JP2018533728A - 薬物又は薬物の組み合わせに対する初代細胞集団の細胞応答性を試験するためのエクスビボの方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明において記載されるAEの成分を以下のように調製する:Histopaque1077(Sigma)をコニカル遠心管に添加する。ドナーからの末梢血液(PB)、または骨髄(BM)、またはリンパ節(LN)サンプルを、慎重にHistopaque−1077の溶液上へと重ね、そして1500rpmで40分間遠心分離にかける。血漿分画を含む上部の層を先に取り除く。単核細胞(MNC)、Histopaque−1077、および顆粒球層(白血球分画)を含む中心の層を取り除き、廃棄する。その後、赤血球(RBC)または赤血球分画を含む下部の層を取り除く(図1)。血漿分画を、使用するまで−80℃で貯蔵する。抗凝血性クエン酸リン酸デキストロースアデニン溶液(CPDA−1,Terumo Corporation,Tokyo,Japan)を、RBC分画(150μl CPDA/ml RBC)に添加し、これを最大35日の間4℃で貯蔵する。血漿および赤血球の分画を、AEが細胞培地を補う全ての実験用に1:1の割合で混合する。
予め凍結保存されたサンプルの解凍おけるAEの役割を調査した。凍結保存の方法は、一般的に白血球を分離するために密度勾配に依存し、白血球分画だけが凍結保存される。ゆえに、これらの細胞が解凍されたとき、分離された白血球はそのAEを全く持たないという結果となる。したがって、これらの解凍された細胞上の化合物の活性を、AEが存在しないことで、人為的に改変することができた。これらの凍結保存された細胞のAEを加減(add back)することができるのか、および、凍結/解凍のプロセスによって細胞毒性や抗増殖性の薬物の化合物の活性が変わるかどうかを調査した。新鮮なBM AMLのサンプルを2つのパートに分けた;1つ目のパートでは、新鮮なサンプルとして、そのAE中のいくつかの化合物の用量反応曲線を評価した。他のパートでは、凍結保存された白血球分画、−20℃で冷凍された血漿分画、および血液バッグからのCPDA内に4℃で保存されていた赤血球−顆粒球分画を分離する密度勾配を行った。2週後に、凍結保存されたガラス瓶は解凍された。また、各患者からの血漿と赤血球の分画は1:1比率で混合され、解凍された初代細胞へ添加した。これらの化合物の活性と同じ評価を繰り返し、再構成されたAEを用いて同じ患者の新鮮なサンプル対凍結されたサンプルにおける結果を比較した。
原発性腫瘍細胞集団を試験する全ての分析に関して、Vybrant(登録商標)CFDA SE Cell Tracer Kit(分子プローブ)は細胞増殖を測定するために使用される。CFDA SE(成分A)を、原液として5mMの濃度でジメチルスルホキシド(成分B)内に溶解し、次の使用まで−20℃で保存する。本実施例において、新たに抽出し分離したCLL細胞を、リン酸緩衝食塩水(PBS(Sigma))中に10x106cells/mlで調節した。CFDAを、初代CLL細胞の1ml細胞懸濁液へ加え、5μMの最終濃度とする。CFDAの添加後、連続的に振とうし光から保護した状態で、細胞を10分間室温で攪拌してインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、細胞を培地中で再撹拌し、5分間氷上で維持した。その細胞を培養液で2回洗浄し、使用するまで4℃で維持した。このステップを、実験用調製における全ての他のステップ前に実施した。
CLLと診断された患者からの原発腫瘍細胞に対する最適条件に関して試験するために、フローサイトメトリーベースのスクリーニング過程が使用される。試験される条件は表1に要約される。各アッセイにおけるB細胞に対するHS−5間質細胞の比率が示される。
本発明の方法を、健康なドナーおよびCLL患者両方のPB由来のAEを評価するために使用した。この実験のための条件を、1μg/mlのCpG+50ng/mlのIL−2を使用して、HS−5共培養なしで及び1:10のHS−5共培養を用いて、各々72時間および96時間のインキュベーション時間でサンプルを刺激するように設定した。代表的な患者のサンプルからの凍結保存された原発性CLL腫瘍細胞は、図5に示される。白棒は72時間の結果であり、黒棒は96時間の結果である。対照サンプルは、CpG+IL2をプラスした又はマイナスした、AEのないCLL原発腫瘍サンプルを指す。原発腫瘍サンプルを、5人の健康なドナー(NPB)から及び5人のCLLドナー(CLL)からのAE(血漿および赤血球分画、1μl/ウェル)を用いて試験した。上のグラフの設定において見ることができるように、生存率のレベルは2つのタイプのAE間でかなり近似しており、HS−5共培養の存在は、両方に対するレベルを幾らか低下させた。下のグラフは増殖のレベルを示し、最も大きな効果は、HS−5共培養およびCLL患者からのAE(右下)を用いる条件である。これらの条件は、最大60%までの腫瘍細胞増殖のレベルをもたらした。これは、最近報告された(14)原発性CLL細胞におけるわずか15%の増殖レベルを十分に超えるものである。対象の1つの他のポイントは、類似したドナーサンプル内では、結果が様々であるということである。これは、HS−5共培養でCLL腫瘍細胞の生存能を大いに阻害した1つの特定のAEにおいて有意である(円を参照)。これは、得られるAEが、本明細書に見られる患者間の変動性を限定するために使用前に試験される必要があり、潜在的にプールされる必要があるということを示している。
本発明の方法を、CLLの凍結保存したサンプルにおけるCLLまたは正常なサンプルからのAEの異なる成分の効果を評価するために使用した。4つのCLLの冷凍したサンプルを、対照(黒丸)と一緒に1μg/mlのCpG+50ng/mlのIL−2(灰色の丸)で播種し、増殖(X軸、中央値の増殖+/−SD)および生存率(Y軸、および中央値の生存率+/−SD)両方を試験した(図6)。丸からの縦および横の線は、両方のパラメータに対するエラーバーを表わす。6つの正常なPB(NPB)および6つのCLLのPBの培地を、AE補足のソースとして使用した。高い患者間の変動性を回避するために、前に記載されたように、6つすべてのサンプルに対する血漿およびRBCを、同じリザーバーに一緒に加え、割合(1:1)を維持した。3つの横の列は、96時間のインキュベーションでの異なるHS5間質細胞株の密度(1:10、1:100および無し)を示す。列はそれぞれ異なる細胞培養条件を表わす:
・ 第1の列(CLL PB):CLLからの末梢血から得られた血漿および赤血球(RBC)から構成されたAE。
・ 第2の列(NPB):正常な末梢血から得られた血漿および赤血球から構成されたAE。
・ 第3の列(血漿CLL PB):CLL PBの血漿分画だけ(RBCなし)。
・ 第4の列(血漿NPB):NPBサンプルの血漿分画だけ(RBCなし)。
・ 第5の列(2x CLL PB):CLL PBから得られた血漿および赤血球から構成されたAEの量の倍。
・ 第6の列(2x NPB):NPBから得られた血漿および赤血球から構成されたAEの量の倍。
・ 第7の列(2x 血漿CLL NPB):CLLサンプルの血漿分画の二倍の量。
・ 第8の列(2x 血漿NPB):NPBサンプルの血漿分画の二倍の量。
原発性CLL腫瘍細胞がインキュベーション過程の間に維持される培地は、10%のウシ胎児血清(FBS)を含有している。アッセイ系に対するFBSの効果を判定するために、3つのCLLサンプルを、インキュベーション培地に対して4つの異なる血清条件、10%のFBS、20%のFBS、10%のヒト血清(HS)、または20%のHSにおいて試験した。CLL腫瘍サンプルを、HS−5共培養なしで、または1:10または1:100の比率での共培養で試験し、1μg/mlのCpG+50ng/mlのIL−2で刺激した。AEはCLL患者からの6つのPBサンプルに由来するものであった。6つのサンプルからの血漿および赤血球の分画を、1:1の比率で混合し、1μl/ウェルでウェルに加えた。結果は、HSが、すべての条件においてFBSよりも腫瘍細胞の生存率を著しく増加させることを示している(図7)。試験された各サンプルに対する中央値が示される。HSおよびFBS両方を20%に増加させることは、細胞の生存率の増加に結びつくが、より高い血清中濃度も増殖を阻害する。HS−5細胞株での共培養は、HSサンプル中の生存率を低下させるが、増殖に必要とされる。生存率および増殖のための全体的な最良の条件は、10%のHSである。
本実験は、異なる細胞シグナル伝達を網羅する24のサイトカインの組み合わせ(表2)の生存率および増殖の効果を評価する。使用されるサイトカインは以下の通りであった:CpG(1μg/ml)、IL−2(50ng/ml)、sCD40L(1μg/ml)、B細胞活性化因子(BAFF、10ng/ml)、IgM+IgG(BCR、10μg/ml)、IL−21(インターロイキン−21、50ng/ml)。間質細胞、HS−5を、含めたときに1:100の希釈で使用した。これらの実験のためのAEは、CLLを有する3人の患者のPBから得られた血漿および赤血球であった。各サンプルからのAE分画を、培養培地に加える前に等しく分けて混合した。使用される培地は、AE(1.6%)+ヒト血清(HS)10%を含有していた。20のCLLの凍結保存した原発腫瘍サンプルを処理し、サイトカインの組み合わせのそれぞれで試験した。増殖(X軸)および生存率(Y軸)両方を、各々のサイトカインの組み合わせに対して前に記載されたように試験した。表2に示された番号は、図8および図9に表わされる各組み合わせに対応している。
図8は、各組み合わせのためのすべてのサンプルに対する中央値を反映しており、これは、CLL PB AEおよびHS 10%と一緒にCpG(1μg/ml)+IL2(50ng/ml)+HS5(1:100)のサイトカインの組み合わせが、96時間のインキュベーションで最大で60%の生存率および40%の増殖を提供する、最良の条件であることを示している。これは表内および図8上の組み合わせ22である。
凍結保存された末梢血(PB)単核細胞は、処置を必要としている15人のCLL患者から提供された。これらの実験のためのAEは、CLLを有する3人の患者のPBから得られた血漿および赤血球であった。各サンプルからのAE分画を、培養培地に加える前に等しく分けて混合した。試験される凍結保存されたCLL原発腫瘍細胞を、1.6%のAE、10%(vol/vol)のヒト血清、2%のHEPES、1%の抗生物質、および1%のL−グルタミン200mMを補足したAIM−V(AIM−V(登録商標)+Albumax(登録商標)(BSA 1X))において、HS−5細胞株の融合層(confluent layers)上で100:1の比率で培養した。細胞を、以下の対のサイトカインの組み合わせで刺激した:5%のCO2を含有している加湿空気中の37℃での96時間の1μg/mlのCpG ODN+50ng/mlのIL−2。CLL細胞の生存率(アネキシンV染色によって評価された)および増殖(CFDA色素によって評価された)は、患者にわたる作用の範囲を網羅する8濃度のイブルチニブ(N=15)およびイデラリシブ(N=21)で試験される。図10A−Cは、サンプルからの用量反応(DR)曲線を示し、ここで灰色線はそれぞれ、異なるサンプルを表わしている。B細胞の生存指数は、100%で開始してY軸に表示され、X軸は、イブルチニブ(図10A)またはイデラリシブ(図10B)の薬物濃度を表わしている。図10Aおよび図10Bにおける左のパネルは、非増殖性(NP)生存腫瘍細胞における各薬物の効果を示し、右のパネルは、増殖性(PR)細胞分画における薬物の効果を示している。図10Aおよび図10Bは、イブルチニブ(A)およびイデラリシブ(B)両方がNP分画に対してほとんど効果がないことを実証しており、これは薬物の直接的なアポトーシス促進活性が制限されることを示唆している。対照的に、増殖の強力な阻害が、増殖(PR)をほぼ完全にブロックする低いnM範囲内で観察される。図10Cは、イブルチニブおよびイデラリシブに対するNP(灰色線)およびPR(暗線)の細胞サブセット両方の中央値を示し、NP細胞対PR細胞の感受性の明確な差を反映している。これらの結果は、イブルチニブおよびイデラリシブなどの薬物の効果を予測するためにAE、間質細胞およびサイトカインの追加とともにここで表わされる、CLLのインビボでの微小環境を再構築する必要性を反映している。
AMLおよびMDSは両方とも、それらのCD34+の発現によって特定され得る多能性造血幹細胞中の悪性腫瘍に関連付けられている。これらの細胞は、エクスビボで生存可能状態を維持することが難しいことが判明し、増殖のレベルは非常に低い。血清、培地またはAEの適切なソースは、CD34+細胞死を回避する及び特定のサイトカインでの増殖を可能にするために使用されるべきである。これらの実験では、骨髄異形成症候群(MDS)の患者からのBMから得られた、凍結保存された初代細胞(単核)を試験した(図11)。7つの異なる条件を、対照を加えて試験し、これは、対照が100ng/mlの幹細胞因子(Peprotech, London, United Kingdon)+50ng/mlのIL−3を含有しているMyeloCultH5100培地(Stemcell Technologies, Vancouver, Canada)を含有していたことを除くすべての条件で、それぞれ3つの時間、24時間、48時間および72時間(各々三通りで)に対して行われた。下記の番号はそれぞれ、サンプルセットに加えられた異なる成分を示し、図11上の番号にも対応しており、結果を示している:
1.HS5細胞株の上清の+10%(vol/vol)。
2.HS5細胞株の上清の+20%(vol/vol)。
3.正常な骨髄(NBM)からの+1.6%のAE(血漿および赤血球分画)。
4.+10%(vol/vol)のヒト血清(HS)。
5.+20%(vol/vol)のヒト血清、RPMI+20%(vol/vol)のウシ胎児血清(FBS)。
6.HS5細胞株+20%(vol/vol)のウシ胎児血清(FBS)の+高いコンフルエント。
7.HS5細胞株+20%(vol/vol)のウシ胎児血清(FBS)の+低いコンフルエント。
CLLサンプルが示すように、異なるサイトカインの組み合わせおよび/またはAEを加えることで、B−非ホジキンリンパ腫(B−NHL)一次サンプルの生存率または増殖を改善しうる(図12AおよびB)。本実験では、アネキシンVおよびCFDAを用い、2つの異なる時間、72時間と96時間、異なる条件で、前述したように生存率(Y軸)と増殖(X軸)の両方をテストした。凍結保存された4つのB−NHL原発腫瘍サンプルが含まれた。すなわち、2つの濾胞性リンパ腫(FL)および2つの脾辺縁帯リンパ腫(SMZL)である。表3に示されるように、生存率と増殖の最適化のために15の異なる条件がテストされた。表3の各条件の数字は、図12のサンプルに対応する。本実施例に使用された該AEは、濃度1.6%(vol/vol)の血漿と赤血球分画より成る。
MM患者から得られた骨髄サンプルは、生存率と増殖速度を維持するための最良の条件を判定することを目的として評価された。様々なサンプルの処理が、腫瘍細胞の生存率および/または増殖にどのように影響するかを判定するために分析された。さらに、各サンプルはアッセイでの使用に先立ち、異なる処理を施された。条件は以下のとおりである:
A.MM患者の骨髄全体+FBS(20%)。
B.フィコール・ハイパック遠心法によって該MMサンプルより分離された骨髄単核細胞+自己由来血漿(5、10、20および50%)および赤血球。
C.(塩化アンモニウム溶液とBulkLysis Cytognosによって)溶解された赤血球を含む骨髄全体+自己由来血漿(20%)。
腫瘍細胞の処置に使用されるいくつかの薬物は、活発に増殖する細胞を優先的に標的とし、抗増殖剤として作用する。この一例は、MMを診断された患者を処置するためのレナリドミドの使用である。レナリドミドの効能を、MM原発腫瘍細胞に対するエクスビボアッセイで評価するのは難しい。なぜなら、従来、使用されてきた条件下では、これらの細胞の増殖のレベルは極めて低いからである。本実施例では、MMを診断された10人の患者から得たBMサンプルを、エクスビボアッセイでテストした。AE(血漿のみ)は、増殖のレベルを増大させるために培地に加えられ、レナリドミドは0.03〜30μMの濃縮範囲に渡ってテストされた。
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Claims (28)
- 薬物又は薬物の組み合わせに対する初代細胞集団の細胞応答性を試験するためのエクスビボの方法であって、
i)末梢血(PB)、骨髄(BN)、又はリンパ節(LN)から選択される被験体の全体のサンプルを、血漿分画、赤血球分画、又はそれらの組み合わせから成る、白血球の無い人工環境(AE)を分離させるための分離プロセスに送る工程、
ii)前の工程で得た白血球の無いAEを初代細胞集団と混合する工程、
iii)工程ii)の混合物に、少なくとも1つの試験される薬物を加える工程、
iv)試験される薬物が初代細胞集団上で活性を及ぼすことを可能にするために、工程iii)で得た混合物を2時間から14日間までにわたりインキュベートする工程、
v)試験された薬物がある状態又は無い状態で初代細胞集団の生存率及び/又は増殖を評価する工程、
vi)試験される薬物がある状態及び無い状態で行われる評価の間に原発腫瘍細胞集団の生存率及び/又は増殖に関する比較データを生成し、得られたデータを初代細胞集団の生存率及び/又は増殖の減少/増大のための薬物活性を示す値に関連づける、工程
を含む、エクスビボの方法。 - 血漿分画及び赤血球分画の組み合わせは1:1の比率である、ことを特徴とする請求項1に記載のエクスビボの方法。
- 初代細胞集団は原発腫瘍細胞集団である、ことを特徴とする請求項1又は2に記載のエクスビボの方法。
- 全体のサンプルはヒト由来である、ことを特徴とする請求項1乃至3の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 白血球の無いAEは、健康なドナー、又は癌に悩んでいた或いは悩んでいるドナー由来である、ことを特徴とする請求項1乃至4の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 白血球の無いAEは、数人のドナーから得られ、初代細胞集団及び/又は試験される薬物と混合される前に共にプールされる、ことを特徴とする請求項1乃至5の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 白血球の無いAEは、初代細胞集団が得られる患者と同じ疾患に悩むドナー、又は初代細胞集団を提供する患者とは異なる疾患に悩むドナーから得られ、或いは代替的に、白血球の無いAEは健康なドナーから得られる、ことを特徴とする請求項1乃至6の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 白血球の無いAEは初代細胞集団を提供する同じ被験体から得られる、ことを特徴とする請求項7に記載のエクスビボの方法。
- インキュベーション混合物はまた、少なくとも1つの可溶性因子、及び/又は、インビボの主要微小環境細胞集団に見出される細胞型の少なくとも1つの追加の細胞集団を含む、ことを特徴とする請求項1乃至8の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 少なくとも1つの可溶性因子は、腫瘍由来エキソソーム、シグナル分子、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、インターロイキン、及び腫瘍細胞又は非腫瘍細胞由来の任意の可溶性の分子から選択される腫瘍内微小環境の非細胞成分である、ことを特徴とする請求項9に記載のエクスビボの方法。
- 少なくとも1つの可溶性因子は、インターロイキン(IL)−2、IL−4、IL−6、IL−8、IL−10、IL−13、IL−15、IL−21、分化(sCD)40リガンドの可溶性クラスタ、免疫グロブリン(Ig)M、CpG、被メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む短い合成一本鎖DNA分子、B細胞活性化因子(BAFF)、及び増殖誘導リガンド(APRIL)から選択される、ことを特徴とする請求項10に記載のエクスビボの方法。
- 少なくとも1つの追加の細胞集団は、繊維芽細胞の細網細胞、ナース様細胞、間葉系幹細胞、濾胞樹状細胞、内皮細胞、周皮細胞、及び初代間質細胞由来の細胞株から選択される、ことを特徴とする請求項9に記載のエクスビボの方法。
- 初代間質細胞由来の細胞株は、HS−5、HS27a、UE6E7T−2、NK−Tert、HMEC−1、KUSA−H1、M210B4、ST−2、及びKUM−4から選択される、ことを特徴とする請求項12に記載のエクスビボの方法。
- 少なくとも1つの可溶性因子及び/又は追加の細胞集団は、ヒト以外の他の種に由来する、ことを特徴とする請求項9乃至13の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 初代細胞集団は、それらの使用の前に新鮮に抽出され、或いは凍結保存され、使用前に解凍される、ことを特徴とする請求項1乃至14の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 凍結保存された初代細胞集団はAEと共に解凍される、ことを特徴とする請求項15に記載のエクスビボの方法。
- 原発腫瘍細胞集団は、癌のための前処置を受けなかった患者から抽出され、或いは、前記癌のための1以上の前処置を受けた癌患者から抽出され、又は、原発腫瘍細胞集団は微小残存病変(MRD)を持つ患者から抽出される、ことを特徴とする請求項1乃至16の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 原発腫瘍細胞集団は固形腫瘍から得られる、ことを特徴とする請求項1乃至17の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 固形腫瘍は、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺非小細胞癌、小腸の癌、食道癌、黒色腫、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、子宮癌、ファロピウス管の細胞腫、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、子宮内膜の細胞腫、頚部の細胞腫、膣癌、外陰癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、膀胱癌、腎臓癌若しくは尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)の腫瘍、中枢神経原発リンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎軸腫瘍、前記癌の転移巣、又はそれらの組み合わせを含むリストから選択される、ことを特徴とする請求項18に記載のエクスビボの方法。
- 前記方法は、スフェロイド、細胞外マトリックスゲル、合成スキャフォールド、回転式細胞培養システム、又は低/非接着性培養プラスチックから選択される、固形腫瘍の微小環境構造を模倣するために構築された、3D細胞培養構築物を含む、ことを特徴とする請求項17乃至19の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 初代細胞集団は、血液学的疾患、自己免疫疾患、血液凝固異常、又は貧血から得られる、ことを特徴とする請求項1乃至20の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 血液学的疾患は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(例えばB細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病)、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、又は急性リンパ性白血病を含むリストから選択される、ことを特徴とする請求項21に記載のエクスビボの方法。
- 試験される少なくとも1つの薬物は、化学療法薬物、標的化された抗癌療法薬物、腫瘍溶解性の薬物、細胞毒性薬、免疫療法薬物、サイトカイン、微小環境を標的とする薬物、副刺激分子の活性剤、抑制分子の阻害剤、又は細胞免疫療法剤を含むリストから選択される少なくとも1つの薬剤を含む、ことを特徴とする請求項1乃至22の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 初代細胞集団の細胞応答の評価は、パラメータとして、生存率、増殖、アポトーシス、細胞不足、表面マーカーの発現における変化、サイトカイン/ケモカインの生産における変化の少なくとも1つを測定することを含む、ことを特徴とする請求項1乃至23の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 初代細胞集団はプールされたウェルに由来する、ことを特徴とする請求項1乃至24の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 処置を開始した後、被験体に処方された処置の効力を判定するために使用される、請求項1乃至25の何れか1つに記載のエクスビボの方法。
- 効力の判定は、処置を開始して少なくとも7日後である、ことを特徴とする請求項26に記載のエクスビボの方法。
- 請求項1乃至27の何れか1つに記載のエクスビボの方法における、富化された血漿分画、赤血球分画、又はそれらの組み合わせから成る、白血球の無いAEの使用。
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