WO2002036154A2 - Procollagen (iii)-propeptide und verwandte substanzen zur behandlung von fibrotischen erkrankungen - Google Patents

Procollagen (iii)-propeptide und verwandte substanzen zur behandlung von fibrotischen erkrankungen Download PDF

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Procollagen (Ill) propeptides and related substances for the treatment of fibrotic diseases are included in Procollagen (Ill) propeptides and related substances for the treatment of fibrotic diseases.
  • the invention relates to the use of procollagen (III) propeptides and related substances for the treatment of fibrotic diseases, and to a method for producing and renaturing recombinant N- and / or C-terminal procollagen (III) propeptide.
  • the Procollagen (Ill) propeptides and related substances are suitable for the treatment of fibrosis of any genesis and organ manifestation.
  • the invention also relates to a method for producing renatured N-terminal procollagen (III) propeptide and / or C-terminal procollagen (III) propeptide.
  • Type I and III collagens are synthesized as prepropetides and are extensively modified post-translationally.
  • the intracellular modifications include, inter alia, glycosylations and enzymatic hydroxylation reactions which relate to lysine amino acid residues and proline amino acid residues in positions 3 and 4 of the imidazole ring.
  • the modified propeptides spontaneously assemble into (oc 1 (NI)) 3 homotrimers.
  • collagen type I mainly ( ⁇ (l)) 2 ⁇ 2 (l) heterotrimers are formed and to a lesser extent also ( ⁇ (lll)) 3 Homotrimer.
  • the propeptides are cleaved at the C-terminal and then N-terminal on the nascent collagen by specific endoproteases.
  • the C-terminal procollagen (III) propeptide (PIIICP) is cleaved by the procollagen C proteinase, which is identical to Bone Morphogenetic Protein-1 (BMP-1) (Kessler 1996). Tissue-specific expression patterns of different splicing variants of the BMP-1 protein were found (Janitz 1998).
  • the N-terminal procollagen propeptide of collagen I (PINP) is cut by the same N-proteinase that also degrades the N-terminal procollagen propeptide of type II collagen.
  • procollagen-N-proteinase of type (III) is due to an enzymatic activity that is separate from that of the N-proteinase (I and II).
  • the enzyme responsible for this is called procollagen-N-proteinase of type (III).
  • PIIICP occurs as a trimer consisting of three identical monomeric PIIICP subunits. The subunits are connected by intermolecular disulfide bridges.
  • Theoretical structural considerations and targeted mutagenesis experiments with so-called collagen minigens have shown that at least 4 and probably even 6 of the 8 cysteine residues of a monomeric PIIICP subunit are involved in the formation of intramolecular disulfide bridges. Probably only the cysteine residues in positions 51 and 68 are involved in the formation of intermolecular disulfide bridges.
  • PIIICP does not have any pharmacokinetic studies. Clearance and elimination mechanisms were only investigated for PICP. For 125 l-labeled PICP, elimination from the serum by the mannose-6-phosphate receptor was described by competition experiments (Smedsrod 1990). Endocytosis through the mediation of this receptor would also be possible with PIIICP, since PIIICP has a glycosylation site in Asn173 (Dion 1987). However, this mechanism can be ruled out for recombinant PIIICP from E. coli because the protein is present in this host without glycosylations due to the expression.
  • the nucleotide sequence of the human PIIICP is stored in the genebank (Accession No. X14420, Ala-Kokko 1989, and X01742, Loidl 1984).
  • the amino acid sequences of this propeptide are given by way of example in FIG. 1 (I).
  • the propeptide sequence has been identified in the system in the overall sequence of the corresponding procollagen sequences C-terminal from the procollagen-C-proteinase interface.
  • the stimulating effect was highly dependent on the degree of confluence of the cells. While an effect could be shown in subconfluent fibroblast cells, this was no longer detectable in confluent cells. The effects were neither line-specific nor species-specific.
  • the polypeptide sequence necessary for the stimulation of the collagen biosynthesis rate could be reduced to a pentapeptide (amino acid residues 212-216), whereby 80% of the original maximum stimulation occurred (Katayama 1993).
  • fibronectin with factor 5-11 showed a significantly stronger stimulation of the synthesis rate compared to type I collagen (factor 4-7).
  • the mRNA concentrations of the affected genes were also examined. No changes in concentration were measured at the mRNA level in either the collagens or fibronectin (Katayama 1991). The influence of the synthetic polypeptides on the stimulation of collagen biosynthesis was therefore at the post-transcriptional level.
  • PIIINP occurs as a trimer, which consists of three identical monomeric PIIINP subunits, which are interconnected by intermolecular disulfide bridges.
  • the PIIINP molecule is structurally divided into three domains.
  • the most N-terminal domain (CoM) has a globular structure and contains several intramolecular cysteine bridges.
  • the so-called Col3 domain adjoining the C-terminal has a collagen-like structure that contains periodically recurring Gly and Pro residues. It forms a characteristic collagen triple helix structure.
  • the Col 2 domain contains those parts of the procollagen telopeptide region which are N-terminal to the interface of the N-proteinase (III). In this region, the monomeric PIIINP strands are arranged parallel to one another.
  • type III collagen A special feature of type III collagen is that some of the N-terminal propeptides in the procollagens are not split off. This so-called pN collagen type III is nevertheless built into fibrils (Fessler 1979). The shape of the fibrils is described differently: as thin fibrils associated with type I collagen (Keene 1987) or as thin pearl-like fibrils that associate with network-like structures (Amenta 1986). When viewed under electron microscopy, pN collagen type III has the appearance of a 'barbed wire' due to the still present PIIINP (Davis 1987). The presence of pN collagen type III on the outside of collagen fibrils could play a role in the regulation of fibril diameters (Schuppan 1991).
  • the amino acid sequence of the human PIIINP is stored in the Genebank database with the accession number X14420 (Ala-Kokko 1989).
  • the example is Amino acid sequences of this propeptide are given in Figure 1 (II).
  • the propeptide sequence has been identified in the plant in the overall sequence of the corresponding PIIINP sequence N-terminai in the vicinity of the type III procollagen-N proteinase interface.
  • PIIINP has so far been primarily described as a fibrosis marker (Boigk, 1997).
  • a framework of possible therapies for liver fibrosis can be used as a non-invasive course parameter (Afdahl, 1997).
  • procollagen (III) propeptides The recombinant production of procollagen (III) propeptides has been described in a number of publications. Lee, 1990, describes the recombinant production of a collagen ⁇ 2 (l) mutant in so-called A2 cells, which are derived from the epithelial liver cell line W8, which in turn is deficient in the production of collagen ⁇ 2 (l).
  • A2 cells which are derived from the epithelial liver cell line W8, which in turn is deficient in the production of collagen ⁇ 2 (l).
  • the recombinant expression of collagen ⁇ (III) Minigene is described in two recent publications (Lees 1994; Bulleid 1996).
  • the expressed proteins contained an N-terminal His tag, so that they could also be purified in denaturing solvents using a Ni-NTA column.
  • These proteins were less suitable for chronic in wVo applications because the His day is potentially immunogenic and the biological half-life of the recombinant protein can therefore be shortened. They were predominantly in monomeric form under the methods given in this application, and their solubility in aqueous solutions was too low for most therapeutic applications.
  • Exceeding concentrations of approx. 10 ⁇ g / ml led to the precipitation of the recombinant PIIICP from aqueous solutions.
  • Fibrotic diseases are understood to mean a diverse group of diseases that are associated with a qualitatively altered collagen production or with an increased deposition of collagen in the extracellular space. This group of diseases includes systemic or local scleroderma, liver fibrosis of various origins, e.g.
  • fibrotic diseases can be initiated or caused by surgical scar revisions, plastic surgery, glaucoma, cataract fibrosis, scarring of the cornea, the so-called "graft versus host disease", surgical interventions on tendons, nerve pinching syndromes, Dupuytren's contracture, adhesions as a result of gynecology Interventions, Pelvic adhesions, infertility, peridural fibrosis, diseases of the thyroid or parathyroid glands, due to metastatic bone attack, multiple myeloma or restenosis. Therapy for many of these diseases has so far not been successful. Others have a need for improved approaches or for reducing side effects. From the foregoing, there is a further need to provide effective drugs against fibrotic diseases. This object is achieved by the embodiments characterized in the examples.
  • the present invention thus relates to a composition, preferably a medicament, comprising (a) a (poly) peptide which is the N-terminal procollagen (III) propeptide and / or the C-terminal procollagen (III) propeptide or (b) a fragment or derivative thereof having essentially the antifibrotic activity of (poly) peptide (a) and / or (c) a peptide which contains the recognition sequence of the type III procollagen C protease and / or a peptide which comprises the recognition sequence of Type III procollagen N proteinase, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • a (poly) peptide which is the N-terminal procollagen (III) propeptide and / or the C-terminal procollagen (III) propeptide means in the sense of the invention that the (poly) peptide is the N- is terminal or the C-terminal procollagen (III) propeptide, to which further amino acid sequences can optionally be connected N-terminal or C-terminal, so that a longer (poly) peptide results.
  • the additional sequences can come from procollagen or can be heterologous or artificial sequences.
  • (Poly) peptides are preferred which, in addition to the (human) PIIICP or PIIINP amino acid sequence, also have possible procollagen C or procollagen N proteinase interface recognition sequences.
  • the term “a fragment or derivative thereof having essentially the antibiotic activity of the (poly) peptide (a)” means that this fragment or derivative is at least 50%, preferably 75%, more preferably 85%, particularly preferably 90% of the antifibrotic Has activity of the N-terminal or C-terminal procollagen / propeptide.
  • Derivatives of the (poly) peptide may be other than that contain natural amino acids or substituted amino acids. Derivatives can be made, for example, by peptidomimetics.
  • polypeptide relates to both polypeptides and peptides.
  • a peptide usually contains no more than 30 amino acids.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents are known to the person skilled in the art and include, for example, phosphate-buffered saline solutions, water, emulsions, such as, for example, oil / water emulsions, various types of wetting agents or detergents, sterile solutions, etc.
  • Carriers can be formulated using known conventional methods. These drugs can be administered to an individual in an appropriate dose. Administration can be oral or parenteral, for example intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intramuscular, local, intranasal, intrabronchial, oral or intradermal, or via a catheter at one location in an artery.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions and emulsions.
  • non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and organic ester compounds such as ethyl oleate, which are suitable for injections.
  • Aqueous carriers include water, alcoholic-aqueous solutions, emulsions, suspensions, Saline solutions and buffered media.
  • Parenteral carriers include sodium chloride solutions, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, Ringer's lactate, and bound oils.
  • Intravenous carriers include, for example, liquid, nutrient and electrolyte supplements (such as those based on Ringer's dextrose.
  • the drug may also include preservatives and other additives such as antimicrobial compounds, antioxidants, complexing agents and inert gases.
  • preservatives and other additives such as antimicrobial compounds, antioxidants, complexing agents and inert gases.
  • other active ingredients such as interleukins, growth factors, differentiation factors, interferons, chemotactic proteins or a non-specific immunomodulatory agent may be included.
  • the treating doctor determines the type of dosage according to the clinical factors. It is known to the person skilled in the art that the type of dosage depends on various factors, such as, for example, the body size or weight, the body surface, the age, gender or general health of the patient, but also on the agent to be administered specifically, the duration and mode of administration, and other medications that may be administered in parallel.
  • a typical dose can be, for example, in a range between 0.001 and 1000 ⁇ g, doses below or above this exemplary range being conceivable, especially taking into account the factors mentioned above.
  • the dose should be in a range between 1 ⁇ g and 10 mg units per day.
  • the active substances in these preparations will usually be present in a concentration of greater than 10 ⁇ g / ml of a physiological buffer. However, they can also be present in solid form in a concentration of 0.1 to 99.5% by weight of the total mixture.
  • the active ingredient (s) in total amounts of about 0.001 to 100 mg / kg, preferably in total amounts of about 0.01 to 10 mg / kg body weight per 24 hours, optionally as a continuous infusion or in the form of several Single doses to be administered to achieve the desired result. If the composition is administered intravenously, the dose should range between 1 ⁇ g and 10 mg units per kilogram of body weight per day.
  • the drug can be administered locally or systemically.
  • the (poly) peptide or fragment or derivative and / or the peptide derives from or is derived from human procollagen (III).
  • the (poly) peptide comprising the recognition sequence comprises 10 to 15 amino acids N-terminal from the cleavage site.
  • the (poly) peptide comprising the recognition sequence comprises 10 to 15 amino acids C-terminal from the cleavage site.
  • the (poly) peptide is a fusion protein.
  • the (poly) peptide contains a His tag.
  • the His tag can be attached at the C-terminal or N-terminal.
  • the His tag 6 His tag and N-terminal is added.
  • the present invention relates to the use of a (poly) peptide or fragment or derivative thereof described above for the manufacture of a medicament or medical device for the treatment or prevention of fibrotic diseases.
  • the fibrotic diseases are selected from systemic or local scleroderma, liver fibrosis of various origins, such as alcoholic cirrhosis of the liver, biliary cirrhosis, hepatitis viral or other genesis, the so-called "veno-occlusive disease", idiopathic interstitial fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, acute pulmonary fibrosis, the "acute respiratory distress syndrome” (ARDS), perimuscular fibrosis, pericentral fibrosis, dermatofibromas, kidney fibrosis, diabetic nephropathy, glomerulonephritis, keloids, hypertrophic scarring, joint adhesions, arthrosis, corneal fibrosis, myelofibular fibroids muscular fibrosis, Duchenne muscular dystrophy, esophageal strictures, Ormond 's disease, Crohn' s disease, ulcerative colitis, atheros
  • the present invention relates to processes for the production of renatured N-terminal procollagen (III) propeptide and / or C-terminal procollagen (III) propeptide, where (a) recombinantly produced with E. coli by conventional methods, the / dissolve the inclusion bodies containing propeptide (s) in a 0.5 to 8 M denaturing buffer; (b) the buffer according to (a) is added dropwise to a limit dilution buffer which buffers around a neutral pH, contains L-arginine in a final concentration of 200 to 1000 mM and a disulfide bridge-reducing coupled redox system until a volume ratio of the denaturing buffer to limit dilution buffer reached at most 1: 3; (c) dialyzing the buffer mixture according to (b) for at least 2 hours against a physiological buffer containing L-arginine in a final concentration of 50 to 200 mM and a disulfide bridge-reducing coupled redox system; (d) dialyzing the buffer mixture
  • the buffer in step (d) contains no arginine and in step (e) neither arginine nor the redox system.
  • Example 4 shows the use of after this Methods of renatured procollagen propeptides in animal models of liver fibrosis are described.
  • the buffer is in at least one of the steps
  • the chelator is preferably EDTA, for example in a final concentration of 10 mM.
  • the redox system glutathione is reduced - glutathione is oxidized.
  • the components of the redox system have the concentrations given in Example 2.
  • a further protease inhibitor is added to the buffer in at least one of steps (b) to (d).
  • the protease inhibitor Pefabloc SC is preferred.
  • the buffer is in one of the steps
  • a salt is added to a final concentration of about 10 mM.
  • the salt is preferably NaCl.
  • the limit dilution and dialysis buffers have the concentrations given in Example 2.
  • the denaturing buffer contains in
  • Step (a) urea at a final concentration of 0.5 to 8 M.
  • the buffer preferably contains urea in a final concentration of about 6 M.
  • Trizma base is used as the buffering agent.
  • the dialysis steps are carried out at about 4 ° C.
  • dialysis is carried out in steps (c) to (e) against at least 100 times the dialysis buffer volume.
  • the present invention relates to a method for producing a medicament, wherein the renatured N-terminal procollagen (III) propeptide and / or C-terminal procollagen (III) propeptide produced by the method according to the invention is concentrated or lyophilized by and with conventional methods added to a pharmaceutically acceptable carrier or with a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the present invention relates to the use of an N-terminal procollagen (III) propeptide and / or a C-terminal procollagen (III) propeptide, which was prepared by the method according to the invention, for the treatment or prevention of fibrotic diseases.
  • the fibrotic diseases are selected from systemic or local scleroderma, liver fibrosis of various origins, such as alcoholic cirrhosis of the liver, biliary cirrhosis, hepatitis viral or other genesis, the so-called "veno-occlusive disease", idiopathic interstitial fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, acute pulmonary fibrosis, the "acute respiratory distress syndrome” (ARDS), perimuscular fibrosis, pericentral fibrosis, dermatofibromas, kidney fibrosis, diabetic nephropathy, glomerulonephritis, keloids, hypertrophic scarring, joint adhesions, arthrosis, corneal fibrosis, myelofibular fibroids muscular fibrosis, Duchenne muscular dystrophy, esophageal strictures, Ormond's disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, atheroscler
  • Table 1 shows the body weight at the end of the experiment, relative liver weight, GIDH serum activities, collagen type III and type I and TGFß mRNA concentrations after chronic application of various procollagen ⁇ (III) propeptides in the mouse CCI 4 model. Differences in mRNA concentration according to TaqMan analysis are given as - ⁇ ct- values in comparison to the intact control. (Mean ⁇ SEM)
  • Table 2 shows the body weight at the end of the experiment, relative liver weight, GIDH serum activities, collagen type III and type I and TGF ⁇ mRNA concentrations after chronic application of different concentrations of the PIIICP4.1 protein in the mouse CCI 4 model. Differences in mRNA concentration according to TaqMan analysis are as - ⁇ ct values compared to the intact control. (Mean ⁇ SEM)
  • Figure 1 (I) shows the amino acid sequences in the region of the human C-terminal procollagen (III) propeptide (PIIICP).
  • the N-terminal end of the prosequence is formed by the procollagen-C-proteinase interface (see arrow).
  • the actual propeptide sequence is printed in bold.
  • the sequence section that is in the vicinity of the procollagen C proteinase interface is underlined.
  • Figure 1 (II) shows the Amino acid sequences in the area of human N-terminal procollagen (III) propeptide (PIIINP).
  • the N-terminal end of the prosequence is adjacent to the presequence.
  • the procollagen-N-proteinase interface is indicated by an arrow.
  • the actual propeptide sequence is printed in bold.
  • the section of the sequence which is in the vicinity of the procollagen-N-proteinase interface is underlined.
  • FIG. 2 shows the PlllCP serum concentration curve in the anesthetized rat model.
  • the terminal half-life was approx. 80 min, the terminal volume of distribution was approx. 7.4 l / kg and the elimination rate was approx. 6.3 l / (h * kg). See Example 3 in the specification for details.
  • Figure 3 shows (A) total collagen area and (B) CTGF mRNA concentration after chronic application of various procollagen ⁇ (III) propeptides in the mouse CCI 4 model (mean ⁇ SEM).
  • FIG. 4 shows (A) total collagen area fraction and (B) CTGF mRNA concentration after chronic application of different concentrations of the PIIICP4.1 protein in the mouse CCI 4 model (mean ⁇ SEM). See Example 4 in the specification for details.
  • FIG. 5 shows immunohistochemical studies on the localization of the PIIICP antigen on representative sections from rat liver.
  • the anti-PIIICP monoclonal antibody 48D19 was used.
  • A intact control after seven days infusion of a buffer control solution (240-fold);
  • B CCI 4 -induced liver fibrosis after seven days of PlIICP protein infusion (400-fold);
  • C CCI-induced liver fibrosis after a seven-day infusion of a buffer control solution (fibrosis control, 320-fold).
  • PIIICP was produced in E. coli in the form of inclusion bodies (Burchardt 1998).
  • the cell paste of three 200 ml cultures in each case was resuspended in 24 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 M NaCl, frozen overnight at -20 ° C. and centrifuged after thawing (5,000 g, 10 min ).
  • 4.8 ml of the same buffer were added to the precipitate, and 4.8 ml of 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mg / ml lysozyme and 4.8 ml of a 0.5 M EDTA solution (pH 8 , 0) added.
  • the pellet was then dissolved in 24 ml of 1 M urea, 1 mM EDTA, dissolved in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), with ultrasound and centrifuged again after 30 min of incubation (5,000 g, 10 min).
  • the pellet consisted of almost pure PIIICP in the form of inclusion bodies.
  • the protein could be dissolved in 6 M urea, dissolved in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). If the sample was centrifuged at 15,800 g for 30 min, the inclusion body protein remained in the supernatant.
  • recombinant human PIIICP4.1 the genetic engineering of which was described in Burchardt, 1998, and in the patent applications: An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide (WO09924835A2 and EP00988964A1) was renatured.
  • recombinant human PIIINP 4.5.2. renatured, the genetic engineering of which is described in the patent application: Monoclonal antibody and assay for detecting PIIINP (WO09961477A2).
  • recombinant murine PIIINP the genetic engineering of which is described in Kauschke, 1999, was also renatured using the method described below.
  • the method is in no way limited to the renaturation of these propeptides mentioned by way of example, but is suitable for the renaturation of other procollagen propeptides and similar compounds.
  • Dialysis buffer 300 mM Trizma base, pH 7.4
  • the collagen ⁇ - ⁇ (III) propeptides can be dissolved in a 6 M urea buffer.
  • the buffer conditions of the proteins were changed abruptly by a limited dilution step.
  • a redox system in the target buffer favored the formation of disulfide bridges.
  • the protein solution was dripped into an excess of ice-cold limited dilution buffer with gentle shaking. This batch was stored at 4 ° C overnight.
  • All dialysis steps took place at 4 ° C. Each step was dialyzed against 100-fold buffer volume for at least three hours. The limited dilution approach was transferred to a tube of suitable pore size and dialyzed against the dialysis buffer. In the next dialysis steps the L-arginine concentration was reduced to 100 mM, then a buffer without L-arginine was used. The fourth buffer also lacked the glutathione redox system. The final buffer was selected according to the intended use. For in v / Vo experiments it consisted, for example, of 10 mM Trizma base, pH 7.4, 145 mM NaCl. The dialysate was then stored at 4 ° C.
  • Example 3 Measurement of the elimination kinetics of renatured PIIICP in the anesthetized rat
  • PIIICP plate ELISA The determination of PIIICP concentrations in biological samples was carried out in a sandwich ELISA assay. Two monoclonal anti-PIIICP antibodies were used (Burchardt 1998).
  • Antibody 48B14 (Burchardt, 1998) was immobilized on the test plate in a concentration of 5 ⁇ g / ml as a capture antibody. After blocking free binding sites on the plate by incubation with a 3% (v / v) BSA solution in PBS biological samples or buffer solutions with known PIIICP concentrations together with a known concentration of FITC-labeled secondary antibody (48D19) (Burchardt, 1998) were added to the immobilized primary antibody for 30 min. Unbound PIIICP antigen and still unbound secondary antibody were then removed by washing steps and the amount of bound, labeled secondary antibody was determined. The above antibodies can be replaced with other anti-PIIICP antibody pairs that can be prepared by conventional methods (Harlow and Lane, 1988).
  • Liquids or substance dilutions were administered via a catheter in the jugular vein.
  • the blood pressure was measured and the blood was drawn using a catheter in the aorta femoralis. A tracheal incision was made to facilitate spontaneous breathing.
  • the animals received infrared heat radiation. After opening, the animals received a bolus of 5 ml of physiological saline per kg body weight to compensate for the loss of blood.
  • the substance dilutions in physiological buffer solution (10 mM Trizma base, pH 7.4, 145 mM NaCl) were administered by a two-hour infusion of renatured PIIICP4.1 (Burchardt 1998) with a flow rate of 100 ⁇ l per kg body weight and minute (PIIICP4.1 concentration in the infusion solution approx. 150 ⁇ g / ml).
  • Blood samples were taken at 2, 60, 115, 150, 180, and 225 minutes after the start of the infusion in parallel with a recording of the respective blood pressure.
  • the terminal half-life was determined to be approximately 80 min. In the terminal curve area, 6.1% of the total area was still below the curve. The volume of distribution in the terminal phase was approx. 7.4 l / kg, the elimination rate was determined to be approx. 6.3 l / h / kg) (see FIG. 2).
  • the biological effectiveness of the substances can be demonstrated in cell culture assays and in vivo.
  • the drop in the concentration of free ⁇ - ⁇ (III) propeptide in the supernatants can be measured because this peptide is released by the activity of the PCP.
  • a recently established assay can be used to measure the PIIICP concentrations in the supernatant (Burchardt, 1997, and patent applications: An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide (WO09924835A2 and EP00988964A1)).
  • This patent application exemplifies the biological activity of PIIICP4.1 (preparation described in Burchardt, 1998, and in the patents: An immunoassay for procollagen III C-terminal propeptide (WO09924835A2 and EP00988964A1); Recovery and renaturation described above in this patent application as an example), PIIINP4.5.2 (preparation described in the patent: Monocional antibody and assay for detecting PIIINP (WO09961477A2); renaturation described above in this patent application as an example) and of murine recombinant PIIINP (production described in Kauschke, 1999; renaturation described above in this patent application as an example) in the model of CCI-induced liver fibrosis in the mouse.
  • animal models for other fibrosis manifestations e.g. in the heart, kidneys, lungs, skin or other organs.
  • the reduction of the collagen deposition of PIIICP and PIIINP by quantitative morphometry is described. It can also be done, for example, by determining the hydroxyproline content (Gerling, 1996) of the fibrotic organs or by quantitative morphometry (Kauschke 1999).
  • the example also describes the organ-protective effect of PIIICP and PIIINP by reducing cell damage, which is determined by measuring the activities of intracellular marker enzymes (eg GIDH).
  • the organ-protective effect can also be measured in another way, for example by measuring the inhibition of the extent of apoptosis and necrosis or the like.
  • Animal experiments The experimental animals were administered 0.2 ml of a mixture of CCI and mineral oil in a ratio of 1: 8 twice a week per 100 g body weight over the entire experimental period.
  • the substance was administered by daily intraperitoneal application of 0.5 ml of a substance dilution. In the fibrous and intact controls, buffer control solution without procollagen propeptides was applied.
  • the animals had free access to standard food and water throughout the experiment.
  • the body weight of the animals was measured at the beginning and at the end of the experiment. At the end of the test, the wet weight of the liver was determined, the liver portioned for the subsequent examinations and immediately snap-frozen in liquid nitrogen. Storage until use was at -80 ° C. Plasma samples were also taken from the test animals to determine clinico-chemical parameters.
  • RNA preparation from tissue About 20 mg of tissue was ground in liquid nitrogen and transferred to an Eppendorf reaction vessel. The tissue powder was mixed with 600 ul buffer RLT (with 0.1% (v / v) ß-mercaptoethanol), mixed homogeneously and applied to a QIAshredder column. The column was centrifuged at 18,000 g and 4 ° C for 2 min. The retained solids were discarded and the flow continued to be used. The following processing was carried out using the RNeasy Total RNA Kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions. Elution was carried out with 35 ⁇ l RNase-free H 2 0.
  • RNA content of each preparation was determined photometrically immediately following an aliquot, and a further sample was checked for the integrity of the RNA bands obtained using an RNA-formaldehyde agarose gel , Storage until use was at -80 ° C.
  • cDNA synthesis from total RNA The synthesis of the cDNA from the prepared total RNA samples was carried out in all cases using the SuperScript II preamplification system according to the manufacturer's instructions (Gibco BRL). All work steps were carried out on ice. In all cases, 1 ⁇ g of total RNA and master mixes were used. Prior to reverse transcription, any genomic DNA contamination in all samples was removed by DNase I digestion. For this purpose, 1 ⁇ g of total RNA was made up to a volume of 8 ⁇ l with RNase-free water, 1 ⁇ l of DNase I (Superscript Kit) and 1 ⁇ l of 10-fold buffer were added, and the digestion was carried out for 10 min at room temperature.
  • the DNase I digestion was stopped by adding 1 ⁇ l of 25 mM EDTA solution and subsequent incubation (10 min at 65 ° C.). The entire approach was used in cDNA synthesis. Following the cDNA synthesis, the batches were made up to a total volume of 100 ⁇ l Fill up with DNase-free water and store at -80 ° C until use. In all cDNA syntheses, random checks were carried out for genomic DNA contamination without the addition of reverse transcriptase.
  • Specific mRNA concentrations were determined by a TaqMan analysis. During the PCR reaction, specific hybridizing fluorescence-labeled probes are cleaved by exonuclease activity of the Taq polymerase and the resulting fluorescence signal is measured in real time. Results are given in the form of the number of cycles at which the fluorescence released exceeds a predetermined threshold value for the first time.
  • the parameter et (threshold cycle) specifies the arithmetically determined number of cycles at which the measured fluorescence signal for the first time delivers a specific signal value above the threshold value (threshold). Lower ct values indicate that there was a higher specific mRNA concentration in the original batch. The maximum possible product doubling with each cycle in the PCR reaction.
  • HPRT can serve as a standard, ie as a reference level.
  • primers and probes were selected with regard to their position on the gene and the amplification product to be expected so that in the context of the TaqMan PCR reaction a doubling of the product concentration was to be expected in each case per cycle. These assumptions were checked and confirmed in advance by control experiments.
  • the primers and the 6-FAM-labeled probes were all present in concentrations of 100 ⁇ M. In order to avoid variability between approaches, master mixes were used in all cases and at least double determinations for each approach. A single transcript was examined for all samples collected on a plate. In all investigations, controls without a template or without a previous reverse transcription reaction were carried out. All work took place under ice cooling.
  • the master mix contained 12.5 ⁇ l of the TaqMan Universal PCR Master Mix (Röche), 7.5 ⁇ l of a primer-probe mix (1 ⁇ M per primer and 0.5 ⁇ M probe in DNase / RNase-free water) as well as 3 , 75 ⁇ l DNase / RNase-free water.
  • 2.5 ⁇ l cDNA were placed in 96-well plates with optical lids and mixed with 22.5 ⁇ l of the master mix per batch. The plate was centrifuged for 1 min at 500 g and 4 ° C before the PCR reaction.
  • the program of the TaqMan PCR reaction included a heating phase of 2 min at 50 ° C, a ten-minute denaturation at 95 ° C and then 40 cycles with a denaturation at 95 ° C for 15 seconds and a combined one-minute annealing / expansion reaction 60 ° C. During the cycles, the fluorescence of the released probes was automatically measured at the time of denaturation. The evaluation was carried out with the ABI PRISM Sequence Detection Software. The baseline was set at the average of cycles 3 to 15, the threshold was 0.04. Results
  • Human PIIICP4.1 (preparation described in Burchardt, 1998, and in the patent applications: An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide (WO09924835A2 and EP00988964A1); recovery and renaturation described above in this patent application as an example) were used as therapeutic recombinant proteins.
  • human complete PIIINP 4.5.2 (preparation described in the patent: Monocional antibody and assay for detecting PIIINP (WO09961477A2); renaturation described above in this patent application as an example) and murine PIIINP with 18 amino acid residues of the prosequence (referred to as M1, preparation described in Kauschke , 1999; renaturation described above in this patent application as an example).
  • the total collagen area in liver sections, the GIDH activity in the serum and the mRNA concentrations of selected transcripts were measured morphometrically using a TaqMan analysis.
  • the proteins were well tolerated by the animals in the concentration used during the period examined. There were no pathological abnormalities, and there were no frequent deaths.
  • the morphometically determined total collagen area which is determined by automated Evaluation of the Sirius red-stained areas showed the highest values in the fibrosis control group (Kauschke, 1999).
  • the total collagen areas in the treatment groups were significantly reduced in all cases (FIG. 3A).
  • PIIICP4.1 to 71% of the fibrosis control p ⁇ 0.04
  • PIIINP 4.5.2 to 63% of the fibrosis control p ⁇ 0.01
  • M1 to 68% of the fibrosis control p ⁇ 0.02
  • CTGF When looking at the mRNA concentrations in the liver, CTGF showed a significant reduction in concentration in all treatment groups compared to fibrosis control (FIG. 3B).
  • GIDH serum activity was also reduced in all treatment groups compared to fibrosis control (Tabellel) (Kauschke, 1999). Serum activities were 17% (PIIICP4.1) and 11% (PIIINP 4.5.2, M1) lower than in the fibrosis control. Due to individual fluctuations, however, the deviations never reached the level of significance (p ⁇ 0.05).
  • the relative liver weight was above the intact controls in all CCI 4 groups.
  • the treated animals tended to have a slightly increased relative liver weight compared to the fibrosis control.
  • the absolute liver weights between the groups were not significantly different (Table 1).
  • More precise dose-effect studies of the in wVo effects after PIIICP4.1 infusion More precise studies of the in wVo effects of the recombinantly produced PIIICP4.1 protein (production described in Burchardt, 1998, and in the patent applications: An immunoassay for procollagen-III -C-terminal propeptides (WO09924835A2 and EP00988964A1); recovery and renaturation described above in this patent application as an example) on the formation of an experimentally induced liver fibrosis were carried out in the mouse CCI 4 model.
  • mice were treated with CCI (fibrosis control) or additionally with PIIICP4.1 protein solutions with concentrations of 50 ⁇ g / ml PIIICP4.1, 150 ⁇ g / ml and 500 ⁇ g / ml over a period of 14 days , In addition, one group was treated with buffer control solution only (intact control).
  • the total collagen area in liver sections, the GIDH activity in the serum and the mRNA concentrations of selected transcripts were measured morphometrically in all animals using the TaqMan analysis.
  • the relative liver weight was above the values of the untreated intact control in all CCI-treated groups. There were no significant differences when comparing the individual treatment groups with the fibrosis control (Table 2).
  • the treatment group with the highest protein concentration (500 ⁇ g / ml PIIICP4.1) showed significant fluctuations in the total collagen area measured within the treatment group and a reduction in the total collagen area by 31%. In comparison to the fibrosis control, the level of significance (p ⁇ 0.05) was not reached.
  • GIDH activity as a measure of cell damage determined in parallel in the serum was significantly reduced in the groups additionally treated with PIIICP4.1 protein solution compared to the fibrosis control (Table 2).
  • GIDH serum activity showed 68% of the activity of the fibrosis control, after 150 ⁇ g / ml PIIICP4.1 in 60% of the fibrosis control and after 500 ⁇ g / ml PIIICP4.1 in 67% the fibrosis control.
  • P ⁇ 0.05 the significance level was not reached due to the fluctuations in the results from animal to animal.
  • Model of liver fibrosis in the biliary ligated rat In fasted female Sprague-Dawley rats, the main biliary duct was isolated after barbiturate anesthesia after medial opening of the upper abdomen. The bile duct system was closed using an inserted catheter by applying approximately 0.1 ml of Ethibloc per animal. The bile duct was then ligated distally and proximally and severed. Intact control animals were also operated on, but the bile duct system was not blocked.
  • the PIIICP4.1 application (preparation described in Burchardt, 1998, and in the patent applications: An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide (WO09924835A2 and EP00988964A1); recovery and renaturation described above in this patent application as Examples 1 and 2) was carried out by means of a permanent venous infusion using an implanted indwelling catheter.
  • the femoral vein was implanted parallel to the bile duct occlusion.
  • the skin in the area of the right groin was opened and the vena femoralis isolated atraumatically and fixed by two ligatures.
  • a venous catheter was inserted into the heart and fixed.
  • the catheter was then guided subcutaneously to the neck using a trocar and the surgical wound was closed with a skin suture.
  • the venous catheter was connected via a collar to a rotation adapter connected to an infusion pump by a protection spiral.
  • 0.1 ml of Tardomyocel was applied subcutaneously postoperatively.
  • the start of the PIIICP4.1 infusion with a protein concentration of 300 ⁇ g / ml took place 24 hours after the operation. Buffer control infusions were given to intact and fibrosis controls. The infusion was carried out at a flow rate of 0.2 ml per hour over a period of seven days. The infusion solution was cooled (approx. 7 ° C) during the entire test period.
  • the rats spent the duration of the experiment in a round cage with free access to standard food and water.
  • the body weight of the animals was measured at the beginning and at the end.
  • the liver was portioned for the subsequent examinations and immediately snap frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C. until use.
  • Tissue fixation for immunohistochemistry The tissues for immunohistochemical examinations were fixed in 3.6% (v / v) formaldehyde solution for 24 h. After washing out with distilled water, the water was removed in an ascending row with ethanol and the tissues embedded in 52 ° C. paraffin.
  • the primary antibody (mouse anti-PIIICP antibody 48D19) was added in a concentration of 4 ⁇ g / ml in PBS and incubated for one hour at room temperature. After a further two washing steps, the ExtrAvidin Peroxidase Staining Kit (Sigma Aldrich) was used. The sections were incubated with biotinylated anti-mouse IgG's at a 1:15 dilution in PBS with 1% (w / v) BSA for 20 min at room temperature. After two washing steps, a 1:15 dilution of the ExtrAvidin peroxidase was treated at room temperature for 20 min.
  • tissue sections were developed using the DAB system (1 tablet per 5 ml of water) (Sigma Aldrich) for 10 minutes. Remains of the staining solution were distilled with H 2 0. away. The counter-staining of the cell nuclei was carried out with hemalum. The tissue sections were placed for 1 min in an acidic Mayer haemun solution (1: 4 dilution with dist. H 2 0), the dye was then washed with dist. H 2 0 washed out. The sections were blued by treating them with tap water for five minutes. After a washing step in H 2 0 dist. the cuts were drained.
  • FIG. 5 shows immunohistochemical investigations with the anti-PIIICP antibody 48D19 on representative sections from rat liver. Liver fibrosis was induced by bile duct ligation. A PIMCP protein or buffer control solution was then infused through a permanent catheter for seven days.
  • the fibrosis control showed severe damage to the liver (FIG. 5C).
  • individual cells that had proven positive on smooth muscle cell actin ( ⁇ -SMA) were strongly stained. They were transformed hepatic star cells that were selectively stained. The conductivity of the sinusoids was clearly limited. Staining of the hepatocytes could not be determined.
  • Sections from animals with bile duct ligation and PlllCP infusion solution also showed the strong intracellular staining of hepatic star cells (FIG. 5B). In contrast to the fibrosis control, these cells showed additional intracellular staining in the form of granules. These intracellular stains were also found in hepatocytes with access to the sinusoids. As far as can be seen, there was no specific immune response in the cell nucleus. The extent of the fibrosis was less compared to the fibrosis control. literature
  • Ehiers-Danlos syndrome type VI IA and VI IB result from splice-junction mutations or genomic deletions that involve exon 6 in the COL1A1 and COL1A2 genes of type I collagen.
  • Bone morphogenetic protein-1 The type I procollagen C-proteinase. Science 271: 360-362

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Procollagen (III)-Propeptiden und verwandten Substanzen zur Behandlung von fibrotischen Erkrankungen sowie ein Verfahren zur Herstellung und Renaturierung von rekombinantem N- und/oder C-terminalem Procollagen (III)-Propeptid. Die Procollagen (III)-Propeptide und verwandte Substanzen sind zur Behandlung von Fibrosen jeder Genese und Organmanifestion geeignet. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von reanutiertem N-terminalen Procollagen (III)-Propeptid und/oder C-terminalen Procollagen (III)-Propeptid.

Description

Procollagen (Ill)-Propeptide und verwandte Substanzen zur Behandlung von fibrotischen Erkrankungen
In der Beschreibung ist eine Reihe von Dokumenten genannt. Der Offenbarungsgehalt dieser Dokumente, einschließlich von Gebrauchsanweisungen vom Hersteller, ist hiermit per Referenz inkoporiert.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Procollagen (Ill)-Propeptiden und verwandten Substanzen zur Behandlung von fibrotischen Erkrankungen sowie ein Verfahren zur Herstellung und Renaturierung von rekombinantem N- und/oder C-terminalem Procollagen (Ill)-Propeptid. Die Procollagen (Ill)-Propeptide und verwandte Substanzen sind zur Behandlung von Fibrösen jeder Genese und Organmanifestation geeignet. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von renaturiertem N-terminalen Procollagen (Ill)-Propeptid und/oder C-terminalen Procollagen (Ill)-Propeptid.
Stand der Technik: Collagenbiosynthese
Die Collagene vom Typ I und III werden als Präpropetide synthetisiert und werden umfangreich posttranlationell modifiziert. Die intrazellulären Modifikationen umfassen u.a. Glycosylierungen, und enzymatische Hydroxylierungsreaktionen, die Lysin- Aminosäurereste und Prolin-Aminosäurereste in den Positionen 3 und 4 des Imidazolrings betreffen. Die modifizierten Propeptide lagern sich im Falle des Collagens Typ III spontan zu (oc1(NI))3 Homotrimern zusammen. Beim Collagen Typ I bilden sich vor allem ( ι(l))2α2(l) Heterotrimere aus und in geringerem Umfang auch (αι(lll))3 Homotrimere. Nach Exocytose werden die Propeptide durch spezifische Endoproteasen zuerst C-terminal und dann N-terminal am naszierenden Collagen abgespalten. Die Spaltung des C-terminalen Procollagen (Ill)-Propeptids (PIIICP) erfolgt durch die Procollagen-C-Proteinase, die mit Bone Morphogenetic Protein-1 (BMP-1) identisch ist (Kessler 1996). Es wurden gewebsspezifische Expressionsmuster unterschiedlicher Splicevarianten des BMP-1 -Proteins gefunden (Janitz 1998). Das N-terminale Procollagen-Propeptid des Collagens I (PINP) wird von dergleichen N-Proteinase geschnitten, die auch das N-terminale Procollagen-Propeptid des Collagens vom Typ II abdaut. Dagegen ist für die Hydrolyse des N-terminalen Procollagen (Ill)-Propeptids (PIIINP) eine von der von der N-Proteinase (I und II) separate enzymatische Aktivität verantwortlich. Das dafür verantwortliche Enzym wird als Procollagen-N-Proteinase vom Typ (III) bezeichnet.
Stand der Technik: PIIICP
PIIICP kommt als Trimer vor, das aus drei identischen monomeren PIIICP- Untereinheiten besteht. Die Untereinheiten sind miteinander durch intermolekulare Disulfidbrücken verbunden. Theoretische strukturelle Überlegungen und zielgerichtete Mutageneseexperimente mit sogenannten Collagen-Minigenen haben gezeigt, daß wenigstens 4 und wahrscheinlich sogar 6 der 8 Cysteinreste einer monomeren PIIICP- Untereinheit an der Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken beteiligt sind. Wahrscheinlich sind nur die Cysteinreste in den Positionen 51 und 68 an der Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken beteiligt. Allerdings wurde beobachtet, daß die Region um diese beiden Cysteinreste auch für die korrekte Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken kritisch ist, weil Cys→Ser-Mutationen in dieser Region zu einer gestörten Ausbildung dieser Disulfidbrücken führen. Andererseits wurde beschrieben, daß die Trimerisierung von Procollagen des Typs III auch dann stattfindet, wenn die Ausbildung von intermolkularen Disulfidbrücken durch eine Cys→Ser-Mutation in der Position 51 unmöglich gemacht wurde. Bisher wurden keine Methoden zur Quantifizierung von PIIICP beschrieben, außer in der Patentanmeldung: An immunoassay for procollagen-lll-C-terminal propeptide (WO09924835A2 und EP00988964A1).
Pharmakokinetische Untersuchungen liegen für PIIICP nicht vor. Lediglich für PICP wurden Untersuchungen zur Clearance und zum Eliminationsmechanismus durchgeführt. Für 125l-markiertes PICP wurde durch Kompetitionsexperimente eine Elimination aus dem Serum durch den Mannose-6-Phosphat-Rezeptor beschrieben (Smedsrod 1990). Möglich wäre eine Endocytose unter Vermittlung dieses Rezeptors auch bei PIIICP, da PIIICP bei Asn173 eine Glykosylierungsstelle aufweist (Dion 1987). Allerdings kann dieser Mechanismus für rekombinantes PIIICP aus E. coli ausgeschlossen werden, weil das Protein aufgrund der Expression in diesem Wirt ohne Glykosylierungen vorliegt.
Bezüglich der physiologischen Rolle von PIIICP gibt es in der Literatur keine Informationen. Zur biologischen Wirksamkeit des C-terminalen Propeptids von Collagen Typ I wurden in der Literatur unterschiedliche Effekte beschrieben.
Die Nucleotidsequenz des humanen PIIICP's ist in der Genebank (Accession No. X14420, Ala-Kokko 1989, und X01742, Loidl 1984) hinterlegt. Beispielhaft wird die Aminosäuresequenzen dieses Propeptids in Figur 1 (I) angegeben. Die Propeptidsequenz ist in der Anlage in der Gesamtsequenz der entsprechenden Procollagensequenzen C-terminal von der Procollagen-C-Proteinase-Schnittstelle kenntlich gemacht worden.
In Fibroblastenzellkultur wurde unter Verwendung von 40 nM intaktem PICP eine Reduktion der Collagenbiosynthese um 80% gemessen, bei 10 nM noch um 30% (Wu 1986). Allerdings korrelierten diese Änderungen der Proteinbiosynthese sehr gut mit gemessenen Änderungen auf Transkriptionsebene. Infolgedessen wurde für PICP über eine regulatorische inhibierende Wirkung auf transkriptioneller Ebene spekuliert. Für natürliches intaktes Ratten-PICP, isoliert aus Fibroblasten, wurde auch in Zellkulturen mit hepatischen Sternzellen eine Inhibition der Collagenbiosynthese gezeigt (Ma 1997). In Konzentrationen von 33.3 nM wurde eine 66%ige Inhibitionswirkung gemessen, die bei einer Konzentration von 133.2 nM auf 83% anstieg. Die mRNA- Konzentrationsveränderungen unter PICP-Einfluß wurden nicht untersucht. Allerdings wurde in diesen Experimenten gezeigt, daß die inhibitorische Wirkung stark von der Struktur des Proteins abhängt. Eine kovalente Modifizierung von PICP durch Acetaldehyd schwächte die Wirkung auf die Biosyntheserate deutlich ab.
Bei der Verwendung überlappender synthetischer Polypeptide von PICP im Fibroblastenzellkulturmodell sind die Literaturdaten widersprüchlich.
Eine inhibitorische Wirkung auf Ebene der Biosyntheserate wurde mit einem Polypeptid bestehend aus 22 Aminosäureresten (Aminosäurereste 225-246) festgestellt (Katayama 1991).
Hingegen zeigten Untersuchungen eines weiteren synthetischen Polypeptids bestehend aus 45 Aminosäureresten (Aminosäurereste 197-242) - im Gegensatz zu allen bisherigen Ergebnissen - eine Steigerung der Biosyntheseraten der Collagene Typ I und Typ III, sowie von Fibronectin (Katayama 1991). Bei einer Konzentration von 45 μM erfolgte in humanen Lungenfibroblasten nach 4 h eine Steigerung der Collagenbiosynthese um das 3,3-fache und der Fibronectinbiosynthese um das 6,1- fache. Nach 8 h wurde eine maximale Stimulation der Collagenbiosynthese um das 6- bis 8-fache gemessen.
Die stimulierende Wirkung hing jedoch in hohem Maße vom Konfluenzgrad der Zellen ab. Während bei subkonfluenten Fibroblastenzellen eine Wirkung gezeigt werden konnte, war diese bei konfluenten Zellen nicht mehr nachweisbar. Die Wirkungen waren weder zeiltypen- noch speziesspezifisch. Bei weitergehenden Untersuchungen konnte die für die Stimulation der Collagenbiosyntheserate notwendige Polypeptidsequenz auf ein Pentapeptid (Aminosäurereste 212-216) reduziert werden, wobei 80% der ursprünglichen Maximalstimulation auftraten (Katayama 1993). Es zeigte sich allerdings bei Fibronectin mit Faktor 5-11 im Vergleich zu Collagen Typ I (Faktor 4-7) eine deutlich stärkere Stimulation der Syntheserate. Neben der Untersuchung der Änderungen auf Proteinebene wurden parallel die mRNA-Konzentrationen der betroffenen Gene untersucht. Sowohl bei den Collagenen als auch bei Fibronectin wurden keine Konzentrationsänderungen auf mRNA-Ebene gemessen (Katayama 1991). Der Einfluß der synthetischen Polypeptide auf die Stimulation der Collagenbiosynthese erfolgte demnach auf posttranskriptioneller Ebene.
Über in v/Vo-Untersuchungen mit PIIICP oder verwandten Substanzen wurde bisher in der Literatur nicht berichtet.
Stand der Technik: PIIINP
PIIINP kommt als Trimer vor, das aus drei identischen monomeren PIIINP Untereinheiten besteht, die untereinander durch intermolekulare Disulfidbrücken verbunden sind. Das PIIINP-Molekül wird strukturell in drei Domänen gegliedert. Die am weitesten N-terminal gelegene Domäne (CoM) hat eine globuläre Struktur und enthält mehrere intramolekulare Cysteinbrücken. Die sich nach C-terminal anschließende sogenannte Col3-Domäne weist eine collagenartige Struktur auf, die periodisch wiederkehrende Gly- und Pro-Reste enthält. Sie bildet eine charakteristische Collagen- Tripelhelixstruktur aus. Die Col 2-Domäne enthält diejenigen Teile der Procollagen- Telopeptidregion, die sich N-terminal der Schnittstelle der N-Proteinase (III) befinden. In dieser Region sind die monomeren PIIINP-Stränge parallel zueinander angeordnet. Charakteristisch für die Col2-Domäne ist das Vorkommen zweier Cysteinreste, die beide intermolekulare Disulfidbrücken ausbilden und die für den Zusammenhalt des trimeren PIIINP's von entscheidender Bedeutung sind. In der Nähe der N-Proteinase (Ill)-Schnittstelle befindet sich eine Oligosaccharid-Glykosylierungsstelle. Acht Aminosäurereste C-terminal von der Propeptidspaltungsstelle ist einer der vier Lysinreste lokalisiert, die vor der kovalenten Quervernetzung der Collagene durch die Lysyloxidase oxidativ zu Aldehyden desaminiert werden.
Eine Besonderheit des Collagens vom Typ III ist, daß ein Teil der N-terminalen Propeptide bei den Procollagenen nicht abgespalten wird. Dieses sogenannte pN- Collagen Typ III wird dennoch in Fibrillen eingebaut (Fessler 1979). Die Form der Fibrillen wird unterschiedlich beschrieben: als dünne mit Collagen Typ I assoziierte Fibrillen (Keene 1987) oder als dünne perlenschnurartige Fibrillen, die zu netzwerkartigen Strukturen assoziieren (Amenta 1986). Bei elektronenmikroskopischer Betrachtung hat das pN-Collagen Typ III aufgrund des noch vorhandenen PIIINP's das Aussehen eines 'barbed wire' (Davis 1987). Die Anwesenheit von pN-Collagen Typ III auf der Außenseite von Collagenfibrillen könnte eine Rolle bei der Regulation der Fibrillendurchmesser spielen (Schuppan 1991).
Bezüglich der Stabilität des PIIINP-Proteins im Organismus wird über Halbwertszeiten zwischen 2 min und 239 min berichtet (z.B. Smedsrβd 1988; Jensen 1989, dazwischen liegende Werte sind von Brooks 1993, und von Melkko 1994, berichtet worden). Die ermittelten Werte unterschieden sich stark je nach Modell und/oder Markierung des Antigens. In Ratten wurde eine Clearance der N-terminalen Propeptide der Collagene Typ III und Typ I aus dem Serum -unabhängig von der Antigenspezies- durch den Scavenger-Rezeptor der Leberendothelzellen beschrieben (Melkko 1994). Die Endocytose erfolgte bei beiden Proteinen unter Vermittlung desselben Rezeptors.
Die Aminosäuresequenz des humanen PIIINP's ist in der Genebank-Datenbank mit der Zugangsnummer X14420 (Ala-Kokko 1989) hinterlegt. Beispielhaft wird die Aminosäuresequenzen dieses Propeptids in Figur 1 (II) angegeben. Die Propeptidsequenz ist in der Anlage in der Gesamtsequenz der entsprechenden PIIINP- Sequenz N-terminai in der Nähe der Procollagen-N-Proteinase-Schnittstelle vom Typ III kenntlich gemacht worden.
PIIINP wurde bisher vornehmlich als Fibrosemarker beschrieben (Boigk, 1997). Es kann Rahmen » von möglichen Therapien der Leberfibrose als nicht-invasiver Verlaufsparameter angewandt werden (Afdahl,1997).
Für PIIINP wurden Untersuchungen zu ihrer Rolle als Feedbackinhibitoren der Collagenbiosynthese in Zellkultursystemen und in zellfreien Lysaten veröffentlicht. Für die N-terminalen Propeptide der Collagene Typ I und Typ III sowie der Col 1-Domäne des PINP wurde zellspezifisch im Fibroblasten-Zellkultursystem eine konzentrationsabhängige Inhibition der Collagenproduktion der α-ι(l)- und α2(l)-Ketten gemessen (Kühn 1982). Verwendet wurden Proteinkonzentrationen von 0,5 μM bis 6 μM. Die Inhibition lag im Bereich von 30% bis 50% im Vergleich zu Kontrollexperimenten. Hierbei wurde eine Beeinflussung der Translationsrate durch die Propeptide und deren Fragmente nachgewiesen. Gestützt wurden die Befunde durch die Lokalisation der internalisierten Proteine in der Nähe des endoplasmatischen Reticulums.
Untersuchungen mit den Col 1 -Domänen der beiden N-terminalen Propeptide wurden zudem im zellfreien Reticulozytensystem durchgeführt (Paglia 1979). Verwendet wurden Proteinkonzentrationen von 0,4 bis 3,2 μM. Es wurde eine konzentrationsabhängige Inhibition der Collagen (I)-Synthese gemessen. In beiden Fällen wurde auf der Ebene der Translation eine Inhibition zwischen 38% und 71% im Vergleich zu Kontrollexperimenten gemessen. Bei der Verwendung sehr hoher Konzentrationen an Proteinen (8 μM) wurde gezeigt, daß die inhibitorische Wirkung auf die Collagentranslation in diesem System nicht weiter gesteigert werden konnte. Bei der Untersuchung des Wirkmechanismus von PINP wurde auch ein System zur rekombinanten cytosolischen Expression von PINP in Fibroblastenzellkultur untersucht (Fouser 1991). Während keine Veränderungen der Collagen (I) mRNA-Konzentrationen gemessen wurden, zeigte sich eine verringerte Biosyntheserate des entsprechenden Proteins und somit eine Regulation auf posttranskriptioneller Ebene.
Gestützt werden die Ergebnisse für PINP durch Experimente mit Hautfibroblasten aus homozygoten dermatosparaktischen Schafen (Kühn 1982). Bei der homologen humanen Erkrankung, dem Ehlers-Danlos-Syndrom Typ Vlla oder Vllb, liegt eine Mutation in der N-Proteinaseschnittstelle des Procollagens Typ I vor, PINP kann demzufolge nicht abgespalten werden (Byers 1997). In Zellkultur wiesen diese Zellen ohne PINP-Feedbackmechanismus im Vergleich zu heterozygoten Kontrollfibroblasten, einen Anteil der Collagenbiosynthese an der gesamten zellulären Biosynthese von 15- 20% auf (Kontrollfibroblasten 2 bis 4%).
Stand der Technik: Rekombinante Produktion von Procollagen (IΙI)-Propeptiden
Die rekombinante Produktion von Procollagen (Ill)-Propeptiden wurde in einer Reihe von Publikationen beschrieben. Lee, 1990, beschreibt die rekombinante Produktion einer Collagen α2(l)-Mutante in sogenannten A2-Zellen, die von der epithelialen Leberzellinie W8 abgeleitet sind, die ihrerseits in Bezug auf die Produktion von Collagen α2(l) defizient ist. In zwei neueren Publikationen wird die rekombinante Expression von Collagen ι(lll) Minigenen beschrieben (Lees 1994; Bulleid 1996).
In einer neueren Arbeit wird die Gewinnung von PIIICP in Zf9-Zellen als trimeres Protein beschrieben (Zafarullah 1997). Allerdings konnte rekombinantes Procollagen nur in sehr kleinen Mengen für Analysezwecke hergestellt werden. Die rekombinante Expression von PIIICP in E. coli wurde in den Patentanmeldungen: An immunoassay for procollagen-lll-C-terminal propeptide. (WO09924835A2 und EP00988964A1) und in Burchardt, 1998, beschrieben. Die Ausbeuten lagen bei diesem Expressionsverfahren bei mehr als 20 mg/l Flüssigkulturmedium. Allerdings lagen die rekombinanten Proteine in E. coli fast ausschließlich als Inclusion Body-Protein vor und mußten mit denaturierenden Aufschlußmethoden aufgereinigt werden. Außerdem enthielten die exprimierten Proteine einen N-terminalen His-Tag, so daß sie auch in denaturienden Lösungsmitteln über eine Ni-NTA-Säule aufgereinigt werden konnten. Für chronische in wVo-Anwendungen waren diese Proteine weniger geeignet, weil der His-Tag potentiell immunogen ist und die biologische Halbwertszeit des rekombinanten Proteins aus diesem Grund verkürzt sein kann. Sie lagen unter den in dieser Anmeldung angegebenen Methoden überwiegend in monomerer Form vor, und ihre Löslichkeit in wässrigen Lösungen war zu gering für die meisten therapeutischen Anwendungen. Überschreiten von Konzentrationen von ca. 10 μg/ml führte zum Ausfallen des rekombinanten PIIICP's aus wässrigen Lösungen.
Die rekombinante Expression von humanem PIIINP in E. coli wurde in der Patentanmeldung: Monoclonal antibody and assay for detecting PIIINP (WO09961477A2) und die von murinem PIIINP in Kauschke, 1999, beschrieben. Die Ausbeuten lagen bei diesem Expressionsverfahren jeweils bei ca. 5 mg/l Flüssigkulturmedium. Außerdem enthielten auch diese Proteine einen N-terminalen His- Tag, so daß sie in denaturienden Lösungsmitteln über eine Ni-NTA-Säule aufgereinigt werden konnten. Für chronische in wVo-Anwendungen waren auch diese Proteine weniger geeignet, weil der His-Tag potentiell immunogen ist und die biologische Halbwertszeit dieser Proteine aus diesem Grund verkürzt sein kann. Die Löslichkeit von PIIINP in wässrigen Lösungen war zu gering für die meisten therapeutischen Anwendungen. Stand der Technik: Fibrotische Erkrankungen
Unter fibrotischen Erkrankungen versteht man eine diverse Gruppe von Krankheiten, die mit einer qualitativ veränderten Collagenproduktion oder mit einer verstärkten Ablagerung von Collagen im Extracellulärraum einhergehen. Zu dieser Gruppe von Erkrankungen gehören u.a. die systemische oder lokale Sklerodermie, Leberfibrosen unterschiedlichen Ursprungs, wie z.B. alkoholische Leberzirrhose, biliäre Zirrhose, Hepatitiden viraler oder anderer Genese, die sogenannte veno-occlusive diesease, idiopathische interstitielle Fibrösen, idiopathische Lungenfibrosen, akute pulmonale Fibrösen, das "acute respiratory distress syndrome" (ARDS), perimuskuläre Fibrösen, perizentrale Fibrösen, Dermatofibrome, Nierenfibrosen, die diabetische Nephropathie, Glomerulonephritiden, Keloide, die hypertrophe Narbenbildung, Gelenkadhäsionen, Arthrosen, Myelofibrosen, Vernarbungen der Cornea, die cystische Fibröse, muskuläre Fibrösen, die Duchenne'sche Muskeldystrophie, Ösophagusstrikturen, Morbus Ormond, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, atherosklerotische Veränderungen, pulmonale Hypertonie, Angiopathien der Arterien und Venen, Aneurysmen der großen Gefäße.
Weitere fibrotische Erkrankungen können initiiert oder hervorgerufen werden durch chirurgische Narbenrevisionen, plastisch-chirurgische Eingriffe, Glaukome, Kataraktfibrosen, Vernarbungen der Cornea, die sogenannte "graft versus host disease", chirurgische Eingriffe an Sehnen, Nerveneinklemmungssyndrome, die Dupuytren'sche Kontraktur, Adhäsionen infolge gynäkologischer Eingriffe, pelvische Adhäsionen, Infertilität, peridurale Fibrösen, Erkrankungen der Schilddrüse oder der Nebenschilddrüsen, durch metastatischen Knochenbefall, durch das multiple Myelom oder durch Restenosen. Bei vielen dieser Erkrankungen ist eine Therapie bislang nicht erfolgreich gewesen. Bei anderen besteht Bedarf zu verbesserten Ansätzen oder zur Reduktion von Nebenwirkungen. Aus Vorgenanntem ergibt sich, daß es weiteren Bedarf gibt, wirksame Arzneimittel gegen fibrotische Erkrankungen bereitzustellen. Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die in den Beispielen gekennzeichnete Ausführungsformen erreicht.
Beschreibung der Erfindung
Somit betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, vorzugsweise ein Arzneimittel enthaltend (a) ein (Poly)peptid, das das N-terminale Procollagen (III)- Propeptid und/oder das C-terminale Procollagen (Ill)-Propeptid ist oder (b) ein Fragment oder Derivat davon mit im wesentlichen der antifibrotischen Aktivität des (Poly)peptids (a) und/oder (c) ein Peptid, das die Erkennungssequenz der Procollagen-C-Protease vom Typ III und/oder ein Peptid, das die Erkennungssequenz der Procollagen-N- Proteinase vom Typ III umfaßt, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Der Begriff "ein (Poly)peptid, das das N-terminale Procollagen (Ill)-Propeptid und/oder das C-terminale Procollagen (Ill)-Propeptid ist" bedeutet im Sinne der Erfindung, daß das (Poly)peptid das N-terminale oder das C-terminale Procollagen (Ill)-Propeptid ist, an das sich gegebenenfalls weitere Aminosäuresequenzen N-terminal oder C-terminal anschließen können, so daß sich ein längeres (Poly)peptid ergibt. Die zusätzlichen Sequenzen können vom Procollagen stammen oder heterologe oder artifizielle Sequenzen sein. Bevorzugt sind (Poly)peptide, die zusätzlich zur (humanen) PIIICP- bzw. PIIINP-Aminosäuresequenz auch mögliche Procollagen-C- bzw. Procollagen-N- Proteinase-Schnittstellen-Erkennungssequenzen aufweisen.
Der Begriff "ein Fragment oder Derivat davon mit im wesentlichen der antibiotischen Aktivität des (Poly)peptids (a)" bedeutet erfindungsgemäß, daß dieses Fragment oder Derivat mindestens 50%, vorzugsweise 75%, stärker bevorzugt 85%, besonders bevorzugt 90% der antifibrotischen Aktivität des N-terminalen oder C-terminalen Procollagen/-Propeptids aufweist. Derivate des (Poly)peptid können andere als die natürlichen Aminosäuren oder substituierte Aminosäuren enthalten. Derivate können beispielsweise durch Peptidomimetics hergestellt werden.
Wenn die nachstehenden Ausführungsformen üblicherweise im Zusammenhang mit Arzneimitteln diskutiert werden, so treffen diese mutatis mutandis auf die Zusammensetzungen zu.
Der Begriff "(Poly)peptid" betrifft sowohl Polypeptide wie auch Peptide. Ein Peptid umfaßt üblicherweise nicht mehr als 30 Aminosäuren.
Mögliche Procollagen-C-Proteinase-Erkennungssequenzen sind in Figur 1 (I) kenntlich gemacht worden.
Mögliche Procollagen-N-Proteinase-Erkennungssequenzen sind in bei der PIIINP- Sequenz in Figur 1 (II) kenntlich gemacht worden.
Beispiele für geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie z.B. Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Netzmittel oder Detergenzien, sterile Lösungen, etc. Arzneimittel, die solche Träger umfassen, können mittels bekannter konventioneller Methoden formuliert werden. Diese Arzneimittel können einem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung kann oral oder parenteral erfolgen, z.B. intravenös, intraperitoneal, subcutan, intramuskulär, lokal, intranasal, intrabronchial, oral oder intradermal, oder über einen Katheter an einer Stelle in einer Arterie. Präparate für eine parenterale Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wäßrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie z.B. Olivenöl, und organische Esterverbindungen wie z.B. Ethyloleat, die für Injektionen geeignet sind. Wäßrige Träger umfassen Wasser, alkoholisch-wäßrige Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Salzlösungen und gepufferte Medien. Parenterale Träger umfassen Natriumchlorid- Lösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat und gebundene Öle. Intravenöse Träger umfassen z.B. Flüssigkeits-, Nährstoff- und Elektrolyt-Ergänzungsmittel (wie z.B. solche, die auf Ringer-Dextrose basieren. Das Arzneimittel kann außerdem Konservierungsmittel und andere Zusätze umfassen, wie z.B. antimikrobielle Verbindungen, Antioxidantien, Komplexbildner und inerte Gase. Des weiteren können, abhängig von der beabsichtigten spezifischen Verwendung, andere Wirkstoffe wie z.B. Interleukine, Wachstumsfaktoren, Differenzierungsfaktoren, Interferone, chemotaktische Proteine oder ein unspezifisches immunmodulatorisches Agens enthalten sein.
Die Art der Dosierung wird vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt. Es ist dem Fachmann bekannt, daß die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie z.B. der Körpergröße bzw. dem Gewicht, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten, aber auch von dem speziell zu verabreichenden Mittel, der Dauer und Art der Verabreichung, und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel verabreicht werden. Eine typische Dosis kann z.B. in einem Bereich zwischen 0,001 und 1000 μg liegen, wobei Dosen unterhalb oder oberhalb dieses beispielhaften Bereiches, vor allem unter Berücksichtigung der oben erwähnten Faktoren, vorstellbar sind. Im allgemeinen sollte sich bei regelmäßiger Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung die Dosis in einem Bereich zwischen 1 μg- und 10 mg-Einheiten pro Tag befinden. Üblicherweise werden die Wirkstoffe in diesen Zubereitungen in einer Konzentration von größer als 10 μg/ml eines physiologischen Puffers vorliegen. Sie können aber auch in fester Form in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5 Gew.% der Gesamtmischung vorhanden sein. Im allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, den oder die Wirkstoffe in Gesamtmengen von etwa 0,001 bis 100 mg/kg, bevorzugt in Gesamtmengen von etwa 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls als Dauerinfusion oder in Form von mehreren Einzelgaben, zur Erzielung des gewünschten Ergebnisses zu verabreichen. Wird die Zusammensetzung intravenös verabreicht, sollte sich die Dosis in einem Bereich zwischen 1 μg- und 10 mg-Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag befinden. Das Arzneimittel kann lokal oder systemisch verabreicht werden.
Überraschenderweise wurde erfindungsgemäß gefunden, daß die obengenannten (Poly)peptide und insbesondere PIIICP in vivo in der Leber aufgenommen wurden und antifibrotische Effekte zeigten. Der in der Patentanmeldung beschriebene Wirkmechanismus von rekombinantem PIIICP durch Herunterregelung der Connective Tissue Growth Factor-mRNA war ebenfalls überraschend und unerwartet. Hier wurde zum ersten Mal die Rolle von PIIICP als natürlichem Feedback-Inhibitor der fibrotischen Matrixdeposition beschrieben. Die erfindungsgemäßen Befunde sind ferner deshalb überraschend, weil PIIICP/PIIINP bislang vorwiegend nur als Diagnosemarker zur Überwachung der Wirksamkeit anderer Arzneimittel, nicht jedoch im Zusammenhang als therapeutisches Agens zum Einsatz beim Menschen diskutiert wurden. Die Erzielung eines antifibrotischen Therapieeffekts war somit völlig überraschend.
In v/Vo-Untersuchungen zur Verringerung von Fibrösen durch Anwendung von rekombinatem PIIINP wurden in der Literatur bisher nicht beschrieben. Aufgrund der fehlenden Glykosylierung von rekombinantem PIIINP aus E. coli war ferner die Verringerung des fibrotischen Areals, die in dieser Patentanmeldung beschrieben wird, völlig überraschend und unerwartet.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammt das (Poly)peptid oder Fragment oder Derivat und/oder das Peptid vom humanen Procollagen (III) oder ist davon abgeleitet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das die Erkennungssequenz umfassende (Poly)peptid 10 bis 15 Aminosäuren N-terminal von der Spaltstelle.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform umfaßt das die Erkennungssequenz umfassende (Poly)peptid 10 bis 15 Aminosäuren C-terminal von der Spaltstelle. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das (Poly)peptid ein Fusionsprotein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das (Poly)peptid einen His- Tag. Der His-Tag kann C-terminal oder N-terminal angefügt sein.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist der His-Tag 6 His-Tag und N-terminal angefügt.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines vorstehend beschriebenen (Poly)peptids oder Fragmentes oder Derivates davon zur Herstellung eines Arzneimittels oder Medizinproduktes zur Behandlung oder Vorbeugung von fibrotischen Erkrankungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die fibrotischen Krankheiten ausgewählt aus systemischer oder lokaler Sklerodermie, Leberfibrosen unterschiedlichen Ursprungs, wie z.B. alkoholischer Leberzirrhose, biliärer Zirrhose, Hepatitiden viraler oder anderer Genese, der sogenannten "veno-occlusive disease", idiopathischen interstitiellen Fibrösen, idiopathischen Lungenfibrosen, akuten pulmonalen Fibrösen, dem "acute respiratory distress syndrome" (ARDS), perimuskulären Fibrösen, perizentralen Fibrösen, Dermatofibromen, Nierenfibrosen, der diabetische Nephropathie, Glomerulonephritiden, Keloiden, der hypertrophen Narbenbildung, Gelenkadhäsionen, Arthrosen, Myelofibrosen, Vernarbungen der Cornea, der cystischen Fibröse, muskulären Fibrösen, der Duchenne'schen Muskeldystrophie, Ösophagusstrikturen, Morbus Ormond, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, atherosklerotische Veränderungen, pulmonaler Hypertonie, Angiopathien der Arterien und Venen und Aneurysmen der großen Gefäße oder sind hervorgerufen oder initiiert durch chirurgische Narbenrevisionen, plastisch-chirurgische Eingriffe, Glaukome, Kataraktfibrosen, Vernarbungen der Cornea, die sogenannte "graft versus host disease", chirurgische Eingriffe an Sehnen, Nerveneinklemmungssyndrome, die Dupuytren'sche Kontraktur, Adhäsionen infolge gynäkologischer Eingriffe, pelvische Adhäsionen, Infertilität, peridurale Fibrösen, Erkrankungen der Schilddrüse oder der Nebenschilddrüsen, durch metastatischen Knochenbefall, durch das multiple Myelom oder durch Restenosen.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von renaturiertem N-terminalen Procollagen (Ill)-Propeptid und/oder C-terminalen Procollagen (Ill)-Propeptid, wobei man (a) nach üblichen Verfahren mit E. coli rekombinant hergestellte, das/die Propeptid(e) enthaltende Einschlußkörper in einem 0,5 bis 8 M denaturierenden Puffer löst; (b) den Puffer gemäß (a) einem Grenzverdünnungspuffer zutropft, der um einen neutralen pH-Wert herumpuffert, L- Arginin in einer Endkonzentration von 200 bis 1000 mM und ein Disulfidbrücken- reduzierendes gekoppeltes Redoxsystem enthält, bis ein Volumenverhältnis des denaturierenden Puffers zu Grenzverdünnungspuffer von höchstens 1 :3 erreicht ist; (c) das Puffergemisch gemäß (b) mindestens 2 Stunden gegen einen physiologischen Puffer, der L-Arginin in einer Endkonzentration von 50 bis 200 mM und ein Disulfidbrücken-reduzierendes gekoppeltes Redoxsystem enthält, dialysiert; (d) das Puffergemisch gemäß (c) mindestens 2 Stunden gegen einen physiologischen Puffer, der ein Disulfidbrücken-reduzierendes gekoppeltes Redoxsystem enthält, dialysiert; und (e) das Puffergemisch gemäß (d) mindestens 2 Stunden gegen einen physiologischen Puffer dialysiert.
Somit enthält der Puffer in Schritt (d) kein Arginin und in Schritt (e) weder Arginin noch das Redoxsystem.
Die Möglichkeit, rekombinantes PIIICP in größeren Konzentrationen als bisher beschrieben in physiologischem Puffer lösen zu können, war völlig überraschend und unerwartet, weil dem Fachmann bekannt ist, daß Collagene in physiologischen Puffern nur schwer löslich sind.
Durch diese Methode wird die therapeutische Anwendung der rekombinanten
Procollagen-Propeptide und verwandter Substanzen in therapeutisch relevanten
Konzentrationen ermöglicht. Im Beispiel 4 wird die Verwendung von nach diesem Verfahren renaturierten Procollagen-Propeptiden in Tiermodellen der Leberfibrose beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist dem Puffer in mindestens einem der Schritte
(b) bis (d) ein Chelator zugesetzt.
Vorzugsweise ist der Chelator EDTA, beispielsweise in einer Endkonzentration von 10 mM.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Redoxsystem Glutathion reduziert - Glutathion oxidiert.
Besonders bevorzugt ist, daß die Komponenten des Redoxsystems die in Beispiel 2 angegebenen Konzentrationen aufweisen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist dem Puffer in mindestens einem der Schritte (b) bis (d) ein weiterer Proteasehemmstoff zugesetzt. Bevorzugt ist der Proteasehemmstoff Pefabloc SC.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform ist dem Puffer in einem der Schritte
(c) und/oder (d) ein Salz in einer Endkonzentration von etwa 10 mM zugesetzt. Vorzugsweise ist das Salz NaCI.
Besonders bevorzugt ist, daß die Grenzverdünnungs- und Dialysepuffer die in Beispiel 2 angegebenen Konzentrationen aufweisen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der denaturierende Puffer in
Schritt (a) Harnstoff in einer Endkonzentration von 0,5 bis 8 M.
Vorrzugsweise enthält der Puffer Harnstoff in einer Endkonzentration von etwa 6 M.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird als Puffermittel Trizma-Base eingesetzt. In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform werden die Dialyseschritte bei etwa 4°C durchgeführt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dialysiert man in den Schritten (c) bis (e) gegen mindestens das 100-fache Dialysepuffervolumen.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, wobei man das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte renaturierte N-terminale Procollagen (Ill)-Propeptid und/oder C-terminale Procollagen (Ill)-Propeptid nach üblichen Verfahren einengt oder lyophilisiert und mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel versetzt.
Verwendbare pharmazeutische verträgliche Träger und Verdünnungsmittel wurden vorstehend diskutiert.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines N-terminalen Procollagen (Ill)-Propeptids und/oder eines C-terminalen Procollagen (Ill)-Propeptids, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde, zur Behandlung oder Vorbeugung von fibrotischen Erkrankungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die fibrotischen Krankheiten ausgewählt aus systemischer oder lokaler Sklerodermie, Leberfibrosen unterschiedlichen Ursprungs, wie z.B. alkoholischer Leberzirrhose, biliärer Zirrhose, Hepatitiden viraler oder anderer Genese, der sogenannten "veno-occlusive disease", idiopathischen interstitiellen Fibrösen, idiopathischen Lungenfibrosen, akuten pulmonalen Fibrösen, dem "acute respiratory distress syndrome" (ARDS), perimuskulären Fibrösen, perizentralen Fibrösen, Dermatofibromen, Nierenfibrosen, der diabetische Nephropathie, Glomerulonephritiden, Keloiden, der hypertrophen Narbenbildung, Gelenkadhäsionen, Arthrosen, Myelofibrosen, Vernarbungen der Cornea, der cystischen Fibröse, muskulären Fibrösen, der Duchenne'schen Muskeldystrophie, Ösophagusstrikturen, Morbus Ormond, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, atherosklerotische Veränderungen, pulmonaler Hypertonie, Angiopathien der Arterien und Venen und Aneurysmen der großen Gefäße oder sind hervorgerufen oder initiiert durch chirurgische Narbenrevisionen, plastisch-chirurgische Eingriffe, Glaukome, Kataraktfibrosen, Vernarbungen der Cornea, die sogenannte "graft versus host disease", chirurgische Eingriffe an Sehnen, Nerveneinklemmungssyndrome, die Dupuytren'sche Kontraktur, Adhäsionen infolge gynäkologischer Eingriffe, pelvische Adhäsionen, Infertilität, peridurale Fibrösen, Erkrankungen der Schilddrüse oder der Nebenschilddrüsen, durch metastatischen Knochenbefall, durch das multiple Myelom oder durch Restenosen.
Die Tabellen zeigen:
Tabelle 1 zeigt das Körpergewicht bei Versuchsende, relatives Lebergewicht, GIDH- Serumaktivitäten, Collagen Typ III- und Typ I- sowie TGFß mRNA-Konzentrationen nach chronischer Applikation verschiedener Procollagen αι(lll)-Propeptide im Mäuse- CCI4-Modell. mRNA-Konzentrationsunterschiede nach TaqMan-Analyse sind als -Δct- Werte im Vergleich zur Intaktkontrolle angegeben. (Mittelwert ± SEM)
Tabelle 2 zeigt das Körpergewicht bei Versuchsende, relatives Lebergewicht, GIDH- Serumaktivitäten, Kollagen Typ III- und Typ I- und TGFß mRNA-Konzentrationen nach chronischer Applikation unterschiedlicher Konzentrationen des PIIICP4.1 -Proteins im Mäuse-CCI4-Modell. mRNA-Konzentrationsunterschiede nach TaqMan-Analyse sind als -Δct-Werte im Vergleich zur Intaktkontrolle. (Mittelwert ± SEM)
Tabelle 1
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Tabelle 2
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Die Figuren zeigen:
Figur 1 (I) zeigt die Aminosäuresequenzen im Bereich des humanen C-terminalen Procollagen (Ill)-Propeptids (PIIICP). Das N-terminale Ende der Prosequenz wird durch die Procollagen-C-Proteinase-Schnittstelle gebildet (siehe Pfeil). Die eigentliche Propeptidsequenz ist fettgedruckt. Der Sequenzabschnitt, der in der Umgebung der Procollagen-C-Proteinase-Schnittstelle liegt, ist unterstrichen. Abbildung 1 (II) zeigt die Aminosäuresequenzen im Bereich des humanen N-terminalen Procollagen (III)- Propeptids (PIIINP). Das N-terminale Ende der Prosequenz grenzt an die Präsequenz. Die Procollagen-N-Proteinase-Schnittstelle ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Die eigentliche Propeptidsequenz ist fettgedruckt. Der Sequenzabschnitt, der in der Umgebung der Procollagen-N-Proteinase-Schnittstelle liegt, ist unterstrichen.
Figur 2 zeigt den PlllCP-Serumkonzentrationsverlauf im Modell der narkotisierten Ratte. Die terminale Halbwertszeit betrug ca. 80 min, das terminale Verteilungsvolumen lag bei ca. 7,4 l/kg und die Eliminationsrate bei ca. 6,3 l/(h*kg). Für Details siehe Beispiel 3 in der Patentschrift.
Figur 3 zeigt (A) Gesamtcollagenflächenanteil und (B) CTGF mRNA-Konzentration nach chronischer Applikation verschiedener Procollagen αι(lll)-Propeptide im Mäuse-CCI4- Modell (Mittelwert ± SEM).
Figur 4 zeigt (A) Gesamtcollagenflächenanteil und (B) CTGF mRNA-Konzentration nach chronischer Applikation unterschiedlicher Konzentrationen des PIIICP4.1 -Proteins im Mäuse-CCI4-Modell (Mittelwert ± SEM). Für Details siehe Beispiel 4 in der Patentschrift.
Figur 5 zeigt immunhistochemische Untersuchungen zur Lokalisation des PIIICP- Antigens auf repräsentativen Schnitten aus Rattenlebern. Verwendet wurde der monoklonale anti-PIIICP-Antikörper 48D19. (A) Intaktkontrolle nach siebentägiger Infusion einer Pufferkontrollösung (240-fach); (B) CCI4-induzierte Leberfibrose nach siebentägiger PlllCP-Proteininfusion (400-fach); (C) CCI -induzierte Leberfibrose nach siebentägiger Infusion einer Pufferkontrollösung (Fibrosekontrolle, 320-fach).
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
In den Beispielen bedeutet "v/v" Volumenprozent und "w/v" Gewichtsprozent. Beispiel 1 : Aufreinqunq von PIIICP aus Inclusion Bodies in E. coli
PIIICP wurde in E. coli in Form von Inclusion Bodies produziert (Burchardt 1998). Die Zellpaste von jeweils drei 200 ml-KuIturen wurde in 24 ml 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 1 M NaCI, resuspendiert, über Nacht bei -20°C eingefroren und nach dem Auftauen zentrifugiert (5.000 g, 10 min). Der Niederschlag wurde mit 4,8 ml des gleichen Puffers versetzt und 4,8 ml 25 mM Tris-HCI (pH 8,0), 5 mg/ml Lysozym sowie 4,8 ml einer 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0) zugegeben. Nach 1 h Inkubation bei 37°C wurden die Bakterienzellen mit Ultraschall aufgeschlossen. Anschließend wurden 12 ml 10% Triton- X-100, 1 mM EDTA, gelöst in 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), zugegeben und nach 30 min Inkubation abzentrifugiert (5.000 g, 10 min). Die unlösliche Fraktion wurde in 24 ml 5% Triton-X-100, gelöst in 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), mit Ultraschall gelöst, nochmals bei 37°C inkubiert und wiederum zentrifugiert (5.000 g, 10 min). Die Tritonextraktion zum Entfernen von Membranlipiden wurde einmal wiederholt. Anschließend wurde das Pellet in 24 ml 1 M Harnstoff, 1 mM EDTA, gelöst in 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), mit Ultraschall gelöst und nach 30 min Inkubation erneut abzentrifugiert (5.000 g, 10 min). Das Pellet bestand aus fast reinem PIIICP in Form von Inclusion Bodies. Das Protein ließ sich in 6 M Harnstoff, gelöst in 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), lösen. Wurde die Probe 30 min bei 15.800 g zentrifugiert, so blieb das Inclusion Body-Protein im Überstand.
Beispiel 2: Renaturierunq von rekombinanten Collagen αidlO-Propeptiden
Renaturiert wurde beispielsweise rekombinantes humanes PIIICP4.1 , dessen gentechnische Herstellung in Burchardt, 1998, und in den Patentanmeldungen: An immunoassay for procollagen-lll-C-terminal propeptide (WO09924835A2 und EP00988964A1) beschrieben ist. Des weiteren wurde rekombinantes humanes PIIINP 4.5.2. renaturiert, dessen gentechnische Herstellung in der Patentanmeldung: Monoclonal antibody and assay for detecting PIIINP (WO09961477A2) beschrieben ist. Schließlich wurde auch rekombinantes murines PIIINP, dessen gentechnische Herstellung in Kauschke, 1999, beschrieben wird, nach dem unten beschriebenen Verfahren renaturiert.
Das Verfahren ist allerdings keineswegs auf die Renaturierung dieser beispielhaft genannten Propeptide beschränkt, sondern eignet sich für die Renaturierung anderer Procollagen-Propeptide und ähnlicher Verbindungen.
Methode
Verwendete Puffer:
Dialysepuffer: 300 mM Trizma-Base, pH 7,4
400 mM L-Arginin
10 mM EDTA
0,4 mM Pefabloc SC
1 mM Glutathion reduziert
0,1 mM Glutathion oxidiert
Limited Dilution-Puffer: 50 mM Trizma-Base, pH 7,4
800 mM L-Arginin
10 mM NaCI
10 mM EDTA
0,4 mM Pefabloc SC
1 mM Glutathion reduziert
0,1 mM Glutathion oxidiert Die Collagen α-ι(lll)-Propeptide lassen sich in einem 6 M Harnstoff puffer lösen. Durch einen Limited Dilution-Schritt wurden die Pufferbedingungen der Proteine schlagartig geändert. Ein im Zielpuffer vorhandenes Redoxsystem begünstigte die Ausbildung von Disulfidbrücken. Hierzu wurde die Proteinlösung unter leichten Schüttelbewegungen in einen Überschuß eiskalten Limited Dilution-Puffers getropft. Dieser Ansatz wurde über Nacht bei 4°C gelagert.
Sämtliche Dialyseschritte fanden bei 4°C statt. Bei jedem Schritt wurde mindestens drei Stunden lang gegen das einhundertfache Puffervolumen dialysiert. Der Limited dilution- Ansatz wurde in einen Schlauch geeigneter Porengröße überführt und gegen den Dialysepuffer dialysiert. In den nächsten Dialyseschritten wurde die L- Argininkonzentration auf 100 mM reduziert, anschließend wurde ein Puffer ohne L- Arginin verwendet. Dem vierten Puffer fehlte zusätzlich das Glutathionredoxsystem. Der abschließende Puffer wurde gemäß des geplanten Verwendungszwecks ausgewählt. Für in v/Vo-Versuche bestand er beispielsweise aus 10 mM Trizma-Base, pH 7,4, 145 mM NaCI. Das Dialysat wurde abschließend bei 4°C gelagert.
Beispiel 3: Messung der Eliminationskinetik von renaturiertem PIIICP in der narkotisierten Ratte
Materialien und Methoden
PIIICP-Platten-ELISA: Die Bestimmung von PIIICP-Konzentrationen in biologischen Proben wurde in einem Sandwich-ELISA-Assay durchgeführt. Verwendet wurden zwei monoclonale anti-PIIICP-Antikörper (Burchardt 1998).
Als Fängerantikörper wurde der Antikörper 48B14 (Burchardt, 1998) in einer Konzentration von 5 μg/ml auf der Testplatte immobilisiert. Nach einem Blocking freier Bindungsplätze auf der Platte durch Inkubation mit einer 3% (v/v) BSA-Lösung in PBS wurden biologische Proben bzw. Pufferlösungen mit bekannten PIIICP-Konzentrationen gemeinsam mit einer bekannten Konzentration an FITC-markiertem Sekundärantikörper (48D19) (Burchardt, 1998) für 30 min zum immobilisierten Primärantikörper zugesetzt. Nicht gebundenes PIIICP-Antigen und noch ungebundener Sekundärantikörper wurden danach durch Waschschritte entfernt und die Menge an gebundenem, markiertem Sekundärantikörper bestimmt. Die obengenannten Antikörper können durch andere anti-PIIICP-Antikörperpärchen ersetzt werden, die nach üblichen Verfahren hergestellt werden können (Harlow and Lane, 1988).
Die gemessenen in vivo Konzentrationen in menschlichem Serum lagen zum größten Teil unter der Nachweisgrenze (unter 0,5 ng/ml, siehe Patentanmeldung: An immunoassay for procollagen-lll-C-terminal propeptide (WO09924835A2 and EP00988964A1)). Diese Ergebisse liegen um fast eine Größenordnung unter den physiologischen PIIINP-Konzentrationen im menschlichem Serum.
Tierversuch: Nüchterne Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von ca. 300 g wurden mit einer intraperitonealen Trapanal-Gabe von 100 mg/kg Körpergewicht betäubt.
Die Gabe von Flüssigkeiten oder Substanzverdünnungen erfolgte über einen Katheder in der Vena jugularis. Die Messung des Blutdrucks sowie die Blutentnahme erfolgte mittels eines Katheders in der Aorta femoralis. Zur Erleichterung der Spontanatmung wurde ein Luftröhrenschnitt durchgeführt. Während des Versuchs erhielten die Tiere Infrarot-Wärmestrahlung. Nach Eröffnung erhielten die Tiere zum Ausgleich des Blutverlustes eine Bolusgabe von 5 ml physiologischer Kochsalzlösung je kg Körpergewicht. Im Anschluß an eine fünfzehnminütige Erholungsphase erfolgte die Gabe der Substanzverdünnungen in physiologischem Pufferlösung (10 mM Trizma- Base, pH 7,4, 145 mM NaCI) durch eine zweistündige Infusion von renaturiertem PIIICP4.1 (Burchardt 1998) mit einer Fließgeschwindigkeit von 100 μl je kg Körpergewicht und Minute (PIIICP4.1 -Konzentration in der Infusionslösung ca. 150 μg/ml). Blutentnahmen erfolgten zu den Zeitpunkten 2 min, 60 min, 115 min, 150 min, 180 min und 225 min nach Start der Infusion parallel zu einer Aufzeichnung des jeweiligen Blutdrucks. Je Zeitpunkt wurden 400 μl Blut entnommen, sofort mit 20 μl Heparin (250 lE/ml) versetzt, scharf abzentrifugiert und das Plasma bis zum Test bei - 20°C gelagert. Nach Beendigung des Versuchs wurden die Versuchstiere durch Gabe von KCI-Lösung getötet. Nach den PIIICP-Konzentrationsbestimmungen in den Proben wurden die pharmakokinetischen Parameter ermittelt.
Ergebnisse
Die terminale Halbwertszeit wurde mit ca. 80 min ermittelt. Im terminalen Kurvenbereich lag noch 6,1 % der Gesamtfläche unterhalb des Kurvenverlaufs. Das Verteilungsvolumen in der terminalen Phase lag bei ca. 7,4 l/kg, die Eliminationsrate wurde mit ca. 6,3 l/h/kg) bestimmt (siehe Figur 2).
Beispiel 4: Demonstration der biologischen Wirksamkeit von PIIICP und PIIINP
Die biologische Wirksamkeit der Substanzen kann in Zellkulturassays und in vivo demonstriert werden. Nach Applikation der Inhibitoren kann in humanen Zellinien z.B. der Abfall der Konzentration an freiem α-ι(lll) Propeptid in den Überständen gemessen werden, weil dieses Peptid durch die Aktivität der PCP freigesetzt wird. Zur Messung der PIIICP-Konzentrationen im Überstand kann ein kürzlich etablierter Assay verwendet werden (Burchardt, 1997, und Patentanmeldungen: An immunoassay for procollagen- lll-C-terminal propeptide (WO09924835A2 und EP00988964A1)).
In dieser Patentanmeldung wird beispielhaft die biologische Wirksamkeit von PIIICP4.1 (Herstellung beschrieben in Burchardt, 1998, und in den Patenten: An immunoassay for procollagen-lll-C-terminal propeptide (WO09924835A2 und EP00988964A1); Gewinnung und Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben), PIIINP4.5.2 (Herstellung beschrieben im Patent: Monocional antibody and assay for detecting PIIINP (WO09961477A2); Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben) und von murinem rekombinantem PIIINP (Herstellung beschrieben in Kauschke, 1999; Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben) im Modell der CCI -induzierten Leberfibrose in der Maus beschrieben.
Für PIIICP wird beipielhaft die antifibrotische Wirkung von 3 verschiedenen Dosen dieser Verbindung in diesem Tiermodell beschrieben.
Je nach Organmanifestation oder Art der fibrotischen Schädigung können auch Tiermodelle für andere Fibrosemanifestationen, z.B. im Herzen, in den Nieren, in den Lungen, in der Haut oder anderen Organen verwendet werden.
Im Beispiel der CCI4-induzierten Leberfibrose in der Maus wird die Reduktion der Collagenablagerung von PIIICP und PIIINP durch quantitative Morphometrie beschrieben. Sie kann z.B. auch durch die Bestimmung des Hydroxyprolingehalts (Gerling, 1996) der fibrotischen Organe oder durch quantitative Morphometrie erfolgen (Kauschke 1999). Außerdem wird im Beispiel die organprotektive Wirkung von PIIICP und PIIINP durch Verringerung der Zellschädigung beschrieben, die durch die Messung der Aktivitäten von intracellulären Markerenzymen (z.B. GIDH) bestimmt wird. Die Messung der organprotektiven Wirkung kann auch auf andere Weise erfolgen, z.B. durch Messung der Hemmung des Ausmaßes von Apoptosen und Nekrosen oder ähnlichem. Materialien und Methoden
Tierversuche: Den Versuchstieren wurde über den gesamten Versuchszeitraum zweimal pro Woche je 100 g Körpergewicht 0,2 ml einer Mischung aus CCI und Mineralöl im Verhältnis 1 :8 oral verabreicht. Die Substanzgabe erfolgte durch eine tägliche intraperitoneale Applikation von 0,5 ml einer Substanzverdünnung. Bei den Fibröse- und Intaktkontrollen wurde Pufferkontrollösung ohne Procollagen-Propeptide appliziert. Die Tiere hatten während des gesamten Versuchs freien Zugang zu Standardfutter und Wasser. Das Körpergewicht der Tiere wurde zu Beginn und am Ende des Versuchs gemessen. Bei Beendigung des Versuches wurde das Naßgewicht der Leber bestimmt, die Leber für die anschließenden Untersuchungen portioniert und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung bis zur Verwendung erfolgte bei -80°C. Es wurden auch Plasmaproben von den Versuchstieren genommen, um darin klinisch-chemische Parameter zu bestimmen.
Gesamtcollagenfärbung mit Sirius Red/Fast Green: 14 μm-Gefrierschnitte wurden über Nacht getrocknet. Nach einer zehnminütigen Behandlung mit einer 10% (v/v) Formaldehydlösung wurden die Schnitte zweimal jeweils fünf Minuten mit H20 dest. gewaschen. Die Picrosirius Rot-Färbung wurde 30 min lang bei Raumtemperatur in einer 0,1 % (w/v) Sirius Rot-Lösung in gesättigter Pikrinsäure (zusätzlich pro 400 ml eine PBS-Tablette und 10 ml Eisessig) durchgeführt. Die Schnitte wurden erneut zweimal mit H20 dest. gewaschen und anschließend 30 min in einer 0,1% (w/v) Fast Green-Lösung in gesättigter Pikrinsäure (zusätzlich pro 400 ml eine PBS-Tablette und 10 ml Eisessig) gefärbt. Die Entfärbungs- und Entwässerungsschritte erfolgten durch eine Abfolge von Waschschritten: zehn Sekunden H20 dest, zehn Sekunden 70% (v/v) Ethanol, je eine Minute 80% (v/v) und 90% (v/v) Ethanol, dreimal je zwei Minuten reines Ethanol. Vor dem abschließenden Eindecken in Leica CV Mount wurden die Schnitte noch dreimal je 5 min lang in Xylol gewaschen.
Gesamt-RNA-Präparation aus Gewebe: Etwa 20 mg Gewebe wurden in flüssigem Stickstoff gemörsert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Das Gewebepulver wurde mit 600 μl Puffer RLT (mit 0,1% (v/v) ß-Mercaptoethanol) versetzt, homogen gemischt und auf eine QIAshredder-Säule aufgetragen. Die Säule wurde 2 min bei 18.000 g und 4°C zentrifugiert. Die zurückgehaltenen festen Bestandteile wurden verworfen, der Durchfluß weiterverwendet. Die folgende Aufarbeitung erfolgte mit Hilfe des RNeasy Total RNA Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellervorschrift. Eluiert wurde mit 35 μl RNase-freiem H20. Der RNA-Gehalt jeder Präparation wurde direkt im Anschluß an einem Aliquot photometrisch bestimmt, eine weitere Probe wurde mit Hilfe eines RNA-Formaldehyd-Agarosegels auf die Integrität der erhaltenen RNA-Banden hin überprüft. Die Lagerung bis zur Verwendung erfolgte bei -80°C.
cDNA-Synthese aus Gesamt-RNA: Die Synthese der cDNA aus den präparierten Gesamt-RNA-Proben erfolgte in allen Fällen mit Hilfe des SuperScript II Preamplification Systems gemäß Herstellerangaben (Gibco BRL). Sämtliche Arbeitsschritte erfolgten auf Eis. In allen Fällen wurde mit 1 μg Gesamt-RNA und Master-Mixen gearbeitet. Vor der reversen Transkription wurden eventuell vorhandene Verunreinigungen durch genomische DNA in sämtlichen Proben durch einen DNase I- Verdau beseitigt. Hierzu wurde 1 μg Gesamt-RNA mit RNase-freiem Wasser auf ein Volumen von 8 μl aufgefüllt, mit 1 μl DNase I (Superscript Kit) und 1 μl 10-fach Puffer versetzt und der Verdau 10 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Durch Zugabe von 1 μl 25 mM EDTA-Lösung und anschließender Inkubation (10 min bei 65°C) wurde der DNase I-Verdau gestoppt. Der gesamte Ansatz wurde in die cDNA-Synthese eingesetzt. Im Anschluß an die cDNA-Synthese wurden die Ansätze auf 100 μl Gesamtvolumen mit DNase-freiem Wasser aufgefüllt und bis zum Gebrauch bei -80°C gelagert. Bei allen cDNA-Synthesen wurden stichprobenartig Kontrollen auf Verunreinigungen durch genomische DNA ohne den Zusatz von Reverser Transkriptase durchgeführt.
mRNA-Konzentrationsbestimmungen mit einer TaqMan-PCR-Analyse: Die
Bestimmung spezifischer mRNA-Konzentrationen erfolgte durch eine TaqMan-Analyse. Während der PCR-Reaktion werden - durch Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase - spezifische hybridisierende fluoreszenzmarkierte Sonden gespalten und in Echtzeit das resultierende Fluoreszenzsignal gemessen. Hierbei werden Ergebnisse in Form der Zyklenzahl angegeben, an dem die freigesetzte Fluoreszenz erstmals einen vorgegebenen Schwellenwert überschreitet. Der Parameter et (threshold cycle) gibt die rechnerisch ermittelte Zyklenzahl an, bei der das gemessene Fluoreszenzsignal erstmals einen bestimmten Signalwert über dem Schwellenwert (threshold) liefert. Geringere ct-Werte geben an, daß im Ursprungsansatz eine höhere spezifische mRNA- Konzentration vorlag. Maximal kann bei der PCR-Reaktion eine Produktverdopplung mit jedem Zyklus erreicht werden. Durch Wahl von geeigneten Primern und Sonden, und durch die geringe Größe der amplifizierten Sequenz, kann annähernd eine Produktverdopplung bei jedem PCR-Zyklus während der exponentiellen Phase der Reaktion angenommen werden. Infolgedessen lassen sich aus den gemessenen Unterschieden der ct-Einheiten nach erfolgter Normierung die Unterschiede in den mRNA-Konzentrationen des betrachteten Transkripts in der ursprünglichen Probe berechnen. So bedeutet ein normierter Unterschied von 3 ct-Einheiten, daß sich bei Gültigkeit der Annahme einer Produktverdopplung mit jedem PCR-Zyklus die mRNA- Konzentrationen dieses Transkripts von den Vergleichsproben um den Faktor 8 (= 23) unterschieden.
Bei der Betrachtung der mRNA-Konzentrationen wurden sämtliche gemessenen mRNA- Konzentrationen auf die jeweilige HPRT mRNA-Konzentration normiert. Für die HPRT mRNA-Konzentration konnte gezeigt werden, daß sich diese im Rahmen einer Fibroseerkrankung nicht ändert und HPRT infolgedessen als Standard, d.h. als Bezugsniveau, dienen kann.
Sämtliche Primer und Sonden wurden in bezug auf ihre Lage auf dem Gen und dem zu erwartenden Amplifikationsprodukt so ausgesucht, daß im Rahmen der TaqMan-PCR- Reaktion in allen Fällen je Zyklus eine Verdopplung der Produktkonzentration zu erwarten war. Diese Annahmen wurden durch Kontrollexperimente im Vorfeld überprüft und bestätigt. Die Primer und die 6-FAM-markierten Sonden lagen sämtlich in Konzentrationen von 100 μM vor. Zur Vermeidung von Variabilitäten zwischen Ansätzen wurde in allen Fällen mit Mastermixen und je Ansatz mindestens mit Doppelbestimmungen gearbeitet. Die Untersuchungen eines einzelnen Transkripts erfolgte für sämtliche Proben gesammelt auf einer Platte. Bei allen Untersuchungen wurden Kontrollen ohne Template bzw. ohne vorangegangene Reverse Transkriptionsreaktion durchgeführt. Sämtliche Arbeiten fanden unter Eiskühlung statt. Je Ansatz enthielt der Mastermix 12,5 μl des TaqMan Universal PCR Master Mixes (Röche), 7,5 μl eines Primer-Sonden-Mixes (1 μM je Primer und 0,5 μM Sonde in DNase/RNase-freiem Wasser) sowie 3,75 μl DNase/RNase-freies Wasser. Pro Ansatz wurden in 96-Loch-PIatten mit optischen Deckeln 2,5 μl cDNA vorgelegt und mit 22,5 μl des Mastermixes gemischt. Die Platte wurde vor der PCR-Reaktion 1 min bei 500 g und 4°C zentrifugiert. Das Programm der TaqMan-PCR-Reaktion umfaßte eine Erwärmungsphase von 2 min bei 50°C, eine zehnminütige Denaturierung bei 95°C sowie im Anschluß 40 Zyklen mit einer Denaturierung bei 95°C für 15 Sekunden und einer kombinierten einminütigen Annealing-/ Expansionsreaktion bei 60°C. Während der Zyklen wurde automatisch jeweils zum Zeitpunkt der Denaturierung die Fluoreszenz der freigesetzten Sonden gemessen. Die Auswertung erfolgte mit der ABI PRISM Sequence Detection Software. Die Basislinie wurde bei dem Mittel der Zyklen 3 bis 15 festgelegt, der Threshold betrug 0,04. Ergebnisse
Effekte der Infusion von Procollagen (Ill)-Propeptiden im chronischen i.p.-Versuch im Mäuse-CCU-Modell: Zur Untersuchung der Effekte der rekombinant hergestellten Procollagen -ι(lll)-Propeptide auf die Ausbildung einer experimentell induzierten Leberfibrose wurden Gruppen von jeweils 10 Mäusen nur mit CCI4 (Fibrosekontrolle) bzw. zusätzlich mit Proteinlösungen mit Konzentrationen von 500 μg/ml behandelt. Auflerdem wurde eine Gruppe nur mit Pufferkontrollösung behandelt (Intaktkontrolle). Als therapeutische rekombinante Proteine wurden humanes PIIICP4.1 (Herstellung beschrieben in Burchardt, 1998, und in den Patentanmeldungen: An immunoassay for procollagen-lll-C-terminal propeptide (WO09924835A2 und EP00988964A1); Gewinnung und Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben), humanes vollständiges PIIINP 4.5.2 (Herstellung beschrieben im Patent: Monocional antibody and assay for detecting PIIINP (WO09961477A2); Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben) und murines PIIINP mit 18 Aminosäureresten der Prosequenz (als M1 bezeichnet, Herstellung beschrieben in Kauschke, 1999; Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben) verwendet.
Am Ende der Behandlung war das gelöste PIIICP in der Infusionslösung in allen Fällen nicht degradiert. Dies wurde mit einem SDS-PAGE-Gel gezeigt.
Bei allen Tieren wurden morphometrisch der Gesamtcollagenflächenanteil in Leberschnitten, die GIDH-Aktivität im Serum sowie die mRNA-Konzentrationen ausgewählter Transkripte mit einer TaqMan-Analyse gemessen. Die Proteine wurden in der verwendeten Konzentration während des untersuchten Zeitraums von den Tieren gut vertragen. Es zeigten sich keine pathologischen Auffälligkeiten, des weiteren traten keine gehäuften Sterbefälle auf.
Der morphometisch ermittelte Gesamtcollagenflächenanteil, der durch automatisierte Auswertung der Sirius Rot-gefärbten Areale bestimmt wurde, zeigte in der Fibrosekontrollgruppe die höchsten Werte (Kauschke, 1999). In den Behandlungsgruppen waren die Gesamtcollagenflächen in allen Fällen signifikant reduziert (Figur 3A). Bei PIIICP4.1 auf 71% der Fibrosekontrolle (p<0,04), bei PIIINP 4.5.2 auf 63% der Fibrosekontrolle (p<0,01) und bei M1 auf 68% der Fibrosekontrolle (p<0,02).
Bei der Betrachtung der mRNA-Konzentrationen in den Lebern zeigte sich bei CTGF in allen Behandlungsgruppen im Vergleich zur Fibrosekontrolle eine signifikante Konzentrationsverringerung (Figur 3B). Die Unterschiede im Vergleich zur Fibrosekontrolle lagen bei +1 ,9 Δct-Einheiten (PIIICP4.1 , p<0,001), bei +1 ,5 Δct- Einheiten (PIIINP 4.5.2, p<0,01) und bei +1 ,2 Δct-Einheiten (M1 , p<0,02).
Die GIDH-Serumaktivität war ebenfalls bei allen Behandlungsgruppen im Vergleich zur Fibrosekontrolle erniedrigt (Tabellel) (Kauschke, 1999). Die Serumaktivitäten lagen um 17% (PIIICP4.1 ) bzw. um 11% (PIIINP 4.5.2, M1) niedriger als in der Fibrosekontrolle. Aufgrund von individuellen Schwankungen erreichten die Abweichungen jedoch in keinem Fall das Signifikanzπiveau (p<0,05).
Bei allen Tieren mit CCI4-Applikation zeigte sich eine Reduktion des Körpergewichts (Tabelle 1). Die Behandlungsgruppen zeigten keine Unterschiede zur Fibrosekontrolle.
Das relative Lebergewicht lag in allen CCI4-Gruppen über den Intaktkontrollen. Die behandelten Tiere wiesen tendenziell ein schwach erhöhtes relatives Lebergewicht gegenüber der Fibrosekontrolle auf. Die absoluten Lebergewichte zwischen den Gruppen waren nicht signifikant unterschiedlich (Tabelle 1).
Die mRNA-Konzentrationen der Transkripte Collagen Typ III und Typ I, TGFßi (Tabelle 1) sowie Lysyloxidase, MMP-1 , PAI-1 und Tenascin (Daten nicht gezeigt) zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen der Fibrosekontrollgruppe und den Behandlungsgruppen mit den Procollagen αι(lll)-Propeptidapplikationen.
Genauere Dosis-Wirkungsuntersuchungen der in wVo-Effekte nach PIIICP4.1- Infusion: Genauere Studien der in wVo-Effekte des rekombinant hergestellten PIIICP4.1 -Proteins (Herstellung beschrieben in Burchardt, 1998, und in den Patentanmeldungen: An immunoassay for procollagen-lll-C-terminal propeptide (WO09924835A2 und EP00988964A1); Gewinnung und Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben) auf die Ausbildung einer experimentell induzierten Leberfibrose wurden im Mäuse-CCI4-Modell durchgeführt.
Gruppen von jeweils 8 Mäusen wurden nur mit CCI (Fibrosekontrolle) bzw. zusätzlich mit PIIICP4.1 -Proteinlösungen mit Konzentrationen von 50 μg/ml PIIICP4.1 , von 150 μg/ml und von 500 μg/ml über einen Zeitraum von 14 Tagen behandelt. Außerdem wurde eine Gruppe nur mit Pufferkontrollösung behandelt (Intaktkontrolle).
Am Ende der Behandlung war das gelöste PIIICP in den Applikationslösungen in allen Fällen nicht degradiert. Dies wurde mit einer SDS-PAGE-Gelanalyse gezeigt.
Bei allen Tieren wurden morphometrisch der Gesamtcollagenflächenanteil in Leberschnitten, die GIDH-Aktivität im Serum sowie die mRNA-Konzentrationen ausgewählter Transkripte mit der TaqMan-Analyse gemessen.
Insgesamt wurde das Protein in allen verwendeten Konzentrationen während des Behandlungszeitraums von den Tieren gut vertragen. Es zeigten sich keine pathologischen Auffälligkeiten, des weiteren traten keine gehäuften Sterbefälle auf.
Sämtliche Tiere mit einer CCI -Applikation zeigten im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolltieren bei Beendigung des Versuchs ein geringeres Körpergewicht (s. Tabelle 2). Im Vergleich zur Fibrosekontrolle zeigte sich den PIIICP-Gruppen allerdings keine signifikanten Unterschiede. Lediglich tendenziell wogen die Tiere mit PIIICP-Applikation, unabhängig von der erhaltenen Konzentration, etwas mehr.
Das relative Lebergewicht lag in allen CCI -behandelten Gruppen über den Werten der unbehandelten Intaktkontrolle. Es gab keine signifikanten Unterschiede beim Vergleich der einzelnen Behandlungsgruppen mit der Fibrosekontrolle (Tabelle 2).
Bei Betrachtung der morphometrisch ermittelten Gesamtcollagenablagerung, die über eine automatisierte Auswertung der Sirius Rot-gefärbten Areale erfolgte, zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Tiergruppen (Figur 4A). Nach chronischer Behandlung mit i.p.-applizierter renaturierter PIIICP4.1 -Lösung wurde in allen Behandlungsgruppen ein verringerte Gesamtcollagenfläche gemessen. In der Behandlungsgruppe mit der niedrigsten PIIICP-Dosis (50 μg/ml) war die Gesamtcollagenfläche um 32% signifikant gegenüber der Fibrosekontrolle reduziert (p<0,05). Nach einer Behandlung mit 150 μg/ml PIIICP4.1 betrug die signifikante Reduktion gegenüber der Fibrosekontrolle 44% (p<0,02). Die Behandlungsgruppe mit der höchsten Proteinkonzentration (500 μg/ml PIIICP4.1) wies deutliche Schwankungen der gemessenen Gesamtcollagenfläche innerhalb der Behandlungsgruppe auf und eine Reduktion der Gesamtcollagenfläche um 31%. Im Vergleich zur Fibrosekontrolle wurde das Signifikanzniveau (p<0,05) nicht erreicht.
Der parallel im Serum bestimmte klinische Parameter der GIDH-Aktivität als Maß für die Zellschädigung war in den zusätzlich mit PIIICP4.1 -Proteinlösung behandelten Gruppen im Vergleich zur Fibrosekontrolle deutlich reduziert (Tabelle 2). Nach einer chronischen Behandlung mit 50 μg/ml PIIICP4.1 wies die GIDH-Serumaktivität 68% der Aktivität der Fibrosekontrolle auf, nach 150 μg/ml PIIICP4.1 bei 60% der Fibrosekontrolle und nach 500 μg/ml PIIICP4.1 bei 67% der Fibrosekontrolle. Lediglich nach Behandlung mit 150 μg/ml PIIICP4.1 war die Reduktion im Vergleich zur Fibrosekontrolle signifikant (p<0,05). In den beiden anderen Behandlungsgruppen wurde aufgrund der Schwankungen der Resultate von Tier zu Tier das Signifikanzniveau jeweils nicht erreicht.
Nach der Normierung auf HPRT zeigten sich bei allen Transkripten (Collagen Typ I , Collagen Typ III, Tenascin, PAI-1 , MMP-1 , Lysyloxidase und CTGF) Unterschiede zwischen den Intaktkontrolltieren (ohne CCI4-Applikation)und den Fibrosekontrollen. Es handelte sich bei allen untersuchten Transkripten um Gene, die an der Synthese der Extrazellulärmatrix beteiligt sind. Infolgedessen lagen die mRNA-Konzentrationen in den Fibrosekontrollen im Durchschnitt um den Faktor 6-10 höher als in den Intaktkontrollen.
Signifikante Unterschiede zwischen zusätzlich zur CCI4-Schädigung mit PIIICP4.1- behandelten Tieren und der Fibrosekontrolle wurden bei den untersuchten Transkripten für das CTGF-Transkript gemessen (Figur 4B). Bei 50 μg/ml PIIICP4.1 lag der Unterschied bei +0,74 Δct-Einheiten (p<0,04), bei 150 μg/ml bei +0,75 Δct-Einheiten (p<0,05) und bei 500 μg/ml PIIICP4.1 bei +1 ,41 Δct-Einheiten (p<0,02).
Beispiel 5: Immunhistochemischer Nachweis von PIIICP auf Leberschnitten
Material und Methoden
Modell der Leberfibrose bei der gallengangsligierten Ratte: Bei nüchternen weiblichen Sprague-Dawley-Ratten wurde während einer Barbituratnarkose nach medialer Öffnung des Oberbauches der Hauptgallengang isoliert. Mittels eines eingeführten Katheders wurde das Gallengangsystem durch Applikation von ca. 0.1 ml Ethibloc je Tier verschlossen. Der Gallengang wurde anschließend distal und proximal ligiert und durchtrennt. Intaktkontrolltiere wurden ebenfalls operiert, es unterblieb jedoch der Verschluß des Gallengangsystems. Die PIIICP4.1 -Applikation (Herstellung beschrieben in Burchardt, 1998, und in den Patentanmeldungen: An immunoassay for procollagen-lll-C-terminal propeptide (WO09924835A2 und EP00988964A1); Gewinnung und Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiele 1 und 2 beschrieben) erfolgte über eine venöse Dauerinfusion mittels eines implantierten Verweilkatheders.
Die Implantation des Vena femoralis-Katheders erfolgte parallel zur Gallengangocclusion. Hierzu wurde die Haut im Bereich der rechten Leiste eröffnet und die Vena femoralis atraumatisch isoliert und durch zwei Ligaturen fixiert. Nach Inzision wurde ein Venenkatheder herzwärts eingeführt und fixiert. Der Katheder wurde anschließend mittels eines Trocars subcutan zum Nacken geführt und die Operationswunde durch eine Hautnaht verschlossen. Über ein Halsband wurde der Venenkatheder durch eine Protektionsspirale an einen Rotationsadapter angeschlossen, der mit einer Infusionspumpe gekoppelt war. Zur Infektionsprophylaxe wurde postoperativ 0,1 ml Tardomyocel subcutan appliziert.
Der Beginn der PIIICP4.1 -Infusion mit einer Proteinkonzentration von 300 μg/ml erfolgte 24 h nach der Operation. Intakt- und Fibrosekontrollen bekamen Pufferkontrollinfusionen. Die Infusion erfolgte mit einer Flußrate von 0,2 ml je Stunde über einen Zeitraum von sieben Tagen. Die Infusionslösung wurde während des gesamten Versuchszeitraums gekühlt (ca. 7°C).
Die Ratten verbrachten die Versuchsdauer in einem Rundkäfig mit freiem Zugang zu Standardfutter und Wasser. Das Körpergewicht der Tiere wurde zu Beginn und am Ende gemessen. Bei Beendigung des Versuches wurde die Leber für die anschließenden Untersuchungen portioniert und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei -80°C gelagert. Gewebefixierung für die Immunhistochemie: Die Gewebe für immunhistochemische Untersuchungen wurden 24 h in 3,6% (v/v) Formaldehydlösung fixiert. Nach dem Auswaschen mit destilliertem Wasser wurde das Wasser über eine aufsteigende Reihe mit Ethanol entfernt und die Gewebe in 52°C Paraffin eingebettet.
Immunhistochemie: 5 μm Paraffinschnitte wurden entparaffiniert. Hierzu wurden die Schnitte suksessive mit Xylol, mit reinem Ethanol und anschließend über eine Konzentrationsreihe einer Ethanol-Wasser-Mischung (90% (v/v), 80% (v/v), 70% (v/v)) in reines Wasser überführt. Nach fünfminütiger Behandlung mit 3,6% (v/v) H2O2 wurde mit destilliertem H20 gewaschen. Anschließend wurde fünf Minuten mit PBS gewaschen. Geblockt wurde 20 min lang in einer Lösung aus 5% (w/v) Magermilchpulver und 1% (w/v) BSA in PBS. Nach zweimaligem Waschen für jeweils drei min PBS wurde der Primärantikörper (monoklonaler Maus-anti-PIIICP-Antikörper 48D19) in einer Konzentration von 4 μg/ml in PBS zugesetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach weiteren zwei Waschschritten wurde gemäß des ExtrAvidin Peroxidase Staining Kits (Sigma Aldrich) vorgegangen. Die Schnitte wurden mit biotinylierten Anti-Maus IgG's in einer Verdünnung von 1 :15 in PBS mit 1 % (w/v) BSA 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zwei Waschschritten wurde 20 min bei Raumtemperatur mit einer 1 :15-Verdünnung der ExtrAvidin-Peroxidase behandelt. Diese Verdünnung wurde mit PBS mit einem Zusatz von 1% (w/v) BSA hergestellt. Im Anschluß an einen zweimaligen Waschvorgang wurden die Gewebeschnitte mit Hilfe des DAB-Systems (je 1 Tablette pro 5 ml Wasser) (Sigma Aldrich) 10 min lang entwickelt. Reste der Färbelösung wurden mit H20 dest. entfernt. Die Gegenfärbung der Zellkerne wurde mit Hämalaun durchgeführt. Die Gewebeschnitte wurden für 1 min in eine saure Hämalaunlösung nach Mayer (1 :4 Verdünnung mit dest. H20) gelegt, der Farbstoff anschließend mit dest. H20 ausgewaschen. Die Schnitte wurden durch fünfminütige Behandlung mit Leitungswasser gebläut. Nach einem Waschschritt in H20 dest. wurden die Schnitte entwässert. Mit Hilfe von wäßrigen Ethanollösungen aufsteigender Konzentration wurde das Wasser entzogen (70% (v/v), 80% (v/v), 90% (v/v), abschließend dreimal reines Ethanol). Die entwässerten Gewebeschnitte wurden dreimal je 5 min lang in Xylol gewaschen und mit dem Kunstharz Leica CV Mount eingedeckt.
Ergebnisse
Figur 5 zeigt immunhistochemische Untersuchungen mit dem anti-PIIICP-Antikörper 48D19 auf repräsentativen Schnitten aus Rattenlebern. Eine Leberfibrose wurde durch eine Gallengangligatur induziert. Im Anschluß wurde durch einen Dauerkatheder für sieben Tage eine PIMCP-Protein- bzw. eine Pufferkontrollösung infundiert.
Bei der Intaktkontrolle, d.h. Scheinoperation und Infusion einer Pufferkontrollösung, zeigten sich kaum immunhistochemische Anfärbungen mit dem PIIICP-Antikörper (Figur 5A).
Die Fibrosekontrolle wies eine starke Schädigung der Leber auf (Figur 5C). Es zeigte sich eine massive Proliferation der Gallengänge bei den geschädigten Lebern. Im Bereich der Sinusoide waren einzelne Zellen, die sich auf Kontrollschnitten als - Glattmuskelzellaktin- (α-SMA-) positiv erwiesen hatten, stark angefärbt. Es handelte sich um transformierte hepatische Sternzellen, die selektiv angefärbt waren. Die Sinusoiden waren in ihrem Durchleitungsvermögen deutlich eingeschränkt. Eine Anfärbung der Hepatozyten konnte nicht festgestellt werden.
Auf Schnitten von Tieren mit Gallengangligatur und PlllCP-Infusionslösung zeigte sich ebenfalls die starke intrazelluläre Anfärbung von hepatischen Sternzellen (Figur 5B). Im Gegensatz zur Fibrosekontrolle wiesen diese Zellen jedoch zusätzliche intrazelluläre Anfärbungen in Form von Granula auf. Diese intrazellulären Anfärbungen wurden hier außerdem bei Hepatozyten mit Zugang zu den Sinusoiden festgestellt. Soweit ersichtlich, gab es keine spezifische Immunreaktion im Zellkern. Das Ausmaß der Fibröse war im Vergleich zur Fibrosekontrolle geringer. Literatur
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Claims

Patentansprüche
1. Arzneimittel enthaltend
(a) ein (Poly)peptid, das das N-terminale Procollagen (Ill)-Propeptid und/oder das C-terminale Procollagen (Ill)-Propeptid umfaßt oder
(b) ein Fragment oder Derivat davon mit im wesentlichen der antifibrotischen Aktivität des (Poly)peptids (a) und/oder
(c) ein Peptid, das die Erkennungssequenz der Procollagen-C-Protease vom Typ III und/oder ein Peptid, das die Erkennungssequenz der Procollagen- N-Proteinase vom Typ III umfaßt, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1 , wobei das (Poly)peptid oder Fragment oder Derivat und/oder das Peptid vom humanen Procollagen (III) stammt oder abgeleitet ist.
3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das die Erkennungssequenz umfassende (Poly)peptid 10 bis 15 Aminosäuren N-terminal von der Spaltstelle umfaßt.
4. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das die Erkennungssequenz umfassende (Poly)peptid 10 bis 15 Aminosäuren C-terminal von der Spaltstelle umfaßt.
5. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das (Poly)peptid ein Fusionsprotein ist.
6. Arzneimittel nach Anspruch 5, wobei das (Poly)peptid einen His-Tag enthält.
7. Arzneimittel nach Anspruch 6, wobei der His-Tag 6 His-Tag ist und N-terminal angefügt ist.
8. Verwendung eines (Poly)peptids oder Fragmentes oder Derivates davon, wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels oder Medizinproduktes zur Behandlung oder Vorbeugung von fibrotischen Erkrankungen.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die fibrotischen Krankheiten ausgewählt sind aus systemischer oder lokaler Sklerodermie, Leberfibrosen unterschiedlichen Ursprungs, wie z.B. alkoholischer Leberzirrhose, biliärer Zirrhose, Hepatitiden viraler oder anderer Genese, der sogenannten "veno- occlusive disease", idiopathischen interstitiellen Fibrösen, idiopathischen Lungenfibrosen, akuten pulmonalen Fibrösen, dem "acute respiratory distress syndrome" (ARDS), perimuskulären Fibrösen, perizentralen Fibrösen, Dermatofibromen, Nierenfibrosen, der diabetische Nephropathie, Glomerulonephritiden, Keloiden, der hypertrophen Narbenbildung, Gelenkadhäsionen, Arthrosen, Myelofibrosen, Vernarbungen der Cornea, der cystischen Fibröse, muskulären Fibrösen, der Duchenne'schen Muskeldystrophie, Ösophagusstrikturen, Morbus Ormond, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, atherosklerotische Veränderungen, pulmonaler Hypertonie, Angiopathien der Arterien und Venen und Aneurysmen der großen Gefäße oder sind hervorgerufen oder initiiert durch chirurgische Narbenrevisionen, plastischchirurgische Eingriffe, Glaukome, Kataraktfibrosen, Vernarbungen der Cornea, die sogenannte "graft versus host disease", chirurgische Eingriffe an Sehnen, Nerveneinklemmungssyndrome, die Dupuytren'sche Kontraktur, Adhäsionen infolge gynäkologischer Eingriffe, pelvische Adhäsionen, Infertilität, peridurale Fibrösen, Erkrankungen der Schilddrüse oder der Nebenschilddrüsen, durch metastatischen Knochenbefall, durch das multiple Myelom oder durch Restenosen.
10. Verfahren zur Herstellung von renaturiertem N-terminalen Procollagen (III)- Propeptid und/oder C-terminalen Procollagen (Ill)-Propeptid, wobei man
(a) nach üblichen Verfahren mit E. coli rekombinant hergestellte, das/die Propeptid(e) enthaltende Einschlußkörper in einem 0,5 bis 8 M denaturierenden Puffer löst;
(b) den Puffer gemäß (a) einem Grenzverdünnungspuffer zutropft, der um einen neutralen pH-Wert herumpuffert, L-Arginin in einer Endkonzentration von 200 bis 1000 mM und ein Disulfidbrücken-reduzierendes gekoppeltes Redoxsystem enthält, bis ein Volumenverhältnis des denaturierenden Puffers zu Grenzverdünnungspuffer von höchstens 1 :3 erreicht ist;
(c) das Puffergemisch gemäß (b) mindestens 2 Stunden gegen einen physiologischen Puffer, der L-Arginin in einer Endkonzentration von 50 bis 200 mM und ein Disulfidbrücken-reduzierendes gekoppeltes Redoxsystem enthält, dialysiert;
(d) das Puffergemisch gemäß (c) mindestens 2 Stunden gegen einen physiologischen Puffer, der ein Disulfidbrücken-reduzierendes gekoppeltes Redoxsystem enthält, dialysiert; und
(e) das Puffergemisch gemäß (d) mindestens 2 Stunden gegen einen physiologischen Puffer dialysiert.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei dem Puffer in mindestens einem der Schritte (b) bis (d) ein Chelator zugesetzt ist.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , wobei das Redoxsystem Glutathion reduziert - Glutathion oxidiert ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei dem Puffer in mindestens einem der Schritte (b) bis (d) ein weiterer Proteasehemmstoff zugesetzt ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei dem Puffer in einem der Schritte (c) und/oder (d) ein Salz in einer Endkonzentration von etwa 10 mM zugesetzt ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei der denaturierende Puffer in Schritt (a) Harnstoff in einer Endkonzentration von 0,5 bis 8 M enthält.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei als Puffermittel Trizma- Base eingesetzt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 10, wobei man die Dialyseschritte bei etwa 4°C durchführt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, wobei man in den Schritten (c) bis (e) gegen mindestens das 100-fache Dialysepuffervolumen dialysiert.
19. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, wobei man das nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18 hergestellte renaturierte N- terminale Procollagen (Ill)-Propeptid und/oder C-terminale Procollagen (III)- Propeptid nach üblichen Verfahren einengt oder lyophilisiert und mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel versetzt.
20. Verwendung eines N-terminalen Procollagen (Ill)-Propeptids und/oder eines C- terminalen Procollagen (Ill)-Propeptids, das nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18 hergestellt wurde, zur Behandlung oder Vorbeugung von fibrotischen Erkrankungen.
21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die fibrotischen Krankheiten ausgewählt sind aus systemischer oder lokaler Sklerodermie, Leberfibrosen unterschiedlichen Ursprungs, wie z.B. alkoholischer Leberzirrhose, biliärer Zirrhose, Hepatitiden viraler oder anderer Genese, der sogenannten "veno- occlusive disease", idiopathischen interstitiellen Fibrösen, idiopathischen Lungenfibrosen, akuten pulmonalen Fibrösen, dem "acute respiratory distress syndrome" (ARDS), perimuskulären Fibrösen, perizentralen Fibrösen, Dermatofibromen, Nierenfibrosen, der diabetische Nephropathie, Glomerulonephritiden, Keloiden, der hypertrophen Narbenbildung, Gelenkadhäsionen, Arthrosen, Myelofibrosen, Vernarbungen der Cornea, der cystischen Fibröse, muskulären Fibrösen, der Duchenne'schen Muskeldystrophie, Ösophagusstrikturen, Morbus Ormond, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, atherosklerotische Veränderungen, pulmonaler Hypertonie, Angiopathien der Arterien und Venen und Aneurysmen der großen Gefäße oder sind hervorgerufen oder initiiert durch chirurgische Narbenrevisionen, plastischchirurgische Eingriffe, Glaukome, Kataraktfibrosen, Vernarbungen der Cornea, die sogenannte "graft versus host disease", chirurgische Eingriffe an Sehnen, Nerveneinklemmungssyndrome, die Dupuytren'sche Kontraktur, Adhäsionen infolge gynäkologischer Eingriffe, pelvische Adhäsionen, Infertilität, peridurale Fibrösen, Erkrankungen der Schilddrüse oder der Nebenschilddrüsen, durch metastatischen Knochenbefall, durch das multiple Myelom oder durch Restenosen.
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