂糖上分别制作直径为3.5mm、孔间距为2.4mm的两个小孔，负压吸引器吸除孔内的凝胶状琼脂糖后室温静置30分钟，再次用负压吸引器吸除孔内析出的液体，左侧小孔即为细胞用孔，右侧小孔即为趋化物用孔。
1.3.2、中性粒细胞的提取
(1)采集健康成人志愿者静脉血6mL。
(2)静脉血与3％右旋糖酐1:1混匀，室温静置20分钟，使红细胞沉降。
(3)收集上层白细胞10℃400g离心7分钟，弃上清，3mL 1×无钙镁HBSS重悬细胞。
(4)取3mLFicoll加至细胞悬液下方，可见两种液体之间呈一清晰的分界线。
(5)20℃400g离心35分钟后弃上清，红细胞裂解液裂解红细胞后即可得高纯度中性粒细胞。
1.3.3、细菌内毒素、趋化物fMLP的配置
细菌内毒素、趋化物fMLP按照说明书溶解配置母液，并用RPMI 1640分别稀释成100μg/mL、1μmol/L的浓度用于实验。
1.3.4、细胞和趋化物的加入及动态观察。
(1)该部分实验分为2组，分别为fMLP组、fMLP+细菌内毒素组，在右侧趋化物用孔内加入fMLP(1μmol/L)，fMLP组左侧细胞用孔内小心加入中性粒细胞悬液，fMLP+细菌内毒素组加入终浓度1μg/mL细菌内毒素刺激的中性粒细胞。
(2)设置活细胞工作站细胞相关参数：打开活细胞工作站细胞培养装置，温度设置为37.2℃，二氧化碳浓度设置为5％，湿度95％，平衡30分钟。设置拍摄总时长为1小时，拍摄间隔为5秒。
(3)动态观察并记录中性粒细胞迁移。
2、实验结果。
如图4所示，中性粒细胞迁移轨迹：迁移轨迹图显示fMLP组中性粒细胞迁移明显，而fMLP+细菌内毒素组中性粒细胞迁移受到显著抑制；中性粒细胞迁移极性化：fMLP组中性粒细胞伸出伪足形成迁移极性化结构，fMLP+细菌内毒素组中性粒细胞迁移极性化受损。结果提示fMLP可引起中性粒细胞趋化并且使中性粒细胞形成极性化结构，细菌内毒素抑制了中性粒细胞趋化，其机制与中性粒细胞极性化受损有关。
综上所述，本发明通过凝胶样琼脂糖形成稳定的趋化物浓度梯度，并在活细胞工作站中动态观察细胞的迁移功能，CellSense软件实时测量细胞的迁移距离(Migrationdistence)、迁移速度(Migration speed)、迁移数量(Migration number)、迁移轨迹(Migration track)、迁移极性化(Migration polarization)等指标，用以评价不同环境中细胞迁移功能的变化。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种动态观察细胞迁移装置，其特征在于：由装有所述凝胶状琼脂糖(1)的圆形培养皿(2)，培养皿中凝胶状琼脂糖围成的细胞用孔(3)，培养皿中凝胶状琼脂糖围成的且与细胞用孔间隔距离的趋化物用孔(4)，培养皿中连通细胞孔与趋化物用孔的凝胶状琼脂糖下细胞迁移观察区域(5)，趋化物孔(4)内的趋化物在凝胶状琼脂糖下缓慢向四周弥散，在细胞迁移观察区域(5)中形成稳定的趋化物浓度差，细胞用孔(3)内的细胞识别趋化物浓度差后发生定向趋化，在凝胶状琼脂糖下发生迁移，向趋化物孔方向趋化，所述培养皿系细胞培养级别，底部为透光材质，采用倒置显微镜观察细胞的迁移。
2.根据权利要求1所述的动态观察细胞迁移装置，其特征在于，所述细胞用孔与趋化物用孔直径均为3.5mm，深度均为3.2mm，间隔距离为2.4mm。
3.一种如权利要求1至2任一项所述的动态观察细胞迁移装置的制备方法，其特征在于：
(1)配置A液：在50mL离心管内依次加入18mL RPMI 1640培养液、2mL澳洲胎牛血清、2mL10×含钙镁HBSS、8mL滤菌双蒸水，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀液体；
(2)配置B液：在50mL离心管内依次加入10mL滤菌双蒸水、0.48g低熔点超纯去热源琼脂糖，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀液体；
(3)配置A、B混合液：将A液放入68℃水浴箱中，水浴35分钟，将B液用微波炉加热至沸腾；使用移液器将A液吸至B液离心管内，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，使A、B液充分混匀；
(4)制作凝脂状琼脂糖：移液器吸取A、B混合液3mL至培养皿2中，室温下冷却1小时，再放入4℃冰箱冷却1小时，即可形成凝脂状琼脂糖；
(5)制作细胞用孔、趋化物用孔：培养皿中的凝脂状琼脂糖上分别制作直径均为3.5mm、深度均为3.2mm、孔间距为2.4mm的两个小孔，负压吸引器吸除孔内的凝胶状琼脂糖后室温静置30分钟，再次用负压吸引器吸除孔内析出的液体，左侧小孔即为细胞用孔(3)，右侧小孔即为趋化物用孔(4)。
4.一种动态观察细胞迁移的方法，其特征在于：
(1)向权利要求1至3任一项所述的动态观察细胞迁移装置中分别加入细胞、趋化物：细胞用孔内小心加入10μL细胞悬液，细胞总量105个，趋化物用孔内小心加入10μL趋化物，浓度为0.1-1μmol/L；趋化物在凝胶状琼脂糖下扩散并能形成稳定的浓度梯度，距趋化物用孔越近趋化物浓度越高，细胞用孔内的细胞则可感受到外界趋化物的浓度变化，并发生定向迁移；
(2)设置活细胞工作站细胞相关参数：打开活细胞工作站细胞培养装置，温度设置为37.2℃，二氧化碳浓度设置为5％，湿度95％，平衡30分钟，根据不同细胞种类设置拍摄参数；
(3)动态观察细胞迁移：将加入细胞、趋化物的观察细胞迁移装置放入活细胞工作站中的培养室内，调整显微镜物镜至观察区域中迁移的细胞，CellSense软件中观察并记录细胞的动态迁移过程。
5.根据权利要求4所述的一种动态观察细胞迁移的方法，其特征在于：所述步骤(2)中拍摄参数，快速迁移细胞设置拍摄总时长为1小时，拍摄间隔为5秒；慢速迁移细胞设置拍摄总时长为10小时，摄间隔为50秒。
6.根据权利要求5所述的一种动态观察细胞迁移的方法，其特征在于：快速迁移细胞为中性粒细胞，慢速迁移细胞为血管内皮细胞。
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