WO2000027377A2 - Phosphinat-peptidanaloga zur behandlung von fibrotischen erkrankungen - Google Patents

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Definitions

  • Phosphinate peptide analogues for the treatment of fibrotic diseases are Phosphinate peptide analogues for the treatment of fibrotic diseases.
  • the invention relates to the use of phosphinate peptide analogs as inhibitors of procollagen C proteinase (PCP) for the treatment of fibrotic diseases.
  • PCP procollagen C proteinase
  • PCP Procollagen C proteinase
  • PCP is probably also responsible for the hydrolytic cleavage of the propeptide sequence of the lysyl oxidase.
  • the cleavage of the prosequence probably leads to the activation of the catalytic lysyl oxidase activity of the matures
  • PCP-like proteases can release TGFß-like growth factors from an inactive complex with TGFß binding proteins [cf. Marques G, Musacchio M, Shimell MJ, Wünnenberg-Stapleton K, Cho KWY, O'Connor MB: Production of a DPP activity gradient in the early drosophila embryo through the opposing actions of the SOG and TLD proteins, Cell 91: 417-426 (1997);
  • TGFß-like growth factors The binding partner of the TGFß-like growth factors is decomposed by specific proteolysis.
  • the PCP may also have a TGFß agonistic activity. Therefore, the PCP can be assigned a crucial role in fibrogenesis.
  • the PCP activity is due to splicing variants of the BMP-I gene [cf. Kessler E, Takahara K, Biniaminow L, Brusel M, Greenspan DS: Bone morphogenetic protein-1: The type I procollagen C-proteinase, Science 271: 360-362 (1996)); Reddi AH:
  • BMP-1 Resurrection as procollagen C proteinase. Science 217: 463 (1996); Li SW, Sieron AL, Fertala A, Hojima Y, Arnold WV, Prockop DJ: The C-proteinase that processes procollagens to fibrillar collagens is identical to the protein previosly identified as bone-morphogenetic protein- 1. Proc. Natl. Acad. Be. USA 93: 5127-5130 (1996)]. So far it has been ensured that the splice variants BMP I-I and BMP I-III
  • PCP belongs to the family of astacin proteases.
  • the crystal structure of Astacin is known in detail.
  • R 1 represents hydrogen or methyl
  • Physiologically acceptable salts are preferred in the context of the invention.
  • Physiologically acceptable salts are generally salts of the compounds according to the invention with inorganic or organic acids. Salts with inorganic acids, such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid or sulfuric acid, or salts with organic carboxylic or sulfonic acids, such as acetic acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid, benzoic acid, are preferred. acid, or methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, phenylsulfonic acid, toluenesulfonic acid or naphthalenedisulfonic acid.
  • the compounds according to the invention can exist in stereoisomeric forms which either behave like image and mirror image (enantiomers) or do not behave like image and mirror image (diastereomers).
  • the invention relates to both the antipodes and the racemic forms as well as the diastereomer mixtures.
  • the compounds of the general formula (I) can exist in all enantiomeric and diastereomeric forms.
  • Preferred isomers are those in which the parts of the molecule formed from proline, lysine and leucine have the L configuration, as well as their salts and prodrugs.
  • Phosphinate peptide analogs of the general formula (I) with the configuration shown are particularly preferred
  • R 1 represents hydrogen or methyl
  • the compound of the general formula (Ib) is very particularly preferred
  • the compounds of the general formula (I) are known and can in principle be prepared from corresponding phosphinate compounds by customary methods of peptide synthesis [cf. see Yiotakis A, Vassilio S, Jiracek J, Dive V: Protection of the Hydroxyphosphinyl Function of Phosphinic Dipeptides by Adamantyl. Application to the Solid-Phase Synthesis of Phosphinic Peptides, J. Org. Chem. 61: 6601-6605 (1996); Campagne JM, Coste J, Guillou L, Heitz A, Jouin P: Solid phase synthesis of phosphinic peptides, Tetrahedron Lett. 34: 4181-4184
  • Meprin I ⁇ IG-Q
  • This loop forms the essential part of the Sl 'binding pocket of the astacin-like proteases.
  • astacin and meprin lies the key to the different substrate and inhibitor specificity of both enzymes.
  • Meprin and Astacin differ very clearly in the Sl 'pocket.
  • the PCP also has two proline residues and one lysine residue in this region. How through
  • the compounds according to the invention are distinguished by a very high potency in inhibiting PCP.
  • the compounds according to the invention are therefore suitable for the treatment of liver fibrosis of any genesis and fibrosis with a different organ manifestation.
  • liver fibrosis of different origins, such as e.g. alcoholic cirrhosis of the liver, biliary cirrhosis, hepatitis viral or other genesis, idiopathic interstitial fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, acute pulmonary
  • Fibrosis the acute respiratory distress syndrome (ARDS), perimuscular fibro- sen, pericentral fibrosis, dermatofibromas, renal fibrosis, diabetic nephropathy, glomerulonephritis, systemic or local scleroderma, keloids, hypertrophic scarring, joint adhesions, arthrosis, myelofibrosis, scarring of the cornea, muscular fibrosis, the cystic fibrosis, the cystic fibrosis, the cystic fibrosis muscular dystrophy, esophageal stricture, 'Ormond's disease,
  • the invention also includes fibrotic diseases which are initiated or caused by surgical scar revisions, plastic surgery, glaucoma, cataract fibrosis, scarring of the cornea, the so-called "graft versus host disease", surgical interventions on tendons, nerve pinching syndromes, the Dupuytren's contracture , Adhesions due to gynecological interventions, pelvic adhesions, peridural fibrosis, diseases of the thyroid or parathyroid glands, due to metastatic bone infestation, multiple myeloma or restenosis.
  • a synthetic decapeptide substrate with the sequence was used to detect the PCP activity
  • This peptide frequency corresponds to the region in the
  • Procollagen ⁇ 2 (I) which is cleaved by PCP.
  • the fission sequence is known to biochemical experts [cf. Lee ST, Kessler E, Greenspan DS: Analysis of site-directed mutations in human pro- ⁇ 2 (I) collagen which block cleavage by the C-proteinase, J. Biol. Chem. 265: 21992-21996 (1990)] as well the procedure of the dequench test [cf. Matayoshi ED, Wang GT, Krafft GA, Erickson J: Novel fluorogenic substrates for assaying retroviral proteases by resonance energy transfer, Science 247: 954-958 (1989)].
  • the concentration of the synthetic peptide was 5.6 ⁇ M, the final buffer conditions were: 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl and 0.005% Br ' ij35.
  • the kinetic test was carried out as described below: The fluorescent substrate was dissolved in 90 ⁇ l reaction buffer. The kinetics of substrate turnover by PCP was detected in duplicate by fluorescence measurement (Ex. 355 nm / Em. 538 nm) between 0 to 120 min. The reaction was through
  • the relative substrate turnover in% of the total amount was calculated from:
  • Ft is the relative fluorescence after a time interval t under incubation with PCP.
  • Ft is the corresponding relative fluorescence after the time interval t without PCP addition
  • Ftotal is the fluorescence after total hydrolysis by adding proteinase K
  • Fini is the initial relative fluorescence before the start of the reaction by adding proteinase K.
  • the PCP activity used was typically adjusted so that approximately 20% of the substrate was reacted with the inhibited enzyme within the measurement period.
  • Figure 1 is a typical reaction kinetics (% conversion) 'with the addition of
  • Phosphinate inhibitors Z- PKF (PC) APL-O-Me Phosphinate inhibitors Z- PKF (PC) APL-O-Me.
  • Figure 2 shows the concentration-activity relationship of a phosphinate inhibitor.
  • Meprin is an enzyme from the family of astacin proteases that occurs in humans (Stöcker W, Gomis-Rüth FX, Bode W, Zwilling R: Implications of the three-dimensional structure of astacin for the structure and function of the astacin family of zinc- endopeptidases, Eur. J. Biochem. 214: 215-231 (1993)).
  • the __- meprine activity test was carried out completely analogously to the in vitro assay for measuring the PCP activity. Instead of the recombinant PCP, human meprin was used, which also converts the fluorescence-labeled decapeptide.
  • Figure 3 shows the specificity of the highly effective phosphinate peptide analog Z - PKF (PC) APL - O-Me for PCP. Even at concentrations up to 100 nM (dose-dependent), Meprin is only insignificantly inhibited during the conversion of the fluorescence-labeled peptide. Demonstration of biological effectiveness
  • liver fibrosis by bile duct ligation [cf. Kountouras J, Billing B, Scheuer P: Prolonged bile obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat, Br. J. Exp. Pathol. 1984; 65: 305-311 (1984)] or the liver fibrosis induced by heterologous serum [cf. Bhunchet E, Wake K .: Suppression of experimental hepatic fibrosis by administration of vitamin A, Lab. Invest. 1985; 52: 182-194 (1985)] can be used.
  • Other animal models with liver fibrosis can also be used to demonstrate the antifibrotic effect.
  • animal models can also be used for other fibrosis mam stations, for example in the heart, kidneys, lungs, skin or other organs.
  • the reduction in collagen deposition can be determined, for example, by determining the hydroxyproline content [cf. Gerling B, Becker M, Waldschmidt J, Rehmann M, Schuppan D .: Elevated serum amino terminal procollagen type-III-peptide parallels collagen accumulation in rats with secondary biliary fibrosis, Hepatology 1996; 25: 79-84 (1996)] of the fibrotic organs or by quantitative morphometry [cf.
  • Figure 1 shows the substrate turnover of the DABCYL-EDANS decapeptide by recombinant PCP as a function of time. The enzyme activity is almost completely inhibited in the presence of 100 nM inhibitor.
  • Figure 2 shows the concentration-activity relationship of the phosphinate inhibitor
  • Figure 3 shows the specificity of the highly effective phosphinate peptide analog Z - PKF (PC) APL - O-Me for PCP. Even at concentrations up to 100 nM (dose-dependent), Meprin is only insignificant in the implementation of the fluorescence-labeled
  • the present invention also includes pharmaceutical preparations which, in addition to inert, non-toxic, pharmaceutically suitable auxiliaries and excipients, contain one or more compounds of the general formula (I) or which consist of one or more active compounds of the formulas (I), and processes for the preparation of these preparations.
  • the active compounds of the formulas (I) should be present in these preparations in a concentration of 0.1 to 99.5% by weight, preferably 0.5 to 95% by weight, of the total mixture.
  • the pharmaceutical preparations can also contain other pharmaceutical active ingredients.
  • the pharmaceutical preparations listed above can be prepared in a customary manner by known methods, for example using the excipient or excipients.
  • the active compound (s) in a total amount of about 0.01 to about 100 mg / kg, preferably in total amounts of about 1 mg / kg to 50 mg / kg body weight per 24 hours , if necessary in the form of several single doses, to achieve the desired result.
  • Example la The protected amine derivative from Example la is dissolved in ethanol (approx. 0.05 mol / 1) and a catalyst (10% palladium on carbon) is added under argon. The suspension is approx. 2 at room temperature under H 2 atmosphere (normal pressure)
  • Example lc The protected amine derivative from Example lc is dissolved in ethanol (approx. 0.05 mol / 1) and a catalyst (10% palladium on carbon) is added under argon. The suspension is approx. 2 at room temperature under H 2 atmosphere (normal pressure)
  • Example le (1 R) - 1 - ( ⁇ (2S) -2- amino-6 - [(tert-butoxycarbonyl) amino] hexanoyl ⁇ - amino) -2-phenylethy 1 ⁇ 3 - [(2S) - 2- ( ⁇ [(15) - 1 - (methoxycarbony l) -3 - methylbutyl] amino ⁇ carbony l) tetrahydro-1 H-pyrrole-1-yl] -2-methyl-3-oxopropyl ⁇ phosphinic acid
  • 0.3 ml of trifluoroacetic acid is added dropwise to 24.50 mg (0.03 mmol) of the compound from Example le in an ice-cooled mixture of 0.3 ml of methylene chloride and 0.03 ml of water. The cooling is removed and the mixture is stirred at room temperature for two hours before being concentrated in vacuo and dried thoroughly in a high vacuum.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Phosphinat-Peptidanaloga der allgemeinen Formel (I) als Inhibitoren der Procollagen-C-Proteinase (PCP) zur Behandlung fibrotischer Erkrankungen.

Description

Phosphinat-Peptidanaloga zur Behandlung von fibrotischen Erkrankungen
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Phosphinat-Peptidanaloga als Inhibitoren der Procollagen-C-Proteinase (PCP) zur Behandlung fibrotischer Erkrankungen.
Es ist bekannt, daß die Procollagen-C-Proteinase (PCP) ein Schlüsselenzym der Fibrogenese ist. Sie katalysiert die hydrolytische Abspaltung der Procollagen- propeptide von den Procollagenen I, II, III und IV sowie Laminin V [vgl. Amano S, Takahara K; Gerecke D, Nishiyama T, Lee S, Greenspan DS, Burgeson RE: Bone morphogenetic protein-1 is the processing enzyme for laminin 5 in human keratinocytes, Mol. Biol. Cell 7 (suppl.) 58A (1996)]. Somit ist die PCP ein Schlüsselenzym der Collagenprozessierung [vgl. Olsen BJ: Morphogenesis: collagen it takes and bone it makes, Curr. Biol. 6: 645-647 (1996)]. In BMP-I-knock-out- Mäusen wurde nachgewiesen, daß eine komplette Abwesenheit der PCP zu einer unvollständigen Collagenprozessierung mit der Ablagerung von atypischen, lockeren Collagenfibrillen fuhrt [vgl. Suzuki N, Labosky PA, Furata Y, Hargett I, Dünn R, Fogo AB, Takahara K, Peters DM, Greenspan DS, Hogan BL: Failure of ventral body wall closure in mouse embryos lacking a procollagen C-proteinase encoded by BMP-1, a mammalian gene related to Drosophila tolloid, Development 122: 3587-
3595 (1996)] .
Die PCP ist wahrscheinlich auch für die hydrolytische Abspaltung der Propeptid- sequenz der Lysyloxidase verantwortlich. Wahrscheinlich führt die Abspaltung der Prosequenz zur Aktivierung der katalytischen Lysyloxidaseaktivität der maturen
Form [vgl. Pachenko MV, Stetler-Stevenson WG, Trubetskoy OV, Gacheru SN, Kagan HM: Metalloproteinase activity secreted by fibrogenic cells in the processing of prolyslyl oxidase. Potential role of procollagen C-proteinase, J. Biol. Chem. 271 : 7113-7119 (1996)]. Aktive Lysyloxidase verknüpft gegenüberliegende Collagen- fibrillen kovalent miteinander. Auf diese Weise wird die biologische Stabilität des Collagens gegenüber dem Abbau durch Collagenasen indirekt auch durch die PCP erhöht.
Die PCP oder eng verwandte Proteine scheinen auch bei der Freisetzung von TGFß- artigen Wachstumsfaktoren eine Rolle zu spielen. Durch neue Arbeiten konnte gezeigt werden, daß PCP-ähnliche Proteasen TGFß-artige Wachstumsfaktoren aus einem inaktiven Komplex mit TGFß-Bindungsproteinen herauslösen können [vgl. Marques G, Musacchio M, Shimell MJ, Wünnenberg-Stapleton K, Cho KWY, O'Connor MB: Production of a DPP activity gradient in the early drosophila embryo through the opposing actions of the SOG and TLD proteins, Cell 91: 417-426 (1997);
Blader P, Rastegar S, Fischer N, Strähle U: Cleavage of the BMP antagonist chordin by zebrafish tolloid, Science 278: 1937-1940 (1997)]. Dabei wird der Bindungspartner der TGFß-artigen Wachstumsfaktoren durch spezifische Proteolyse zersetzt. Indirekt besitzt die PCP also möglicherweise auch eine TGFß-agonistische Aktivität. Daher kann der PCP eine entscheidende Rolle in der Fibrogenese zugesprochen werden.
Die PCP-Aktivität geht auf Splicevarianten des BMP-I-Gens zurück [vgl. Kessler E, Takahara K, Biniaminow L, Brusel M, Greenspan DS: Bone morphogenetic protein- 1 : The type I procollagen C-proteinase, Science 271: 360-362 (1996)); Reddi AH:
BMP-1: Resurrection as procollagen C-proteinase. Science 217: 463 (1996); Li SW, Sieron AL, Fertala A, Hojima Y, Arnold WV, Prockop DJ: The C-proteinase that processes procollagens to fibrillar collagens is identical to the protein previosly identified as bone-morphogenetic protein- 1. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 5127- 5130 (1996)]. Bislang ist gesichert, daß die Splicevarianten BMP I-I und BMP I-III
(tld- Variante) Procollagen und Pro-Lysyloxidase spezifisch schneiden können. Durch neuere Arbeiten wurden weitere BMP- 1 -Splicevarianten identifiziert, deren biologische Funktion und Substratspezifität aber zum Teil noch ungeklärt ist [vgl. Janitz M, Heiser V, Böttcher U, Landt O, Lauster R: Three altematively spliced variants of the gene coding for the human bone morphogenetic protein-1. J. Mol.
Med. 76: 141-146 (1998)]. Obwohl die Expressionsclonierung und Aufreinigung der PCP bisher nur in kleinen Ausbeuten gelungen ist, sind von dem Enzym zahlreiche strukturelle Details bekannt. Die PCP gehört nämlich zur Familie der Astacinproteasen. Die Kristallstruktur des Astacins ist im Detail bekannt. Zwischen der katalytischen Domäne von BMP-I und Astacin gibt es einen sehr hohen Grad an struktureller Homologie,' so daß es möglich war, vielen Aminosäuren der PCP-Proteasedomäne aufgrund dieser Homologie die wahrscheinliche strukturelle und biochemische Funktion zuzuordnen [vgl. Stöcker W, Gomis-Rüth FX, Bode W, Zwilling R: Implications of the three-dimensional structure of astacin for the structure and function of the astacin family of zinc- endopeptidases, Eur. J. Biochem. 214: 215-231 (1993)].
Durch computergesteuertes "Molecular Modelling" konnte in der Vergangenheit die Substratbindung an das aktive Zentrum der Astacine im molekularen Detail hergeleitet werden [vgl. Stöcker W, Grams F, Baumann U, Reinemer P, Gomis-Rüth FX, McKay DB, Bode W: The metzincins - Topological and sequential relations between the astacins, adamalysins, serralysins, and matrixins (collagenases) define a superfamily of zinc-endopeptidases, Prot. Sei.: 823-840 (1995)]. Diese Arbeiten führten zum "rational design" von Phosphinat-Peptidanaloga, die das Astacin mit hoher Wirkpotenz inhibieren. Der Komplex zwischen einem Phosphinatinhibitor und Astacin wurde strukturell aufgeklärt [vgl. Grams F, Dive V, Yiotakis A, Yiallouros I,
Vassilou S, Zwilling R, Bode W, Stöcker W: Structure of astacin with transition-state analogue inhibitor, Nature Struct. Biol. 3: 671-675 (1996)].
Bisher wurde trotz der hohen strukturellen Homologie zwischen Astacin und der katalytischen Domäne von BMP-1 davon ausgegangen, daß die beiden Proteasen sich aufgrund biochemischer Unterschiede hinsichtlich ihres Reaktionsverhaltens auch in der Hemmbarkeit durch Proteaseinhibitoren deutlich unterscheiden. Biochemische Unterschiede zwischen Astacin und BMP-I bestehen z.B. hinsichtlich der Substrat- spezifität (Astacin hydrolysiert als Verdauungsenzym des Flußkrebses relativ unspe- zifisch kollagenartige Proteine, während die PCP hochspezifisch an nur einer Stelle im Procollagenmolekül und in der Pro-Lysyloxidase schneidet). In der Literatur sind bisher nur niederpotente Inhibitoren der PCP beschrieben, denen eine antifibrotische Wirkung zugeschrieben wird [vgl. Brenner M, Ho WB: C- proteinase inhibitors for the treatment of disorders related to the overproduction of collagen. WO 97/05865]
Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, daß Phosphinatpeptidanaloga der allgemeinen Formel (I),
Figure imgf000006_0001
in welcher
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
und deren Salze und Isomere die PCP mit sehr hoher Wirkpotenz inhibieren und deshalb zur Behandlung und Prophylaxe von fibrotischen Erkrankungen verwendet werden können.
Im Rahmen der Erfindung sind physiologisch unbedenkliche Salze bevorzugt. Physiologisch unbedenkliche Salze sind im allgemeinen Salze der erfindungsgemäßen Ver- bindungen mit anorganischen oder organischen Säuren. Bevorzugt werden Salze mit anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure oder Salze mit organischen Carbon- oder Sulfonsäuren, wie Essigsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Benzoe- säure, oder Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Phenylsulfonsäure, Toluolsulfon- säure oder Naphthalindisulfonsäure.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in stereoisomeren Formen existieren, die sich entweder wie Bild und Spiegelbild (Enantiomere), oder die sich nicht wie Bild und Spiegelbild (Diastereomere) verhalten. Die Erfindung betrifft sowohl die Antipoden als auch die Racemformen sowie die Diastereomerengemische.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können in allen enantiomeren und diastereomeren Formen vorliegen. Bevorzugt sind diejenigen Isomeren, in denen die aus Prolin, Lysin und Leucin gebildeten Molekülteile die L-Konfiguration besitzen, ebenso wie deren Salze und Prodrugs.
Besonders bevorzugt werden Phosphinatpeptidanaloge der allgemeinen Formel (I) mit aufgezeigter Konfiguration
Figure imgf000007_0001
in welcher
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
und deren Salze und Isomere zur Behandlung und Prophylaxe von fibrotischen Erkrankungen verwendet. Ganz besonders bevorzugt wird die Verbindung der allgemeinen Formel (Ib)
Figure imgf000008_0001
im folgenden als Z— PKF(PC)APL— O-Me bezeichnet,
deren Enantiomere und deren Salze zur Behandlung und Prophylaxe von fibrotischen Erkrankungen verwendet.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind bekannt und können grundsätzlich nach üblichen Methoden der Peptidsynthese aus entsprechenden Phos- phinatverbindungen hergestellt werden [vgl. hierzu Yiotakis A, Vassilio S, Jiracek J, Dive V: Protection of the Hydroxyphosphinyl Function of Phosphinic Dipeptides by Adamantyl. Application to the Solid-Phase Synthesis of Phosphinic Peptides, J. Org. Chem. 61 : 6601-6605 (1996); Campagne JM, Coste J, Guillou L, Heitz A, Jouin P: Solid phase synthesis of phosphinic peptides, Tetrahedron Lett. 34: 4181-4184
(1993)].
Die Ergebnisse waren unerwartet, weil sich BMP-I, Meprin und Astacin vor allem im sogenannten Sl'-Loop unterscheiden. Ein Ausschnitt aus diesem Loop ist hier dargestellt:
Astacin: T-DPYD
BMP-I: KPPIG-Q
Meprin: I ~ IG-Q Dieser Loop bildet den essentiellen Teil der Sl '-Bindungstasche der Astacin-ähn- lichen Proteasen. Hier liegt, wie am Beispiel des Astacins und des Meprins gezeigt wurde, der Schlüssel zur unterschiedlichen Substrat- und Inhibitorspezifität beider Enzyme. In der Sl '-Tasche unterscheiden sich Meprin und Astacin sehr deutlich. Die PCP hat zusätzlich zwei Prolinreste und einen Lysinrest in dieser Region. Wie durch
Computermodelling der Proteasedomäne der PCP gezeigt werden konnte, ist der Lysinrest sehr wahrscheinlich an der Bindung der Carboxylgruppe in der Seitenkette des Aspartats in Pl' neben der Spaltstelle im Procollagen beteiligt. Die Prolinreste liegen nach dem Modell in der cw-Konfiguration vor und sind eine Eigentümlichkeit der BMP-I-Subfamilie unter den Astacinen. Im Gegensatz dazu spaltet Astacin nicht neben sauren Resten. Aus diesen Gründen war es völlig unerwartet, daß sich ein für die Inhibition von Astacin entworfenes Phosphinat [vgl. Yiallouros I, Vassiliou S, Yiotakis A, Zwilling R, Stöcker W, Dive V: Phosphinic peptides, the first potent inhibitors of astacin, behave as extremely slow-binding inhibitors, Biochem. J. 331 : 375-379 (1998)] als effektiver PCP-Hemmstoff erwies.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zeigen ein nicht vorhersehbares, wertvolles pharmakologisches Wirkspektrum.
Überraschenderweise zeichnen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen durch eine sehr hohe Wirkpotenz bei der Inhibition der PCP aus.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind deshalb zur Behandlung von Leber- fibrosen jeder Genese und von Fibrösen mit anderer Organmanifestation geeignet.
Dazu gehören diverse Gruppen von Krankheiten, die mit einer qualitativ veränderten Collagenproduktion oder mit einer verstärkten Ablagerung von Collagen im Extra- cellulärraum einhergehen, wie Leberfibrosen unterschiedlichen Ursprungs, wie z.B. alkoholische Leberzirrhose, biliäre Zirrhose, Hepatitiden viraler oder anderer Genese, idiopathische interstitielle Fibrösen, idiopathische Lungenfibrosen, akute pulmonale
Fibrösen, das "acute respiratory distress syndrome" (ARDS), perimuskuläre Fibro- sen, perizentrale Fibrösen, Dermatofibrome, Nierenfibrosen, die diabetische Nephro- pathie, Glomerulonephritiden, die systemische oder lokale Sklerodermie, Keloide, die hypertrophe Narbenbildung, Gelenkadhäsionen, Arthrosen, Myelofibrosen, Vernarbungen der Cornea, die cystische Fibröse, muskuläre Fibrösen, die Duchenne'sche Muskeldystrophie, Ösophagusstrikturen, Morbus ' Ormond, Morbus
Crohn, Colitis ulcerosa und Aneurysmen der großen Gefäße.
Außerdem umfaßt die Erfindung fibrotische Erkrankungen, die initiiert oder hervorgerufen werden durch chirurgische Narbenrevisionen, plastische Chirurgie, Glau- kome, Kataraktfibrosen, Vernarbungen der Cornea, die sogenannte "graft versus host disease", chirurgische Eingriffe an Sehnen, Nerveneinklemmungssyndrome, die Dupuytren'sche Kontraktur, Adhäsionen infolge gynäkologischer Eingriffe, pelvi- sche Adhäsionen, peridurale Fibrösen, Erkrankungen der Schilddrüse oder der Nebenschilddrüsen, durch metastatischen Knochenbefall, durch das multiple Myelom oder durch Restenosen.
Nachweis der PCP-Aktivität im Fluoreszenzdequenchtest
Zum Nachweis der PCP-Aktivität wurde ein synthetisches Dekapeptidsubstrat mit der Sequenz
DABCYL - Asp - Phe - Tyr - Arg - Ala - Asp - Gen - Pro - Arg - Asp (EDANS) - NH2
durch Zusatz von PCP gespalten. Diese Peptidfrequenz entspricht der Region im
Procollagen α2 (I), die von PCP gespalten wird. Die Spaltsequenz ist biochemischen Experten bekannt [vgl. Lee ST, Kessler E, Greenspan DS: Analysis of site-directed mutations in human pro-α2(I) Collagen which block cleavage by the C-proteinase, J. Biol. Chem. 265: 21992-21996 (1990)], ebenso das Verfahren des Dequenchtests [vgl. Matayoshi ED, Wang GT, Krafft GA, Erickson J: Novel fluorogenic Substrates for assaying retroviral proteases by resonance energy transfer, Science 247: 954-958 (1989)].
Die Konzentration des synthetischen Peptids war 5.6 μM, die finalen Pufferbedin- gungen waren: 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl und 0,005 % Br'ij35.
Die Durchführung des kinetischen Test erfolgte wie im folgenden beschrieben: Das Fluoreszenzsubstrat wurde in 90 μl Reaktionspuffer gelöst. Die Kinetik des Substratumsatzes durch PCP wurde in Doppelbestimmungen durch Fluoreszenzmessung (Ex. 355 nm/Em. 538 nm) zwischen 0 bis 120 min detektiert. Die Reaktion wurde durch
Zugabe einer geeigneten Aktivität von PCP, in 10 μl Reaktionspuffer gelöst, gestartet. In Zeitintervallen von anfangs 5min und später in größeren Zeitintervallen wurde die Emission als ein Maß der proteolytischen Aktivität gemessen. Als Negativkontrolle wurde der spontane Zerfall des Fluoreszenzsubstrats bei Zugabe von Reaktionspuffer ohne PCP-Aktivität gemessen. Die Fluoreszenzmessungen erfolgten über einen Zeitraum von ca. 4h bei 37°C. Nach Ablauf der Reaktion wurde das Substrat durch Zugabe von Proteinase K (Boehringer Mannheim, 1 ,44 μg/Reak- tionsansatz, gelöst in 10 μl PBS) und Inkubation bei 37°C für 20 min vollständig zersetzt. Die Vollständigkeit der Hydrolyse wurde dadurch gezeigt, daß keine Zu- nähme der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Zeit mehr erfolgte.
Der relative Substratumsatz in % der Gesamtmenge errechnete sich aus:
% Umsatz = (Ft - F-t)-(Ftotal - Fjni) x 100%
wobei Ft die relative Fluoreszenz nach einem Zeitintervall t unter Inkubation mit PCP ist. F-t ist die korrespondierende relative Fluoreszenz nach dem Zeitintervall t ohne PCP-Zusatz, Ftotal ist die Fluoreszenz nach Totalhydrolyse durch Zusatz von Proteinase K, und Fini ist die initiale relative Fluoreszenz vor Start der Reaktion durch Zugabe von Proteinase K. In dem Test wurde die verwendete PCP-Aktivität typischerweise so eingestellt, daß mit ininhibiertem Enzym innerhalb des Meßzeitraumes ca. 20 % des Substrats umgesetzt wurden.
In Abbildung 1 ist eine typische Reaktionskinetik (% Umsatz) ' unter Zugabe des
Phospinatinhibitors Z— PKF(PC)APL— O-Me dargestellt.
Die prozentuale Inhibition unter Zugabe der Inhibitoren errechnete sich nach:
% Inhibition = 100% x % Umsatz (mit Inhibitor) -=- % Umsatz (ohne Inhibitor)
In Abbildung 2 wird die Konzentrations-Wirkungsbeziehung eines Phosphinat- inhibitors dargestellt.
Spezifitätsnachweis der PCP-Inhibitoren durch Untersuchung mit der Astacin- ähnlichen Protease Meprin in vitro
Meprin ist ein Enzym aus der Familie der Astacinproteasen, das im Menschen vorkommt (Stöcker W, Gomis-Rüth FX, Bode W, Zwilling R: Implications of the three-dimensional structure of astacin for the structure and function of the astacin family of zinc-endopeptidases, Eur. J. Biochem. 214: 215-231 (1993)). Der __- Meprinaktivitätstest wurde komplett analog zum in vitro-Assay zur Messung der PCP-Aktivität durchgeführt. Anstatt der rekombinanten PCP wurde humanes Meprin verwendet, das das fluorenszenzmarkierte Dekapeptid ebenfalls umsetzt.
Abbildung 3 zeigt die Spezifität des hochwirksamen Phosphinat-Peptidanalogen Z — PKF(PC)APL — O-Me für PCP. Meprin wird auch bei Konzentrationen bis zu 100 nM (dosisabhängig) nur unwesentlich bei der Umsetzung des fluoreszenzmarkierten Peptids inhibiert. Demonstration der biologischen Wirksamkeit
Die biologische Wirksamkeit der Substanzen kann in Zellkulturassays und in vivo demonstriert werden. Nach Applikation der Inhibitoren kann in humanen Zellinien z.B. der Abfall der Konzentration an freiem Procollagen αj (III) Propeptid in den
Überständen gemessen werden, weil dieses Peptid durch die Aktivität der PCP freigesetzt wird. Zur Messung der PIIICP-Konzentrationen im Überstand kann ein kürzlich etablierter Assay verwendet werden [vgl. Burchardt ER, Schröder W, Heke M, Kohlmeyer J, Neumann R, Kroll W: Expression cloning of C-terminal procollagen (III) propeptide and its use in a novel serum assay to monitor liver fibrogenesis, Hepatology 26: 487A (1997)].
Zum Nachweis des antifibrotischen Effekts der Substanzen in der Leber können z.B. das Tiermodell der akuten [vgl. Johnson SJ, Hines JE, Burt AD: Phenotypic modulation of perisinusoidal cells following acute liver injury: a quantitative analysis. Int. J. Exp. Path. 1992; 73: 765-772 (1992)] oder chronischen [vgl. McLean E, McLean A, Sutton P: Instant Cirrhosis. An improved method for producing cirrhosis of the liver in rats by simultaneous administration of carbon tetrachloride and phenobarbitone, Br. J. Exp. Pathol. 1969; 50: 502-506 (1969)] Tetrachlorkohlenstoff-induzierten Leberschädigung, das Modell der Leberfibrose durch Gallengangsligatur [vgl. Kountouras J, Billing B, Scheuer P: Prolonged bile obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat, Br. J. Exp. Pathol. 1984; 65: 305-311 (1984)] oder die durch heterologes Serum induzierte Leberfibrose [vgl. Bhunchet E, Wake K.: Suppression of experimental hepatic fibrosis by administration of vitamin A, Lab. Invest. 1985; 52: 182-194 (1985)] verwendet werden. Auch andere Tiermodelle, bei denen eine Leberfibrose auftritt, können zum Nachweis des antifibrotischen Effekts verwendet werden.
Je nach Organmanifestation oder Art der fibrotischen Schädigung können auch Tiermodelle für andere Fibrosemamfestationen, z.B. im Herzen, in den Nieren, in den Lungen, in der Haut oder anderen Organen verwendet werden. Die Reduktion der Collagenablagerung kann z.B. durch die Bestimmung des Hydroxyprolingehalts [vgl. Gerling B, Becker M, Waldschmidt J, Rehmann M, Schuppan D.: Elevated serum aminoterminal procollagen type-III-peptide parallels collagen accumulation in rats with secondary biliary fibrosis, Hepatology 1996; 25: 79-84 (1996)] der fibrotischen Organe oder durch quantitative Morphometrie erfolgen [vgl. Kauschke SG, Knorr A, Olzen M, Burchardt ER: Expression of collagen (III) as determined by quantitative PCR and its correlation with extracellular collagen deposition in the rat CCI4 model of liver fibrosis. Hepatology 26: 538A (1997)].
Abbildung 1 zeigt den Substratumsatz des DABCYL-EDANS-Dekapeptides durch rekombinante PCP in Abhängigkeit von der Zeit. Die Enzymaktivität wird in Anwesenheit von 100 nM Inhibitor fast vollständig inhibiert.
Abbildung 2 zeigt die Konzentrations- Wirkungsbeziehung des Phosphinatinhibitors
Z— PKF(PC)APL— O-Me
Abbildung 3 zeigt die Spezifität des hochwirksamen Phosphinat-Peptidanalogen Z — PKF(PC)APL — O-Me für PCP. Meprin wird auch bei Konzentrationen bis zu 100 nM (dosisabhängig) nur unwesentlich bei der Umsetzung des fluoreszenzmarkierten
Peptids inhibiert.
Zur vorliegenden Erfindung gehören auch pharmazeutische Zubereitungen, die neben inerten, nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfs- und Trägerstoffen eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel (I) enthalten, oder die aus einem oder mehreren Wirkstoffen der Formeln (I) bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen.
Die Wirkstoffe der Formeln (I) sollen in diesen Zubereitungen in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5 Gew.-%, bevorzugt von 0,5 bis 95 Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein. Neben den Wirkstoffen der Formeln (I) können die pharmazeutischen Zubereitungen auch andere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.
Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können in üblicher Weise nach bekannten Methoden hergestellt werden, beispielsweise mit dem oder den Hilfsoder Trägerstoffen.
Im allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, den oder die Wirkstoffe der Formeln (I) in Gesamtmengen von etwa 0,01 bis etwa 100 mg/kg, bevorzugt in Gesamtmengen von etwa 1 mg/kg bis 50 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung des gewünschten Ergebnisses zu verabreichen.
Es kann aber gegebenenfalls vorteilhaft sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von der Art und vom Körpergewicht des behandelten
Individuums, vom individuellen Verhalten gegenüber dem Medikament, der Art und Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung und Applikation, sowie dem Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Verabreichung erfolgt.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) wird nachstehend beispielhaft anhand einer exemplarischen Synthese der Verbindung der Formel (I, R= Methyl)) gezeigt, auf welche die vorliegende Erfindung jedoch nicht beschränkt ist. Nachstehend beziehen sich alle Mengenangaben, soweit nicht anderweitig angegeben, auf Gewichtsprozente.
Bsp. la: (lR)-l-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-2-phenylethyl{3-[(2S)-2-
( { [( 1 S)- 1 -(methoxycarbonyl)-3 -methylbuty 1] amino } carbony 1)- tetrahydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl] -2-methyl-3 -oxopropy 1 } phosphinsäure
Figure imgf000016_0001
Zu einer Lösung von 1.4 bis 1.5 eq. [(l-Benzyloxycarbonyl)amino]-2-phenylethyl)- (2-carboxy-l-propyl)hydroxyphosphonsäure (hergestellt analog WO 89/10961, S. 72, Bsp.[14]) in absolutem Dichlormethan (ca. 0.1 bis 0.15 mol/1) werden nacheinander unter Argon bei 0°C 4.0 eq. Ethyldiisopropylamin, 1.50 eq. Benzotriazol-1-yl-oxy- tris-pyrrolidino-phosphoniumhexafluorophosphat (PyBop) (J. Martinez et al., J. Med. Chem. 1988, 28, 1874; J. Costre, D. Le-Nguyen, B. Castro, Tetrahedron. Lett., 1990, 31, 2055) und nach 2 bis 5 min 1.0 eq. Pro-Leu-OMe-Trifluoressigsäuresalz (hergestellt nach Standardverfahren der Peptidchemie, vgl. z.B. Houben-Weyl, 4. Aufl.: Methoden der Organischen Chemie, Band XV1-/-2, Synthese von Peptiden
Teil 1 und Teil 2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974) hinzugefügt. Nach 15-30 min wird die Eiskühlung entfernt und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Es wird mit Dichlormethan verdünnt und nacheinander mit gesättigter Natriumhydrogencarbont-Lösung, IN Salzsäure-Lösung und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im
Vakuum eingeengt.
Ausbeute: 133.7 mg gelbliches Öl als Rohprodukt (keine Ausbeuteangabe, da das Produkt Lösungsmittelreste enthält) LC-MS: rt (%), m/z (%) = 4.066 (34.6 %), 630 (100, M+H); 4.197 (52.7), 630 (100,
M+H). Bsp. lb: (lR)-l-Amino-2-phenylethyl{3-[(2S)-2-({[(lS)-l-(methoxycarbonyl)-3- methylbutyljamino } carbonyl)tetrahydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl]-2-methyl-3 - oxopropyl } phosphinsäure
Figure imgf000017_0001
Das geschützte Aminderivat aus Bsp. la wird in Ethanol (ca. 0.05 mol/1) gelöst und unter Argon mit einem Katalysator (10 % Palladium auf Kohle) versetzt. Die Suspension wird bei Raumtemperatur unter H2- Atmosphäre (Normaldruck) ca. 2
Stunden kräftig gerührt, bevor über Celite filtriert wird (gründlich mit Ethanol nachgewaschen). Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt und im Hochvakuum getrocknet.
Ausbeute: 80.4 mg (97.3 % der Theorie) LC-MS: rt, m/z (%) - 2.706, 496 (100, M+H)
HPLC: rt (%) = 5.80 (32.5), 5.91 (51.5).
Bsp. lc: ( 1 R)- 1 -( { (2S)-2- { [(Benzyloxy)carbonyl]amino } -6-[(tert-butoxycarbonyl)- aminojhexanoyl } amino)-2-phenylethyl { 3 - [(2S)-2-( { [( 1 S)- 1 -(methoxy- carbony l)-3 -methylbutyl] amino } carbonyl)tetrahydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl] -2- methyl-3 -oxopropyl } phosphinsäure
Figure imgf000018_0001
Zu einer Lösung von 1.0 eq. der Verbindung aus Bsp. Ib werden nacheinander unter Argon bei 0°C 4.0 eq. Ethyldusopropylamin, 1.50 eq. PyBop und nach 2 bis 5 min 1.45 eq. Z-(NHBoc)-Lys-OH hinzugefügt. Nach 15-30 min wird die Eiskühlung entfernt und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Es wird mit Dichlormethan verdünnt und nacheinander mit gesättigter Natriumhydrogencarbont- Lösung, IN Salzsäure-Lösung und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Rohausbeute: 207 mg zähes Öl, LC-MS: rt (%), m/z (%) = 4.456 (11.2 %), 858 (100,
M+H); 4.549 (32.7), 858 (100, M+H). Das Rohprodukt wird durch präparative RP- HPLC gereinigt. Ausbeute: 40 mg (32.8 % der Theorie). Bsp. ld: (lR)-l-({(2S)-2-Amino-6-[(tert-butoxycarbonyl)amino]hexanoyl}amino)- 2-phenylethyl{3-[(2S)-2-({[(lS)-l-(methoxycarbonyl)-3-methylbutyl]- amino } carbonyl)tetrahydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl] -2-methyl-3-oxopropyl } - phosphinsäure
Figure imgf000019_0001
Das geschützte Aminderivat aus Bsp. lc wird in Ethanol (ca. 0.05 mol/1) gelöst und unter Argon mit einem Katalysator (10 % Palladium auf Kohle) versetzt. Die Suspension wird bei Raumtemperatur unter H2- Atmosphäre (Normaldruck) ca. 2
Stunden kräftig gerührt, bevor über Celite filtriert wird (gründlich mit Ethanol nachgewaschen). Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Ausbeute: 31 mg (85.4 % der Theorie) LC-MS: rt (%), m/z (%) = 2.97 (85.8 %), 724 (100, M+H).
Bsp. le: ( 1 R)- 1 -( { (2S)-2- Amino-6-[(tert-butoxycarbonyl)amino]hexanoyl } - amino)-2-pheny lethy 1 { 3 - [(2S)-2-( { [( 15)- 1 -(methoxycarbony l)-3 - methy lbutyl] amino } carbony l)tetrahydro- 1 H-pyrrol- 1 -y l]-2-methyl-3 - oxopropyl } phosphinsäure
Figure imgf000020_0001
Zu einer Lösung von 1.0 eq. der Verbindung aus Bsp. Id werden nacheinander unter Argon bei 0°C 4.0 eq. Ethyldusopropylamin, 1.50 eq. PyBop und nach 2 bis 5 min 1.45 eq. Z-Pro-OH hinzugefügt. Nach 15-30 min wird die Eiskühlung entfernt und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Es wird mit Dichlormethan verdünnt und nacheinander mit gesättigter Natriumhydrogencarbont-Lösung, IN Salzsäure-Lösung und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. 50 mg Rohprodukt werden erhalten.
LC-MS: rt (%), m/z (%) - 4.394 (25.9 %), 955 (100, M+H); 4.509 (44.6), 955 (100, M+H). Das Rohprodukt wird durch präparative RP-HPLC gereinigt. Ausbeute: 24.5 mg (59.9 % der Theorie). Bsp. lf: Darstellung der Verbindung der Formel (I), R= Methyl)
(lR)-l-({(2S)-6-amino-2-[({(2S)-l-[(benzyloxy)carbonyl]tetrahydro-lH-pyπOl-2- y 1 } carbony l)amino] hexanoyl } amino)-2-pheny lethyl { 3 - [(2S)-2-( { [( 1 S)- 1 -(methoxy- carbony l)-3 -methylbutyljamino } carbonyl)tetrahydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl] -2-methyl-3 - oxopropyl}phosphinsäure
Figure imgf000021_0001
Zu 24.50 mg (0.03 mmol) der Verbindung aus Bsp. le in einem eisgekühltem Gemisch aus 0.3 ml Methylenchlorid und 0.03 ml Wasser werden 0.3 ml Trifluoressigsäure getropft. Die Kühlung wird entfernt und es wird zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt, bevor im Vakuum eingeengt und gründlich am Hochvakuum getrocknet wird.
Ausbeute: 21.0 mg farbloser Feststoff (95.8 % der Theorie) LC-MS: rt, m/z (%) = 3.057 (beide Stereoisomere), 855 (100, M+H) RP-HPLC rt (%) = 2.18 (48.7), 2.42 (46.0).

Claims

Patentansprüche
Verwendung von Phosphinat-Peptidanaloga der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000022_0001
in welcher
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
und/oder deren Stereoisomeren und Salzen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von fibrotischen Erkrankungen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mit der in der Formel (la) aufgezeigten Konfiguration
Figure imgf000022_0002
in welcher R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
und/oder deren Stereoisomere und Salze verwendet werden.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel (Ib)
Figure imgf000023_0001
und/oder deren Enantiomere und Salze verwendet wird.
4. Verwendung gemäß Anspruch 1 zur Behandlung von Leberfibrose.
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