WO2002016560A1 - Verfahren zur herstellung gebrauchsfertiger, antigenbeladener oder -unbeladener, kryokonservierter, reifer dendritischer zellen - Google Patents

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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/52—CD40, CD40-ligand (CD154)

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of ready-to-use, cryopreserved, mature dendritic cells, in particular for the production of a vaccine which contains these dendritic cells, in which immature dendritic cells are cultivated in the presence of suitable maturation stimuli and the mature dendritic cells obtained in this way are frozen. Before or after freezing, the dendritic cells can be loaded with antigen.
  • the invention also relates to a vaccine obtainable by the method according to the invention and a composition containing frozen, mature, antigen-loaded dendritic cells.
  • DC Dendritic cells
  • DZ Dendritic cells
  • T-cell stimulatory mode T-cell stimulatory mode
  • DC which was isolated from tissue or blood and was loaded with antigen in vitro, was immunogenic as a mature DC in vivo after back injection. It has recently been shown that DC can induce CD4 + and CD8 + T cell immunity both in healthy people and in cancer patients. In immunocompetent, healthy individuals, a single booster injection with mature DC not only increased the frequency but also the functional avidity of the CD8 + T cell response. For these reasons are (especially mature) DCs currently very promising adjuvants for eliciting potent T cell responses to tumors and infections in humans.
  • DC fetal calf serum
  • GM-CSF + IL-4 fetal calf serum
  • Frozen PBMC also have the disadvantage that after thawing, the cells have to be cultivated for several days in order to differentiate them in DC.
  • the freezing of immature dendritic cells produced by means of GM-CSF and IL-4 from monocytes is also disclosed in WO 99/46984.
  • An object of the present invention is therefore to provide a composition such as. B. Provide a vaccine containing mature DC over a longer period Can be kept without significant loss of activity and at
  • Need can be administered within a short time.
  • the DCs used according to the invention preferably originate from the patient who is treated with the vaccine (autologous).
  • the DC can also come from other patients (ailogen), e.g. B. from Leukapheresaten by normal volunteers, such as. B. in Thurner et al. (1999) J. Immunol. Methods 283, 1-15.
  • mature DC only fully mature DC (hereinafter also referred to as “mature DC” for short), which can be obtained by culturing in the presence of a suitable "ripening cocktail” with specific maturation stimuli, survive to a high percentage after freezing without FCS and thawing and have immunostimulatory activities that are comparable to those of freshly prepared, mature DC.
  • a suitable "ripening cocktail” with specific maturation stimuli, survive to a high percentage after freezing without FCS and thawing and have immunostimulatory activities that are comparable to those of freshly prepared, mature DC.
  • the immature DC When cultivating with the ripening cocktail, the immature DC is differentiated into mature DC.
  • a particularly preferred ripening cocktail contains interleukin- ⁇ (IL- ⁇ ), interleukin-6 (IL-6), prostaglandin E 2 (PGE 2 ) and "tumor necrosis factor ⁇ " TNF ⁇ .
  • the present invention thus relates
  • a method for producing ready-to-use, cryopreserved, mature dendritic cells comprising a) providing immature dendritic cells (DC); b) Culturing the immature DC in a culture medium containing a ripening cocktail with one or more ripening stimuli under
  • a method for finding advantageous conditions for freezing DC comprising the steps of: a) providing immature DC; b) culturing different approaches of immature DC in the presence of different maturation stimuli; c) subsequently culturing the DC in medium with or without cytokines, cultivation without cytokines being preferred; d) determining the proportion of living cells after at least 1 day of culture in the medium with or without cytokines; and e) determining the maturation stimulus that gave the highest survival rate.
  • immature DC are first cultivated, a suitable ripening cocktail with one or more ripening stimuli being added to the culture medium.
  • Suitable maturation stimuli are IL-1 such as e.g. B. IL-lß etc., IL-6, TNF- ⁇ , prostglandins such as e.g. B. PGE 2 etc., IFIM- ⁇ , lipopolysaccharides and other bacterial cell products such as.
  • B. MPL monophosphoryl lipid A
  • lipoteichoic acid, etc. phosphorylcholine
  • calcium ionophores phorbol esters
  • phorbol esters such as PMA
  • heat shock proteins nucleotides such as. B.
  • the culture medium or the ripening cocktail contains IL-1ß, IL-6, PGE 2 and TNF ⁇ or the maturation cocktail is monocyte-conditioned medium (MCM) or MCM with additional PGE 2 .
  • the DC can be loaded with antigen during or after the cultivation step. After maturation and, if necessary, loading with antigen, the DC are frozen in freezing medium which does not contain heterologous serum such as e.g. B.
  • FCS contains.
  • heterologous serum is serum that does not originate from the human species. According to the invention, however, it is possible to use both autologous serum or plasma (which comes from the same person as the DC) and allogeneic serum or plasma (which comes from a different person than the DC).
  • Immature DC in the sense of this application are CD83 (and / or p55 / fascin- and / or DC-LAMP-) negative (or only weak and / or too little positive), compared to mature DC only small amounts of class I - and class II MHC and adhesion or costimulatory molecules (eg in particular CD86, CD80, CD40) expressing leukocytes which differentiate into mature DC after a suitable maturation stimulus.
  • Mature DC in the sense of this application are leukocytes which develop from immature DC after the action of a maturation stimulus, an increased expression of CD83 (and / or p55 / fascin and / or DC-LAMP) and of class dog class I Show MHC molecules and adhesion or costimulatory molecules, in particular of CD86, CD80, CD40. Furthermore, the mature DC show a clearly increased T-cell stimulatory capacity in comparison to immature DC (eg, in contrast to immature DC, they show a clear stimulatory activity in the allogeneic MLR even with a DC: T ratio ⁇ 1: 100); in addition, a characteristic of the mature DC in the sense of this application is that these DC are stable, i. H.
  • DCs that are not fully developed are not stable and differentiate from immature DCs or z.
  • the immature DC can be provided from various known sources.
  • the progenitor cells of immature DC are usually non-proliferating CD14-positive mononuclear cells (PBMC; monocytes) or proliferating CD34-positive cells.
  • PBMC can be isolated from leukapheresis products.
  • the PBMC can be differentiated into immature DC as described (Thurner et al. (1999) J. Exp. Med. 190, 1669). For this, the PBMC are cultivated in the presence of IL-4 (or IL-13; Romani et al. (1996) J. Immunol.
  • Immature DC can also be produced from CD14-positive monocytes by cultivation in the presence of GM-CSF and IFN ⁇ (Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191, 1777-1788).
  • CD34-positive cells can be cultivated in the presence of GM-CSF, SCF (stem cell factor) and TNF. mature DC can be obtained.
  • the immature dendritic cells can also be obtained directly from fresh blood, e.g. B. Nestle et al. (1998) Nat. Med. 4, 328.
  • CDllc + and CDllc-DC also exist in the blood.
  • M-DC8-DC Schott al. (1999) Pathobiology 67, 287-290
  • These DCs can also be isolated from the blood and used further in the method according to the invention.
  • the preferred concentrations of the various maturation stimuli in the culture medium are in the range from 0.1 ng / ml to 100 ⁇ g / ml, preferably 1 ng / ml to 10 ⁇ g / ml.
  • the concentration of the ripening stimuli is 0.1 to 100 ng / ml IL-1, 0.1 to 100 ng / ml IL-6, 0.1 to 10 ⁇ g / ml PGE 2 and 0, 1 to 100 ng / ml TNF ⁇ (most preferably, the concentration of these specific maturation stimuli is approximately 10 ng / ml IL-lß, 10 ng / ml IL-6, 1 ⁇ g / ml PGE 2 and 10 ng / ml TNF ⁇ ).
  • the concentrations relate to the final concentrations of the substances in the cell culture medium in which the DC are cultivated.
  • One way to mature the DC in the presence of the active substances mentioned is to cultivate the immature DC in the presence of monocyte-conditioned medium (MCM).
  • MCM contains IL- ⁇ , IL-6, PGE 2 and TNF ⁇ . It can be obtained by culturing PBMC in medium without cytokines, as described for example in Romani et al. (1996) J. Immunol. Methods 196, 137.
  • MCM monocyte-conditioned medium
  • the culture medium contains 1-100%, preferably 5-25% MCM.
  • the DC is matured by adding MCM and a defined amount of PGE 2 .
  • maturing times 6 to 96 hours, preferably 18 to 36 hours (in the case of using leucopharesis as the starting material) or for 36 to 60 hours (when using fresh blood or buffy as the starting material) ,
  • the DCs are loaded with at least one antigen or an antigen-antibody complex during and / or after said ripening step.
  • the antigen loading can take place before or after freezing. If it occurs after freezing, the DCs are only loaded with antigen after thawing. However, loading with antigen is preferred before freezing the DC. This has the advantage that the DC are ready for use immediately after thawing.
  • Antigens in the sense of this application are proteins, protein fragments, peptides and molecules derived therefrom (e.g. glycosified compounds or compounds with other chemical modifications), but also the nucleic acid coding for them, viruses, whole pro- or eukaryotic cells or fragments thereof or apoptotic cells.
  • “Loading by antigen” is understood to mean a process which leads to MHC molecules "presenting" on the cell surface of the DC peptides, ie having a complex with the MHC molecules. While the MHC molecules can be loaded directly using specific peptides, protein (fragment) s must first be processed, i.e. first taken up by the cell.
  • MHCII-peptide complexes are presented on the cell surface.
  • proteins or protein fragments come into consideration as antigens.
  • the proteins can be of native origin or have been produced recombinantly.
  • the maturation and loading with protein antigen results in the DC MHCII-peptide complexes on the cell surface, which comprise peptide fragments of the added antigen.
  • the concentration of the protein antigen in the culture medium is usually 0.1 to 100 ⁇ g / ml, preferably 1 to 50 ⁇ g / ml, most preferably 1 to 10 ⁇ g / ml.
  • the loading should preferably take place during the maturation of the DC. Then a particularly effective presentation of the antigen fragments by MHCII molecules takes place.
  • the protein (fragment) need not be present throughout the ripening period, but both the ripening composition and the protein (fragment) should be present at least for part of the ripening period.
  • protein antigens examples include KLH (keyhole limpet hemocyanin) as a widely used positive control antigen, MAGE-3 protein as an example of a tumor antigen, and hepatitis B surface antigen (HbsAg) or HIV-1 gp 160 protein as an example of a protein useful for the treatment of viral diseases.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • MAGE-3 protein as an example of a tumor antigen
  • HbsAg hepatitis B surface antigen
  • HIV-1 gp 160 protein examples include HIV-1 gp 160 protein useful for the treatment of viral diseases.
  • short polypeptides or protein fragments (e.g. short polypeptides with up to 50 amino acid residues that fit exactly into the MHC molecules on the DC surface)
  • a loading after the Maturation possible namely before freezing or after thawing.
  • the short polypeptides are added to washed TLC.
  • a further possibility for loading with antigen is the addition of apoptotic or lysed cells to the culture medium.
  • the cells added can then be phagocytized by the DC.
  • This method has the advantage that in addition to MHC class II molecules, class I molecules are also loaded effectively. It was shown, for example, that even when proteins (especially particulate nature) are administered, presentation also takes place on MHC class I molecules.
  • DC fragments from necrotic cells or apoptotic tumor cells
  • DC z. B. can also be loaded with antigen DC that DC z. B. be fused with tumor cells.
  • a fusion can be achieved by means of polyethylene glycol or electroporation.
  • the DC are loaded with antigen by transfecting or virally infecting them.
  • nucleic acids coding for antigens are introduced into the DC and brought to expression.
  • DNA or RNA transfection or infection with adenoviruses can be carried out in a suitable manner.
  • This also makes it possible to load the MHC class I molecules.
  • RNA prepared from tumor cells can also be transfected. Common methods such as e.g. B. electroporation can be used.
  • specific antigen peptide may be added during or after the ripening period to directly load Class I or II MHC molecules.
  • the peptide antigen can be added to the cells before the ripening composition, but is preferably added simultaneously or afterwards.
  • the antigen loading is preferably carried out for at least 10 minutes, more preferably for 1 to 24 hours, most preferably for 3 to 12 hours.
  • the peptides typically have at least 8 amino acids. Such peptides preferably have 8 to 12 amino acids (MHCI) or 8 to 25 amino acids (MHCII).
  • the concentration of the peptide in the culture medium for loading is generally 0.01 to 1000 ⁇ M, preferably 0.1 to 100 ⁇ M, most preferably 1 to 20 ⁇ M.
  • peptides that can be presented by MHC molecules are conceivable as usable peptides.
  • Peptides derived from proteins derived from pathogens are preferred. These can also be peptides that have variations in the naturally occurring amino acid sequence. Such variations are usually one or two amino acid changes.
  • Examples of peptide antigens are the influenza matrix peptide (IMP) with the amino acid sequence GILGFVFTL (SEQ ID NO: 1) or the melan A-analogous peptide with the sequence ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 2). Examples of other possible peptides are shown in FIG. 26.
  • IMP influenza matrix peptide
  • GILGFVFTL amino acid sequence GILGFVFTL
  • melan A-analogous peptide melan A-analogous peptide with the sequence ELAGIGILTV
  • FIG. 26 examples of other possible peptides are shown in FIG. 26.
  • peptide / protein pulsing can also be carried out in order to load DC with
  • the DC can also be loaded with antigen-antibody complexes.
  • Suitable antigens for this are all the antigens mentioned above.
  • Antigen-antibody complexes in the sense of the present invention are complexes of these antigens with suitable antibodies, e.g. B. antigen-IgG or IgE complexes.
  • suitable antibodies e.g. B. antigen-IgG or IgE complexes.
  • the loading of DC with such antigens is described in Reynault, A. et al., 3rd Exp. Med. 189 (2): 371-80 (1999), to which express reference is made here.
  • the mature DC can be frozen in freezing medium.
  • the freezing medium can also contain one or more antifreezing agents (for example from 0.1 to 35% (v / v), preferably 5 to 25% (v / v)).
  • Suitable antifreeze agents are preferably the following compounds: DMSO, glycerol, polyvinyl pyrrolidone, polyethylene glycol, albumin, choline chloride, amino acids, methanol, acetamide, glycerol monoacetate, inorganic salts etc.
  • the preferred antifreeze agent is DMSO, which is preferably in a concentration of 5 to 25% (v / v), more preferably 10 to 20% (v / v), most preferably about 10% DMSO is contained in the freezing medium.
  • the freezing medium can contain a non-heterologous serum component, preferably in a concentration of 2 to 90% (w / v), preferably 5 to 80% (w / v), with human serum albumin, preferably in a concentration of 10 to 30% (w / v) is particularly preferred.
  • the freezing medium contains autologous serum or plasma instead of human serum albumin. It can also contain human, allogeneic or pool serum.
  • One or more carbohydrate-derived polyol compounds may also be present in the freezing medium as an additive. preferably at a concentration of 2 to 30%, more preferably 5 to 10%, most preferably about 5% (w / v).
  • the most preferred freezing medium is pure autologous serum with approximately 10% DMSO and approximately 5% glucose. Usually the cells are centrifuged before freezing in order to concentrate them and take them up in the freezing medium.
  • the preferred concentration of cells in the freezing medium is 1 to 100 x 10 6 cells / ml, the most preferred concentration is approximately 5 x 10 6 cells / ml to 20 x 10 6 cells / ml.
  • the survival rate of DC is increased when the DC is contacted with an anti-apoptotic molecule before freezing or after thawing.
  • the DC are therefore brought into contact with a molecule which can inhibit apoptosis before freezing or after thawing.
  • Preferred anti-apoptotic molecules are CD40 ligand (CD40L) (Morris et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 418), TRANCE (Wong et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 2075) or RANKL (Anderson et al. (1997) Nature 390, 175).
  • one of the molecules before freezing or after thawing 'of DC is at least at least 10 min, preferably at least 1 hour preferably at least four hours the culture medium was added.
  • Preferred concentrations in the culture medium are 1 ng / ml to 5 ⁇ g / ml (RA KL / TRANCE) or 1 ng / ml to 1 ⁇ g / ml (CD40L).
  • Particularly preferred concentrations are 0.5 to 1 ⁇ g / ml (RANKL / TRANCE) and 0.1 to 0.5 ⁇ g / ml (CD40L).
  • the DC are furthermore in the presence of the immunosuppressive interleukin-10 (IL-10) or other immune / maturation modulators such as e.g. B. vitamin D3 and its derivatives, fumaric acid and derivatives thereof such as. B. esters, etc., mycophenolate mofetil, etc. cultivated.
  • IL-10 immunosuppressive interleukin-10
  • other immune / maturation modulators such as e.g. B. vitamin D3 and its derivatives, fumaric acid and derivatives thereof such as. B. esters, etc., mycophenolate mofetil, etc. cultivated.
  • Cells treated in this way are not used to stimulate the immune system; rather, tolerance to certain antigens is to be induced.
  • the concentration of these modulators and of IL-10 in the medium is 1 - 1000 ng / ml, preferably 10 - 100 ng / ml.
  • the present invention also relates to a vaccine which can be obtained by the method according to the invention.
  • the vaccine according to the invention can also be pharmaceutical contain pharmaceutically acceptable excipients. After thawing the vaccine according to the invention, various substances can be added that are pharmaceutically acceptable and advantageous for administration.
  • the invention also relates to frozen, mature, antigen-loaded dendritic cells.
  • These cells according to the invention can be part of a pharmaceutical composition which, in addition to the cells, also contains conventional additives suitable for administration to humans.
  • the present invention for the first time provides a vaccine that contains mature, antigen-loaded DC and can be frozen.
  • a major advantage of the invention is that the survival rate of the DC after thawing is very high. After thawing the frozen DC, more than 75%, preferably more than 85% surviving DC, based on the number of frozen DC, is generally obtained. Such high survival rates of thawed DC had never been achieved without the addition of FCS. However, this is an important prerequisite for achieving effective immune stimulation.
  • a significant advantage of freezing mature, antigen-loaded DC is that numerous aliquots of a vaccine can be made and frozen. As a result, the vaccine is immediately available when needed and can be applied in a very short time without lengthy culture steps.
  • Antigen loading only after freezing and thawing mature DC makes it possible to load the DC variably according to the particular circumstances. For example, in the event of developing overstimulation or allergy to one of the peptides used for vaccination, this can be dispensed with during loading.
  • the invention is therefore also based on the finding that the maturation stimulus according to the invention not only leads to full DC maturation, but also delivers DC that can survive better than DC that have been matured by other stimuli. So far, no attention has been paid to the maturation stimulus with regard to freezing.
  • a further aspect of the invention is therefore a method for finding advantageous conditions for freezing DC, immature DC being provided and being cultivated in the presence of various maturation stimuli, the cells then being cultivated in medium with or without cytokines, preferably without cytokines, after at least one day of culture in medium with or without cytokines, the proportion of surviving cells is determined and finally the maturation stimulus is determined which gave the highest survival rate of DC.
  • This maturation stimulus is then used to make DC, which is frozen.
  • the number of living cells is preferably determined only after at least 2 days of culture in medium without cytokines, most preferably after at least 3 days.
  • FIG 1 shows the influence of the cell concentration in the freezing vessels on the yield of DC after thawing.
  • Mature DCs were made from healthy adult leukapheresis products, initially converting adherent monocytes to immature DCs by culture in GM-CSF + IL-4 for six days, then maturing for one day using a four-component cocktail. from TNF ⁇ + IL-lß + IL-6 + PGE 2 (see Example 1). Mature (day 7) DC were frozen at a freezing rate of -l ° C / min in pure autologous serum + 10% DMSO + 5% glucose at different cell densities (DC number / ml).
  • FIG. 2 shows the influence of various freezing media on the DC yield after thawing.
  • DCs were prepared as described in the legend to FIG. 1, and aliquots were at a concentration of 10 ⁇ 10 6 DC / ml in HSA + 10% DMSO, in autologous serum + 10% DMSO and in autologous serum + 10% DMSO + 5% glucose (final concentrations) frozen.
  • FIG. 3 shows the survival rate of fresh DC in comparison with the frozen and thawed DC in "washout tests”.
  • Figure 4 shows that freezing and thawing does not change the characteristic morphology of mature DC.
  • Ripe, d7-DC which had been produced as described for FIG. 1, were either cultured immediately for a further 2 days or, after freezing, at least 3 hours of storage in the gas phase of liquid nitrogen and thawed again. Even after 48 hours of further culture in the absence of cytokines ("washout test"), the unfrozen (left) and frozen / thawed (right) DC remained stable, non-adherent cells.
  • FIG. 5 shows that freezing and thawing does not change the characteristic phenotype of mature DC.
  • FIG. 6 shows that freezing and thawing does not change the stimulatory capacity of mature DC in the primary allogeneic MLR ("Mixed Leukocyte Reaction").
  • Mature d7 DCs were produced as shown in FIG. 1 and the allostimulatory potency of freshly prepared, not frozen DCs was compared with an aliquot of this DC which had been frozen and thawed (after storage in liquid nitrogen for 3 hours).
  • Figure 7 shows that freezing and thawing does not change the ability of mature DCs to induce a strong IMP-specific CTL response.
  • purified CD8 + T cells were cultivated without DC ⁇ addition of IMP. After 7 days, the T cells were harvested and examined for cytolytic activity using a standard 51 Cr release assay.
  • T2 cells which were pulsed without or with 10 ⁇ g / ml IMP, served as target cells.
  • Figure 8 shows that freezing and thawing does not change the ability of mature DC to induce a strong IMP-specific CD8 + T cell response (HLA-A2.1 / peptide tetramer analysis).
  • the expansion of IMP peptide-specific CD8 + T cells (the percentage of tetramer-binding CD8 + T cells is shown in the figure) is comparable for fresh and frozen DC. Loading DC before freezing and after
  • Figure 9 shows that contact with CD40L further improves the survival rate of thawed DC.
  • Mature d7-DC were produced as described for FIG. 1.
  • soluble primary CD40L 100 ng / ml
  • FIG. 10 shows that DC can be successfully loaded with protein antigen before freezing.
  • DC at their immature stage was pulsed by adding the model antigen tetanus toxoid (TT) (10 ⁇ g / ml) on day 6.
  • Ripe DCs were then harvested on day 7 and frozen as described in the legend to Figure 3. Frozen, TT pulsed DCs were as stimulatory as freshly made TT pulsed, mature DCs.
  • FIG. 11 shows that DC can be successfully loaded with peptide antigen before freezing.
  • the expansion of melan-A peptide-specific CD8 + T cells is comparable to frozen DCs that were loaded before freezing or after thawing , See also Figure 8.
  • FIG. 12 shows the induction of a helper line type 1 response against KLH in patients who were vaccinated as described in example 6.
  • FIG. 13-15 show the results of Example 7.
  • FIG. 16 shows a schematic illustration of the experimental setup of Example 8. The results of Example 8 are summarized in FIGS. 17 and 18.
  • FIG. 17A shows the total number of DC after loading with tumor cell lysate or necrotic tumor cells and subsequent cryopreservation.
  • FIG. 17B shows the allostimulatory potency of DC after loading with tumor cell lysate or necrotic tumor cells and subsequent cryopreservation.
  • FIG. 17C shows the result of the FACS analysis after tumor loading and cryopreservation.
  • FIG. 18A shows the result of the determination of the total number of. DC after loading with apoptotic tumor cells and subsequent cryopreservation.
  • FIG. 18B shows the allostimulatory potency of DC after loading with apoptotic MEL 526 melanoma cells and subsequent cryopreservation.
  • FIG. 18C shows the results of the FACS analysis of the MAGE-1 / HLA-Al Ag expression on Mage-1 peptide-pulsed DC before or after cryopreservation.
  • FIG. 18D shows the comparison of the expression of MAGE-1 / HLA-Al complexes (determined by means of antibodies against MAGE-1 / HLA-Al complex) before and after cryopreservation on DC, which were loaded in different ways.
  • FIG. 19 shows a schematic illustration of the experimental setup of Example 9, in which adenovirus-infected dendritic cells are compared with or without cryopreservation.
  • the results of Example 9 are summarized in FIGS. 20 to 23
  • FIG. 20 shows the recovery of adenovirus-infected dendritic cells after cryopreservation.
  • the recovery rate of adeno-GFP-infected DC after freezing and thawing versus mock-treated (non-transfected) DC is comparable.
  • Figure 21 CD4-T cell stimulating activity of adenovirus-infected dendritic cells after cryopreservation. It can be shown that cryopreservation does not change the allostimulatory activity of adenovirus-infected DC.
  • Figures 22A and 22B show that a similar phenotype is present in adenovirus-infected DC with or without cryopreservation.
  • Figures 23A and 23B show a phenotype of adenovirus-infected DC with or without cryopreservation.
  • FIG. 24 shows the schematic test procedure of Example 10 in comparison to RNA-electroporated DC with or without cryopreservation. The results are summarized in Figures 25 to 27.
  • FIG. 25 shows that the recovery after cryopreservation of EGFP-RNA electroporated DC is similar to that in the control experiment.
  • FIG. 26 shows that cryopreservation does not change the allostimulatory capacity of the EGFP-RNA transfected DC.
  • Figure 27 shows that the phenotype of RNA-transfected DC is similar to that in the control experiment.
  • Figure 28 shows MHC class I and II restricted melanoma and influenza virus peptides that can be used in the method of the present invention.
  • AS amino acids
  • NT nucleotides
  • NP nucleoprotein
  • ana * analog peptide a most common DR4 subtype, approximately 80% b most common DR4 subtype, approximately 80% c
  • AS amino acids
  • NT nucleotides
  • NP nucleoprotein
  • ana * analog peptide a most common DR4 subtype, approximately 80% b most common DR4 subtype, approximately 80% c
  • the survival rate of freshly produced, immature DC and of DC matured by various maturation stimuli was determined.
  • Immature TLC were obtained by culture in complete medium with recombinant human GM-CSF (800 U / ml) and IL-4 (500 U / ml).
  • GM-CSF 800 U / ml
  • IL-4 500 U / ml
  • the various maturation stimuli mentioned above were added to the DC
  • the mature DC were harvested and cultivated for a further two days in the absence of cytokines.
  • the survival rates after two days of culture as a percentage of the DC sown were: 38.25% for immature DC,
  • DCs were frozen as follows: DCs were resuspended in cryogenic vessels in different concentrations (5, 20, 40, 60 and 100 x 10 6 per ml) either in pure autologous serum or in 20% human serum albumin ( HSA; consisting of 1000 ml electrolyte solution supplemented with 200 g human plasma proteins with at least 95% albumin; DRK blood donation service Baden-written, Baden-Baden, Germany).
  • HSA human serum albumin
  • the resulting DC suspension was mixed 1: 1 with the various freezing solutions described below, then immediately transferred to a 1.0 or 1.8 ml cryo jar.
  • HSA + DMSO ⁇ glucose Consisting of 20% HSA solution (see above + 10, 15, 20 and 25% (v / v) DMSO + glucose (Glucosteril 40% TM, Fresenius, Germany, active ingredient: glucose monohydrate)) 2, 4, 6, 10, 20 or 30% (v / v)];
  • Serum + DMSO + Glucose [pure autologous serum + 20% (v / v) DMSO ⁇ glucose added to 2, 4, 6, 10, 20 or 30%];
  • Erythrocyte Freezing Solution TM Erythrocyte Freezing Solution TM (Fresenius, Dreieich, Germany), consisting of 38% glycerol, 2.9% sorbitol and 0.63% sodium chloride in sterile water];
  • Frozen mature (day 7) DC were thawed as described under 1 and after a rest period of two hours at 37 ° C. and 5% CO 2 on tissue culture dishes (Falcon Bacton Dickinson Labware, New Jersey, USA), the cells were harvested (centrifugation for 10 min at 150 g and 22 ° C) for further use.
  • the respective amounts of living DC were determined by a cell counter (Cassy Cell Counter and Analyzer System, Model TT, Scharfung System, Reutlingen, Germany; this system uses "Pulse area analysis” and permits the determination of cell numbers, cell size and volume and whether living cells are present) and also determined as a control by standard trypan blue staining.
  • Optimally matured and frozen DC are freshly made DC equivalent in terms of survival and T-cell stimulatory activity.
  • the morphology and phenotype of thawed DC was also compared to freshly made DC.
  • the morphology of the cells was examined under an invert phase microscope (Leika DM IRB, Leika Mikroskopie und Systeme GmbH, Wetzlar, Germany) and recorded photographically.
  • the phenotype of the cell populations was examined by a series of monoclonal antibodies and examined on a FACScan device (Becton Dickinson, New Jersey, USA) as described (Thurner et al. (1999) J. Immunol. Methods 223, 1). Dead cells were sorted out due to their light scattering properties. The result is shown in FIGS. 4 and 5. Frozen and thawed DC retain their characteristic morphological properties and phenotype for several days.
  • IMP Melan-A A2.1-peptide-specific CD8 + T cells
  • CTL were quantified by a standard lysis assay (Bhardwaj et al. (1994) J. Clin. Invest. 94, 797) or by tetrahedral staining at 37 ° C (Whelan et al. (1999) J. Immunol. 163, 4342).
  • Target cells for the standard 4 hour 51 Cr release assay which was carried out at different effector / target cell ratios, were IMP-pulsed (10 ⁇ g / ml for 1 hour at 37 ° C.) T2A1 cells, non-pulsed T2A1 cells and K562 target cells (all 51 Cr labeled). All experiments were carried out with an 80-fold excess of K562 cells in order to block the natural killer cell activity.
  • the specific lysis in% was calculated using the formula (specific release - spontaneous
  • the cells were analyzed on a FACScan device (Becton Dickinson).
  • Freezing and thawing DC does not change the ability of mature DC to induce a strong IMP-specific CLT response. Freezing and thawing also does not change the ability of mature DCs to induce strong IMP-specific CD8 + T cell responses, as demonstrated by HLA-A2.1 / peptide tetramer analysis.
  • the DC were the various anti-apoptotic stimuli at 37 ° C overnight for the last 12-16 h of culture before freezing, for 4 h before freezing (cell density lxlO 6 in complete medium with GM-CSF and IL-4) and also exposed for 4 h after thawing (cell density lxlO 6 in complete medium with GM-CSF and IL-4).
  • Short-term exposure of thawed DC to the anti-apoptotic stimuli was just as effective as the DC treatment before freezing and resulted in an increased survival rate, which was often only visible after 3 days in the "washout test”.
  • CD40L ( Figure 9) and TRANCE / RANKL (results not shown) gave similar results. The results show that adding CD40L or TRANCE / RANKL improves the survival rate of DC beyond day 3.
  • DC was loaded with tetanus toxoid (TT) (as an example of a protein antigen) or with IMP (as a model peptide).
  • TT tetanus toxoid
  • IMP a model peptide
  • DC were made from fresh or frozen aliquots of PBMC from leukapheresis products (see above).
  • TT was added to the immature cells on day 5 at 10 ⁇ g / ml.
  • Matured DCs were harvested on day 7 and examined for their ability to induce TT-specific proliferative responses in PBMC, either freezing or after freezing and thawing (after 4 h).
  • TT-pulsed DC were just as stimulatory as freshly made, TT-pulsed DC ( Figure 10). Both before freezing and after thawing, IMP- or Melan A-loaded DC stimulated equally well IMP- or Melan A-specific CTL (FIGS. 8 and 11). These results show that it is possible to prepare frozen aliquots of mature DC that are already loaded with antigen and can be used immediately after thawing.
  • FIG. 12 shows the induction of a helper cell type 1 response against KLH in all vaccinated patients.
  • the patients each received only a single subcutaneous administration of 4 million mature DCs, which were prepared from leukopheresates using GM-CSF and interleukin-4 and the maturation composition as described in the application (e.g. FIGS. 1 and 3) ,
  • the control antigen KLH was added in a concentration of 10 ⁇ g / ml at the same time as the ripening composition and the DC was then frozen in portions.
  • a patient from the study of Example 6 received several vaccinations with DC, with 4 million DC thawed in each case loaded with the peptides shown in FIGS. 13, 14 and 15 (ie only 1 peptide per 4 million DC) and injected subcutaneously were.
  • Blood was drawn before the first vaccination and 14 days after the previous vaccination and immediately before the next vaccination, and a standard Elispot assay was carried out as described in Thurner et al. (1999), J. Exp. Med. 190, 1669-1678 under Material and Methods.
  • the DCs used for the vaccination were produced as described in the legend to FIGS. 8 and 11 / in Example 5 and were only loaded with the corresponding peptides after thawing.
  • FIG. 13 shows the induction of immunity to the influenza apeptides NP-A3 and IMP-A2 after a single vaccination (No. 2 means blood sample and Elispot measurement shortly before administration of vaccination No. 2) and shows an increase after another vaccination, however no change in EBV-A2 and IV-9-A2 peptides that were not used for vaccination.
  • FIG. 2 shows the induction of immunity to the influenza apeptides NP-A3 and IMP-A2 after a single vaccination (No. 2 means blood sample and Elispot measurement shortly before administration of vaccination No. 2) and shows an increase after another vaccination, however no change in EBV-A2 and IV-9-A2 peptides that were not used for vaccination.
  • FIG. 14 shows an induction of immunity against 4 class I-restricted tumor peptides, clearly and unequivocally against the peptide melan A-A2.1.
  • FIG. 15 shows an induction of immunity against two class II restricted tumor peptides (Mage 3-DR13 and -DP4), but not against tyrosinase-DR4 and GP 100 DR4 (this represents a negative control since the patient was DR4 negative and the DC could not be loaded with these peptides).
  • tumor cell preparations tumor cell lysates, necrotic or apoptotic tumor cells
  • DC Dendritic cells
  • TAA tumor-associated antigens
  • Tumor cell preparation The Mel526 melanoma cell line was used to prepare the tumor cell preparations. Mel526 cells were washed in RPMI and treated by repetitive heating to 57 ° C. and subsequent cooling in the liquid nitrogen. The cell material was then broken up using an ultrasound device. Since necrosis is induced by the warming / freezing cycles, this type of tumor cell preparation, which contains all cell components, is referred to below as necrotic cell material. In order to obtain lysate, we connected ultracentrifugation to these steps to remove cell components and purify the proteins in the Centricon centrifuge. gationstube performed. According to the results of the Bradford analysis, we have the protein fraction with the higher activity, namely the> 10 KDa. used.
  • DC were generated from leukapheresis according to the technique used in experimental immunotherapy. PBMC were plated out in Nunc Cell Factories and cultured with RPMI (1% autologous, heat-inactivated plasma) substituted with 1000 IU / ml GM-CSF and 500 IU / ml IL-4. On day 5, the immature DCs were used and loaded with the described tumor cell preparations in a concentration of 1: 1 for 4 hours. Loading: The loading was carried out in a 5 ml polypropylene reaction vessel at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the DC were plated out in 12 ml tissue culture plates and cultivated with a maturation cocktail consisting of TNF- ⁇ , IL- ⁇ , IL-6 and PGE 2 for 24 h. Freezing / thawing: Half of the DC in each case was loaded according to the method described (Feuerstein B. et al., J. Immunol. Methods 245: 15-29 (2000)) in 1.8 ml Nunc freeze vials at -80 ° C cryopreserved for 3 hours. The cells were then again thawed in accordance with the method described and cultured for one hour in RPMI medium at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • a mixed leukocyte reaction test (MLR) was carried out to test the functional capacity.
  • the loaded DCs were placed in an allogeneic MLR (4 days incubation with allogeneic leukocytes) and then pulsed with radioactive thymidine ( 3 H-thymidine) for 13 hours. It turned out comparable allostimulatory potencies for cryopreserved and non-cryopreserved loaded DC (FIGS. 17B, 18B).
  • Phenotype To evaluate the expression of the surface molecules relevant for the antigen presentation and the functional state of the DC, a FACS analysis was carried out with the corresponding antibodies. A comparable surface expression pattern was found both for the different loading methods and after cryopreservation (FIG. 17C).
  • Direct antigen detection For the direct detection of tumor antigen, an antibody was used that MAGE-1 in the HLA-Al context d. H. recognizes the complex of Mage-1 peptide and the HLA-Al molecule. The differently loaded DCs were stained with this antibody and analyzed in the FACS.
  • the MAGE-1 / Al antibody was used to determine the effectiveness of the different loading methods.
  • a significant loading was achieved with the tumor cell preparations (the melanoma cell line used expresses the Mage-1 antigen), which reached approximately 20% of the antigen density of the peptide pulse (FIG. 18D).
  • the expression of the MAGE-1 / HLA-Al complex was detectable in comparable quantity before and after cryopreservation (calculated as positivity against the background of unloaded DC).
  • the method of the present invention not only allows an effective cryopreservation of unloaded DC loaded with peptide or protein (as shown in Example 1-7), but also an effective one of DC, which with (tumor -) Cell preparations (simple necrotic tumor cells, lysates made from tumor cells or apoptotic tumor cells) were loaded.
  • Effective means that freezing i) means that the cell loss after thawing is ⁇ 25% compared to unfrozen DC, ii) the thawed DC has a comparable T cell stimulatory capacity as the unfrozen DC (tested in the allo - genes MLR) and iii) the surface expression of antigens or ligands for
  • T cell receptors ie specific MHC-peptide complexes
  • T cell receptors are retained after the freezing and thawing process (shown by way of example by direct detection of a specific peptide / MHC complex, namely the MAGE-1 / HLA-Al complex, using one of these Complex-specifically recognizing monoclonal antibody).
  • Dendritic cells transfected with adenoviruses can be frozen using the method according to the invention in such a way that the properties of the dendritic cells are comparable in comparison to non-transfected dendritic cells.
  • mature DC with an infection multiplicity (MOI) of 500 for 2 hours were infected with an adenovirus vector (AD5) which contains a cDNA coding for the "Green Fluorescent Protein” (GFP). After washing twice, the cells were frozen at a concentration of 10 ⁇ 10 6 DC / ml in the HSA and 10% DMSO in 5% glucose (final concentration) and stored for 4 hours. After thawing, the viability of the cells was determined by trypain blue exclusion. The viable cell recovery rate is shown in Figure 20 as a percentage of frozen DC.
  • mature DC were cryopreserved with adeno-GFP at an MOI of 500 as described above. After thawing and the indicated culture time, the cells were counterstained using antibodies specific for CD83, CD25, CD86, CD80, followed by PE-conjugated goat / mouse IG (Fab ') 2 fragments. The results are shown in Fig. 22A. In a comparable experiment using HLA class 1, HLA-DR and CD40 specific antibodies, the results shown in Figure 22B were obtained.
  • Dendritic cells transfected with RNA can be frozen using the method according to the invention in such a way that the properties of the dendritic cells are comparable in comparison to non-transfected dendritic cells.
  • the DC can be transfected with RNA in the immature stage - then matured - and then frozen as a mature DC (not shown).
  • Mature DCs are preferably transfected with RNA and cryopreserved. The results are summarized in Figures 25 to 27.
  • Control TLC were pulsed without the addition of RNA.
  • the cells were frozen at a concentration of 10 ⁇ 10 6 DC / ml in HSA (with 10% DMSO and 5% glucose (final concentration)) and stored for 4 hours. After thawing, cell viability was determined by trypan blue exclusion. The recovery of viable cells is shown in Figure 25 as a percentage of the frozen DCs. Mature DCs were electroporated with EGFP-RNA and cryopreserved as described above. After thawing and a culture period of 48 hours, the dendritic cells were co-cultivated with allogeneic CD4 + T cells (2 ⁇ 10 5 / well) at the ratios indicated in FIG. 26. After 4 days, the cells were pulsed with [ 3 H] thymidine for 16 hours and the incorporation of the radioactivity was determined. 26 shows the mean values for triplicate measurement (with standard deviation). The numbers of T cells alone or DC alone were less than 1000 per minute.
  • RNA electroporated DC does not change the phenotypic DC marker.
  • mature DC were electroporated, with or without EGFP-RNA and cryopreserved as described above. After thawing and a cultivation period of 48 hours, the DC were counterstained with the mouse monoclonal antibodies and PE-conjugated anti-mouse Ig (Fab ') 2 fragments shown in FIG. 27, followed by FACS analysis.
  • the numbers in FIG. 27 relate to the EGFP-positive DC in the lower right part of the square and the EGFP / DC marker double-positive DC in the upper right part.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung gebrauchsfertiger, kryokonservierter, reifer dendritischer Zellen, insbesondere zur Herstellung eines Impfstoffs, der diese dendritische Zellen enthält, wobei unreife dendritische Zellen in Gegenwart von geeigneten Reifungsstimuli kultiviert und die auf diese Weise erhaltenen reifen dendritischen Zellen eingefroren werden. Vor oder nach dem Einfrieren können die dendritischen Zellen mit Antigen beladen werden. Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren und eine Zusammensetzung enthaltend gefrorene, reife, mit Antigen beladene dendritische Zellen.

Description

Verfahren zur Herstellung gebrauchsfertiger, antigenbeladener oder -unbeladener, kryokonservierter, reifer dendritischer Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung gebrauchsfertiger, kryokonservierter, reifer dendritischer Zellen, insbesondere zur Herstellung eines Impfstoffs, der diese dendritische Zellen enthält, wobei unreife dendritische Zellen in Gegenwart von geeigneten Reifungsstimuli kultiviert und die auf diese Weise erhaltenen reifen dendritischen Zellen eingefroren werden. Vor oder nach dem Einfrieren können die dendritischen Zellen mit Antigen beladen werden. Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren und eine Zusammensetzung enthaltend gefrorene, reife, mit Antigen beladene dendritische Zellen.
Hintergrund der Erfindung
Dendritische Zellen (nachfolgend kurz "DC" oder auch "DZ") sind antigenpräsen- tierende Zellen, die das Immunsystem durch Wechselwirkung mit Lymphozyten beeinflussen. Die meisten DC weisen immunstimulatorische Aktivität auf. Diese klassischen DC können auf verschiedene Weisen in vivo die Bildung von Helferund Killer-T-Zellen induzieren ("nature's adjuvant"). Insbesondere haben unreife DC, die in peripheren Geweben vorkommen, die Fähigkeit, Antigene zu binden und daraus immunogene MHC-Peptid-Komplexe herzustellen ("antigen proces- sing mode"). Auf reifungsinduzierende Stimuli wie z. B. inflammatorische Cyto- kine hin entwickeln sich diese unreifen DC durch eine erhöhte Bildung von Adhä- sions- und costimulatorischen Molekülen in potente T-Zell-Stimulatoren ("T-cell stimulatory mode"). Gleichzeitig wandern die Zellen in sekundäre lymphatische Organe, um seltene Antigen-spezifische T-Zellen auszuwählen und zu stimulieren. Es konnte gezeigt werden, dass DC, die aus Gewebe oder Blut isoliert wur- den und in vitro mit Antigen beladen wurden, nach Rückinjektion als reife DC in vivo immunogen waren. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass DC CD4+ und CD8+ T-Zellimmunität sowohl in gesunden Menschen als auch in Krebspatienten induzieren können. Bei immunkompetenten, gesunden Personen konnte eine einzige Auffrischungsinjektion mit reifen DC nicht nur die Häufigkeit, sondern auch die funktioneile Avidität der CD8+ T-Zellantwort verstärken. Aus diesen Gründen sind (insbesondere reife) DC gegenwärtig äußerst vielversprechende -Adjuvantien, um im Menschen potente T-Zellantworten gegen Tumoren und Infektionen hervorzurufen.
Eine Voraussetzung für die Verwendung von DC in der Immuntherapie ist die Entwicklung von Techniken, die es erlauben, eine große Anzahl von DC in Kultur zu produzieren, entweder aus proliferierenden CD34+-Vorläuferzellen oder nicht oder wenig proliferierenden CD14+-monozytischen Vorläuferzellen. Von Mono- zyten abgeleitete DC werden gegenwärtig häufig verwendet, da sie einfach ohne jede Cytokinvorbehandlung des Spenders hergestellt werden können, und da die resultierende DC-Population recht homogen und am besten charakterisiert ist. Es können z. B. aus adhärenten Monozyten in Abwesenheit von fötalem Kälberse- rum (FCS) unreife DC hergestellt werden während einer in der Regel sechs- bis siebentägigen Kultur in (GM-CSF + IL-4), gefolgt von einer zumeist ein- bis dreitätigen Reifung, induziert durch autologes Monozyten-konditioniertes Medium. Eine effektive Cryokonservierung dendritischer Zellen oder ihrer Vorläuferzellen hat sich als äußerst schwierig erwiesen, außer in Gegenwart von FCS (Taylor et al. (1990) Cryobiology 27, 269; Makino et al. (1997) Scand. J. Immu- nol. 45, 618). Da jedoch FCS bei Vakzinierungen nicht zugegen sein darf, war es bislang immer noch notwendig, für jede DC-Vakzinierung DC neu herzustellen, entweder aus frischem Blut, aus frischen Leukaphereseprodukten oder aus gefrorenen PBMC ("peripheral blood mononuclear cells")-Aliquots aus Leukaphereseprodukten (Thurner et al. (1999) J. Immunol. Methods 223, 1). Gefrorene PBMC haben auch den Nachteil, dass nach dem Auftauen erst eine mehrtägige Kultivierung der Zellen erfolgen muß, um sie in DC zu differenzieren. Lewalle et al. (2000) 3. Immunol. Methods 240, 69-78 offenbaren ein Verfahren zum Einfrieren unreifer DC, es werden aber nur schlechte Ausbeuten an überlebenden Zellen erhalten (S. 71, linke Spalte oben). Das Einfrieren von mittels GM-CSF und IL-4 aus Monozyten hergestellten unreifen dendritischen Zellen ist auch in der WO 99/46984 offenbart.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Zusammensetzung wie z. B. ein Impfstoff bereitzustellen, der reife DC enthält, über einen längeren Zeitraum ohne wesentlichen Aktivitätsverlust aufbewahrt werden kann und bei
Bedarf innerhalb kurzer Zeit verabreicht werden kann.
Die erfindungsgemäß eingesetzten DC stammen bevorzugt von demjenigen Pati- enten, der mit dem Impfstoff behandelt wird (autolog). Alternativ hierzu können die DC aber auch von anderen Patienten stammen (ailogen), z. B. aus Leu- kapheresaten von normalen Freiwilligen, wie z. B. in Thurner et al. (1999) J. Immunol. Methods 283, 1-15 beschrieben.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass nur voll ausgereifte DC (nachfolgend auch kurz "reife DC"), die durch Kultivieren in Gegenwart eines geeigneten "Reifungscocktails" mit spezifischen Reifungsstimuli erhältlich sind, nach Einfrieren ohne FCS und Auftauen zu einem hohen Prozentsatz überleben und immunstimulierende Aktivitäten aufweisen, die vergleichbar sind mit denen von frisch präpa- rierten, reifen DC. Beim Kultivieren mit dem Reifungscocktail werden die unreifen DC zu reifen DC differenziert. Ein besonders bevorzugter Reifungscocktail enthält Interleukin-lß (IL-lß), Interleukin-6 (IL-6), Prostaglandin E2 (PGE2) und "tumor necrosis factor α" TNFα.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit
(1) ein Verfahren zur Herstellung gebrauchsfertiger, kryokonservierter, reifer dendritischer Zellen, umfassend a) Bereitstellen von unreifen dendritische Zellen (DC) ; b) Kultivieren der unreifen DC in einem Kulturmedium, das einen Reifungscocktail mit einem oder mehreren Reifungsstimuli enthält, unter
Erhalt von reifen DC; c) Einfrieren der reifen DC in einem Einfriermedium, das kein heterologes Serum enthält;
(2) ein Verfahren, wie vorstehend unter (1) definiert, das zur Herstellung eines Impfstoffs aus reifen, kryokonservierten DC geeignet ist;
(3) gefrorene, reife, mit Antigen beladene dendritische Zellen, insbesondere solche dendritische Zellen, die gemäß dem Verfahren (1) erhältlich sind;
(4) einen Impfstoff, umfassend dendritische Zellen, wie in (3) definiert; und (5) Verfahren zum Auffinden vorteilhafter Bedingungen zum Einfrieren von DC, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen unreifer DC; b) Kultivieren verschiedener Ansätze der unreifen DC in Gegenwart verschiedener Reifungsstimuli; c) anschließendes Kultivieren der DC in Medium mit oder ohne Cytokine, wobei ein Kultivieren ohne Cytokine bevorzugt ist; d) Bestimmen des Anteils lebender Zellen nach wenigstens 1 Tag Kultur in dem Medium mit oder ohne Cytokine; und e) Ermitteln des Reifungsstimulus, der die höchste Überlebensrate ergeben hat.
In den Verfahren (1) und (2) der Erfindung werden zunächst unreife DC kultiviert, wobei ein geeigneter Reifungscocktail mit einem oder mehreren Reifungs- Stimuli dem Kulturmedium zugesetzt wird. Geeignete Reifungsstimuli sind dabei IL-1 wie z. B. IL-lß usw., IL-6, TNF-α, Prostglandine wie z. B. PGE2 usw., IFIM-α, Lipopolysacchariden und andere bakterielle Zellprodukte wie z. B. MPL (Mono- phosphoryllipid A), Lipoteichonsäure usw., Phosphorylcholin, Calciumionophore, Phorbolester wie PMA, Heat-Schock-Proteine, Nukleotide wie z. B. ATP usw., Li- popeptide, künstliche Liganden für Toll-ähnliche Rezeptoren, doppelsträngige RNA wie z. B. Poly-I:C usw., immunstimulatorische DNA-Sequenzen, CD40-U- gand usw.. Besonders bevorzugt im Sinne der Erfindung ist, wenn das Kulturmedium oder der Reifungscocktail IL-lß, IL-6, PGE2 und TNFα enthält oder der Reifungscocktail Monocyten-konditioniertes Medium (MCM) oder MCM mit zusätz- lichem PGE2 ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Verfahren (1) und (2) können die DC während oder nach dem Kultivierungsschritt mit Antigen beladen werden. Nach Reifung und gegebenenfalls Beladung mit Antigen werden die DC in Einfriermedium eingefroren, das kein heterologes Serum wie z. B. FCS enthält. Heterologes Serum im Sinne dieser Anmeldung ist Serum, das nicht von der Spe- zies Mensch stammt. Erfindungsgemäß ist es aber möglich, sowohl autologes Serum oder Plasma (das von dem gleichen Menschen stammt wie die DC) als auch allogenes Serum oder Plasma (das von einem anderen Menschen stammt als die DC) zu verwenden. Unreife DC im Sinne dieser Anmeldung sind CD83 (und/oder p55/fascin- und/oder DC-LAMP-) negative (oder nur schwach und/oder zu geringem Prozentsatz positive), im Vergleich zu reifen DC nur geringe Mengen an Klasse-I- und Klasse-II-MHC sowie Adhäsions- bzw. kostimulatorischen Molekülen (z. B. insbe- sondere CD86, CD80, CD40) exprimierende Leukozyten, welche nach einem geeigneten Reifungsstimulus in reife DC differenzieren.
Reife DC im Sinne dieser Anmeldung sind Leukozyten, welche sich nach Einwirkung eines Reifungsstimulus aus unreifen DC entwickeln, eine verstärkte Expres- sion von CD83 (und/oder p55/fascin und/oder DC-LAMP) sowie von Klasse-Hund Klasse-I-MHC-Molekülen und Adhäsions- bzw. kostimulatorischen Molekülen zeigen, insbesondere von CD86, CD80, CD40. Weiter zeigen die reifen DC eine deutlich erhöhte T-Zell-stimulatorische Kapazität im Vergleich zu unreifen DC (z. B. zeigen sie im Gegensatz zu unreifen DC eine eindeutige stimulatorische Akti- vität in der allogenen MLR noch bei einem DC:T-Verhältnis um < 1: 100); zudem ist ein Charakteristikum der reifen DC im Sinne dieser Anmeldung, dass diese DC stabil sind, d. h. ihre Eigenschaften eines reifen Phänotyps und einer starken T- Zell-stimulatorischen Kapazität auch behalten, wenn sie in Abwesenheit von Zy- tokinen für 1-2 Tage oder länger kultiviert werden. Im Gegensatz dazu sind DC, die nicht voll ausgereift sind, nicht stabil und differenzieren zu unreifen DC oder z. B. zu adhärenten Makrophagen.
Die unreifen DC können aus verschiedenen bekannten Quellen bereitgestellt werden. Die Vorläuferzellen der unreifen DC sind in der Regel nicht-proliferierende CD14-positive mononukleäre Zellen (PBMC; Monozyten) oder proliferierende CD34-positive Zellen. Beispielsweise können aus Leukaphereseprodukten PBMC isoliert werden. Die PBMC können wie beschrieben zu unreifen DC differenziert werden (Thurner et al. (1999) J. Exp. Med. 190, 1669). Dazu werden die PBMC in Gegenwart von IL-4 (oder IL-13; Romani et al. (1996) J. Immunol. Methods 196, 137-151) und GM-CSF ("granulocyte-macrophage-colony stimulating factor") kultiviert. Aus CD14-positiven Monocyten können unreife DC auch durch Kultivierung in Gegenwart von GM-CSF und IFNα hergestellte werden (Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191, 1777-1788). Aus CD34-positiven Zellen können durch Kultivierung in Gegenwart von GM-CSF, SCF ("stem cell factor") und TNF un- reife DC erhalten werden. Die unreifen dendritischen Zellen können auch direkt aus frischem Blut gewonnen werden wie z. B. in Nestle et al. (1998) Nat. Med. 4, 328 beschrieben. Im Blut existieren auch präformierte CDllc+ und CDllc- DC (O'Doherty et al. (1994) Immunology 82, 487-493) sowie M-DC8-DC (Schäkel et al. (1999) Pathobiology 67, 287-290). Auch diese DC können aus dem Blut isoliert werden und weiter in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Die bevorzugten Konzentrationen der verschiedenen Reifungsstimuli im Kulturmedium liegt im Bereich von 0,1 ng/ml bis 100 μg/ml, vorzugsweise 1 ng/ml bis 10 μg/ml. Für den besonders bevorzugten Reifungscocktail der vorliegenden Erfindung beträgt die Konzentration der Reifungsstimuli 0,1 bis 100 ng/ml IL-lß, 0,1 bis 100 ng/ml IL-6, 0,1 bis 10 μg/ml PGE2 und 0,1 bis 100 ng/ml TNFα (am bevorzugtesten ist die Konzentration dieser speziellen Reifungsstimuli ungefähr 10 ng/ml IL-lß, 10 ng/ml IL-6, 1 μg/ml PGE2 und 10 ng/ml TNFα). Die Konzent- rationen beziehen sich auf die Endkonzentrationen der Stoffe im Zellkulturmedium, in dem die DC kultiviert werden. Eine Möglichkeit, die DC in Gegenwart der genannten Wirkstoffe auszureifen, besteht darin, die unreifen DC in Gegenwart von Monocyten-konditioniertem Medium (MCM) zu kultivieren. MCM enthält IL- lß, IL-6, PGE2 und TNFα. Es kann durch Kultivierung von PBMC in Medium ohne Cytokine gewonnen werden, wie zum Beispiel in Romani et al. (1996) J. Immunol. Methods 196, 137 beschrieben. Bei der Ausreifung der DC durch MCM enthält das Kulturmedium 1-100 %, vorzugsweise 5-25 % MCM. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Ausreifung der DC durch Zusatz von MCM und einer definierten Menge PGE2. Es wurde nämlich gefunden, dass Schwankungen in der Fähigkeit von MCM, DC bestmöglich auszureifen, durch Zusatz von PGE2 (bevorzugt in den oben angegebenen Konzentrationen) aufgefangen werden können. Erfindungsgemäß ist es aber bevorzugt, die DC durch Zusatz definierter optimaler Mengen der Wirkstoffe IL-lß, IL-6, PGE2 und TNFα auszureifen. Das bedeutet, dass die Reifungszusammensetzung aus gereinigten Zu- bereitungen der einzelnen Wirkstoffe hergestellt wird. Dadurch werden bessere Ergebnisse erzielt als bei der Ausreifung mit MCM oder MCM+PGE2. IL-lß, IL-6, PGE2 und TNFα sind in GMP ("good manufacturing practice")-Qualität erhältlich. Üblicherweise erfolgt die Reifung durch Kultivierung in Gegenwart der genannten Stoffe für wenigstens 1 Stunde, vorzugsweise 2 Stunden und besonders bevor- zugt wenigstens 6 Stunden. Besonders bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Reifezeiten von 6 bis 96 Stunden, vorzugsweise von 18 bis 36 Stunden (im Falle der Verwendung von Leukopharesen als Ausgangsmaterial) bzw. für 36 bis 60 Stunden (bei Verwendung von Frischblut oder buffy als Ausgangs- material).
Erfindungsgemäß werden die DC während und/oder nach dem genannten Reifungsschritt mit wenigstens einem Antigen oder einem Antigen-Antikörperkom- plex beladen. Erfindungsgemäß kann die Antigen-Beladung vor oder nach dem Einfrieren erfolgen. Erfolgt sie nach dem Einfrieren, dann werden die DC erst nach dem Wiederauftauen mit Antigen beladen. Bevorzugt ist aber eine Beladung mit Antigen vor dem Einfrieren der DC. Das hat den Vorteil, dass die DC unmittelbar nach dem Auftauen einsatzbereit sind.
Antigene im Sinne dieser Anmeldung sind Proteine, Proteinfragmente, Peptide sowie davon abgeleitete Moleküle (z. B. glykosierte Verbindungen oder Verbindungen mit sonstigen chemischen Modifikationen), aber auch die dafür kodierende Nukleinsäure, Viren, ganze pro- bzw. eukaryontische Zellen oder Fragmente davon oder apoptotische Zellen. Unter "Beladung durch Antigen" wird ein Prozess verstanden, der dazu führt, dass MHC-Moleküle auf der Zelloberfläche der DC Peptide "präsentieren", also einen Komplex mit den MHC-Molekülen aufweisen. Während durch spezifische Peptide eine direkte Beladung der MHC-Moleküle möglich ist, müssen Protein(fragment)e erst prozessiert werden, also zunächst von der Zelle aufgenommen werden. Nach intrazellulärer Spaltung der Proteine und Beladung von MHC mit Peptid werden MHCII-Peptid-Komplexe auf der Zelloberfläche präsentiert. Als Antigene kommen zunächst vor allem Proteine oder Proteinfragmente in Frage. Die Proteine können nativen Ursprungs sein oder rekombinant hergestellt worden sein. Durch die Reifung und Beladung mit Pro- tein-Antigen entstehen auf der Zelloberfläche der DC MHCII-Peptid-Komplexe, die Peptidfragmente des zugesetzten Antigens umfassen. Die Konzentration des Protein-Antigens im Kulturmedium ist in der Regel 0,1 bis 100 μg/ml, vorzugsweise 1 bis 50 μg/ml, am bevorzugtesten 1 bis 10 μg/ml. Wird als Antigen ein Protein (d. h. ein Polypeptid mit mehr als 50 Aminosäureresten) eingesetzt, so sollte die Beladung vorzugsweise während der Reifung der DC erfolgen. Dann erfolgt eine besonders effektive Präsentation der Antigen- fragmente durch MHCII-Moleküle. Das Protein(fragment) muß nicht während des gesamten Reifungszeitraums anwesend sein, es sollte aber wenigstens für einen Teil des Reifungszeitraums sowohl die Reifungszusammensetzung als auch das Protein(fragment) gleichzeitig anwesend sein. Beispiele für Proteinantigene sind KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) als weit verwendetes positives Kontrollanti- gen, MAGE-3-Protein als Beispiel für ein Tumorantigen, sowie Hepatitis B Ober- flächenantigen (HbsAg) oder HIV-1 gp 160-Protein als Beispiel für ein zur Behandlung von viralen Erkrankungen sinnvolles Protein.
Bei einer Beladung mit "kurzen Polypeptiden" oder Proteinfragmenten (z. B. kurze Polypeptide mit bis zu 50 Aminosäureresten, die exakt in die MHC-Moleküle an der DC-Oberfläche hineinpassen) sind neben der obengenannten Beladung während der Reifung auch eine Beladung nach der Reifung, nämlich vor dem Einfrieren oder nach dem Wiederauftauen, möglich. Bei solch einer Beladung nach der Reifung werden die kurzen Polypeptide zu gewaschenen DC zugegeben.
Eine weitere Möglichkeit der Beladung mit Antigen stellt die Zugabe von apoptoti- schen oder lysierten Zellen zum Kulturmedium dar. Die zugesetzten Zellen können dann von den DC phagocytiert werden. Diese Methode hat den Vorteil, dass neben MHC-Klasse-II-Molekülen auch Klasse-I-Moleküle effektiv beladen werden. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass selbst bei Gabe von Proteinen (insbeson- dere partikulärer Natur) Präsentation auch auf MHC -Klasse-I-Molekülen stattfindet. Beispielsweise kann man, anstatt die DC in Gegenwart von Mage-3 Tumorprotein oder -peptid zu kultivieren, den DC Zellfragmente (von nekrotischen Zellen oder apoptotischen Tumorzellen) zusetzen, die Mage-3 enthalten.
Es können DC auch dadurch mit Antigen beladen werden, dass DC z. B. mit Tumorzellen fusioniert werden. Eine solche Fusion kann mittels Polyethylenglycol oder Elektroporation erreicht werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die DC dadurch mit Antigen beladen, dass sie transfiziert oder viral infiziert werden. Dadurch werden Nukleinsäuren, die für Antigene kodieren, in die DC eingebracht und zur Expression gebracht. Beispielsweise kann eine DNA- oder RNA-Transfektion oder eine Infektion mit Adenoviren in geeigneter Weise durchgeführt werden. Dadurch ist auch eine Beladung der MHC-Klasse-I-Moleküle möglich. Beispielsweise kann auch aus Tumorzellen präparierte RNA transfiziert werden. Zur Transfektion können gängige Methoden wie z. B. Elektroporation eingesetzt werden.
Wie vorstehend ausgeführt, kann während des Reifungszeitraums oder nach dem Reifungszeitraum spezifisches Antigen-Peptid (d. h. "kurze Polypeptide") zugesetzt werden, um MHC-Moleküle der Klasse I oder II direkt zu beladen. Das Pep- tid-Antigen kann vor der Reifungszusammensetzung zu den Zellen gegeben werden, es wird aber vorzugsweise gleichzeitig oder danach zugesetzt. Die Anti- genbeladung erfolgt vorzugsweise für wenigstens 10 min, mehr bevorzugt für 1 bis 24 Stunden, am bevorzugtesten für 3 bis 12 Stunden.
Die Peptide (d. h. "kurze Polypeptide") haben in der Regel wenigstens 8 Aminosäuren. Vorzugsweise haben solche Peptide 8 bis 12 Aminosäuren (MHCI) bzw. 8 bis 25 Aminosäuren (MHCII). Die Konzentration des Peptids im Kulturmedium zur Beladung beträgt in der Regel 0,01 bis 1000 μM, vorzugsweise 0,1 bis 100 μM, am bevorzugtesten 1 bis 20 μM.
Als einsetzbare Peptide sind alle Peptide denkbar, die von MHC-Molekülen prä- sentiert werden können. Bevorzugt sind Peptide, die von Proteinen abgeleitet sind, die von Krankheitserregern stammen. Dabei kann es sich auch um Peptide handeln, die Variationen der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz aufweisen. Solche Variationen sind in der Regel ein oder zwei Aminosäureaustausche. Beispiele für Peptidantigene sind das Influenza-Matrix-Peptid (IMP) mit der Aminosäuresequenz GILGFVFTL (SEQ ID NO: l) oder das Melan A-analoge Peptid mit der Sequenz ELAGIGILTV (SEQ ID NO:2). Beispiele für weitere mögliche Peptide sind in Fig. 26 dargestellt. Neben "Peptid-/Proteinpulsing" kann auch "Peptid-/Protein-transloading" durchgeführt werden, um DC mit Antigen zu beladen.
Wie vorstehend angeführt, können die DC auch mit Antigen-Antikörperkomplexen beladen werden. Geeignete Antigene hierfür sind alle vorstehend erwähnten Antigene. Antigen-Antikörperkomplexe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Komplexe dieser Antigene mit geeigneten Antikörpern, z. B. Antigen-IgG- oder IgE-Komplexe. Das Beladen von DC mit solchen Antigenen ist in Reynault, A. et al., 3. Exp. Med. 189(2):371-80 (1999) beschrieben, worauf hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Nach Reifung und gegebenenfalls Antigenbeladung der DC können die reifen DC in Einfriermedium eingefroren werden. Das Einfriermedium kann neben der Serumkomponenten noch ein oder mehrere Gefrierschutzmittel (z. B. von 0,1 bis 35 % (v/v), vorzugsweise 5 bis 25 % (v/v)) enthalten. Geeignete Gefrierschutzmittel sind dabei vorzugsweise die folgenden Verbindungen: DMSO, Glycerin, Polyvi- nylpyrrolidon, Polyethylenglykol, Albumin, Cholinchlorid, Aminosäuren, Methanol, Acetamid, Glycerin monoacetat, anorganische Salze usw. Das bevorzugte Gefrierschutzmittel ist DMSO, das vorzugsweise in einer Konzentration von 5 bis 25 % (v/v), bevorzugter 10 bis 20 % (v/v), am bevorzugtesten ungefähr 10 % DMSO, im Einfriermedium enthalten ist. Das Einfriermedium kann eine nicht heterologe Serumkomponente enthalten, vorzugsweise in einer Konzentration von 2 bis 90 % (w/v), bevorzugt 5 bis 80 % (w/v), wobei humanes Serumalbumin, vorzugsweise in einer Konzentration von 10 bis 30 % (w/v) besonders bevorzugt ist. Be- vorzugter ist es jedoch, dass das Einfriermedium anstelle von humanem Serumalbumin autologes Serum oder Plasma enthält. Es kann auch humanes, allogenes Serum oder Poolserum enthalten sein. Ebenfalls kann als Zusatz in dem Einfriermedium eine oder mehrere von Kohlenhydraten abgeleitete Polyolverbindungen, insbesondere ausgewählt aus Glukose, Dextran, Sucrose, Ethylenglykol, Erythrit, D-Ribit, D-Mannit, D-Sorbit, Inosit, D-Laktose usw. enthalten sein, vorzugsweise in einer Konzentration von 2 bis 30 %, mehr bevorzugt 5 bis 10 %, am bevorzugtesten etwa 5 % (w/v). Das bevorzugteste Einfriermedium ist reines autologes Serum mit ungefähr 10 % DMSO und ungefähr 5 % Glukose. In der Regel werden die Zellen vor dem Einfrieren abzentrifugiert, um sie zu konzentrieren und im Einfriermedium aufzunehmen.
Die bevorzugte Konzentration von Zellen im Einfriermedium ist 1 bis 100 x 106 Zellen/ml, die bevorzugteste Konzentration ist ungefähr 5 x 106 Zellen/ml bis 20 x 106 Zellen/ml.
Es wurde ebenfalls gefunden, dass die Überlebensrate von DC erhöht wird, wenn die DC vor dem Einfrieren oder nach dem Auftauen mit einem anti-apoptotischen Molekül in Kontakt gebracht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden daher vor dem Einfrieren oder nach dem Auftauen die DC mit einem Molekül in Kontakt gebracht, das die Apoptose hemmen kann. Bevorzugte anti-apoptotische Moleküle sind CD40 Ligand (CD40L)(Morris et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 418), TRANCE (Wong et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 2075) oder RANKL (Anderson et al. (1997) Nature 390, 175). Vorzugsweise wird wenigstens eines der Moleküle vor dem Einfrieren oder nach dem Auftauen' der DC wenigstens 10 min, bevorzugt wenigstens 1 Stunde, bevorzugter wenigstens 4 Stunden dem Kulturmedium zugesetzt. Bevorzugte Konzentrationen im Kulturmedium sind 1 ng/ml bis 5 μg/ml (RA KL/TRANCE) bzw. 1 ng/ml bis 1 μg/ml (CD40L). Besonders bevorzugte Konzentrationen sind 0,5 bis 1 μg/ml (RANKL/TRANCE) und 0,1 bis 0,5 μg/ml (CD40L).
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden die DC weiterhin in Gegenwart des immunosuppressiven Interleukin-10 (IL-10) oder anderer Im- mun-/Reifungsmodulatoren wie z. B. Vitamin D3 und dessen Derivate, Fumar- säure und Derivate davon wie z. B. Ester usw., Mycophenolatmofetil usw. kultiviert. Derartig behandelte Zellen werden nicht zur Stimulation des Immunsystems eingesetzt, vielmehr soll eine Toleranz gegen bestimmte Antigene induziert werden. Die Konzentration dieser Modulatoren und von IL-10 im Medium beträgt 1 - 1000 ng/ml, bevorzugt 10 - 100 ng/ml.
Gemäß Ausführungsform (4) betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Impfstoff, der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist. Der erfindungsgemäße Impfstoff kann neben den reifen, Antigen-beladenen DC weiterhin phar- mazeutisch verträgliche Hilfsstoffe enthalten. Nach dem Auftauen des erfindungsgemäßen Impfstoffs können noch verschiedene Stoffe zugesetzt werden, die pharmazeutisch verträglich und für eine Verabreichung vorteilhaft sind.
Gemäß Ausführungsform (3) betrifft die Erfindung auch gefrorene, reife, mit Antigen beladene dendritische Zellen. Diese erfindungsgemäßen Zellen können Bestandteil einer pharmazeutischen Zusammensetzung sein, die neben den Zellen noch übliche, für die Verabreichung an Menschen geeignete Zusatzstoffe enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal einen Impfstoff zur Verfügung, der reife, Antigen-beladene DC enthält und eingefroren werden kann. Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung ist es, dass die Überlebensrate der DC nach dem Auftauen sehr hoch ist. Nach dem Auftauen der eingefrorenen DC erhält man in der Regel mehr als 75 %, bevorzugt mehr als 85 % überlebende DC, bezogen auf die Anzahl eingefrorener DC. Derartig hohe Überlebensraten von aufgetauten DC waren bislang ohne Zusatz von FCS nicht erreicht worden. Dies ist aber eine wichtige Voraussetzung, um eine wirksame Immunstimulation zu erzielen. Ein erheblicher Vorteil des Einfrierens von reifen, Antigen-beladenen DC ist, dass zahlreiche Aliquots eines Impfstoffs hergestellt und eingefroren werden können. Dadurch ist der Impfstoff bei Bedarf sofort verfügbar und kann ohne langwierige Kultur-Schritte innerhalb kürzester Zeit appliziert werden. Durch eine Antigenbe- ladung erst nach Einfrieren und Wiederauftauen reifer DC ist es möglich, die DC nach den jeweiligen Gegebenheiten variabel zu beladen. Beispielsweise kann bei einer sich entwickelnden Überstimulation bzw. Allergie gegenüber einem der zur Vakzination eingesetzten Peptide auf dieses bei der Beladung verzichtet werden.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass es zum Auffinden geeigneter Verfahren zum Einfrieren von DC nicht ausreichend ist, die unmittelbaren Einfrierparameter wie z. B. Einfriermedium und Abkühlgeschwindigkeit zu variieren und die Überlebensrate unmittelbar nach dem Auftauen zu bestimmen. Diese unmittelbare Überlebensrate entspricht nicht unbedingt einem Überleben frisch hergestellter DC während mehrtägiger Kultur in der Abwesenheit von Cytokinen. Vielmehr spielt auch die Reifung bzw. der verwendete Reifungsstimulus vor dem
Einfrieren eine entscheidende Rolle für das Überleben der Zellen. Der Erfindung liegt somit auch die Erkenntnis zugrunde, dass der erfindungsgemäße Reifungsstimulus nicht nur zu einer vollen DC-Reifung führt, sondern auch DC liefert, die besser überleben können als DC, die durch andere Stimuli gereift worden sind. Bisher wurde dem Reifungsstimulus im Hinblick auf das Einfrieren überhaupt keine Beachtung geschenkt.
Es wurde auch gefunden, dass es eine hervorragende Methode zur Optimierung des Verfahrens zum Einfrieren von DC ist, DC mittels verschiedener Reifungsstimuli auszureifen und dann als "Read Out" das Überleben nach Kultur in Komplettmedium ohne jeglichen Cytokinzusatz zu testen. Der Reifungsstimulus, der am höchsten viable DC induziert, wird zur Herstellung von DC verwendet, die dann eingefroren werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Auffinden vorteilhafter Bedingungen zum Einfrieren von DC, wobei unreife DC bereitgestellt werden und in Gegenwart verschiedener Reifungsstimuli kultiviert werden, die Zellen anschließend in Medium mit oder ohne Cytokine, vorzugsweise ohne Cytokine, kultiviert werden, nach wenigstens einem Tag Kultur in Medium mit oder ohne Cytokine der Anteil überlebender Zellen bestimmt wird und schließlich der Reifungsstimulus ermittelt wird, der die höchste Überlebensrate an DC ergeben hat. Dieser Reifungsstimulus wird dann zur Herstellung von DC verwendet, die eingefroren werden. Vorzugsweise wird die Anzahl lebender Zellen erst nach wenigs- tens 2 Tagen Kultur in Medium ohne Cytokine bestimmt, am bevorzugtesten nach wenigstens 3 Tagen.
Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt den Einfluß der Zellkonzentration in den Einfriergefäßen auf die Ausbeute an DC nach dem Auftauen. Reife DC wurden aus Leukapheresepro- dukten gesunder Erwachsener hergestellt, wobei zunächst adhärente Monozyten durch sechstägige Kultur in GM-CSF + IL-4 in unreife DC umgewandelt wurden, dann eine Reifung für einen Tag durch einen Vierkomponenten-Cocktail beste- hend aus TNFα + IL-lß + IL-6 + PGE2 erfolgte (s. Beispiel 1). Reife (Tag 7) DC wurden mit einer Einfriergeschwindigkeit von -l°C/min in reinem autologen Serum + 10 % DMSO + 5 % Glukose bei verschiedenen Zelldichten (DC-Zahl/ml) eingefroren. Nach dem Auftauen der reifen DC wurden die Ausbeuten lebender DC (angegeben als Anteil an der Anzahl eingefrorener DC in Prozent) unmittelbar (= d7) und nach mehreren Tagen in Kultur (nach 1 Tag = d8, nach 2 Tagen = d9, etc.) bestimmt. Die letztgenannte Bestimmung wurde in Komplettmedium, aber ohne Zusatz von GM-CSF oder IL-4, durchgeführt, da dieser harte "washout test" eine etablierte Methode ist, um zu bestimmen, ob DC tatsächlich voll aus- gereift und stabil sind. Einfrieren bei 10 x 106 reifen DC/ml lieferte die besten Ergebnisse (p < 0,05 an Tag 7, p < 0,01 an allen anderen Tagen; n = 3).
Figur 2 zeigt den Einfluß verschiedener Einfriermedien auf die DC-Ausbeute nach dem Wiederauftauen. DC wurden hergestellt wie in der Legende zu Figur 1 be- schrieben, und Aliquots wurden in einer Konzentration von 10 x 106 DC/ml in HSA + 10 % DMSO, in autologem Serum + 10 % DMSO sowie in autologem Serum + 10 % DMSO + 5 % Glukose (Endkonzentrationen) eingefroren. Die DC- Ausbeuten nach Einfrieren und Wiederauftauen wurden bestimmt wie für Figur 1 beschrieben. Einfrieren in autologem Serum + 10 % DMSO + 5 % Glukose ergab die besten Resultate (p < 0,05 an Tag 8; n = 4).
Figur 3 zeigt die Überlebensrate frischer DC im Vergleich mit der eingefrorener und wiederaufgetauter DC in "Washout tests". Reife, d7-DC wurden wie zu Figur 1 beschrieben hergestellt, und frisch hergestellte sowie eingefrorene (-l°C/min in reinem autologen Serum + 10 % DMSO + 5 % Glukose bei einer Zelldichte von 10 x 106 DC/ml) und wiederaufgetaute (nach mehr als 3 Stunden Lagerung in der Gasphase von flüssigem Stickstoff) DC wurden dann für mehrere Tage in Medium ohne Cytokine ("washout test") wie in Figur 1 beschrieben kultiviert. Die Ausbeuten an lebenden DC sind als Prozentangaben der Gesamtzahl an DC, die in die Wells an Tag 7 ausgesät wurden, angegeben. Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen frisch hergestellten und gefrorenen/aufgetauten DC (n = 4). Figur 4 zeigt, dass Einfrieren und Wiederauftauen die charakteristische Morphologie reifer DC nicht verändert. Reife, d7-DC, die wie zu Figur 1 beschrieben hergestellt worden waren, wurden für weitere 2 Tage entweder unmittelbar weiterkultiviert oder nach Einfrieren, mindestens 3 Stunden Lagerung in der Gasphase von flüssigem Stickstoff und Wiederauftauen weiterkultiviert. Sogar nach 48 Stunden weiterer Kultur in der Abwesenheit von Cytokinen ("washout test") blieben die nicht eingefrorenen (links) und die eingefrorenen/wiederaufgetauten DC (rechts) stabile, nicht adhärierende Zellen.
Figur 5 zeigt, dass Einfrieren und Wiederauftauen den charakteristischen Phäno- typ reifer DC nicht verändert. Reife, d7-DC, die wie zu Figur 1 beschrieben frisch hergestellt worden waren, wurden durch FACS-Analyse phänotypisiert (frische DC, Tag 7). Aliquots wurden eingefroren, mindestens 3 Stunden in der Gasphase von flüssigem Stickstoff gelagert, wiederaufgetaut, anschließend wurde ihr Phä- notyp unmittelbar (DC eingefroren/aufgetaut d7) oder nach weiteren 3 Tagen in Kultur (DC eingefroren/aufgetaut dlO) in der Abwesenheit von Cytokinen ("washout test") bestimmt. Eingefrorene/wiederaufgetaute, reife, d7-DC haben den charakteristischen Phänotyp reifer DC (CD14-, CD83 homogen++), sogar nach Entfernen von Cytokinen und weiterer Kultur für 3 Tage behalten.
Figur 6 zeigt, dass Einfrieren und Wiederauftauen die stimulatorische Kapazität reifer DC in der primären allogenen MLR ("Mixed Leukocyte Reaction") nicht verändert. Reife d7-DC wurden wie zu Figur 1 dargestellt hergestellt und die allosti- mulatorische Potenz frisch hergestellter, nicht eingefrorener DC wurde mit einem Aliquot dieser DC, das eingefroren und wiederaufgetaut worden war (nach 3- stündiger Lagerung in flüssigem Stickstoff), verglichen.
Figur 7 zeigt, dass Einfrieren und Auftauen die Fähigkeit reifer DC, eine starke IMP-spezifische CTL-Antwort zu induzieren, nicht verändert. Frisch hergestellte oder eingefrorene/wiederaufgetaute HLA-A2.1 + reife d7-DC wurden mit In- fluenza-Matrixpeptid (= IMP) GILGFVFTL (SEQ ID NO: l) beladen oder unbehan- delt gelassen und mit autologen CD8+-T-Zellen (T:DC-Verhältnis = 10: 1) ohne Zugabe jeglicher Cytokine kultiviert. Zusätzlich wurden gereinigte CD8+-T-Zellen ohne DC ± Zugabe von IMP kultiviert. Nach 7 Tagen wurden die T-Zellen geerntet und auf ihre zytolytische Aktivität hin untersucht, wozu ein Standard-51Cr-Frei- setzungsassay verwendet wurde. T2-Zellen, die ohne oder mit 10 μg/ml IMP gepulst waren, dienten als Zielzellen.
Figur 8 zeigt, dass Einfrieren und Auftauen die Fähigkeit reifer DC, eine starke IMP-spezifische CD8+-T-Zellantwort zu induzieren, nicht verändert (HLA- A2.1/Peptidtetrameranalyse). Frisch hergestellte oder eingefrorene/wiederaufgetaute HLA-A2.1 + reife d7-DC wurden mit IMP beladen (im Fall von gefrorenen/wiederaufgetauten Zellen vor dem Einfrieren oder nach dem Auftauen) oder unbehandelt gelassen und für 7 Tage mit autologen, nicht-adhä- rierenden Fraktionen von PBMC (PBMC:DC-Verhältnis = 30: 1) ohne Zugabe jeglicher Cytokine co-kultiviert, geerntet und mit HLA-A2.1/IMP-Tetrameren (X- Achse) und anti-CD8 (Y-Achse) doppelgefärbt. Die Expansion IMP-Peptid-spezifi- scher CD8+-T-Zellen (der Prozentsatz Tetramer-bindender CD8+-T-Zellen ist in der Figur angegeben) ist vergleichbar für frische und eingefrorene DC. Beladung von DC vor dem Einfrieren und nach dem Auftauen zeigt keinen Unterschied.
Figur 9 zeigt, dass Kontakt mit CD40L die Überlebensrate aufgetauter DC weiter verbessert. Reife d7-DC wurden hergestellt wie zu Figur 1 beschrieben. Nach dem Auftauen wurde lösliches, primäres CD40L (100 ng/ml) für 4 Stunden zugesetzt, dann wurden die DC gewaschen und für mehrere Tage in Medium ohne Cytokine ("washout test") kultiviert wie in der Legende zu Figur 3 beschrieben. Die Ausbeuten lebender DC (angegeben als Prozentsatz eingefrorener DC) wurden unmittelbar (= d7) sowie nach mehreren Tagen in Kultur (nach 1 Tag = d8, nach 2 Tagen = d9, etc.) bestimmt. CD40L-Behandlung von DC ergab eine verbesserte Überlebensrate, insbesondere über Tag 2 der weiteren Kultur hinaus (p < 0,01 an Tag 10 und Tag 11; n = 5).
Figur 10 zeigt, dass DC erfolgreich mit Protein-Antigen vor dem Einfrieren bela- den werden können. DC wurden in ihrem unreifen Stadium durch Zugabe des Modellantigens Tetanustoxoid (TT) (10 μg/ml) an Tag 6 gepulst. Reife DC wurden dann an Tag 7 geerntet und eingefroren wie in der Legende zu Figur 3 beschrieben. Eingefrorene, TT-gepulste DC waren ebenso stimulatorisch wie frisch hergestellte TT-gepulste, reife DC. Figur 11 zeigt, dass DC erfolgreich mit Peptid-Antigen vor Einfrieren beladen werden können. Eingefrorene/aufgetaute (siehe Figur 3) HLA-A2.1 + reife d7-DC wurden mit Melan-A-analogem Peptid ELAGIGILTV (SEQ ID NO:2) entweder vor dem Einfrieren oder nach dem Auftauen beladen oder unbehandelt gelassen und für 7 Tage mit autologen, nicht-adhärierenden Fraktionen von PBMC (PBMC:DC- Verhältnis = 20: 1) ohne Zugabe jeglicher Cytokine co-kultiviert, geerntet und mit HLA-A2.1/Melan-A-Tetrameren (X-Achse) und anti-CD8 (Y-Achse) doppelgefärbt. Die Expansion Melan-A-Peptid-spezifischer CD8+-T-Zellen (der Prozentanteil Tetramer-bindender CD8+-T-Zellen ist in der Figur angegeben) ist vergleichbar für eingefrorene DC, die vor dem Einfrieren oder nach dem Auftauen beladen worden sind. Siehe dazu auch Figur 8.
Figur 12 zeigt die Induktion einer Helferzeil Typ 1-Antwort gegen KLH in Patien- ten, die wie in Beispiel 6 beschrieben vakziniert wurden.
Figuren 13-15 zeigen die Ergebnisse von Beispiel 7.
Figur 16 zeigt eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus von Beispiel 8. Die Ergebnisse des Beispiels 8 sind in Figuren 17 und 18 zusammengefasst.
Figur 17A zeigt die Gesamtzahl der DC nach Beladung mit Tumor-Zell-Lysat oder nekrotischen Tumorzellen und nachfolgender Kryokonservierung.
Figur 17B zeigt die Allostimulatorische Potenz von DC nach Beladung mit Tumor- Zell-Lysat oder nekrotischen Tumorzellen und nachfolgender Kryokonservierung.
Figur 17C zeigt das Resultat der FACS Analyse nach Tumorbeladung und Kryokonservierung.
Figur 18A zeigt das Ergebnis der Bestimmung der Gesamtzahl der. DC nach Beladung mit apoptotischen Tumorzellen und nachfolgender Kryokonservierung. Figur 18B zeigt die Allostimulatorische Potenz von DC nach Beladung mit apopto- tischen MEL 526 Melanomzellen und nachfolgender Kryokonservierung.
Figur 18C zeigt die Ergebnisse der FACS Analyse der MAGE-1/HLA-Al Ag-Expres- sion auf Mage-1 Peptid-gepulsten DC vor bzw. nach Kryokonservierung.
Figur 18D: zeigt den Vergleich der Expression von MAGE-1/HLA-Al Komplexen (bestimmt mittels Antikörper gegen MAGE-1/HLA-Al Komplex) vor und nach Kryokonservierung auf DC, welche auf verschiedene Art beladen wurden.
Figur 19 zeigt eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus von Beispiel 9, in dem Adenovirus infizierte dendritische Zellen mit oder ohne Kryokonservierung verglichen werden. Die Ergebnisse des Beispiels 9 sind in Figuren 20 bis 23 zu- sammengefasst
Figur 20 zeigt die Wiedergewinnung von Adenovirus infizierten dendritischen Zellen nach Kryokonservierung. Die Wiedergewinnungsrate von adeno-GFP infizierten DC nach Einfrieren und Wiederauftauen versus Mock-treated (nicht- transfizierten) DC ist vergleichbar.
Figur 21: CD4-T-Zell stimulierende Aktivität von Adenovirus-infizierten dendritischen Zellen nach Kryokonservieren. Es kann gezeigt werden, dass die Kryokonservierung die allostimulierende Aktivität von Adenovirus-infizierten DC nicht verändert.
Figuren 22A und 22B zeigen, dass ein ähnlicher Phenotyp bei Adenovirus-infizierten DC mit oder ohne Kryokonservierung vorliegt.
Figuren 23A und 23B zeigen einen Phenotypen von Adenovirus-infizierten DC mit oder ohne Kryokonservierung.
Figur 24 zeigt den schematischen Versuchsablauf von Beispiel 10 im Vergleich zu RNA-elektroporierten DC mit oder ohne Kryokonservierung. Die Ergebnisse sind in Figuren 25 bis 27 zusammengefasst. Figur 25 zeigt, dass die Wiedergewinnung nach Kryokonservierung von EGFP- RNA-elektroporierter DC ähnlich ist wie in dem Kontrollexperiment.
Figur 26 zeigt, dass die Kryokonservierung die allostimulatorische Kapazität der EGFP-RNA-transfizierten DC nicht ändert.
Figur 27 zeigt, dass der Phenotyp von RNA-transfizierten DC ähnlich ist wie in dem Kontrollexperiment.
Figur 28 zeigt MHC-Klasse I- und II-restringierte Melanom- und Influenzavirus- peptide, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
Abkürzungen: AS = Aminosäuren, NT = Nukleotide, NP = Nukleoprotein, ana* = analoges Peptid a häufigster DR4-Subtyp, ungefähr 80 % b häufigster DR4-Subtyp, ungefähr 80 % c Bis heute wurden 30 verschiedene HLA-DR13-Allele beschrieben. Es wurde Restriktion für DRB!*1301 und DRB1*1302 gezeigt, die zusammen 80 % der DR13- Allele ausmachen. Es ist möglich, dass auch andere DR13-Allele das Peptid präsentieren. d Das Epitop wird durch dieses zweite HLA-DP4-Allel weniger effektiv präsentiert als durch das Alle! DPB1*0401.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, schränken sie jedoch nicht ein.
Beispiel 1
Es wurde die Überlebensrate von frisch hergestellten, unreifen DC und von durch verschiedene Reifungsstimuli gereiften DC bestimmt.
Folgende verschiedene Reifungsstimuli wurden getestet:
Monozyten-konditioniertes Medium, hergestellt und verwendet wie beschrieben (Thurner et al. (1999) 3. Immunol. Methods 223, 1)
10 ng/ml TNFα - 10 ng/ml TNFα + 1 μg/ml PGE2
10 ng/ml TNFα + 10 ng/ml IL-lß + 100 U/ml IL-6 + 1 μg/ml PGE2 ("Rei- fungscocktail") bis zu 1,0 μg/ml LPS von Salmonella abortus equi doppelsträngige RNA (Poly I:C, 20 μg/ml) - 50 - 1000 ng/ml CD40L
Herstellung von aus Monozyten abgeleiteten DC aus PBMC: Als Komplettmedium wurde RPMI 1640 mit 20 μg/ml Gentamicin, 2 mM Glutamin und 1 % hitzeinaktiviertem (56°C, 30 min) autologem humanem Plasma verwendet. Leukaphere- seprodukte wurden als Monozyten-Separationsprodukte aus gesunden Zytaphe- resespendern hergestellt wie beschrieben (Thurner et al. (1999) 1. Immunol. Methods 223, 1). Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) wurden dann durch Zentrifugation in Lymphoprep isoliert, und DC wurden aus Plastik-adhärierenden Fraktionen der PBMC wie beschrieben hergestellt(Thurner et al. (1999) J. Immu- noi. Methods 223, 1). Dazu wurden unreife DC durch Kultur in Komplettmedium mit rekombinantem humanem GM-CSF (800 U/ml) und IL-4 (500 U/ml) erhalten. An Tag 6 wurden die verschiedenen, oben genannten Reifungsstimuli zu den DC gegeben, an Tag 7 wurden die reifen DC geerntet und für weitere zwei Tage in Abwesenheit von Cytokinen weiterkultiviert. Die Überlebensraten nach zwei Ta- gen Kultur in Prozent der ausgesähten DC waren: 38,25 % für unreife DC,
76,2 % für (IL-lß + IL-6 + PGE2 + TNFα) -gereifte DC, 13,5 % für TNFα-gereifte DC, 37,0 % für (TNFα + PGE2)-gereifte DC, 31,8 % für (Poly I:C)-gereifte DC und
49,6 % für CD40L-gereifte DC (bei 500 ng/ml).
Die Unterschiede waren statistisch signifikant.
Beispiel 2
Reife (Tag 7) DC wurden folgendermaßen eingefroren: DC wurden in Cryogefä- ßen resuspendiert in unterschiedlichen Konzentrationen (5, 20, 40, 60 und 100 x 106 pro ml) entweder in reinem autologem Serum oder in 20 % humanem Se- rumalbumin (HSA; bestehend aus 1000 ml Elektrolytlösung supplementiert mit 200 g humanen Plasmaproteinen mit wenigstens 95 % Albumin; DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg, Baden-Baden, Deutschland). In die entstandene DC-Suspension wurde 1 : 1 mit den verschiedenen nachstehend beschriebenen Einfrierlösungen gemischt, dann sofort in ein 1,0 oder 1,8 ml Cryogefäß über- führt. Unmittelbar danach wurden die Gefäße auf -80°C abgekühlt in einem "Cryo Freezing Container" (Nalgene Cryo 1°C Freezing Container, Abkühlgeschwindigkeit -l°C/min) und schließlich in die Gasphase von flüssigem Stickstoff überführt, wo sie bis zu sieben Monaten aufbewahrt wurden.
a~) Einfriermedien
HSA + DMSO ± Glukose [bestehend aus 20 % HSA-Lösung (siehe oben + 10, 15, 20 und 25 % (v/v) DMSO + Glukose (Glukosteril 40 %™, Freseni- us, Deutschland, Wirkstoff: Glukosemonohydrat) zu 2, 4, 6, 10, 20 oder 30 % (v/v)];
Serum + DMSO + Glukose [reines autologes Serum + 20 % (v/v) DMSO ± Glukose zugesetzt zu 2, 4, 6, 10, 20 oder 30 %];
Erythrocyte Freezing Solution™ [Erythrocyte Freezing Solution™ (Freseni- us, Dreieich, Deutschland), bestehend aus 38 % Glycerol, 2,9 % Sorbitol und 0,63 % Natriumchlorid in sterilem Wasser];
Cell Processing Solution™ + DMSO (Fresenius, Dreieich, Deutschland, bestehend aus 6 % Hydroxyethylstärke in 0,9 % Natriumchlorid, üblicher- weise benutzt zur Sedimentation von Erythrozyten) + 10 oder 15 % (v/v)
DMSO.
b") Auftaubedingungen Zum Auftauen gefrorener reifer (Tag 7) DC wurden folgende vier Verfahren untersucht:
1. DC wurden in einem 56°C Wasserbad aufgetaut, dann ohne Waschen in 10 bis 20 ml eiskaltes Komplettmedium (supplementiert mit 800 U/ml GM-CSF und 500 U/ml IL-4) in Teflonschalen (Rotilabo-Dosen, Roth, Karlsruhe, Deutschland) bei 37°C und 5 % CO2 für zwei Stunden inkubiert, dann geerntet und 10 Minuten bei 150 g und 22°C zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen gezählt und wiederum auf Teflonschalen ausgesäht, in Komplettmedium mit GM-CSF und IL-4 (Zelldichte 1 x 106 pro ml) und über Nacht kultiviert. Am nächsten Tag wurden die Zellen zur weiteren Verwendung geerntet.
2. Gefrorene reife (Tag 7) DC wurden wie unter 1 beschrieben aufgetaut, nach einer Ruheperiode von zwei Stunden bei 37°C und 5 % CO2 auf Teflonschalen wurden die Zellen geerntet (Zentrifugation 10 min bei 150 g und 22°C) zur weiteren Verwendung.
3. Gefrorene reife (Tag 7) DC wurden wie unter 1 beschrieben aufgetaut und nach einer Ruheperiode von zwei Stunden bei 37°C und 5 % CO2 auf Gewebekulturschalen (Falcon Bacton Dickinson Labware, New Jersey, USA) wurden die Zellen geerntet (Zentrifugation für 10 min bei 150 g und 22°C) zur weiteren Verwendung.
4. Gefrorene reife (Tag 7) DC wurden in einem 56°C Wasserbad aufgetaut, dann in 10 ml eiskalte "Hank's Balanced Salt Solution" (Bio Whitaker) gegeben und sofort für 12 min bei 133 g und 4°C zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen zur weiteren Verwendung geerntet. c Ermittlung der DC Überlebensrate
Die Überlebensrate eingefrorener und wiederaufgetauter DC wurde durch Kultivierung in Komplettmedium ohne Zusatz von GM-CSF und IL-4 über wenigstens 4 Tage untersucht (= "Washout Test") und mit der Überlebensrate von DC vergli- chen, die frisch hergestellt worden waren aus nicht eingefrorenen oder gefrorenen Aliquots von PBMC wie beschrieben (Thurner et al. (1999) J. Immunol. Methods 223, 1). Die jeweiligen Mengen an lebenden DC wurden durch einen Zellzähler (Cassy Cell Counter and Analyser System, Model TT, Schärfe System, Reutlingen, Deutschland; dieses System benutzt "Pulse area analysis" und er- laubt die Bestimmung von Zellzahlen, Zellgröße und Volumen sowie ob lebende Zellen vorliegen) und als Kontrolle ebenfalls durch Standard-Trypanblaufärbung bestimmt.
Zunächst wurde der Einfluß der DC-Konzentration untersucht, wobei Einfrieren bei 10 x 106 reifen DC/ml die besten Ergebnisse lieferte. Das Ergebnis ist in Figur 1 dargestellt.
Weiterhin wurde der Einfluß der DMSO-Konzentration (5 bis 12,5 % v/v Endkonzentration) untersucht. Eine Veränderung der DMSO-Konzentration hatte keinen signifikanten Effekt auf die Überlebensrate aufgetauter DC.
Weiterhin wurde untersucht, ob HSA oder reines autologes Serum bessere Überlebensraten ergibt, sowie ob ein Zusatz von Glukose (Endkonzentrationen v/v von 1, 2, 3, 5, 10 und 15 %) die Überlebensrate verbessern. Das Ergebnis ist in Figur 2 dargestellt. Die Überlebensrate von DC nach mehreren Tagen wurde reproduzierbar erhöht, wenn HSA durch autologes Serum ersetzt wurde. Zusatz von Glukose in einer Endkonzentration von 5 % (v/v) verbesserte weiterhin die Ergebnisse.
Es wurden auch verschiedene kommerziell erhältliche Einfriermedien wie Erythro- cyde Freezing Solution™ oder Cell Processing Solution (Fresenius) untersucht. Diese lieferten jedoch schlechtere Ergebnisse als die bereits getesteten Einfriermedien. Es wurden ebenfalls die verschiedenen unter b) genannten Auftaubedingungen überprüft, um den Streß, dem die Zellen nach dem Auftauen ausgesetzt sind, zu minimieren. Keine der vier getesteten Methoden zeigte eine klare Überlegenheit gegenüber den anderen.
Reife (Tag 7) DC wurden hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben und unter folgenden Bedingungen eingefroren:
Abkühlung 1°C pro min in reinem autologem Serum + 10 % DMSO + 5 % Glukose bei einer Zelldichte von 10 x 106/ml. Nach einer mindestens dreistündigen Aufbewahrung in der Gasphase von flüssigem Stickstoff wurden die Zellen aufgetaut. Nach dem Auftauen wurde der Prozentsatz an lebenden DC direkt bestimmt (= D7). Aliquots der DC wurden ausgesäht und die Überlebensraten nach bis zu 4 Tagen in Kultur im Medium ohne Cytokine ("Washout Test") bestimmt wie in Beispiel lc) dargestellt (n = 20). Das Ergebnis ist in nachstehender Tabelle dargestellt.
Ausbeute an gefrorenen/aufgetauten DC nach Auftauen (Tag 7) und in "Washout
Tests" (Tage 8 bis 11)
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Beispiel 3
Optimal gereifte und eingefrorene DC sind frisch hergestellten DC gleichwertig im Hinblick auf Überlebensrate und T-Zell-stimulatorische Aktivität.
a) Zunächst wurde untersucht, ob die Überlebensrate eingefrorener und wieder aufgetauter DC vergleichbar ist mit der Überlebensrate frisch herge- stellter DC aus demselben Spender. Dazu wurde der "Washout Test" benutzt, wie er in Beispiel 2c) beschrieben ist. Das Ergebnis ist in Figur 3 dargestellt. Es wurde gefunden, dass kein Unterschied besteht zwischen aufgetauten DC und frisch hergestellten DC aus demselben Spender.
Es wurde ebenfalls die Morphologie und der Phänotyp aufgetauter DC mit frisch hergestellten DC verglichen. Die Morphologie der Zellen wurde unter einem Invert-Phasenmikroskop (Leika DM IRB, Leika Mikroskopie und Systeme GmbH, Wetzlar, Deutschland) untersucht und photographisch festgehalten. Der Phänotyp der Zellpopulationen wurde untersucht durch eine Reihe monoklonaler Antikörper und auf einem FACScan-Gerät untersucht (Becton Dickinson, New Jersey, USA) wie beschrieben (Thurner et al. (1999) J. Immunol. Methods 223, 1). Tote Zellen wurden aufgrund ihrer Lichtstreuungseigenschaften aussortiert. Das Ergebnis ist in den Figuren 4 und 5 dargestellt. Gefrorene und wiederaufgetaute DC behalten ihre charakteristischen morphologischen Eigenschaften und ihren Phänotyp über mehrere Tage hinweg.
b) Sodann wurde untersucht, ob wiederaufgetaute DC auch ihre funktionalen Eigenschaften beibehalten.
1. Dazu wurde untersucht, ob wiederaufgetaute DC genauso effektiv wie frisch hergestellte, nicht eingefrorene reife DC primäre allogene MLRs induzieren können. Dieser Test wurde durchgeführt wie beschrieben (Thurner et al. (1999), J. Immunol. Methods 223, 1). DC wurden in abge- stuften Dosen zu 2 x 105 allogenen T-Zellen pro Well in 96 Well-Platten mit flachem Boden gegeben und 4 bis 5 Tage in RPMI 1640 (supplementiert mit Gentamicin, Glutamin und 5 % allogenem hitzeinaktiviertem humanem Serum (Pool Serum)) co-kultiviert, und die Proliferation wurde durch Zugabe von 3H-Thymidin (4 μCi Endkonzentration/ml) für die letzten 12 bis 16 Stunden der Co-Inkubation bestimmt. Das Ergebnis ist in Figur 6 dargestellt. Eingefrorene und wiederaufgetaute DC induzieren primäre allogene MLRs genausogut wie frisch hergestellte reife DC.
2. Es wurde auch untersucht, wie gut eingefrorene und wiederaufgetaute DC zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzieren können. Dazu wurde die Induktion von IMP (Influenza Matrix Peptide)-spezifi- schen CTL durch IMP-gepulste reife DC gemessen. Dieser Ansatz ist spezifisch für reife DC, wenn er in Abwesenheit von T-Zellhilfe und exogenem IL-2 durchgeführt wird. Die Induktion von Influenza Matrix A2.1-Peptid
(IMP) oder Melan-A A2.1-Peptid-spezifischen CD8+ T-Zellen wurde durchgeführt durch Stimulation gereinigter CD8+ T-Zellen (isoliert aus PBMC durch magnetische Zellsortierung/MACS mit CD8-Mikrokügelchen nach den Angaben des Herstellers, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) oder in anderen Experimenten von nichtadhärenten PBMC-Fraktionen mit
DC (hergestellt aus autologem PBMC von HLA-A2.1+-Spendern), die entweder ungepulst oder gepulst waren mit HLA-A2.1-beschränktem IMP (GILGFVFTL [SEQ ID NO: l], 10 μM für 1 Stunde bei 37°C bei 1 x 106 DC/ml Komplettmedium) oder Melan-A-analog Peptid (ELAGIGILTV [SEQ ID NO:2], 10 μM) bei einem DC/T- Verhältnis von 1 : 10 oder 1:30 für
7 Tage ohne Zugabe von Cytokinen. CTL wurden durch einen Standard- Lyse-Assay quantifiziert (Bhardwaj et al. (1994) J. Clin. Invest. 94, 797) oder durch Tetra merfärbung bei 37°C (Whelan et al. (1999) J. Immunol. 163, 4342). Zielzellen für den Standard-4 Stunden-51Cr-Release Assay, der bei verschiedenen Effektor/Zielzellverhältnissen durchgeführt wurde, waren IMP-gepulste (10 μg/ml für 1 Stunde bei 37°C) T2A1-Zellen, nichtge- pulste T2A1-Zellen und K562-Zielzellen (alle 51Cr-markiert). Alle Versuche wurden mit einem 80-fachen Überschuß an K562-Zellen durchgeführt, um die natürliche Killerzellaktivität zu blockieren. Die spezifische Lyse in % wurde berechnet durch die Formel (spezifische Freisetzung - spontane
Freisetzung)/(maximale Freisetzung - spontane Frei-setzung) x 100. Lösliche IMP- und Melan-A/HLA A2.1-Tetramere wurden hergestellt, und die Bindung an T-Zellen wurde analysiert durch Durchflußzytometrie bei 37°C wie beschrieben (Whelan et al., 1999). 1 μl Tetramer (0,5 bis 1 mg/ml) wurde zu 2 x 106 Zellen in etwa 60 μl (zurückbleibendes Volumen im Gefäß nach Zentrifugation und Abgießen des Überstands) Medium, bestehend aus RPMI 1640, mit Gentamicin, Glutamin und 5 % allogenem hitzeinaktivierten humanem Serum (Pool Serum) supplementiert, für 15 min bei 37°C gegeben. Anschließend wurden die Zellen ohne Waschen abgekühlt und für 15 min mit einem dreifach gefärbten monoklonalen Antikörper gegen humanes CD8 (Caltag Laboratories, Burlingame, Kalifornien) auf Eis inkubiert. Nach drei Waschschritten
wurden die Zellen auf einem FACScan-Gerät analysiert (Becton Dickinson).
Das Ergebnis ist in den Figuren 7 und 8 dargestellt.
Einfrieren und Auftauen von DC ändert nicht die Fähigkeit reifer DC eine starke IMP-spezifische CLT-Antwort zu induzieren. Einfrieren und Auftauen ändert ebenfalls nicht die Fähigkeit reifer DC, starke IMP-spezifische CD8+- T-Zellantworten zu induzieren, wie durch die HLA-A2.1/Peptid Tetrameranalyse gezeigt.
Diese Versuche zeigen, dass nach Einfrieren und Auftauen lebende DC erhalten wurden, die vollkommen gleichwertig zu frisch hergestellten DC sind.
Beispiel 4
Um eine erhöhte Überlebensrate der eingefrorenen und wieder aufgetauten DC zu erreichen, wurden die folgenden verschiedenen anti-apoptotischen Stimuli in verschiedenen Konzentrationen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten zu den DC gegeben:
1. Rekombinantes murines oder menschliches trimeres TRANCE (Wong et al.
(1997) J. Exp. Med. 186, 2075) zu 100, 200, 500 ng/ml; 2. RANKL (Anderson et al. (1997) Nature 390, 175) zu 10 ng/ml, 50 ng/ml,
100 ng/ml und 1 μg/ml;
3. Trimeres, lösliches CD40L (Morris et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 418) zu
50, 100 und 500 ng/ml.
Die DC wurden den verschiedenen anti-apoptotischen Stimuli bei 37°C über Nacht für die letzten 12-16 h der Kultur vor dem Einfrieren, für 4 h vor dem Einfrieren (Zelldichte lxlO6 in Komplettmedium mit GM-CSF und IL-4) und ebenfalls für 4 h nach dem Auftauen (Zelldichte lxlO6 in Komplettmedium mit GM-CSF und IL-4) ausgesetzt. Eine kurzzeitige Exposition aufgetauter DC mit den anti-apoptotischen Stimuli war genauso wirksam wie die DC-Behandlung vor dem Einfrieren und ergab eine erhöhte Überlebensrate, die allerdings oft erst nach 3 Tagen im "Washout test" sichtbar wurde. CD40L (Figur 9) und TRANCE/RANKL (Ergebnisse nicht gezeigt) ergaben ähnliche Resultate. Die Ergebnisse zeigen, dass Zugabe von CD40L oder TRANCE/RANKL die Überlebensrate von DC über Tag 3 hinaus verbessert.
Beispiel 5 Um zu untersuchen, ob DC vor dem Einfrieren erfolgreich mit Antigen beladen werden können, wurden DC mit Tetanus Toxoid (TT) (als Beispiel für ein Protein- Antigen) oder mit IMP (als Modellpeptid) beladen. Zum Pulsen mit TT wurden DC aus frischen oder eingefrorenen Aliquots von PBMC aus Leukaphereseprodukten hergestellt (s. o.). TT wurde den unreifen Zellen an Tag 5 zu 10 μg/ml zugesetzt. Reife DC wurden an Tag 7 geerntet und entweder uneingefroren oder nach Einfrieren und Auftauen (nach 4 h) auf ihre Fähigkeit hin untersucht, TT-spezifische proliferative Antworten in PBMC zu induzieren. Dazu wurden abgestufte Dosen an ungepulsten und TT-gepulsten DC zu PBMC (10xl04/well) gegeben und an Tag 5 mit 3H Thymidin gepulst wie beschrieben (Thurner et al. (1999) J. Immunol. Methods 223, 1). Zur Beladung mit IMP wurden DC . mit 10 μM Peptid (für 1 h, 37°C, lxlO6 DC/ml Komplettmedium) gepulst entweder vor dem Einfrieren oder nach dem Auftauen. Die Fähigkeit, IMP erfolgreich zu präsentieren, wurde getestet wie obenstehend beschrieben.
Eingefrorene, TT-gepulste DC waren genauso stimulatorisch wie frisch hergestellte, TT-gepulste DC (Figur 10). Sowohl vor dem Einfrieren als auch nach dem Auftauen IMP- bzw. Melan A-beladene DC stimulierten gleich gut IMP- bzw. Melan A-spezifische CTL (Figuren 8 und 11). Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, eingefrorene Aliquots reifer DC herzustellen, die bereits mit Antigen beladen sind und nach dem Auftauen unmittelbar verwendet werden können.
Beispiel 6
Es wurde bei Stadium IV Melanom-Patienten eine Vakzination mit Peptid- und Protein-beladenen DC, welche nach den hier dargestellten Verfahren hergestellt und mit Antigen beladen wurden, durchgeführt. Figur 12 zeigt die Induktion einer Helferzell Typ 1 Antwort gegen KLH in allen vakzinierten Patienten. Die Patienten erhielten jeweils nur eine einzige subkutane Gabe von 4 Mio. reifen DC, welche aus Leukopheresaten unter Verwendung von GM-CSF und Interleukin-4 und der Reifungszusammensetzung wie in der Anmeldung geschildert, hergestellt wurden (z. B. Figur 1 und 3). Es wurde hierbei das Kontrollantigen KLH in einer Konzentration von 10 μg/ml gleichzeitig mit der Reifungszusammensetzung zugegeben und die DC dann portioniert eingefroren. Vor der Vakzination und 14 Tage nach der einmaligen Verabreichung von 4 Mio. DC wurde Blut entnommen und mittels Standard-Elispot-Assay (Zugabe von 10 μg/ml KLH zu 500.000 PBMC und Messung der Anzahl der Interferon-γ oder IL-4 produzierenden Zellen; der Hintergrund ohne Zugabe von KLH ist nahezu 0). Es zeigt sich, dass vor der Vakzination weder Interferon-γ noch Interleukin-4 nach KLH-Präsentation produziert wird, wogegen 14 Tage nach der einmaligen Impfung mit den KLH beladenen DC in allen Patienten Interferon-γ, aber nicht oder nur minimal Interleukin-4 produzierende T-Zellen induziert wurden (in Kontrollexperimenten wurde durch Entfernen der CD4-Zellen aus den PBMC gezeigt, dass es sich bei den reaktiven Zellen um CD4-positive Helfer-T-Zellen handelt).
Beispiel 7
Ein Patient aus der Studie von Beispiel 6 erhielt mehrere Vakzinationen mit DC, wobei jeweils 4 Mio. wieder aufgetaute DC mit den in Figur 13, 14 bzw. 15 angeführten Peptiden beladen (d. h. pro 4 Mio. DC jeweils nur 1 Peptid) und subkutan injiziert wurden. Jeweils vor der ersten Impfung und 14 Tage nach der je- weils vorangehenden Impfung und unmittelbar vor der nächsten Impfung wurde Blut entnommen und ein Standard-Elispot-Assay durchgeführt wie in Thurner et al. (1999), J. Exp. Med. 190, 1669-1678 unter Material und Methoden beschrieben. Die für die Vakzination verwendeten DC wurden wie in der Legende zu Figur 8 und 11/in Beispiel 5 geschildert hergestellt und erst nach dem Auftauen mit den entsprechenden Peptiden beladen. Wie aus den Figuren 13 bis 15 ersehen werden kann, wird gegenüber mehreren Klasse-I- (Figuren 13 und 14) und Klasse-II-Peptiden (Figur 15) Immunität induziert. Die Charakteristika der verwendeten Peptide sind Tabelle I zu entnehmen. Anzumerken ist, dass der HLA- Typ des speziellen Patienten HLA-A 2.1+ und HLA-A3+ ist sowie HLA-DR 13+, HLA-DP4+ (aber DR4-). Figur 13 zeigt die Induktion von Immunität gegen die Influenzapeptide NP-A3 und IMP-A2 nach einer einzigen Impfung (Nr. 2 bedeutet Blutentnahme und Elispot-Messung kurz vor Verabreichung der Vakzination Nr. 2) und zeigt einen Anstieg nach einer weiteren Impfung, aber keine Änderung bei EBV-A2 und IV-9-A2 Peptiden, welche zur Impfung nicht verwendet wurden. Figur 14 zeigt eine Induktion der Immunität gegen 4 Klasse-I-restringierte Tumor- peptide, deutlich und zweifelsfrei gegen das Peptid Melan A-A2.1. Figur 15 zeigt eine Induktion von Immunität gegen zwei Klasse II-restringierte Tumorpeptide (Mage 3-DR13 und -DP4), nicht aber gegen Tyrosinase-DR4 und GP 100 DR4 (dies stellt eine Negativkontrolle dar, da der Patient DR4 negativ war und die DC somit nicht mit diesen Peptiden beladen werden konnten).
Beispiel δ
Kryokonservierung von Dendritischen Zellen nach der Antigenbeladung mit Tu- morzellpräparationen (Tumor-Zell-Lysate, Nekrotische oder apoptotische Tumorzellen)
Dendritische Zellen (DC) können in großer Menge aus Leukapheresen generiert werden. Es wurde eine Methode zur Kryokonservierung reifer DC entwickelt, die erlaubt die portionierte Verwendung dieser Zellen zur Vakzination erlaubt. Bisher wurden die reifen DC vor der Anwendung mit Peptiden beladen, die den immuno- dominanten Sequenzen von Tumor assoziierten Antigenen (TAA) entsprechen. In den hier beschriebenen Versuchen (siehe Figur 16) wurden überprüft, ob unreife DC, die mit verschiedenen Tumorzellpräparationen beladen und anschließend gereift wurden, ebenfalls kryokonserviert werden können.
Tumorzellpräparation: Zur Herstellung der Tumorzellpräparationen wurde die Mel526 Melanomzellinie verwendet. Mel526 Zellen wurden in RPMI gewaschen und durch repetetive Erhitzung auf 57°C und anschließende Kühlung im Flüssigstickstoff behandelt. Anschließend wurde das Zellmaterial mit Hilfe eines Ultra- schallgerätes zertrümmert. Da durch die Erwärmung/Einfrierzyklen Nekrose induziert wird, wird diese Art der Tumorzellpräparation, die sämtliche Zellbestandteile enthält, im Folgenden nekrotisches Zellmaterial genannt. Um Lysat zu gewinnen haben wir an diese Schritte eine Ultrazentrifugation angeschlossen um Zellbestandteile zu entfernen und eine Aufreinigung der Proteine im Centricon-Zentrifu- gationstube durchgeführt. Wir haben nach den Ergebnissen der Bradford Analyse die Proteinfraktion mit der höheren Aktivität, nämlich die > 10 KDa. verwendet. Apoptotische Tumorzellen wurden mit einem Breitspektrum UVB Bestrahlungsgerät induziert und mit einem Annexin V Test verifiziert. Generierung der DC: DC wurden entsprechend der in der Experimentellen Immuntherapie verwendeten Technik aus Leukapheresen generiert. PBMC wurden in Nunc Cell Factories ausgeplated und mit RPMI (1 % autologes, hitzeinaktiviertes Plasma) substituiert mit 1000 IU/ml GM-CSF und 500 IU/ml IL-4 kultiviert. Am Tag 5 wurden die dann unreifen DC verwendet und für 4 Stunden mit den geschilderten Tumorzellpräparationen beladen in einer Konzentration von 1 : 1. Beladung: Die Beladung erfogte in einem 5 ml Polypropylene Reaktionsgefäß bei 37°C und 5 % CO2. Nach der Beladung wurden die DC in 12 ml Tissue culture plates ausgeplated und mit einem Maturationscocktail bestehend aus TNF-α, IL- lß, IL-6 und PGE2 für 24 h kultiviert. Einfrieren/Auftauen : jeweils die Hälfte der jeweils beladenen DC wurde entsprechend der beschriebenen Methode (Feuerstein B. et al., J. Immunol. Methods 245: 15-29 (2000)) in 1,8 ml Nunc freeze vials bei -80 °C für 3 Stunden kryokonserviert. Danach wurden die Zellen wiederum entsprechend der beschriebenen Methode aufgetaut und für eine Stunde im RPMI Medium bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Anschließend wurde diese Fraktion der DC wie die nicht eingefrorene Fraktion analysiert und für weitere Versuche verwendet. Der beschriebene Versuchsaufbau ist als Flussdiagramm in Figur 16 dargestellt. Zellzahl und Viabilität: Die Gesamtzellzahl und die Viabilität der DC nach der Durchführung der geschilderten Beladung und der Kryokonservierung wurde mit Trypan Blau im Mikroskop bestimmt. Anfänglich werden 5 x 105 DC verwendet. Wir fanden vergleichbare Zellzahlen und keinen Unterschied in der Viabilität der beladenen und kryokonservierten DC im Vergleich zu den nicht kryokonservierten Zellen (Figur 17A, 18A). Eine Abnahme der Zellzahl durch die Beladung, nicht aber durch die Kryokonservierung, insbesondere mit nekrotische Zellen war zu beobachten.
Funktionalität: Zur Testung der funktioneilen Kapazität wurde ein Mixed-Leuko- cyte-Reaction-Test (MLR) durchgeführt. Die beladenen DC wurden in einem allogenen MLR eingesetzt (4 Tage Inkubation mit allogenen Leukozyten) und dann mit radioaktivem Thymidin (3H-Thymidin) für 13 Stunden gepulst. Es ergaben sich vergleichbare allostimulatorische Potenzen für kryokonservierte und nicht kryokonservierte beladene DC (Figur 17B, 18B).
Phänotyp: Zur Beurteilung der Expression der für die Antigenpräsentation und den Funktionszustand der DC relevanten Oberflächenmoleküle wurde eine FACS- Analyse mit den entsprechenden Antikörpern durchgeführt. Es wurden eine vergleichbares Oberflächenexpressionsmuster sowohl für die verschiedenen Beladungsmethoden als auch nach der Kryokonservierung gefunden (Figur 17C). Direkter Antigennachweis: Zum direkten Nachweis von tumoralem Antigen wurde ein Antikörper eingesetzt, der MAGE-1 im HLA-Al Kontext d. h. den Komplex aus Mage-1 Peptid und dem HLA-Al Molekül erkennt. Die verschieden beladenen DC wurden mit diesem Antikörper gefärbt und im FACS analysiert. Dabei zeigte sich bei Verwendung von peptidbeladenen (20μg MAGE-1 Peptid für 3 Stunden/ml) DC, dass nach der Kryokonservierung ein vergleichbarer Prozentsatz von MAGE- 1/A1 Antigen nachweisbar war wie ohne Kryokonservierung (Figur 18C). Aus die- sem Versuch lässt sich schließen, dass die Kryokonservierung nicht zu einem An- tigenverlust führt.
In einem weiteren Versuch wurden der MAGE-1/Al Antikörper angewendet, um die Effektivität der verschiedenen Beladungsmethoden zu bestimmen. Mit den Tumorzellpräparationen (die verwendete Melanomzell-Linie exprimiert das Mage- 1 Antigen) konnte eine signifikante Beladung erreicht werden, die etwa 20 % der Antigendichte des Peptidpulsens erreichte (Figur 18D). Dabei war die Expression des MAGE-1/HLA-Al Komplexes vor und nach Kryokonservierung in vergleichbarer Quantität nachweisbar (errechnet als Positivität gegen den Hintergrund un- beladener DC).
Schlussfolgerung: Es konnte also gezeigt werden, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht nur eine effektive Kryokonservierung unbeladener, mit Peptid oder Protein beladenener DC erlaubt (wie in Beispiel 1-7 gezeigt), sondern auch eine ebenso effektive von DC, welche mit (Tumor-) Zellpräparationen (simplen nekrotischen Tumorzellen, aus Tumorzellen hergestellten Lysaten oder apoptotischen Tumorzellen) beladen wurden. Effektiv bedeutet, dass durch das Einfrieren i) der Zellverlust nach dem Auftauen < 25 % im Vergleich zu nicht eingefrorenen DC beträgt, ii) die aufgetauten DC eine vergleichbare T Zell-Stimula- torische Kapazität aufweisen wie die nicht eingefrorenen DC (getestet in der allo- genen MLR) und iii) die Oberflächen-Expression von Antigenen bzw. Liganden für
T Zeil-Rezeptoren (d. h. spezifische MHC-Peptidkomplexe) nach dem Einfrier- und Auftauvorgang erhalte bleibt (modellhaft gezeigt durch direkten Nachweis eines bestimmten Peptid/MHC-Komplexes, nämlich des MAGE-1/HLA-Al-Komple- xes, mittels eines diesen Komplex spezifisch erkennenden monoklonalen Antikörpers).
Beispiel 9
Kryokonservierung von Dendritischen Zellen nach der Antigenbeladung mittels adenoviraler Transfektion
Mit Adenoviren transfizierte Dendritischen Zellen können mittels dem erfindungsgemäßen Verfahren so eingefroren werden, dass die Eigenschaften der Dendritischen Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Dendritischen Zellen vergleich- bar sind. Hierzu wurden reife DC bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 500 für 2 Stunden mit einem Adenovirusvektor (AD5) infiziert, der eine für das "Green Fluorescent Protein" (GFP) kodierende cDNA enthält . Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen bei einer Konzentration von 10 x 106 DC/ml im HSA und 10 % DMSO in 5 % Glukose (Endkonzentration) eingefroren und für 4 Stun- den aufbewahrt. Nach Auftauen wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch Try- panblau-Exklusion bestimmt. Die Wiedergewinnungsrate von lebensfähigen Zellen ist in Figur 20 als Prozentsatz der eingefrorenen DC angegeben.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die allostimulatorische Aktivität von Ade- novirus-infizierten DC durch Kryokonservierung nicht verändert wird. Hierzu wurden reife DC mit Adeno-GFP bei einem MOI von 500 infiziert und kryokonserviert, wie vorstehend beschrieben. Nach Wiederauftauen und einer Kuiturperiode von 24 oder 72 Stunden wurden die dendritischen Zellen mit allogenischen CD4+-T- Zellen (2 x 105 pro Napf) unter den in Fig. 21 angegebenen Verhältnissen co-kul- tiviert. Nach 4 Tagen wurden die Zellen mit [3H]-Tymidin für 16 Stunden gepulst und der Einbau der Radioaktivität wurde bestimmt. In Fig. 21 sind die Durchschnittswerte von drei Zählungen mit der entsprechenden Standardabweichungen angegeben. Die Werte von T-Zellen allein oder DC allein waren immer weniger als 1000 pro min. Weiterhin wurden reife DC mit Adeno-GFP bei einem MOI von 500, wie vorstehend beschrieben, kryo konserviert. Nach Wiederauftauen und der angegebenen Kulturzeit wurden die Zellen unter Verwendung von für CD83, CD25, CD86, CD80 spezifischen Antikörpern, gefolgt von PE-konjugiertem Ziegen/Maus-IG-(Fab')2- Fragmenten gegengefärbt. Die Ergebnisse sind in Fig. 22A gezeigt. Bei einem vergleichbaren Versuch unter Verwendung von für HLA Klasse 1, HLA-DR und CD40 spezifischen Antikörpern, wurden die in Fig. 22B gezeigten Ergebnisse erhalten.
Beispiel 10
Kryokonservierung von Dendritischen Zellen nach der Antigenbeladung mittels RNA-Transfektion. Mit RNA transfizierte Dendritischen Zellen können mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens so eingefroren werden, dass die Eigenschaften der Dendritischen Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Dendritischen Zellen vergleichbar sind. Die DC können in unreifem Stadium mit RNA transfiziert - dann gereift - und als reife DC dann eingefroren werden (nicht gezeigt). Bevorzugt werden bereits reife DC mit RNA transfiziert und kryokonserviert. Die Ergebnisse sind in Figuren 25 bis 27 zusammengefasst.
Hierzu wurden reife dendritische Zellen zweimal mit RPMI gewaschen und einmal in einer Waschlösung des Optimix-Kits (EQUIBIO, Maidstone Kent, UK). DC wurden auf eine Endkonzentration von 40 x 106 DC/ml in Optimix-Medium gebracht. Es wurden dann 0,1 ml der Zellsuspension mit 40 μg /n-wr/O-transkribierter EGFP-RNA in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vermischt. Nach Inkubierung bei Raumtemperatur für maximal 3 min wurde die Zellsuspension in eine 0,4 cm Spalt-Elektroporationsküvette transferiert und bei einer Spannung von 260 V und einer Kapazität von 150 μF mit dem Gene-Pulser II (Biorad, München, Deutschland) gepulst. Kontroll-DC wurden ohne die Zugabe von RNA gepulst. Die Zellen wurden bei einer Konzentration von 10 x 106 DC/ml in HSA (mit 10 % DMSO und 5 % Glukose (Endkonzentration)) eingefroren und 4 Stunden gelagert. Nach Auftauen wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Exklusion bestimmt. Die Wiedergewinnung von lebensfähigen Zellen ist in Figur 25 als Prozentsatz der eingefrorenen DCs angegeben. Reife DC wurden mit EGFP-RNA elektroporiert und kryokonserviert, wie vorstehend beschrieben. Nach Wiederauftauen und einer Kulturperiode von 48 Stunden wurden die dendritischen Zellen mit allogenen CD4+-T-Zellen (2 x 105/Napf) bei den in Fig. 26 angegebenen Verhältnissen co-kultiviert. Nach 4 Tagen wurden die Zellen mit [3H]-Thymidin für 16 Stunden gepulst und der Einbau der Radioaktivität wurde bestimmt. In Fig. 26 sind die Mittelwerte bei dreifachen Messung (mit Standardabweichung) gezeigt. Die Zahlen von T-Zellen allein oder DC alleine waren weniger als 1000 pro min.
Kryokonservierung von RNA-elektroporierten DC ändert nicht den phenotypi- schen DC-Marker. Hierzu wurden reife DC elektroporiert, mit oder ohne EGFP- RNA und kryokonserviert, wie vorstehend beschrieben. Nach Wiederauftauen und einer Kultivierungsperiode von 48 Stunden wurden die DC gegengefärbt mit den in Fig. 27 angegebenen Maus-monoklonalen Antikörpern und PE-konjugierten Antimaus-Ig-(Fab')2-Fragmenten gefolgt durch FACS-Analyse. Die Zahlen in Figur 27 betreffen im rechten unteren Teil des Quadrats die EGFP-positiven DC, im oberen rechten Teil die EGFP/DC-Marker-doppelpositiven DC.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung gebrauchsfertiger, kryokonservierter, reifer dendritischer Zellen, umfassend a) Bereitstellen von unreifen dendritische Zellen (DC) ; b) Kultivieren der unreifen DC in einem Kulturmedium, das einen Reifungscocktail mit einem oder mehreren Reifungsstimuli enthält, unter Erhalt von reifen DC; c) Einfrieren der reifen DC in einem Einfriermedium, das kein heterologes Se- rum enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DC vor dem Einfrieren oder nach Wiederauftauen der eingefrorenen DC mit einem Antigen oder einem Anti- gen-Antikörperkomplex beladen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei
(i) die unreifen DC aus CD14-positiven, mononuklearen Zellen (Monozyten) oder aus CD34-positiven Zellen hergestellt werden; und/oder (ii) die unreifen DC direkt aus dem Blut isoliert werden; und/oder (iii) die unreifen DC oder deren Vorläuferzellen aus Leukapheresaten gewonnen werden; und/oder
(iv) die unreifen DC oder deren Vorläuferzellen aus Frischblut oder Knochenmark gewonnen werden.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Reifungsstimuli ausgewählt sind aus IL-1 wie IL-lß, IL-6, TNF-α, Prostglandine wie PGE2, IFN-α, Lipopolysacchariden und andere bakterielle Zellprodukte wie z. B. MPL (Monophosphoryllipid A) und Lipoteichonsäure, Phosphorylcholin, Calci- umionophore, Phorbolester wie PMA, Heat-Schock-Proteine, Nukleotide wie ATP, Lipopeptide, künstliche Liganden für Toll-ähnliche Rezeptoren, doppelsträngige RNA wie z. B. Poly-I:C, immunstimulatorische DNA-Sequenzen, CD40-Ligand usw. enthält, insbesondere das Kulturmedium oder der Reifungscocktail IL-lß, IL-6, PGE2 und TNFα enthält oder der Reifungscocktail Monocyten-konditionier- tes Medium (MCM) oder MCM mit zusätzlichem PGE2 ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die unreifen DC in Gegenwart von 0,1 bis 100 ng/ml IL-lß, 0,1 bis 100 ng/ml IL-6, 0,1 bis 10 μg/ml PGE2 und 0,1 bis 100 ng/ml TNF-α kultiviert werden.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirkstoffe IL-lß, IL-6, PGE2 und TNFα, die den DC zur Ausreifung zugesetzt werden, aus gereinigten Zubereitungen der einzelnen Wirkstoffe stammen.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, wobei
(i) die Reifung für wenigstens 1 Stunde, vorzugsweise wenigstens 6 Stunden, erfolgt und/oder
(ii) während der Reifung der Reifungscocktail des Kulturmediums ausgetauscht wird und/oder zusätzliche Reifungsstimuli dem Kulturmedium zugegeben werden; und/oder
(iii) dem Kulturmedium Immun-/Reifungsmodulatoren, insbesondere ausgewählt aus IL-10, Fumarsäure und Ester davon, Mycophenolatmofetil und Vitamin D3, zugegeben werden.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Einfriermedium
(i) 5 bis 25 % (v/v) eines oder mehrerer Gefrierschutzmittel, die insbesondere aus gewählt sind aus DMSO, Glycerin, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol, Albumin, Cholinchlorid, Aminosäuren, Methanol, Acetamid, Glycerinmonoacetat und anorganische Salze und das besonders bevorzugt DMSO enthält und/oder
(ii) 2 bis 30 % (w/v) einer oder mehrerer Polyolverbindungen, die insbesondere ausgewählt sind aus Glukose Dextran, Sucrose, Ethylenglykol, Erythrit, D-Ribit, D-Mannit, D-Sorbit, Inosit und D-Laktose und besonders bevorzugt Glukose ist; und/oder (iii) 2 - 90 % (w/v) einer nicht heterologen Serumkomponente, insbesondere autologes Serum oder Plasma oder allogenes Serum oder Plasma, und besonders bevorzugt humanes Serumalbumin, autologes Serum, allogenes humanes Serum oder Poolserum enthält.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in einer Konzentration von 5 x 106 bis 100 x 106 Zellen/ml eingefroren werden.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 9, wobei die DC vor dem Einfrieren mit Antigen oder Antigen-Antikörperkomplexen beladen werden.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 10, wobei das Antigen, mit dem die DC beladen werden, ein Protein oder ein Fragment davon mit wenigstens 8 Aminosäuren ist und insbesondere das Protein oder Fragment in einer Konzentration von 0,01 bis 1000 μM zum Kulturmedium gegeben wird, vorzugsweise während IL-lß, IL-6, PGE2 und TNFα im Kulturmedium enthalten sind.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei die DC mit einem DNA- oder RNA-Molekül beladen werden, das für das Antigen kodiert.
13. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 10, wobei in dem Antigen-Antikörperkomplex als Antigen ein Proteinfragment, Zellen oder
Zellbruchstücke oder Nukleinsäuresequenzen dienen und der Antikörper aus der Klasse IgG oder IgE ist.
14. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, wobei die DC vor dem Einfrieren oder nach dem Auftauen mit einem Molekül in Kontakt gebracht werden, das die Apoptose hemmen kann, wobei das Molekül, das die Apoptose hemmen kann, vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CD40-ügand, TRANCE und RANKL
15. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14, wobei nach Einfrieren und Auftauen der DC mehr als 75 %, bevorzugt mehr als 85 % überlebende DC erhält, bezogen auf die Anzahl eingefrorener DC.
16. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs aus reifen kryokonservierten PC geeignet ist.
17. Verfahren zum Auffinden vorteilhafter Bedingungen zum Einfrieren von DC, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen unreifer DC; b) Kultivieren verschiedener Ansätze der unreifen DC in Gegenwart verschiedener Reifungsstimuli; c) anschließendes Kultivieren der DC in Medium mit oder ohne Cytokine, wobei ein Kultivieren ohne Cytokine bevorzugt ist; d) Bestimmen des Anteils lebender Zellen nach wenigstens 1 Tag Kultur in dem Medium mit oder ohne Cytokine; und e) Ermitteln des Reifungsstimulus, der die höchste Überlebensrate ergeben hat.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei nach wenigstens 2 Tagen, bevorzugt nach wenigstens 3 Tagen Kultur in dem Medium mit oder ohne Cytokine der Anteil lebender Zellen bestimmt wird.
19. Gefrorene, reife, mit Antigen beladene dendritische Zellen.
20. Zellen gemäß Anspruch 19, die nach einem Verfahren gemäß dem Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 16 erhältlich sind.
21. Impfstoff, umfassend dendritische Zellen nach Anspruch 19 oder 20.
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