CN115029244A - 一种循环肿瘤细胞分选及单细胞水平多维度异质性分析的微流控芯片及应用 - Google Patents

一种循环肿瘤细胞分选及单细胞水平多维度异质性分析的微流控芯片及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及了一种循环肿瘤细胞分选及单细胞水平多维度异质性分析的微流控芯片及应用，属于微流控芯片技术领域。具体涉及基于螺旋结构和单细胞阵列结构相结合的级联式微流控芯片系统。所述芯片依次包含两级结构：一级螺旋结构和二级单细胞阵列结构。一级结构用于依据细胞大小从血液中快速去除大量血细胞，二级结构用于以单细胞形式捕获循环肿瘤细胞，并进行基于单细胞水平的循环肿瘤细胞异质性分析。以此芯片系统实现循环肿瘤细胞以单细胞的形式被高效捕获，进一步原位进行单细胞水平循环肿瘤细胞分子和功能异质性分析。

Description

一种循环肿瘤细胞分选及单细胞水平多维度异质性分析的微 流控芯片及应用
技术领域
本发明属于微流控芯片技术领域，具体涉及基于螺旋结构和单细胞阵列结构相结合的级联式微流控芯片系统，可将循环肿瘤细胞以单细胞的形式高效捕获，并可以实现原位分子和功能异质性分析。
背景技术
转移是恶性肿瘤的基本生物学特征之一，也是导致肿瘤患者死亡的主要原因，因此需要探索新型诊断方法，为预测转移、评价治疗和预后提供实时、准确、有效的信息。循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell, CTC）是指从肿瘤原发灶或转移灶脱落后进入外周血循环的肿瘤细胞，可以随着血液循环侵入其他组织并增殖形成新的肿瘤，在肿瘤复发和转移的过程中起到重要的作用，也在肿瘤患者的预后评估、治疗方案选择和疗效监测等方面具有重要的临床应用价值。
然而值得注意是，只有极少数具有高转移潜能的CTC可以形成转移灶，因此如何有效地富集并分析此类CTC是预测肿瘤转移的关键问题。同时，CTC存在异质性，而CTC的哪些特性决定转移活性尚未可知，因此发现和明确这些特征对于准确预测肿瘤转移具有重要意义。另外，基于CTC的异质性特点，有必要从单细胞水平研究其多维度异质性。目前，对CTC进行单细胞水平异质性分析主要存在两个技术关键点：一是高速度、高回收率、高纯度的富集CTC，二是从分子表型、功能表型、形态等多维度进行CTC的异质性分析。此外，实时记录CTC的动态变化将为CTC的异质性分析提供完整全面的信息，但实时动态分析单细胞水平CTC的行为变化，以及进行单细胞水平CTC多维度异质性分析的工作仍少有报道。
微流控芯片具有操作简单、通量高、成本低、易于自动化、微型化和集成化等优点，被公认为是富集、分析CTC的有效平台。然而，基于单细胞水平对CTC进行富集和多维度异质性分析仍具挑战。因此，建立微流控研究平台，高效实现CTC富集及单细胞水平CTC的多维度异质性，探究CTC的异质性特征与肿瘤转移的相关性将对肿瘤转移研究具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是创建基于螺旋结构和单细胞阵列结构相结合的级联式微流控芯片系统，实现CTC以单细胞的形式被高效捕获，进一步满足原位单细胞水平CTC多维度异质性分析，同时提供该微流控芯片的应用。
本发明要解决的技术问题：CTC的单细胞水平异质性分析主要存在两个技术关键点，一是高速度、高回收率、高纯度的富集CTC，二是从分子表型、功能表型、形态等多维度进行CTC的异质性分析。此外，实时记录CTC的动态变化将为CTC的异质性分析提供完整全面的信息，但实时动态分析单细胞水平CTC的行为变化，以及进行单细胞水平CTC多维度异质性分析的工作仍未见报道。该级联式微流控芯片系统通过级联用于从血液中快速富集CTC的一级螺旋结构和捕获单个CTC的二级单细胞阵列结构，实现CTC以单细胞形式被高效捕获，同时实现原位单细胞水平多维度异质性分析。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
本发明提供了一种循环肿瘤细胞分选及单细胞水平多维度异质性分析的微流控芯片系统，其特征在于，所述芯片系统（图1）是基于螺旋分选结构和单细胞阵列结构相结合的级联微流控芯片系统；所述第一级螺旋分选结构包括：一个注液孔（1）、一个具有周期性扩张结构的螺旋通道（2）、两个血细胞出口（3）和一个肿瘤细胞出口（4）组成；第二级单细胞阵列结构包括：三角形扩张结构（5）、由带有微缝的马蹄形结构排列组成的单细胞阵列（6）和开放区域（7）。
进一步地，所述第一级螺旋分选结构用于快速去除大量血细胞；所述第二级单细胞阵列结构用于以单细胞形式高纯度捕获CTC；将上述两级结构级联后能够提高CTC分选性能。
进一步地，所述第一级螺旋分选结构中周期性扩张结构的螺旋通道结构中扩张结构的宽为100~500μm，长为500~2000μm，非扩张结构的宽为50~250μm，两个扩张结构的间距为250~1000μm，上一道螺旋通道中扩张结构与下一道螺旋通道间距为200~500μm。
进一步地，所述单细胞阵列结构中三角形扩张结构（5）使流体从肿瘤细胞出口（4）流出后流速显著降低，进而保证肿瘤细胞在单细胞阵列（6）中被捕获。
进一步地，所述单细胞阵列结构包括横向10~150列，纵向10~150行带有微缝的马蹄形单细胞微缝结构；每个马蹄形微缝结构由一对对称的边界组成，顶端有20~40μm开口保证肿瘤细胞以单细胞形式进入该结构，底部5~12μm微缝保证单个肿瘤被捕获于该结构，并提供细胞迁移和侵袭的通道，阵列结构横向和纵向空隙为20~60μm保证液流在芯片中稳定通过。
进一步地，所述单细胞阵列结构中单细胞阵列（6）和开放区域（7）连通；当芯片置于含有细胞培养基的细胞培养皿中，芯片外的液体可通过开放区域（7）扩散进入芯片内部；当芯片内外施加不同浓度趋化因子或营养条件时，可形成由芯片外至芯片内的浓度梯度。
进一步地，所述单细胞阵列结构中肿瘤细胞以单细胞形式被捕获于单细胞阵列（6）中，可以原位进行肿瘤细胞分子表型和功能表型的异质性分析，以及单细胞原位动态变化的实时监测。
进一步地，所述芯片由基底层和流道层互相键合封装，所述流道层的材料为聚二甲基硅氧烷、环烯烃类共聚物、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯，所述基底层的材料为二氧化硅、硅片、聚二甲基硅氧烷、硅化玻璃、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯。
本发明还提供了一种循环肿瘤细胞分选及单细胞水平多维度异质性分析的微流控芯片系统的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
a. 取肿瘤患者外周血，PBS进行稀释，将外周血稀释液从注液孔（1）泵入芯片，肿瘤细胞流经螺旋通道（2）、肿瘤细胞出口（4）、三角形扩张结构（5）进入单细胞阵列（6）被以单细胞形式捕获，血细胞流经螺旋通道（2）从血细胞出口（3）和开放区域（7）流出；待血液样品全部泵入芯片后，通入PBS至芯片内无血细胞残留。CTC分选过程示意图如图2所示；
b. 对捕获的CTC进行相关标志物免疫荧光染色，确定CTC的捕获数量和分析单细胞水平CTC的分子表型异质性。CTC分子表型异质性分析示意图如图3A所示；
c. 向芯片内加入含有低浓度FBS细胞培养基稀释的基质胶，将芯片置于细胞培养皿中，并向培养皿中加入含有高浓度FBS细胞培养基，使芯片内部形成驱动CTC迁移、侵袭的血清浓度梯度，置于细胞培养箱中培养，并定时对芯片内同一位置细胞状态进行拍摄，记录细胞行为变化；另外，将培养皿置于活细胞动态监测系统中，对细胞进行持续拍摄，记录同一视野内不同肿瘤细胞的实时行为变化；以上步骤实现单细胞水平CTC的功能表型异质性分析。CTC功能表型异质性分析示意图如图3B所示。
进一步地，步骤b中所述相关标志物包括EpCAM、E-cadherin、CK8、CK18和CK19中的至少一种作为上皮细胞类型标志蛋白质，和/或选自N-cadherin、Vimentin、Fibronectin、ZEB1和Snail1中的至少一种作为间质细胞类型标志蛋白质，和白细胞标志物CD45。
与现有技术相比本发明的有益效果。
本发明提供了一种基于螺旋结构和单细胞阵列结构相结合的级联式微流控芯片系统，该级联式芯片系统可以从螺旋结构和单细胞阵列结构中取长补短，使芯片系统既可以基于螺旋结构实现高通量CTC分选，也基于单细胞阵列结构实现高纯度CTC分选，弥补单独使用螺旋结构分选纯度低和单细胞阵列结构分选通量低的缺点，进而实现肿瘤患者外周血中CTC的高效分选。
本发明创建的基于螺旋结构和单细胞阵列结构相结合的级联式微流控芯片，实现了CTC分选与单细胞分析的无缝衔接，提高了分析速度并减少了由于样品转移和人为操作带来的样品损失和分析误差。在CTC被捕获后，在芯片中可以原位进行单细胞水平多个维度异质性分析，包括分子表型异质性分析，增殖、侵袭、迁移、药物摄取等功能异质性分析，以及这些功能表型实时动态的监测。以上对肿瘤细胞多维度异质性的分析，将为评价CTC异质性与肿瘤转移的相关性提供更加丰富的信息。
附图说明
图1是本发明级联式微流控芯片的构成。
图2是级联式微流控芯片进行CTC分选及捕获的流程示意图。
图3是芯片中原位实现单细胞水平CTC的分子表型和功能表型异质性分析的示意图。
图4是实施例1级联式微流控芯片对血液中肿瘤细胞进行分选和捕获的结果图。
图5是实施例2级联式微流控芯片对血液中不同种类和不同数量肿瘤细胞进行分选的结果图和捕获效率分析。
图6是实施例3微流控芯片内SW620细胞分子表型异质性的结果图。
图7是实施例4微流控芯片内实时观察A549细胞功能异质性的结果图。
图8是实施例5级联式微流控芯片对肿瘤患者外周血中CTC的捕获及分子异质性分析结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中的操作方法均为本技术领域常规操作方法。
实验例1基于级联式微流控芯片对血液中肿瘤细胞进行分选和捕获。
用活细胞染料Cell Tracker荧光标记LoVo细胞，将细胞掺入到PBS稀释的兔血中，模拟肿瘤患者血液中的CTC，使用微量注射泵以200μL/min的速度将细胞悬液泵入芯片，观察血细胞和肿瘤细胞在螺旋结构出口分选情况（图4A），无荧光的血细胞与带有荧光的肿瘤细胞各自聚焦成束，血细胞主要从外侧出口流出，肿瘤细胞从中央出口流出进入下游结构。观察单细胞阵列可以看到带有荧光的肿瘤细胞以单细胞的形式被微缝单元捕获，而残留的少量血细胞在微缝单元及微缝中穿过而流出（图4B）。血液分选结束后，向芯片中通入PBS，可以使残留在芯片中的血细胞被去除掉（图4C）。上述结果表明，该级联式微流控芯片可以有效分选血液中的肿瘤细胞，并将肿瘤细胞以单细胞形式捕获于单细胞阵列结构中。
实施例2级联式微流控芯片对血液中不同数量和不同种类肿瘤细胞富集效率的评价。
分别将不同数量经活细胞染料Cell Tracker荧光标记的胃癌细胞SGC-7901以50个/mL、100个/mL、150个/mL掺入到1mL兔全血中，模拟临床患者外周血样品进行细胞分选。使用PBS对上述血液进行5倍稀释，使用微量注射泵以300μL/min的速度将细胞悬液泵入芯片，使用倒置荧光显微镜拍照记录单细胞阵列处捕获胃癌细胞SGC-7901的情况，并记录每组实验中捕获的SGC-7901数目，按照捕获的肿瘤细胞数/注入肿瘤细胞总数×100％计算捕获效率。结果显示，被标记的肿瘤细胞可在单细胞阵列中被捕获（图5A），并具有满意的捕获效率（图5B）。
分别将胃癌细胞SGC-7901、肺癌细胞A549、肠癌细胞LoVo以100个细胞/mL掺入1mL兔全血中，模拟临床患者外周血样品进行细胞分选。使用PBS对上述血液进行5倍稀释，使用微量注射泵以300μL/min的速度将细胞悬液泵入芯片，使用倒置荧光显微镜拍照记录单细胞阵列处捕获的肿瘤细胞数目，按照捕获的肿瘤细胞数/注入肿瘤细胞总数×100％计算捕获效率。结果显示，不同细胞的捕获效率均达到85%以上（图5C）。
实施例3微流控芯片内SW620细胞分子表型异质性的分析。
将肠癌细胞SW620通过芯片系统捕获于单细胞阵列结构中，依据如下实验流程进行分子表型异质性的分析。首先，通入4%多聚甲醛室温固定细胞15min，PBS冲洗5min；通入400μL BSA封闭缓冲液，封闭细胞60min；向芯片中通入荧光标记的鼠抗人EpCAM抗体，37℃避光孵育40min，PBS冲洗5min，以此完成上皮细胞标志蛋白质EpCAM的染色，并将芯片置于倒置荧光显微镜下观察记录细胞表达EpCAM情况。然后，通入0.5% TritonX-100，通透细胞15min，PBS冲洗5min；向芯片中通入兔抗人Vimentin抗体，室温孵育2h，PBS冲洗5min；向芯片中通入荧光标记的山羊抗兔二抗，37℃避光孵育40min，PBS冲洗5min，以此完成间质细胞标志蛋白质Vimentin的染色。向芯片内通入DAPI稀释液，室温避光孵育5min，PBS冲洗5min。将芯片置于倒置荧光显微镜下观察记录细胞表达Vimentin情况。利用ImageJ图像分析软件分析芯片内单细胞的荧光强度，评价蛋白表达水平。结果显示，不同SW620细胞的分子表达呈现高度异质性（图6）。细胞1，4，6，7为EpCAM阳性；细胞2，3为Vimentin阳性；细胞5，8为EpCAM和Vimentin双阳性。经ImageJ数值分析结果也表明，不同SW620细胞的EpCAM和Vimentin分子表达存在显著异质性。
实施例4微流控芯片内实时观察A549细胞功能异质性。
将肺癌细胞A549通过芯片系统捕获于单细胞阵列中，使用含有10%FBS的细胞培养基对基质胶以1：9稀释比进行稀释，再将稀释液通入芯片，将芯片置于细胞培养皿中，并向培养皿中加入含有20%FBS的细胞培养基，细胞培养皿置于活细胞动态监测系统中，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，对细胞进行持续拍摄，记录同一视野下不同肿瘤细胞的实时行为变化，进而分析其功能异质性。连续29h的视频记录显示，不同的细胞在增殖、侵袭甚至细胞的相互作用行为上均表现为实时异质性。0时细胞位置截图见图7A，代表性的细胞实时行为截图见图7B。结果可见，图7B（a）和图7B（b）中的两个单细胞在持续29小时的连续观察中保持活性状态，但未发现明显的位置移动；图7B（c）中的单细胞在持续的观察中呈现迁移-分裂-分裂的行为变化；图7B（d）的两个细胞，细胞1保持活性状态而无位置移动，但细胞2呈现迁移-分裂-迁移的行为变化；图7B（e）中的两个细胞，细胞1保持活性状态而无位置移动，但细胞2呈现迁移（2h）-分裂（13h）-迁移（15h）-分裂（25h）的行为变化。值得注意的是，观察到原本处于第6行由细胞2分裂产生的细胞3迁移至第8行，并与所在位置的细胞产生了融合（21h-29h），并同时观察到细胞向外分泌物质的行为表现。以上结果表明，基于本芯片实时观察到了单个肿瘤细胞在多个功能表型上的异质性行为，包括增殖能力，迁移侵袭能力，细胞相互作用能力等等，所反映的多维度实时信息为准确评价CTC的肿瘤转移预测价值提供了重要基础。
实施例5级联式微流控芯片对肿瘤患者外周血中CTC的捕获。
采用级联式微流控芯片分离富集临床肿瘤患者外周血中的CTC。取1例肺癌患者的外周血1mL，以PBS对上述外周血进行5倍稀释，使用微量注射泵以300μL/min的速度将外周血泵入芯片，CTC以单细胞形式被捕获于单细胞阵列中，通入PBS至芯片内无血细胞残留。依据实施例3操作基本流程，对捕获的细胞进行EpCAM和CD45免疫荧光染色。其中，CD45+/DAPI+/EpCAM-判定为白细胞，CD45-/DAPI+判定为CTC。结果显示（图8A），从患者1外周血捕获到3个CTC，其中一个为EpCAM+，2个为EpCAM-，提示本发明可成功用于CTC的捕获且CTC的EpCAM表达具有高度异质性。
另外取1例肠癌患者外周血，并对捕获的细胞进行EpCAM和Vimentin的双荧光免疫染色，结果如图（图8B），患者2外周血捕获到2个CTC和1个由多个细胞构成的CTC簇，2个CTC单细胞均为EpCAM-/Vimentin+，CTC簇为EpCAM+/Vimentin+。上述结果提示，本系统可有效地从不同类型肿瘤患者的外周血中捕获CTC，并可在单细胞水平分析CTC的多种分子表型异质性，特别是在捕获CTC单细胞的同时，还可以富集到CTC簇，扩展了CTC分析的维度。

Claims (10)

1.一种循环肿瘤细胞分选及单细胞水平多维度异质性分析的微流控芯片系统，其特征在于，所述芯片系统是基于螺旋分选结构和单细胞阵列结构相结合的级联微流控芯片系统；所述第一级螺旋分选结构包括：一个注液孔（1）、一个具有周期性扩张结构的螺旋通道（2）、两个血细胞出口（3）和一个肿瘤细胞出口（4）组成；第二级单细胞阵列结构包括：三角形扩张结构（5）、由带有微缝的马蹄形结构排列组成的单细胞阵列（6）和开放区域（7）。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片系统，其特征在于，所述第一级螺旋分选结构用于快速去除大量血细胞；所述第二级单细胞阵列结构用于以单细胞形式高纯度捕获CTC；将上述两级结构级联后能够提高CTC分选性能。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片系统，其特征在于，所述第一级螺旋分选结构中周期性扩张结构的螺旋通道结构中扩张结构的宽为100~500μm，长为500~2000μm，非扩张结构的宽为50~250μm，两个扩张结构的间距为250~1000μm，上一道螺旋通道中扩张结构与下一道螺旋通道间距为200~500μm。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片系统，其特征在于，所述单细胞阵列结构中三角形扩张结构（5）使流体从肿瘤细胞出口（4）流出后流速显著降低，进而保证肿瘤细胞在单细胞阵列（6）中被捕获。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片系统，其特征在于，所述单细胞阵列结构包括横向10~150列，纵向10~150行带有微缝的马蹄形单细胞微缝结构；每个马蹄形微缝结构由一对对称的边界组成，顶端有20~40μm开口保证肿瘤细胞以单细胞形式进入该结构，底部5~12μm微缝保证单个肿瘤被捕获于该结构，并提供细胞迁移和侵袭的通道，阵列结构横向和纵向空隙为20~60μm保证液流在芯片中稳定通过。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片系统，其特征在于，所述单细胞阵列结构中单细胞阵列（6）和开放区域（7）连通；当芯片置于含有细胞培养基的细胞培养皿中，芯片外的液体可通过开放区域（7）扩散进入芯片内部；当芯片内外施加不同浓度趋化因子或营养条件时，可形成由芯片外至芯片内的浓度梯度。
7.根据权利要求1所述的微流控芯片系统，其特征在于，所述单细胞阵列结构中肿瘤细胞以单细胞形式被捕获于单细胞阵列（6）中，可以原位进行肿瘤细胞分子表型和功能表型的异质性分析，以及单细胞原位动态变化的实时监测。
8.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述芯片由基底层和流道层互相键合封装，所述流道层的材料为聚二甲基硅氧烷、环烯烃类共聚物、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯，所述基底层的材料为二氧化硅、硅片、聚二甲基硅氧烷或硅化玻璃。
9.一种循环肿瘤细胞分选及单细胞水平多维度异质性分析的微流控芯片系统的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
a. 取肿瘤患者外周血，PBS进行稀释，将外周血稀释液从注液孔（1）泵入芯片，肿瘤细胞流经螺旋通道（2）、肿瘤细胞出口（4）、三角形扩张结构（5）进入单细胞阵列（6）被以单细胞形式捕获，血细胞流经螺旋通道（2）从血细胞出口（3）和开放区域（7）流出；待血液样品全部泵入芯片后，通入PBS至芯片内无血细胞残留；
b. 对捕获的CTC进行相关标志物免疫荧光染色，确定CTC的捕获数量和分析单细胞水平CTC的分子表型异质性；
c. 向芯片内加入含有低浓度FBS细胞培养基稀释的基质胶，将芯片置于细胞培养皿中，并向培养皿中加入含有高浓度FBS细胞培养基，使芯片内部形成驱动CTC迁移、侵袭的血清浓度梯度，置于细胞培养箱中培养，并定时对芯片内同一位置细胞状态进行拍摄，记录细胞行为变化；另外，将培养皿置于活细胞动态监测系统中，对细胞进行持续拍摄，记录同一视野内不同肿瘤细胞的实时行为变化；以上步骤实现单细胞水平CTC的功能表型异质性分析。
10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，步骤b中所述相关标志物包括EpCAM、E-cadherin、CK8、CK18和CK19中的至少一种作为上皮细胞类型标志蛋白质，和/或选自N-cadherin、Vimentin、Fibronectin、ZEB1和Snail中的至少一种作为间质细胞类型标志蛋白质，和白细胞标志物CD45。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114540182A (zh) * 2022-04-14 2022-05-27 严一喆 一种基于单细胞水平检测循环肿瘤细胞分泌物的微流控系统及其使用方法
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