WO2002016528A1 - Particules magnetiques et procede de fabrication correspondant - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a magnetic fine particle and a method for producing the same, a method for separating or concentrating microorganisms, a method for purifying, detecting, or concentrating a nucleic acid, a separating agent, a method for separating a biological substance, and a method for converting a substance.
- LCST lower critical solution temperature
- the stimulus-responsive magnetic fine particles are finely dispersed in water because their particle diameters are as small as about 100 to 200 nm.
- L C ST critical solution temperature
- the stimulus-responsive magnetic fine particles precipitate and aggregate. Since this aggregate can be easily recovered by magnetic force, attempts have been made to separate various biomolecules and microorganisms using the stimulus-responsive magnetic fine particles in which antibodies and antigens are immobilized on the stimulus-responsive magnetic fine particles. It has been done.
- the target substance and the stimuli-responsive magnetic particles and the stimulus-responsive magnetic fine particles used c needs to be a temperature above LCST of a solution containing LCST, Further, depending on the thermal stability of the target substance, the target substance such as a biomolecule may be damaged or deactivated.
- the present inventors have conducted intensive studies in view of the above-mentioned problems of the related art. As a result, when magnetic particles immobilized with a polymer having an upper critical solution temperature are used for separating biomolecules, the separation can be performed without damaging or inactivating the target biomolecules. They found that they could be recovered, and completed this invention based on this finding.
- the present invention has the following configuration.
- Magnetic fine particles on which a polymer having an upper critical solution temperature is immobilized (1) Magnetic fine particles on which a polymer having an upper critical solution temperature is immobilized.
- R 11 represents a hydrogen atom or a methyl group
- R 12 represents a single bond or a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms.
- the polymer having an upper critical solution temperature is a polymer obtained by polymerizing a monomer represented by the above general formula (1) and a monomer represented by the following general formula (2). 2.
- the polymer having an upper critical solution temperature is a polymer obtained by polymerizing a monomer represented by the general formula (1) and a monomer having biotin as a part of its structure. 2.
- a pair of substances having mutual specific effects are composed of biotin and avidin, an antigen and an antibody, a polynucleotide having a complementary nucleotide sequence to a polynucleotide, cDNA and mMA, an enzyme (active site) and a substrate, an enzyme ( (Active site) and product, enzyme (active site) and competition inhibitor, enzyme (coenzyme binding site) and coenzyme, enzyme (coenzyme binding site) and triazine dye, protease and protease inhibitor, Fc site And at least one selected from the combination of protein A, Fc site and protein G, lectin and sugar, hormone receptor and hormone, DNA and DNA binding protein, heparin and fibronectin, and heparin and laminin.
- Item 7 The magnetic fine particles according to Item.
- a method for detecting a nucleic acid comprising amplifying a nucleic acid obtained by the method for purifying or concentrating a nucleic acid according to the item 25.
- a method for separating a biological substance comprising using the separating agent according to the above (28).
- a method for producing magnetic fine particles having an upper critical solution temperature comprising polymerizing a polymer having an upper critical solution temperature in the presence of magnetic fine particles.
- (31) A method for producing magnetic fine particles having an upper critical solution temperature, comprising polymerizing a monomer represented by the above general formula (1) in the presence of magnetic fine particles.
- a magnetic fine particle having an upper critical solution temperature characterized in that in the presence of magnetic fine particles, a monomer represented by the above general formula (1) is polymerized with a monomer having piotin as a part of its structure. Production method.
- the monomer at least one selected from a hydrophilic monomer and a hydrophobic monomer is used, and the upper limit critical solution temperature described in any one of the above paragraphs 30 to 33 is provided.
- a method for producing magnetic fine particles is provided.
- a polymer having an upper critical temperature (hereinafter referred to as “UCST”) essential for the present invention (hereinafter referred to as “UCST polymer”) is a polymer-containing solvent in which the temperature of the polymer-containing solvent is When the temperature exceeds a specific temperature, the polymer is dissolved in a solvent, and when the temperature is lower than the specific temperature, the polymer precipitates and aggregates in the solvent. .
- UCST is the specific temperature.
- the phenomenon that the polymer dissolves and precipitates after UCST is called UCST characteristic.
- the above-mentioned solvent is not particularly limited, and specific examples thereof include water and a liquid containing 50% by weight or more of water. Furthermore, specific examples of the liquid containing 50% by weight or more of water include physiological saline and buffer.
- the solvent may be a mixture of an organic solvent such as acetone and water, as long as the solvent contains the polymer and exhibits UCST characteristics.
- the UCST polymer used in the present invention can be any polymer as long as it is a polymer having exactly UCST.
- homopolymers of acryloyl glycine amide, copolymers of acryloyl glycine amide and polymerizable biotin monomer, copolymers of acryloyl glycine amide and N-formyl acrylamide, and acrylyl amide examples include a copolymer of N-formylacrylamide and a copolymer of acrylamide and N-acetylacrylamide.
- a monomer represented by the following general formula (1) (hereinafter referred to as “monomer (1)”): a polymer obtained by polymerization, and a monomer (1) represented by the following general formula (2)
- a polymer obtained by polymerizing the resulting monomer (hereinafter referred to as “monomer (2)”) is particularly preferably used in the present invention.
- R 11 represents a hydrogen atom or a methyl group, and in the present invention, R 11 is preferably a hydrogen atom.
- R 12 represents a single bond or a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms, and in the present invention, R 12 is preferably a methylene group.
- R 13 represents a hydrogen atom or a methyl group, and in the present invention, R 13 is preferably a hydrogen atom.
- R 14 is a hydrogen atom, a linear, branched or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an alkoxyl group, an alkylamino group, or an aryl group. Or a heterocyclic group.
- the alkyl group is preferably a linear alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
- the alkyl group portion of the alkoxyl group and the alkylamino group is preferably a linear alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
- the aryl group include a phenyl group and a naphthyl group
- examples of the complex group include pyrimidine.
- UCST polymer In the polymerization of UCST polymer, if one or more selected from hydrophilic monomer and hydrophobic monomer are used in addition to monomer (1) and monomer (2), the type and usage ratio must be changed. Can control UCST.
- the classification of whether the monomer used is hydrophilic or hydrophobic is based on the hydrophilicity of the monomer (1) used for polymerization. That is, those that are more hydrophilic than the monomer (1) used for polymerization are hydrophilic monomers, and those that are hydrophobic are hydrophobic monomers. When a plurality of monomers (1) are used for polymerization, classification may be performed based on the most hydrophilic monomer among them.
- (meth) acrylamide as the hydrophilic monomer used in the present invention.
- (Meth) acrylic acid, aryl alcohol, and arylamine examples of the hydrophobic monomer include unsaturated hydrocarbons such as alkyl (methyl) acrylate, styrene, ethylene, propylene, and acetylene.
- examples thereof include alkyl vinyl ether and alkyl (meth) acrylamide.
- the UCST tends to decrease, and when a hydrophobic monomer is used, the UCST tends to increase.
- the material of the magnetic fine particles used in the present invention may be an organic substance or an inorganic substance as long as the substance exhibits magnetism at room temperature.
- specific examples of the substance exhibiting magnetism include nickel oxide particles, ferrite particles, magnetite particles, cobalt iron oxide, norium fluoride, and carbon dioxide. Examples include steel, tungsten steel, KS steel, fine particles of rare earth cobalt magnets, and hematite particles.
- the particle size of the magnetic fine particles is not particularly limited in the present invention, even if the magnetic force is applied to the solvent in which the magnetic fine particles are dispersed, as long as the magnetic fine particles do not adsorb the magnetic fine particles. Although not a thing, 1 ⁇ ! The range is preferably from 1 to 1 zm, more preferably from 1 nm to 10 Onm.
- Magnetite is formed into double micelles using sodium oleate and sodium dodecyl benzene sulfonate, and by dispersing the micelles in an aqueous solution, magnetic magnetite fine particles having a particle size of several tens of nm can be obtained. it can.
- This method is a method described in Biocatalysis 1991, Vol. 5, pp. 61-69.
- the magnetic fine particles of the present invention are those in which UCST polymer is immobilized and are fine particles. Therefore, the magnetic fine particles themselves have UCST.
- the UCST of the magnetic fine particles and the U CST polymer in the present invention refers to, specifically, magnetic fine particles or UCST polymer-containing water obtained by adding the magnetic fine particles or the UCST polymer to water at a ratio of 1% by weight to water. Then, the temperature of the water containing the magnetic fine particles or UCST polymer is lowered at a rate of 1 ° C per minute, and the visible light transmittance of the water containing the magnetic fine particles or UCST polymer becomes clear. It is the temperature at the time when the value reached 1/2 of the state.
- the visible light transmittance of the water containing the magnetic fine particles or UCST polymer becomes 1/2 of that in the clarified state, and the value of 1/2 is maintained in a certain temperature range even when the temperature is raised or lowered.
- the upper limit of this temperature range is called UCST at the time of temperature rise, and the lower limit is called UCST at the time of temperature fall.
- the difference (temperature range) between the two is called the switching range.
- the temperature is preferably in the range of 0 to 50 ° C, and particularly preferably. It is in the range of 0 to 40 ° C.
- the U CST polymer may be immobilized on the magnetic fine particles by any action. Physical adsorption or chemical bonding such as hydrogen bonding or covalent bonding may be used.
- Specific examples of the immobilization method include a method of polymerizing a CST polymer in the presence of magnetic fine particles, a method of contacting a UCST polymer with magnetic fine particles in a solvent, and a method in which the magnetic fine particles have a functional group such as an SH group. Examples of such a method include binding a coupling agent and graft-polymerizing the UCST polymer based on the functional group.
- the magnetic fine particles of the present invention obtained by a method of polymerizing a UCST polymer in the presence of magnetic fine particles are immobilized even when repetition of dissolution, precipitation, and aggregation in a liquid containing the same is performed.
- the UCST polymer obtained is preferred because it is difficult to detach from the magnetic fine particles.
- a method of polymerizing the monomer (1) alone or the monomer (1) and the monomer (2) in the presence of the magnetic fine particles can be preferably used according to the present invention.
- a method of polymerizing at least one selected from the group consisting of a monomer and a hydrophobic monomer, the monomer (1), and the monomer (2) can be particularly preferably used in the present invention.
- each monomer is added to a solution in which magnetic fine particles are suspended, and a polymerization initiator (for example, ammonium persulfate and potassium persulfate) and a polymerization accelerator (for example, ⁇ # -Tetramethylethylenediamine) and stirred for several hours to prepare magnetic particles with polymer physically adsorbed ⁇
- a polymerization initiator for example, ammonium persulfate and potassium persulfate
- a polymerization accelerator for example, ⁇ # -Tetramethylethylenediamine
- the UCST of the magnetic fine particles of the present invention is preferably at the same temperature as the UCST specific to the UCST polymer immobilized on the magnetic fine particles. Also, the magnetic fine particles of the present invention It is preferable that the immobilized UCST polymer is firmly held even when the dissolution, precipitation and aggregation are repeated in the solution.
- the magnetic fine particles of the present invention having UCST and aggregating in a liquid are extremely effective for separating, recovering, and concentrating a target substance in a solution because the aggregates can be easily recovered by magnetic force. Can be used.
- a pair of substances having a mutually specific action is a substance that specifically adsorbs to each other by an interaction such as an interaction between ions, a hydrogen bond, a hydrophobic interaction, and a coordination to a metal atom.
- biotin and avidin, antigens and antibodies polynucleotides with complementary nucleotide sequences to polynucleotides, cDNA and mRNA, enzymes (active sites) and substrates, enzymes (active sites) and products, enzymes (active Site) and competition inhibitor, enzyme (coenzyme binding site) and coenzyme, enzyme (coenzyme binding site) and triazine dye, protease and protease inhibitor, Fc site and protein A, Fc site and protein G, Lectins and sugars, hormone receptors and hormones, DNA and DNA binding proteins, heparin and fibronectin, heparin and laminin, polythymine and mRN A, E. coli antibodies and E. coli,
- biotin and avidin can be most preferably used in the present invention.
- biotin was immobilized on UCST polymer, it was possible to selectively separate and recover only the target substance on which avidin was immobilized.
- avidin was immobilized on UCST polymer, biotin was immobilized. Only the target substance can be selectively separated and recovered.
- biotin may be iminobiotin, and avidin may be streptavidin.
- avidin may be streptavidin.
- the target substance at this time is not particularly limited, but examples thereof include enzymes, antibodies, nucleic acids, molecular chaperones, and heat shock proteins.
- avidin When avidin is immobilized on UCST polymer, Since it is possible to keep a maximum of three sites out of four sites in total, it is possible to separate and collect the biotinylated target substance more efficiently. However, since it is difficult to immobilize avidin directly on UCST polymer, it is difficult to immobilize avidin on UCST polymer relatively easily by immobilizing it on biotin via biotin. preferable. That is, avidin is preferably immobilized on UCST polymer in the form of avidin-bound biotin.
- the magnetic fine particles of the present invention in which one of a pair of substances having a mutually specific action is immobilized on UCST polymer, the other substance, the substance on which the substance is immobilized, can be easily separated. It becomes possible to collect.
- a substrate for example, if magnetic microparticles in which an enzyme is immobilized on a UCST polymer are used in an enzymatic reaction, it is possible to convert a substrate at a faster rate than in an enzymatic reaction using a conventional immobilized enzyme.
- the enzyme used at this time is not particularly limited, and examples thereof include an oxidoreductase, a transferase, a hydrolase, a degradase, an isomerase, and a synthase.
- the substance produced by the conversion of the substrate is reduced by lowering the temperature of the solution containing the magnetic fine particles of the present invention and the produced substance, thereby precipitating only the magnetic fine particles and removing only the precipitated magnetic fine particles by using a magnetic force. Thereby, the enzyme and the product can be easily separated.
- the use of magnetic microparticles in which the antibody is immobilized on a UCST polymer enables efficient separation and concentration of microorganisms in a solution.
- the antibody used at that time may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
- the method for separating and concentrating the microorganisms in the solution is not particularly limited. Specifically, the magnetic fine particles are added to a solution containing the microorganism, and the microorganisms and the magnetic fine particles are sufficiently contacted. Thereafter, a method of lowering the temperature of the solution to precipitate only the magnetic fine particles to which the microorganisms are adsorbed and removing only the precipitated magnetic fine particles by using a magnetic force can be mentioned. With this method, microorganisms in the solution can be easily separated and concentrated. For example, if the antibody used is a Salmonella antibody, only the Salmonella bacteria in the food suspension can be easily separated and concentrated, so that the magnetic fine particles of the present invention having any antibody immobilized thereon can be used. By combining it with an appropriate detection reagent, it is possible to produce a highly sensitive microbial test kit or diagnostic agent.
- Magnetic microparticles with molecular chaperones and heat shock proteins immobilized on UCST polymer enhance the stability of enzymes and antibodies in solution, so they can be used repeatedly, producing protein and substance at industrial level Can be assisted.
- proteins such as molecular chaperones are expensive and difficult to use on an industrial level.
- Magnetic fine particles having a base immobilized on UCST polymer are added to a nucleic acid-containing solution, and the magnetic fine particles and nucleic acid are sufficiently contacted.
- a method of depositing only fine particles and removing only the precipitated magnetic fine particles using a magnetic force can be used. With this method, the nucleic acids in the solution can be easily separated and concentrated. Further, the method for separating and concentrating the nucleic acid can be applied to purification, concentration, detection and the like of a specific gene.
- the nucleic acid is aggregated and recovered together with the nucleic acid by lowering the temperature of the mixed solution. By raising the temperature, any nucleic acid can be easily purified, detected, and concentrated.
- the target DNA or mRNA can be concentrated and purified.
- the nucleic acid can be detected with high sensitivity by amplifying the obtained nucleic acid by various gene amplification methods.
- the method for amplifying the nucleic acid is not particularly limited, but the PCIRT-PCR method can be preferably used in the present invention.
- the method of immobilizing one of the pair of substances having a mutually specific action on the UCST polymer immobilized on the magnetic fine particles of the present invention is not particularly limited, and the pair of substances may be added to the already synthesized UCST polymer.
- a method of immobilizing one of the substances hereinafter referred to as “immobilization method”
- a monomer having one of the pair of substances as a part of a structure A method of introducing one of the pair of substances into a U CST polymer by polymerizing a monomer that forms a UCST polymer by polymerization (hereinafter referred to as “polymerization method”), and the like can be mentioned.
- the immobilization method described above is preferably a covalent bond, but may be a bond using an ion complex / charge transfer complex, or a bond using biochemical affinity.
- the reactivity of a functional group such as an amino group to a carboxyl group of the protein is determined by using the reactivity of the ucS polymer.
- the T-polymer and the protein may be linked.
- a carboxy group can be introduced into the UCST polymer, and an amide bond can be formed by the following reaction formula.
- R protein
- R ' UCST polymer
- One, a method using an aldehyde group as described below, or a protein -UCST polymer may be bound using an epoxy group.
- an amino group can be introduced into the UCST polymer and an amide bond can be formed by the following reaction formula.
- a UCST polymer By designing a UCST polymer to have an appropriate functional group, a protein such as an enzyme or antibody can be immobilized on the UCST polymer by a known protein immobilization method using carbodimid or the like.
- the binding is preferably carried out in a phosphate or Tris buffer having a pH around neutrality. Further, the salt concentration can be appropriately set according to the purpose.
- the polymerization method can be preferably used in the present invention since the polymerization ratio in the polymer is relatively easy to control.
- a method for immobilizing one of a pair of substances having a mutually specific action on a UCST polymer immobilized on magnetic fine particles of the present invention comprising using a monomer having biotin as a part of its structure. This will be described in detail taking legality as an example.
- Monomers that form the UCST polymer by polymerization include N-acryloylglycinamide, N-formylacrylamide, N-acetylacrylamide, acrylamide, and polymerizable biotin derivatives.
- Examples of the monomer that is a part of the structure include (meth) acrylamide and (meth) acrylate derivatives using the terminal carboxyl group of biotin, but the present invention is not limited to these. Absent.
- Examples of the monomer which forms the UCST polymer which can be preferably used in the polymerization method include the above-mentioned monomer (1).
- the polymerizable biotin derivative represented by 3) can be mentioned.
- R 2 represents a hydrogen atom or an alkyl group.
- R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group or an aryl group.
- W represents a single bond, a carbonyl group, a thiocarbonyl group or an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms.
- U represents a single bond or a single NH— group.
- X represents a single bond, a hydrocarbon bond having 1 to 8 carbon atoms, an oxygen atom or an —NH— group.
- Y represents a single bond or a carbonyl group, a thiocarbonyl group, a mono-NH group, a 1,2-dioxyethylene group or a 1,2-diaminoethylene group.
- Z represents a single bond or a carbonyl group, a thiocarbonyl group, an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms, an oxygen atom or a mono-NH— group.
- V represents a single bond or an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms.
- acryloylglycine amide represented by the following general formula (4) can be specifically mentioned as the monomer (1).
- R 1 represents a single bond or an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms
- R 5 represents an alkylene group having 2 or 3 carbon atoms
- X 1 represents an oxygen atom or a sulfur atom
- X 2 to X 5 each independently represent an oxygen atom or an —NH— group.
- T, RR 3 and H 4 are the same as defined in the above general formula (3).
- the polymerizable biotin derivative represented by the above general formula (5) is generally obtained by appropriately removing the side chain carboxyhydroxyl group of the biotin or the biotin derivative represented by the following general formula (8). After conversion into a group, the compound can be obtained by a condensation reaction with an acrylic derivative represented by the following general formula (9). -' ⁇
- the polymerizable biotin derivative represented by the above general formula (6) generally comprises a biotin derivative represented by the following general formula (10), and a suitable acrylate agent (including a methacrylate agent.
- a suitable acrylate agent including a methacrylate agent.
- Acrylic agents such as acrylic acid chloride, acrylic acid anhydride, acryloxys succinimide, etc .
- Methacrylic acid agents such as methacrylic acid, methacrylic acid chloride, methacrylic anhydride, methacryloxysuccinimide, etc. Can be obtained.
- the polymerizable biotin derivative represented by the general formula (7) is generally obtained by converting a biotin derivative represented by the following general formula (11) into tetrahydrofuran (THF), dimethyl sulfoxide (DMS 0), ether, dimethylformamide (DMF ), Dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, acetone, aliphatic hydrocarbons, benzene, toluene, etc. in an aprotic solvent such as isocyanate represented by the general formula (12). Can be.
- a polymerizable biotin derivative represented by the following general formula (13) can be particularly preferably used in the polymerization method.
- a biotinmethamide clearamide derivative represented by the general formula (14) and a biotin derivative represented by the general formula (15) can be mentioned.
- the magnetic fine particles of the present invention are produced by a method of polymerizing a UCST polymer in the presence of the magnetic fine particles, impurities such as unreacted monomers and salts coexist in the reaction solution.
- the removal of the contaminants may be performed by dialysis or by reducing the temperature of the solution.
- the concentration may be set to UCST or less, and the aggregation may be performed by collecting the aggregate with a magnet and removing the supernatant.
- the immobilization of one of a pair of substances having a mutually specific action on the UCST polymer may be performed by directly immobilizing one of the pair of substances having a mutually specific action on the UCST polymer as described above.
- the immobilization operation is simple, it is preferable that the immobilization is carried out on UCST polymer via a bond between biotin and avidin.
- the enzyme on which avidin has been immobilized may be immobilized on the biotin-immobilized U CST polymer by utilizing the specific adsorption action between avidin and biotin.
- the avidin-linked biotin can immobilize up to three biotinylated enzymes Thus, substrate conversion, separation, and recovery can be performed with higher efficiency.
- this is not limited to enzymes, and a similar effect can be obtained with the above-mentioned pair of substances having mutually specific actions.
- the separating agent of the present invention is not particularly limited as long as it contains the magnetic fine particles of the present invention, but the content ratio of the magnetic fine particles to the separating agent is in the range of 1 to 100% by weight. And particularly preferably in the range of 2 to 30% by weight.
- Other components include ferrite particles, magnetite particles, and hematite particles.
- the separating agent of the present invention By using the separating agent of the present invention, microorganisms, nucleic acids, proteins, peptides, antigens, environmental hormones and the like can be easily separated.
- Magnetic fine particles were prepared by the following method.
- the UCST magnetic fine particles obtained in Example 2, 50/1, 1.0% avidin solution 50/1, 1.0M sodium phosphate buffer (pH 7.0) 100/1, distilled water 800 z 1 were put in a test tube. After mixing, the mixture was placed in ice water to lower the temperature of the solution to UCST or lower.
- the UCST magnetic fine particle aggregates were collected with a neody magnet (0.43T), 100 ⁇ 1 of the supernatant was removed, denatured by SDS, and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). It was confirmed that there was no band corresponding to avidin from Kiyoshi.
- Example 4 Specific separation of avidin from egg white
- UCST magnetic microparticles obtained in Example 2, 50/1, 1.0% avidin solution 50/1, 1.0M sodium phosphate buffer (pH 7.0) 100/1, distilled water 450/1, 2.5% egg white solution 400 After mixing well in the test, the sample was placed in ice water and the temperature of the solution was lowered to UCST or lower. The aggregate was collected by a neodymium magnet, 100/1 of the supernatant was removed, and after denaturation treatment with SDS, SDS-PAGE confirmed that only the band corresponding to avidin was removed from the supernatant.
- Example 5 [Immobilization of avidinase on UCS T magnetic fine particles]
- UCST magnetic fine particle solution 100/1 of the UCST magnetic fine particle solution obtained in Example 2, a commercially available avidinated peroxidase solution (lmg / ml) 1000 zK 1.0M sodium phosphate buffer (pH 7.0) 100-1 and distilled water 700 1 Add and mix well.
- the obtained solution was cooled, the aggregated UCST magnetic fine particles were collected with a magnet, the supernatant 1900 ⁇ 1 was removed, and 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) 19001 was newly added.
- a UCST magnetic fine particle solution on which avidinated peroxidase was immobilized was prepared. This solution dissolved above UCST and aggregated below UCST.
- the temperature of this solution was changed in a thermostat, and the operations of dissolution, aggregation, and recovery with a magnet were performed.
- the activity of peroxidase in the supernatant was measured by the following method for measuring the activity of peroxidase. After the collection of the UCST magnetic fine particles with the magnet, the supernatant 1900/1 was removed each time, and 1900 zl of 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) was newly added.
- a commercially available biotinylated Salmonella antibody was immobilized on the avidinated UCST magnetic fine particles prepared in Example 6 and having a free biotin binding site other than the polymer binding site.
- the immobilization of biotinylated Salmonella antibodies in this manner was confirmed by SDS-PAGE. The confirmation was performed using.
- 1 ml of this biotinylated Salmonella antibody-immobilized UCST magnetic microparticle solution was added to 20 ml of a bacterial suspension prepared so that the concentration of Salmonella was 1 cell / ml, and the mixture was stirred well.
- UCST magnetic microparticles were prepared according to Example 2, except that 252 mg of methyl acryl amide was used instead of N-pyotinyl- ⁇ '-methacryltrimethylene amide.
- the U CST of the obtained magnetic fine particles was 2 ° C.
- UCST magnetic microparticles were prepared according to Example 2, except that 25 lmg of N-acetylacrylamide was used instead of N-pyotinyl-N, -methacryltrimethyleneamide. UCST of the obtained magnetic fine particles was 6 ° C. Example 12
- UCST magnetic fine particles were prepared according to Example 2, except that 132 mg of N-formyl acrylamide was used instead of N-pyotinyl-N, -methacryltrimethylene amide.
- the UCST of the obtained magnetic fine particles was 16 ° C.
- UCST magnetic microparticles were prepared according to Example 2, except that 22 lmg of formyl acrylamide was used instead of N-piotinyl- ⁇ '-methylchlortrimethyleneamide. UCST of the obtained magnetic fine particles was 30 ° C. Example 14
- UCST magnetic fine particles were prepared according to Example 2, except that 237 mg of acrylamide was used in place of N-pyotinyl-N, -methacryltrimethylene amide. UCST of the obtained magnetic fine particles was 10 ° C. Example 15
- Example 16 UCST magnetic fine particles according to Example 2, except that 188 mg of N-acetylacrylamide was used instead of N-pyotinyl-N, -methacryltrimethyleneamide. Offspring were prepared. The UCST of the obtained magnetic fine particles was 12 ° C. Example 16
- Example 2 Example 1 was repeated except that 1.18 g of acrylamide and 275 mg of N-formylacrylamide were used in place of N-acryloylglycine amide and N-biotinyl-N, -methacryloyltrimethylene amide.
- UCST magnetic fine particles were prepared according to the procedure described in the above. UCST of the obtained magnetic fine particles was 14 ° C.
- the magnetic fine particles of the present invention on which a polymer having an upper critical solution temperature is immobilized, are used for separating biological molecules, the target substance is separated and recovered without damaging or inactivating the biological molecules. It is possible.
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Description
明 細 書 磁性微粒子、 およびその製造方法 <技術分野 >
本発明は、磁性微粒子およびその製造方法、微生物の分離方法または濃縮方法、 核酸の精製方法、 検出方法、 または濃縮方法、 分離剤、 生体物質の分離方法、 お よび物質の変換方法に関する。
<背景技術 >
アプライ ドマイク口バイオロジーアンドバイオテクノロジ一（Appl. Microbiol. Biotechnol. ) 1994年、 41卷、 99〜105頁、 および、 ジャーナルォプフアーメン テーシヨ ンアン ドバイオテク ノ ロジ一 ( Journal of fermentation and Bioengineering) 1997年、 84卷、 337〜341頁には、 下限臨界溶液温度（以下「L C S T」 と記述する。） を有するポリイソプロピルアクリルアミ ドを、 粒径が 100 〜200nm程度の磁性微粒子に固定化した刺激応答性磁性微粒子が開示されている。 該刺激応答性磁性微粒子は、その粒子径が 100〜200nm程度と微小であることか ら水によく分散する。 該刺激応答性磁性微粒子の水溶液を加熱して、 その温度を L C S T以上とした場合には、 該刺激応答性磁性微粒子が析出、 凝集する。 この 凝集物は磁力で容易に回収可能であることから、 該刺激応答性磁性微粒子に抗体 や抗原を固定化した刺激応答性磁性微粒子を用い、 種々の生体分子や微生物の分 離を行う試みがなされている。
しかしながら、 前述の方法で生体分子等の分離を行う場合、 その目的物質と該 刺激応答性磁性微粒子とを含有する溶液の温度を L C S T以上にする必要がある c 用いる刺激応答性磁性微粒子の L C S T、 さらには目的物質の熱安定性によって は、 目的物質である生体分子等を損傷もしくは失活させてしまう場合があった。
<発明の開示 >
本発明者らは、 前述の従来技術の課題に鑑み鋭意研究を重ねた。 その結果、 上 限臨界溶液温度を有するポリマーを固定化した磁性微粒子を、 生体分子等の分離 に用いた場合には、 その目的物質である生体分子等を損傷もしくは失活させるこ となく分離、 回収することが可能であることを見出し、 この知見に基づいて本発 明を完成させた。
本発明は以下の構成を有する。
( 1 ) 上限臨界溶液温度を有するポリマーが固定化された磁性微粒子。
( 2 )上限臨界溶液温度を有するポリマーが、下記一般式（1)で表されるモノマ 一を重合させて得られたポリマーである前記第 1項記載の磁性微粒子。
(式中、 R11は水素原子又はメチル基を示し、 R12は単結合または炭素数 1〜5の 直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示す。）
( 3 )上限臨界溶液温度を有するポリマーが、 上記一般式（1)で表されるモノマ 一と、 下記一般式 （2 ) で表されるモノマーとを重合させて得られたポリマーで ある前記第 1項記載の磁性微粒子。
(式中、 R13は水素原子又はメチル基を示し、 R14は水素原子、 炭素数 1〜 1 0 の直鎖状、 分岐状もしくは環状のアルキル基、 アルコキシル基、 アルキルアミノ 基、 ァリール基、 又は複素環基を示す。）
(4)上限臨界溶液温度を有するポリマーが、 上記一般式（1)で表されるモノマ —と、 ビォチンをその構造の一部とするモノマーとを重合させて得られたポリマ 一である前記第 1項記載の磁性微粒子。
(5) 上限臨界溶液温度を有するポリマーが、 さらに親水性モノマーおよび疎水 性モノマーから選ばれた 1種以上を用いて重合して得られたポリマ一である前記 第 2項〜第 4項の何れか 1項記載の磁性微粒子。
(6)相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が、 上限臨界溶液温度を有す るポリマーに固定化された前記第 1項記載の磁性微粒子。
(7) 相互に特異的作用を有する一対の物質が、 ピオチンとアビジン、 抗原と抗 体、 ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、 cDNAと mMA、 酵素 （活性部位） と基質、 酵素 （活性部位） と生産物、 酵素 （活性部位） と競争 阻害剤、 酵素 （補酵素結合部位） と補酵素、 酵素 （補酵素結合部位） とトリアジ ン色素、 プロテアーゼとプロテアーゼインヒビ夕一、 Fc部位とプロテイン A、 Fc 部位とプロテイン G、 レクチンと糖、 ホルモンレセプターとホルモン、 DNAと DNA 結合タンパク質、 へパリンとフイブロネクチン、 およびへパリンとラミニンとの 組合せから選ばれた 1種以上である前記第 6項記載の磁性微粒子。
(8)相互に特異的作用を有する一対の物質が、 ピオチンとアビジンである前記 第 6項記載の磁性微粒子。
( 9 )上限臨界溶液温度を有するポリマーに固定化された該一対の物質の一方が、 ビォチンである前記第 6項記載の磁性微粒子。
(10) ピオチンがアビジンと結合したピオチン（以下「アビジン結合ピオチン」 と記載する。） である前記第 9項記載の磁性微粒子。
(11) アビジン化酵素をピオチンに結合させた前記第 9項記載の磁性微粒子。
(12) ビォチン化酵素をアビジン結合ピオチンに結合させた前記第 10項記載 の磁性微粒子。
(13) 前記第 11項または第 12項記載の磁性微粒子を用いることを特徴とす る物質の変換方法。
(14) アビジン化抗体をピオチンに結合させた前記第 9項記載の磁性微粒子。
(15) ピオチン化抗体をアビジン結合ビォチンに結合させた前記第 10項記載 の磁性微粒子。
(16)前記第 14項または第 15項記載の磁性微粒子を用いることを特徴とす る微生物の分離方法または濃縮方法。
(17) アビジン化分子シャペロンをピオチンに結合させた前記第 9項記載の磁 性微粒子。
(18) ビォチン化分子シャペロンをアビジン結合ピオチンに結合させた前記第 10項記載の磁性微粒子。
(19) 前記第 17項または第 18項記載の磁性微粒子を用いることを特徴とす る変性蛋白質の改質方法。
(20) アビジン化ヒートショックプロテインをビォチンに結合させた前記第 9 項記載の磁性微粒子。
( 21 ) ビォチン化ヒートショックプロテインをァビジン結合ピオチンに結合さ せた前記第 10項記載の磁性微粒子。
(22) 前記第 20項または第 21項記載の磁性微粒子を用いることを特徴とす る変性蛋白の改質方法。
(23) アビジン化核酸をピオチンに結合させた前記第 9項記載の磁性微粒子。 (24) ビォチン化核酸をアビジン結合ピオチンに結合させた前記第 10項記載 の磁性微粒子。
(25) 前記第 23項または第 24項記載の磁性微粒子を用いることを特徴とす る核酸の精製、 検出、 または濃縮方法。
(26)前記第 25項記載の核酸の精製、 または濃縮方法により得られた核酸を 増幅することを特徴とする核酸の検出方法。
(27)増幅方法が PCR法または RT- PCR法である前記第 26項記載の核酸の検出 方法。
(28)前記第1項〜第10項の何れか 1項記載の磁性微粒子を含有する分離剤。 (29)前記第 28項記載の分離剤を用いることを特徴とする生体物質の分離方
(30)磁性微粒子の存在下、 上限臨界溶液温度を有するポリマーを重合するこ とを特徴とする上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
(31)磁性微粒子の存在下、 上記一般式（1)で表されるモノマーを重合させる ことを特徴とする上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
(32)磁性微粒子の存在下、上記一般式（1)で表されるモノマーと、一般式（ 2 ) で表されるモノマーとを重合させることを特徴とする上限臨界溶液温度を有する 磁性微粒子の製造方法。
(33)磁性微粒子の存在下、 上記一般式 （1)で表されるモノマーと、 ピオチン をその構造の一部とするモノマーとを重合させることを特徴とする上限臨界溶液 温度を有する磁性微粒子の製造方法。
(34) さらにモノマーとして、 親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ば れた 1種以上を用いることを特徴とする前記第 30項〜第 33項の何れか 1項記 載の上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
<発明を実施するための最良の形態 >
以下、 本発明について更に詳しく説明する。
本発明に必須の上限臨界温度（以下「UCST」 と記述する。） を有するポリマ 一（以下「UCSTポリマ一」 と記述する。） とは、 ポリマ一含有溶媒において、 該ポリマー含有溶媒の温度が特定温度を越えた場合には、 該ポリマーが溶媒に溶 解した状態となり、 該特定温度以下となった場合には、 該ポリマーが溶媒中に析 出、 凝集する性質を有するポリマーのことである。 UCSTとは該特定温度のこ とである。 また、 UCSTを境にポリマーの溶解、 析出が起こる現象を UCST 特性と言う。
前述の溶媒は特に限定されるものではないが、 具体的には水、 および水を 50 重量％以上含有する液体を挙げることができる。 さらに水を 50重量％以上含有 する液として具体的には、 生理食塩水、緩衝液などを挙げることができる。 また、 ポリマーを含有した状態で UCST特性を示すのであれば、 該溶媒は、 アセトン などの有機溶媒と水との混合液であっても良い。
本発明において使用する U C S Tポリマーは、 まさに U C S Tを有するポリマ —であれば何れのポリマーであっても使用することができる。 該 U C S Tポリマ
—として具体的には、 ァクリロイルグリシンアミ ドのホモポリマ一、 ァクリロイ ルグリシンアミ ドと重合性ピオチンモノマーの共重合ポリマ一、 ァクリロイルグ リシンアミ ドと Nホルミルァクリルアミ ドの共重合ポリマー、 ァクリルアミ ドと Nホルミルアクリルアミ ドの共重合ポリマー、 およびアクリルアミ ドと Nァセチ ルァクリルアミ ドの共重合ポリマ一などを挙げることができる。
その中でも下記一般式 （1) で表されるモノマー （以下 「モノマー （ 1 )」 と記 述する。） 重合させて得られたポリマー、 さらに、 モノマ一 （ 1 ) と一般式 （2 ) で表されるモノマー （以下 「モノマー （2 )」 と記述する。） とを重合させて得ら れたポリマーは特に好ましく本発明に使用することができる。
NHc
UC S Tポリマ一の重合において、 モノマー （1) とモノマー （2) の他に、 親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた 1種以上を用いた場合には、 その種類および使用割合を変えることによって U C S Tを制御することが可能で ある。
使用するモノマーが親水性であるのか、 もしくは疎水性であるのかの分類は、 重合に用いるモノマー （1) の親水性を基準として行う。 つまり、 重合に用いる モノマ一 （1) よりも親水性であるものは親水性モノマーであり、 疎水性である ものは疎水性モノマーである。 また、 重合に用いるモノマー （1) が複数である 場合には、 その中で最も親水性であるモノマーを基準に分類を行えばよい。
重合に用いるモノマー （1) の種類により異なり、 一概に特定することはでき ないが、 具体的にその例を挙げれば、 本発明において使用する親水性モノマーと しては、 （メタ） アクリルアミ ド、 （メタ） アクリル酸、 ァリルアルコール、 およ びァリルアミンなどを挙げることができ、疎水性モノマーとしては、アルキル（メ 夕) ァクリレート、 スチレン、 エチレン、 プロピレン、 アセチレン等の不飽和炭 化水素、 アルキルビニルエーテル、 およびアルキル （メタ） アクリルアミ ドなど を挙げることができる。
UC S Tポリマーの重合に親水性モノマーを用いた場合、 UC S Tは低下する 傾向にあり、 反対に疎水性モノマーを用いた場合、 UCSTは上昇する傾向にあ る。
本発明 UC S Tポリマ一重合の際の、 各モノマーの組成は特に限定されるもの ではないが、 モル比で通常、 モノマー （1)：モノマ一 （2)：その他のモノマ一 =95〜20 ： 1〜60 ： 0〜40の割合であり、 好ましくは 95〜 50 ： 1〜 50 ： 0〜20の割合である。
本発明に使用する磁性微粒子の素材は、 常温で磁性を示す物質であれば有機物 質であっても無機物質であっても良い。 本発明においては以下のものに特定され るものではないが、 磁性を示す物質として具体的には、 酸化二ヅケル粒子、 フエ ライ ト粒子、 マグネタイ ト粒子、 コバルト鉄酸化物、 ノ リウムフヱライ ト、 炭素 鋼、 タングステン鋼、 KS鋼、 希土類コバルト磁石の微粒子、 およびへマタイ ト粒 子などを挙げることができる。
該磁性微粒子の粒子径は、 該磁性微粒子を分散させた溶媒に磁力をかけた場合 であっても、その磁力によって該磁性微粒子が吸着されないサイズであればよく、 本発明においては特に限定されるものではないが、 1 ηπ！〜 1 zmの範囲である ことが好ましく、 より好ましくは 1 nm〜l 0 Onmの範囲である。
本発明に使用する磁性微粒子の調製方法について、 マグネタイ トを用いた場合 を例にとって説明する。 ォレイン酸ナトリウムとドデシルペンゼンスルホン酸ナ トリゥムとを用いてマグネタイトを二重のミセルとし、 このミセルを水溶液中に 分散させることにより、 粒径が数十 nmである磁性マグネタイト微粒子を得るこ とができる。 この方法はバイオ力夕ライシス (Biocatalysis) 1991年、 第 5卷、 61〜69頁に記載の方法である。
本発明の磁性微粒子は、 UCSTポリマーが固定化されたものであり、 且つ微 粒であることから、 該磁性微粒子それ自体も UCSTを有する。
本発明における該磁性微粒子および U CSTポリマーの UCSTとは、 具体的 には、 該磁性微粒子または U C S Tポリマーを水に対して 1重量％の割合で水に 添加した磁性微粒子または U C S Tポリマー含有水を加熱して清澄状態とし、 次 いで該磁性微粒子または U C S Tポリマー含有水の温度を 1分あたり 1 °cの割合 で降下させて行き、 該磁性微粒子または U C S Tポリマ一含有水の可視光透過率 が、 清澄状態時の 1 / 2の値になつた時点の温度である。
該磁性微粒子または U C S Tポリマー含有水の可視光透過率が、 清澄状態時の 1/2の値になって、 さらに昇温乃至降温してもある温度範囲で 1/2の値が保 持される場合がある。 この温度範囲の上限を昇温時の UCSTと言い、 同下限を 降温時の UCSTと言う。 この両者の差 （温度範囲） をスイッチング範囲言う。
このスィツチング範囲は狭ければ狭いほど良く、本発明においては 10°C以下であ ることが好ましく、 より好ましくは o °cである。
本発明磁性微粒子の U C S Tは特に限定されるものではないが、 本発明の磁性 微粒子を分離剤として使用する場合には、 0〜5 0 °Cの範囲であることが好まし く、 特に好ましくは 0〜4 0 °Cの範囲である。
本発明において、 U C S Tポリマーの磁性微粒子への固定化は、 何れの作用に よるものであっても構わない。 物理的な吸着であっても、 水素結合や共有結合な どの化学結合によるものであっても良い。 固定化方法として具体的には、 磁性微 粒子の存在下に u C S Tポリマーを重合する方法、 溶媒中において U C S Tポリ マーと磁性微粒子とを接触させる方法、 磁性微粒子に S H基などの官能基を有す るカヅプリング剤を結合させ、 該官能基を基点として U C S Tポリマ一をグラフ ト重合させる方法などを挙げることができる。
その中でも、 磁性微粒子の存在下に U C S Tポリマーを重合する方法で得られ た本発明の磁性微粒子は、 その含有液中において溶解と析出 ·凝集との繰返しを 行つた場合であっても、 固定化された U C S Tポリマーが該磁性微粒子から脱離 しにくいことから好ましい。
さらに、 磁性微粒子の存在下、 モノマー （1) のみ、 もしくはモノマ一 （1) と モノマー（2 ) とを重合させる方法は、本発明により好ましく用いることができ、 磁性微粒子の存在下、 親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた 1種以 上、 モノマー （1)、 およびモノマー （2 ) を重合させる方法は、 本発明に特に好 ましく用いることができる。
具体的には、 各モノマ一を、 磁性微粒子をけん濁させた溶液へ添加し、 窒素置 換下、 攪袢しながら重合開始剤 （例えば過硫酸アンモニゥムゃ過硫酸カリウム） および重合促進剤 （例えば^ # -テトラメチルエチレンジァミン） を添カロし、 数時間攪拌することでポリマーが物理吸着した磁性微粒子を調製することが出来 る ο
本発明磁性微粒子の U C S Tは、 該磁性微粒子に固定化されている U C S Tポ リマー固有の U C S Tと同じ温度であることが好ましい。 また、 本発明磁性微粒
子は、 その溶解液中において溶解と析出 ·凝集との繰返しを行った場合であって も、 固定化された U C S Tポリマーがしっかり保持されているものであることが 好ましい。
U C S Tを有し、 且つ液中において凝集する本発明の磁性微粒子は、 その凝集 物が磁力によって容易に回収することができることから、 溶液中における目的物 質の分離、 回収、 および濃縮などに極めて有効に用いることができる。
相互に特異的作用を有する一対の物質とは、 イオン間の相互作用、 水素結合、 疎水的相互作用、 および金属原子に対する配位などの相互作用によって特異的に 相互に吸着する物質であり、 具体的には、 ピオチンとアビジン、 抗原と抗体、 ポ リヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、 c DNAと mRNA、 酵素 (活性部位） と基質、 酵素 （活性部位） と生産物、 酵素 （活性部位） と競争阻害 剤、 酵素 （補酵素結合部位） と補酵素、 酵素 （補酵素結合部位） とトリアジン色 素、 プロテアーゼとプロテアーゼインヒビ夕一、 Fc部位とプロテイン A、 Fc部位 とプロティン G、 レクチンと糖、 ホルモンレセプ夕一とホルモン、 DNAと DNA結合 タンパク質、 へパリンとフイブロネクチン、 へパリンとラミニン、 ポリチミンと mR N A、 大腸菌抗体と大腸菌、 および抗体 （I g G ) と抗 I g Gとの組合せを 挙げることができる。
その中でも、 ピオチンとアビジンとの組合せは本発明に最も好ましく使用する ことができる。 U C S Tポリマーにピオチンを固定化した場合には、 アビジンを 固定化した目的物質のみを選択的に分離、 回収することが可能となり、 U C S T ポリマーにアビジンを固定化した場合には、 ピオチンを固定化した目的物質のみ を選択的に分離、 回収することが可能となる。
なお、 本発明においてビォチンは、 イミノビォチンであってもよく、 アビジン はストレブトアビジンであっても良い。 何れの場合も本発明の効果を得ることが できる。
その際の目的物質は特に限定されるものではないが、 例えば酵素、抗体、核酸、 分子シャペロン、 およびヒ一トショックプロティンなどを挙げることができる。
U C S Tポリマーにアビジンが固定化された場合には、 アビジンのピオチン結
合 4サイ トのうち最大 3サイ トを閧いた状態に保つことが可能であることから、 ピオチン化された目的物質をさらに効率よく分離、 回収することが可能となる。 しかしながら、 現実的にはアビジンを直接 U C S Tポリマーに固定化すること は困難であることから、 アビジンを U C S Tポリマーに比較的容易に固定化する には、 ピオチンを介して U C S Tポリマーに固定化することが好ましい。つまり、 アビジンはアビジン結合ビォチンのかたちで U C S Tポリマーに固定化されてい ることが好ましい。
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が、 U C S Tポリマーに固定化さ れた本発明の磁性微粒子を用いれば、 そのもう一方の物質、 該物質が固定化され た物質を容易に分離、 回収することが可能となる。
例えば、 酵素を U C S Tポリマーに固定化した磁性微粒子を酵素反応に用いれ ば、 従来の固定化酵素を用いた酵素反応に比べ、 より速い速度で基質を変換する ことが可能である。 その際使用される酵素は特に限定されるものではないが、 酸 化還元酵素、 転移酵素、 加水分解酵素、 分解酵素、 異性化酵素、 および合成酵素 などを挙げることができる。
基質の変換により生成した物質は、 本発明の磁性微粒子と該生成物質とを含有 する溶液の温度を下げることにより、 該磁性微粒子のみを析出させ、 析出した該 磁性微粒子のみを磁力を用いて取り除くことにより、 酵素と該生成物質とを容易 に分離することができる。
抗体を U C S Tポリマ一に固定化した磁性微粒子を用いれば、 溶液中の微生物 の分離、 濃縮を効率よく行うことができる。 その際に使用する抗体はモノクロ一 ナル抗体であってもよく、 ポリクロ一ナル抗体であっても良い。
溶液中の微生物の分離方法、 濃縮方法は特に限定されるものではないが、 具体 的には、 微生物を含有する溶液に該磁性微粒子を添加し、 微生物と該磁性微粒子 とを充分に接触させた後、 該溶液の温度を下げることにより、 微生物を吸着した 磁性微粒子のみを析出させ、 析出した磁性微粒子のみを磁力を用いて取り除く方 法を挙げることができる。 この方法であれば、 溶液中の微生物を容易に分離、 濃 縮することが可能である。
例えば、 使用する抗体がサルモネラ抗体であれば、 食品懸濁液中のサルモネラ 菌だけを容易に分離、 濃縮することが可能であることから、 任意の抗体が固定化 された本発明の磁性微粒子と適当な検出試薬とを組み合わせることによって、 感 度の高い微生物検査キットもしくは診断薬を作ることも可能である。
分子シャペロンやヒートショックプロティンを U C S Tポリマーに固定化した 磁性微粒子は、 溶液中における、 酵素や抗体の安定性を高めることから、 その繰 り返し利用が可能となり、 工業レベルでの蛋白質生産、 物質生産を補助すること が出来る。 通常、 分子シャペロンのような蛋白質は高価なため、 工業レベルでの 使用は困難である。
塩基を U C S Tポリマーに固定化した磁性微粒子を、 核酸を含有する溶液に添 加し、 該磁性微粒子と核酸とを充分に接触させた後、 該溶液の温度を下げること により、 核酸を吸着した磁性微粒子のみを析出させ、 析出した磁性微粒子のみを 磁力を用いて取り除く方法を挙げることができる。 この方法であれば、 溶液中の 核酸を容易に分離、 濃縮することが可能である。 また、 該核酸の分離、 濃縮方法 は、 特定遺伝子の精製、 濃縮、 検出等に応用することも可能である。
また、 複数種類の核酸と該磁性微粒子とを含有する混合液中で、 ハイブリダィ ゼ一シヨンを充分に行った後、該混合液の温度を下げることにより核酸ごと凝集、 回収を行った後、 再度温度を上げることで容易に任意の核酸の精製、 検出、 濃縮 を行うことが出来る。
例えば目的とする D N Aと相補的な配列を有するビォチン化 D N Aやピオチン 化ポリチミンを用いることで、 目的 D NAや mR N Aを濃縮、 精製することが出 来る。 得られた核酸を各種遺伝子増幅法により増幅させることで、 感度良く核酸 を検出することが出来る。 核酸の増幅方法は特に限定されないが、 P C I R T - P C R法が本発明に好ましく用いることができる。
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方を、 本発明の磁性微粒子に固定化 された U C S Tポリマーに固定化する方法は特に限定されるものではなく、 既に 合成された U C S Tポリマーに該一対の物質の一方を固定化する方法 （以下 「固 定化法」 と記載する。）や、該一対の物質の一方を構造の一部とするモノマーと、
重合により UC S Tポリマーを形成するモノマ一とを重合させることにより、 U CSTポリマーに該一対の物質の一方を導入する方法 （以下 「重合法」 と記載す る。） などを挙げることができる。
前述の固定化法としては共有結合であることが好ましいが、 イオンコンプレツ クスゃ電荷移動錯体を利用した結合、 生化学的親和性等を利用した結合であって もよい。
抗体や酵素などの蛋白質を u C S Tポリマーに結合させる場合であれば、 該蛋 白質が有するアミノ基ゃカルボキシル基等の官能基の反応性を利用して、 uc S
Tポリマ一と該蛋白質とを結合させればよい。
例えば、 蛋白質のアミノ基を利用する場合は、 UC S Tポリマーにカルボキシ ル基を導入して、 下記に示すような反応式でアミ ド結合を作ることができる。 縮合剤
R-NH2 4- HOOC-R7 > R-NH-CO-R' + H20
R：蛋白質、 R ' ： UCSTポリマ一 また、下記に示すようなアルデヒド基を利用する方法、エポキシ基を利用して- UC S Tポリマーと蛋白質とを結合させても良い。
R-NH2 +· OHC-R' ~~► R-NH = CH-R'
(シッフ塩基）
通元^1 J
► R-NH-CH2-R
R-NH2 + CH2-CH-R' R-NH-CH¾-CH-RJ
\ / I
0 OH また、 該蛋白質のカルボキシル基を利用する場合であれば、 UCSTポリマー にアミノ基を導入して、 下記に示すような反応式でアミ ド結合を作ることができ る。
縮合剤
-COOH + H2N— R' R-CO-NH-R' +H20 また、 例えば、 メ夕クリル酸のカルボキシル基などを、 上記モノマーや他のモ ノマーに共重合させて、 カルボキシル基など適当な官能基を持つように UC S T ポリマーを設計することにより、 カルボジィミ ド等を用いる既知の蛋白質固定化 方法により酵素や抗体などの蛋白質を、 UC S Tポリマーに固定化することも出 来る。
UCSTポリマーに抗体を導入して蛋白質と結合させる場合、 該結合は、 pH が中性付近の燐酸、 トリスバッファーの中で行われることが好ましい。 また、 塩 濃度は目的に応じて適宜設定できる。
—方、 重合法は、 ポリマー中への重合比を比較的制御しやすいことから本発明 に好ましく用いることが出来る。
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方を、 本発明の磁性微粒子に固定化 された UC S Tポリマーに固定化する方法について、 ビォチンをその構造の一部 とするモノマ一を用いた該重合法を例にとって詳細に説明する。
重合により UC S Tポリマ一を形成するモノマーとしては、 Nァクリロイルグ リシンアミ ド、 Nホルミルアクリルアミ ド、 Nァセチルアクリルアミ ド、 ァクリ ルアミ ド、 重合性ビォチン誘導体などを挙げることが出来、 一方、 ビォチンをそ の構造の一部とするモノマ一としては、 ビォチンの末端カルボキシル基を用いた (メタ）ァクリルアミ ド、 （メタ）ァクリレート誘導体などを挙げることが出来る が、 本発明においてこれらに限定されるものではない。
該重合法において好ましく使用することができる UCSTポリマーを形成する モノマ一としては、 前述のモノマ一 （1) を挙げることができ、 ピオチンをその 構造の一部とするモノマーとしては、 下記一般式 （3) で表される重合性ビォチ ン誘導体を挙げることができる。
一般式 （3) 中、 R 2は水素原子又はアルキル基を示す。 R 3及び R 4はそれそ れ独立に水素原子、 アルキル基又はァリール基を示す。 Tは酸素原子又は =NH 基を示す。 Wは単結合又はカルボニル基、 チォカルボニル基もしくは炭素数 1〜 5のアルキレン基を示す。 Uは単結合又は一 NH—基を示す。 Xは単結合又は炭 素数 1〜 8の炭化水素結合、 酸素原子もしくは— NH—基を示す。 Yは単結合又 はカルボニル基、 チォカルボニル基、 一 NH基—、 1， 2—ジォキシエチレン基 もしくは 1, 2—ジアミノエチレン基を示す。 Zは単結合又はカルボニル基、 チ ォカルボニル基、 炭素数 1〜5のアルキレン基、 酸素原子もしくは一 NH—基を 示す。 Vは単結合又は炭素数 1〜 5のアルキレン基を示す。
さらに、 モノマー （1) として具体的に、 下記一般式 （4) で表されるァクリ ロイルグリシンアミ ドを挙げることができる。
一般式 （3) で表されるモノマーの中でも、 下記一般式 （5) 〜 （7) で表さ れる重合性ビォチン誘導体は、 該重合法に好ましく使用することができる。
—般式 （5
一般式 （ 6 )
上記一般式（5)で示される重合性ピオチン誘導体は、 一般に下記一般式（8) で示されるピオチン又はピオチン誘導体の側鎖カルボキシル水酸基を適当な脱離
基に変換後、 下記一般式 （9 ) で示されるアクリル誘導体と縮合反応させること により得ることができる。 -' ^
( 5 上記一般式 （6 ) で示される重合性ピオチン誘導体は、 一般に下記一般式 （ 1 0 ) で示されるピオチン誘導体を、 適当なアクリル化剤 （メタクリル化剤等も含 む。 例えばアクリル酸、 アクリル酸クロリ ド、 無水アクリル酸、 ァクリロキシス クシンイミ ド等のアクリル化剤、 メ夕クリル酸、 メ夕クリル酸クロリ ド、 無水メ タクリル酸、 メタクリロキシスクシンィミ ド等のメ夕クリル化剤などが挙げられ る。） と反応させることにより得ることができる。
ここで、 一般式 （10) で表されるビォチン誘導体は、 一般式 （8) で表され るピオチン又はビォチン誘導体を適当な還元剤で還元して得られるアルコール体 (X4 =酸素原子） の水酸基を、 脱離基機能を有する官能基に変換し、 変換後の 該アルコール体とアミン誘導体 （X4 =— NH— ) とを置換反応させることによ り得ることができる。
上記一般式 （7) で示される重合性ビォチン誘導体は、 一般に下記一般式 （1 1)で示されるピオチン誘導体を、 テトラヒドロフラン （THF)、 ジメチルスル ホキシド (DMS 0)、 エーテル、 ジメチルホルムアミ ド (DMF)、 ジクロロメ タン、 クロ口ホルム、 酢酸ェチル、 アセトン、 脂肪族炭化水素、 ベンゼン、 トル ェン等の非プロトン性溶媒中で、 一般式 （12) で示されるイソシァネート物質 と反応させることにより得ることができる。
(7) さらに、 下記一般式 （ 13) で表される重合性ビォチン誘導体は、 該重合法に 特に好ましく使用することができる。
UCST以下とし、凝集させ凝集物を磁石で回収後上清を取り除くことによって行つ ても良い。
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方の、 U C S Tポリマーへの固定化 は、 前述のように相互に特異的作用を有する一対の物質の一方を、 U C S Tポリ マーに直接固定化しても良いが、 固定化の作業が簡便であることから、 ピオチン とアビジンとの結合を介して U C S Tポリマーに固定化されていることが好まし い。 例えば、 アビジンが固定化された酵素を、 アビジンとピオチンとの間の特異 的吸着作用を利用して、 ピオチンが固定化された U C S Tポリマーに固定化すれ ばよい。
さらに好ましくは、 例えば、 ピオチンが固定化された酵素を、 アビジン結合ビ ォチンが固定化された U C S Tポリマーに固定化することである。 前述のように 該ァビジン結合ビォチンは、 最大 3つのビォチン化酵素を固定化することが可能
であることから、 より高い効率での基質の変換、 分離、 回収が可能となる。
当然のことながら、 これは酵素に限定されるものではなく、 前述の相互に特異的 作用を有する一対の物質であれば、 同様の効果が得られる。
本発明の分離剤は、 本発明の磁性微粒子を含有するものであれば特に限定され るものではないが、 該磁性微粒子の分離剤に対する含有割合が 1〜1 0 0重量％ の範囲であることが好ましく、 特に好ましくは 2〜3 0重量％の範囲である。 その他の成分としてはフェライ ト粒子、 マグネタイ ト粒子、 およびへマタイ ト 粒子などを挙げることができる。
本発明の分離剤を用いれば、 微生物、 核酸、 タンパク、 ペプチド、 抗原、 環境 ホルモンなどの分離を容易に行うことが出来る。
<実施例 >
以下、 実施例を示してこの発明をさらに詳細にかつ具体的に説明するが、 この 発明は以下の例に限定されるものではない。 実施例 1 [磁性微粒子の調製]
磁性微粒子を以下の方法により調製した。
1 L容のフラスコ内で硫酸第一鉄 （7水和物） 83.4 gおよび亜硝酸ナトリウム 10.4gを蒸留水 500m lとよく混合し、 40°Cで 20分間撹拌した。 その後、 濃アン モニゥム 125m lを添加し、 不溶物を集め、 蒸留水で 2回洗浄し、 マグネタイ ト を得た。得られたマグネタイ 卜を 1 L容のフラスコ内で蒸留水 500m lに添加し、 溶液の温度を 8 0 °Cとした後、 ォレイン酸ナトリウム 7.5 gを添加し、 同温度で 2 0分間撹拌した。 その後、 1 Nの塩酸で p Hを 5.5に調整し、 得られた不溶物 をろ過により集め、 蒸留水で 2回洗浄し、 ォレイン酸の層を有するマグネタイ ト を得た。 これを再度 1 L容のフラスコに添加し、 蒸留水を 5 0 0 m l添加し、 溶 液の温度を 7 0 °Cとした後、 ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム 7.5 gを添 加し一晩撹拌し、 5 0〜1 0 0 nmの粒径を有する磁性微粒子の黒色透明水溶液 を得た。 この磁性微粒子を使用して、 U C S Tポリマーが固定化された本発明の
磁性微粒子を以下の方法により調製した。 実施例 2 [U C S Tポリマーが固定化された磁性微粒子 (以下「U C S T微粒子」 と記載する。） の調製]
300ml容のフラスコ内に実施例 1で調製した磁性微粒子 4m 1、 N-ァクリロイ ルグリシンアミ ド 2.13g、 N-ピオチニル -N，-メタクロィルトリメチレンアミ ド 12. 7mgおよび蒸留水 94mlを添加し 50°Cでよく撹拌した。 そこに 0.1 gの過硫酸カリウムを添加し、 室温で 6時間撹拌した。 得られた黒色透明溶液を 一昼夜透析し、 UCST磁性微粒子溶液を得た。 得られた黒色透明溶液の UCS Tを測定したところ、 18°Cであった。 この UC S Tは生理食塩水中や lOOmMのリ ン酸緩衝液 ( pH 7.0 )中でもほとんど変化しなかった。 実施例 3 [水溶液中からのアビジンの分離]
実施例 2で得られた UC S T磁性微粒子 50〃1、 1.0% アビジン溶液 50〃1、 1.0M リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.0) 100〃1、 蒸留水 800 z 1を試験管中で良く 混合した後、 氷水中に置き、 溶液の温度を UC S T以下にした。 この UCS T磁 性微粒子凝集物をネオジ磁石 （0.43T) により回収し、 上清部分 100〃1 を取り 出し、 SDS による変性処理後、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動（SDS- PAGE) により上清からアビジンに対応するバンドが無くなつていることを確認した。 実施例 4 [卵白中からのアビジンの特異的分離]
実施例 2で得られた UCST磁性微粒子 50〃1、 1.0% アビジン溶液 50〃1、 1.0M リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.0) 100〃1、 蒸留水 450〃1、 2.5%の卵白溶液 400 /1を試験中で良く混合した後、氷水中に置き溶液の温度を UC S T以下にし た。 凝集物をネオジ磁石により回収し、 上清部分 100 /1 を取り出し、 SDS によ る変性処理後、 SDS-PAGEにより上清からァビジンに対応するバンドのみが無くな つていることを確認した。
実施例 5 [UCS T磁性微粒子へのアビジン化酵素の固定化]
実施例 2で得られた U C S T磁性微粒子溶液 100 / 1、市販のァビジン化ペルォ キシダーゼ溶液（lmg/ml) 1000 zK 1.0Mリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH7.0) 100〃1 及び蒸留水 700 1 を添加し、 良く混合した。 得られた溶液を冷却し、 磁石によ り UC S T磁性微粒子凝集物を回収し、 上清 1900^1 を取り除いた後、 新たに 0.1M リン酸緩衝液 （pH 7.0) 1900 1を添加し、 アビジン化ペルォキシダ一ゼを 固定化した UC S T磁性微粒子溶液を調製した。 この溶液は UC S T以上では溶 解し、 UCST以下では凝集した。 この溶液の温度を恒温槽により変化させ、 溶 解、 凝集および磁石による回収の操作を行い、 それそれの上清のペルォキシダー ゼの活性を下記に示すペルォキシダーゼの活性測定法により測定した。 なお、 磁 石による UCS T磁性微粒子の回収後は毎回上清 1900 /1 を取り除き、 新たに 0.1M リン酸緩衝液 （pH 7.0) 1900 zlを添加した。
(ペルォキシダーゼ活性測定法）
lOOmM過酸化水素 100〃 1、 50mMフエノール: 100 / 1、 50mM4-ァミノアンチ ピリン 100〃1、 1.0M リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.0) 100〃1、 蒸留水 580〃1 を吸光度計のセル内で予め混合し、 そこへ上記調製した溶液よりサンプリングし た 20 1 を添加し、 再び良く混合した後、 生成物を 500nmの吸収の増加により 測定した。 なお、 以上の操作は 30°Cで行った。
上記の方法により繰り返し本発明の UCST磁性微粒子の凝集、 溶解を行った 場合の上清の酵素活性を測定した結果を下記に示す。 なお、 酵素活性は最初の溶 解時の活性を 100とした場合の比活性で示した。
表 1
まず、 アビジンのピオチン結合サイ ト 3力所が空いている状態のアビジン化 U C S T磁性微粒子を得るため、実施例 2で得られた U C S T磁性微粒子 50 lに 1.0%アビジン溶液 100 zl、 1.0Mリン酸ナトリウム緩衝液 (ρΗ7·0) 100〃1、 蒸留 水 350 zl を試験中で良く混合した後、 氷水中に置き溶液の温度を UCST以下 にした。 凝集物をネオジ磁石 （0. 43T) により回収し、 ポリマーとの結合部 位以外のビォチン結合サイ トが空いているアビジン化 U C S T磁性微粒子を得た c この磁性微粒子 100〃1、 市販のピオチン化ペルォキシダ一ゼ溶液（lmg/ml) 1000 〃1、 1.0Mリン酸ナトリゥム緩衝液（pH7.0) 100 l及び蒸留水 700 zlを添加し、 良く混合した。 得られた溶液を冷却し、 磁石により凝集物を回収し、 上清 1900 〃1を取り除いた後、 新たに 0.1Mリン酸緩衝液 （pH 7.0) 1900 1を添加し、 ビ ォチン化ペルォキシダーゼを固定化したアビジン化 UC S T磁性微粒子を調製し た。 この磁性微粒子を使って、 実施例 5と同様に溶解、 凝集回収を繰り返し、 上 清の酵素活性を測定した結果を下記に示す。 なお、 酵素活性についても同様に最 初の溶解時の活性を 100とした場合の比活性で示した。
表 2
市販のピオチン化されたヒートショックプロテイン HSP70を lOOmMのリン酸ナ トリウム緩衝液 (pH 7.0)によく混合させた後、 5 1 を取り出し、 変性処理後、 SDS-PAGEにより HSP70のバンドを確認した。続いて上記ピオチン化 HSP70のリン 酸ナトリゥム緩衝溶液 50^1に実施例 6で調製した、 ポリマーとの結合部位以 外のピオチン結合サイ 卜が空いているアビジン化 UC S T磁性微粒子 50 /1 を 加え、良く混合したのち、実施例 3と同様に溶液を冷却させ磁性微粒子を凝集後、 磁石により回収し、 上清の HSP70 を同様に SDS-PAGEにより確認したところ上清 には HSP70は無く、磁性微粒子に固定化されたアビジンと結合していることが確 認された。 実施例 8 [微生物の分離濃縮方法]
市販のピオチン化サルモネラ抗体を実施例 6で調製した、 ポリマーとの結合部 位以外のピオチン結合サイ 卜が空いているアビジン化 UCS T磁性微粒子に固定 化した。 ビォチン化サルモネラ抗体がこのように固定化されたことは SDS- PAGE
を用い確認を行った。続いてサルモネラ菌が 1個/ mlになるように調整した菌け ん濁液 20m 1にこのピオチン化サルモネラ抗体固定化 U C S T磁性微粒子溶液 1 m 1を添加してよく撹拌後、 実施例 3と同様に溶液を冷却し、 磁性微粒子を凝集 後、 磁石により回収し、 上清を取り除き lmlの溶液とした。 この凝集体の溶液 を予め滅菌し、 50°Cにィンキュベ一トしていたブレインハ一トインフユ一ジョ ン寒天培地 2 Omlに添加し、 すばやく混合後、 シャーレに広げ、 寒天が固まる まで放冷し、 37°Cで 48時間インキュベートした。 48時間後のコロニー数を 計測した結果を下記に示した。 また、 これら総ての操作はクリーンベンチ内にて 行った。 また、 対照として、 該 UCST磁性微粒子を添加せず、 最初に調整した 菌けん濁液 1 m 1中の菌数を同様に測定した。 表 3
この結果より、 サルモネラ菌はこの磁性微粒子により濃縮されていることが明 らかである。 実施例 9 [UCS T磁性微粒子への核酸の固定化]
市販のピオチン化ラベルされた DNA断片 500// 1 (50〜1000bp)に蒸留水 450〃 1、 実施例 6で調製した、 ポリマ一との結合部位以外のピオチン結合サイ トが空いて いるアビジン化 UCST磁性微粒子 50 1を加え、 良く混合したのち、 実施例 3 と同様に溶液を冷却し、 該 UCST磁性微粒子を凝集後、 磁石により回収し、 上 清の DNA断片をァガロースゲル電気泳動により確認したところ、 いずれの DNA断 片も該 UCST磁性微粒子に結合していることが示唆された。 MAについても同 様の実験を行い、 該 UC S T磁性微粒子への結合を確認した。
実施例 1 o
N-ピオチニル -Ν'-メタクロィルトリメチレンアミ ドの代わりに、 メ夕クリル アクリルアミ ド 252 mgを用いた以外は、 実施例 2に準じて UCST磁性微粒 子を調製した。 得られた磁性微粒子の U C S Tは 2 °Cであった。 実施例 11
N-ピオチニル -N，-メタクロィルトリメチレンアミ ドの代わりに、 Nァセチル アクリルアミ ド 25 lmgを用いた以外は、 実施例 2に準じて UCST磁性微粒 子を調製した。 得られた磁性微粒子の UCSTは 6°Cであった。 実施例 12
N -ピオチニル -N，-メタクロィルトリメチレンアミ ドの代わりに、 Nホルミル アクリルアミ ド 132 mgを用いた以外は、 実施例 2に準じて UCST磁性微粒 子を調製した。 得られた磁性微粒子の UC S Tは 16°Cであった。 実施例 13
N-ピオチニル -Ν'-メ夕クロィルトリメチレンアミ ドの代わりに、 Νホルミル アクリルアミ ド 22 lmgを用いた以外は、 実施例 2に準じて UCST磁性微粒 子を調製した。 得られた磁性微粒子の UCSTは 30°Cであった。 実施例 14
N-ピオチニル -N，-メタクロィルトリメチレンアミ ドの代わりに、 ァクリルァ ミ ド 237 mgを用いた以外は、 実施例 2に準じて UCST磁性微粒子を調製し た。 得られた磁性微粒子の UCSTは 10°Cであった。 実施例 15
N -ピオチニル -N，-メタクロィルトリメチレンアミ ドの代わりに、 Nァセチル アクリルアミ ド 188mgを用いた以外は、 実施例 2に準じて UCST磁性微粒
子を調製した。 得られた磁性微粒子の UC STは 12°Cであった。 実施例 16
N-ァクリロイルグリシンアミ ド、 および N-ビォチニル -N，-メ夕クロィルトリ メチレンアミ ドの代わりに、 アクリルアミ ド 1. 18 g、 Nホルミルアクリルァ ミド 275 mgを用いた以外は、 実施例 2に準じて UCST磁性微粒子を調製し た。 得られた磁性微粒子の UCSTは 14°Cであった。 本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、 本発明の精神と範 囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にと つて明らかである。
本出願は、 2000年 8月 21日出願の日本特許出願 No.2000— 249817に基づくも のであり、 その内容はここに参照として取り込まれる。
<産業上の利用可能性 >
上限臨界溶液温度を有するポリマーを固定化した本発明の磁性微粒子を生体分 子等の分離に用いた場合には、 その目的物質である生体分子等を損傷もしくは失 活させることなく分離、 回収することが可能である。
Claims
1 . 上限臨界溶液温度を有するポリマーが固定化された磁性微粒子。
2 . 上限臨界溶液温度を有するポリマーが、 下記一般式（1)で表されるモ ノマーを重合させて得られたポリマーである請求の範囲第 1項記載の磁性微粒子 c
NH2
(式中、 R 11は水素原子又はメチル基を示し、 R12は単結合または炭素数 1〜5の 直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示す。）
3 . 上限臨界溶液温度を有するポリマーが、上記一般式（1)で表されるモ ノマーと、 下記一般式 （2 ) で表されるモノマーとを重合させて得られたポリマ —である請求の範囲第 1項記載の磁性微粒子。
(式中、 R 13は水素原子又はメチル基を示し、 R14は水素原子、 炭素数 1〜1 0 の直鎖状、 分岐状もしくは環状のアルキル基、 アルコキシル基、 アルキルアミノ 基、 ァリール基、 又は複素環基を示す。）
4 . 上限臨界溶液温度を有するポリマーが、上記一般式（1)で表されるモ ノマーと、 ピオチンをその構造の一部とするモノマーとを重合させて得られたポ
リマーである請求の範囲第 1項記載の磁性微粒子。
5 . 上限臨界溶液温度を有するポリマーが、 さらに親水性モノマーおよび 疎水性モノマ一から選ばれた 1種以上を用いて重合して得られたポリマ一である 請求の範囲第 2項〜第 4項の何れか 1項記載の磁性微粒子。
6 . 相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が、 上限臨界溶液温度を 有するポリマーに固定化された請求の範囲第 1項記載の磁性微粒子。
7 . 相互に特異的作用を有する一対の物質が、 ピオチンとアビジン、 抗原 と抗体、 ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、 c DNA と mRNA、 酵素 （活性部位） と基質、 酵素 （活性部位） と生産物、 酵素 （活性部位） と競争阻害剤、 酵素 （補酵素結合部位） と補酵素、 酵素 （補酵素結合部位） とト リァジン色素、 プロテア一ゼとプロテア一ゼィンヒビ夕一、 Fc部位とプロティン A、 Fc部位とプロテイン G、 レクチンと糖、 ホルモンレセプ夕一とホルモン、 DNA と DNA結合タンパク質、 へパリンとフィプロネクチン、 およびへパリンとラミニ ンとの組合せから選ばれた 1種以上である請求の範囲第 6項記載の磁性微粒子。
8 . 相互に特異的作用を有する一対の物質が、 ピオチンとアビジンである 請求の範囲第 6項記載の磁性微粒子。
9 . 上限臨界溶液温度を有するポリマーに固定化された該一対の物質の一 方が、 ピオチンである請求の範囲第 6項記載の磁性微粒子。
1 0 . ピオチンがアビジンと結合したピオチン （以下 「アビジン結合ビォ チン」 と記載する。） である請求の範囲第 9項記載の磁性微粒子。
1 1 . アビジン化酵素をピオチンに結合させた請求の範囲第 9項記載の磁
性微粒子。 -
1 2 . ピオチン化酵素をアビジン結合ビォチンに結合させた請求の範囲第 1 0項記載の磁性微粒子。
1 3 . 請求の範囲第 1 1項または第 1 2項記載の磁性微粒子を用いること を特徴とする物質の変換方法。
1 4 . アビジン化抗体をビォチンに結合させた請求の範囲第 9項記載の磁 性微粒子。
1 5 . ビォチン化抗体をアビジン結合ピオチンに結合させた請求の範囲第 1 0項記載の磁性微粒子。
1 6 . 請求の範囲第 1 4項または第 1 5項記載の磁性微粒子を用いること を特徴とする微生物の分離方法または濃縮方法。
1 7 . アビジン化分子シャペロンをビォチンに結合させた請求の範囲第 9 項記載の磁性微粒子。
1 8 . ピオチン化分子シャペロンをアビジン結合ビォチンに結合させた請 求の範囲第 1 0項記載の磁性微粒子。
1 9 . 請求の範囲第 1 7項または第 1 8項記載の磁性微粒子を用いること を特徴とする変性蛋白質の改質方法。
2 0 . アビジン化ヒートショックプロティンをピオチンに結合させた請求 の範囲第 9項記載の磁性微粒子。
2 1 . ピオチン化ヒートショックプロティンをアビジン結合ビォチンに結 合させた請求の範囲第 1 0項記載の磁性微粒子。
2 2 . 請求の範囲第 2 0項または第 2 1項記載の磁性微粒子を用いること を特徴とする変性蛋白の改質方法。
2 3 . ァビジン化核酸をピオチンに結合させた請求の範囲第 9項記載の磁 性微粒子。
2 4 . ビォチン化核酸をアビジン結合ビォチンに結合させた請求の範囲第 1 0項記載の磁性微粒子。
2 5 . 請求の範囲第 2 3項または第 2 4項記載の磁性微粒子を用いること を特徴とする核酸の精製、 検出、 または濃縮方法。
2 6 . 請求の範囲第 2 5項記載の核酸の精製、 または濃縮方法により得ら れた核酸を増幅することを特徴とする核酸の検出方法。
2 7 . 増幅方法が PCR法または RT- PCR法である請求の範囲第 2 6項記載の 核酸の検出方法。
2 8 . 請求の範囲第 1項〜第 1 0項の何れか 1項記載の磁性微粒子を含有 する分離剤。
2 9 . 請求の範囲第 2 8項記載の分離剤を用いることを特徴とする生体物 質の分離方法。
3 0 . 磁性微粒子の存在下、 上限臨界溶液温度を有するポリマーを重合す
ることを特徴とする上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
3 1 . 磁性微粒子の存在下、 下記一般式（1)で表されるモノマーを重合さ せることを特徴とする請求の範囲第 3 0項記載の上限臨界溶液温度を有する磁性 微粒子の製造方法。
(式中、 R11は水素原子又はメチル基を示し、 R12は単結合または炭素数 1〜5の 直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示す。）
3 2 . 磁性微粒子の存在下、 上記一般式 （1)で表されるモノマーと、 一般 式 （2 ) で表されるモノマーとを重合させることを特徴とする請求の範囲第 3 0 項記載の上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
(式中、 R 13は水素原子又はメチル基を示し、 R14は水素原子、 炭素数 1〜1 0 の直鎖状、 分岐状もしくは環状のアルキル基、 アルコキシル基、 アルキルアミノ 基、 ァリール基、 又は複素環基を示す。）
3 3 . 磁性微粒子の存在下、 上記一般式 （1)で表されるモノマーと、 ビォ チンをその構造の一部とするモノマーとを重合させることを特徴とする請求の範 囲第 3 0項記載の上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
3 4 . さらにモノマーとして、 親水性モノマ一および疎水性モノマ一から 選ばれた 1種以上を用いることを特徴とする請求の範囲第 3 0項〜第 3 3項の何 れか 1項記載の上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
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