CN101263223A - 细胞迁移测定 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于制备三维跨内皮细胞迁移(TEM)测定的组合物和方法。这些组合物和方法特别适于高通量TEM测定，以及抑制或刺激TEM进程的介质的分析和鉴定。用于检测细胞迁移的组合物含有：含有胶原凝胶的固体层；接触所述固体层并含有第一细胞类型的第一细胞层；以及接种到所述第一细胞层上面的第二细胞类型。任选地，胶原凝胶中含有明胶。披露了一种96孔板形式，与高通量的细胞筛选仪结合能够进行高通量的TEM测定。

Description

细胞迁移测定

相关申请的交叉引用

本申请要求2005年9月16日提交的申请号为60/718,057的美国临时专利申请，以及2006年5月17日提交的申请号为60/747,430的美国临时专利申请的优先权，上述申请披露的内容全部通过援引加入本文。

发明领域

本发明一般涉及血球渗出测定方法。更具体地讲，本发明涉及用于跨内皮迁移测定的组合物，以及制备和使用这些组合物的方法。

发明背景

细胞通过血管内皮的迁移是像炎症、动脉硬化和肿瘤转移这些状况的病理生理学上的重要事件。这些年已经发展出了体外测量细胞迁移的方法。最常用的方法是使用人工屏障(膜)，通常需要对迁移的细胞进行人工计数。市场上已有的细胞迁移测定装置有：经典Boyden小室(Boyden chamber)、细胞培养插入(cell culture insert)(改良版Boyden小室)、FluoroBlock^TM(BD Biosciences)和Cell MotilityHitKit^TM(Cellomics)。这些装置的主要局限性有通量低，细胞人工计数，使用为了细胞穿越的生物非相关材料，以及分析得到的结果存在困难。

最近，致力于模仿迁移细胞的体内环境的多层构建物已经提出(参见公布号为WO 2003/027256和WO 2004/046337的国际申请)。然而，该系统制备复杂，并且不适合高通量筛选。

仍需要改良的、使用简单的跨内皮细胞迁移(Transendothelial CellMigration，TEM)测定系统，尤其是用于药物探寻业的高通量筛选。

发明内容

本发明的目的是提供用于跨内皮细胞迁移测定的组合物和方法。这些组合物和方法特别适于高通量TEM测定，以及抑制或刺激TEM进程的介质的分析。

本发明的一方面提供用于检测细胞迁移的组合物，该组合物含有：含有胶原凝胶的固体层；接触所述固体层并含有第一细胞类型的第一细胞层；以及接种到所述第一细胞层上的第二细胞类型。固体胶原凝胶层任选地含有明胶。这方面的一个具体实施方式提供了在96孔板形式中的组合物，具有人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)的汇合第一细胞层，中性粒细胞或者外周血单核细胞(PBMC)作为第二细胞类型。该实施方式的变化被提供在下面的详细说明和权利要求中。

本发明的另一方面提供了一种制备用于检测细胞迁移的物质组合物(composition of matter)的方法，该方法包括以下步骤：在容器内沉积和固化胶原凝胶以形成含有胶原凝胶的固体层；置第一类型细胞于所述固体层上并孵育所述第一细胞类型以形成同所述固体层接触的汇合细胞层；以及将第二细胞类型的细胞接种到所述第一细胞层上。提供了能够制备所述物质组合物的详细实施方式，包括在96孔板形式(96well plate format)内的所述复合物，其对于包括TEM在内的细胞迁移的高通量分析是理想的。在形成固体层前任选地将明胶溶液混入胶原凝胶中。

本发明的另一方面提供了一种检测包括TEM在内的细胞迁移的方法，包括以下步骤：孵育所述物质组合物；以及在所述组合物的所述固体层的第一位置检测迁移细胞。提供了该方法的一些实施方式，其采用96孔板形式中的组合物，适于利用自动化细胞分析仪进行自动化、高通量的细胞迁移分析。

本发明的又一方面提供了一种鉴别细胞迁移的介质(mediator)的方法，该方法包括：将细胞迁移的候选介质加入到所述的物质组合物中；孵育所述组合物；以及测定存在所述候选介质的情况下的细胞迁移，其中相对于缺少所述候选介质的组合物在应答上的差异鉴别了细胞迁移的介质。该方法的高通量实施为大量的细胞迁移/TEM介质的快速测定提供了一个平台，是制药业的重要技术(enabler)。

本发明的其它方面和优点将在下面的详细说明中体现出来。

附图简要说明

图1表示依照本发明实施方式的三维的跨内皮细胞迁移(TEM)测定的构建。在左侧是该系统侧视的示意说明。在右边表示了俯视的内皮细胞(EC)单层的图。

图2是表示胶原凝胶质量对中性粒细胞TEM的影响的图示。

图3是表示胶原凝胶质量对外周血单核细胞(PBMC)TEM的影响的图示。

图4表示胶原凝胶体积对中性粒细胞TEM的影响。

图5表示胶原凝胶体积对PBMC TEM的影响。

图6表示起始细胞密度对中性粒细胞TEM的影响。

图7表示中性粒细胞TEM的时间过程。定量测量了板底以上Z：120μm在0.5、1、1.5和2小时的时点上的迁移细胞。

图8表示PBMC TEM的时间过程。定量测量了板底以上Z：120μm在2、4、6和8小时的时点上的迁移细胞。

图9表示用IL-8预浸凝胶层时提高了中性粒细胞TEM。

图10表示1，10-phenathronoline(一种MMP-9抑制剂)抑制中性粒细胞TEM。

图11是贯通凝胶层的一叠21-Z切片的三维图像重建。

图12是利用阳性对照(IL-1β刺激)和阴性对照(未用IL-1β刺激)进行的中性粒细胞TEM的大规模研究。

具体实施方式

我们提供了用于细胞迁移测定的组合物和方法，包括跨内皮细胞迁移(TEM)和血球渗出测定。为了更接近地表示体内环境，已设计出了三维测定系统。该测定系统已经提供于能够自动化高通量筛选的96孔板形式中，因此满足了制药业中对基于细胞的功能分析的需要。我们的结果表明所述测定方法适用于例如炎症、动脉硬化和肿瘤转移这些病理生理状况的研究。它们完全适于高通量筛选测定。这些组合物和方法还提供了改良的检测生物学和细胞分析仪(例如IN CellAnalyzer 3000)的自动化特征之间在定量分析上的协同性。它们提供了用于研究抑制或刺激该进程的介质(例如细胞因子或药物)的独特方法。

文中所用的术语“跨内皮迁移”(TEM)是指迁移细胞从内皮细胞的上表面到基膜的运动，超出了对趋化因子(当这些因子在内皮细胞的基膜的浓度高于上表面时)应答的范畴。细胞因子在单个内皮细胞之间形成的接合部位之间迁移。通常，TEM发生在内皮细胞被激活时，例如被TNF、IL-1或者其它前炎性介质激活时。TEM也会内源性地发生，甚至在内皮细胞没有直接激活的情况下，由于白细胞黏附，TEM将会沿内皮细胞以较低的、强度更小的水平发生。因此，在体内，TEM发生在炎症位点；在体外，会穿过培养的内皮细胞，更优选地在内皮细胞激活后以及/或者创建了趋化梯度(chemotactic gradient)后发生。

文中所用的术语“血球渗出(Diapedesis)”是指白细胞透过血管内皮层进入间质液(IF)的运动。该进程受到趋化因子的驱动。血球渗出经常发生在一个区域受伤或被损坏且需要炎症反应时。

组合物

图1提供了依照本发明的实施方式的三维的跨内皮迁移(TEM)测定模型。左侧是该系统的示意说明。上部的绿点代表荧光标记的白细胞。褐色带代表汇合的内皮细胞。无底色区域代表厚约200μm的凝固的胶原凝胶。EC层下分散的绿点代表迁移的细胞。注意，明胶任选地包含在凝固的胶原凝胶中。注意，胶原凝胶层的厚度根据成像显微镜的对焦面而定。多数情况下，约50-500μm的胶原层为TEM测定提供合适的厚度。右侧为内皮细胞(EC)单层的照片。在该照片中，细胞核受到Hoechst染色(蓝色)。F-肌动蛋白由Alexa Fluor^TM488结合的鬼笔环肽(phalloidin)染色(绿色)。染红色的表明是一种蛋白，VE钙黏蛋白(VE-Cadherin)，其在细胞边界当有紧密的接合形成时进行表达。

我们的系统相对于已有技术系统的优点在于它简单而高效。它是可诱导的，并利用人类脐静脉内皮细胞和人类白细胞模拟了体内血球渗出。我们确定了中性粒细胞TEM在2小时内达到稳定状态并表现出受到MMP-9抑制剂的特异抑制。我们也断定该系统可用于在胶原凝胶中加入化学引诱剂分子的趋化性研究。

要注意图1中的3-D TEM模型图表示在单容器(vessel)中的构建(set up)。我们在实施例部分详细描述96孔板形式的开发。我们确定了胶原质量对中性粒细胞TEM的影响(图2)和对PBMC TEM(图3)的影响。我们证实在正常凝胶负荷条件(loading conditions)下并进行快速旋转，我们能够可靠地制出质量足够好的胶原凝胶层。我们也确定了对于标准96孔板形式中每个孔的胶原凝胶的工作体积(图4和5)。我们也测验了最佳的迁移细胞密度，得出的结论为300,000-500,000细胞/孔之间能够得到满意的测定结果(图6)。我们注意到胶原凝胶层中明胶的增加不影响系统的性能。明胶的使用能够延长凝固的胶原凝胶在室温下的贮藏时间。

96孔板形式中的TEM模型有几个优点。其一，它是可以在96孔板的单个孔中完成测定的更紧凑的系统。使用自动化细胞分析仪并用上合适的图像分析软件能够进行高通量的药物筛选测定。它也允许在空间上和时间上和以三维形式(共聚焦显微镜的Z-堆叠特征(Z-stacking feature))进行细胞运动的定量测量。测定系统的三层设置也避免了如塑胶多孔膜这类生物不相关材料的使用。

组合物的制备

我们提供用于制备实施例部分中的测定系统的详细材料和方法。简要的讲，胶原沉积在容器内并凝固形成固体层。或者作为选择，可以使用支持3D内皮生长和细胞迁移的合成基质凝胶。任选地，在胶原层凝固前，将明胶溶液加入到胶原凝胶中。然后将第一细胞类型(内皮细胞)置于固体层上并进行培养以形成与固体层接触的汇合细胞层。然后制备迁移细胞并将其接种到第一细胞类型的汇合层顶部。典型地，第一细胞类型为内皮细胞，例如为HUVEC。也可以使用其它的原代内皮细胞，例如HCAEC (冠状动脉内皮细胞)、HMVEC(肺微血管内皮细胞)或者内皮细胞系例如SK-HEP-1(ATCC HTB-52)。尽管任何迁移细胞类型都能在该系统中使用或进行试验，例如中性粒细胞系HL-60(ATCC CCL-240)、淋巴细胞、肿瘤细胞系例如HT-1080(ATCC CCL-121)以及精子，但我们用原代中性粒细胞和PBMC作为迁移细胞进行试验。

为了检测方便，在对迁移细胞进行接种和分析前可以进行标记。通常用于标记细胞的很广范的染料也能用于该模型，所用染料例如为Hoechst、钙黄绿素(Calcein)、荧光右旋糖酐(fluorescein dextran)和德州红右旋糖酐(Texas Red dextran)。作为一个例子，我们在我们的研究中用CellTracker^TMGreen(Invitrogen)标记细胞。

做为选择，在固体胶原凝胶层的制备过程中，可以在胶原凝胶中混入荧光化合物。当细胞迁移到凝胶中时，它们暴露于荧光材料。细胞和荧光材料之间的相互作用产生荧光信号，所述相互作用例如为蛋白酶的消化、内在化(internalization)或者其它生化反应。所述信号然后被荧光显微镜捕获，并且进行定量测量。这里迁移细胞在测定前不需要标记。这会使测定更易于操作，更有效，并且更适于高通量应用。因为迁移细胞在跨内皮迁移前不带标记，因此仅迁移通过内皮细胞层的细胞含有荧光信号。从未迁移的细胞完全不会显示信号。这消除了来自未迁移的、预先标记的细胞的背景，因此提高了测定的准确性和灵敏性。

使用所述组合物的方法

我们开发的细胞迁移测定系统能够用于细胞迁移研究，也能够筛选促进或抑制细胞迁移的介质或药物。当用于筛选细胞迁移的介质时，该方法包括以下步骤：(a)将细胞迁移的候选介质加入所述组合物中，或者用所述候选介质对迁移细胞进行预处理；(b)孵育所述组合物，包括接种后的迁移细胞；(c)测定存在所述候选介质情况下的细胞迁移；和(d)与缺少所述候选介质的同一类型的细胞就测量结果进行比较，测量的迁移结果的差异鉴别了细胞迁移的介质。

我们成功地检验了该系统对于刺激或抑制细胞迁移的分子进行筛选的能力。白介素-1-β(IL-1β)是中性粒细胞和PBMC的内生的细胞迁移介质。IL-1β明显地刺激内皮细胞以表达进一步增强上述两种细胞类型跨内皮迁移的黏附分子。存在IL-1β时，中性粒细胞TEM发生得相对较快，并在约0.5-2小时内达到明显的信噪比(S/N)(IL-1β刺激对比未刺激，图7)。我们也注意到经过过夜孵育，中性粒细胞TEM S/N(有/无IL-1β刺激)达到稳定状态。PBMC TEM发生的相对较慢，通常需要6-8小时的孵育时间(图8)。

将IL-1β加入用于HUVEC培养的培养基中并过夜培养时，我们也检验了另一种方法，即引入化学引诱物。白介素-8(IL-8)是公知的中性粒细胞强力吸引剂。为了证实IL-8对中性粒细胞TEM的作用，在接种HUVEC层前，我们用含有IL-8的培养基预浸胶原凝胶4小时。我们的结果表明IL-8的浸渍产生了TEM作用，类似于HUVEC的IL-1β活化所起到的作用(图9)。

我们也检验了抑制剂并显示出该系统也能鉴别TEM抑制剂。公知1，10-phenathronoline抑制MMP-9(基质金属蛋白酶-9)。用1，10-phenathronoline对中性粒细胞预处理。整个TEM测定中该抑制剂持续存在。图9和10中(对于图9，对比IN-和IN+)，我们证明了中性粒细胞TEM的抑制。另一个MMP-9抑制剂，强力霉素(doxycyclin)，也进行了测验并表明抑制TEM。公知迁移细胞释放的蛋白酶，例如MMP-9，会促进细胞迁移通过组织。蛋白酶的抑制会导致细胞迁移的下调。

高通量、三维的细胞迁移测定系统

上面描述的组合物已经成功地在96孔板平台中得到实施。具有透明底部的96孔板用于该测定，一个这样的实例是PerkinElmer的ViewPlate^TM。用自动化的细胞分析仪，例如In Cell Analyzer^TM(GEHealthcare)，进行细胞迁移的分析。例如，在某一Z-plate上产生预定观察区域的共聚焦图像。然后这些图像通过自动分析和定量软件进行处理。结合自动成像和数据分析，该测定系统在96孔形式中的实施提供了高通量的细胞迁移系统。该系统能够用于大规模的探寻和评测用于包括TEM在内的细胞迁移的介质。

除了单个的Z plane图像采集，该系统也能提供细胞迁移的3-D细胞图像。因为进行图像采集不干扰该测定系统，它也能够提供时间数据系列。图11提供了96孔板的孔的视域(field view)的白细胞TEM的3-D图像。该图像是从通过胶原凝胶层的一叠21个Z-plate图像切片(每部分10μm)重新构建而成。该3-D图像表明凝胶层中白细胞TEM向下迁移到了凝胶中积聚了较高梯度化学引诱物的地方。

该系统的可靠性通过中性粒细胞TEM的分散图得到了检验，所述分散图呈现了Z：120μm处有或无HUVEC激活情况下迁移细胞的数量(图12)。我们看到了紧密-分散分布。这表明处理中的变化很小，并且两个处理间的差异是显著的并可辨别，这就符合了该测定的高通量目的。需要时，同样的测定形式应当也可以用于384孔形式。

实施例

提供这些实施例只是出于说明性目的，不应解释为对权利要求界定的本发明的范围的限定。本说明书下文或其它地方给出的参考文献都通过援引包含于此。

材料和方法

表1包含了以下测定中用到的基本材料，以及关于生产商和相应的目录编号的信息。

另外的材料在随后的方法中进行说明。

表1：试验部分用到的材料

材料	供应商	目录#
			HUVEC	CAMBREX	CC2915
EGM-2	CAMBREX	CC3162
			纤维粘连蛋白(Fibronectin)	BD Biosciences	354008
VITROGEN-100，I型胶原	COHESION	FXP-019
			CellTracker Green	Invitrogen	C2925
结合鬼笔环肽的Alexa FluorTM 488	Invitrogen	A-22284
			抗人PECAM单克隆(Anti-humanPECAM monocl onal)	Pierce	MA 3100
人血清白蛋白	Sigma	A 1653
			RPMI培养基	Invitrogen	72400-047
Cadhe rin-5，小鼠抗人单克隆抗体	BD Biosciences	555661
			小鼠IgG	Sigma	M 9144
ViewPlateTM 96-孔板	PerkinElmer	6005182
			明胶	Sigma	G9391
黑色胶粘封板剂(Black adhesive plateseal)	Perkin Elmer	6005189

下面的副标题描述了用于制备和实施该测定系统的操作步骤

胶原凝胶层的制备

胶原I按照生产商的建议制备。简要地讲，将8ml的胶原与1ml的10×PBS和1ml NaOH(0.1N)相混合，使用的是保存在4℃预冷的吸液管和反应物。可选择地，通过加入0.12N HCl将所述混合物的pH调到7.5。

将96-孔板(ViewPlate^TM，PerkinElmer Life and Analytical Sciences)放到冰上，用分步重复移液器(stepper repeat pipette)(500或者1000μl的移液头)将40μl的凝胶(2.5mg/ml)分配入每个孔。将该板在4℃以1,500rpm旋转2分钟。该凝胶在无CO₂的培养箱中在37℃固化，以在96孔板的孔上构建厚的胶原凝胶层(200μm)。利用这种方法制备的胶原凝胶进行下面的TEM测定。

备选地，在向96孔板中分配前加入明胶溶液至胶原凝胶混合物中。通过向组织级水(tissue grade water)中加入5克粉末并加热到完全溶解来制备5％明胶溶液。用10N NaOH将pH调到7.2，该溶液121℃高压灭菌30分钟。分装为1ml量4℃贮存。每1ml的胶原混合物中加入125μl的5％明胶溶液。胶原/明胶混合物以类似于胶原凝胶混合物的方式进行分装和固化。具有固化凝胶的板可以立刻用于下述TEM测定。备选地，该板可用封板剂密封并在潮湿的环境下以室温保存，留作后用。

培养HUVEC在凝胶上形成汇合单层

各孔中的胶原凝胶层被涂敷上200μl的含有1μg/ml的人纤维粘连蛋白(BD Biosciences)的无血清EGM-2培养基，置于室温下1小时。移除含有纤维粘连蛋白的培养基后，将HUVEC细胞(CAMBREX)接种到凝胶上并在EGM-2培养基中37℃培养3天，细胞浓度为40,000细胞/孔。从早期传代(第3到第4代)挑选细胞，70-80％汇合的HUVEC细胞培养物。测定的前一天，HUVEC培养基替换为新鲜的单独的EGM-2培养基或者含有10ng/ml IL-1β(或者TNF-α或者其它化学引诱物)的新鲜EGM-2培养基。该混合物过夜孵育用以刺激TEM。

备选地，为了证实IL-8是中性粒细胞TEM的主要化学引诱物，在接种迁移细胞前，胶原凝胶可以用含有200ng/ml的IL-8的培养基预浸4小时。

从血样中分离和标记白细胞

中性粒细胞或者外周血单核细胞(PBMC)从血沉棕黄层(bloodBuffycoat)中新鲜分离。简单地讲，利用右旋糖酐沉降法除去RBC。然后用Ficoll-Hypaque离心法分离PBMC。在Ficoll-Hypaque离心的团粒中，通过残留的RBC的低渗溶解纯化中性粒细胞。这些细胞用CellTracker^TM Green标记，37℃下在含0.5到1μm染料的RPMI中孵育45分钟。移除含有染料的RPMI，用无血清RPMI培养基清洗细胞一次。在含有0.2％HAS(测定用培养基)的RPMI中以2.5×10⁶细胞/毫升重悬所述细胞。

执行并测量TEM测定

在测定日，除去用于HUVEC细胞培养的培养基，HUVEC单层用PBS清洗2次并用测定培养基(含有0.2％HAS的RPMI)清洗一次。将CellTracker^TM Green标记的500,000(200μl)中性粒细胞或PBMC置于各孔中的HUVEC单层之上。该测定在37℃进一步孵育。孵育时间的长度根据主要的细胞类型而定。对于中性粒细胞，孵育时间在2小时内，对于PBMC，可能需要6到10小时。

所需的孵育时间过后，获取已经迁移到HUVEC层之下的中性粒细胞/PBMC细胞的图像。通常，在单个Z位置就足以获取图像并确定在目标Z位置在凝胶中的迁移细胞的数目。例如，利用IN Cell Analyzer3000(GE Healthcare)的Z-切片特征(Z-slicing feature)对120μm Z平面的图像进行量化。利用目标强度(Object Intensity)分析模型分析图像。在多个时间重复进行该实验，这样，图中的各数据点代表6个重复的孔的正/负标准差，一个图像Z平面/孔。

结果

胶原凝胶的制备

合适的凝胶制剂是高质量TEM测定所必须的。图2和3表明凝胶质量显著影响TEM结果。坏胶(broken gel)是通过插入移液器枪头穿过凝胶层或者造成大的气泡进入凝胶中而制备的。作为对比，用12管道的移液器将不同体积的对照凝胶分装入各孔中。气泡好像是使得中性粒细胞和PBMC的TEM测定存在差异的主要因素。相对于正常的对照胶，坏胶确实影响测定结果，但是不太显著。注意，用多管道的移液器注射凝胶时，小气泡易于通过外力而带入凝胶中。我们发现在4℃以1,500rpm转动该板2分钟会除去大部分气泡。也要注意，小心地进行清洗操作能够防止坏胶发生。

由于分析设备的限制，胶的体积对测定的设置(set up)也很重要。IN Cell Analyzer仅能聚焦板底凝胶中限定的200μm的Z距。我们的分析表明40μl的凝胶体积提供了用于在孔的中心形成胶层的良好凝胶深度，并且满足了测定和设备的要求。图4和5分别显示了胶的体积对中性粒细胞和PBMC TEM的影响。

HUVEC培养

依照以上的材料和方法部分在EGM-2培养基中培养来自CAMBREX的HUVEC。合适的HUVEC培养物汇合单层在胶原凝胶上生长。这通过钙粘蛋白-5免疫染色而证实。图1右侧的彩色图像表示有紧密连接的汇合的内皮细胞单层。细胞核受到Hoechst染色(蓝色)。F-肌动蛋白由Alexa Fluor^TM 488结合的鬼笔环肽(phalloidin)染色(绿色)。染红色表明是一种蛋白，即VE钙黏蛋白(VE-Cadherin)，其在细胞边界当有紧密的接合形成时进行表达。

中性粒细胞和PBMC的接种密度

用滴定法测量中性粒细胞和PBMC的接种密度以鉴定出测定所需的最佳细胞数目。中性粒细胞的起始细胞密度的分析结果表示在图6中。其表明为获得合理的信噪(S/N)比，需要300,000-500,000细胞/孔的密度。对于PBMC，确定了类似的范围。

中性粒细胞和PBMC TEM的时间过程

中性粒细胞TEM发生得相对比较快，在约0.5-2小时内达到明显的S/N(IL-1β刺激对比未刺激)。图7显示了中性粒细胞TEM时间过程测定的结果。分别在0.5、1、1.5和2小时的时点上定量测量了板底以上Z：120μm的迁移细胞。我们也注意到经过过夜孵育，中性粒细胞TEM S/N(有/无IL-1β刺激)达到稳定状态。PBMC TEM发生的相对较慢，通常需要6-8小时的孵育时间。图8显示了PBMC TEM时间过程测定的结果。分别在2、4、6和8小时的时点上定量测量了板底以上Z：120μm的迁移细胞。

IL-8浸渍增加中性粒细胞TEM

IL-8是公知的中性粒细胞强力吸引剂。为了证实IL-8对中性粒细胞TEM的作用，在开始该测定前，具有一层汇合的HUVEC单层的胶原凝胶用含有200ng/ml的IL-8的培养基预浸4小时。图9显示了该研究的结果。该结果表明IL-8的浸渍产生了TEM作用，类似于HUVEC的IL-1β活化所起到的作用。IN+/IN-：存在/缺失MMP-9抑制剂(参见下文)。

通过MMP-9抑制剂抑制中性粒细胞TEM

该TEM测定前，用1，10-phenathronoline，一种MMP-9抑制剂(12-1000μM)，对中性粒细胞预处理0.5小时。整个TEM测定中持续存在该抑制剂。图9和10中，证明了中性粒细胞TEM受到抑制。图10中的各数据点代表6个重复孔的正/负SD，每个孔在Z：60um处一个图像。另一个MMP-9抑制剂，强力霉素(doxycyclin)，也进行了测验并表明抑制TEM(数据未显示)。

重建的三维TEM图像

96孔板的孔中的白细胞可视3-D细胞图像表示在图11中。利用INCell Analyzer 3000产生了Z系列共聚焦图像部分(sections)。采集了从0-200μm，通过凝胶层，每部分为10μm的总共21个切片的图像。利用图像分析程序AutoDeblur&Auto Visulize 9.3(AutoQuant Imaging)构建3-D图像。注意，图11仅表示了孔的一小部分，约0.75mm²的视域(a field view)。该3-D图像表明凝胶层中的白细胞TEM，向下迁移到了含有化学引诱物的胶层中。

中性粒细胞TEM的大规模研究

图12中表示了中性粒细胞TEM的分散图，所述分散图呈现了Z：120μm处在有或无HUVEC激活情况下迁移细胞的数量。紧密-分散分布表明处理中的变化很小，并且两个处理间的差异给出了显著的信号窗口，这使得该测定能够用于高通量应用。

如同每一个都被单独并特别地通过援引并入本文一样，文中提及的所有的专利、专利公布和提及的其它公布的参考文献都全部通过援引并入本文。尽管描述了本发明的优选的说明性实施方式，所述领域的技术人员会知道本发明能够通过上述实施方式外的其它方式来实施，上述实施方式仅是出于说明性目的而提供的，并不起限制作用。本发明只由后面的权利要求来限定。

Claims (24)

1.一种用于检测细胞迁移的物质组合物，该物质组合物含有：

(a)含有胶原凝胶或合成基质凝胶的固体层；

(b)接触所述固体层并含有第一细胞类型的第一细胞层；以及

(c)接种到所述第一细胞层上的第二迁移细胞类型。

2.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述细胞迁移为跨内皮迁移(TEM)。

3.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述固体层还含有荧光化合物。

4.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述固体层还含有化学引诱物。

5.根据权利要求4所述的物质组合物，其中所述化学引诱物在添加所述第一细胞层之前加入到所述胶原凝胶中。

6.根据权利要求4所述的物质组合物，其中所述化学引诱物由所述第一细胞层的所述第一细胞类型在细胞因子刺激后释放出来。

7.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述第一细胞层是汇合的。

8.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述第一细胞类型是人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)。

9.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述第一细胞类型由细胞因子刺激。

10.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述第二细胞类型选自由单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞、肿瘤细胞或者精子组成的组。

11.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述第二细胞类型是中性粒细胞或者外周血单核细胞(PBMC)。

12.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述第二细胞类型进行了染料标记。

13.根据权利要求1所述的物质组合物，其位于96孔板形式中。

14.根据权利要求13所述的物质组合物，其中所述第一细胞类型是HUVEC的汇合层，且其中所述第二细胞类型为中性粒细胞或PBMC。

15.根据权利要求1所述的物质组合物，其位于384孔板形式中。

16.根据权利要求13所述的物质组合物，其还含有用于图像采集的自动荧光显微镜。

17.根据权利要求16所述的物质组合物，其中所述自动荧光显微镜包括共聚焦显微镜和用于自动图像采集和同时在线分析的软件。

18.一种制备用于检测细胞迁移的物质组合物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在容器内沉积和固化胶原凝胶以形成含有胶原凝胶的固体层；

(b)置第一细胞类型的细胞于所述固体层上并孵育所述第一细胞类型以形成同所述固体层接触的汇合细胞层；以及

(c)将第二细胞类型的细胞接种到所述第一细胞层上。

19.一种检测细胞迁移的方法，包括以下步骤：

(a)孵育权利要求1所述的组合物；以及

(b)在所述组合物的所述固体层的第一位置检测迁移细胞。

20.一种鉴别细胞迁移的介质的方法，包括：

(a)将细胞迁移的候选介质加入到权利要求1所述的组合物中；

(b)孵育所述组合物；以及

(c)测定存在所述候选介质的情况下的细胞迁移，其中相对于缺少所述候选介质的组合物，在应答上的差异鉴别了细胞迁移的介质。

21.根据权利要求1所述的组合物，其中所述固体层还含有明胶。

22.根据权利要求18所述的方法，其中所述沉积步骤还包括将明胶溶液与所述胶原凝胶混合。

23.根据权利要求15所述的组合物，还含有用于采集图像的自动荧光显微镜。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述自动荧光显微镜包括共聚焦显微镜和用于自动图像采集和同时在线分析的软件。

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