CN206751843U

CN206751843U - 磁场中分离细胞的微流控芯片

Info

Publication number: CN206751843U
Application number: CN201720453165.3U
Authority: CN
Inventors: 赵建华; 刘志安; 钟山亮; 胡嘉华; 戴明飞; 张贵雪
Original assignee: Jiangsu Cancer Hospital
Current assignee: Jiangsu Cancer Hospital
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2027-04-27

Abstract

本实用新型公开了一种磁场中分离细胞的微流控芯片，包括设于磁场中的基片和盖片，其中基片上设有液池，该液池一侧设进样口，该进样口与液池之间设用于待分离磁性标记细胞单排进入的微流通道，另一侧分别设磁性标记的细胞收集口和未被磁性标记的细胞收集口，所述盖片上对应设有进样接口、磁性标记的细胞接收口和未被磁性标记的细胞接收口。本实用新型的微流控芯片，不仅能实现“阳性”法分离靶细胞，而且能实现”阴性“法分离靶细胞，扩展了该微流控芯片的应用范围；同时，该芯片在细胞回收率和细胞数量百分比这两个关键分离性能指标上能够满足几乎所有生物学和医学试验要求。因此，可作为一个技术平台用于生物学研究、医学试验及临床应用。

Description

磁场中分离细胞的微流控芯片

技术领域

本实用新型属于生物技术工程及医学领域，涉及一种在磁场中分离细胞的微流控芯片。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。随着现代生物学和医学基础研究的发展。个体化治疗已经成为肿瘤治疗的发展方向。然而，个体化治疗前需要首先对肿瘤细胞进行分子鉴定。在这个过程中存在两个问题：一是需要首先分离出肿瘤细胞；二是分离出的肿瘤细胞数量及其纯度(数量百分比)需要满足生物及医学试验中的分子鉴定要求。

目前，肿瘤细胞的主流分离方法是磁分离。其中包括“阴性”和”阳性“两种磁分离法。“阴性”磁分离法是将细胞溶液中不需要的细胞进行免疫磁性标记，在磁场作用下，不需要的细胞留在磁场中，需要的靶细胞流出磁场而被分离出；“阳性”分离法是将细胞溶液中的靶细胞进行免疫磁性标记，在磁场作用下，靶细胞留在磁场中，不需要的细胞则流出磁场而被去除。然而，现有“阴性”磁分离法存在一些技术问题：一是分离后的靶细胞数量百分比不高，难以满足后续分子鉴定在细胞纯度上的要求；二是分离后的靶细胞回收率较低，难以满足后续分子鉴定在细胞数量上的要求；三是在某些情况下，既需要“阴性”法也需要“阳性”法才能满足生物与医学试验中对靶细胞进行鉴定。

实用新型内容

实用新型目的：本实用新型旨在提供一种在磁场中有效分离细胞的微流控芯片。

技术方案：本实用新型所述的微流控芯片，包括设于磁场中的基片和盖片，其中，所述基片上设有液池，该液池一侧设进样口，该进样口与液池之间设用于待分离磁性标记细胞单排进入的微流通道，另一侧分别设磁性标记的细胞收集口和未被磁性标记的细胞收集口，所述盖片上对应设有进样接口、磁性标记的细胞接收口和未被磁性标记的细胞接收口。

其中，所述微流通道为并列设置的弯曲的多排通道，该微流通道的深度为50～100μm，宽度为100～200μm，使得溶液在通过弯曲通道时形成近乎单个细胞排列的液流，以提高磁场分离的精确度。

所述液池的宽度、长度和深度分别为1～2cm、4～5cm和100～200μm。在该长宽比下，被磁性标记的细胞能够在最大限度上实现在磁场中充分偏转而获得最佳分离效果；深度在该深度下，溶液中的细胞能够形成近乎单层的排列状态，从而有效避免磁性标记的细胞在磁场中发生流向偏转时会同时影响没有被磁性标记的细胞，此外还降低了制作芯片的成本。

所述进样口、磁性标记的细胞收集口、未被磁性标记的细胞收集口、进样接口、磁性标记的细胞接收口和未被磁性标记的细胞接收口的孔径为1～2mm，该尺寸下细胞不会在进出口位置发生堵塞，并且容易完全回收细胞。此外，该尺寸与芯片整体大小匹配，有助于产品美观。

所述基片两侧设有磁铁，该磁铁两端设有磁屏蔽体。同时，基片、磁铁及磁屏蔽体放置于基件上。所述磁铁为钕铁硼磁铁。

所述进样口外接微流注射泵。

实用新型原理：通过磁性标记的细胞在磁场中的流向会发生偏转这一基本原理，研制出一种微流控芯片，在细胞液流的不同流向部位分别收集被磁性标记和未被磁性标记的肿瘤细胞，从而实现既可以通过“阳性”法也可以通过“阴性”法分离肿瘤细胞的微流控芯片，这在技术上扩展了现有微流控芯片的应用范围。

有益效果：与现有技术相比，本实用新型提供了一种在磁场中分离细胞、尤其是肿瘤细胞的微流控芯片，不仅能实现“阳性”法分离靶细胞，而且能实现”阴性“法分离靶细胞，扩展了该微流控芯片的应用范围；同时，该芯片在细胞回收率和细胞数量百分比这两个关键分离性能指标上能够满足几乎所有生物学和医学试验要求。因此，可作为一个技术平台用于生物学研究、医学试验及临床应用。

附图说明

图1(a)为本实用新型微流控芯片的结构示意图；

图1(b)为本实用新型微流控芯片的基片及其配件的俯视图；

图1(c)为本实用新型细胞在磁场中的偏转示意图；

图2(a)为不同分离间距下的PC9细胞回收率和数量百分比图；

图2(b)为不同液流速度下的PC9细胞回收率和数量百分比图；

图3(a)为肺癌细胞系PC9在分离前的CD133亚群的数量百分比图；

图3(b)为肺癌细胞系PC9在分离后的CD133亚群数量百分比图；

图4(a)为肺癌患者胸腔积液肿瘤细胞在分离前的数量百分比图；

图4(b)为肺癌患者胸腔积液肿瘤细胞在分离后的肿瘤细胞数量百分比图。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型的技术方案作进一步说明。

本实用新型的微流控芯片，包括基片1和盖片10，其中，所述基片1上设有液池2，液池的宽度、长度和深度分别为1～2cm、4～5cm和100～200μm。液池2一侧设进样口3，该进样口3与液池2之间通过微流通道4连通，微流通道4为弯曲形状，深度为50～100μm，宽度为100～200μm，可用于待分离细胞单排形式进入，同时微流通道可以为并列设置的多排通道。液池2另一侧上下两端分别设磁性标记细胞收集口5和未被磁性标记细胞收集口6，所述盖片上对应设有进样接口、磁性标记细胞接收口和未被磁性标记细胞接收口。其中，进样口3、磁性标记细胞收集口5、未被磁性标记细胞收集口6、进样接口、磁性标记细胞接收口和未被磁性标记细胞接收口的孔径为1～2mm。与此同时，基片1两侧设有磁铁7，该磁铁7两端设有磁屏蔽体8。而且基片1、磁铁7及磁屏蔽体8放置于基件9上，这里的磁铁为钕铁硼磁铁。

上述微流孔芯片是基于下列五步技术方案实现的：

第一步：微流控芯片的设计：①单个细胞排列的液流设计，以提高分离精确度；②芯片与与磁铁相对位置固定，以提高分离的稳定性；③优化分离间距和液流速度，以达到最佳的分离效果。

第二步：微流控芯片及其附属配件的制作：

①基片上进出样口的制作：使用高速微电机，在芯片上打孔。

②基片上液流通道及液池的制作：使用SU-8光刻胶掩膜，湿法腐蚀出液流通道(即细胞进出口通道)和液池。

③基片与盖片接合：通过粘结剂，将基片与盖片接合。

④芯片需放入磁场才能分离细胞，因此需要制作放置芯片的磁场基件。在制作中，使用条形磁铁形成平行磁场，并用屏蔽材料阻断多余的磁力线，以消除不均匀的磁力线对细胞偏转角度的影响。

第三步：细胞的磁性标记

本实用新型的基本原理是磁分离，因此需要对细胞进行磁性标记。使用MyOne^TMStreptavidin T1(ThermoFisher Scitific，货号65601)和单克隆抗体来实现细胞的特异性磁性标记。

第四步：磁场中微流控芯片分离肿瘤细胞的参数优化

细胞被磁性标记后，在磁场中的发生角度偏转，靶细胞与非靶细胞才能得到分离。在本实用新型确定的芯片结构下，液流速度和分离间距是影响分离效率并且独立于芯片结构的两个关键参数。液流速度越大，所需的分离间距将越小，但获得生物靶细胞数量百分比将越低；液流速度越小，所需的分离间距将越大，但获得的靶细胞数量百分比将越低。为了同时提高靶细胞的回收率和数量百分比以满足生物学和临床医学应用，需要优化这两个参数才能得到最优的分离效果。本实用新型以人的白细胞和肺癌细胞系PC9混合的细胞为例，来优化相关参数。

第五步：微流控芯片在磁场中分离不同来源细胞的效率检验

以肺癌细胞系PC9为例，通过分离其中的CD133(一种干细胞标志物)亚群细胞，检验该微流控芯片在分离细胞亚群上的效率，这也是检验该微流控芯片在“阳性”磁分离上的性能；以肺癌患者的胸腔积液为例，通过分离其中的肿瘤细胞，检验该微流控芯片在“阴性”磁分离上的性能。

本实用新型解决问题的技术方案包括：(1)微流控芯片的制作；(2)细胞的磁性标记；(3)微流控芯片在磁场中分离细胞的参数优化。

具体的技术流程主要包括以下几个部分：

1.微流控芯片的设计与制作(参见图1(a)-1(b))：

(1)基于物体通过弯曲通道产生的离心力改变速度的物理原理，设计并制作多排弯曲的微流通道，通道的深度为100μm，宽度为200μm。

(2)基片上进出样口的制作：使用高速微电机，在芯片上打孔，孔的直径为1mm。(3)基片上的液流通道及液池制作：使用SU-8光刻胶掩膜，湿法腐蚀出深度为100μm的液流通道，刻蚀出的液池宽度和长度分别为2cm和5cm。

(4)基片与盖片接合：通过粘结剂，将基片与盖片接合。

2.细胞的磁性标记：

(1)细胞按照1x10⁷/mL重悬于含2％胎牛血清和1mM EDTA的PBS溶液(pH,7.4)，混合均匀；

(2)按照生产商的推荐用量加入单克隆抗体，混匀，4℃遮光孵育10min；

(3)用含2％胎牛血清和1mM EDTA的PBS溶液(pH,7.4)洗涤细胞一次；

(4)按照生产商提供的步骤使用MyOne^TMStreptavidin T1磁珠对细胞进行磁性标记。

3.在磁场中分离并分别收集磁性标记与未被磁性标记的细胞(参见图1(c))：

(1)分离参数的优化：

以人的白细胞和肺癌细胞系PC9混合后制备的细胞溶液为例，采用“阴性”分离原理，对分离间距和液流速度这两个关键参数进行了优化，以提高分离效率。

具体的技术流程包括：

①细胞溶液的制备：包括健康者的白细胞溶液、PC9细胞溶液以及混合细胞溶液制备。

②细胞的磁性标记：取上述混合细胞溶液，使用Human CD45BiotinylatedAntibody对混合细胞中的白细胞进行免疫荧光染色，然后加入MyOne^TMStreptavidin T1(ThermoFisher Scitific，货号65601)磁珠，按照生产商提供的步骤进行白细胞的磁性标记。

③分离间距的优化：同样量的混合细胞溶液经注射泵在100μL/min的流速下分别进入不同分离间距的微流控芯片，收集未被磁性标记的细胞。

④液流速度的优化：同样量的混合细胞溶液经注射泵分别在不同液流速度下进入优化了分离间距的微流控芯片，收集未被磁性标记的细胞。

⑤流式细胞仪鉴定并计数PC9细胞的数量及其百分比。

(2)“阳性”磁分离性能的检验：

以分离PC9细胞中的CD133亚群为例，使用Human CD133/1(AC133)-Biotin(clone:AC133)进行免疫荧光染色，按照上述同样的流程对PC9细胞中的CD133亚群进行磁性标记，在优化后的分离间距和液流速度下，通过微流控芯片，收集磁性标记的细胞，流式细胞仪鉴定并计数CD133亚群细胞的数量及其百分比。

(3)“阴性”磁分离性能的检验：

以肺癌患者的胸腔积液样品为例，通过使用Human CD45 Biotinylated Antibody和MyOne^TMStreptavidin T1磁珠对样品中的白细胞进行免疫荧光染色和磁性标记，在优化后的分离间距和液流速度下，通过该微流控芯片，收集未被磁性标记的细胞，然后使用human anti-CD326(Biolegend，货号324204)和Human anti-Cytokeratin(BDBioscience，货号563614)抗体进行免疫荧光染色，流式细胞仪鉴定并计数PC9细胞的数量及其百分比。

使用玻璃制作了该微流控芯片，使用MyOne^TMStreptavidin T1(ThermoFisher Scitific，货号65601)磁珠、Human CD45 Biotinylated Antibody(Bio-Techne China Co.Ltd，货号BAM1430)和Human CD133/1(AC133)-Biotin(clone:AC133)(Miltenyi Biotec Technology&Trading，货号130-098-897)抗体进行了不同细胞的磁性标记，并使用材质为钕铁硼的磁铁进行了细胞分离。此外，可以使用微流注射泵加压进样。所有材料和设备均可在市场上方便的购买到。

实施例1微流控芯片的参数优化

以人的白细胞和肺癌细胞系PC9混合后制备的细胞溶液为例，采用“阴性”磁分离法，对分离间距和液流速度这两个关键参数进行了优化，以确定磁性标记的细胞与未被磁性标记的细胞最佳的分割收集位置，具体步骤为：

1、分离间距的优化

①按照同样的技术流程制备每毫升含有1x10⁷个白细胞和100个PC9细胞的混合细胞溶液并磁性标记白细胞；

②分别取1mL混合细胞溶液，经注射泵以100μL/min的流速分别进入分离间距为1mm、2mm、3mm、4mm以及5mm的微流控芯片，收集未被磁性标记的细胞；

③使用human anti-CD326(Biolegend，货号324204)和Human anti-Cytokeratin(BDBioscience，货号563614)抗体进行细胞免疫荧光染色；

④流式细胞仪鉴定并计数PC9细胞的数量及其百分比；

⑤为满足生物学和临床试验在细胞分子鉴定上的要求，选取靶细胞回收率大于80％并且其数量百分比大于50％的分割点作为最优的分离间距。

结果显示，随着分离间距增大，PC9细胞的回收率增大，但数量百分比降低。在3mm和4mm时，PC9细胞的回收率分别为85％和88％，其数量百分比分别为65％和50％。因此选取3mm作为最优的分离间距。图2(a).为不同分离间距下PC9细胞回收率和数量百分比。

2、液流速度的优化

①按照前面所述的流程制备每毫升含有1x10⁷个白细胞和100个PC9细胞的混合细胞溶液并磁性标记白细胞；

②分别取1mL混合细胞溶液，使用优化了分离间距的微流控芯片，经注射泵分别以10、25、50、100、20、300、400、500、600、700、800、900以及1000μL/min的液流速度注入细胞溶液，收集未被磁性标记的细胞；

③使用human anti-CD326(Biolegend，货号324204)和Human anti-Cytokeratin(BD Bioscience，货号563614)抗体进行细胞免疫荧光染色；

④流式细胞仪鉴定并计数PC9细胞的数量及其百分比；

⑤为满足生物学和临床试验在细胞分子鉴定上的要求，选取靶细胞回收率大于80％并且其数量百分比大于50％的液流速度作为最优液流速度。

结果显示，随着液流速度的增大，PC9细胞的回收率和数量百分比均降低。在75μL/min的液流速度下，PC9细胞的回收率和数量百分比分别为88％和61％。因此选取75μL/min作为最优的液流速度。图2(b).为不同液流速度下PC9细胞回收率和数量百分比。

实施例2肺癌细胞系PC9中CD133干细胞亚群的分离效率检验

通过分离PC9中CD133干细胞亚群，确定了该微流控芯片在“阳性”磁分离法上的性能。

1、PC9细胞培养及细胞溶液配制，具体步骤为：

PC9细胞用RPMI 1640培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青链霉素和2mM谷氨酰胺)在37℃和5.0％CO₂培养箱中培养；在对数生长期阶段使用含5mM EDTA的PBS溶液(pH7.4)收获细胞，悬浮于重悬于PBS溶液(pH,7.4，含2％胎牛血清和1mM EDTA)，细胞计数并胎盘兰排除死细胞，使用同样的缓冲液配置成细胞溶液。

2、流式细胞仪鉴定PC9细胞的CD133表达，具体步骤为：

①配置成的PC9细胞溶液加入Human CD133/1(AC133)-Biotin(clone:AC133)进行免疫荧光染色10min；

②细胞用PBS缓冲液洗涤一次；

③流式细胞仪鉴定CD133的表达；

3、磁性标记并分离CD133亚群细胞，具体步骤为：

①取1x10⁷个上述免疫荧光染色后的PC9细胞，加入MyOne^TMStreptavidin T1(ThermoFisher Scitific，货号65601)磁珠，按照生产商提供的步骤进行CD133亚群的磁性标记。

②在分离间距为3mm和液流速度75μL/min的条件下，磁性标记的细胞经注射泵进入微流控芯片，收集磁性标记的细胞。

4、流式细胞仪鉴定并计数CD133亚群细胞的数量百分比。

结果显示，分离前PC9细胞中约有1.5％的CD133亚群细胞，分离后CD133亚群细胞的数量百分比超过95％。这表明，该微流控芯片在“阳性”磁分离中具有高的分离效率。图3(a)-(b)为该微流控芯片在“阴性”磁分离法中的性能检验，其中为图3(a)为肺癌细胞系PC9在分离前的CD133亚群的数量百分比；图3(b)为肺癌细胞系PC9在分离后的CD133亚群数量百分比。

实施例3肺癌患者胸腔积液中肿瘤细胞的分离效率鉴定

通过分离肺癌患者胸腔积液中肿瘤细胞，确定了该微流控芯片在“阴性”磁分离法上的性能。

1、胸腔积液的前处理：

①收集肺癌患者的胸腔积液样品200-500mL；

②红细胞裂解液(含154mM NH4Cl、10mM KHCO3以及0.1mM EDTA的超纯水溶液)去除其中的红细胞。

③PBS溶液(pH,7.4，含2％胎牛血清和1mM EDTA)重悬成1x10⁷/mL，加入HumanCD45Biotinylated Antibody(Bio-Techne China Co.Ltd，货号BAM1430)免疫荧光染色10min。

2、细胞的磁性标记与微流控芯片分离

①加入MyOne^TMStreptavidin T1(ThermoFisher Scitific，货号65601)磁珠，按照生产商提供的步骤进行白细胞的磁性标记；

3、靶细胞数量及其百分比的鉴定

①分离后的细胞两等分，分别加入human anti-CD326(Biolegend，货号324204)及其同型对照，进行细胞表面染色10min；

②用PBS缓冲液洗涤一次，然后加入1mL PBS溶液(含1％福尔马林)固定10min；

③用PBS缓冲液洗涤一次，然后加入1mL HANKS缓冲液(含0.1％Saponin和0.05％NaN₃)通透10min；

④加入Human anti-Cytokeratin(BD Bioscience，货号563614)抗体进行细胞被的免疫荧光染色20min；

⑤流式细胞仪鉴定并计数肿瘤细胞(CD326+或Cytokeratin+)的数量百分比。

结果显示，分离前的胸腔积液中，流式细胞仪未检出CD326+或Cytokeratin+的肿瘤细胞(百分比小于0.1％)；经该微流控芯片分离后，CD326+或Cytokeratin+的肿瘤细胞数量百分比为48％。这表明，该微流控芯片在“阴性”磁分离中同样具有高的分离效率。图4(a)-(b)为该微流控芯片“阴性”磁分离法中的性能检验。具体为肺癌患者胸腔积液肿瘤细胞的分离效率检验。图4(a)为肺癌患者胸腔积液肿瘤细胞在分离前的数量百分比；图4(b)肺癌患者胸腔积液肿瘤细胞在分离后的肿瘤细胞数量百分比。

Claims

1.一种磁场中分离细胞的微流控芯片，其特征在于：包括设于磁场中的基片(1)和盖片(10)，其中，所述基片(1)上设有液池(2)，该液池(2)一侧设进样口(3)，该进样口(3)与液池(2)之间设用于待分离磁性标记细胞单排进入的微流通道(4)，液池另一侧分别设磁性标记细胞收集口(5)和未被磁性标记细胞收集口(6)，所述盖片上对应设有进样接口、磁性标记细胞接收口和未被磁性标记细胞接收口。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流通道(4)为并列设置的多排通道。

3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流通道(4)的深度为100～200μm，宽度为100～200μm。

4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述液池(2)的宽度为1～2cm,长度为4～5cm，深度为100～200μm。

5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述进样口(3)、磁性标记细胞收集口(5)、未被磁性标记细胞收集口(6)、进样接口、磁性标记细胞接收口和未被磁性标记细胞接收口的孔径为1～2mm。

6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述基片(1)两侧设有磁铁(7)，该磁铁(7)两端设有磁屏蔽体(8)。

7.根据权利要求6所述的微流控芯片，其特征在于：所述基片(1)、磁铁(7)及磁屏蔽体(8)放置于基件(9)上。

8.根据权利要求6或7所述的微流控芯片，其特征在于：所述磁铁(7)为钕铁硼磁铁。

9.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述进样口(3)外接微流注射泵。